BRPI0707784B1 - Ácido nucléico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula hospedeira isolada transformada, e método para produção de um polipeptídeo recombinante - Google Patents

Ácido nucléico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula hospedeira isolada transformada, e método para produção de um polipeptídeo recombinante Download PDF

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Abstract

xilanases, ácidos nucléicos que as codificam e métodos para produzi-las e usá-las a presente invenção refere-se a enzimas que têm atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, por exemplo, catalisar a hidrólise de li- gações <225>-1 ,4-xilosídicas internas ou ligações de endo-<225>-1 ,4-glicanase; e/ou degradar um polissacarídeo beta-1 ,4-xiíano linear em xilose. dessa forma, ainvenção fornece métodos e processos para quebrar hemicelulose, que é um componente principal da parede celular de plantas, incluindo métodos e processos para hidrolisar hemiceluloses em qualquer planta ou madeira ou pro-duto de madeira, resíduo de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo ou subproduto de papel. além disso, métodos de desenhar as novas xilanases, mananases e/ou glicanases e métodos de uso dessas também são fornecidos. as xilanases, mananases e/ou glicanases têm atividade e estabilidade aumentadas em ph e temperatura aumentados.

Description

(54) Título: ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, SINTÉTICO OU RECOMBINANTE, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR OU VEÍCULO DE CLONAGEM, CÉLULA HOSPEDEIRA ISOLADA TRANSFORMADA, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE (51) Int.CI.: C07H 21/04 (30) Prioridade Unionista: 14/02/2006 US 60/773,122 (73) Titular(es): VERENIUM CORPORATION (72) Inventor(es): DAVID WEINER; DAVID BLUM; ALEXANDER VARVAK; SHAUN HEALEY; KRISTINE CHANG; GEOFF HAZLEWOOD; THOMAS TODARO; GRACE DESANTIS; HWAI CHANG; CONNIE JO HANSEN; SCOTT W. BEAVER; THOMAS WOODWARD; CHARLES HANCOCK
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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, SINTÉTICO OU RECOMBINANTE, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR OU VEÍCULO DE CLONAGEM, CÉLULA HOSPEDEIRA ISOLADA TRANSFORMADA, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE. SUBMISSÃO EM DISCO COMPACTO [001] O conteúdo dessa submissão em disco compacto está incorporado aqui por referência na sua totalidade: Uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequência em disco compacto (nome do arquivo: 564462007967, data da gravação: 14 de fevereiro de 2007, tamanho: 1.851.392 bytes); uma cópia da triplicata do disco compacto da Listagem de Sequências (CÓPIA 1) (nome do arquivo: 564462007967, data da gravação: 14 de fevereiro de 2007, tamanho: 1.851.392 bytes); uma cópia da triplicata do disco compacto da Listagem de Sequências (CÓPIA 2) (nome do arquivo: 564462007967, data da gravação: 14 de fevereiro de 2007, tamanho: 1.851.392 bytes); uma cópia da triplicata do disco compacto da Listagem de Sequências (CÓPIA 3) (nome do arquivo: 564462007967, data da gravação: 14 de fevereiro de 2007, tamanho: 1.851.392 bytes).
CAMPO DA INVENÇÃO [002] Essa invenção se refere geralmente a enzimas, polinucleotídeos que codificam as enzimas, o uso de tais polinucleotídeos e polipeptídeos e mais especificamente a enzimas que apresentam atividade de xilanase, por exemplo, que catalisam a hidrólise de ligações β1,4-xilosídicas internas ou ligações endo-e-1,4-glicanase; e/ou que degradam um polissacarídeo beta-1,4-xilano linear em xilose; ou uma atividade de glucanase, por exemplo, uma atividade de endoglucanase, por exemplo, catalisam a hidrólise de ligações endo-e-1,4- e/ou
1,3-glucanase internas, uma atividade de xilanase e/ou uma atividade de mananase. Assim, a invenção fornece métodos e processos para
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2/510 quebrar hemicelulose, que é um componente importante da parede celular de plantas, incluindo métodos e processos para hidrolisar hemiceluloses em qualquer composto orgânico, planta ou madeira ou produto ou subproduto de madeira, resíduo de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo ou subproduto de papel.
ANTECEDENTES [003] Xilanases (por exemplo, endo-1,4-beta-xilanase, EC 3.2.1.8) hidrolisam ligações p-1,4-xilosídicas internas em xilano para produzir xilose e xilo-oligômeros de peso molecular menor. Xilanos são polissacarídeos formados a partir de D-xilopiranoses 1,4-p-glicosídeoligada. Xilanases são de considerável valor comercial, sendo usadas na indústria da alimentação, para cozimento e processamento de frutas e vegetais, degradação de resíduo agrícola, na produção de ração animal e na produção de polpa e papel. Xilanases são formadas por fungos e bactérias.
[004] Arabinoxilanos são importantes polissacarídeos nãoamiláceos de cereais representando 2,5 a 7,1% p/p dependendo da variedade e condições de cultivo. As propriedades físico-químicas desse polissacarídeo são tais que ele dá origem a soluções viscosas ou até mesmo géis sob condições oxidativas. Além disso, arabinoxilanos apresentam grande capacidade de se ligar a água e podem ter um papel na estabilidade de espuma de proteína. Todas essas características apresentam problemas para várias indústrias incluindo cervejarias, panificação, nutrição animal e fabricação de papel. Em cervejarias, a presença de xilano resulta em problemas de filtrabilidade do malte e formação de opacidade. Em panificação (especialmente para biscoitos e bolachas), esses arabinoxilanos criam massas pegajosas que são difíceis de processar e reduzem o tamanho do biscoito. Além disso, esse carboidrato está implicado na rápida reidratação do produto assado resultando em perda da crocância e vida útil reduzida. Para fabriPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 8/525
3/510 cação na alimentação de animal monogástrico com dieta de cereais, arabinoxilano é um importante fator que contribui para a viscosidade do conteúdo intestinal e através disso afeta adversamente a digestibilidade do alimento e a taxa de crescimento do animal. Para animais ruminantes, esses polissacarídeos representam componentes substanciais de ingestão de fibra e a digestão mais completa de arabinoxilanos pode facilitar maior eficiência na conversão do alimento.
[005] Xilanases se mostraram úteis no bioalvejamento e tratamento de polpas químicas (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.202.249), bioalvejamento e tratamento de polpas de madeira ou papel (veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.179.021, 5.116.746, 5.407.827, 5.405.769, 5.395.765, 5.369.024, 5.457.045, 5.434.071, 5.498.534, 5.591.304, 5.645.686, 5.725.732, 5.759.840, 5.834.301, 5.871.730 e 6.057.438), em reduzir a lignina na madeira e modificar madeira (veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.486.468 e 5.770.012) como beneficiadores de farinha, massa e pão (veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.108.765 e 5.306.633), como aditivos e/ou suplementos alimentares, como descrito acima (veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.432.074, 5.429.828, 5.612.055, 5.720.971, 5.981.233,
5.948.667, 6.099.844, 6.132.727 e 6.132.716), na produção de soluções de celulose (veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.760.211). Composições detergentes que apresentam atividade de xilanase são usadas para fruta, vegetais e/ou compostos de barro e argila (veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.786.316). Xilanases tam bém podem ser usadas na hidrólise de hemicelulose para a qual é seletiva, particularmente na presença de celulose. Além disso, o retentado rico em celulase é adequado para a hidrólise de celulose (veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 4.725.544).
[006] Permanece uma necessidade na técnica por xilanases para ser usadas na indústria de papel e polpa, por exemplo, onde a enzima
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4/510 é ativa na faixa de temperatura de 65°C a 75°C em um pH de aproximadamente 10. Além disso, uma enzima útil na indústria de papel e polpa poderia diminuir a necessidade de branqueadores químicos, tal como dióxido de cloro.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] A invenção fornece enzimas que têm: atividade de xilanase, por exemplo, que catalisam a hidrólise de ligações p-1,4-xilosídicas internas ou ligações endo-p-1,4-glicanase; e/ou que apresentam uma atividade de glicanase, por exemplo, uma atividade de endoglicanase, por exemplo, que catalisam a hidrólise de ligações internas endo-β1,4- e/ou 1,3-glicanase, uma atividade de xilanase e/ou uma atividade de mananase; e ácidos nucléicos que codificam as mesmas, vetores e células que compreendem as mesmas, sondas para amplificar e identificar esses ácidos nucléicos que codificam xilanase e métodos para fazer e usar esses polipeptídeos e peptídeos.
[008] Por exemplo, a invenção fornece enzimas que apresentam atividade de xilanase e composições e métodos que compreendem as mesmas, para hidrolisar ligações e-1,4-xilosídicas internas ou ligações endo-e-1,4-glicanase ou hemiceluloses, em madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo de papel. Em um aspecto, a atividade de xilanase compreende catalisar a hidrólise de xilano, por exemplo, degradar um polissacarídeo beta-1,4-xilano linear em uma xilose. Assim a invenção fornece métodos e processos para decompor uma composição que compreende xilano e/ou uma hemicelulose, que é um componente importante da parede celular de plantas. [009] Em um aspecto, a atividade de glicanase de um polipeptídeo ou peptídeo da invenção (que inclui uma proteína ou peptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção) compreende uma atividade de endoglicanase, por exemplo, atividade de endo-1,4- e/ou 1,3beta-D-glican 4-glicano hidrolase. Em um aspecto, a atividade de enPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 10/525
5/510 doglicanase compreende catalisar a hidrólise de ligações 1,4-beta-Dglicosídicas. Em um aspecto, a atividade de glicanase, por exemplo, endoglicanase, compreende uma atividade de endo-1,4- e/ou 1,3-betaendoglicanase ou atividade de endo-p-1,4-glicanase. Em um aspecto, a atividade de glicanase (por exemplo, atividade de endo-1,4-beta-Dglican 4-glicano hidrolase) compreende a hidrólise de ligações 1,4beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (por exemplo, carbóxi metil celulose e hidróxi etil celulose), liquenina, ligações beta1,4 em beta-1,3 glicanos mistas, tais como beta-D-glicanos de cereais e outro material de planta contendo partes celulósicas. Em um aspecto, a atividade de glicanase, xilanase ou mananase compreende hidrolisar um glicano ou outro polissacarídeo para produzir um polissacarídeo ou oligômero de menor peso molecular. Em um aspecto, o glicano compreende um beta-glicano, tal como um beta-glicano solúvel em água.
[0010] A invenção fornece enzimas, composições, métodos e processos para hidrolisar hemiceluloses em qualquer matéria orgânica, incluindo células, plantas e/ou madeira ou produtos de madeira, resíduos de madeira, polpa de papel, produtos de papel ou resíduos ou subprodutos de papel.
[0011] Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que apresentam atividade lignocelulotíca (lignocelulósica), por exemplo, uma atividade ligninolítica e celulolítica, incluindo, por exemplo, que apresentam uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de glicosil hidrolase, incluindo atividade de celulase, glicanase, xilanase e/ou mananase e ácidos nucléicos que codificam os mesmos e métodos para fazê-los e usá-los. A invenção fornece enzimas para a bioconversão de qualquer biomassa, por exemplo, um resíduo lignocelulósico em açúcares fermentáveis ou polissacarídeos; e esses açúcares ou polissacarídeos podem ser usados como matéria-prima química
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6/510 para a produção de álcoois tais como etanol, propanol, butanol e/ou metanol e na produção de combustíveis, por exemplo, biocombustíveis tais como gases ou líquidos sintéticos, tais como gás de síntese.
[0012] Em um aspecto, as enzimas da invenção apresentam uma taxa catalítica aumentada para melhorar o processo de hidrólise do substrato (por exemplo, um resíduo lignocelulósico, celulose, bagaço). Essa eficiência aumentada na taxa catalítica leva a uma eficiência aumentada na produção de açúcares ou polissacarídeos, o que pode ser úteis em aplicações industriais, agrícolas ou médicas, por exemplo, para fazer um biocombustível ou um álcool tal como etanol, propanol, butanol e/ou metanol. Em um aspecto, os açúcares produzidos pela hidrólise usando enzimas dessa invenção podem ser usados por microrganismos para a produção de álcool (por exemplo, etanol, propanol, butanol e/ou metanol) e/ou produção de combustível (por exemplo, biocombustível).
[0013] A invenção fornece aplicações industriais, agrícolas ou médicas: por exemplo, biomassa para biocombustível, por exemplo, etanol, propanol, butanol e/ou metanol, usando enzimas da invenção que apresentam custos diminuídos com enzimas, por exemplo, custo diminuído em biomassa para processos de conversão de biocombustível. Assim, a invenção fornece processos eficazes para a produção de bioalcóois, biocombustíveis e/ou composições que compreendem bicombustível (por exemplo, bioetanol, propanol, butanol e/ou metanol), incluindo combustíveis sintéticos, líquidos ou gás compreendendo um bioálcool, de qualquer biomassa.
[0014] Em um aspecto, enzimas da invenção, incluindo os “coquetéis” de enzimas da invenção (“coquetéis” significando misturas de enzimas que compreendem pelo menos uma enzima dessa invenção), são usadas para hidrolisar os componentes principais de uma biomassa lignocelulósica, ou de qualquer composição que compreende celuPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 12/525
7/510 lose e/ou hemicelulose (biomassa lignocelulósica também compreende lignina), por exemplo, sementes, grãos, tubérculos, resíduo de planta (tal como uma forragem ou palha, por exemplo, palha de arroz ou uma palha de trigo, ou qualquer talos secos de qualquer cereal) ou subprodutos de processamento de alimento ou processamento industrial (por exemplo, talos), milho (incluindo espigas, palha e semelhantes), gramíneas (por exemplo, grama Indiana, tal como Sorghastrum nutans; ou “switchgrass”, por exemplo da espécie Panicum, tal como Panicum virgatum), madeira (incluindo lascas de madeira, resíduo de processamento, tal como resíduo de madeira), papel, polpa, papel reciclado (por exemplo, jornal); também incluindo um monocotiledôneo ou dicotiledôneo ou milho monocotiledôneo, cana-de-açúcar ou partes destes (por exemplo, pontas da cana), arroz, trigo, cevada, “switchgrass” ou Miscanthus; ou uma cultura de semente oleaginosa de dicotiledônea, soja, canola, colza, linho, algodão, óleo de palma, beterraba, amendoim, árvore, álamo ou tremoceiro; ou madeiras ou subprodutos de processamento de madeira, tais como resíduo de madeira, por exemplo, no processamento da madeira, indústria de polpa e/ou papel, indústria têxtil e em agentes de limpeza doméstica e industrial e/ou no processamento de resíduo de biomassa.
[0015] Em um aspecto, enzimas da invenção são usadas para hidrolisar celulose que compreende uma cadeia linear de porções de glicose p-1,4-ligadas e/ou hemicelulose como uma estrutura complexa que varia de planta para planta. Em um aspecto, as enzimas da invenção são usadas para hidrolisar hemiceluloses que contêm uma cadeia principa de moléculas de xilose p-1,4-ligadas com ramificações intermitentes de arabinose, galactose, ácido glicurônico e/ou manose. Em um aspecto, as enzimas da invenção são usadas para hidrolisar hemicelulose que contêm constituintes não-carboidratos tais como grupos acetila em xilose e ésteres de ácido ferúlico em arabinose. Em um asPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 13/525
8/510 pecto, as enzimas da invenção são usadas para hidrolisar hemiceluloses covalentemente ligadas à lignina e/ou acopladas a outros filamentos de hemicelulose através de ligações cruzadas de diferulato.
[0016] Em um aspecto, as composições e métodos da invenção são usados na digestão enzimática de biomassa e podem compreender o uso de várias enzimas diferentes, incluindo celulases e hemicelulases. Enzimas ligocelulósicas usadas na prática da invenção podem digerir celulose para açúcares monoméricos, incluindo glicose. Em um aspecto, as composições usadas para praticar a invenção podem incluir misturas de enzimas, por exemplo, glicosil hidrolases, glicose oxidases, xilanases, xilosidases (por exemplo, β-xilosidases), celobioidrolases e/ou arabinofuranosidases ou outras enzimas que podem digerir a hemicelulose até açúcares monoméricos. Misturas da invenção podem compreender, ou consistir em, apenas enzimas dessa invenção, ou podem incluir pelo menos uma enzima dessa invenção e outra enzima que também pode ser uma enzima lignocelulósica e/ou qualquer outra enzima.
[0017] Em um aspecto, as enzimas da invenção apresentam uma atividade de glicanase, por exemplo, uma endoglicanase, por exemplo, que catalisa a hidrólise de ligações endo-e-1,4- e/ou e-1,3-glicanase internas. Em um aspecto, a atividade de endoglicanase (por exemplo, atividade de endo-1,4-beta-D-glican 4-glicano hidrolase) compreende a hidrólise de ligações 1,4- e/ou β-1,3- beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (por exemplo, carbóxi metil celulose e hidróxi etil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal e outros materiais de planta que contêm partes celulósicas.
[0018] Em modalidades alternativas, a invenção fornece polipeptídeos (e os ácidos nucléicos que codificam os mesmos) que apresentam pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa e que
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9/510 retêm sua atividade de xilanase, mananase ou glicanase; ou em que pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa compreende substituir um aminoácido por outro aminoácido de características semelhantes; ou uma substituição conservativa compreende: substituição de um aminoácido alifático por outro aminoácido alifático; substituição de uma Serina por uma Treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo ácido por outro resíduo ácido; substituição de um resíduo que carrega um grupo amida por outro resíduo que carrega um grupo amida; troca de um resíduo básico por outro resíduo básico; ou substituição de um resíduo aromático por outro resíduo aromático.
[0019] Em modalidades alternativas, a invenção fornece polipeptídeos (e os ácidos nucléicos que codificam os mesmos) que apresentam atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, mas que não apresentam uma sequência de sinal, um domínio prepro, um domínio de doquerina e/ou um módulo de ligação a carboidrato (CBM); e em um aspecto, o módulo de ligação a carboidrato (CBM) compreende, ou consiste em, um módulo de ligação ao xilano, um módulo de ligação à celulose, um módulo de ligação à lignina, um módulo de ligação à xilose, um módulo de ligação à mananase, um módulo específico para xiloglicano e/ou um módulo de ligação à arabinofuranosidase.
[0020] Em modalidades alternativas, a invenção fornece polipeptídeos (e os ácidos nucléicos que codificam os mesmos) que apresentam atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase compreendendo ainda uma sequência heteróloga; e em um aspecto, a sequência heteróloga compreende, ou consiste em, uma sequência que codifica: (i) uma sequência de sinal heteróloga, um módulo de ligação a carboidrato heterólogo, um domínio de doquerina heterólogo, um domínio catalítico heterólogo (CD) ou uma combinação desses; (ii) a sequência de (ii) em que a sequência de sinal heteróloga, módulo de ligação a carboidrato ou domínio catalítico (CD) é derivado de uma enzima heteróPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 15/525
10/510 loga; ou (iii) um sinalizador, um epitopo, um peptídeo direcionador, uma sequência clivável, uma porção detectável ou uma enzima; e em um aspecto, o módulo de ligação a carboidrato (CBM) heterólogo compreende, ou consiste em, um módulo de ligação ao xilano, um módulo de ligação à celulose, um módulo de ligação à lignina, um módulo de ligação à xilose, um módulo de ligação à mananase, um módulo específico para xiloglicano e/ou um módulo de ligação à arabinofuranosidase; e em um aspecto, a sequência de sinal heteróloga direciona a proteína codificada para um vacúolo, para o retículo endoplasmático, para um cloroplasto ou para um grânulo de amido.
[0021] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem um ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,
69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,
81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais ou identidade de sequência completa (100%) à sequência de (homologia) a uma sequência de ácido nucléico exemplar da invenção, incluindo a sequência de
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID
NO:35, SEQ ID
NO:43, SEQ ID
NO:51, SEQ ID
NO:59, SEQ ID
NO:67, SEQ ID
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NO:61, SEQ ID
NO:69, SEQ ID
NO:39, SEQ ID
NO:47, SEQ ID
NO:55, SEQ ID
NO:63, SEQ ID
NO:71, SEQ ID
NO:41, SEQ ID
NO:49, SEQ ID
NO:57, SEQ ID
NO:65, SEQ ID
NO:73, SEQ ID
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NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID
NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID
NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID
NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID
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NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:161, SEQ ID
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NO:243, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:249, SEQ ID
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NO:259, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:265, SEQ ID
NO:267, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:273, SEQ ID
NO:275, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:281, SEQ ID
NO:283, SEQ ID NO:285, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:289, SEQ ID
NO:291, SEQ ID NO:293, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:297, SEQ ID
NO:299, SEQ ID NO:301, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:305, SEQ ID
NO:307, SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:313, SEQ ID
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NO:315, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:321, SEQ ID
NO:323, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:329, SEQ ID
NO:331, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:337, SEQ ID
NO:339, SEQ ID NO:341, SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:345, SEQ ID
NO:347, SEQ ID NO:349, SEQ ID NO:351, SEQ ID NO:353, SEQ ID
NO:355, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:361, SEQ ID
NO:363, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:369, SEQ ID
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NO:379, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID
NO:387, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:393, SEQ ID
NO:395, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:401, SEQ ID
NO:403, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:409, SEQ ID
NO:411, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:417, SEQ ID
NO:419, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:425, SEQ ID
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NO:435, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:441, SEQ ID
NO:443, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:449, SEQ ID
NO:451, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:455, SEQ ID NO:457, SEQ ID
NO:459, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:465, SEQ ID
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NO:531, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:537, SEQ ID
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NO:547, SEQ ID NO:549, SEQ ID NO:551, SEQ ID NO:553, SEQ ID
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NO:555, SEQ ID NO:557, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:561, SEQ ID
NO:563, SEQ ID NO:565, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:569, SEQ ID
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NO:595, SEQ ID NO:597, SEQ ID NO:599, SEQ ID NO:601, SEQ ID
NO:603, SEQ ID NO:605, SEQ ID NO:607, SEQ ID NO:609, SEQ ID
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NO:619, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:623, SEQ ID NO:625, SEQ ID
NO:627, SEQ ID NO:629, SEQ ID NO:631, SEQ ID NO:633 e/ou SEQ ID NO:635 (ou, daqui por diante referidas como as SEQ ID NOs. ímpares entre SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:635, ou as sequências de ácido nucléico exemplares da invenção), ao longo de uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 ou mais resíduos ou da extensão completa de um cDNA, transcrito (mRNA) ou gene, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase ou que codifica uma proteína que pode gerar um anticorpo específico para um polipeptídeo dessa invenção, tal como epitopos ou imunógenos (daqui por diante coletivamente referidos como ácidos nucléicos da invenção) ou ao longo de uma região que consiste na região codificante da proteína (por exemplo, o cDNA) ou a sequência genômica; e todas essas sequências de ácidos nucléicos e os polipeptídeos que elas codificam abrangem “sequências da invenção”. Em um aspecto (opcionalmente) as identidades de sequência são determinadas pela análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual, e em
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14/510 um aspecto (opcionalmente) o algoritmo de comparação de sequência é um algoritmo BLAST versão 2.2.2 onde um ajuste de filtro é ajustado para blastall-p blastp-d “nr pataa”-F F e todas as outras opções são ajustadas para o padrão.
