CN114980875A - 提取物、可消费产品及用于富集提取物中的生物活性代谢物方法 - Google Patents

提取物、可消费产品及用于富集提取物中的生物活性代谢物方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及具有提高水平的一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的方法和组合物。本文还公开了用于产生具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的可消费产品的方法。一些实施方案涉及富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的组合物。

Description

提取物、可消费产品及用于富集提取物中的生物活性代谢物 方法
背景
N-羟基肉桂酸酰胺(HCAA)是通过羟基肉桂酰辅酶A硫酯和芳族胺的缩合反应合成的。羟基肉桂酰辅酶A硫酯包括肉桂酰辅酶A、p-香豆酰辅酶A、咖啡酰辅酶A、阿魏酰辅酶A和芥子酰辅酶A，并且通过一系列酶(包括肉桂酸酯-4-羟化酶、香豆酸酯-3-羟化酶、咖啡酸O-甲基转移酶、阿魏酸酯-5-羟化酶和羟基肉桂酸酯：辅酶A连接酶)由肉桂酸合成。羟基肉桂酸(Douglas(1996)Trends Plant Sci 1:171-178)。
酪胺衍生的HCAA通常与病原体感染的区域或伤口愈合区域附近的组织的细胞壁有关。此外，阿魏酰酪胺和阿魏酰辛胺是马铃薯(Solanum tuberosum)块茎的天然周皮和创伤周皮的共价细胞壁成分，并且是木栓质的芳香结构域的推定组分。HCAA的沉积被认为通过降低细胞壁的可消化性而产生对抗病原体的屏障。HCAA是通过羟基肉桂酰辅酶A硫酯与苯乙胺如酪胺或多胺如腐胺的缩合形成的。酪胺衍生的HCAA生物合成的最终步骤由羟基肉桂酰辅酶A：酪胺N-(羟基肉桂酰基)转移酶催化。考虑到这些化合物的重要作用，期望具有能够增加植物中这些次级代谢物的水平的手段和方法。
EP 1671534A1描述了通过用生物和/或非生物刺激处理植物来增加植物中缩酚酸类，优选二咖啡酰奎尼酸和/或二咖啡酰酒石酸的含量的方法。
US 7,666,455教导了通过减小花生仁的尺寸，非生物地胁迫该减小尺寸的花生仁，并且在能够增加该减小尺寸的花生仁中的白藜芦醇的量的条件下培育经非生物胁迫的减小尺寸的花生仁来增加花生材料中的白藜芦醇的量的方法。
US 9,227,898描述了通过用紫外-C光或紫外-B光照射甘蔗坯料的切面来增加甘蔗中二苯乙烯(特别是白藜芦醇和白皮杉醇)产量的方法。
US 2004/0234657A1教导了用改性的卵磷脂例如酶改性的卵磷脂(EML)和化学改性的卵磷脂如乙酰化卵磷脂(ACL)和羟基化卵磷脂(HDL)处理植物以诱导苯丙氨酸氨裂合酶、多酚氧化酶和过氧化物酶的表达，并增强木质素产生。
此外，受伤的烟草(Hagel,&Facchini(2005)Plan ta 22l:904-914)和马铃薯块茎盘(Negrel,et al.(1993)J.Plant Physiol.142(5):518-524)已经显示出产生增加水平的阿魏酸与酪胺或章鱼胺(octopamine)的酰胺，并且已经显示出激发子壳聚糖处理在马铃薯中增加香豆酰酪胺(Schmidt,et al.(1999)J.Biol.Chem.274:4273-4280).
发明内容
在一些方面，本文提供的公开内容描述了用于产生具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的可消费产品的方法。在一些实施方案中，用于产生具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的可消费产品的方法包括：
(a)使用于产生通式I化合物的植物经受至少一种生物或非生物胁迫，
Figure BDA0003737885440000021
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基；虚线键存在或不存在；
X是CH2或O；
Z是CHRa、NRa或O；以及
Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基，任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基，
虚线键存在或不存在；以及
(b)将所述植物或提取物并入可消费产品中。
在一些实施方案中，用于产生具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的可消费产品的方法包括：
(a)使用于产生通式II化合物的植物经受至少一种生物或非生物胁迫，
Figure BDA0003737885440000031
其中
R1、R2和R3各自独立地存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子(例如，2、3和/或4位)上的取代基，并且对于每个环原子独立地是羟基、卤素基团、取代或未取代的低级烷基或者取代或未取代的低级烷氧基，
虚线键存在或不存在；以及
(b)将所述植物或提取物并入可消费产品中。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述植物回收提取物。在一些实施方案中，所述方法还包括使植物与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体接触。在一些实施方案中，生物胁迫是假萌发。在一些实施方案中，所述至少一种生物或非生物胁迫在收获后施用。在一些实施方案中，所述至少一种生物或非生物胁迫在收获前施用。在一些实施方案中，非生物胁迫选自高渗胁迫、盐胁迫、温度胁迫、异常的营养条件、机械冲击淹水、创伤、厌氧胁迫、氧化胁迫、臭氧、强光、重金属、毒性化学品、超声、紫外光、激发子壳聚糖处理、改性卵磷脂处理或脱落酸处理中的至少一种。
在一些实施方案中，任选地从植物回收提取物包括乙醇提取物。在一些实施方案中，所述植物选自以下中的至少一种：蒺藜(Tribulus terrestris)、山刺番荔枝(Annonamontana)、刺果番荔枝(Annona muricata)、秘鲁番荔枝(Annona cherimola)、阿蒂莫耶番荔枝(Annona atemoya)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大麻(Cannabis sativa)、枸杞(Lycium barbarum)、大蒜(Allium sativum)、番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、小米椒(Capsicum frutescens)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番荔枝(Annona spp.)、枸杞(Lycium barbarum)、甘薯(Ipomoea batatas)、玉米(Zea Mays)、胡椒(Piper nigrum)、土荆芥(Dysphania ambrosioides)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、墨西哥叶胡椒(Piper auritum)、番茄(Solanum lycopersicum)或葱(Alliumfistulosum)。
在一些实施方案中，所述化合物选自p-香豆酰酪胺、n-咖啡酰酪胺、n-阿魏酰酪胺和芥子酰基(sinpoyl)酪胺。在一些实施方案中，n-阿魏酰酪胺的产率大于1000mg/kg植物。在一些实施方案中，p-香豆酰酪胺的产率大于50mg/kg植物。在一些实施方案中，所述至少一种生物或非生物胁迫包括在约25℃至约37℃和6.5至约9.5的pH下培育植物。在一些实施方案中，所述至少一种生物或非生物胁迫包括在约30℃和约8.5的pH下培育植物。
在一些实施方案中，非生物胁迫是物理创伤，并且通式I的化合物是n-阿魏酰酪胺。在一些实施方案中，物理创伤增加n-阿魏酰酪胺增加至少9倍。在一些实施方案中，物理创伤增加n-阿魏酰酪胺增加至少13倍。在一些实施方案中，物理创伤增加n-阿魏酰酪胺增加至少33倍。在一些实施方案中，非生物胁迫是紫外光，并且通式I化合物是n-阿魏酰酪胺、n-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺。在一些实施方案中，将植物暴露于紫外光约15分钟至约30分钟。在一些实施方案中，非生物胁迫是温度胁迫且通式I化合物是n-阿魏酰酪胺、n-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺。在一些实施方案中，温度胁迫将n-阿魏酰酪胺、n-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺的产量从约25％增加至约47％。
在一些实施方案中，通过如本文所述的方法生产可消费产品。在一些实施方案中，可消费产品是膳食补充剂、食品成分、食品添加剂、食品、饲料产品、医疗食品、营养品或药物组合物。
一些实施方案涉及富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的组合物，所述组合物包含提取物或源材料，所述提取物或源材料包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体，其中所述提取物或源材料已经与酶材料接触，其中所述酶材料包含一种或多种能够将所述一种或多种前体转化成含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的内源酶。
在一些实施方案中，酶材料包含苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸酯-辅酶A连接酶、肉桂酸酯-4-羟化酶、香豆酸酯-3-羟化酶、香豆酰辅酶A 3-羟化酶、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶、阿魏酸酯-5-羟化酶、咖啡酸/5-羟基阿魏酸O-甲基转移酶、酪氨酸氨裂合酶或它们的组合。在一些实施方案中，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺为N-咖啡酰酪胺、N-阿魏酰酪胺、5-羟基阿魏酰酪胺、p-香豆酰酪胺、肉桂酰酪胺、芥子酰酪胺或它们的组合。在一些实施方案中，所述组合物是可消费产品。在一些实施方案中，可消费产品是膳食补充剂、食品成分、食品添加剂、饲料产品、食品、医疗食品、营养品或药物组合物。
