KR100589352B1

KR100589352B1 - 구기자나무에서 추출한 다이하이드로-ν-카페요일티라민을함유하는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR100589352B1
Application number: KR1020040016182A
Authority: KR
Inventors: 정혜광; 우은란
Original assignee: 학교법인조선대학교
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2006-06-14
Also published as: KR20050091116A

Abstract

본 발명은 구기자나무(Lycium chinense miller)에서 추출한 하기 화학식 1로 표현되는 다이하이드로-N-카페요일티라민(dihydro-N-caffeoyltyramine) 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다:

[화학식 1]

다이하이드로-N-카페요일티라민, 트랜스-N-카페요일티라민, 시스-N-카페요일티라민, 항염증 제제, COX-2, 구기자나무

Description

구기자나무에서 추출한 다이하이드로-Ν-카페요일티라민을 함유하는 항염증용 조성물{Pharmaceutical composition for anti-inflammation formation comprising dihydro-N-caffeoyltyramine isolated from the root bark of Lycium chinense Miller}

도 1은 LPS에 의하여 유도되는 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 반응 산물인 프로스타그란딘 E2 (prostaglandin E₂:PGE₂) 생성의 화학식 1의 화합물에 의한 농도 의존적 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 2는 lipopolysaccharid(LPS)에 의하여 유도되는 사이클로옥시게나아제 Ⅱ (cyclooxygenase-2: COX-2)의 mRNA 생성의 화학식 1의 화합물에 의한 농도 의존적 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 3은 LPS에 유도되는 사이클로옥시게나아제 Ⅱ (COX-2) 전사인자의 활성도의 화학식 1의 화합물에 의한 농도 의존적 감소 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate ; TPA)에 유도되는 AP-1 전사인자의 활성도의 화학식 1의 화합물에 의한 농도 의존적 감소 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 in vivo 실험동물 기낭(air pouch) 모델을 도입하여 카라기난(carrageenan)에 의하여 유도되는 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 반응 산물인 PGE₂ 생성의 화학식 1의 화합물에 의한 농도 의존적 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 6은 in vivo 실험동물 기낭(air pouch) 모델을 도입하여 카라기난에 의하여 유도되는 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 mRNA 생성의 화학식 1의 화합물에 의한 농도 의존적 억제 효과를 나타낸 것이다.

[화학식 1]

Lycium chinense miller(구기자나무)의 열매와 껍질은 약용(강장제), 어린 순은 식용 또는 차의 원료로 쓰이며, 한방과 민간에서 열매·잎·뿌리껍질을 세안( 洗眼), 소염, 해열, 강장, 당뇨병, 치통, 음양(陰痒), 근골(筋骨) 등에 약재로 쓴다. 명나라 이시은이 지은 본초강목에 구기자는 독성이 없고 열을 식히고 체내에 쌓인 사기(邪氣), 흉부(胸部)의 염증 소갈과 당뇨병, 관절 류마티스 신경통 등에 좋으며 오래 복용하면 근육을 건전하게 하고 전신이 상쾌하고 더위와 추위를 모르는 젊음을 찾는다고 기재되어 있다.

현대의 구기자나무 열매, 껍질에 관한 학자들의 임상보고에 의하면 고혈압, 저혈압, 변비 간장병, 신경통, 류마티스, 발육촉진, 피로회복, 신체의 활력 등 이외에도 많은 효과가 있다. 구기자나무의 함유 성분 중 베타인(betaine)은 간장에 지방질이 엉키는 것을 예방하며 지방간을 치유하는 작용이 있다.

최근 과학적인 연구결과에 의하면 첫째, 구기자의 물 추출물은 항균효과가 있음이 밝혀졌다. J. Korean Soc. Food Nutr. 21(1) 91-96 1992 에서의 보고에 의하면 구기자 추출물이 그램 양성균 및 음성균, 대장균, 효모와 곰팡이에 MIC(minimum inhibition concentration) 테스트를 한 결과 그램 양성 및 음성균에 모두 증식 억제력이 있고 곰팡이와 효모에 대한 항균 작용은 없다. 그리고 에탄올 추출물은 항균효과가 나타나지 않으나 지골피의 에탄올 추출물은 그램 양성균인 Staphylococcus aureus에 대하여 항균효과를 나타내고 있다.