[0022] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem um ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o ácido nucléico compreende uma sequência que hibridiza sob condições estringentes a um ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucléico exemplar da invenção (isto é, sequências como descritas em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, etc., incluindo todas as SEQ ID Nos. ímpares entre SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:635), e em um aspecto (opcionalmente) as condições estringentes compreendem uma etapa de lavagem que compreende uma lavagem em SSC 0,2X em uma temperatura de cerca de 65°C por cerca de 15 minutos e em um aspecto (opcionalmente) o ácido nucléico tem pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ou mais resíduos de extensão ou a extensão completa do gene ou transcrito. [0023] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem um ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo tem uma sequência como descrita em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID
NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID
NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID
NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID
NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID
NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID
NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID
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NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID
NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID
NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ I D NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID
NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID
NO:114 SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID
NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID
NO:130, SEQ ID NO:132; SEQ ID NO:134; SEQ ID NO:136; SEQ ID
NO:138: SEQ ID NO:140; SEQ ID NO:142; SEQ ID NO:144; NO:146,
SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154
SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162
SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170
SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178
SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186
SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:194
SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:202
SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:210
SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218
SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226
SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234
SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:242
SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:250
SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:254, SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:258
SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:266
SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:274
SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:282
SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:290
SEQ ID NO:292, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:298
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SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO:300,
NO:308,
NO:316,
NO:324,
NO:332,
NO:340,
NO:348,
NO:356,
NO:364,
NO:372,
NO:380,
NO:388,
NO:396,
NO:404,
NO:412,
NO:420,
NO:428,
NO:436,
NO:444,
NO:452,
NO:460,
NO:468,
NO:476,
NO:484,
NO:492,
NO:500,
NO:508,
NO:516,
NO:524,
NO:532,
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO:302,
NO:310,
NO:318,
NO:326,
NO:334,
NO:342,
NO:350,
NO:358,
NO:366,
NO:374,
NO:382,
NO:390,
NO:398,
NO:406,
NO:414,
NO:422,
NO:430,
NO:438,
NO:446,
NO:454,
NO:462,
NO:470,
NO:478,
NO:486,
NO:494,
NO:502,
NO:510,
NO:518,
NO:526,
NO:534,
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO:304,
NO:312,
NO:320,
NO:328,
NO:336,
NO:344,
NO:352,
NO:360,
NO:368,
NO:376,
NO:384,
NO:392,
NO:400,
NO:408,
NO:416,
NO:424,
NO:432,
NO:440,
NO:448,
NO:456,
NO:464,
NO:472,
NO:480,
NO:488,
NO:496,
NO:504,
NO:512,
NO:520,
NO:528,
NO:536,
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO:306,
NO:314,
NO:322,
NO:330,
NO:338,
NO:346,
NO:354,
NO:362,
NO:370,
NO:378,
NO:386,
NO:394,
NO:402,
NO:410,
NO:418,
NO:426,
NO:434,
NO:442,
NO:450,
NO:458,
NO:466,
NO:474,
NO:482,
NO:490,
NO:498,
NO:506,
NO:514,
NO:522,
NO:530,
NO:538,
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SEQ ID NO:540, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:544, SEQ ID NO:546,
SEQ ID NO:548, SEQ ID NO:550, SEQ ID NO:552, SEQ ID NO:554,
SEQ ID NO:556, SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:560, SEQ ID NO:562,
SEQ ID NO:564, SEQ ID NO:566, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:570,
SEQ ID NO:572, SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:578,
SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:582, SEQ ID NO:584, SEQ ID NO:586,
SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:590, SEQ ID NO:592, SEQ ID NO:594,
SEQ ID NO:596, SEQ ID NO:598, SEQ ID NO:600, SEQ ID NO:602,
SEQ ID NO:604, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:608, SEQ ID NO:610,
SEQ ID NO:612, SEQ ID NO:614, SEQ ID NO:616, SEQ ID NO:618,
SEQ ID NO:620, SEQ ID NO:622, SEQ ID NO:624, SEQ ID NO:626,
SEQ ID NO:628, SEQ ID NO:630, SEQ ID NO:632, SEQ ID NO:634 e/ou SEQ ID NO:636, ou fragmentos enzimaticamente ativos destas, incluindo as sequências descritas nas Tabelas 1 a 4, e na Listagem de Sequências (todas essas sequências são “enzimas/polipeptídeos exemplares da invenção”) e subsequências (fragmentos) enzimaticamente ativas destas e/ou subsequências imunologicamente ativas destas (tal como epitopos ou imunógenos) (todos “peptídeos da invenção”) e variantes destas (todas essas sequências que abrangem sequências de polipeptídeo e peptídeo da invenção) (ou, referidas daqui por diante como, as SEQ ID NOs. pares entre SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:636; ou as sequências de polipeptídeo exemplares da invenção). [0024] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem sequências completamente complementares a todas essas sequências de ácido nucléico da invenção (sequências complementares (não-codificantes) e codificantes também, daqui por diante, são coletivamente referidas como sequências de ácido nucléico da invenção).
[0025] Em um aspecto, a identidade de sequência é de pelo menos cerca de 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,
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61%, 62%, 63%, 64% 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,
73%, 74%, 75%, 76% 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88% 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% ou 100% (completa) de identidade de sequência
(homologia). Em um aspecto, a identidade de sequência é ao longo de uma região com pelo menos cerca de 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 ou mais resíduos ou a extensão completa de um gene ou transcrito. Por exemplo, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem uma sequência de ácido nucléico descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. ímpares entre SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:635 (as sequências de polinucleotídeo exemplares dessa invenção). A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que codificam um polipeptídeo que compreende uma sequência descrita em qualquer uma das SEQ ID NOs. pares entre SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:636 (as sequências de polinucleotídeo exemplares dessa invenção) e fragmentos enzimaticamente ativos destas.
[0026] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que codificam um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o ácido nucléico tem pelo menos uma modificação de sequência de uma sequência exemplar da invenção ou qualquer sequência da invenção.
[0027] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que codificam um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o ácido nucléico tem pelo menos uma modificação de sequência de um ácido nucléico exemplar da invenção, em que a modificação de sequência compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenoPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 24/525
19/510 ve ou todas as seguintes alterações: os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 10 a 12 de SEQ ID NO:383 são alterados para CCT, TTA, TTG, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 25 a 27 de SEQ ID NO:383 são alterados para CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 28 a 30 de SEQ ID NO:383 são alterados para TCA, TCC, TCT, TCG, AGT ou AGC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para TTT ou TTC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para TAC ou TAT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para ATA, ATT ou ATC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para TGG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 40 a 42 de SEQ ID NO:383 são alterados para CAC ou CAT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 52 a 54 de SEQ ID NO:383 são alterados para TTC ou TTT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 73 a 75 de SEQ ID NO:383 são alterados para GAG ou GAA, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 73 a 75 de SEQ ID NO:383 são alterados para CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 88 a 90 de SEQ ID NO:383 são alterados para GTG, GTC, GTA ou GTT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 100 a 102 de SEQ ID NO:383 são alterados para TGT ou TGC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 100 a 102 de SEQ ID NO:383 são alterados para CAT ou CAC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 100 a 102 de SEQ ID NO:383 são alterados para TTG, TTA, CTT, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 103 a 105 de SEQ ID NO:383 são alterados para GAG ou GAA, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 103 a 105 de SEQ ID NO:383 são alterados para GAT ou GAC, os nucleotídeos que correspondem aos resíPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 25/525
20/510 duos 211 a 213 de SEQ ID NO:383 são alterados para ACA, ACT, ACC ou ACG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 211 a 213 de SEQ ID NO:383 são alterados para TGT ou TGC, ou os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 508 a 582 de SEQ ID NO:383 são alterados para CAT ou CAC.
[0028] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que codificam um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o ácido nucléico tem pelo menos uma modificação de sequência de SEQ ID NO:383, ou o equivalente de pelo menos uma modificação de sequência de SEQ ID NO:383, e a pelo menos uma modificação de SEQ ID NO:383 compreende uma alteração em: os nucleotídeos nos resíduos 10 a 12 são CCT, TTA, TTG, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos nos resíduos 25 a 27 são CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos nos resíduos 28 a 30 são TCA, TCC, TCT, TCG, AGT ou AGC, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são TTT ou TTC, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são TAC ou TAT, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são ATA, ATT ou ATC, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são TGG, os nucleotídeos nos resíduos 40 a 42 são CAC ou CAT, os nucleotídeos nos resíduos 52 a 54 são TTC ou TTT, os nucleotídeos nos resíduos 73 a 75 são GAG ou GAA, os nucleotídeos nos resíduos 73 a 75 são CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos nos resíduos 88 a 90 são GTG, GTC, GTA ou GTT,os nucleotídeos nos resíduos 100 a 102 são TGT ou TGC, os nucleotídeos nos resíduos 100 a 102 são CAT ou CAC, os nucleotídeos nos resíduos 100 a 102 são TTG, TTA, CTT, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos nos resíduos 103 a 105 são GAG ou GAA, os nucleotídeos nos resíduos 103 a 105 são GAT ou GAC, os nucleotídeos nos resíduos 211 a 213 são ACA, ACT, ACC ou ACG, os nucleotídeos nos resíduos 211 a 213 são TGT ou TGC, ou os nucleotídeos nos resíduos 508 a 582 são CAT ou CAC. Em aspectos alternativos, a
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21/510 modificação de sequência compreende pelo menos duas das alterações, pelo menos três das alterações, pelo menos quatro das alterações, ou pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou todas as alterações.
[0029] Em um aspecto, a invenção também fornece ácidos nucléicos codificantes de enzima com uma inovação em comum, na qual eles codificam um novo subgrupo de xilanases ou um clado, compreendendo o “módulo X14” (J Bacteriol. 2002 Agosto; 184(15): 41244133). Em um aspecto, a invenção também fornece ácidos nucléicos codificantes de enzimas com uma inovação em comum na qual eles codificam um novo subgrupo de xilanases, ou um clado, compreendendo o “módulo X14”. Os membros de xilanase que compreendem X14 deste clado estão listados na Tabela 9 abaixo. Dessa forma, em um aspecto, a invenção fornece um novo gênero de xilanases que compreende os membros de xilanase do clado listado na Tabela 9, abaixo e enzimas relacionadas (por exemplo, xilanases que apresentam uma identidade de sequência a uma enzima exemplar da invenção, conforme listado na Tabela 9 abaixo).
[0030] Em um aspecto (opcionalmente), os ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes da invenção apresentam atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, por exemplo, em que a atividade de xilanase compreende catalisar a hidrólise de ligações internas β1,4-xilosídicas; compreende uma atividade de endo-1,4-beta-xilanase; compreende hidrolisar um xilano ou arabinoxilano para produzir xilose e xilo-oligômero de menor peso molecular; compreende hidrolisar um polissacarídeo que compreende uma D-xilopiranose 1,4-e-glicosídeoligada; compreende hidrolisar uma celulose ou hemicelulose; compreende hidrolisar uma celulose ou hemicelulose em uma madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel, ou resíduo de papel;
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22/510 compreende catalisar a hidrólise de um xilano ou um arabinoxilano em uma ração ou produto alimentício; ou compreende catalisar a hidrólise de um xilano ou arabinoxilano em uma célula microbiana ou uma célula de planta. Em um aspecto, a atividade de xilanase compreende hidrolisar polissacarídeos que compreendem D-xilopiranoses 1,4-βglicosídeo-ligadas ou hidrolisar hemiceluloses, por exemplo, hidrolisar hemiceluloses em madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo de papel. Em um aspecto, o arabinoxilano é um arabinoxilano de cereal, tal como arabinoxilano de trigo.
[0031] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase compreende catalisar a hidrólise de polissacarídeos, por exemplo, mananas ou xilanos, em uma ração ou produto alimentício, tal como ração animal a base de cereal, um mosto ou uma cerveja, um leite ou produto de leite, uma fruta ou vegetal. Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase compreende catalisar a hidrólise de polissacarídeos, por exemplo, mananas ou xilanos, em uma célula microbiana ou célula de planta.
[0032] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é termoestável, por exemplo, onde o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma faixa de temperatura entre cerca de 1°C a cerca de 5°C, entre cerca de 5°C a cerca de 15°C, entre cerca de 15°C a cerca de 25°C, entre cerca de 25°C a cerca de 37°C, 37°C a cerca de 95°C, ou entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 75°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, entre cerca de 90°C a cerca de 95°C, entre cerca de 95°C a cerca de 105°C, ou entre cerca de 95°C a cerca de 110°C. Em um aspecto, o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma faixa de temperatura entre cerca de 1°C a cerca de 5°C, entre cerca de 5°C a cerca de 15°C, entre cerca de
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23/510
15°C a cerca de 25°C, entre cerca de 25°C a cerca de 37°C. Em um aspecto, polipeptídeos da invenção retêm atividade em temperaturas acima de 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais; em outro aspecto, os polipeptídeos da invenção retêm atividade após exposição a temperaturas acima de 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103.5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais.
[0033] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é termotolerante, por exemplo, onde o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a uma temperatura na faixa de mais do que 37°C a cerca de 95°C, ou entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 75°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, entre cerca de 90°C a cerca de 95°C, entre cerca de 95°C a cerca de 105°C, ou entre cerca de 95°C a cerca de 110°C. Em um aspecto, o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a condições que compreendem uma faixa de temperatura entre cerca de 1°C a cerca de 5°C, entre cerca de 5°C a cerca de 15°C, entre cerca de 15°C a cerca de 25°C, entre cerca de 25°C a cerca de 37°C. Em um aspecto, polipeptídeos da invenção podem reter atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a uma temperatura acima de 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103.5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais.
[0034] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase de polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos da invenção retém atividade sob condições ácidas compreendendo cerca de pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 ou pH 4 ou menos (mais ácido);
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24/510 ou retém atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições básicas compreendendo cerca de pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 ou mais (mais básico) ou retém atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a condições básicas que compreendem cerca de pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH
11.5, pH 12, pH 12.5 ou mais (mais básico). Em um aspecto, atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase de polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos da invenção retém atividade em uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C,
86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94° C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103.5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH
10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 ou mais (mais básico).
[0035] A invenção fornece cassetes de expressão, veículos de clonagem ou um vetor (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção. O veículo de clonagem pode compreender um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriófago ou um cromossomo artificial. O vetor viral pode compreender um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno-associado. O veículo de clonagem pode compreender um cromossomo artificial que compreende um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um vetor derivado de bacteriófago P1 (PAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC) ou um cromossomo artificial de mamífero (MAC).
[0036] A invenção fornece sondas de ácido nucléico para identificar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo com atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que a sonda compreende pelo
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25/510 menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 ou mais bases consecutivas de um ácido nucléico que compreende uma sequência exemplar da invenção ou qualquer sequência da invenção (como definido aqui), em que em um aspecto (opcionalmente), a sonda compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos entre cerca de 10 a 300, cerca de 25 a 250, cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de60 a 100 ou cerca de 50 a 150 ou mais bases consecutivas.
[0037] A invenção fornece pares de iniciadores de amplificação para amplificar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o par de iniciadores é capaz de amplificar um ácido nucléico que compreende uma sequência exemplar da invenção ou qualquer sequência da invenção (como definido aqui) ou uma subsequência desta, em que opcionalmente, um membro do par de sequências de iniciadores de amplificação compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da sequência ou cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou mais bases consecutivas da sequência. A invenção fornece pares de iniciadores de amplificação em que o par de iniciadores compreende um primeiro membro que tem uma sequência descrita por cerca dos primeiros (a 5') 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou mais resíduos de uma sequência exemplar da invenção ou qualquer sequência da invenção (como definidas nesse) e um segundo membro que tem uma sequência descrita por cerca dos primeiros (a 5') 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou mais resíduos da fita complementar do primeiro membro.
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26/510 [0038] A invenção fornece ácidos nucléicos que codificam uma xilanase e/ou uma glicanase gerados por amplificação de um polinucleotídeo usando um par de iniciadores de amplificação da invenção, em que, opcionalmente, a amplificação é por reação em cadeia da polimerase (PCR). Em um aspecto, o ácido nucléico é gerado por amplificação de uma biblioteca genômica, em que em um aspecto (opcionalmente) a biblioteca genômica é uma biblioteca ambiental. A invenção fornece xilanases e/ou glicanases isoladas, sintéticas ou recombinantes codificadas por um ácido nucléico que codifica uma xilanase e/ou glicanase gerado por amplificação de um polinucleotídeo usando um par de iniciadores de amplificação da invenção. A invenção fornece métodos para amplificar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, os métodos compreendendo a etapa de amplificação de um ácido nucléico molde com um par de sequências de iniciadores de amplificação capaz de amplificar uma sequência de ácido nucléico exemplar da invenção ou qualquer sequência da invenção (como definido aqui) ou uma subsequência destas.
[0039] A invenção fornece cassetes de expressão, um vetor ou veículo de clonagem que compreendem uma sequência da invenção, em que opcionalmente o veículo de clonagem compreende um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriófago ou um cromossomo artificial. O vetor viral pode compreender um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno-associado ou, o cromossomo artificial compreende um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um vetor derivado de bacteriófago P1 (PAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC) ou um cromossomo artificial de mamífero (MAC).
[0040] A invenção fornece células transformadas que compreendem um ácido nucléico ou vetor da invenção ou um cassete de exPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 32/525
27/510 pressão ou veículo de clonagem da invenção. A célula transformada pode ser uma célula bacteriana, uma célula de mamífero, uma célula de fungo, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula de planta.
[0041] A invenção fornece animais transgênicos não-humanos que compreendem uma sequência da invenção. O animal transgênico nãohumano pode ser um camundongo, um rato, um coelho, uma ovelha, um porco, uma galinha, uma cabra, um peixe, um cão ou uma vaca. A invenção fornece plantas transgênicas que compreendem uma sequência da invenção, por exemplo, em que a planta é uma planta de milho, uma planta de sorgo, uma planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta de semente oleaginosa, uma planta de colza, uma planta de soja, uma planta de arroz, uma planta de cevada, grama ou uma planta de tabaco. A invenção fornece sementes transgênicas que compreendem uma sequência da invenção, por exemplo, em que a semente é uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente oleaginosa, uma semente de colza, uma semente de soja, uma semente de palma, uma semente de girassol, uma semente de gergelim, uma semente de planta de arroz, cevada, amendoim ou tabaco.
[0042] A invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido que compreendem uma sequência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições estringentes a uma sequência da invenção (incluindo, por exemplo, sequências exemplares da invenção), ou uma subsequência desta, em que opcionalmente o oligonucleotídeo anti-sentido tem cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases de extensão, e em um aspecto (opcionalmente) as condições estringentes compreendem uma etapa de lavagem que compreende uma lavagem em SSC 0,2X em uma temperatura de cerca de 65oC por cerca de 15 minutos.
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28/510 [0043] A invenção fornece métodos de inibir a tradução de uma mensagem de xilanase, mananase e/ou glicanase em uma célula que compreende administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma sequência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições estringentes a uma sequência da invenção (incluindo, por exemplo, sequências exemplares da invenção).
[0044] A invenção fornece moléculas de RNA inibidor (RNAi) de fita dupla que compreendem uma subsequência de uma sequência da invenção (incluindo, por exemplo, sequências exemplares da invenção). A molécula de RNA inibidor (RNAi) de fita dupla pode ter cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 ou mais nucleotídeos de dúplex de extensão. A invenção fornece métodos de inibir a expressão de uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase em uma célula que compreendem administrar à célula ou expressar na célula um RNA inibidor (RNAi) de fita dupla, em que o RNA compreende uma subsequência de uma sequência da invenção (incluindo, por exemplo, sequências exemplares da invenção).
[0045] A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que tem uma atividade de xilanase, uma mananase e/ou glicanase ou polipeptídeos capazes de gerar uma resposta imune específica para uma xilanase, uma mananase e/ou glicanase (por exemplo, um epitopo), (i) compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%,
56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,
80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou tem 100%
(completa) de identidade de sequência a uma sequência de aminoáciPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 34/525
29/510 dos exemplar da invenção (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, ... SEQ ID NO:636, etc., como descrito aqui), ao longo de uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 ou 250 ou mais resíduos, em que em um aspecto (opcionalmente) as identidades de sequência são determinadas pela análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual, ou (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucléico da invenção (incluindo, por exemplo, sequências exemplares da invenção). Sequências de polipeptídeo ou peptídeo da invenção incluem polipeptídeos ou peptídeos especificamente ligados por um anticorpo da invenção (por exemplo, epitopos) ou polipeptídeos ou peptídeos que podem gerar um anticorpo da invenção (por exemplo, um imunógeno).