在一些实施方案中，本文提供了用于提高提取物或源材料中的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物或源材料与酶材料接触，其中所述酶材料包含一种或多种能够将所述一种或多种前体转化成含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的内源酶，从而提高所述提取物或源材料中含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述提取物或源材料与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体接触。在一些实施方案中，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺是通式I的化合物。在一些实施方案中，源材料选自以下中的至少一种：蒺藜、山刺番荔枝、刺果番荔枝、秘鲁番荔枝、阿蒂莫耶番荔枝、马铃薯、大麻、枸杞、大蒜、番茄、辣椒、小米椒、马铃薯、番荔枝、枸杞、甘薯、玉米、胡椒、土荆芥、玫瑰茄、墨西哥叶胡椒、番茄或葱。
本公开还提供了富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的组合物，所述组合物由包括含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物组成，其中所述提取物已经与包括一种或多种内源酶活性的酶材料接触，所述内源酶活性将所述一种或多种前体转化为含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。在一些实施方案中，酶材料包含苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸酯-辅酶A连接酶、肉桂酸酯-4-羟化酶、香豆酸酯-3-羟化酶、香豆酰辅酶A 3-羟化酶、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶、阿魏酸酯-5-羟化酶、咖啡酸/5-羟基阿魏酸O-甲基转移酶、酪氨酸氨裂合酶或它们的组合。在其它实施方案中，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺为N-咖啡酰酪胺、N-阿魏酰酪胺、5-羟基阿魏酰酪胺、p-香豆酰酪胺、肉桂酰酪胺或芥子酰酪胺。还提供了可消费产品，例如膳食补充剂、食品成分或添加剂、食品、医疗食品、营养品或药物组合物，以及用于提高提取物中含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平的方法。
附图的简要说明
图1描述了由羟基肉桂酰辅酶A酯和酪胺生物合成含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的示意性途径。然而，为了清楚起见，没有示出辅因子和辅底物(co-substrate)。苯丙素类化合物途径的酶是苯丙氨酸氨裂合酶(PAL,E.C.4.3.1.24)；肉桂酸酯-4-羟化酶(C4H,E.C.1.14.14.91)；4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL,E.C.6.2.1.12)；香豆酸酯-3-羟化酶(C3H,E.C.1.14.13.-)；香豆酰辅酶A 3-羟化酶(CCoA3H，或5-O-(4-香豆酰基)-D-奎尼酸酯3’-单加氧酶，E.C.1.14.14.96)；咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶(CCoAOMT,E.C.2.1.1.104)；阿魏酸酯-5-羟化酶(F5H,E.C.1.14.-.-)；和咖啡酸/5-羟基阿魏酸O-甲基转移酶(COMT,E.C.2.1.1.68)。在含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的生物合成中的另外的酶包括羟基肉桂酰辅酶A：酪胺羟基肉桂酰转移酶(THT,E.C.2.3.1.110)；酪氨酸氨裂合酶(TAL,E.C.4.3.1.23)、苯丙氨酸羟化酶(PAH,E.C.1.14.16.1)和酪氨酸脱羧酶(TYDC,E.C.4.1.1.25)。
图2显示了存在于来自各种来源的乙醇提取物(提取物的％，w/w)中的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的量，所述来源包括蒺藜(Tribulusterrestris)籽(1)、印度大麻(Cannabis)(大麻(hemp))籽壳(2)、番荔枝(Annona spp.)(杂交番荔枝(atemoya))籽(3)、刺果番荔枝(Annona muricata)(刺果番荔枝(Guanabana))籽(4)、秘鲁番荔枝(A.cherimola)(南美番荔枝(Cherimoya))叶(5)、玉米(Zea mays)秆(6)、蒺藜(Tribulus terrestris)(Goat Head)籽(7)、秘鲁番荔枝(A.cherimola)硬木(树皮和核心)(8)、番茄(Solanum lycopersicum)研磨的果渣(9)、马铃薯(S.tuberosum)(黄马铃薯)皮(10)、胡椒(Piper nigrum)(黑胡椒粒)果实(11)、马铃薯(S.tuberosum)(紫马铃薯)皮(12)、马铃薯(S.tuberosum)(红马铃薯)皮(13)、番茄(S.lycopersicum)果渣(14)、番茄(S.lycopersicum)挤压的果渣(15)、刺果番荔枝(A.muricata)(刺果番荔枝(Guanabana)叶(16)、大蒜(Allium sativum)(大蒜(garlic))鳞茎(17)、马铃薯(S.tuberosum)(紫马铃薯)皮(18)、A.montana(山刺番荔枝(Mountain soursop))叶(19)、玉米(Z.mays)叶(20)、马铃薯(S.tuberosum)(紫马铃薯)芽(21)、秘鲁番荔枝(A.cherimola)(南美番荔枝(Cherimoya))籽(22)、葱(Allium fistulosum)(大葱(green onion))全植物(23)、马铃薯(S.tuberosum)(白马铃薯)皮(24)、秘鲁番荔枝(A.cherimola)(南美番荔枝(Cherimoya))未干枯的树(25)、印度大麻(Cannabis)(大麻(hemp))叶(26)、马铃薯(S.tuberosum)(白马铃薯)皮(27)、番茄(S.lycopersicum)籽(28)、番茄(S.lycopersicum)(Beefsteak)全果实(29)、刺果番荔枝(A.muricata)(Guarabana)未成熟果实的皮(30)、刺果番荔枝(A.muricata)(刺果番荔枝(Guanabana)成熟的新鲜果实(31)、香荔枝(A.squamosa)(番荔枝(sweetsop))全果实(32)、辣椒(Capsicum annuum)(塞拉诺辣椒(serrano pepper))果实(33)、马铃薯(S.tuberosum)(褐色马铃薯(Russet potato))皮(34)、枸杞(Lyciumbarbarum)(枸杞(goji)/西方雪果(wolf berry))果实(35)、马铃薯(S.tuberosum)(紫马铃薯)核(36)、藜麦(Chenopodium quinoa)(昆诺阿藜(quinoa))籽(37)、甘薯(Ipomoeabatatas)(番薯(sweet potato))全薯(38)、甘薯(Ipomoea batatas)(番薯(sweetpotato))皮(39)、辣根(Armoracia rusticana)(辣根(horseradish))根(40)、马铃薯(S.tuberosum)(科罗拉多马铃薯(Colorado potato))皮(41)、荞麦(Fagopyrumesculentum)(荞麦(buckwheat))壳(42)、小米椒(Capsicum frutescens)(piri辣椒)果实(43)、马铃薯(S.tuberosum)(紫马铃薯)核(44)、辣椒(C.annuum)(朝天椒(Thai chili))茎和叶(45)、刺果番荔枝(A.muricata)(刺果番荔枝(Guanabana)未成熟的果肉(46)、马铃薯(S.tuberosum)(黄马铃薯)核(47)和苔麸(Eragrostis tef)埃塞俄比亚画眉草((teff))籽(48)。
图3显示存在于乙醇提取物中的N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的量(mg化合物/kg干植物材料)，所述乙醇提取物来自另外的来源，包括胡椒(Piper nigrum)(胡椒粒(peppercorn))果实(1)、土荆芥(Dysphania ambrosioides)(土荆芥(epazote))叶(2)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)(芙蓉花(hibiscus))洛神葵(roselle)(3)和墨西哥叶胡椒(Piper auritum)(hoja santa)叶。
图4显示在使去皮的块茎受创后1、5和9天，创伤胁迫对在马铃薯(Solanumtuberosum)块茎的核中产生N-反式-阿魏酰酪胺的影响。
图5A和图5B显示在15分钟或30分钟UV-C暴露后辐射胁迫对胡椒籽中N-反式-阿魏酰酪胺的产生的影响(图5A)，或者与对照(未暴露的植物组织(CNTL))相比，在15分钟UV-C暴露后辐射胁迫对刺果番荔枝叶(graviola leaves)和大葱(green onions)中N-反式-阿魏酰酪胺、N-反式-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺的产生的影响(图5B)。
图6显示大麻籽的假萌发对含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺产生的影响。将烘烤的大麻籽在蒸馏水中浸泡5天，并每天取样以获得N-反式-咖啡酰酪胺(M1)、N-反式-阿魏酰酪胺(M2)或p-香豆酰酪胺(M3)。
图7显示浸泡温度和烘烤条件对通过假萌发的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的组合富集的影响。
图8显示组合不同胁迫N-反式-阿魏酰酪胺产生的影响。将红马铃薯切片(即，受创)并浸入10mg/ml活的内生菌根真菌、10mg/ml灭活的cordy-gen真菌或1mg/ml昆布多糖(来自褐藻的多糖)的水溶液中。
图9显示了胁迫与前体的组合对阿魏酰酪胺产生的影响。将红马铃薯切片(即，并在水中煮沸6分钟或浸入非生物的N-反式-受创的)400μM酪胺或柠檬酸(pH～4)水溶液中。
公开内容的详细说明