둘째는 항암효과를 들 수 있다. 구기자의 항암효과에 대해서 이상래 박사의 연구결과 구기자 < 구기엽 < 지골피 순으로 항암효과가 강함을 알 수 있다. 지골피 추출물이 암세포에 대한 저해농도 IC50값은 13 ㎍/ml로 오미자(27 ㎍/ml), 백작약(46 ㎍/ml)보다 강하고 시호(10.2 ㎍/ml)보다는 약하다.

셋째는, 면역 증진 효과를 들 수 있다. 경희대 한의과 대학의 구기자의 면역반응에 미치는 영향이라는 보고(경희한의대논문집 10, 579-587.1987)에서는 세포성 면역반응을 증강시킨다고 하였다.

넷째는 간기능 개선, 혈압강하 및 항당뇨 효과를 들 수 있다. 조선대학교 서화중(1985)의 박사학위 논문에서 알록산(alloxan)으로 유발된 토끼의 고혈당에 대하여 아주 탁월한 혈당저하 효과를 나타냈다. 또 구기자의 메탄올 추출물에서 인위적으로 손상시킨 간의 회복도를 촉진시킴이 밝혀졌다.

마지막으로 항산화 효과를 들 수 있다. 구기자의 효능 중 장수에 관한 언급이 많은데 이는 노화방지 효능인 항산화 개념으로 이해할 수 있다. 자유 라디칼의 소거 작용, 리놀레산(linoleic acid)을 기질로 한 지질산화 억제효과 및 이에 따른 경시적인 말돈알데히드(maldonaldehyde) 생성 억제효과와 노화방지 효소인 SOD(superoxide dismutase)와 POD(peroxid ase)의 활성을 비교한 결과 우선 DPPH에 의한 자유 라디칼(free radical)의 50%를 소거시키는 농도인 RC50 값을 측정한 결과 구기자가 1,140㎍, 구기엽은 268㎍ 및 지골피는 15㎍으로 지골피가 가장 활성이 높았다. 구기자 추출물의 과산화물가(peroxide value, POV)를 측정한 결과 지질산화 억제율이 최고 53% 까지 나타나 항산화 효과가 강하였다.

프로스타글란딘(Prostaglandin) 합성의 주요 효소인 사이클로옥시게나아제(COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘(PGs)을 생합성하는 데에 관여하는 효소로 사이클로옥시게나아제 I과 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 2가지 동종효소(isoform)가 존재한다. 사이클로옥시게나아제 I은 구성효소(constitutive enzyme)로서 위 점막상피(mucosal epithelium)의 무결성(integrity) 유지 등의 역할을 담당하는 보호용 PGs을 생성하여 정상적인 생리적 기능(physiological function)에 기여하며, 사이클로옥시게나아제 Ⅱ는 유도효소(inducible enzyme)로서 염증과 발암 등을 유도한다(Vane et al., 1998; Dubois et al., 1998; Vane, 1994). 사이클로옥시게나아제 I (COX-1)과 사이클로옥시게나아제 Ⅱ (COX-2)를 모두 저해하면 생리기능에 필요한 프로스타글란딘 (prostaglandins) 의 생성이 저해되어 위궤양과 같은 여러 부작용을 나타내게 되지만, 사이클로옥시게나아제 Ⅱ에 대한 선택적 저해제는 부작용이 적은 항염증 작용을 가질 수 있으므로 항염증제의 좋은 소재가 될 수 있다(Vane et al., 1998; Masferrer et al., 1994; Chan et al., 1995). 이러한 사이클로옥시게나아제 I 및 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 작용기작을 선택적으로 조절하고 염증유도 인자발현에 주요작용 전사인자 AP-1 등의 활성화를 억제할 수 있는 소재가 개발된다면 보다 적은 부작용으로 보다 효율적인 치료를 할 수 있는 치료제의 개발이 가능 할 것으로 사료된다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 항염증 효과를 갖는 제제를 찾던 중 구기자나무(Lycium chinense miller)에서 분리한 다이하이드로-N-카페요일티라민에서 탁월한 항염증 효과를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 안전하고 독성이 없는 천연물인 구기자나무에서 분리한 다이하이 드로-N-카페요일티라민이 염증 관련 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 발현과 염증유도 인자발현에 주로 작용하는 주요작용 전사인자 AP-1 등의 활성화를 억제시킴으로써, 적은 부작용으로 큰 효과를 나타내는, 새로운 개념의 항염증 효과를 지닌 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 구기자나무(Lycium chinense miller)에서 추출한 하기 화학식 1로 표현되는 다이하이드로-N-카페요일티라민(dihydro-N-caffeoyltyramine)를 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다:

본 발명에서 사용하는 구기자나무는 마을 근처의 둑이나 냇가에서 자란다. 높이는 1∼2m 정도이나 다른 물체에 기대어 자란 것은 4m에 이르기도 한다. 줄기는 비스듬히 자라고 끝이 밑으로 처진다. 흔히 가시가 있으나 없는 것도 있다. 잔가지는 노란빛을 띤 회색이고 털이 없다. 잎은 어긋나는데, 여러 개가 뭉쳐나고 넓은 달걀 모양 또는 달걀 모양 바소꼴이다. 끝은 뾰족하고 밑부분이 넓거나 좁으며 양면에 털이 없다. 잎자루의 길이는 1cm 정도이며 털이 없다.

6∼9월에 자줏빛 꽃이 1∼4개 잎겨드랑이에서 나와서 피고, 화관은 종 모양으로 5갈래로 갈라지며 끝이 뾰족하다. 작은꽃자루는 길이 3∼8mm이며, 꽃받침은 3∼5개로 갈라진다. 수술은 5개이고 암술은 1개이다. 열매는 장과로 달걀 모양 또는 타원형으로 8∼9월에 붉게 익는다.

어린 잎은 나물로 쓰고 잎과 열매는 차로 달여 먹거나 술을 담그기도 한다. 한방에서는 가을에 열매와 뿌리를 채취하여 햇볕에 말려 쓰는데, 열매를 말린 것을 구기자라 하고 뿌리껍질을 말린 것을 지골피(地骨皮)라 한다. 지골피는 강장·해열제로 폐결핵·당뇨병에 쓰고, 구기자로는 술을 담가 강장제로 쓴다. 잎도 나물로 먹거나 달여 먹으면 같은 효과가 있다. 민간에서는 요통에 지골피를 달여 먹는다. 한국(진도군·충청남도), 일본, 타이완, 중국 북동부 등지에 분포한다.

또한 본 발명은 구기자나무(Lycium chinense miller)에서 추출한 하기 화학식 2로 표현되는 다이하이드로-N-카페요일티라민(dihydro-N-caffeoyltyramine)의 유도체인 N-카페요일티라민을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다:

본 발명에 의한 다이하이드로-카페요일티라민 또는 그 유도체의 함유량은 항염증 조성물 총 중량에 대하여 0.01∼5 중량%의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항염증용 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균 상태의, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태 등의 경구용 제형으로 제형화할 수도 있고, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수도 있다.

경구용 제형의 경우는 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 부형제(forming agent)를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산 가능한 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태의 경구형 제형으로 제제화될 수 있으며, 이는 단위 투여량, 형태 등에 따라 알맞게 제조할 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용 가능한 희석제 (diluent)나 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매로는 물, 링거액 그리고 등장성 식 염수 용액이 있으며, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터 또는 폴리에틸렌글리콜 등과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 다이하이드로-N-카페요일티라민 및 그 유도체의 분리

Lycium chinense Miller(가지과)의 뿌리 껍질인 지골피는 광주광역시 소재 진원당 제약에서 구입하였고, 조선대학교 약학과 생약학 교실에서 엄밀한 감정을 거쳐 실험재료로 사용하였다.

지골피 800g을 상온에서 메탄올 1.8 L로 추출한 다음 감압농축하여 용매를 날리고, 얻어진 메탄올 추출물을 물에 현탁한 후 CH₂Cl₂, EtOAc 및 n-BuOH로 차례로 분획하였다. 활성을 나타낸 에틸아세테이트 분획 3.0g을 CH₂Cl₂-MeOH-H₂O = 8:1:0.1 → 6:1:0.1 → 4:1:0.1 → 2:1:0.1 → MeOH only의 혼합용매의 극성을 점진적으로 높여가면서 실리카겔 컬럼크로마토그라피를 실시하였다. 컬럼크로마토그라피 결과 TLC 패턴을 기점으로 소분획 E1-E8로 나누었다. 각 소분획에 대한 활성을 검색한 결과 활성은 subfraction E4로 모아져 이 분획을 다시 CH₂Cl₂-MeOH-H₂O = 8:1:0.1 →6:1:0.1 →3:1:0.1 →1:1:0.1 →MeOH only)의 혼합용매를 사용하여 실리카젤 컬럼크로마토그라피를 실시하여 TLC 패턴을 기점으로 소분획 E41-E47로 나누었다. 얻어진 소분획 E43을 CH₂Cl₂-MeOH-H₂O의 혼합용매와 iso PrOH-MeOH-H ₂O의 혼합용매를 이용한 분취 고속액체크로마토그라피를 실시하여 정제된 다이하이드로-N-카페요일티라민 0.106g, trans-N-카페요일티라민 0.0148g 및 cis-N-카페요일티라민 0.009g을 얻었다.