[0046] A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem uma sequência como descritas em qualquer uma das sequências pares entre SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:636 (a sequência do polipeptídeo exemplar da invenção) e fragmentos enzimaticamente ativos dessas e variantes dessas, por exemplo: em modalidades alternativas, enzimas variantes de xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção compreendem as sequências de: SEQ ID NO:384 (três resíduos de aminoácidos foram então removidos da extremidade carbóxi terminal do polipeptídeo de SEQ ID NO:382, resultando em SEQ ID NO:384) e SEQ ID NO:482 (veja abaixo). A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que apresentam uma atividade de xilanase, uma mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo tem uma sequência que compreende uma modificação de sequência de uma sequência exemplar da invenção (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, ... SEQ ID NO:636, etc., como
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30/510 descrito aqui), em que a modificação de sequência compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou todas as seguintes alterações: o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 4 de SEQ ID NO:384 é leucina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 9 de SEQ ID NO:384 é prolina, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 10 de SEQ ID NO:384 é serina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é fenilalanina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é tirosina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é isoleucina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é triptofano, o aminoácido que corresponde à asparagina no resíduo 14 de SEQ ID NO:384 é histidina, o aminoácido que corresponde à tirosina no resíduo 18 de SEQ ID NO:384 é fenilalanina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 25 de SEQ ID NO:384 é acido glutâmico, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 25 de SEQ ID NO:384 é prolina, o aminoácido que corresponde à asparagina no resíduo 30 de SEQ ID NO:384 é valina, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 34 de SEQ ID NO:384 é cisteína, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 34 de SEQ ID NO:384 é histidina, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 34 de SEQ ID NO:384 é leucina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 35 de SEQ ID NO:384 é ácido glutâmico, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 35 de SEQ ID NO:384 é ácido aspártico, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 71 de SEQ ID NO:384 é treonina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 71 de SEQ ID NO:384 é cisteína, ou o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 194 de SEQ ID NO:384 é histidina.
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31/510 [0047] A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que tem uma atividade de xilanase, uma mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo tem uma sequência que compreende um ou mais das seguintes modificações na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:384: a treonina na posição de aminoácido 4 é leucina, a serina na posição de aminoácido 9 é prolina, a glutamina na posição de aminoácido 10 é serina, a treonina na posição de aminoácido 13 é fenilalanina, a treonina na posição de aminoácido 13 é tirosina, a treonina na posição de aminoácido 13 é isoleucina, a treonina na posição de aminoácido 13 é triptofano, a asparagina na posição de aminoácido 14 é histidina, a tirosina na posição de aminoácido 18 é fenilalanina, a serina na posição de aminoácido 25 é ácido glutâmico, a serina na posição de aminoácido 25 é prolina, a asparagina na posição de aminoácido 30 é valina, a glutamina na posição de aminoácido 34 é cisteína, a glutamina na posição de aminoácido 34 é histidina, a glutamina na posição de aminoácido 34 é leucina, a serina na posição de aminoácido 35 é ácido glutâmico, a serina na posição de aminoácido 35 é ácido aspártico a serina na posição de aminoácido 71 é treonina, a serina na posição de aminoácido 71 é cisteína, ou a serina na posição de aminoácido 194 é histidina. Em aspectos alternativos, a alteração de sequência compreende pelo menos duas das alterações, pelo menos três das alterações, pelo menos quatro das alterações ou a alteração da sequência compreende pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou todas as alterações.
[0048] Em um aspecto, os peptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes da invenção apresentam uma atividade de xilanase, por exemplo, em que a atividade de xilanase compreende catalisar a hidrólise de ligações p-1,4-xilosídicas internas; compreende uma atividade de endo-1,4-beta-xilanase; compreende hidrolisar um xilano ou
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32/510 um arabinoxilano para produzir uma xilose e xilo-oligômero de peso molecular menor; compreende hidrolisar um polissacarídeo que compreende uma D-xilopiranose 1,4-p-glicosídeo-ligada; compreende hidrolisar uma celulose ou uma hemicelulose; compreende hidrolisar uma celulose ou uma hemicelulose em uma madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo de papel; compreende catalisar a hidrólise de um xilano ou um arabinoxilano em uma ração ou um produto alimentício; ou, compreende catalisar a hidrólise de um xilano ou um arabinoxilano em uma célula microbiana ou uma célula de planta. O xilano pode compreender um arabinoxilano, por exemplo, um arabinoxilano solúvel em água, por exemplo, um arbinoxilano solúvel em água em uma massa ou produto de pão.
[0049] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase compreende hidrolisar polissacarídeos, por exemplo, compreendendo D-xilopiranoses 1,4-p-glicosídeo-ligadas ou hidrolisar hemiceluloses, por exemplo, hidrolisar hemiceluloses em uma madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo de papel.
[0050] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase compreende catalisar a hidrólise de polissacarídeos, por exemplo, xilanos, em uma ração ou produto alimentício, tal como uma ração animal baseada em cereal, um mosto ou cerveja, leite ou produto de leite, uma fruta ou um vegetal. Em um aspecto, a atividade de xilanase compreende catalisar a hidrólise de xilanos em uma célula microbiana ou célula de planta.
[0051] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é termoestável, por exemplo, onde o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma faixa de temperatura entre cerca de 37°C a cerca de 95°C, ou entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, ou entre cerca de
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70°C a cerca de 75°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, entre cerca de 90°C a cerca de 95°C, entre cerca de 95°C a cerca de 105°C, ou entre cerca de 95°C a cerca de 110°C. Em um aspecto, o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma faixa de temperatura entre cerca de 1°C a cerca de 5°C, entre cerca de 5°C a cerca de 15°C, entre cerca de 15°C a cerca de 25°C, entre cerca de 25°C a cerca de 37°C. Em um aspecto, polipeptídeos da invenção retêm atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase em temperaturas acima de 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103.5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C. [0052] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é termotolerante, por exemplo, onde o polipeptídeo retém a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a uma temperatura na faixa de mais do que 37°C a cerca de 95°C, ou entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 75°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, entre cerca de 90°C a cerca de 95°C, entre cerca de 95°C a cerca de 105°C, ou entre cerca de 95°C a cerca de 110°C. Em um aspecto, polipeptídeos da invenção podem reter atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a uma temperatura acima de 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103.5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C.
[0053] A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem um polipeptídeo da invenção e que não apresentam uma sequência de sinal ou uma sequência prepro. A invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem um polipeptídeo da invenção e que apresentam uma sequência de sinal heteróloga ou uma sequência prepro heteróloga.
[0054] Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção tem atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende uma atividade
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34/510 específica em cerca de 37°C na faixa entre cerca de 100 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína, entre cerca de 500 a cerca de 750 unidades por miligrama de proteína, entre cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína ou entre cerca de 7500 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em um aspecto, unidades são definidas como 0,1 a 20 unidades/g de polpa, onde uma unidade equivale a umol de xilose liberado por minuto por mg de enzima, usando arabinoxilano como um substrato como descrito no ensaio de Nelson Somogy, descrito em detalhe abaixo. Em aspectos alternativos, polipeptídeos da invenção apresentam atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase na faixa entre cerca de 0,05 a 20 unidades por grama de polpa ou 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,50, 0,60, 0,70, 0,80, 0,90, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais unidades por grama de polpa (onde uma unidade equivale a umol de xilose liberado por minuto por mg de enzima, usando arabinoxilano como um substrato como descrito no ensaio de Nelson Somogy).
[0055] Em um aspecto, a termotolerância compreende a retenção de pelo menos metade da atividade específica de xilanase, mananase e/ou glicanase a 37°C após ser aquecida até uma temperatura elevada. A termotolerância pode compreender retenção de atividade específica a 37°C na faixa entre cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína após ser aquecida até uma temperatura elevada.
[0056] Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção podem compreender pelo menos um sítio de glicosilação ou ainda compreender um polissacarídeo. A glicosilação pode ser uma glicosilação N-ligada, por exemplo, em que o polipeptídeo é glicosilado após ser expresso em P. pastoris ou S. pombe.
[0057] Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou
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35/510 glicanase de polipeptídeos da invenção retém atividade sob condições ácidas que compreendem cerca de pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 ou pH 4 ou menos (mais ácido), ou retém atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição à condições ácidas que compreendem cerca de pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 ou pH 4 ou menos (mais ácido); ou retém atividade sob condições básicas que compreendem cerca de pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 ou mais (mais básico) ou retém atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase após exposição a condições básicas que compreendem cerca de pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 ou mais (mais básico). Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase de polipeptídeos da invenção retém atividade em uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C ou 90°C e um pH básico de pelo menos cerca de pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 ou mais (mais básico).
[0058] A invenção fornece preparação de proteína que compreende um polipeptídeo da invenção, em que a preparação de proteína compreende um líquido, uma pasta, um sólido ou um gel. A invenção fornece heterodímeros que compreendem um polipeptídeo da invenção e um segundo domínio. O segundo domínio pode ser um polipeptídeo e o heterodímero é uma proteína de fusão. O segundo domínio pode ser um epitopo ou um sinalizador.
[0059] A invenção fornece homodímeros ou heterodímeros que compreendem o polipeptídeo da invenção. A invenção fornece polipeptídeos imobilizados, em que os polipeptídeos compreendem uma sequência da invenção ou uma subsequência desta, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção ou um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo da invenção e um segundo domínio, por
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36/510 exemplo, em que o polipeptídeo está imobilizado sobre ou dentro de uma célula, uma vesícula, um lipossomo, uma película, uma membrana, um metal, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo, uma partícula de grafite, uma esfera, uma placa, um arranjo, um tubo capilar, um cristal, um comprimido, uma pílula, uma cápsula, um pó, um aglomerado, uma superfície, uma estrutura porosa, ou materiais tais como lascas de madeira, polpa marrom, polpa, papel e materiais derivados destes.
[0060] As xilanases e/ou glicanases da invenção podem ser usadas ou formuladas sozinhas ou como uma mistura (um “coquetel”) de xilanases e/ou glicanases e outras enzimas hidrolíticas tais como celulases, mananases, proteases, lipases, amilases, ou enzimas redox tais como lacases, peroxidases, catalases, oxidases, ou redutases. Elas podem ser usadas formuladas em uma forma sólida tal como um pó, uma preparação liofilizada, um grânulo, um comprimido, uma barra, um cristal, uma cápsula, uma pílula, um pelete, ou em forma líquida tal como uma solução aquosa, um aerossol, um gel, uma pasta, uma pasta fluida, uma emulsão água/óleo, um creme, uma cápsula ou em suspensão vesicular ou micelar. As formulações da invenção podem compreender qualquer um ou uma combinação dos seguintes ingredientes: polióis tal como um polietileno glicol, um polivinilálcool, um glicerol, um açúcar tal como uma sacarose, um sorbitol, uma trealose, uma glicose, uma frutose, uma maltose, uma manose, um agente gelificante tal como goma guar, carragena, alginato, dextranos, um derivado celulósico, uma pectina, um sal tal como um cloreto de sódio, um sulfato de sódio, um sulfato de amônio, um cloreto de cálcio, um cloreto de magnésio, um cloreto de zinco, sulfato de zinco, um sal de um ácido graxo ou um derivado de um ácido graxo, um quelante de metal tal como EDTA, EGTA, um citrato de sódio, um agente antimicrobiano tal como um ácido graxo ou derivado de ácido graxo, um parabeno, um sorbato, um
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37/510 benzoato, um composto modulador adicional para bloquear o impacto de uma enzima tal como uma protease, uma conjunto de proteínas tal como BSA, um hidrolisado de trigo, um composto de borato, um aminoácido ou um peptídeo, um composto modulador de pH ou temperatura apropriado, um emulsificante tal como um detergente não-iônico e/ou iônico, um agente redox tal como uma cistina/cisteína, uma glutationa, uma glutationa oxidada, um composto reduzido ou um antioxidante tal como um ácido ascórbico ou um dispersante. Reticulação e modificação de proteína tal como peguilação, modificação com ácido graxo, glicosilação podem também ser usados para melhorar a estabilidade da enzima.
[0061] A invenção fornece arranjos que compreendem polipeptídeo(s) imobilizado(s) e/ou ácidos nucléicos da invenção e arranjos que compreendem um oligonucleotídeo imobilizado da invenção. As enzimas, fragmentos destas e ácidos nucléicos que codificam as enzimas ou sondas da invenção e fragmentos destas, podem ser fixadas a um suporte sólido; e essas modalidades podem ser econômicas e eficientes no uso de enzimas e ácidos nucléicos da invenção em processos industriais, médicos, de pesquisa, farmacêuticos, alimentícios e de ração e suplementos alimentícios e para ração e outras aplicações e processos. Por exemplo, uma associação ou coquetel de enzimas (ou fragmentos ativos destas), que são usadas em uma reação química específica, pode ser acoplado a um suporte sólido e imerso em um tanque de processamento. A reação enzimática pode ocorrer. Então, o suporte sólido pode ser retirado do tanque, junto com as enzimas afixadas a ele, para uso repetido. Em uma modalidade da invenção, o ácido nucléico isolado é fixado a um suporte sólido. Em outra modalidade, o suporte sólido é selecionado a partir do grupo de um gel, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo e qualquer combinação destes.
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38/510 [0062] Por exemplo, suportes sólidos úteis nessa invenção incluem géis. Alguns exemplos de géis incluem sefarose, gelatina, glutaraldeído, glutaraldeído tratado com quitosana, albumina-glutaraldeído, quitosana-Xantana, gel toyopearl (gel polimérico), alginato, alginatopolilisina, carragena, agarose, glioxil agarose, agarose magnética, dextran-agarose, hidrogel de poli(Carbamoil Sulfonato), hidrogel de BSAPEG, álcool polivinílico fosforilado (PVA), monoaminoetil-N-aminoetil (MANA), amino, ou qualquer combinação destes. Outros suportes sólidos úteis na presente invenção são resinas ou polímeros. Alguns exemplos de resinas ou polímeros incluem celulose, acrilamida, náilon, raiom, poliéster, resina de troca de ânion, AMBERLITE® XAD-7, AMBERLITE® XAD-8, AMBERLITE® IRA-94, AMBERLITE® IRC-50, polivinil, poliacrílico, polimetacrilato, ou qualquer combinação destes. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é a cerâmica. Alguns exemplos incluem cerâmica não porosa, cerâmica porosa, SiO2, Al2O3. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é o vidro. Alguns exemplos incluem vidro não poroso, vidro poroso, vidro de aminopropila ou qualquer combinação destes. Outro tipo de suporte sólido que pode ser usado é um microeletrodo. Um exemplo é uma magnetita coberta com polietilenoimina. Partículas de grafite também podem ser usadas como um suporte sólido. Outro exemplo de um suporte sólido é uma célula, tal como uma célula vermelha do sangue.
[0063] Há vários métodos que são conhecidos de um versado na técnica para imobilizar enzimas ou fragmentos destas, ou ácidos nucléicos sobre um suporte sólido. Alguns exemplos de tais métodos incluem geração de gotas eletrostáticas, meios eletroquímicos, através de adsorção, através de ligação covalente, através de reticulação, através de uma reação ou processo químico, através de encapsulamento, através de aprisionamento, através de alginato de cálcio, ou através de poli(2-hidroxietil metacrilato). Métodos semelhantes são
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39/510 descritos em Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Parte C. 1987. Academic Press. Editado por S. P. Colowick & N. O. Kaplan. Volume 136; e Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Editado por G. F. Bickerstaff. Série: Methods in Biotechnology, Editada por: J. M. Walker.
[0064] A invenção fornece anticorpos isolados, sintéticos ou recombinantes que se ligam especificamente a um polipeptídeo da invenção. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal, ou é um anticorpo de cadeia única. A invenção fornece hibridomas que compreendem um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo da invenção.
[0065] A invenção fornece métodos de isolar ou identificar um polipeptídeo com uma atividade de atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase compreendendo as etapas de: (a) fornecer um anticorpo da invenção; (b) fornecer uma amostra que compreende polipeptídeos; e (c) colocar a amostra da etapa (b) em contato com um anticorpo da etapa (a) sob condições em que o anticorpo pode se ligar especificamente ao polipeptídeo, dessa forma isolando ou identificando um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase. A invenção fornece métodos de fazer um anticorpo antixilanase e/ou antiglicanase que compreende administrar a um animal nãohumano um ácido nucléico da invenção, ou uma subsequência deste, em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune humoral, fazendo assim um anticorpo antixilanase e/ou antiglicanase. A invenção fornece métodos de fazer um anticorpo antixilanase e/ou antiglicanase que compreende administrar a um animal não-humano um polipeptídeo da invenção, ou uma subsequência deste, em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune humoral, fazendo assim um anticorpo antixilanase e/ou antiglicanase.
[0066] A invenção fornece métodos de produzir um polipeptídeo
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40/510 recombinante que compreende as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico operativamente ligado a um promotor, em que o ácido nucléico compreende uma sequência da invenção; e (b) expressar o ácido nucléico da etapa (a) sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo, produzindo assim um polipeptídeo recombinante, O método pode ainda compreender transformar uma célula hospedeira com o ácido nucléico da etapa (a) seguido por expressar o ácido nucléico da etapa (a), produzindo assim um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada.
[0067] A invenção fornece métodos para identificar um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção; (b) fornecer um substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase; e (c) colocar o polipeptídeo em contato com o substrato da etapa (b) e detectar uma diminuição na quantidade de substrato ou um aumento na quantidade de um produto da reação, em que uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação detecta um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase.
[0068] A invenção fornece métodos para identificar um substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção; (b) fornecer um substrato de teste; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com o substrato de teste da etapa (b) e detectar uma diminuição na quantidade de substrato ou um aumento na quantidade de produto de reação, em que uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação identifica o substrato de teste como um substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase. [0069] A invenção fornece métodos de determinar se um composto de teste se liga especificamente a um polipeptídeo, compreendendo
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41/510 as seguintes etapas: (a) expressar um ácido nucléico ou um vetor que compreende o ácido nucléico sob condições permissivas para tradução do ácido nucléico para um polipeptídeo, em que o ácido nucléico tem uma sequência da invenção; (b) fornecer um composto de teste; (c) colocar o polipeptídeo em contato com o composto de teste; e (d) determinar se o composto de teste da etapa (b) se liga especificamente ao polipeptídeo.
[0070] A invenção fornece métodos de determinar se um composto de teste se liga especificamente a um polipeptídeo, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção; (b) fornecer um composto de teste; (c) colocar o polipeptídeo em contato com o composto de teste; e (d) determinar se o composto de teste da etapa (b) se liga especificamente ao polipeptídeo.
[0071] A invenção fornece métodos para identificar um modulador de uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção; (b) fornecer um composto de teste; (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com o composto de teste da etapa (b) e medir uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que uma alteração na atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase medida na presença do composto de teste comparada com a atividade na ausência do composto de teste fornece uma determinação de que o composto de teste modula a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase. A atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase pode ser medida por fornecer um substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase e detectar uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação, ou, um aumento na quantidade do substrato, ou uma diminuição na quantidade de um produto de reação. Em um aspecto, uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação com o composto
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42/510 de teste quando comparado com a quantidade do substrato ou do produto de reação sem o composto de teste identifica o composto de teste como um ativador de uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, um aumento na quantidade do substrato ou uma diminuição na quantidade do produto de reação com o composto de teste quando comparado com a quantidade do substrato ou do produto de reação sem o composto de teste identifica o composto de teste como um inibidor da atividade de uma xilanase, mananase e/ou glicanase.
[0072] A invenção fornece sistemas de computador que compreendem um processador e um dispositivo de armazenamento de dados em que o dito dispositivo de armazenamento de dados tem armazenado nele uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucléico, em que a sequência de polipeptídeo compreende uma sequência da invenção, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. Os sistemas de computador compreendem ainda um algoritmo de comparação de sequência e um dispositivo de armazenamento de dados que tem pelo menos uma sequência de referência armazenada nele. Em outro aspecto, o algoritmo de comparação de sequência compreende um programa de computador que indica polimorfismos. Em um aspecto, o sistema de computador pode ainda compreender um identificador que identifica uma ou mais características na dita sequência. A invenção fornece meios de leitura em computador que apresentam armazenada neles uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido da invenção. A invenção fornece métodos para identificar uma característica em uma sequência que compreendem as etapas de: (a) ler a sequência usando um programa de computador que identifica uma ou mais características em uma sequência, em que a sequência compreende uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucléico da invenção; e (b) identificar
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43/510 uma ou mais características na sequência com o programa de computador. A invenção fornece métodos para comparar uma primeira sequência a uma segunda sequência, compreendendo as etapas de: (a) ler a primeira sequência e a segunda sequência através do uso de um programa de computador que compara sequências, em que a primeira sequência compreende uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucléico da invenção; e (b) determinar as diferenças entre a primeira sequência e a segunda sequência com o programa de computador. A etapa de determinar diferenças entre a primeira sequência e a segunda sequência compreende ainda a etapa de identificar polimorfismos. Em um aspecto, o método pode ainda compreender um identificador que identifica uma ou mais características em uma sequência. Em outro aspecto, o método pode compreenderr ler a primeira sequência usando um programa de computador e identificar uma ou mais características na sequência.