酪胺-衍生的N-羟基肉桂酸酰胺(HCAA)通常与植物的病原体感染区域或创伤愈合区域附近的组织的细胞壁有关。此外，阿魏酰酪胺和阿魏酰辛胺是马铃薯(Solanumtuberosum)块茎的天然周皮和创伤周皮的共价细胞壁成分。HCAA的沉积被认为通过降低细胞壁可消化性而产生对抗病原体的屏障。
现在已经显示含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺对HNF4α(肝细胞核因子4α)表现出激动活性，HNF4α是调节参与维持平衡代谢(内稳态)的基因的表达的全核转录因子。通过激动HNF4α活性，发现植物特异性酪胺衍生物在减轻游离脂肪酸的副作用、调节代谢、改善消化健康和解决代谢病症(例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和II型糖尿病)的潜在发病机理方面的用途。
因此，本公开提供了具有提高水平的一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的组合物。在一些实施方案中，所述组合物通过使包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物与包含将所述一种或多种前体转化成含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种内源酶活性的酶材料接触来制备。或者，或除此之外，还可通过使植物经受至少一种生物或非生物胁迫，任选地从该植物中回收提取物来实现含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平的提高；以及将所述植物或提取物掺入到可消费产品中。本发明的原位方法允许在植物提取物或其级分中提高含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的产率，从而降低下游加工和纯化成本。
在一些方面，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺具有通式I的结构并且包括其同二聚体、异二聚体和缀合物：
Figure BDA0003737885440000101
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R8各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基，以及R4、R5、R6、R7和R9各自独立地是氢、氘、羟基或卤素；
在一些实施方案中，R1、R2和R8各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的C1-6炔基、-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基，以及R3、R4、R5、R6、R7和R9各自独立地是氢、氘、羟基或卤素。
在一些实施方案中，虚线键存在或不存在。
在一些实施方案中，X为CH2或O。
在一些实施方案中，Z为CHRa、NRa或O。
在一些实施方案中，Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基。
在一些实施方案中，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺具有通式II的结构并且包括其同二聚体、异二聚体和缀合物(例如，木质素酰胺)，
Figure BDA0003737885440000121
其中
R1存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子(例如，2、3和/或4位)上的取代基，并且对于每个环原子独立地是羟基、卤素基团、取代的或未取代的低级烷基或者取代的或未取代的低级烷氧基；R2存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子(例如2、3和/或4位)上的取代基，并且对于每个环原子独立地是羟基、卤素基团、取代的或未取代的低级烷基或者取代的或未取代的低级烷氧基，R3存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子(例如2、3和/或4位)上的取代基，并且对于每个环原子独立地是羟基、卤素基团、取代的或未取代的低级烷基或者取代的或未取代的低级烷氧基，并且虚线键存在或不存在。根据本公开，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺包括顺式和反式异构体。
对于本文中的基团，以下括号下标进一步如下定义基团：“(Cn)”定义基团中碳原子的确切数目(n)。例如，“C1-C6-烷基”指定具有1至6个碳原子(例如1、2、3、4、5或6个，或其中可衍生的任何范围(例如3-6个碳原子))的那些烷基。
术语“低级烷基”意指含有1至6个碳原子的支链或直链饱和一价烃基(即，C1-C6-烷基)，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、丁基、正己基等。
类似地，低级烷氧基是具有结构-OR的C1-C6烷氧基，其中R是如上进一步定义的“烷基”。具体的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、1,2-二甲基丁氧基等。
术语“卤素”在本文中用于指氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘(I)基团。在一些实施方案中，卤素基团是氟基团。
在本文所述的任何基团中，取代的基团(例如，取代的低级烷基或取代的低级烷氧基)是指可用的氢被如下基团替换：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、烷基芳基、杂芳烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、烷基杂芳基、羟基、羟基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷氧基烷氧基、酰基、卤素、硝基、氰基、羧基、芳烷氧基羰基、杂芳基磺酰基、烷氧基羰基、烷基磺酰基、烷硫基、芳硫基、芳氧基羰基、芳基磺酰基、杂芳基硫基、芳烷基硫基、杂芳烷基硫基、环烷基、杂环基或糖基。
在一些实施方案中，本公开包括通式(III)的化合物：
Figure BDA0003737885440000131
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基。
在一些实施方案中，虚线键存在或不存在。
在一些实施方案中，Z为CHRa、NRa或O。
在一些实施方案中，Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基。
本申请中所示的结构的原子上的任何未定义的化合价隐含地表示与该原子键合的氢原子。
在一些实施方案中，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺具有通式IV的结构：
Figure BDA0003737885440000141
其中，
R2存在或不存在，并且当存在时是羟基或甲氧基；
R3存在或不存在，并且当存在时是羟基或甲氧基；以及
R4存在或不存在，并且当存在时是羟基或甲氧基。
“异构体”尤其指旋光异构体(例如基本上纯的对映异构体、基本上纯的非对映异构体及其混合物)以及构象异构体(即，仅在其至少一个化学键的角度上不同的异构体)、位置异构体(特别是互变异构体)和几何异构体(例如，顺式-反式异构体)。
在一些实施方案中，本公开包括通式(V)的化合物：
Figure BDA0003737885440000142
Figure BDA0003737885440000151
在一些实施方案中，R3和R4各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C2-12杂环基、任选取代的-(O)C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基。
在一些实施方案中，每个独立选择的虚线键存在或不存在。
在一些实施方案中，Z为CHRa、NRa或O。
在一些实施方案中，Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12杂芳基。
在一些实施方案中，Qa、Qb、Qc、Qd各自独立地选自键、CHRa、NRa、C＝O和-O-。
在一些实施方案中，Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基。
在一些实施方案中，Qc、Qd不存在。在一些实施方案中，Qd不存在。
在一些实施方案中，n为1、2、3或4。
在一些实施方案中，通式I、II、III和IV的化合物选自咖啡酰酪胺、阿魏酰酪胺、香豆酰酪胺、肉桂酰酪胺、芥子酰酪胺和5-羟基阿魏酰酪胺。在一些实施方案中，通式I、II、III和IV的化合物选自n-咖啡酰酪胺、n-阿魏酰酪胺、n-香豆酰酪胺、n-肉桂酰酪胺、n-芥子酰酪胺和5-羟基阿魏酰酪胺。在一些实施方案中，含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺是以下化合物之一：
Figure BDA0003737885440000161
通过高等植物生物合成酪胺的羟基肉桂酸酰胺是通过苯丙素类化合物途径，特别是羟基肉桂酸酪胺酰胺生物合成途径，其涉及酪胺部分和羟基肉桂酸衍生部分的偶联。酰胺偶联反应通过酪胺-N-羟基肉桂酰转移酶(以前称为酪胺-N-阿魏酰转移酶)或THT(E.C.2.3.1.110)进行，其将活化的辅酶A(CoA)形式的特定羟基肉桂酸衍生物与酪胺一起缩合。
酪胺和羟基肉桂酸部分都是通过莽草酸途径产生的，所述莽草酸途径产生芳族氨基酸和叶酸化合物。酪氨酸—酪胺的前体是由植物的质体中莽草酸途径中的一种中间体预苯酸酯产生的。使用谷氨酰胺作为胺供体，经由谷氨酸预苯酸氨基转移酶(E.C.2.6.1.79)，或使用天冬酰胺作为胺供体，经由天冬氨酸预苯酸氨基转移酶(E.C.2.6.1.78)，通过转氨酶反应将衍生自中枢莽草酸途径中间体分支酸(chorismite)的经由分支酸变位酶的预苯酸转化为阿罗酸(arogenate)。然后阿罗酸通过阿罗酸脱水酶(E.C.4.2.1.91)或阿罗酸脱氢酶(E.C.1.3.1.43)转化为酪氨酸。最后，酪氨酸经由酪氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.25)转化为酪胺。
羟基肉桂酸部分是通过苯丙氨酸的转化产生的，苯丙氨酸像酪氨酸一样是通过阿罗酸脱水酶由阿罗酸产生的。然后苯丙氨酸通过苯丙氨酸氨裂合酶(E.C.4.3.1.24)(其催化脱氨基步骤)转化为反式-肉桂酸酯。反式-肉桂酸酯通过反式-肉桂酸酯4-单加氧酶(E.C.1.14.14.91)转化为4-羟基肉桂酸酯。然后，4-羟基肉桂酸酯和辅酶A通过4-香豆酸酯连接酶(E.C.6.2.1.12)转化为4-香豆酰辅酶A。活化的CoA形式的其它羟基肉桂酸酯家族成员(包括咖啡酸和阿魏酸)衍生自4-香豆酰辅酶A。