상기에서 분리한 다이하이드로-N-카페요일티라민의 UV, IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, MS, HR-MS를 포함하는 물리화학적 데이터는 다음과 같다 (Chen et al., 1998; Han et. al., 2002).

C₁₇H₁₉NO₄ (M.W. 302) light yellow flakes; m.p. 162-164 ℃; UV(MeOH) λ_max nm (logε): 220 (4.44), 282 (1.18); IRν_max (KBr) cm^-1: 3310, 2974, 1612, 1516, 1447, 1362, 1242; EIMS m/z (rel. int.): 301 (M+ 1.9 %), 182 (18.3), 136 (28.0), 107 (100.0); HR-FABMS m/z: 302.1386 (calcd. for C₁₇H₂₀NO₄ : 302.1392).

¹H-NMR (CD₃OD, 500 MHz) δ 6.63 (d, J=1.5 Hz, H-2), 6.67 (d, J=8.5 Hz, H-5), 6.50 (dd, J=8.5, 1.5 Hz, H-6), 2.73 (t, J=7.5 Hz, H-7), 2.37 (t, J=7.5 Hz, H-8), 6.94 (d, J=8.5 Hz, H-2', 6'), 6.69 (d, J=8.5 Hz, H-3', 5'), 2.60 (t, J=7.5 Hz, H-7'), 3.29 (t, J=7.5 Hz, H-8').

¹³C-NMR (CD₃OD, 125MHz) δ 132.61(C-1, s), 115.17(C-2, d), 143.45(C-3, s), 145.02(C-4, s), 115.39(C-5, d), 119.46(C-6, d), 31.27(C-7, t), 38.25(C-8, t), 174.26(C-9, s), 130.15(C-1', s), 129.56(C-2', d), 115.03(C-3', d ), 156.64(C-4', s), 115.03(C-5', d), 129.56(C-6', d), 34.53(C-7', t), 41.13(C-8', t).

< 하기 시험예들에서 사용한 실험 동물 및 처리방법은 아래와 같다 >

1. 시약

RAW264.7 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였고, 매트리겔(Matrigel), 헤마톡실린(Hematoxylin), 에오신(Eosin), 젤라틴(Gelatin), EMEM 배양액, 트립신(Trypsin), 우태아 혈청(Fetal bovine serum)은 시그마사(Sigma chemical co.)에서 구입하였다.

2. 동물

시험동물은 생후 8주된 25∼30g의 실험용 마우스(C57BL/6 mouse)를 사용하였고, 사료(purina korea)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21∼24℃, 상대습도는 40∼80%로 유지하였다. 또한 12 시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다.

[시험예 1] 구기자나무(Lycium chinense miller)에서 분리한 다이하이드로-N-카페요일티라민의 PGE₂ 생성량 조사

다이하이드로-N-카페요일티라민의 PGE₂ 생성량을 조사하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 48웰 플레이트에 계대 배양한 후 LPS 0.5㎍/㎖ 와 함께 다이하이드로-N-카페요일티라민을 0, 1, 5, 10μM 씩 농도별로 처리한 다음 24시간 후에 PEG₂ 생성량의 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었고, LPS를 대조군으로 하여 LPS와 다이하이드로-N-카페요일티라민을 동시 처리한 결과를 비교하였다. 이때, 시료 무처리 군(NA)은 이미 알려진 염증 유발 물질인 LPS 처리시 PEG₂ 생성량의 증가를 보여주기 위한 것이다.