[0073] A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase a partir de uma amostra do ambiente que compreende as etapas de: (a) fornecer um par de sequências de iniciadores de amplificação para amplificar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o par de iniciadores é capaz de amplificar um ácido nucléico da invenção; (b) isolar um ácido nucléico da amostra do ambiente ou tratar a amostra do ambiente tal que o ácido nucléico na amostra seja acessível para hibridização ao par de iniciadores de amplificação da etapa (a); e (c) combinar o ácido nucléico da etapa (b) com o par de iniciadores de amplificação da etapa (a); e amplificar o ácido nucléico a partir da amostra do ambiente, dessa forma isolando ou recuperando um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase da
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44/510 amostra do ambiente. Um ou cada membro do par de sequências de iniciadores de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo que compreende pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas de uma sequência da invenção. Em um aspecto, o par de sequências de iniciadores de amplificação é um par de amplificação da invenção. [0074] A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase a partir de uma amostra do ambiente que compreende as etapas de: (a) fornecer uma sonda de polinucleotídeo que compreende um ácido nucléico da invenção ou uma subsequência deste; (b) isolar um ácido nucléico da amostra do ambiente ou tratar a amostra do ambiente tal que o ácido nucléico na amostra seja acessível para hibridização a uma sonda de polinucleotídeo da etapa (a); (c) combinar o ácido nucléico isolado ou a amostra do ambiente tratada da etapa (b) com a sonda de polinucleotídeo da etapa (a); e (d) isolar um ácido nucléico que hibridiza especificamente com a sonda de polinucleotídeo da etapa (a), dessa forma isolando ou recuperando um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase a partir de uma amostra do ambiente. A amostra do ambiente pode compreender uma amostra de água, uma amostra de líquido, uma amostra de solo, uma amostra de ar, ou uma amostra biológica. Em um aspecto, a amostra biológica pode ser derivada de uma célula bacteriana, uma célula de protozoário, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula de fungo, ou uma célula de mamífero.
[0075] A invenção fornece métodos de gerar uma variante de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico molde que compreende um ácido nucléico da invenção; e (b) modificar, deletar ou adicionar um ou mais nucleotíPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 50/525
45/510 deos na sequência molde, ou uma combinação destes, para gerar uma variante do ácido nucléico molde. Em um aspecto, o método pode compreender ainda expressar o ácido nucléico variante para gerar um polipeptídeo de xilanase, a mananase e/ou a glicanase variante. As modificações, adições ou deleções podem ser introduzidas por um método que compreende “error-prone” PCR, embaralhamento, mutagênese sítio-direcionada, “assembly” PCR, mutagênese por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de agrupamentos repetitivos, mutagênese de agrupamento exponencial, mutagênese sítio-específica, reagrupamento de genes (por exemplo, GeneReassembly, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6 .537.776), Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene (Gene Site Saturation Mutagenesis (GSSM)), reagrupamento por ligação sintética (synthetic ligation reassembly (SLR)) ou uma combinação destes. Em outro aspecto, as modificações, adições ou deleções são introduzidas por um método que compreende recombinação, recombinação de sequência repetitiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese de molde contendo uracila, mutagênese de dúplex interrompido, mutagênese de reparo de mal-pareamentos pontuais, mutagênese por cepas do hospedeiro deficientes em reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese por deleção, mutagênese por seleção de restrição, mutagênese por purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de agrupamentos, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e uma combinação destes.
[0076] Em um aspecto, o método pode ser repetido iterativamente até que uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase que tem uma atividade alterada ou diferente ou uma estabilidade alterada ou diferente daquela de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico é produzida. Em um aspecto, o polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase variante é termotolerante, e retém alguma atividade após ser
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46/510 exposto a uma temperatura elevada. Em outro aspecto, o polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase tem glicosilação aumentada quando comparado à xilanase, à mananase e/ou à glicanase codificada pelo ácido nucléico molde. Alternativamente, o polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase variante tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob uma alta temperatura, em que a xilanase, mananase e/ou glicanase codificada pelo ácido nucléico molde não é ativa sob a alta temperatura. Em um aspecto, método pode ser repetido iterativamente até que uma sequência codificante de xilanase, mananase e/ou glicanase que tem um uso de códon diferente daquele do ácido nucléico molde é produzida. Em outro aspecto, o método pode ser repetido iterativamente até que um gene de xilanase, mananase e/ou glicanase que tem um nível maior ou menor de expressão de mensagem ou estabilidade do que aquele do ácido nucléico molde é produzido. Em outro aspecto, a formulação do produto final de xilanase, mananase e/ou glicanase permite um aumento ou modulação do desempenho da xilanase, mananase e/ou glicanase no produto.
[0077] A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase; e, (b) identificar um códon não-preferido ou menos preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo por um códon preferido ou usado de forma neutra que codifica o mesmo aminoácido que o códon substituído, em que um códon preferido é super-representado em sequências codificantes em genes na célula hospedeira e um códon não preferido ou menos preferido é sub-representado em sequências codiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 52/525
47/510 ficantes em genes na célula hospedeira, modificando assim o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira. [0078] A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção; e (b) identificar um códon no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo por um códon diferente que codifica o mesmo aminoácido que o códon substituído, modificando assim códons em um ácido nucléico que codifica uma xilanase, mananase e/ou glicanase.
[0079] A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção que codifica um polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase; e, (b) identificar um códon não preferido ou menos preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo por um códon preferido ou usado de forma neutra que codifica o mesmo aminoácido que o códon substituído, em que um códon preferido é um códon super-representado em sequências codificantes em genes na célula hospedeira e um códon não-preferido ou menos preferido é um códon sub-representado em sequências codificantes em genes na célula hospedeira, modificando assim o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira.
[0080] A invenção fornece métodos para modificar um códon em um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção; e (b) identificar pelo menos um códon preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo
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48/510 por um códon não-preferido ou menos preferido que codifica o mesmo aminoácido que o códon substituído, em que um códon preferido é um códon super-representado em sequências codificantes em genes em uma célula hospedeira, e um códon não-preferido ou menos preferido é um códon sub-representado em sequências codificantes em genes na célula hospedeira, modificando assim o ácido nucléico para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira. Em um aspecto, a célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, uma célula de fungo, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta ou uma célula de mamífero.
[0081] A invenção fornece métodos para produzir uma biblioteca de ácidos nucléicos que codifica uma pluralidade de sítios ativos ou sítios de ligação de substrato modificados de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que os sítios ativos ou sítios de ligação de substrato modificados são derivados de um primeiro ácido nucléico que compreende uma sequência que codifica um primeiro sítio ativo ou um primeiro sítio de ligação de substrato, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um primeiro ácido nucléico que codifica um primeiro sítio ativo ou um primeiro sítio de ligação de substrato, em que a primeira sequência de ácido nucléico compreende uma sequência que hibridiza sob condições estringentes a uma sequência da invenção, ou uma subsequência desta, e o ácido nucléico codifica um sítio ativo de xilanase, mananase e/ou glicanase ou um sítio de ligação de substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase; (b) fornecer um conjunto de oligonucleotídeos mutagênicos que codificam variantes de aminoácido de ocorrência natural em uma pluralidade de códons alvo no primeiro ácido nucléico; e (c) usar o conjunto de oligonucleotídeos mutagênicos para gerar um conjunto de ácidos nucléicos variantes codificantes de sítio ativo ou codificantes de sítio de ligação de substrato que codificam uma gama de variações de aminoácido em cada códon
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49/510 de aminoácido que foi mutagenizado, produzindo assim uma biblioteca de ácidos nucléicos que codifica uma pluralidade de sítios ativos ou sítios de ligação de substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) por um método que compreende um sistema de evolução dirigida otimizado, Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene (GSSM), ou reagrupamento por ligação sintética (SLR). Em um aspecto, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método que compreende “errorprone” PCR, embaralhamento, mutagênese sítio direcionada, “assembly” PCR, mutagênese por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de agrupamentos repetitivos, mutagênese de agrupamento exponencial, mutagênese sítio-específica, reagrupamento de genes (GeneReassembly, Patente U.S. N° 6.537.776), Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene (GSSM), reagrupamento por ligação sintética (SLR) e uma combinação destes. Em um aspecto, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método que compreende recombinação, recombinação de sequência repetitiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese de molde contendo uracila, mutagênese de dúplex interrompido, mutagênese de reparo de mal-pareamentos pontuais, mutagênese por cepas do hospedeiro deficientes em reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese por deleção, mutagênese por seleção de restrição, mutagênese por purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de agrupamentos, criação de multímero de ácido nucléico quimérico ou uma combinação destes.
[0082] A invenção fornece métodos para fazer uma pequena molécula que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma pluralidade de enzimas biossintéticas capazes de sintetizar ou modificar uma
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50/510 pequena molécula, em que uma das enzimas compreende uma xilanase, mananase e/ou glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato para pelo menos uma das enzimas da etapa (a); e (c) reagir o substrato da etapa (b) com as enzimas sob condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas para gerar uma pequena molécula por uma série de reações biocatalíticas. A invenção fornece métodos para modificar uma pequena molécula que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase, em que a enzima compreende um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; ou uma subsequência deste; (b) fornecer uma pequena molécula; e (c) reagir a enzima da etapa (a) com a pequena molécula da etapa (b) sob condições que facilitam uma reação enzimática catalisada pela enzima xilanase, mananase e/ou glicanase, modificando assim uma pequena molécula por uma reação enzimática de xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, o método pode compreender uma pluralidade de substratos de pequenas moléculas para a enzima da etapa (a), gerando assim uma biblioteca de pequenas moléculas modificadas produzidas por pelo menos uma reação enzimática catalisada pela enzima xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, o método pode compreender uma pluralidade de enzimas adicionais que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas pelas enzimas para formar uma biblioteca de pequenas moléculas modificadas produzidas pela pluralidade de reações enzimáticas. Em outro aspecto, o método pode ainda compreender a etapa de testar a biblioteca para determinar se uma pequena molécula modificada em particular que exibe uma atividade desejada está presente dentro da biblioteca. A etapa de testar a biblioteca pode ainda compreender as etapas de eliminar sistematicamente todas menos uma das reações biocatalíticas usadas para produzir uma porção da pluralidade das pePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 56/525
51/510 quenas moléculas modificadas dentro da biblioteca por testar a porção da pequena molécula modificada quanto à presença ou ausência da pequena molécula modificada em particular com uma atividade desejada, e identificar pelo menos uma reação biocatalítica que produz a pequena molécula modificada particular de atividade desejada.
[0083] A invenção fornece métodos para determinar um fragmento funcional de uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende as etapas de: (a) fornecer uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase, em que a enzima compreende um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou uma subsequência deste; e (b) deletar uma pluralidade de resíduos de aminoácido da sequência da etapa (a) e testar a subsequência remanescente quanto a uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, determinando assim um fragmento funcional de uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é medida por fornecer um substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase e detectar uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação.
[0084] A invenção fornece métodos para a manipulação de células inteiras de fenótipos novos ou modificados pelo uso de análise de fluxo metabólico em tempo real, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fazer uma célula modificada por modificar a composição genética de uma célula, em que a composição genética é modificada pela adição à célula de um ácido nucléico da invenção; (b) cultivar a célula modificada para gerar uma pluralidade de células modificadas; (c) medir pelo menos um parâmetro metabólico da célula por monitorar a cultura celular da etapa (b) em tempo real; e (d) analisar os dados da etapa (c) para determinar se o parâmetro medido difere de uma medida comparável em uma célula não modificada sob condições similares,
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52/510 identificando assim um fenótipo manipulado na célula usando análise de fluxo metabólico em tempo real. Em um aspecto, a composição genética da célula pode ser modificada por um método que compreende deleção de uma sequência ou modificação de uma sequência na célula, ou nocaute da expressão de um gene. Em um aspecto, o método ainda pode compreender selecionar uma célula que compreende um fenótipo recentemente manipulado. Em outro aspecto, o método pode compreender ainda cultivar a célula selecionada, gerando assim uma nova linhagem celular que compreende um fenótipo recentemente manipulado.
[0085] A invenção fornece sequências de sinal isoladas, sintéticas ou recombinantes que consistem em, ou compreendem, uma sequência descrita nos resíduos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a
27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, a 37, 1 a 38, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43 ou 1 a 44 de um polipeptídeo da invenção, incluindo sequências de polipeptídeo exemplares da invenção. A invenção fornece sequências de sinal isoladas, sintéticas ou recombinantes que consistem em, ou compreendem sequências descritas na Tabela 4 abaixo.
[0086] A invenção fornece polipeptídeos quiméricos que compreendem pelo menos um primeiro domínio que compreende um peptídeo de sinal (SP) e pelo menos um segundo domínio que compreende um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo que compreende uma sequência da invenção, ou uma subsequência desta, em que o polipeptídeo ou peptídeo heterólogo não está associado naturalmente com o peptídeo de sinal (SP). Em um aspecto, o peptídeo de sinal (SP) não é derivado de uma xilanase, mananase e/ou glicanase. O polipeptídeo ou peptídeo heterólogo pode ser amino terminal a, carbóxi terminal a, ou estar em ambas as extremidades do peptídeo de sinal (SP) ou de um domíPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 58/525
53/510 nio catalítico (CD) de uma xilanase, mananase e/ou glicanase. A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que codificam um polipeptídeo quimérico, em que o polipeptídeo quimérico compreende pelo menos um primeiro domínio que compreende um peptídeo de sinal (SP) e pelo menos um segundo domínio que compreende um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo que compreende uma sequência da invenção, ou uma subsequência desta, em que o polipeptídeo ou peptídeo heterólogo não está naturalmente associado com o peptídeo de sinal (SP).
[0087] A invenção fornece métodos de aumentar a termotolerância ou termoestabilidade de um polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase, o método compreendendo glicosilar um polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo compreende pelo menos trinta aminoácidos contíguos de um polipeptídeo da invenção; ou um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucléico da invenção, aumentando assim a termotolerância ou termoestabilidade do polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, a atividade especifica de xilanase, mananase e/ou glicanase pode ser termoestavel ou termotolerante em uma temperatura na faixa de mais do que cerca de 37°C a cerca de 85°C, 90°C, 95°C, 97°C ou mais.
[0088] A invenção fornece métodos para superexpressar um polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase recombinante em uma célula, compreendendo expressar um vetor que compreende um ácido nucléico da invenção ou uma sequência de ácido nucléico da invenção, em que as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual, em que a superexpressão é afetada pelo uso de um promotor de alta atividade, um vetor bicistrônico, ou por amplificação gênica do vetor.
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54/510 [0089] A invenção fornece métodos de fazer uma planta e sementes transgênicas, compreendendo as seguintes etapas: (a) introduzir uma sequência de ácido nucléico heteróloga na célula, em que a sequência de ácido nucléico heterólogo compreende uma sequência de ácido nucléico da invenção, produzindo assim uma célula de planta ou semente transformada; e (b) produzir uma planta transgênica a partir da célula ou semente transformada. Em um aspecto, a etapa (a) pode ainda compreender introduzir a sequência de ácido nucléico heterólogo por eletroporação ou microinjeção de protoplastos de célula de planta. Em outro aspecto, a etapa (a) pode ainda compreender introduzir a sequência de ácido nucléico heterólogo diretamente em um tecido de planta por bombardeio de partículas de DNA. Alternativamente, a etapa (a) pode ainda compreender introduzir a sequência de ácido nucléico heterólogo no DNA da célula de planta usando um hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, milho, arroz, trigo, tabaco, ou cevada.
[0090] A invenção fornece métodos de expressar uma sequência de ácido nucléico heterólogo em uma célula de planta que compreende as seguintes etapas: (a) transformar a célula de planta com uma sequência de ácido nucléico heterólogo operativamente ligada a um promotor, em que a sequência de ácido nucléico heterólogo compreende um ácido nucléico da invenção; (b) cultivar a planta sob condições em que a sequência de ácido nucléico heterólogo seja expressa na célula de planta. A invenção fornece métodos de expressar uma sequência de ácido nucléico heterólogo em uma planta, compreendendo as seguintes etapas: (a) transformar a célula de planta com uma sequência de ácido nucléico heterólogo operativamente ligada a um promotor, em que a sequência de ácido nucléico heterólogo compreende uma sequência da invenção; (b) cultivar a planta sob condiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 60/525
55/510 ções em que a sequência de ácido nucléico heterólogo seja expressa na célula de planta.
[0091] A invenção fornece métodos para hidrolisar, quebrar ou romper uma composição que compreende xilano, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição que compreende um xilano; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com a composição da etapa (b) sob condições em que a xilanase, mananase e/ou glicanase hidrolisa, quebra ou rompe a composição que compreende xilano. Em um aspecto, a composição compreende uma célula de planta, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula de inseto, ou uma célula de animal. Dessa forma, a composição pode compreender qualquer planta ou parte de planta, qualquer alimento ou ração que contém xilano, um produto residual e semelhantes.
[0092] A invenção fornece métodos para liquefazer ou remover uma composição que compreende xilano, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição que compreende um xilano; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com a composição da etapa (b) sob condições em que a xilanase remover, amolece ou liquefaz a composição que contém xilano.
[0093] A invenção fornece composições detergentes que compreendem um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, em que o polipeptídeo tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase. A xilanase pode ser uma xilanase, mananase e/ou glicanase sem atividade na superfície, ou uma xilanase, mananase e/ou glicanase com atividade de superfície. A
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56/510 xilanase, mananase e/ou glicanase pode ser formulada em uma composição líquida não-aquosa, um sólido moldado, uma forma granular, uma forma particulada, um tablete comprimido, uma forma em gel, uma pasta ou uma forma de pasta fluida. A invenção fornece métodos para lavar um objeto que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição que compreende um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um objeto; e (c) colocar a o polipeptídeo da etapa (a) com o objeto da etapa (b) sob condições em que a composição pode lavar o objeto.
[0094] A invenção fornece têxteis ou tecidos, incluindo, por exemplo, fios, que compreendem um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, os têxteis ou tecidos compreendes fibras que contêm xilano. A invenção fornece métodos para tratar um têxtil ou tecido (por exemplo, remover uma mancha de uma composição) compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição que compreende um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um têxtil ou tecido que compreende um xilano; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com a composição da etapa (b) sob condições em que a xilanase, mananase e/ou glicanase possa tratar o têxtil ou tecido (por exemplo, remover a mancha). A invenção fornece métodos para melhorar o acabamento de um tecido compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição que compreende um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um tecido; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com o tecido da etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo possa tratar o tecido
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57/510 melhorando assim o acabamento do tecido. Em um aspecto, o tecido é lã ou seda. Em outro aspecto, o tecido é uma fibra celulósica ou uma mistura de uma fibra natural e uma fibra sintética.
[0095] A invenção fornece rações ou alimentos que compreendem um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos para hidrolisar xilanos em uma ração ou alimento antes do consumo por um animal compreendendo as seguintes etapas: (a) obter um material de ração que compreende uma xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção, ou uma xilanase, mananase e/ou glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; e (b) adicionar o polipeptídeo da etapa (a) ao material de ração ou alimento em uma quantidade suficiente por um período de tempo suficiente para causar hidrólise do xilano e formação de um alimento ou ração tratada, hidrolisando assim os xilanos no alimento ou na ração antes do consumo pelo animal. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para hidrolisar xilanos em uma ração ou alimento após o consumo por um animal, compreendendo as seguintes etapas: (a) obter um material de ração que compreende uma xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção, ou uma xilanase, mananase e/ou glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; e (b) adicionar o polipeptídeo da etapa (a) ao material de ração ou alimento; e (c) administrar o material de ração ou alimento ao animal, em que após o consumo, a xilanase, mananase e/ou glicanase causa hidrolise de xilanos na ração ou alimento no trato digestivo do animal. O alimento ou a ração pode ser, por exemplo, um cereal, um grão, milho, semelhantes.
[0096] A invenção fornece produtos de massa de farinha ou pão que compreendem um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo compreende uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um
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58/510 ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse. A invenção fornece métodos de acondicionar massa de farinha que compreendem colocar uma massa de farinha ou um produto de pão em contato com pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo compreende uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse, sob condições suficientes para acondicionar a massa de farinha.
[0097] A invenção fornece bebidas que compreendem um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo compreende uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção. A invenção fornece métodos de produção de bebida que compreendem a administração de pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo compreende uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse, a uma bebida ou precursor de bebida sob condições suficientes para diminuir a viscosidade da bebida, em que em um aspecto (opcionalmente) bebida ou o precursor de bebida é um mosto ou uma cerveja.
[0098] A invenção fornece alimentos ou suplementos nutricionais para um animal, que compreendem um polipeptídeo da invenção, por exemplo, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, o polipeptídeo no alimento ou suplemento nutricional pode ser glicosilado. A invenção fornece matrizes de liberação de enzima comestíveis que compreendem um polipeptídeo da invenPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 64/525
59/510 ção, por exemplo, um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, a matriz de liberação compreende um pélete. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado. Em um aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é termotolerante. Em outro aspecto, a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase é termoestável.
[0099] A invenção fornece um alimento, uma ração ou suplemento nutricional que compreende um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece métodos para utilizar uma xilanase, mananase e/ou glicanase como um suplemento nutricional em uma dieta animal, o método compreendendo: preparar um suplemento nutricional contendo uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase que compreende pelo menos trinta aminoácidos contíguos de um polipeptídeo da invenção; e administrar o suplemento nutricional a um animal para aumentar a utilização de um xilano contido em uma ração ou alimento ingerido pelo animal. O animal pode ser um ser humano, um ruminante ou um animal monogástrico. A enzima xilanase, mananase e/ou glicanase pode ser preparada pela expressão de um polinucleotídeo que codifica a xilanase, mananase e/ou glicanase em um organismo selecionado a partir do grupo que consiste em uma bactéria, uma levedura, uma planta, um inseto, um fungo e um animal. O organismo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em S. pombe, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Pseudomonas sp. E. coli, Streptomyces sp., Bacillus sp. e Lactobacillus sp.