酪胺的羟基肉桂酸酰胺是通过肉桂酰辅酶A、p-香豆酰辅酶A、咖啡酰辅酶A、阿魏酰辅酶A和芥子酰辅酶A与酪胺通过酪胺-N-羟基肉桂酰转移酶(E.C.2.3.1.110)(也称为酪胺-N-阿魏酰转移酶)缩合，分别产生肉桂酰酪胺、p-香豆酰酪胺、N-咖啡酰酪胺、N-阿魏酰酪胺和芥子酰酪胺而合成的。在图1中提供了生化途径的示意图。
虽然原则上可以根据本公开使用任何植物，但是已经显示含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺在来自如下属的植物中合成，包括茄属植物(Solanum sp.)(例如，番茄、马铃薯、荨麻(nettle)、红辣椒(chili pepper)和茄子)，辣椒属植物(Capsicum)(例如，piri piri辣椒和塞拉诺辣椒(searrano pepper))，葱属植物(Allium sp.)(例如，大蒜、洋葱和韭菜)，蒺藜属植物(Tribulus sp.)(例如，蒺藜)和番荔枝属植物(Annona sp.)(例如，南美番荔枝(cherimoya)、释迦凤梨(custard apple)和番荔枝(sweetsop))。在所测试的植物物种中，发现大多数物种在乙醇提取物中以小于1重量％的滴度(titer)产生感兴趣的化合物(图2)。具体而言，发现刺果番荔枝(Annona muricata)(刺果番荔枝(Guanabana))产生最高水平的N-反式-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺，但仅产生低水平的N-反式-阿魏酰酪胺。通过比较，阿蒂莫耶番荔枝产生第二高滴度的N-反式-咖啡酰酪胺和高滴度的p-香豆酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺。此外，红马铃薯皮(Solanum tuberosum)含有痕量的N-反式-咖啡酰酪胺、高水平的N-反式-阿魏酰酪胺和最高滴度的p-香豆酰酪胺。大葱显示第二高的量的p-香豆酰酪胺(仅次于马铃薯皮)、中等水平的N-反式-阿魏酰酪胺和不可检测量的N-反式-咖啡酰酪胺。
根据本公开的一个方面，使植物经受至少一种生物或非生物胁迫或刺激以增加酚类化合物的含量，尤其是含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺和/或用于其生产的底物的含量。术语“植物”包括全植物；植物部分，例如枝(shoot)营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种籽(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的卵巢)；植物组织(例如，脉管组织、基本组织等)；和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)，以及它们的后代和培养物或细胞系。
植物可以在收获前和/或收获后经受至少一种生物或非生物胁迫或刺激，并且随后用于制备植物衍生的提取物，包括汁液、浸制液(infusions)和发酵残余物。发现产物发酵植物来源的提取物或其经加工的部分(例如，包括纯化的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺)可用于可消费组合物，例如促进健康的组合物或用于人和动物的滋养剂，以及化妆品。
至少一种生物和/或非生物处理用于增加植物中羟基肉桂酸酰胺(例如含有N-咖啡酰酪胺、N-阿魏酰酪胺、p-香豆酰酪胺、肉桂酰酪胺或芥子酰酪胺的酪胺)或其前体的水平。在一些实施方案中，使用多于一种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)的生物和/或非生物处理。在其它实施方案中，在收获前施加至少一种生物或非生物胁迫，并且在收获后施加至少一种生物或非生物胁迫。为了本公开的目的，术语“收获”是指其中植物或植物部分从其自然环境中移出的过程或时间段。例如，当将整株植物从种植它的土壤中移出时，收获整株植物，而当将果实从整株植物中移出时，收获果实。
“生物”胁迫或刺激被定义为由于其它活生物体(例如细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益昆虫和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物)对生物体造成损伤而发生的胁迫。例如，在积累苯丙素类化合物中，N-羟基肉桂酰酪胺已经在致病疫霉(Phytophthora infestans)感染的叶和悬浮培养的马铃薯细胞中被鉴定(Keller,et al.(1996)Phytochemistry 42:389-396)。马铃薯中致病疫霉(P.infestans)诱导的途径也已经显示出在对心叶烟(Nicotiana glutinosa)的激发子的响应和培养的细胞花菱草(Eschscholtziacalifornica)(Villegas&Brodelius(1990)Physiol.Plant.78:414-420)以及烟草(Nicotiana tabacum)(Negrel&Javelle(1995)Physiol.Plant.95:569-574)中的处理中发生。类似地，已经显示用丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)接种的番茄植物累积p-香豆酰酪胺和阿魏酰酪胺(Zacares,et al.(2007)Mol.PlantMicrobe Interact.20(11)1439-48)。
在本公开的方法中使用的合适的生物刺激的实例包括但不限于致病疫霉(Phytophthora infestans)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种(Erwinia carotovora subsp.Carotovora)、青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、链格孢属(Alternaria)、丝核菌属(Rhizoctonia)、核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、腐霉菌属(Phythium sp.)、黄萎病(Verticillium)、枯萎病(Fusarium wilt)、晚疫病(lateblight)、斑萎病毒(spotted wilt virus)、番茄花叶病毒(tomato mosaic virus)、果虫(fruitworm)、根结线虫(root-knot nematode)、马铃薯Y病毒、番茄黄化曲叶病(Tomatoyellow leaf curl)、番茄花叶病(Tomato mosaic)、番茄斑驳病(Tomato mottle)、黑胫病(black leg)、白粉病(powdery mildew)、粉痂病(powdery scab)、卷叶病毒(leafrollvirus)、Braephratiloides cubense和蓟马(thrips)。食品级真菌如酱油曲霉(Aspergillus sojae)也可用于增强酚类化合物的产生。
“非生物”胁迫或刺激被定义为非生命因素对活生物体的负面影响。在本公开的方法中使用的非生物胁迫的实例包括但不限于高渗胁迫如干旱或高盐，温度胁迫如冷或热，异常的营养条件，机械冲击，淹水，创伤，厌氧胁迫，氧化胁迫，臭氧，强光，重金属，毒性化学品，超声，紫外光，激发子壳聚糖处理、改性卵磷脂处理，脱落酸处理，假萌发及它们的组合。
举例而言，氮缺乏、温度和光已经显示出协同地增加番茄叶中酚类化合物的含量和基因表达(Lovdal,et al.(2010)Phytochemistry 71:605-613)。此外，在受伤的烟草(Hagel,&Facchini(2005)Planta 221:904-914)和马铃薯块茎盘(tuber discs)(Negrel,et al.(1993)J.Plant Physiol.142(5):518-524)中酪氨酸脱羧酶和酪胺羟基肉桂酰转移酶水平增加，同时在体内产生阿魏酸与酪胺或章胺的酰胺。此外，已经显示激发子壳聚糖处理增加马铃薯中的香豆酰酪胺(Schmidt,et al.(1999)J.Biol.Chem.274:4273-4280)。
高渗胁迫包括暴露于干旱、高盐或高溶质条件。尽管可以通过减少或消除植物接收的水量来实现干旱，但是高盐或高渗条件可以包括使植物暴露于含有例如至少150mMNaCl或至少300mM甘露糖醇的溶液中。通过将植物覆盖或浸没在水中，植物可以被淹没或浸透水中。
温度胁迫包括暴露于高温或低温。低温或冷冻胁迫可以是其中植物环境的平均温度为15℃或更低，并且还更严重地为5℃或更低，更严重地为10℃或更低的条件。高温胁迫可以是其中植物环境的平均温度为25℃或更高，更严重地为30℃或更高，并且还更严重地为35℃或更高的条件。
异常的营养条件是指高或低氮、磷、铁等。
术语“厌氧胁迫”是指足以产生如上文所定义的胁迫(包括缺氧和低氧)的氧水平的任何降低。
氧化胁迫是指增加活性氧物种的细胞内水平的任何胁迫。
创伤是天然植物、组织和/或细胞结构通过诸如切割、切片、磨削、挤压、破碎、剥离、压碎、按压、鞭打、研磨、流体注射、渗透性冲击、拆卸、切碎、摩擦、刺穿、掐捏和撕扯等方法的不可逆干扰。
据报道，紫外光是诱导酚类化合物增加的非生物胁迫。UVB已经是用于增加植物中苯酚抗氧化剂产生的最常用的辐射源。UVB光谱带(280-315μm)在阳光中贡献小于2％的短波光子。可以通过已知的方法完成在约10mW/cm2至约50mW/cm2的光范围内的UVB辐射的收获后施用(Huyskens-Keil(2007)J.Appl.Bot.Food Qual.81:140-144；Eichholz(2011)FoodChem.126:60-64)，根据已知方法在约1mW/cm2至约25mW/cm2的光范围内的UVC处理(100-280nm)也可用于诱导酚类物质的产生(Cantos,et al.(2000)J.Agric.Food Chem.48:4606-4612)。照射持续时间取决于UV强度，并且在某些实施方案中为约10分钟至约3小时，其中一些持续时间为30分钟至1小时。持续时间和强度可以使用本领域的常规技术来确定，并且将根据用于处理大量植物材料的商业设置而变化。在某些实施方案中，照射在约20-40℃的温度下进行。
假萌发或类似于或等同于发芽的假发芽处理描述了本领域技术人员实践的技术。然而，由于种子处于休眠状态，例如处于二级休眠状态，因此经受假发芽的种子不会萌芽。参见US 10,334,689 B2，通过引用并入本文。