상기 도 1에서 알 수 있듯이, RAW 264.7 세포에 염증 유발물질로 잘 알려진 LPS를 처리하면 24 시간 후에 PGE₂생성이 크게 증가하였으나, LPS와 다이하이드로-N-카페요일티라민를 동시에 처리하였을 때 다이하이드로-N-카페요일티라민의 처리농도에 비례하여 PGE₂생성이 농도 의존적으로 저해됨을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 다이하이드로-N-카페요일티라민의 염증관련 유전자 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 발현 측정

다이하이드로-N-카페요일티라민의 염증관련 유전자 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 발현 감소 효과를 조사하기 위하여, 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 이용하여 염증 유발물질인 LPS (0.5㎍/㎖)와 다이하이드로-N-카페요일티라민을 0, 1, 5, 10μM 씩 농도별로 처리한 다음 2시간 후 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 의 발현에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에서 알 수 있듯이, 다이하이드로-N-카페요일티라민의 농도에 비례하여 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 다이하이드로-N-카페요일티라민의 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 및 AP-1의 활성도 측정

COX-2와 AP-1의 DNA 결합부위에 해당하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성하여 SV40 프로모터와 루시퍼라아제(luciferase)를 포함하는 벡터(pGL3-promoter)의 SV40 프로모터의 상류(upstream)에 삽입시켜 재조합 플라스미드를 만들고, 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 및 AP-1 전사촉진제의 활성도에 의존적으로 루시퍼라아제가 발현되도록 하였다. 세포에 LimphofectAMINE를 이용하여 pLUC(COX-2)₃과 pLUC(AP)₃를 형질전환 시킨 다음 염증 유발 물질인 TPA 100 nM과 다이하이드로-N-카페요일티라민을 0, 1, 5, 10μM 씩 농도별로 처리한 다음 24시간동안 배양한 후, lysate를 만들어 상층액만 취하여 루시퍼라아제 활성도를 측정하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 이때, TPA를 대조군으로 하여 TPA와 다이하이드로-N-카페요일티라민을 동시 처리한 결과를 비교하였고, 시료 무처리 군(NA)은 TPA 처리시 AP-1 전사촉진제의 활성도 증가를 보여주기 위한 것이다.

상기 도 3 및 도 4에서 알 수 있듯이, 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 와 AP-1의 루시퍼라아제 활성도가 염증 유발물질인 TPA의 일정량에 대하여 다이하이드로-N-카페요일티라민의 농도에 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] In vivo 실험을 통한 다이하이드로-N-카페요일티라민의 항염증 효과 검증

이러한 in vitro 실험 결과의 유의성과 효율성을 검증하기 위하여 in vivo 기낭 (air pouch) 모델을 도입하였다. 즉 실험동물의 등에 3ml의 air를 무균적으로 주입한 후, 3일 후 다시 1ml의 공기를 추가 주입하여 기낭을 형성하였다. 실험동물의 복강에 0, 1, 5, 10μM의 다이하이드로-N-카페요일티라민을 복강 투여하고 2시간 후 염증유발물질인 카라기난(carrageenan)을 생리식염수에 1%가 되도록 녹인 용액 1ml을 동물의 기낭에 투여한 다음, 24시간 후 기낭액에서 PGE₂의 생성량을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 염증유발 물질인 카라기난을 대조군으로 카라기난과 다이하이드로-N-카페요일티라민을 처리한 결과를 비교하였고, 시료 무처리 군(NA)은 이미 알려진 카라기난 처리시 염증유발을 비교하기 위한 동물의 기낭에 생리식염수만 처리한 것이다.

상기 도 5에서 알 수 있듯이, PGE₂의 생성량이 염증유발 물질로 사용된 카라 기난의 일정량에 대하여 다이하이드로-N-카페요일티라민의 농도에 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.

[시험예 5] In vivo 실험동물 기낭조직(pouch tissue)을 이용한 다이하이드로-N-카페요일티라민의 염증관련 유전자 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 유전자의 발현 측정

실험동물에 기낭을 형성한 후, 실험동물의 복강에 0, 1, 5, 10μM의 다이하이드로-N-카페요일티라민을 복강 투여하고 2시간 후 염증유발물질인 카라기난(carrageenan)을 생리식염수에 1%가 되도록 녹인 용액 1ml을 기낭에 투여한 다음, 24시간 후 기낭조직에서 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 유전자 발현을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 카라기난을 대조군으로 카라기난과 다이하이드로-N-카페요일티라민을 처리하여 비교하였으며, 시료 무처리 군(NA)은 이미 알려진 카라기난 처리시 염증유발을 비교하기위한 동물의 기낭에 생리식염수만 처리한 것이다.