[00100] A invenção fornece matriz de liberação de enzima comestível que compreende uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase recombinante termoestável, por exemplo, um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece métodos para liberar um suplemento de xilanase, mananase e/ou glicanase a um animal, o método compreendendo: preparar uma matriz de liberação de enzima comestível na forma
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60/510 de péletes que compreendem um veículo granulado comestível e uma enzima xilanase, mananase e/ou glicanase recombinante termoestável, em que os péletes dispersam facilmente a enzima xilanase, mananase e/ou glicanase neles em meio aquoso, e administrar a matriz de liberação de enzima comestível ao animal. A enzima xilanase, mananase e/ou glicanase recombinante pode compreender um polipeptídeo da invenção. O veículo comestível granulado compreende um veículo selecionado a partir do grupo que consiste em um germe de grão, um germe de grão que tem o óleo extraído, um feno, uma alfafa, grama (Timothy), uma casca de soja, uma farinha de semente de girassol, e um farelo de trigo. O veículo comestível pode compreender germe de grão que tem o óleo extraído. A enzima xilanase, a mananase e/ou a glicanase pode ser glicosilada para fornecer termoestabilidade em condições de peletização. A matriz de liberação pode ser formada por peletizar uma mistura que compreende um germe de grão e uma xilanase, mananase e/ou glicanase. As condições de peletização podem incluir aplicação vapor. As condições de peletização podem compreender a aplicação de uma temperatura acima de cerca de 80°C por cerca de 5 minutos e a enzima retém uma atividade específica de pelo menos 350 a cerca de 900 unidades por miligrama de enzima.
[00101] A invenção fornece métodos para melhorar a textura e sabor de um produto lácteo, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um produto lácteo; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com o produto lácteo da etapa (b) sob condições em que a xilanase, mananase e/ou glicanase possa melhorar a textura ou o sabor de um produto lácteo. Em um aspecto, o produto lácteo compreende um queijo ou um iogurte. A invenção fornece produtos lácteos
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61/510 que compreendem uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase da invenção, ou que é codificada por um ácido nucléico da invenção. [00102] A invenção fornece métodos para melhorar a extração de óleo de uma planta rica em óleo, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer material de uma planta rica em óleo; (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com o material da planta rica em óleo. Em um aspecto, o material da planta rica em óleo compreende uma semente rica em óleo. O óleo pode ser um óleo de soja, um óleo de oliva, um óleo de colza (canola) ou um óleo de girassol.
[00103] A invenção fornece métodos para preparar um suco, xarope, purê ou extrato de fruta ou vegetal, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição ou um líquido que compreende um material de fruta ou vegetal; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com a composição, preparando assim o suco, xarope, purê ou extrato de fruta ou vegetal.
[00104] A invenção fornece papéis ou produtos de papel ou polpa de papel que compreendem uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos de tratar um papel ou uma polpa de papel ou madeira compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer uma composição que compreende um papel ou uma
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62/510 polpa de papel ou madeira; e (c) colocar o polipeptídeo da etapa (a) em contato com a composição da etapa (b) sob condições em que uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase possam tratar o papel ou polpa de papel ou madeira.
[00105] A invenção fornece métodos para reduzir a quantidade de lignina (deslignificação), ou solubilizar uma lignina, em um papel ou produto de papel, um resíduo de papel, uma madeira, polpa de madeira, ou produto de madeira, ou uma composição de reciclagem de madeira ou papel, que compreende colocar o papel ou produto de papel, madeira, polpa de madeira, ou produto de madeira, ou composição de reciclagem de madeira ou papel em contato com um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste.
[00106] A invenção fornece métodos para hidrolisar hemiceluloses em uma madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo de papel, compreendendo colocar a madeira, produto de madeira, polpa de papel, produto de papel ou resíduo de papel em contato com um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste.
[00107] A invenção fornece métodos para alvejante enzimático de polpa de papel, cânhamo ou linho, que compreendem colocar a polpa de papel, cânhamo ou linho em contato com uma xilanase, mananase e/ou glicanase e um agente de alvejamento, em que a xilanase, mananase e/ou glicanase compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste. O agente de alvejamento pode compreender oxigênio ou peróxido de hidrogênio.
[00108] A invenção fornece métodos para o alvejante de uma polpa de lingocelulose, que compreendem colocar a polpa de lignocelulose em contato com uma xilanase, mananase e/ou glicanase, em que a xilanase, mananase e/ou glicanase compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste.
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63/510 [00109] A invenção fornece métodos para remoção enzimática de tintas de papel, resíduo de papel, produto reciclado de papel, remoção de toner de papéis usados impressos sem contato ou misturas de papéis usados impressos por contato e sem contato, compreendendo colocar em contato o papel, resíduo de papel, produto reciclado de papel, papel usado impresso sem contato ou papel usado impresso por contato com uma xilanase, mananase e/ou glicanase, em que a xilanase, mananase e/ou glicanase compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste.
[00110] A invenção fornece métodos para alvejar uma linha, tecido, fio, roupa ou têxtil, compreendendo colocar o tecido, fio, roupa ou têxtil em contato com uma xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições adequadas para produzir um alvejante do têxtil, em que a xilanase, mananase e/ou glicanase compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste. A linha, tecido, fio, roupa ou têxtil pode compreender uma linha, tecido, fio, roupa ou têxtil celulósico sem algodão. A invenção fornece tecidos, fios, roupas ou têxteis que compreendem um polipeptídeo que tem uma sequência da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo destes, em que em um aspecto (opcionalmente) o tecido, fio, roupa ou têxtil compreende um tecido, fio, roupa ou têxtil celulósico sem algodão.
[00111] A invenção fornece métodos para alvejar ou remover tinta de jornais compreendendo colocar o jornal em contato com uma xilanase, mananase e/ou glicanase, em que a xilanase, a mananase e/ou a glicanase compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse.
[00112] A invenção fornece madeira, lascas de madeira, polpa de madeira, produtos de madeira, polpas de papel, produtos de papel,
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64/510 jornais ou resíduo de papel que compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste. A invenção fornece linha, tecido, fio, roupa ou têxtil que compreende um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste. [00113] A invenção fornece métodos para reduzir lignina em uma madeira ou produto de madeira que compreende colocar a madeira ou produto de madeira em contato com um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo tem uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste.
[00114] A invenção fornece métodos para reduzir lignina em uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85 °C, 90°C ou mais e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico) em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase que tem uma sequência da invenção, ou a xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste; (b) fornecer uma madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel; que compreende lignina; e (c) colocar a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel em contato com o polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 90°C ou mais, e
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65/510 um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo reduz a lignina na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel.
[00115] A invenção fornece métodos para tratar uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um produto de papel, um papel ou uma polpa de papel sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 90°C ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase que tem uma sequência da invenção, ou a xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste; (b) fornecer uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel; e (c) colocar a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel em contato com polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 90°C ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo catalisa a hidrólise de compostos na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel, e em que em um aspecto (opcionalmente), a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel compreende uma madeira mole e madeira dura, ou a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel ou polpa de papel é derivada de uma maPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 71/525
66/510 deira mole e madeira dura; e em que em um aspecto (opcionalmente), após o tratamento a polpa tem uma consistência de pelo menos cerca de 10%, ou de pelo menos cerca de 32%.
[00116] A invenção fornece métodos para descolorir uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, a mananase e/ou a glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85 °C, 90°C ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, mananase e/ou glicanase que tem uma sequência da invenção, ou a xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste; (b) fornecer uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel; e (c) colocar a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel em contato com o polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 90°C, 91° C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C e um pH básico de pelo menos cerca de pH 9.5, pH 10.0, pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo catalisa a hidrólise de compostos na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel, branqueando assim a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel.
[00117] A invenção fornece métodos para reduzir o uso de químicos
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67/510 branqueadores em um processo de alvejante de madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, a mananase e/ou a glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94 °C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase que tem uma sequência da invenção, ou a xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste; (b) fornecer uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel; e (c) colocar a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel em contato com o polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C,
92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo catalisa a hidrólise de compostos na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel, bioalvejando assim a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel e reduzindo o uso de químicos branqueadores no processo de alvejante; em que em um aspecto (opcionalmente), o químico branPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 73/525
68/510 queador compreende cloro, dióxido de cloro, um cáustico, um peróxido ou qualquer combinação desses.
[00118] A invenção fornece métodos para remoção de tinta de papel ou polpa sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, a mananase e/ou a glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 8 7°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98° C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 10.5, pH 11, pH 12, pH 12.5 ou mais (básico), em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, mananase e/ou glicanase que tem uma sequência da invenção, ou a xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste; (b) fornecer uma madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, um produto de papel ou polpa de papel com tinta; e (c) colocar a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel em contato com o polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 85°C e um pH básico de pelo menos cerca de pH 11, em que o polipeptídeo catalisa a hidrólise de compostos na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel ou polpa de papel, facilitando assim a remoção da tinta da madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel.
[00119] A invenção fornece métodos para liberar lignina de uma madeira, uma polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 74/525
69/510 cer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, a mananase e/ou a glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95° C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 11, em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, mananase e/ou glicanase que tem uma sequência da invenção, ou uma xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste; (b) fornecer uma madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel que compreende lignina; e (c) colocar a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou a polpa de papel da etapa (b) em contato com o polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96° C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 11, em que o polipeptídeo catalisa a hidrólise de compostos na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel, facilitando assim a liberação de lignina da madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel; em que em um aspecto (opcionalmente) após o tratamento a polpa tem uma consistência de cerca de 10%.
[00120] A invenção fornece composições que compreendem uma madeira, a polpa de madeira, uma polpa Kraft, um papel, um produto de papel ou uma polpa de papel compreendendo um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o
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70/510 polipeptídeo tem uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste, em que em um aspecto (opcionalmente), a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel compreende uma madeira mole e uma madeira dura, ou a madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel é derivado de uma madeira mole e de uma madeira dura.
[00121] A invenção fornece métodos para fazer etanol que compreende colocar uma composição que compreende amido em conato com um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo tem uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo deste. A invenção fornece composições que compreendem um etanol e um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo tem uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse. A invenção fornece métodos para fazer etanol sob condições de alta temperatura e pH básico, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer pelo menos um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo retém uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92° C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 11, em que o polipeptídeo compreende uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase que tem uma sePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 76/525
71/510 quência da invenção, ou a xilanase, mananase e/ou glicanase é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse; (b) fornecer uma composição que compreende amido compreendendo uma madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, um produto de papel ou polpa de papel; e (c) colocar a composição da etapa (b) em contato com o polipeptídeo da etapa (a) sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C,
90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98° C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 11, em que o polipeptídeo catalisa a hidrólise de compostos na madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel ou polpa de papel, gerando assim etanol a partir da madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel ou polpa de papel.
[00122] A invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o polipeptídeo compreende uma sequência da invenção, ou o polipeptídeo é codificado por um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou um fragmento enzimaticamente ativo desse. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para eliminar, ou proteger animais de, um microorganismos que compreende um xilano compreendendo administrar um polipeptídeo da invenção. O microorganismo pode ser uma bactéria que compreende um xilano, por exemplo, Salmonella.
[00123] Em um aspecto, a composição farmacêutica age como um auxiliar digestivo ou um antimicrobiano (por exemplo, contra Salmonella). Em um aspecto, o tratamento é profilático. Em um aspecto, a invenção fornece produtos de cuidado oral que compreendem um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase
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72/510 e/ou glicanase, ou uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção. O produto de cuidado oral pode compreender uma pasta de dentes, um creme dental, um gel, ou um pó para os dentes, uma odôntico, um enxaguatório bucal, uma formulação de limpeza pré- ou pós-escovação, uma goma de mascar, uma pastilha, ou uma bala. A invenção fornece composições de limpeza de lentes de contato que compreendem um polipeptídeo da invenção que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase ou uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase codificada por um ácido nucléico da invenção.
[00124] A invenção fornece glicosidases, xilanases e/ou glicanases quiméricas que compreendem uma sequência de polipeptídeo (por exemplo, uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase) da invenção e pelo menos um módulo de ligação a carboidrato (CBM) heterólogo, em que em um aspecto (opcionalmente) o CBM compreende um CBM3a, CBM3b, CBM4, CBM6, CBM22 ou X14 ou um CBM listado e discutido abaixo. A invenção também fornece glicosidases, xilanases e/ou glicanases quiméricas que compreendem pelo menos um módulo de ligação a carboidrato (CBM) heterólogo, em que o CBM compreende uma subsequência de ligação a carboidrato de uma sequência de xilanase da invenção, ou uma subsequência de ligação a carboidrato que compreende um X14 descrito na Tabela 9. A invenção fornece métodos para desenhar uma glicosidase, uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase quimérica que tem uma nova especificidade de ligação a carboidrato ou uma especificidade de ligação a carboidrato aumentada, compreendendo inserir um módulo de ligação a carboidrato (CBM) heterólogo ou endógeno adicional em glicosidases, xilanases e/ou glicanases, em que o CBM compreende uma subsequência de ligação a carboidrato de uma sequência de glicosidase, xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção, ou uma subsequência de
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73/510 ligação a carboidrato que compreende um X14 descrito na Tabela 9, ou alternativamente, um CBM heterólogo, ou um CBM endógeno adicional, é inserido em uma sequência de xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção.
[00125] A invenção fornece misturas ou “coquetéis” de enzimas que compreendem pelo menos uma enzima da invenção e uma ou mais outras enzimas(s) que podem ser outra xilanase, mananase e/ou glicanase, ou qualquer outra enzima; por exemplo, os “coquetéis” da invenção, além de pelo menos uma enzima dessa invenção, podem compreendem qualquer outra enzima tal como xilanase (não desta invenção), celulases, lipases, esterases, proteases, ou endoglicosidases, endo-beta.-1,4-glicanases, beta-glicanases, endo-beta-1,3(4)glicanases, cutinases, peroxidases, catalases, lacases, amilases, glicoamilases, pectinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemicelulases, mananases, xiloglicanases, xilanases, pectina acetil esterases, ramnogalacturonano acetil esterases, poligalacturonases, ramnogalacturonases, galactanases, pectina liases, pectina metilesterases, celobioidrolases e/ou transglutaminases, para citar apenas alguns exemplos. Em modalidades alternativas, as misturas de enzimas, ou “coquetéis” que compreendem pelo menos uma enzima da invenção podem ser usados em qualquer processo ou método da invenção, ou composição da invenção, por exemplo, em alimentos ou rações, suplementos de alimentos ou de rações, têxteis, papéis, madeiras processadas, etc. e métodos de fazer os mesmos, e em composições e métodos para tratar papel, polpa, madeira, resíduos ou subprodutos de papel, polpa ou madeira, e semelhantes, e nos produtos finais destes.
[00126] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são descritos nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da
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74/510 descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.
[00127] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, sequências do GenBank e depósitos da ATCC, citados aqui estão expressamente incorporados aqui por referência para todas as finalidades.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00128] Os desenhos a seguir são ilustrativos de aspectos da invenção e não são pretendidos para limitar o escopo da invenção conforme abrangido pelas reivindicações.
[00129] O arquivo da patente ou pedido contém pelo menos um desenho em cores. Cópias dessa publicação de patente ou pedido de patente com desenho(s) em cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[00130] A figura 1 é um diagrama de blocos de um sistema de computador.
[00131] A figura 2 é um fluxograma ilustrando um aspecto de um processo para comparar uma nova sequência de nucleotídeo ou proteína com uma base de dados de sequências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova sequência e as sequências na base de dados.
[00132] A figura 3 é um fluxograma ilustrando um aspecto de um processo em um computador para determinar se duas sequências são homólogas.
[00133] A figura 4 é um fluxograma ilustrando um aspecto de um processo identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma sequência.
[00134] A figura 5 é um gráfico que compara a atividade da sequência tipo selvagem (SEQ ID NOS: 189 e 190) ao mutante 8x (SEQ ID NOS: 375, 376), uma combinação de mutantes D, F, H, I, S, V, X e AA na Tabela 1.
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75/510 [00135] A figura 6A ilustra os nove mutantes de um único sítio de aminoácido de SEQ ID NO: 378 (codificada por SEQ ID NO: 377) gerados por Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene (GSSM) de SEQ ID NO:190 (codificada por SEQ ID NO:189), como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00136] A figura 6B ilustra o desenovelamento de SEQ ID NO:190 e SEQ ID NO:378 em experimentos do ponto médio da transição da temperatura de fusão (Tm) conforme determinado por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) para cada enzima, como descrito em detalhes no Exemplo 5, abaixo.
[00137] A figura 7A ilustra os perfis de atividade em pH e temperatura para as enzimas SEQ ID NO:190 e SEQ ID NO:378, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00138] A figura 7B ilustra a taxa/atividade da temperatura ótima para as enzimas SEQ ID NO:190 e SEQ ID NO:378, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00139] A figura 7C ilustra a tolerância térmica/ atividade residual para as enzimas SEQ ID NO:190 e SEQ ID NO:378, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00140] A figura 8A ilustra a biblioteca de GeneReassembly de todas as combinações possíveis das 9 mutações pontuais de GSSM que foi construída e rastreada quanto a variantes com tolerância térmica e atividade melhoradas, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00141] A figura 8B ilustra a atividade relativa da variante “6X-2” e da variante “9X” (SEQ ID NO:378) em comparação com SEQ ID NO:190 (“tipo selvagem”) em uma temperatura ótima e pH 6.0, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00142] A figura 9A ilustra as impressões digitais obtidas após hidrólise de oligoxilanos (Xyl)3, (Xyl)4, (Xyl)5 e (Xyl)6 pelas enzimas
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SEQ ID NO:190 (“tipo selvagem”) e a variante “9X” (SEQ ID NO:378), como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00143] A figura 9B ilustra as impressões digitais obtidas após hidrólise de xilano de madeira de faia (beechwood) pelas enzimas SEQ ID NO:190 (“tipo selvagem”) e a variante “9X” (SEQ ID NO:378), como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00144] A figura 10A é um diagrama esquemático que ilustra o nível de melhora na estabilidade térmica (representado por Tm) em relação a SEQ ID NO:190 (“tipo selvagem”) obtido por evolução de GSSM, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo.
[00145] A figura 10B ilustra um “diagrama de aptidão” (fitness diagram) da melhora da enzima na forma de SEQ ID NO:378 e SEQ ID NO:380, conforme obtido por combinar as tecnologias de GSSM e GeneReassembly, como descrito em detalhe no Exemplo 5, abaixo. [00146] A figura 11 é um fluxograma esquemático de um protocolo de rastreamento de rotina exemplar para determinar se uma xilanase da invenção é útil no pré-tratamento de polpa de papel, como descrito em detalhe no Exemplo 6, abaixo.
[00147] A figura 12 ilustra graficamente os resultados de um estudo de “bioalvejamento” usando xilanases exemplares da invenção, como descrito em detalhe, abaixo.
[00148] A figura 13 ilustra um resumo de alterações feitas à sequência SEQ ID NO:382 exemplar da invenção, como descrito em detalhe, abaixo.
[00149] A figura 14 ilustra um processo industrial de bioalvejamento da invenção, como descrito em detalhe no Exemplo 9, abaixo.
[00150] A figura 15 é uma tabela que resume dados demonstrando a atividade enzimática de enzimas exemplares da invenção, como descrito em detalhe no Exemplo 10, abaixo.
[00151] A figura 16, figura 17, figura 18 e figura 19 são tabelas ilusPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 82/525
77/510 trando graficamente a atividade de SEQ ID NO:382 sobre Madeira Mole do Sul (SSWB) sob várias condições, e resumindo esses dados, como descrito em detalhe no Exemplo 11, abaixo.
[00152] A figura 20 é uma tabela ilustrando graficamente a atividade de SEQ ID NO:382 sobre Madeira Dura do Norte (NHW) pós-O2 em várias faixas de pH, como descrito em detalhe no Exemplo 11, abaixo. [00153] A figura 21 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de azo-xilano usando enzimas exemplares da invenção, como descrito em detalhe no Exemplo 12, abaixo.
[00154] A figura 22 e a figura 23 ilustram graficamente os resultados de um ensaio de atividade enzimática exemplar usando as enzimas exemplares da invenção sobre arabinoxilano de trigo usando em ensaio de Nelson-Somogyi, como descrito em detalhe no Exemplo 12, abaixo.
[00155] A figura 24 e a figura 25 ilustram graficamente os resultados de um ensaio de termotolerância exemplar para xilanases usando um ensaio de azo-xilano, como descrito em detalhe no Exemplo 12, abaixo.
[00156] A figura 26 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de termotolerância exemplar para enzimas, um método de atividade residual, como descrito em detalhe no Exemplo 12, abaixo.
[00157] A figura 27A e a figura 27B ilustram dados que mostram a inativação térmica da xilanase exemplar “tipo selvagem” da invenção SEQ ID NO:382, e da xilanase exemplar variante ou “mutante” da invenção SEQ ID NO:482, como descrito em detalhe no Exemplo 14 abaixo.
[00158] A figura 28 ilustra dados mostrando a diferença na energia de inativação de SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:482 exemplares, onde a inativação térmica foi medida em várias temperaturas e os dados foram usados para construir um gráfico de Arrhenius, como descrito
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 83/525
78/510 em detalhe no Exemplo 14 abaixo.
[00159] Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00160] A invenção fornece glicosil hidrolases, incluindo xilanases e/ou glicanases, e polinucleotídeos que codificam as mesmas e métodos de fazer e usar as mesmas. Glicosil hidrolase, incluindo atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase dos polipeptídeos da invenção, abrange enzimas que apresentam atividade de hidrolase, por exemplo, enzimas capazes de hidrolisar ligações glicosídicas em um polissacarídeo, por exemplo, uma ligação glicosídica presente em xilano, por exemplo, catalisar hidrólise de ligações p-1,4-xilosídicas internas. As xilanases e/ou glicanases da invenção podem ser usadas para fazer e/ou processar alimentos, rações, suplementos nutricionais, têxteis detergentes e semelhantes. As xilanases e/ou glicanases da invenção podem ser usadas em composições farmacêuticas e auxiliares dietéticos.