对植物施加生物或非生物胁迫的步骤诱导关键酶的表达和/或增加酶底物的库，这又导致所需的化合物或通式I化合物的形成和累积。实际上，如本文提供的数据证实，发现马铃薯(Solanum tuberosum)块茎的创伤提供了N-反式-咖啡酰酪胺产量的33倍增加。
根据本公开的另一方面，通过使包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物或源植物材料与包含将一种或多种该前体转化成一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种内源酶的酶材料接触，提高植物或提取物中一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平。在某些实施方案中，提取物或源材料和酶材料获自不同来源，例如，相同植物的两种或更多种不同组织、来自两种或更多种不同植物的组织，或植物和微生物。在一些实施方案中，使包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的源材料与含有一种或多种内源酶的源材料接触，所述内源酶将所述一种或多种前体转化成一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。在另一个实施方案中，将包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的源材料与含有一种或多种内源酶的提取物接触，所述内源酶将一种或多种前体转化为一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。在另一个实施方案中，将包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物与含有一种或多种内源酶的提取物接触，所述内源酶将所述一种或多种前体转化为一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。
“提取物”是指含有所需目标化合物的组合物，所述目标化合物与从其中获得所述组合物的天然源材料中存在的其它物质分离。在一些实施方案中，天然源材料是植物、微生物或动物。在某些实施方案中，提取物是细菌提取物或真菌提取物。在其它实施方案中，提取物是植物提取物。植物提取物可以从任何植物组织中获得，包括全植物；植物部分，例如枝(shoot)营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种籽(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的卵巢)；植物组织(例如，脉管组织、基本组织等)；和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)，以及它们的后代和培养物或细胞系。在一些实施方案中，通常认为提取物对人类消费是安全的。因此，在某些实施方案中，提取物来自可食用源。在这方面，提取物是可食用的提取物。
提取物可以通过冷冻、研磨、浸渍、粉碎和/或发酵感兴趣的源材料，对源材料进行溶剂提取，并将不溶性材料与可溶性材料分离来制备。在这方面，本公开的“提取物”可以是粗制的、分级的、亚分级的、分离的(separated)、隔离的(isolated)、富集的或纯化的，但不限于此。术语“粗制的”是指化合物或分子未完全与该化合物或分子存在于其中的原始组合物的组分分离。在涉及级分或亚级分的实施方案中，可以对粗制的提取物中的分子进行部分分离以提供含有其它物质的较不粗制的提取物。通过比较，术语“分离的”是指化合物或分子相对于其天然存在的复杂的细胞环境(例如粗制的提取物中)基本上富集或纯化。当分离的分子被富集或纯化时，纯度的绝对水平不是关键的，并且本领域技术人员可以根据材料的用途容易地确定合适的纯度水平。在一些情况下，分离的分子形成组合物的一部分(例如含有许多其它物质的或多或少的粗制的提取物)，其可以例如含有其它组分。在其它情况下，可以将分离的分子纯化至基本均匀，例如通过分光光度法，通过NMR或通过色谱法(例如LC-MS)测定。
用于制备提取物的合适溶剂包括例如正戊烷、己烷、丁烷、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙腈、水、丁醇、异丙醇、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮、诺氟烷(HFA134a)、乙酸乙酯、二甲亚砜、七氟丙烷(HFA227)和亚临界或超临界流体，例如液体二氧化碳和水，或它们的任意比例的组合。当使用如上所列的溶剂时，所得提取物通常含有非特异性脂溶性物质。这可以通过各种方法除去，包括“冬化”，其涉及冷却至特定温度，通常-20℃，随后过滤或离心以除去蜡状稳定物(ballast)，用亚临界或超临界二氧化碳或非极性溶剂(例如己烷)萃取并通过蒸馏。
“包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物”是指包含图1中所示的一种或多种前体的提取物，即酪氨酸、苯丙氨酸、酪胺、肉桂酰辅酶A、肉桂酸酯、p-香豆酸、p-香豆酰辅酶A、咖啡酸、咖啡酰辅酶A、阿魏酸、阿魏酰辅酶A、芥子酸和/或芥子酰辅酶A。这些前体的任何天然来源可用于提供根据本公开的提取物。作为示例性说明，p-香豆酸的天然来源包括但不限于花生、菜豆、西红柿、胡萝卜、罗勒、大蒜和大麦。此外，咖啡酸的天然来源包括但不限于咖啡、姜黄、罗勒、百里香、牛至、鼠尾草、卷心菜、苹果、草莓、花椰菜、萝卜、大葱、蘑菇、甘蓝和梨。此外、阿魏酸的天然来源包括爆米花(popcorn)、番茄、大蒜、菜豆、竹笋和熟的甜玉米。此外，富含羟基肉桂酸的来源尤其包括谷物、谷类食品、水果、蔬菜和草本植物。干酪也是一种或多种前体的来源。
“包含将一种或多种前体转化成一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种内源酶的酶材料”是指内源性包括(例如，表达)图1中所示的一种或多种酶(即，PAL、C4H、4CL、C3H、CCoA3H、CCoAOMT、F5H、COMT、THT、TAL、PAH和/或TYDC)的级分、亚级分、提取物(如本文所述)、分离的酶、酶复合物、细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或植物组织培养物。虽然原则上可以使用任何植物来提供本公开的酶材料，但是已经显示酪胺的羟基肉桂酸酰胺已经显示在来自如下属的植物中合成，包括茄属植物(Solanum sp.)(例如，番茄、马铃薯、荨麻(nettle)、红辣椒(chili pepper)和茄子)，葱属植物(Allium sp.)(例如，大蒜、洋葱和韭菜)，蒺藜属植物(Tribulus sp.)(例如，蒺藜)和番荔枝属植物(Annona sp.)(例如，南美番荔枝(cherimoya)、释迦凤梨(custard apple)和番荔枝(sweetsop))。在所测试的植物物种中，发现大多数物种在乙醇提取物中以小于1重量％的滴度(titer)产生感兴趣的化合物(图2)。具体而言，发现刺果番荔枝(Annona muricata)(刺果番荔枝(Guanabana))产生最高水平的N-反式-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺，但仅产生低水平的N-反式-阿魏酰酪胺。通过比较，阿蒂莫耶番荔枝产生第二高滴度的N-反式-咖啡酰酪胺和高滴度的p-香豆酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺。此外，红马铃薯皮(Solanum tuberosum)含有痕量的N-反式-咖啡酰酪胺、高水平的N-反式-阿魏酰酪胺和最高滴度的p-香豆酰酪胺。大葱显示第二高的量的p-香豆酰酪胺(仅次于马铃薯皮)、中等水平的N-反式-阿魏酰酪胺和不可检测量的N-反式-咖啡酰酪胺。
此外，也可通过微生物催化的酪氨酸脱羧来产生酪胺。各种发酵微生物(尤其是乳酸菌)表达编码酪氨酸脱羧酶的tdcA基因。这种活性的实例是在乳酪产品中发现的由耐久肠球菌(Enterococcus durans)将酪氨酸生物转化为酪胺。
为了产生本公开的所期望的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺，某些实施方案包括使提取物或源材料与酶材料接触。在本公开的上下文中，“接触”是指将提取物或源材料和酶材料集合在一起以促进前体向一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的转化。在一些实施方案中，可以通过使提取物通过其上结合有酶材料的固体表面来实现接触。在其它实施方案中，可通过将提取物或源材料与表达一种或多种内源酶的微生物混合来实现接触，所述内源酶将一种或多种前体转化为一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。在某些实施方案中，将提取物或源材料与表达一种或多种内源酶的微生物混合，所述内源酶将一种或多种前体转化为一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺，还包括用酪氨酸补充该混合物。在另一个实施方案中，可通过将提取物或源材料与第二提取物(例如植物提取物)或包含一种或多种内源酶的源材料混合来实现接触，所述内源酶将一种或多种前体转化为一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。理想地，与没有与酶材料接触的相同提取物或源材料相比，提取物或源材料与酶材料的接触产生了提高的水平的一种或多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。在需要调节含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的生产的实施方案中，酶活性可以通过引入辅因子来增强，通过pH或温度来调节，和/或通过使酶经受酶失活步骤(例如热处理)来终止。
在一些实施方案中，源材料或提取物与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体的接触可进一步增强含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的产生。因此，在一些实施方案中，本公开的方法还提供使植物、源材料或提取物与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体接触，所述含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体包括但不限于酪氨酸、苯丙氨酸、酪胺、肉桂酰辅酶A、肉桂酸酯、p-香豆酸、p-香豆酰辅酶A、咖啡酸、咖啡酰辅酶A、阿魏酸、阿魏酰辅酶A、芥子酸和/或芥子酰辅酶A。