상기 도 6에서 알 수 있듯이, 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 발현이 염증유발 물질로 사용된 카라기난의 일정량에 대하여 다이하이드로-N-카페요일티라민의 농도에 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 다이하이드로-N-카페요일티라민이 마우스 대식세포주인 RAW264.7에서 염증관련 유전자 사이클로옥시게나아제 Ⅱ(COX-2)의 발현과 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 유전자의 발현에 작용하는 주요 전사인자 AP-1의 활성에 미치는 효과를 조사하였다(도 4). 또한, 생쥐의 등에 기낭(air pouch)을 형성하여 형성된 기낭에 양성대조군인 카라기난(carrageenan)으로 염증 반응을 유도한 후, 다이하이드로-N-카페요일티라민을 농도별로 처리하여 염증 억제효과를 조사하였다.

먼저, 다이하이드로-N-카페요일티라민에 염증관련 효소인 사이클로옥시게나아제(COX)의 활성 억제효과에 대한 영향을 마우스 대식세포주인 Raw264.7를 이용하여 사이클로옥시게나아제에 의해 생성되는 염증 유발 인자인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성량을 측정한 결과, 다이하이드로-N-카페요일티라민의 처리에 의해 배양액에 존재하는 PGE₂의 양이 다이하이드로-N-카페요일티라민 처리 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과가 사이클로옥시게나아제 유전자의 발현에 의한 것인지를 알아보기 위하여 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)을 수행한 결과 다이하이드로-N-카페요일티라민의 처리 농도에 의존적으로 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 유전자의 발현이 감소하였으며, 사이클로옥시게나아제 I 유전자의 발현은 변화가 없었다.

사이클로옥시게나아제 Ⅱ 유전자의 발현에 작용하는 주요 전사인자의 활성에 의한 것인지를 알아보기 위하여 형질전환(transient transfection)과 EMSA를 수행하였다. 그 결과, 다이하이드로-N-카페요일티라민의 농도에 의존적으로 AP-1 전사인자의 활성도와 결합능이 감소하였다.

다이하이드로-N-카페요일티라민에 의한 사이클로옥시게나아제 Ⅱ의 발현에 관여하는 전사인자들을 확인하기 위하여 COX-2 프로모터를 클로닝하였으며, 이를 이용하여 일시적인 형질전환(transient transfection)과 EMSA를 수행한 결과, AP-1의 결합부위가 다이하이드로-N-카페요일티라민에 의한 COX-2 발현감소에 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

이러한 일련의 염증반응들이 그 전사 조절인자의 활성에 의한 염증관련 유전자의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다. in vitro 결과의 유의성과 효율성을 검증하기 위하여 in vivo 실험동물을 이용한 기낭(air pouch) 모델을 도입하여 실험동물에 기낭을 형성한 후, 형성된 기낭에 다이하이드로-N-카페요일티라민을 처리한 기낭액(pouch fluid)에서 PGE₂의 생성량을 측정한 결과, 다이하이드로-N-카페요일티라민의 처리 농도에 의존적으로 PGE₂의 양이 감소하였다. 이러한 결과가 사이클로옥시게나아제 유전자의 발현에 의한 것인지를 알아보기 위하여 기낭조직(Pouch tissue)을 이용하여 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)을 수행한 결과, 다이하이드로-N-카페요일티라민의 농도에 의존적으로 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 유전자의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

이러한 결과들을 종합해 볼 때, 다이하이드로-N-카페요일티라민의 항염증 효과를 지니는 기능성 식품/의약품 소재로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

이와 같이 본 발명의 Lycium chinense miller(구기자나무)에서 분리한 다이하이드로-N-카페요일티라민이 염증 관련 PGE₂및 사이클로옥시게나아제 Ⅱ 의 효소 작용을 선택적으로 억제하는 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과로 인해 본 발명에 의한 다이하이드로-N-카페요일티라민은 항염증용 기능성 식품/의약품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

< 참고문헌 >

Chen, C.-Y., Chang, F.-R., Yen, H.-F., and Wu, Y.-C. (1998) Amides from stems of Annona cherimola. Phytochemistry, 45: 1443-1447.

Han, S.-H., Lee H.-H., Lee, I.-S., Moon, Y.-H., and Woo, E.-R. (2002) A new phenolic amide from Lycium chinense Miller. Arch. Pharm. Res., 25: 433-437.

Claims

구기자나무(Lycium chinense miller)로부터 추출되고 하기 화학식 1로 표현되는 다이하이드로-N-카페요일티라민(dihydro-N-caffeoyltyramine)을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물:

[화학식 1]
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제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.01∼5 중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 시클로옥시게나아제 Ⅱ의 발현을 억제하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
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