[00161] As xilanases e/ou glicanases da invenção são particularmente úteis em processos de cozimento, ração animal, bebida e madeira, polpa de madeira, polpa Kraft, papel, produto de papel, ou polpa de papel. Em um aspecto, uma enzima da invenção é termotolerante e/ou tolerante a altas temperaturas e/ou condições de pH baixo. Por exemplo, em um aspecto, uma xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção retém atividade sob condições que compreendem uma temperatura de pelo menos cerca de 80°C, 85°C, 86°C, 8 7°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98° C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 103,5°C, 104°C, 105°C, 107°C, 108°C, 109°C ou 110°C, ou mais, e um pH básico de pelo menos cerca de pH 11, ou mais.
[00162] A invenção fornece variantes de polinucleotídeos ou poliPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 84/525
79/510 peptídeos da invenção, que compreendem sequências modificadas em um ou mais pares de base, códons, íntrons, éxons, ou resíduos de aminoácido (respectivamente), mas que ainda retêm a atividade biológica de uma xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção. Variantes podem ser produzidas por qualquer meio incluindo métodos tais como, por exemplo, “error-prone” PCR, embaralhamento, mutagênese sítio-direcionada, “assembly” PCR, mutagênese por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de agrupamentos repetitivos, mutagênese de agrupamento exponencial, mutagênese sítio-específica, reagrupamento de genes (por exemplo, GeneReassembly, veja Patente U.S. N° 6.537.776), GSSM e qualquer combinação desses.
[00163] A tabela 1 e tabela 2 listam variantes obtidas por mutar SEQ ID NO:189 (que codifica SEQ ID NO:190) por GSSM. A invenção fornece ácidos nucléicos que tem uma ou mais, ou todas as sequências descritas nas Tabelas 1 e 2, isto é, ácidos nucléicos que apresentam sequências que são variantes de SEQ ID NO:189, onde as variações são descritas na Tabela 1 e Tabela 2, e os polipeptídeos que são codificados por estas variantes.
[00164] As variantes de GSSM (descritas nas Tabelas 1 e 2) foram testadas quanto à tolerância térmica (veja Exemplos abaixo). Os mutantes D, F, G, H, I, J, K, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, DD e EE foram observados tendo a maior tolerância térmica entre os mutantes da Tabela 1. Os mutantes também podem ser combinados para formar um mutante “maior” (isto é, um polipeptídeo da invenção que tem múltiplas variações de sequência, veja também, por exemplo, a Tabela 10 abaixo). Por exemplo, os mutantes D, F, H, I, S, V, X e AA da Tabela 1 foram combinados para formar um mutante maior chamado “8x” com uma sequência descrita em SEQ ID NO:375 (ácido nucléico codificante do polipeptídeo) e SEQ ID NO:376 (sequência de aminoácido). A
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 85/525
80/510 figura 5 é um gráfico que compara a atividade da sequência tipo selvagem (SEQ ID NOS: 189 e 190) com a da sequência mutante 8x (SEQ ID NOS: 259 e 260). Ao comparar a tipo selvagem com a mutante 8x, foi descoberto que a temperatura ótima para ambas era de 65°C e que o pH ótimo para ambas era de 5.5. A sequência tipo selvagem foi observada mantendo sua estabilidade por menos do que 1 minuto a 65°C, enquanto que a mutante 8x (SEQ ID NOS:375, 376) foi observada mantendo sua estabilidade por mais do que 10 minutos a 85°C. O substrato usado foi azo-xilano (por exemplo, espelta de aveia, por exemplo, de Megazyme International Ireland Ltd). Em um aspecto, a mutante 8x (SEQ ID NOS:375, 376) foi evoluída por GSSM. Em outro aspecto, a tipo selvagem é um precursor de GSSM para evolução de tolerância térmica.
TABELA 1
Mutante Mutação Seq. Tipo selvagem Seq. de GSSM
A A2F GCC TTT
B A2D GCC GAC
C A5H GCT CAC
D D8F GAC TTC
E Q11L CAA CTC
F Q11H CAA CAC
G N12L AAT TTG
H N12L AAT TTG
I G17I GGT ATA
J Q11H,T23T CAA,ACC CAT,ACG
K Q11H CAA CAT
L S26P TCT CCG
M S26P TCT CCA
N S35F TCA TTT
O Nenhuma alteração GTT GTA
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 86/525
81/510
Mutante Mutação Seq. Tipo selvagem Seq. de GSSM
P A51P GCA CCG
Q A51P GCA CCG
R G60R GGA CGC
S G60H GGA CAC
T G60H GGA CAC
U P64C CCG TGT
V P64V CCG GTA
W P64V CCG GTT
X S65V TCC GTG
Y Q11H CAA CAT
Z G68I GGA ATA
AA G68A GGA GCT
BB A71G GCT GGA
CC Nenhuma alteração AAT AAC
DD S79P TCA CCA
EE S79P TCA CCC
FF T95S ACT TCT
GG Y98P TAT CCG
HH T114S ACT AGC
II Nenhuma alteração AAC AAC
JJ Nenhuma alteração AGG AGA
KK I142L ATT CTG
LL S151I AGC ATC
MM S138T,S151A TCG,AGC ACG,GCG
NN K158R AAG CGG
OO K160V,V172I AAA,GTA GTT,ATA
[00165] As variantes de códon descritas na Tabela 2 que produziram variantes (de SEQ ID NO:189) com a melhor variação ou “melhoPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 87/525
82/510 ra” em tolerância térmica sobre a “tipo selvagem” (SEQ ID NO:189) estão destacadas. Como observado acima, a invenção fornece ácidos nucléicos, e os polipeptídeos que codificam os mesmos, que compreendem uma, várias ou todas as variações descritas na Tabela 2 e na Tabela 1.
TABELA 2
Mutação Sequência Tipo selvagem Sequência de GSSM Outros códons que também codificam
o mesmo aminoácido alterado
A2F GCC TTT TTC
A2D GCC GAC GAT
A5H GCT CAC CAT
D8F GAC TTC TTT
Q11L CAA CTC TTA, TTG, CTT, CTA, CTG
Q11H CAA CAC, CAT -
N12L AAT TTG TTA, CTC, CTT, CTA, CTG
G17I GGT ATA ATT, ATC
T23T ACC ACG ACT, ACC, ACA
S26P TCT CCG, CCA CCC
S35F TCA TTT TTC
A51P GCA CCG CCC, CCA
G60R GGA CGC CGT, CGA, CGG, AGA, AGG
G60H GGA CAC CAT
P64C CCG TGT TGC
P64V CCG GTA, GTT GTC, GTG
S65V TCC GTG GTC, GTA, GTT
G68I GGA ATA ATT, ATC
G68A GGA GCT GCG, GCC, GCA
A71G GCT GGA GGT, GGC, GGG
S79P TCA CCA, CCC CCG
T95S ACT TCT TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
Y98P TAT CCG CCC, CCA
T114S ACT AGC TCC, TCA, TCG, AGT, TCT
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 88/525
83/510
Mutação Sequência Tipo selvagem Sequência de GSSM Outros códons que também codificam
o mesmo aminoácido alterado
I142L ATT CTG TTA, CTC, CTT, CTA, TTG
S151I AGC ATC ATT, ATA
S138T TCG ACG ACT, ACC, ACA
S151A AGC GCG GCT, GCC, GCA
K158R AAG CGG CGT, CGA, CGC, AGA, AGG
K160V AAA GTT GTC, GTA, GTG
V172I GTA ATA ATT, ATC
[00166] Em um aspecto, a sequência de aminoácido ácido de uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 208) de sequências de aminoácido da invenção é modificada por uma única mutação de aminoácido. Em um aspecto específico, esta mutação é uma mutação de asparagina para ácido aspártico. A sequência de aminoácido resultante e a sequência de ácido nucléico correspondente são descritas como SEQ ID NO:252 e SEQ ID NO:251, respectivamente. Mutações de um único aminoácido com uma melhora no pH ótimo da enzima, tal como a mutação de SEQ ID NO:208, foram mostradas na técnica com relação a xilanases. (Veja, por exemplo, Joshi, M., Sidhu, G., Pot, I., Brayer, G., Withers, S., McIntosh, L., J. Mol. Bio. 299, 255-279 (2000)). Também é observado que em tais mutações de um único aminoácido, porções das sequências podem ser removidas no processo de subclonagem. Por exemplo, SEQ ID NO:207 e SEQ ID NO:251 diferem em apenas um nucleotídeo, ao longo da área em que as sequências se alinham. Entretanto, observa-se que uma área de 78 nucleotídeos na terminação-N de SEQ ID NO:207 foi removida da terminação-N de SEQ ID NO:251 na subclonagem. Adicionalmente, os três primeiros nucleotídeos em SEQ ID NO:251 foram trocados para ATG e então a mutação pontual foi feita no sexto nucleotídeo em SEQ ID NO:251.
[00167] O termo “mutagênese por saturação”, “mutagênese por saturação do sítio do gene” ou “GSSM” inclui um método que usa iniciaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 89/525
84/510 dores de oligonucleotídeo degenerados para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, como descrito em detalhe abaixo.
[00168] O termo “sistema de evolução dirigida otimizado” ou “evolução dirigida otimizada” inclui um método de reagrupar fragmentos de sequências de ácido nucléico relacionadas, por exemplo, genes relacionados, e é explicado em detalhe, abaixo.
[00169] O termo “reagrupamento por ligação sintética” ou “SLR” inclui um método de ligar fragmentos de oligonucleotídeo de uma maneira não-estocástica, e é explicado abaixo em detalhe.
GERANDO E MANIPULANDO ÁCIDOS NUCLÉICOS [00170] A invenção fornece ácidos nucléicos (por exemplo, ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos que apresentam uma atividade de glicosil hidrolase, por exemplo, uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase; incluindo enzimas que apresentam pelo menos uma modificação de sequência de uma sequência de ácido nucléico exemplar da invenção (como definido acima), em que a modificação de sequência compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou todas as seguintes alterações: os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 10 a 12 de SEQ ID NO:383 são alterados para CCT, TTA, TTG, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 25 a 27 de SEQ ID NO:383 são alterados para CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 28 a 30 de SEQ ID NO:383 são alterados para TCA, TCC, TCT, TCG, AGT ou AGC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para TTT ou TTC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para TAC ou TAT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para ATA, ATT ou ATC, os nucleotídeos que correspondem
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 90/525
85/510 aos resíduos 37 a 39 de SEQ ID NO:383 são alterados para TGG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 40 a 42 de SEQ ID NO:383 são alterados para CAC ou CAT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 52 a 54 de SEQ ID NO:383 são alterados para TTC ou TTT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 73 a 75 de SEQ ID NO:383 são alterados para GAG ou GAA, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 73 a 75 de SEQ ID NO:383 são alterados para CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 88 a 90 de SEQ ID NO:383 são alterados para GTG, GTC, GTA ou GTT, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 100 a 102 de SEQ ID NO:383 são alterados para TGT ou TGC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 100 a 102 de SEQ ID NO:383 são alterados para CAT ou CAC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 100 a 102 de SEQ ID NO:383 são alterados para TTG, TTA, CTT, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 103 a 105 de SEQ ID NO:383 são alterados para GAG ou GAA, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 103 a 105 de SEQ ID NO:383 são alterados para GAT ou GAC, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 211 a 213 de SEQ ID NO:383 são alterados para ACA, ACT, ACC ou ACG, os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 211 a 213 de SEQ ID NO:383 são alterados para TGT ou TGC, ou os nucleotídeos que correspondem aos resíduos 508 a 582 de SEQ ID NO:383 são alterados para CAT ou CAC), incluindo cassetes de expressão tais como vetores de expressão, que codificam os polipeptídeos da invenção.
[00171] A invenção também inclui métodos para descobrir novas sequências de xilanase, mananase e/ou glicanase usando os ácidos nucléicos da invenção. A invenção também inclui métodos para inibir a expressão de genes, transcritos e polipeptídeos de xilanase, mananase e/ou glicanase usando os ácidos nucléicos da invenção. Também
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86/510 são fornecidos métodos para modificar os ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, por reagrupamento por ligação sintética, sistema de evolução dirigida otimizado e/ou mutagênese por saturação.
[00172] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser feitos, isolados e/ou manipulados, por exemplo, por clonagem e expressão de bibliotecas de cDNA, amplificação de mensagem ou DNA genômico por PCR, e semelhantes. Por exemplo, as seguintes sequências exemplares da invenção foram derivadas inicialmente das seguintes fontes: TABELA 3
SEQ ID FONTE
1, 2 Bactérias
101, 102 Ambiente
103, 104 Bactérias
105, 106 Ambiente
107, 108 Bactérias
109, 110 Ambiente
11, 12 Ambiente
111, 112 Ambiente
113, 114 Ambiente
115, 116 Ambiente
117, 118 Ambiente
119, 120 Ambiente
121, 122 Ambiente
123, 124 Ambiente
125, 126 Ambiente
127, 128 Ambiente
129, 130 Bactérias
13, 14 Ambiente
131, 132 Ambiente
133, 134 Ambiente
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87/510
135, 136 Ambiente
137, 138 Ambiente
139, 140 Ambiente
141, 142 Ambiente
143, 144 Bactérias
145, 146 Eucarioto
147, 148 Ambiente
149, 150 Ambiente
15, ' 16 Ambiente
151, 152 Ambiente
153, 154 Ambiente
155, 156 Ambiente
157, 158 Ambiente
159, 160 Ambiente
161, 162 Ambiente
163, 164 Ambiente
165, 166 Ambiente
167, 168 Ambiente
169, 170 Ambiente
17, 18 Bactérias
171, 172 Ambiente
173, 174 Ambiente
175, 176 Ambiente
177, 178 Ambiente
179, 180 Ambiente
181, 182 Ambiente
183, 184 Ambiente
185, 186 Ambiente
187, 188 Ambiente
189, 190 Ambiente
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 93/525
88/510
19, 20
191, 192
193, 194
195, 196
197, 198
199, 200
201, 202
203, 204
205, 206
207, 208
209, 210
21, 22
211, 212
213, 214
215, 216
217, 218
219, 220
221, 222
223, 224
225, 226
227, 228
229, 230
23, 24
231, 232
233, 234
235, 236
237, 238
239, 240
241, 242
243, 244
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Bactérias
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Ambiente
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89/510
245, 246 Ambiente
247, 248 Ambiente
249, 250 Ambiente
25, 26 Ambiente
251, 252 Ambiente
253, 254 Ambiente
255, 256 Ambiente
257, 258 Ambiente
259, 260 Ambiente
261, 262 Ambiente
263, 264 Ambiente
265, 266 Ambiente
267, 268 Bactérias
269, 270 Ambiente
27, 28 Ambiente
271, 272 Ambiente
273, 274 Ambiente
275, 276 Ambiente
277, 278 Ambiente
279, 280 Ambiente
281, 282 Ambiente
283, 284 Ambiente
285, 286 Ambiente
287, 288 Ambiente
289, 290 Ambiente
29, 30 Archaea
291, 292 Ambiente
293, 294 Ambiente
295, 296 Ambiente
297, 298 Ambiente
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 95/525
90/510
299, 300 Ambiente
3, 4 Ambiente
301, 302 Ambiente
303, 304 Ambiente
305, 306 Bactérias
307, 308 Ambiente
309, 310 Ambiente
31, 32 Ambiente
311, 312 Ambiente
313, 314 Bactérias
315, 316 Ambiente
317, 318 Ambiente
319, 320 Ambiente
321, 322 Ambiente
323, 324 Ambiente
325, 326 Ambiente
327, 328 Ambiente
329, 330 Ambiente
33, 34 Ambiente
331, 332 Ambiente
333, 334 Ambiente
335, 336 Ambiente
337, 338 Ambiente
339, 340 Ambiente
341, 342 Ambiente
343, 344 Ambiente
345, 346 Ambiente
347, 348 Ambiente
349, 350 Ambiente
35, 36 Ambiente
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 96/525
91/510
351 , 352 Ambiente
353 , 354 Ambiente
355 , 356 Ambiente
357 , 358 Ambiente
359 , 360 Ambiente
361 , 362 Ambiente
363 , 364 Ambiente
365 , 366 Ambiente
367 , 368 Ambiente
369 , 370 Ambiente
37, 38 Ambiente
371 , 372 Ambiente
373 , 374 Ambiente
375 , 376 Artificial
377 , 378 Artificial
39, 40 Ambiente
41, 42 Ambiente
43, 44 Ambiente
45, 46 Ambiente
47, 48 Ambiente
49, 50 Ambiente
5, 6 Ambiente
51, 52 Ambiente
53, 54 Bactérias
55, 56 Ambiente
57, 58 Ambiente
59, 60 Ambiente
61, 62 Ambiente
63, 64 Ambiente
65, 66 Ambiente
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99, 100 Ambiente [00173] Em um aspecto, a invenção também fornece ácidos nucléicos que codificam xilanase, mananase e/ou glicanase com uma inovação em comum, em que eles são derivados de uma fonte ambiental, ou de uma fonte bacteriana, ou de uma fonte de Archaea.
[00174] Ao praticar os métodos da invenção, genes homólogos podem ser modificados por manipular um ácido nucléico molde, como descrito aqui. A invenção pode ser praticada junto com qualquer método ou protocolo ou equipamento conhecido na técnica, que estão descritos na literatura científica e de patente.
[00175] Um aspecto da invenção é um ácido nucléico que compreende uma das sequências da invenção e sequências substancialmente
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93/510 idênticas a elas, as sequências complementares a elas, ou um fragmento que compreende pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das sequências de uma Sequência da invenção (ou das sequências complementares a elas). Os ácidos nucléicos isolados, podem compreender DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, e DNA sintético. O DNA pode ser de fita dupla ou de fita única, e se for de fita única, pode ser a fita codificante ou a fita não-codificante (anti-senso). Alternativamente, os ácidos nucléicos isolados podem compreender RNA.
[00176] Conseqüentemente, outro aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado que codifica um dos polipeptídeos da invenção, ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos de um dos polipeptídeos da invenção. As sequências codificantes desses ácidos nucléicos podem ser idênticas a uma das sequências codificantes de um dos ácidos nucléicos da invenção, ou um fragmento deste ou podem ser sequências codificantes diferentes que codificam um dos polipeptídeos da invenção, sequências substancialmente idênticas a elas e fragmentos que tem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos de um dos polipeptídeos da invenção, como um resultado da redundância ou degeneração do código genético. O código genético é bem-conhecido dos versados na técnica e pode ser obtido, por exemplo, na página 214 de B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997.
[00177] O ácido nucléico isolado que codifica um dos polipeptídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a ele, pode incluir, mas não se limita a: apenas a sequência codificante de um ácido nucléico da invenção, sequências substancialmente idênticas a ela e sequências codificantes adicionais, tais como sequências líder ou sequências de pró-proteína, e sequências não codificantes, tal como ínPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 99/525
94/510 trons ou sequências não codificantes 5' e/ou 3' da sequência codificante. Dessa forma, como usado aqui, o termo “polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo” abrange um polinucleotídeo que inclui apenas a sequência codificante para o polipeptídeo assim como um polinucleotídeo que inclui sequências codificantes e/ou não-codificantes adicionais.
[00178] Alternativamente, as sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, podem ser mutagenizadas usando técnicas convencionais, tal como mutagênese sítio-direcionada, ou outras técnicas familiares daqueles versados na técnica, para introduzir alterações silenciosas nos polinucleotídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a eles. Como usado aqui, “alterações silenciosas” incluem, por exemplo, alterações que não alteram a sequência de aminoácido codificada pelo polinucleotídeo. Tais alterações podem ser desejáveis a fim de aumentar o nível do polipeptídeo produzido por células hospedeiras que contêm um vetor que codifica o polipeptídeo por introduzir códons ou pares de códons que ocorrem freqüentemente no organismo hospedeiro.
[00179] A invenção também se refere a polinucleotídeos que apresentam alterações de nucleotídeo que resultam em substituições adições, deleções, fusões, e truncamentos de aminoácido nos polipeptídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Tais alterações de nucleotídeo podem ser introduzidas usando técnicas, tais como, mutagênese sítio-direcionada, mutagênese química aleatória, deleção por exonuclease III e outras técnicas de DNA recombinante. Alternativamente, tais alterações de nucleotídeo podem ser variantes alélicas que ocorrem naturalmente que são isoladas por identificar ácidos nucléicos que hibridizam especificamente a sondas que compreendem pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das sequênPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 100/525
95/510 cias da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas (ou as sequências complementares a elas) sob condições que estringência alta, moderada, ou baixa, como fornecido aqui.
TÉCNICAS GERAIS [00180] Os ácidos nucléicos usados para praticar essa invenção, quer sejam RNAm iRNA ácido nucléico anti-senso, cDNA, DNA genômico, vetores, vírus, ou híbridos destes, podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, podem ser manipulados geneticamente, amplificados e/ou expressos /gerados recombinantemente. Polipeptídeos recombinantes (por exemplo, glicosil hidrolases da invenção) gerados a partir desses ácidos nucléicos podem ser isolados individualmente ou clonados e testados quanto a uma atividade desejada. Qualquer sistema de expressão recombinante pode ser usado, incluindo sistemas de expressão bacterianos, de mamífero, levedura, inseto ou célula de planta.
[00181] Alternativamente, esses ácidos nucléicos podem ser sintetizados in vitro por técnicas de síntese química bem-conhecidas, como descrito, por exemplo, em Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; Patente U.S. N° 4.458.066.