富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物可以照原样使用或通过沉淀、用活性炭处理、蒸发、过滤、色谱分离或其组合进一步处理。富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物理想地通过色谱分离获得。色谱分离通常包括柱色谱法，并且可以基于分子大小、电荷、溶解度和/或极性。根据色谱方法的类型，可以使用由例如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或二氧化硅组成的基质材料实施柱色谱法，并且可以包括溶剂如二甲亚砜、吡啶、水、二甲基甲酰胺、甲醇、盐水、二氯乙烷、氯仿、丙醇、乙醇、异丁醇、甲酰胺、二氯甲烷、丁醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃、二噁烷、氯仿/二氯甲烷等。
作为替代方案，或与色谱法结合，可以进行结晶以获得高纯度的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。通过改变温度和/或溶液的组成，例如通过除去乙醇，和/或调节pH以促进沉淀，随后过滤或离心所沉淀的晶体或油，来调节含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的溶解度。
通常，色谱步骤的产物以多个级分收集，然后可以使用任何合适的分析技术(例如，高压或中压色谱法、质谱)测试所需化合物的存在。然后可以选择富含所需化合物的级分用于进一步纯化。
作为示例性说明，通过研磨或粉碎植物材料，在室温下将植物材料用80％乙醇处理，过滤并浓缩80％乙醇提取物，将浓缩的提取物重新悬浮在水中，用己烷分配水溶液，向水层中加入氯仿，并将氯仿层用硅胶进行液相色谱法，获得含有N-反式-咖啡酰酪胺的提取物。参见例如Ko,et al.(2015)Internatl.J.Mol.Med.36(4):1042-8。
包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物可以使用常规技术例如高效液相色谱法(HPLC)或高效薄层色谱法(HPTLC)标准化。术语“标准化的提取物”是指通过鉴定提取物中存在的特征性成分或生物活性标记物而被标准化的提取物。表征可以例如通过分析光谱数据如质谱(MS)、红外(IR)和核磁共振(NMR)光谱数据来进行。
基本上纯的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺、含有含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物或具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的植物材料可掺入到可消费产品中以供个体消费或施用。合适的可消费产品包括但不限于膳食补充剂、食品成分或食品添加剂、食品(例如功能性食品)、医学食品、营养品或药物组合物。
使用本文所述的组合物和方法，可以制备富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的新制备的食品和饮料，其促进良好的代谢健康。因此，本公开还提供了用富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物或植物材料制备的可消费产品。可消费产品的实例包括但不限于膳食补充剂、食品成分或食品添加剂、食品(例如功能性食品)、医学食品、营养品或药物组合物。
食品成分或食品添加剂是旨在直接或间接导致其成为任何食物的组分或以其它方式影响任何食物的特性的可食用物质(包括旨在用于生产、制造、包装、加工、制备、处理、包装、运输或保存食物的任何物质)。食品，特别是功能性食品，是在加工过程中强化或富集的食品，包括另外的补充营养素和/或有益成分。根据本公开的食品可以例如是如下形式：黄油、人造黄油、甜味的或可口的涂抹物、饼干、健康棒、面包、蛋糕、谷类食物、糖果、糕点糖果、酸奶或发酵乳制品、基于果汁的饮料和基于蔬菜的饮料、奶昔、调味水、发酵饮料(例如，Kombucha(康普茶)或发酵的马黛茶)、方便的小吃如焙烤或油炸的蔬菜片或其它挤压的小吃产品，或任何其它合适的食品。
膳食补充剂是由口摄取的产品，其含有本公开的化合物或提取物并且旨在补充膳食。营养品是来源于食物来源的产品，除了在食物中发现的基本营养价值外，其还提供了额外的健康益处。药物组合物被定义为旨在在疾病的诊断、治愈、减轻、治疗或预防中提供药理学活性或其它直接作用，或影响人或其它动物的身体的结构或任何功能的药物产品的任何组分。膳食补充剂、营养品和药物组合物可以以许多形式存在，例如片剂、包衣片剂、丸剂、胶囊剂、小丸剂、颗粒剂、软凝胶剂、软胶囊剂、液体剂、粉末剂、乳剂、混悬剂、酏剂、糖浆剂和任何其它适合使用的形式。
在一些实施方案中，将包含酪胺的羟基肉桂酸酰胺的富集的提取物与载体组合。如本文所用，短语“载体”是指参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一个器官或身体的另一部分的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂包封材料。每种载体应该与制剂的其它成分相容并且对个体无害。可用作载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素和羟丙基甲基纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)表面活性剂，如卵磷脂；和(22)常规制剂中使用的其它无毒相容性物质。
为了制备固体组合物如片剂或胶囊剂，将富集的提取物与载体(例如，常规的制片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其它稀释剂(例如水)混合以形成固体组合物。然后将该固体组合物细分为含有有效量的本公开的化合物的单位剂型。含有化合物或提取物的片剂或丸剂可被包衣或以其它方式复合以提供具有延长的作用的优点的剂型。
其中掺入本公开的化合物或提取物的用于口服给药或肠胃外给药的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液和具有食用油的调味乳剂以及酏剂和类似媒介物。用于水性悬浮液的合适的分散剂或助悬剂包括合成的天然树胶，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以作为用于在使用前与水或其它合适的媒介物重组的干燥产品存在。这种液体制剂可以通过常规方法用可接受的添加剂制备，所述添加剂例如助悬剂(例如，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油酯或乙醇)；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；以及人造的或天然的颜色和/或甜味剂。
制备本公开的单剂量制剂或组合物的方法包括将本公开的富集的提取物与载体和任选的一种或多种辅助成分和/或活性成分结合的步骤。通常，通过将本公开的富集的提取物与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀地且紧密地结合，然后，如果需要，使产物成形来制备制剂。因此，所公开的制剂可以由本文所述的富集的提取物与合适的载体组合组成，或基本上由本文所述的富集的提取物与合适的载体组合组成。
当本公开的富集的提取物以药物、营养品或膳食补充剂的形式施用于人和动物时，它们可以作为包含例如0.1至99％的活性成分与可接受载体的组合的组合物形式施用。在一些实施方案中，所述组合物包含约10％至约30％的活性成分与可接受载体的组合。
可消费产品可由个体消费以每天提供少于100mg的本文公开的化合物。在某些实施方案中，可消费产品提供5-60mg/天的酪胺的羟基肉桂酸酰胺。有效量可以通过本领域研究中已知的方法确定，并且取决于生物利用度、毒性等。
尽管预期可消费产品含有多于一种的羟基肉桂酸酰胺，但也预期可消费产品仅包括单独的羟基肉桂酸酰胺。还预期一种或多种提取物可以以任何相对量组合以产生含有所需比例的两种或更多种含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的成分的定制组合，以增强产品功效，改善感官特性或改善对产品最终使用重要的一些其它质量测量值。
本公开的方法有利地提供了较低成本的生产，其赋予了生产比某些高等植物物种中天然存在的酪胺的羟基肉桂酸酰胺更高滴度的酪胺的羟基肉桂酸酰胺的能力，从而降低下游加工和纯化成本。此外，使用本公开的方法，与在某些高等植物物种中发现的组合物相比，可以产生定制的、更有效的组合物。实际上，可以用通式I化合物的定制组合生产组合物。此外，可以在加工过程中处理植物以促进例如THT的更大活性，以及促进更大的底物库的生产。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步示例性说明本公开内容。
实施例1：含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的来源
从各种植物物种及其植物组织中制备乙醇提取物。通过用95％乙醇水溶液提取干燥植物粉末材料来鉴定提取物中的各个化合物。将乙醇提取物浓缩并吸附到
Figure BDA0003737885440000301
(硅藻土)上，并干燥装载到C18固相提取柱上。通过用两个柱体积的水洗涤将提取物脱盐，收集并弃去水。用两个柱体积的甲醇洗脱化合物，并将提取物浓缩至干。在分析之前，将提取物重悬于1:1的乙腈：水中。已知浓度的合成标准物用于在分析之前产生校准曲线。该分析的结果示于表1中。
表1
Figure BDA0003737885440000302
Figure BDA0003737885440000311
测定存在于某些乙醇提取物中的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的量(提取物的％，w/w)。通过用乙醇提取物的重量归一化结果进行化合物的定量。这些分析的结果示于图2中。
随后对另外的植物组织的分析鉴定了N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的另外的植物来源(包括在表1中)。这种第二分析与第一分析类似地进行，但是采用不同的且更灵敏的分析仪器，其允许直接分析C18甲醇洗脱液，而不需要浓缩步骤。这些结果显示在图3中。通过用于提取的干燥植物材料的质量(kg)将提取的每种化合物的质量(mg)归一化。
实施例2：具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物