[00182] Técnicas para a manipulação de ácidos nucléicos, tal como, por exemplo, subclonagem, sondas de marcação (por exemplo, marcação de iniciador aleatório usando a polimerase de Klenow, tradução por cortes (nick translation), amplificação), seqüenciamento, hibridização, e semelhantes estão bem descritos na literatura científica e de patente, veja, por exemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor
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Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
[00183] Outro meio útil de obter e manipular ácidos nucléicos usados para praticar os métodos da invenção é clonar a partir de amostras genômicas, e, se desejado, rastrear e re-clonar insertos isolados ou amplificados a partir, por exemplo, de clones genômicos ou clones de cDNA. Fontes de ácidos nucléicos usados nos métodos da invenção incluem bibliotecas de cDNA ou genômicas contidas, por exemplo, em cromossomos artificiais de mamífero (MACs), veja por exemplo, Patente U.S. N° 5.721.118; 6.025.155; cromossomos humanos artificiais, veja, por exemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; cromossomos artificiais de levedura (YAC); cromossomos artificiais bacterianos (BAC); cromossomos artificiais P1, veja por exemplo, Woon (1998) Genomics 50:306-316; vetores derivados de P1 (PACs), veja, por exemplo, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; cosmídeos, vírus recombinantes, fagos ou plasmídeos.
[00184] Em um aspecto, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção é agrupado em fase apropriada com uma sequência líder capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo traduzido ou fragmento deste.
[00185] A invenção fornece proteínas de fusão e ácidos nucléicos que codificam as mesmas. Um polipeptídeo da invenção pode ser fundido a um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo, tais como peptídeos de identificação N-terminal que conferem características desejadas, tal como estabilidade aumentada ou purificação simplificada. Peptídeos e polipeptídeos da invenção também podem ser sintetizados e expresPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 102/525
97/510 sos como proteínas de fusão com um ou mais domínios adicionais ligados a elas, por exemplo, para produzir um peptídeo mais imunogênico, para isolar mais facilmente um peptídeo sintetizado recombinantemente, para identificar e isolar anticorpos e células B que expressam anticorpos, e semelhantes. Domínios que facilitam a detecção e purificação incluem, por exemplo, peptídeos quelantes de metal, tais como tratos de poli-histidina e módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação sobre metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação sobre imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação por extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). A inclusão de sequências ligantes cliváveis tal como Fator Xa ou enteroquinase (Invitrogen, San Diego CA) entre um domínio de purificação e o peptídeo ou polipeptídeo que compreende o motivo para facilitar purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de ácido nucléico codificante de um epitopo ligada a seis resíduos de histidina seguidos por um sítio de clivagem de tireodoxina e enteroquinase (veja, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Os resíduos de histidina facilitam a detecção e purificação enquanto que o sítio de clivagem de enteroquinase fornece um meio para purificar o epitopo do restante da proteína de fusão. Tecnologia relativa a vetores que codificam proteínas de fusão e aplicação de proteínas de fusão está bem descrita na literatura científica e de patente, veja, por exemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53. [00186] As expressões “ácido nucléico” ou “sequência de ácido nucléico”, como usadas aqui, referem-se a um oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo, ou a um fragmento de qualquer um desses, a DNA, ou RNA de origem genômica ou sintética que pode ser de fita única ou fita dupla e podem representar uma fita de sentido ou antisenso, a ácido peptídeo nucléico (PNA), ou a qualquer material semePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 103/525
98/510 lhante a DNA ou semelhante a RNA, de origem sintética ou natural. As expressões “ácido nucléico” ou “sequência de ácido nucléico” incluem oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo, ou um fragmento de qualquer um destes, DNA ou RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA) de origem genômica ou sintética que pode ser de fita única ou de fita dupla e pode representar uma fita de sentido ou anti-senso, ácido peptídeo nucléico (PNA), ou qualquer material semelhante a DNA ou semelhante a RNA, de origem sintética ou natural, incluindo por exemplo, iRNA, ribonucleoproteínas (por exemplo, iRNAs de fita dupla, por exemplo, iRNPs). O termo abrange ácidos nucléicos, isto é, oligonucleotídeos, contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas semelhantes a ácidos nucléicos com arcabouços sintéticos, veja, por exemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156. “Oligonucleotídeo” inclui um polidesoxinucleotídeo de fita única ou duas fitas de polidesoxinucleotídeos complementares que podem ser sintetizadas quimicamente. Tais oligonucleotídeos sintéticos não tem 5' fosfato e assim não se ligarão a outro oligonucleotídeo sem a adição de um fosfato com um ATP na presença de uma quinase. Um oligonucleotídeo sintético pode se ligar a um fragmento que não foi desfosforilado.
[00187] Uma “sequência codificante de” ou uma “sequência de nucleotídeo que codifica” um polipeptídeo ou proteína em particular, é uma sequência de ácido nucléico que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo ou proteína quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas.
[00188] O termo “gene” significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo; ele inclui regiões anteriores e posteriores à região codificante (líder e trailer) assim como, onde
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99/510 aplicável, sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos codificantes individuais (éxons). “Operativamente ligado” como usado aqui se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucléico (por exemplo, DNA). Tipicamente, se refere à relação funcional de uma sequência regulatória transcricional a uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma sequência codificante, tal como um ácido nucléico da invenção, se ele estimula ou modula a transcrição da sequência codificante em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, sequências regulatórias transcricionais promotoras que são operativamente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, elas são cis-atuantes. Entretanto, algumas sequências regulatórias transcricionais, tais como intensificadores, não precisam estar fisicamente contíguas ou localizadas próximo das sequências codificantes cuja transcrição é aumentada por elas.
[00189] O termo “cassete de expressão” como usado se refere a uma sequência de nucleotídeo que é capaz de afetar a transcrição de um gene estrutural (isto é, uma sequência codificante de proteína, tal como uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase da invenção) em um hospedeiro compatível com tais sequências. Cassetes de expressão incluem pelo menos um promotor operativamente ligado com a sequência codificante de polipeptídeo; e em um aspecto, com outras sequências, por exemplo, sinais de terminação de transcrição. Fatores adicionais necessários ou auxiliares em efetuar a expressão também podem ser usados, por exemplo, intensificadores. Dessa forma, cassetes de expressão também incluem plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombinantes, qualquer forma de vetor de “DNA nu” recombinante, e semelhantes. Um “vetor” compreende um ácido nucléico que pode infectar, transfectar, transduzir transitoriamente ou permanentePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 105/525
100/510 mente uma célula. Será identificado que um vetor pode ser um ácido nucléico nu, ou um ácido nucléico complexado com proteína ou lipídio. O vetor, em um aspecto, compreende ácidos nucléicos e/ou proteínas e/ou membranas virais ou bacterianas (por exemplo, uma membrana celular, um envelope lipídico viral, etc.). Vetores incluem, mas não são limitados a replicons (por exemplo, replicons de RNA, bacteriófagos) aos quais fragmentos de DNA podem ser ligados e se tornar replicados. Vetores incluem, mas não são limitados a RNA, DNA ou RNA circular ou linear auto-replicante autônomo (por exemplo, plasmídeos, vírus, e semelhantes, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.217.879), e incluem plasmídeos de expressão e não-expressão). Onde um microorganismo recombinante ou cultura celular é descrita como hospedando um “vetor de expressão” isso inclui DNA circular e linear extracromossômico e DNA que foi incorporado no(s) cromossomo(s) do hospedeiro. Onde um vetor está sendo mantido por uma célula hospedeira, o vetor pode estar sendo replicado estavelmente pelas células durante a mitose como uma estrutura autônoma, ou estar incorporado dentro do genoma do hospedeiro.
[00190] Como usado aqui, o termo “promotor” inclui todas as sequências capazes de direcionar a transcrição de uma sequência codificante em uma célula, por exemplo, uma célula de planta. Dessa forma, promotores usados nos construtos da invenção incluem elementos de controle transcricional cis-atuantes e sequências regulatórias que estão envolvidas na regulação ou modulação do momento e/ou taxa de transcrição de um gene. Por exemplo, um promotor pode ser um elemento de controle transcricional cis-atuante, incluindo um intensificador, um promotor, um terminador de transcrição, uma origem de replicação, uma sequência de integração cromossômica, regiões 5' e 3' não traduzidas, ou uma sequência intrônica, que estão envolvidas na regulação transcricional. Essas sequências cis-atuantes interagem tiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 106/525
101/510 picamente com proteínas ou outras biomoléculas para efetuar (iniciar, parar, regular, modular, etc.) a transcrição. Promotores “constitutivos” são aqueles que direcionam a expressão continuamente sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Promotores “induzíveis” ou “reguláveis” direcionam a expressão do ácido nucléico da invenção sob a influência de condições ambientais ou condições de desenvolvimento. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada, seca, ou a presença de luz.
[00191] Promotores “tecido-específicos” são elementos de controle transcricional que são ativos apenas em células ou tecidos ou órgãos particulares, por exemplo, em plantas ou animais. Regulação tecidoespecífica pode ser obtida por certos fatores intrínsecos que garantem que genes que codificam proteínas específicas para um dado tecido sejam expressas. Tais fatores são conhecidos por existir em mamíferos e plantas a fim de permitir que tecidos específicos se desenvolvam.
[00192] Como usado aqui, o termo “isolado” significa que o material (por exemplo, um ácido nucléico, um polipeptídeo, uma célula) é removido de seu ambiente natural (por exemplo, o ambiente natural se ele ocorrer naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que ocorre naturalmente presente em um animal vivo não está isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de algum ou todos os materiais co-existentes no sistema natural, está isolado. Tais polinucleotídeos poderiam fazer parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam fazer parte de uma composição e ainda serem isolados já que tal vetor ou composição não faz parte de seu ambiente natural. Como usado aqui, o termo “purificado” não requer pureza absoluta; ao invés disso, ele é pretendido como
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102/510 uma definição relativa. Ácidos nucléicos individuais obtidos a partir de uma biblioteca foram convencionalmente purificados até homogeneidade eletroforética. As sequências obtidas a partir desses clones não poderiam ser obtidas diretamente a partir da biblioteca ou de DNA humano total. Os ácidos nucléicos purificados da invenção foram purificados do restante do DNA genômico no organismo por pelo menos 104-106 vezes. Entretanto, o termo “purificado” também inclui ácidos nucléicos que foram purificados do restante do DNA genômico ou de outras sequências em uma biblioteca ou outro ambiente por pelo menos uma ordem de magnitude, tipicamente duas, ou três ordens e mais tipicamente quatro ou cinco ordens de magnitude [00193] Como usado aqui, o termo “recombinante” significa que o ácido nucléico está ao lado de um ácido nucléico da “cadeia principal” que não está ao lado dele no seu ambiente natural. Adicionalmente, para serem “enriquecidos” os ácidos nucléicos deverão representar 5% ou mais do número de insertos de ácidos nucléicos em uma população de moléculas da cadeia principal de ácidos nucléicos. Moléculas da cadeia principal de acordo com a invenção incluem ácidos nucléicos tais como vetores de expressão, ácidos nucléicos auto-replicantes, vírus, ácidos nucléicos de integração e outros vetores ou ácidos nucléicos usados para manter ou manipular um inserto de ácido nucléico de interesse. Tipicamente, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 15% ou mais do número de insertos de ácido nucléico na população de moléculas da cadeia principal recombinantes. Mais tipicamente, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 50% ou mais do número de insertos de ácido nucléico na população de moléculas da cadeia principal recombinantes. Em um aspecto, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 90% ou mais do número de insertos de ácido nucléico na população de moléculas da cadeia principal recombinantes. [00194] “Plasmídeos” são designados por um “p” minúsculo precePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 108/525
103/510 dido e/ou seguido por letras maiúsculas e/ou números. Os plasmídeos iniciais aqui contidos são disponíveis comercialmente, disponíveis publicamente de forma irrestrita, ou podem ser construídos a partir de plasmídeos disponíveis de acordo com procedimentos publicados. Além disso, plasmídeos equivalentes àqueles descritos aqui são conhecidos na técnica e serão claros para o versado na técnica. “Plasmídeos” podem ser disponíveis comercialmente, disponíveis publicamente de forma irrestrita, ou podem ser construídos a partir de plasmídeos disponíveis de acordo com procedimentos publicados. Plasmídeos equivalentes àqueles descritos aqui são conhecidos na técnica e serão claros para o versado na técnica.
[00195] “Digestão” de DNA se refere à clivagem catalítica de DNA com uma enzima de restrição que age apenas em certas sequências no DNA. As várias enzimas de restrição usadas aqui são disponíveis comercialmente e suas condições de reação, co-fatores e outras necessidades foram usadas como é conhecido do versado na técnica. Para fins analíticos, tipicamente 1 pg de plasmídeo ou fragmento de DNA é usado com cerca de 2 unidades de enzima em cerca de 20 pl de solução tampão. Para a finalidade de isolar fragmentos de DNA para a construção de plasmídeos, tipicamente 5 a 50 pg de DNA são digeridos com 20 a 250 unidades de enzima em um volume maior. Tampões e quantidades de substratos apropriados para enzimas de restrição em particular são especificados pelo fabricante. Tempos de incubação de cerca de 1 hora a 37°C são geralmente usad os, mas podem variar de acordo com as instruções do fabricante. Após a digestão, eletroforese em gel pode ser realizada para isolar o fragmento desejado. [00196] “Hibridização” se refere ao processo pelo qual uma fita de ácido nucléico se une a uma fita complementar através de pareamento de bases. Reações de hibridização podem ser sensíveis e seletivas para que uma sequência particular de interesse possa ser identificada
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104/510 mesmo em amostras nas quais ela está presente em concentrações baixas. Condições estringentes adequadas podem ser definidas, por exemplo, pelas concentrações de sal ou formamida nas soluções de pré-hibridização e hibridização, ou pela temperatura de hibridização e são bem-conhecidas na técnica. Em particular, a estringência pode ser aumentada por reduzir a concentração de sal, aumentar a concentração de formamida, ou aumentar a temperatura de hibridização. Em aspectos alternativos, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua habilidade de hibridizar sob várias condições de estringência (por exemplo, alta, média e baixa), como descrito aqui.
[00197] Por exemplo, hibridização sob condições de alta estringência poderia ocorrer em cerca de 50% de formamida a cerca de 37°C a 42°C. A hibridização poderia ocorrer sob condições de estringência reduzida em cerca de 35% a 25% de formamida a cerca de 30°C a 35°C. Em particular, a hibridização poderia ocorrer sob condições de estringência alta a 42°C em 50% de formamida, SSPE 5X, SDS 0,3% e 200 n/ml de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado. A hibridização poderia ocorrer sob condições de estringência reduzida como descrito acima, mas em 35% de formamida em uma temperatura reduzida de 35°C. A faixa de temperatura que corres ponde a um nível de adstringência particular pode ser ainda diminuída pelo cálculo da proporção de purina para piridimina do ácido nucléico de interesse e conseqüente ajuste da temperatura. Variações nas faixas e condições acima são bem-conhecidas na técnica.
Sequências de controle transcricional e traducional [00198] A invenção fornece sequências de ácido nucléico (por exemplo, DNA) da invenção operativamente ligadas a sequência(s) de controle de expressão (por exemplo, transcricional ou traducional), por exemplo, promotores ou intensificadores, para direcionar ou modular a síntese/expressão de RNA. A sequência de controle de expressão poPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 110/525
105/510 de estar em um vetor de expressão. Promotores bacterianos exemplares incluem lacI, lacZ, T3, T7, gpt, PR lambda, PL e trp. Promotores eucarióticos exemplares incluem precoce imediato de CMV, timidina quinase de HSV, precoce e tardio de SV40, LTRs de retrovírus, e metalotioneína I de camundongo. Uma sequência promotora está “operativamente ligada a” uma sequência codificante quando a RNA polimerase que inicia a transcrição no promotor transcreverá a sequência codificante em mRNA.
[00199] Promotores adequados para expressar um polipeptídeo em bactérias incluem os promotores lac ou trp de E. coli, o promotor lacZ, o promotor T3, o promotor T7, o promotor gpt, o promotor PR lambda, o promotor PL lambda, promotores de óperons que codificam enzimas glicolíticas tal como 3-fosfoglicerato quinase (PGK), e o promotor de fosfatase ácida. Promotores eucarióticos incluem o promotor precoce imediato de CMV, o promotor de timidina quinase de HSV, promotores de choque térmico, o promotor precoce e tardio de SV40, LTRs de retrovírus, e o promotor de metalotioneína-I de camundongo. Outros promotores conhecidos para controlar a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus também podem ser usados. Promotores adequados para expressar o polipeptídeo ou fragmento deste em bactérias incluem os promotores de lac ou trp de E. coli, o promotor lacI, o promotor lacZ, o promotor T3, o promotor T7, o promotor gpt, promotor lambda PR, o promotor lambda PL, promotores de óperons que codificam enzimas glicolíticas tais como 3fosfoglicerato quinase (PGK) e o promotor de fosfatase ácida. Promotores fúngicos incluem o promotor de fator . Promotores eucarióticos incluem o promotor precoce imediato de CMV, o promotor de timidina quinase de HSV, promotores de choque térmico, o promotor precoce e tardio de SV40, LTRs de retrovírus e o promotor de metalotioneína de camundongo. Outros promotores conhecidos por controlar a expresPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 111/525
106/510 são de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus também podem ser usados.
Promotores de Planta Tecido-específicos [00200] A invenção fornece cassetes de expressão que podem ser expressos de uma maneira tecido-específica, por exemplo, que podem expressar uma xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção de uma maneira tecido-específica. A invenção também fornece plantas ou sementes que expressam uma xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção de uma maneira tecido-específica. A especificidade tecidual pode ser especificidade por semente, especificidade por caule, especificidade por folha, especificidade por raiz, especificidade por fruto e semelhantes.
[00201] Em um aspecto, um promotor constitutivo tal como o promotor 35S de CaMV pode ser usado para expressão em partes especificas da planta ou semente ou por toda a planta. Por exemplo, para superexpressão, pode ser empregado um fragmento de promotor de planta que direcionará a expressão de um ácido nucléico em alguns ou todos os tecidos de uma planta, por exemplo, uma planta regenerada. Tais promotores são referidos aqui como promotores “constitutivos” e são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de início de transcrição 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor-1' ou -2' derivado de TDNA de Agrobacterium tumefaciens, e outras regiões de início de transcrição de vários genes de planta conhecidos dos versados. Tais genes incluem, por exemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); o gene que codifica a proteína desaturase transportadora de estearoil-acil de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant
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Physiol. 104:1167-1176); GPc1 de milho (GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208:551-565); o Gpc2 de milho (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); promotores de planta descritos nas Patente U.S. Nos 4.962.028; 5.633.440.
[00202] A invenção usa promotores constitutivos ou tecidoespecíficos derivados de vírus que podem incluir, por exemplo, o promotor subgenômico de tobamovírus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683; o vírus baciliforme do tungro do arroz (RTBV), que se replica apenas em células do floema em plantas de arroz infectadas, com seu promotor que direciona forte expressão de gene repórter floema-específico; o promotor do vírus do mosaico da nervura da mandioca (CVMV), com atividade mais alta nos elementos vasculares, em células de mesófilo de folha, e extremidades da raiz (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139).
[00203] Alternativamente, o promotor de planta pode direcionar a expressão de um ácido nucléico que expressa xilanase e/ou glicancase em um tecido, órgão ou tipo celular específico (isto é, promotores tecido-específicos) ou pode estar sob controle ambiental ou de desenvolvimento mais preciso ou sob o controle de um promotor induzível. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada, a presença de luz, ou pulverização com químicos/hormônios. Por exemplo, a invenção incorpora o promotor induzido por seca de milho (Busk (1997) supra); o promotor induzido por calor, seca e alta concentração de sal de batata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897 909).
[00204] Promotores tecido-específicos podem promover a transcrição apenas dentro de certo período de tempo do estágio de desenvolvimento dentro daquele tecido. Veja, por exemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800, que caracteriza o promotor do gene LEAFY de Arabidopsis. Veja também Cardon (1997) Plant J 12:367-77, que desPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 113/525
108/510 creve o fator de transcrição SPL3, que reconhece um motivo de sequência conservado na região do promotor do gene de identidade do meristema floral AP1 de A. thaliana; e Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp. 995-1004, que descreve o promotor de meristema eIF4. Promotores tecido-específicos que são ativos por todo o ciclo de vida de um tecido particular podem ser usados. Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são operativamente ligados a um promotor ativo primariamente apenas em células de fibra de algodão. Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são operativamente ligados a um promotor ativo primariamente durante os estágios de alongamento da célula da fibra do algodão, por exemplo, como descrito por Rinehart (1996) supra. Os ácidos nucléicos podem ser operativamente ligados ao promotor do gene Fbl2A para serem expressos preferivelmente em células de fibra de algodão (Ibid). Veja também, John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al., Patente U.S. Nos. 5.608.148 e 5.602.321, que descrevem promotores específicos de fibras de algodão e métodos para a construção de plantas transgênicas. Promotores específicos da raiz também podem ser usados para expressar os ácidos nucléicos da invenção. Exemplos de promotores específicos da raiz incluem o promotor do gene de álcool desidrogenase (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60). Outros promotores que podem ser usados para expressar os ácidos nucléicos da invenção incluem, por exemplo, promotores tegumento-específicos promotores específicos do revestimento da semente ou alguma combinação destes; um promotor folha-específico (veja, por exemplo, Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, que descreve um promotor folha-específico em milho); o promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que exibe alta atividade em raízes, veja por exemplo, Hansen (1997) supra); um promotor específico de pólen (veja, por exemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168); um promotor de tomate ativo durante o
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109/510 amadurecimento do fruto, senescência e queda de folhas e, em uma menor proporção, de flores, pode ser usado (veja, por exemplo, Blume (1997) Plant J. 12:731 746); um promotor pistilo-específico do gene SK2 de batata (veja, por exemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431); o gene Blec4 de ervilha, que é ativo em tecido epidérmico de ápices radiculares vegetativos e florais de alfafa transgênica, tornandoo uma ferramenta útil para direcionar a expressão de genes estranhos para camada epidérmica de raízes ou fibras que estão crescendo ativamente; o gene BEL1 óvulo-específico (veja, por exemplo, Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944); e/ou, o promotor em Klee, Patente U.S. N° 5.589.583, que descreve uma região de promotor de planta que é capaz de conferir altos níveis de transcrição em tecido meristemático e/ou células que se dividem rapidamente.