含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的高等植物源的初始分析表征指示这些化合物的广泛变化的水平(图2)。已知催化使底物置于特定的下游代谢途径的生化反应的代谢分支点通常是感兴趣的产物的总体生化合成中的速率确定步骤。假定THT步骤是含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的生物合成中的速率确定步骤。此外，据信该反应的速率是一级底物-限制的和二级酶-限制的。
因此，为了产生具有较高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的提取物，将富含目标底物，特别是羟基肉桂酸衍生物或目标衍生物和/或富含酪胺的源的植物源与含有THT酶的植物组织源接触。THT酶的植物组织源包括Annona sp.,A.montana(山金车种)(mountainsoursop(山刺果番荔枝))、A.muricata(刺果番荔枝)和A.cherimola(秘鲁番荔枝)、蒺藜、Alli um sp.(葱属植物)、A.sativa(大蒜)和A.fistulosum(大葱)、Solanum lycopersicum(番茄)、Capsicum sp.(辣椒)、C.annuum(塞拉诺辣椒(Serrano pepper))和C.frutescens(灌木辣椒)(Piri Piri辣椒)。
将含有THT的植物源和含有羟基肉桂酸衍生的底物的植物源在与THT酶的最佳活性所需的温度和pH条件类似的条件下，即30℃和8.5的pH下培育。更一般地，使用25-37℃的温度和6.5-9.5的pH进行培育。举例来说，通过在30℃和8.5的pH下将含有THT的植物组织与咖啡酰辅酶A源(例如蒺藜、山刺番荔枝、刺果番荔枝或秘鲁番荔枝)一起培育1小时来产生富含N-反式-咖啡酰酪胺的成品食品或饮品。类似地，富含N-反式-阿魏酰酪胺、N-反式-香豆酰酪胺或N-反式-肉桂酰酪胺的成品食品或饮品通过含有THT的植物组织分别与富含阿魏酸、富含酸或富含肉桂酸的源一起来产生。
发酵的饮品或食品也可以使用产生酪胺的微生物(包括乳酸菌)以及一种或多种羟基肉桂酸、酪氨酸和THT酶的源来产生。
实施例3：创伤诱导N-反式-阿魏酰酪胺的产生
含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的高等植物源的初始分析表征指示变化的水平。已知催化使底物置于特定的下游代谢途径的生化反应的代谢分支点通常是感兴趣的产物的总体生化合成中的速率确定步骤。假定THT步骤是含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的生物合成中的速率确定步骤。此外，据信该反应的速率是一级底物-限制的和二级酶-限制的。因此，通过使植物经受非生物胁迫(例如，创伤)，确定是否可以原位产生升高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺。特别地，通过创伤使马铃薯的黄色块茎受创，并且在受创后1、5和9天评估块茎中N-反式-阿魏酰酪胺的产生。该分析的结果表明，植物组织的物理创伤导致N-反式-阿魏酰酪胺产量增加33倍(图4)。与黄色马铃薯块茎相似，白色的黄褐色马铃薯皮、黄金马铃薯皮和紫色马铃薯皮的创伤导致处理后14天时段内N-反式-阿魏酰酪胺产量增加178倍、13倍和9倍。进一步的分析表明需要氧气，即，马铃薯不能被浸没，柠檬酸/NaCl对创伤反应没有不利影响，并且提供另外的底物(酪胺)增强了创伤反应。
实施例4：UV-C辐射诱导N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的产生
测定辐射对含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺水平的影响。特别地，将胡椒籽暴露于UV-C辐射15或30分钟，在室温下培育6小时，随后测定N-反式-阿魏酰酪胺的产生。该分析的结果显示，在暴露于UV-C辐射15分钟后，N-反式-阿魏酰酪胺产量略微增加(图5A)。
使用刺果番荔枝叶或大葱进行类似的分析。在该分析中，将新鲜植物材料经受直接的UV-C辐射15分钟，随后在黑暗中培育(对于刺果番荔枝培育约5小时，以及对于大葱培育过夜)。该分析的结果表明，UV-C暴露诱导了N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺产量的50-300％增加(图5B)。
实施例5：假萌发诱导N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的产生
测定假萌发对大麻籽中含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺水平的影响。将烘烤的大麻籽在蒸馏水中浸泡过夜。将水排出，并将种籽在新鲜蒸馏水中每天冲洗2次，持续5天。在实验的时间过程中将种籽保持在潮湿黑暗的环境中，并且每天收集种籽样品。对于收集的每个样品，将种籽干燥、破碎并用己烷处理以除去脂肪。随后研磨该材料并分析N-反式-阿魏酰酪胺、p-香豆酰酪胺或N-反式-咖啡酰酪胺的产生。这种分析表明，N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的峰值诱导在第2天(1.7倍增加；图6)，尽管甚至在过夜浸泡后紧接着第1天观察到这些化合物的富集。
另外的研究表明，初步干燥烘烤温度和蒸馏水浸泡温度影响所实现的富集程度(图7)。将浸泡温度从20℃提高到30℃使得N-反式-阿魏酰酪胺、N-反式-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺的组合富集比对照大25％提高到比对照大47％。同时，在蒸馏水(保持在30℃)中浸泡过夜之前，在100℃下再烘烤种籽10分钟将所实现的富集程度降低到12％，这可能是因为这样的烘烤条件使在假萌发过程中起关键作用的酶失活。
实施例6：组合胁迫诱导N-反式-阿魏酰酪胺的产生
已证实，创伤可以增加N-反式-阿魏酰酪胺的产生，确定创伤与THT酶激发子组合是否可以进一步提高N-反式-阿魏酰酪胺的产生。对于这种分析，将红马铃薯切成标准厚度。随后，将马铃薯切片浸入10mg/ml活的内生菌根真菌、10mg/ml灭活的cordy-gen真菌(来自Mycopia)、1mg/ml昆布多糖(来自褐藻的多糖)或水(对照)的溶液中。将马铃薯切片松散地覆盖以允许空气流动，并在室温下培育4或8天。该分析的结果表明，尽管创伤与昆布多糖暴露的组合显著增强了N-反式-阿魏酰酪胺的产生，但创伤与cordy-gen的组合提供了一些增强，以及活的内生菌根抑制了N-反式-阿魏酰酪胺响应于创伤的产生(图8)。
实施例7：创伤和前体暴露诱导N-反式-阿魏酰酪胺的产生
已经证实创伤可以增加N-反式-阿魏酰酪胺的产生，确定创伤与暴露于N-反式-阿魏酰酪胺的前体的组合是否可以进一步提高N-反式-阿魏酰酪胺的产生。对于该分析，将红马铃薯切成标准厚度(1/4英寸；两片马铃薯/时间点)。随后，将马铃薯切片或者在水中煮沸6分钟，或者浸入400μM酪胺(作为前体)或柠檬酸(pH～4；作为防腐剂)的水溶液或水(对照)中。将马铃薯切片松散地覆盖以允许空气流动，并在室温下培育4天。该分析的结果表明，创伤和酪胺暴露的组合可以提高N-反式-阿魏酰酪胺的产生至第4天，而柠檬酸的影响不大(图9)。值得注意的是，尽管酪胺浸渍进一步增加了受创的马铃薯切片的褐变，但柠檬酸抑制褐变途径而不影响N-反式-阿魏酰酪胺的产生。
实施例8：评估胁迫诱导的酶活性的增加
生物和/或非生物胁迫可用于人工诱导参与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的酶的更大丰度和活性，人工诱导的增加的底物供应，或两者。响应于生物和/或非生物胁迫的酶活性评估可以如下进行。
在含有100mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0和酶提取物的混合物(250μL)中测定PAL活性。通过添加150μL的200mg mL-1L-苯丙氨酸(终浓度：6mg mL-1)引发反应，并且在ΔA290下在10分钟内测量肉桂酸的产生。
在含有100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)、1mM DTT、1mM NADPH和100μL酶提取物的混合物(250μL)中测定C4H活性。通过加入10mM反式肉桂酸(终浓度1mM)引发反应，并在10分钟内记录290nm处的吸光度变化。
在室温下使用分光光度测定(Knobloch&Hahlbrock(1977)Hoffm.Arch.Biochem.Biophys.184:237-248)测量CoA酯的形成，测定4CL活性，如前所述(Lee&Douglas(1996)Plant Physiol.112:193-205)。
使用已知方法(Hohlfeld,et al.(1995)Plant Physiol.107:545-552)测定THT活性。其活性的测定通过HPLC偶联光电二极管阵列检测来完成(Schmidt,et al.(1998)Planta 205:51-55)。
酶活性表示为提取物的蛋白质浓度的函数，使用Bradford方法(Bradford(1976)Anal.Biochem.72:248-54)测定并计算酶活性。将获得的酶活性相对于对照样品归一化并计算归一化值的倍数变化。

Claims (34)

1.用于产生具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的可消费产品的方法，所述方法包括：
(a)使用于产生通式I化合物的植物经受至少一种生物或非生物胁迫
Figure FDA0003737885430000011
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基；虚线键存在或不存在；
X是CH2或O；
Z是CHRa、NRa或O；以及
Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基，
虚线键存在或不存在；以及
(b)将所述植物或提取物并入可消费产品中。
2.用于产生具有提高水平的含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的可消费产品的方法，所述方法包括：
(a)使用于产生通式II化合物的植物经受至少一种生物或非生物胁迫，
Figure FDA0003737885430000021
其中
R1、R2和R3各自独立地存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子(例如，2、3和/或4位)上的取代基，并且对于每个环原子独立地是羟基、卤素基团、取代或未取代的低级烷基或者取代或未取代的低级烷氧基，
虚线键存在或不存在；以及
(b)将所述植物或提取物并入可消费产品中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括从所述植物中回收提取物。
4.如权利要求1或2所述的方法，其还包括使所述植物与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体接触。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物胁迫是假萌发。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物或非生物胁迫在收获后施用。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物或非生物胁迫在收获前施用。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述非生物胁迫选自高渗胁迫、盐胁迫、温度胁迫、异常的营养条件、机械冲击淹水、创伤、厌氧胁迫、氧化胁迫、臭氧、强光、重金属、毒性化学品、超声、紫外光、激发子壳聚糖处理、改性卵磷脂处理或脱落酸处理中的至少一种。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述任选地从所述植物回收提取物包括乙醇提取物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述植物选自蒺藜(Tribulusterrestris)、山刺番荔枝(Annona montana)、刺果番荔枝(Annona muricata)、秘鲁番荔枝(Annona cherimola)、阿蒂莫耶番荔枝(Annona atemoya)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大麻(Cannabis sativa)、枸杞(Lycium barbarum)、大蒜(Allium sativum)、番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、小米椒(Capsicum frutescens)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番荔枝(Annona spp.)、枸杞(Lycium barbarum)、甘薯(Ipomoeabatatas)、玉米(Zea Mays)、胡椒(Piper nigrum)、土荆芥(Dysphania ambrosioides)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、墨西哥叶胡椒(Piper auritum)、番茄(Solanumlycopersicum)或葱(Allium fistulosum)中的至少一种。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述化合物选自p-香豆酰酪胺、n-咖啡酰酪胺、n-阿魏酰酪胺和芥子酰酪胺。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述n-阿魏酰酪胺的产率大于1000mg/kg所述植物。
13.如权利要求11的方法，其中所述p-香豆酰酪胺的产率大于50mg/kg所述植物。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物或非生物胁迫包括在约25℃至约37℃和6.5至约9.5的pH下培育所述植物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种生物或非生物胁迫包括在约30℃和约8.5的pH下培育所述植物。
16.如权利要求8所述的方法，其中所述非生物胁迫是物理创伤，并且所述通式I化合物是n-阿魏酰酪胺。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述物理创伤增加n-阿魏酰酪胺增加至少9倍。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述物理创伤增加n-阿魏酰酪胺增加至少13倍。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述物理创伤增加n-阿魏酰酪胺增加至少33倍。
20.如权利要求8所述的方法，其中所述非生物胁迫是紫外光，并且所述通式I化合物是n-阿魏酰酪胺、n-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述植物暴露于紫外光约15分钟至约30分钟。
22.如权利要求8所述的方法，其中所述非生物胁迫是温度胁迫，并且所述通式I化合物是n-阿魏酰酪胺、n-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述温度胁迫将n-阿魏酰酪胺、n-咖啡酰酪胺和p-香豆酰酪胺的产量从约25％增加至约47％。
24.通过权利要求1至23中任一项所述的方法产生的可消费产品。
25.如权利要求24所述的可消费产品，其中所述可消费产品是膳食补充剂、食品成分、食品添加剂、食品、饲料产品、医疗食品、营养品或药物组合物。
26.富含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的组合物，其包含：
包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物或源材料，其中所述提取物或源材料已经与酶材料接触，其中所述酶材料包含一种或多种能够将所述一种或多种前体转化成所述含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的内源酶。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述酶材料包含苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸酯辅酶A连接酶、肉桂酸酯-4-羟化酶、香豆酸酯-3-羟化酶、香豆酰辅酶A 3-羟化酶、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶、阿魏酸酯-5-羟化酶、咖啡酸/5-羟基阿魏酸O-甲基转移酶、酪氨酸氨裂合酶或它们的组合。
28.如权利要求26所述的组合物，其中所述含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺为N-咖啡酰酪胺、N-阿魏酰酪胺、5-羟基阿魏酰酪胺、p-香豆酰酪胺、肉桂酰酪胺、芥子酰酪胺或它们的组合。
29.如权利要求25所述的组合物，其中所述组合物是可消费产品。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述可消费产品是膳食补充剂、食品成分、食品添加剂、饲料产品、食品、医疗食品、营养品或药物组合物。
31.用于提高提取物或源材料中含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平的方法，所述方法包括：
使包含含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的一种或多种前体的提取物或源材料与酶材料接触，其中所述酶材料包含一种或多种能够将所述一种或多种前体转化成所述含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的内源酶，
从而提高所述提取物或源材料中含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的水平。
32.如权利要求31所述的方法，还包括使所述提取物或源材料与含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺的前体接触。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述含有羟基肉桂酸酰胺的酪胺是通式I化合物
Figure FDA0003737885430000061
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基；虚线键存在或不存在；
X是CH2或O；
Z是CHRa、NRa或O；以及
Ra选自氢、氘、羟基、卤素、氰基、硝基、任选取代的氨基、任选取代的C-酰氨基、任选取代的N-酰氨基、任选取代的酯、任选取代的-(O)C1-6烷基、任选取代的-(O)C1-6烯基、任选取代的-(O)C1-6炔基、任选取代的-(O)C4-12环烷基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12环烷基、任选取代的-(O)C4-12杂环基、任选取代的-(O)C1-6烷基C4-12杂环基、任选取代的-(O)C4-12芳基、任选取代的-(O)C1-6烷基C5-12芳基、任选取代的-(O)C1-12杂芳基和任选取代的-(O)C1-6烷基C1-12杂芳基，
虚线键存在或不存在。
34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述源材料选自蒺藜(Tribulusterrestris)、山刺番荔枝(Annona montana)、刺果番荔枝(Annona muricata)、秘鲁番荔枝(Annona cherimola)、阿蒂莫耶番荔枝(Annona atemoya)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大麻(Cannabis sativa)、枸杞(Lycium barbarum)、大蒜(Allium sativum)、番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、小米椒(Capsicum frutescens)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番荔枝(Annona spp.)、枸杞(Lycium barbarum)、甘薯(Ipomoeabatatas)、玉米(Zea Mays)、胡椒(Piper nigrum)、土荆芥(Dysphania ambrosioides)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、墨西哥叶胡椒(Piper auritum)、番茄(Solanumlycopersicum)或葱(Allium fistulosum)中的至少一种。
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