[00205] Alternativamente, promotores de planta que são induzíveis por exposição a hormônios de planta, tais como auxinas, são usados para expressar os ácidos nucléicos da invenção. Por exemplo, a invenção pode usar o fragmento do promotor E1 dos elementos de resposta à auxina (AuxREs) em soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407); o promotor GST6 de Arabidopsis de resposta à auxina (que também responde ao ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); o promotor parC induzível por auxina de (Sakai (1996) 37:906-913); um elemento de resposta à biotina de plantas (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); e, o promotor que responde ao hormônio de estresse ácido abscíssico (Sheen (1996) Science 274:1900-1902).
[00206] Os ácidos nucléicos da invenção também podem ser operativamente ligados a promotores de planta que são induzíveis por exposição a reagentes químicos que podem ser aplicados à planta, tais como herbicidas ou antibióticos. Por exemplo, o promotor In2-2 de milho, ativado por herbicidas protetores de benzenosulfonamida, pode
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110/510 ser usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); aplicação de diferentes herbicidas protetores induz padrões de expressão gênica distintos, incluindo expressão na raiz, hidatódeos, e meristema radicular apical. A sequência codificante pode estar sob o controle, por exemplo, de um promotor induzido por tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas que contêm o gene de arginina descarboxilase de Avena sativa L. (aveia) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); ou, um elemento de resposta ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324). Usando promotores induzidos quimicamente (por exemplo, por hormônios ou pesticidas), isto é, promotor responsivo a um químico que pode ser aplicado à planta transgênica no campo, a expressão de um polipeptídeo da invenção pode ser induzida em um estágio particular do desenvolvimento da planta. Dessa forma, a invenção também fornece plantas transgênicas que contêm um gene induzível que codifica polipeptídeos da invenção cuja variação de hospedeiro é limitada para direcionar espécies de planta, tais como milho, arroz, cevada, trigo, batata ou outros cultivos, induzíveis em qualquer estágio do desenvolvimento do cultivo.
[00207] Um versado na técnica reconhecerá que um promotor de planta tecido-específico pode direcionar a expressão de sequências operativamente ligadas em tecidos diferentes do tecido alvo. Dessa forma, um promotor tecido-específico é um que direciona a expressão preferencialmente no tecido ou tipo celular alvo, mas também pode causar alguma expressão em outros tecidos.
[00208] Os ácidos nucléicos da invenção também podem ser operativamente ligados a promotores de planta que são induzíveis por exposição a reagentes químicos. Esses reagentes incluem, por exemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, ou antibióticos que podem ser aplicados, por exemplo, pulverizados, sobre as plantas transgênicas. Expressão induzível dos ácidos nucléicos produtores de xilanase e/ou
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111/510 glicanase da invenção permitirá que o agricultor selecione plantas com a expressão e/ou atividade ótima de xilanase, mananase e/ou glicanase. O desenvolvimento de partes de planta pode ser então controlado. Dessa forma, a invenção fornece os meios para facilitar a colheita de plantas e partes de planta. Por exemplo, em várias modalidades, o promotor In2-2 de milho, ativado por herbicidas protetores de benzenosulfonamida, é usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); aplicação de diferentes herbicidas protetores induz padrões de expressão gênica distintos, incluindo expressão na raiz, hidatódeos, e meristema radicular apical. Sequências codificantes da invenção também estão sob o controle de um promotor induzido por tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas que contêm o gene de arginina descarboxilase de Avena sativa L. (aveia) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); ou, um elemento de resposta ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324). [00209] Em alguns aspectos, expressão apropriada do polipeptídeo pode requerer uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região codificante. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta (ou de animal ou outros), ou de genes no T-DNA de Agrobacteria.
[00210] O termo “planta” (por exemplo, como em uma planta transgênica ou semente de planta dessa invenção, ou promotor de planta usado em um vetor da invenção) inclui plantas inteiras, partes de planta (por exemplo, folhas, caules, flores, raízes, etc.), protoplastos de planta, sementes e células de planta e progênie da mesma; as classes de planta que podem ser usadas para praticar essa invenção (incluindo composições e métodos) podem tão variadas quanto a classe de plantas superiores, incluindo plantas receptivas a técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), assim como gimnospermas; também incluindo partes de
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112/510 planta de uma variedade de níveis de ploidia, incluindo poliplóide, diplóide, haplóide e estados hemizigotos. Como usado aqui, o termo “planta transgênica” inclui plantas ou células de planta dentro das quais uma sequência de ácido nucléico heteróloga foi inserida, por exemplo, os ácidos nucléicos e vários construtos recombinantes (por exemplo, cassetes de expressão, tais como vetores) da invenção. Plantas transgênicas da invenção também são discutidas abaixo. Vetores de expressão de veículos de clonagem [00211] A invenção fornece vetores de expressão e veículos de clonagem que compreendem os ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, sequências que codificam as xilanases e/ou glicanases da invenção. Vetores de expressão e veículos de clonagem da invenção podem compreender partículas virais, baculovírus, fagos, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomos bacterianos artificiais, DNA viral (por exemplo, vacínia, adenovírus, avipoxvírus, pseudoraiva, e derivados de SV40), cromossomos artificiais baseados em P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiais de levedura, e qualquer outro vetor específico para hospedeiros específicos de interesse (tal como bacilos, Arpergillus e levedura. Vetores da invenção podem incluir sequências cromossômicas, não-cromossômicas, e sintéticas. Grandes números de vetores adequados são conhecidos daqueles versados na técnica, e são disponíveis comercialmente. Vetores exemplares incluem: bacterianos: vetores pQE (Qiagen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH, (vetores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser usado contanto que eles sejam replicáveis e viáveis no hospedeiro. Vetores com baixo número de cópias ou alto número de cópias podem ser empregados com a presente invenção.
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113/510 [00212] O vetor de expressão pode compreender um promotor, um sítio de ligação de ribossomo para início da tradução e um terminador de transcrição. O vetor também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. Vetores de expressão de mamífero podem compreender uma origem de replicação, quaisquer sítios de ligação de ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceptores de splice, sequências de terminação transcricional, e sequências não-transcritas flanqueadoras 5'. Em alguns aspectos, sequências de DNA derivadas dos sítios de poliadenilação e splice de SV40 podem ser usadas para fornecer os elementos genéticos nãotranscritos necessários.
[00213] Em um aspecto, os vetores de expressão contêm um ou mais genes marcadores selecionáveis para permitir a seleção de células hospedeiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionáveis incluem genes que codificam diidrofolato redutase ou genes que conferem resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, genes que conferem resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli, e o gene TRP1 de S. cerevisiae. Regiões promotoras podem ser selecionadas a partir de qualquer gene desejado usando vetores de cloranfenicol transferase (CAT) ou outros vetores com marcadores selecionáveis.
[00214] Vetores para expressar o polipeptídeo ou fragmento deste em células eucarióticas também podem conter intensificadores para aumentar os níveis de expressão. Intensificadores são elementos cisatuantes de DNA, geralmente de cerca de 10 a cerca de 300 pb de extensão que agem sobre um promotor para aumentar sua transcrição. Exemplos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação pb 100 a 270, o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e os intensificadores de adenovírus.
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114/510 [00215] Uma sequência de ácido nucléico pode ser inserida em um vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a sequência é ligada à posição desejada no vetor após digestão do inserto e do vetor com endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, extremidades cegas no inserto e no vetor podem ser ligadas. Uma variedade de metodologias de clonagem é conhecida na técnica, por exemplo, como descrito em Ausubel & Sambrook. Tais procedimentos e outros são considerados estando dentro do escopo daqueles versados na técnica.
[00216] O vetor pode estar na forma de um plasmídeo, uma partícula viral ou um fago. Outros vetores incluem sequências de DNA cromossômicas, não-cromossômicas, e sintéticas, derivadas de SV40; plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vacínia, adenovírus, avipoxvírus, e pseudoraiva. Uma variedade de vetores de clonagem e expressão para uso com hospedeiros procarióticos e eucarióticos é descrita, por exemplo, por Sambrook.
[00217] Vetores bacterianos particulares que podem ser usados incluem os plasmídeos disponíveis comercialmente que compreendem elementos genéticos dos vetores de clonagem bem-conhecidos pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK2333, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro vetor pode ser usado contanto que ele seja replicável e viável na célula hospedeira.
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115/510 [00218] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser expressos em cassetes de expressão, vetores ou vírus e expressos transitoriamente ou estavelmente em células e sementes de plantas. Um sistema de expressão transitória exemplar usa sistemas de expressão epissomais, por exemplo, RNA viral de vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) gerado no núcleo por transcrição de um minicromossomo epissomal contendo DNA superespiralizado, veja por exemplo, Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. Alternativamente, sequências codificantes, isto é, sequências inteiras da invenção, ou subfragmentos das mesmas, podem ser inseridas em um genoma de célula de planta hospedeira se tornando uma parte integral do DNA cromossômico do hospedeiro. Transcritos senso e anti-senso podem ser expressos dessa maneira. Um vetor que compreende as sequências (por exemplo, promotores ou regiões codificantes) de ácidos nucléicos da invenção pode compreender um gene marcador que confere fenótipo selecionável em uma célula de planta ou uma semente. Por exemplo, o marcador pode codificar resistência à um biocida, particularmente resistência à antibióticos, tal como resistência à canamicina, G418, bleomicina, higromicina, ou resistência à um herbicida tal como resistência à clorosulfuron ou Basta.
[00219] Vetores de expressão capazes de expressar ácidos nucléicos e proteínas em plantas são bem-conhecidos na técnica e podem incluir, por exemplo, vetores de Agrobacterium spp., vírus X da batata (veja, por exemplo, Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684), vírus do mosaico do tabaco (veja, por exemplo, Casper (1996) Gene 173:69-73), vírus bushy stunt do tomate (veja, por exemplo, Hillman (1989) Virology 169:42-50), vírus etch do tabaco (veja, por exemplo, Dolja (1997) Virology 234:243-252), vírus do mosaico dourado do feijão (veja, por exemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476), vírus do mosaico da couve-flor (veja, por exemplo, CecPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 121/525
116/510 chini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento transponível Ac/Ds de milho (veja, por exemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), e o elemento transponível supressor-mutator (Spm) de milho (veja, por exemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725); e derivados destes.
[00220] Em um aspecto, o vetor de expressão pode ter dois sistemas de replicação para permitir que ele seja mantido em dois organismos, por exemplo, em células de mamífero ou inseto para expressão e em um hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Além disso, para vetores de expressão de integração, o vetor de expressão pode conter pelo menos uma sequência homóloga ao genoma da célula hospedeira. Ele pode conter duas sequências homólogas que flanqueiam o construto de expressão. O vetor de integração pode ser direcionado para um lócus específico na célula hospedeira por selecionar a sequência homóloga apropriada para inclusão no vetor. Construtos para vetores de integração são bem-conhecidos na técnica.
[00221] Vetores de expressão da invenção também podem incluir um gene marcador selecionável para permitir a seleção de cepas bacterianas que foram transformadas, por exemplo, genes que tornam a bactéria resistente a fármacos, tais como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina, e tetraciclina. Marcadores selecionáveis também podem incluir genes biossintéticos, tais como aqueles nas vias biossintéticas da histidina, triptofano e leucina.
[00222] A sequência de DNA no vetor de expressão é operativamente ligada a sequência(s) de controle de expressão (promotor) apropriada(s) para direcionar a síntese de RNA. Promotores bacterianos particulares mencionados incluem lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda Pr, Pl e trp. Promotores eucarióticos incluem precoce imediato de
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CMV, timidina quinase de HSV, precoce e tardio de SV40, LTRs de retrovírus e metalotioneína-I de camundongo. A seleção do vetor e promotor apropriados está dentro do conhecimento do versado na técnica. O vetor de expressão também contém um sítio de ligação de ribossomo para iniciar a tradução e um terminador de transcrição. O vetor também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. Regiões promotoras podem ser selecionadas a partir de qualquer gene desejado usando vetores de cloranfenicol transferase (CAT) ou outros vetores com marcadores selecionáveis. Além disso, os vetores de expressão contêm preferivelmente um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas tal como resistência à diidrofolato redutase ou neomicina para uma cultura de célula eucariótica ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli.
[00223] Vetores de expressão de mamífero também podem compreender uma origem de replicação, qualquer sítio de ligação de ribossomo necessário, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceptores de splice, sequências de terminação da transcrição e sequências não-transcritas flanqueadoras 5'. Em alguns aspectos, sequências de DNA derivadas dos sítios de splice e poliadenilação de SV40 podem ser usadas para fornecer os elementos genéticos não-transcritos necessários.
[00224] Vetores para expressar o polipeptídeo ou fragmento deste em células eucarióticas podem conter também intensificadores para aumentar os níveis de expressão. Intensificadores são elementos cisatuantes de DNA, geralmente de cerca de 10 a cerca de 300 pb de extensão que agem sobre um promotor para aumentar sua transcrição. Exemplos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação pb 100 a 270, o intensificador do promotor precoce
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118/510 de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e os intensificadores de adenovírus.
[00225] Além disso, os vetores de expressão contêm tipicamente um ou mais genes marcadores selecionáveis para permitir a seleção de células hospedeiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionáveis incluem genes que codificam diidrofolato redutase ou genes que conferem resistência à neomicina a uma cultura de célula eucariótica, genes que conferem resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli e gene TRP1 de S. cerevisiae.
[00226] Em alguns aspectos, o ácido nucléico que codifica um dos polipeptídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a ele, ou fragmentos que compreendem pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos deste é montado em fase apropriada com uma sequência líder capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo traduzido ou fragmento deste. O ácido nucléico pode codificar um polipeptídeo de fusão no qual um dos polipeptídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a eles, ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes, são fundidos a peptídeos ou polipeptídeos heterólogos, tais como peptídeos de identificação N-terminais que conferem características desejadas, tal como estabilidade aumentada ou purificação simplificada. [00227] A sequência de DNA apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a sequência de DNA é ligada à posição desejada no vetor após digestão do inserto e do vetor com endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, extremidades cegas no inserto e no vetor podem ser ligadas. Uma variedade de técnicas de clonagem são descritas em Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Ed., Cold
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Spring Harbor Laboratory Press (1989). Tais procedimentos e outros são considerados estando dentro do escopo daqueles versados na técnica.
[00228] O vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, ou um fago. Outros vetores incluem sequências de DNA cromossômicas, não-cromossômicas e sintéticas, derivadas de SV40; plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vacínia, adenovírus, avipoxvírus e pseudo-raiva. Uma variedade de vetores clonagem e expressão para uso com hospedeiros procarióticos e eucarióticos são descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).
Células hospedeiras e células transformadas [00229] A invenção também fornece células transformadas que compreendem uma sequência de ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma sequência que codifica uma xilanase, uma mananase e/ou uma glicanase da invenção, ou um vetor da infecção. A célula hospedeira pode ser de qualquer uma das células hospedeiras familiares daqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, tais como células bacterianas, células fúngicas, células de levedura, células de mamífero, células de inseto e/ou células de planta. Células bacterianas exemplares incluem E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Células de inseto exemplares incluem Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. Células de animais exemplares incluem CHO, COS ou melanoma de Bowes ou qualquer linhagem celular humana ou de camundongo. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro das habilidades do versado na técnica. Técnicas para transformar uma grande variedade de espéPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 125/525
120/510 cies de plantas superiores são bem-conhecidas e descritas na literatura técnica e científica. Veja, por exemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Patente U.S. N° 5.750.870.
[00230] O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras usando qualquer uma de uma variedade de técnicas, incluindo transformação, transfecção, transdução, infecção viral, armas de genes, ou transferência de gene mediada por Ti. Métodos particulares incluem transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAEDextrano, lipofecção, ou eletroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
[00231] Em um aspecto, os ácidos nucléicos ou vetores da invenção são introduzidos nas células para rastreamento, dessa forma, os ácidos nucléicos entram nas células de uma maneira adequada para expressão subseqüente do ácido nucléico. O método de introdução é amplamente ditado pelo tipo de célula atingido. Métodos exemplares incluem precipitação com CaPO4, fusão de lipossoma, lipofecção (por exemplo, LIPOFECTIN®), eletroporação, infecção viral, etc. Os ácidos nucléicos candidatos podem se integrar estavelmente no genoma da célula hospedeira (por exemplo, com introdução retroviral) ou podem existir transitoriamente ou estavelmente no citoplasma (isto é, através do uso de plasmídeos tradicionais, utilizando sequências regulatórias usuais, marcadores de seleção, etc). Já que muitos rastreamentos farmaceuticamente importantes requerem alvos celulares de mamífero humano ou modelo, vetores retrovirais capazes de transfectar tais alvos podem ser usados.
[00232] Onde apropriado, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados como apropriado para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes da invenção. Após a transformação de uma cepa hospedeira adequada e cultivo da cepa hospedeira para uma densidaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 126/525
121/510 de celular apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas por um período adicional para permitir que elas produzam o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
[00233] As células podem ser coletadas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos, e o extrato bruto resultante é retido para purificação adicional. Células microbianas empregadas para expressão de proteínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou uso de agentes de lise celular. Tais métodos são bem-conhecidos dos versados da técnica. O polipeptídeo expresso ou fragmento deste pode ser recuperado e purificado das culturas de células recombinantes por métodos que incluem precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração com ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Etapas de reenovelamento de proteína podem ser usados, conforme necessário, em completar a configuração do polipeptídeo. Se desejado, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser empregada para as etapas finais de purificação.
[00234] Os construtos nas células hospedeiras podem ser usados de uma maneira convencional para produzir o produto gênico codificado pela sequência recombinante. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos pelas células hospedeiras que contêm o vetor podem ser glicosilados ou podem ser não-glicosilados. Polipeptídeos da invenção podem ou não incluir um resíduo de aminoácido metionina inicial.
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122/510 [00235] Sistemas de tradução sem células também podem ser empregados para produzir um polipeptídeo da invenção. Sistemas de tradução sem células podem usar mRNAs transcritos a partir de um construto de DNA que compreende um promotor operativamente ligado a um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou fragmento deste. Em alguns aspectos, o construto de DNA pode ser linearizado antes da condução de uma reação de transcrição in vitro. O mRNA transcrito é então incubado com um extrato de tradução sem célula apropriado, tal como um extrato de reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
[00236] Os vetores de expressão podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas, tal como, resistência à diidrofolato redutase ou neomicina para uma cultura de célula eucariótica, ou resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli. [00237] Células hospedeiras que contêm os polinucleotídeos de interesse, por exemplo, ácidos nucléicos da invenção, podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar genes. As condições de cultura, tal como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas usadas previamente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão claras para o versado na técnica. Os clones que são identificados como tendo a atividade enzimática especificada podem então ser seqüenciados para identificar a sequência de polinucleotídeo que codifica uma enzima que tem a atividade aumentada.
[00238] A invenção fornece um método para superexpressar uma xilanase, mananase e/ou glicanase recombinante em uma célula que compreende expressar um vetor que compreende um ácido nucléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico que compreende uma
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123/510 sequência de ácido nucléico com pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%,
64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de sequência a uma sequência da invenção ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, em que as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual, ou, um ácido nucléico que hibridiza sob condições estringentes a uma sequência de ácido nucléico da invenção, ou uma subsequência desta. A superexpressão pode ser feita por qualquer meio, por exemplo, uso de um promotor de alta atividade, um vetor bicistrônico, ou por amplificação gênica do vetor.
[00239] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser expressos ou superexpressos em qualquer sistema de expressão in vitro ou in vivo. Qualquer sistema de cultura de célula pode ser empregado para expressar ou superexpressar proteína recombinante, incluindo culturas bacterianas, de inseto, de levedura, fúngicas, ou de mamífero. A superexpressão pode ser realizada pela escolha apropriada de promotores, intensificadores, vetores (por exemplo, uso de vetores de replicon, vetores bicistrônicos (veja, por exemplo, Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8), meios, sistemas de cultura e semelhantes. Em um aspecto, amplificação gênica usando marcadores de seleção, por exemplo, glutamina sintetase (veja, por exemplo, Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63), em sistemas celulares são usados para superexpressar os polipeptídeos da invenção.
[00240] Detalhes adicionais com relação a essa abordagem estão na literatura púbica e/ou são conhecidos do versado na técnica. Em um exemplo não limitante particular, tal literatura pubicamente disponíPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 129/525
124/510 vel inclui EP 0659215 (W0 9403612 A1) (Nevalainen et al.); Lapidot, A., Mechaly, A., Shoham, Y., “Overexpression and single-step purification of a thermostable xylanase from Bacillus stearothermophilus T-6,” J. Biotechnol. Nov 51:259-64 (1996); Lüthi, E., Jasmat, N.B., Bergquist, P.L., “Xylanase from the extremely thermophilic bacterium Caldocellum saccharolyticum: overexpression of the gene in Escherichia coli and characterization of the gene product,” Appl. Environ. Microbiol. Sep 56:2677-83 (1990); e Sung, W.L., Luk, C.K., Zahab, D.M., Wakarchuk, W., “Overexpression of the Bacillus subtilis and circulans xylanases in Escherichia coli,” Protein Expr. Purif. Jun 4:200-6 (1993), embora essas referências não demonstrem as enzimas inventivas do presente pedido.
[00241] A célula hospedeira pode ser qualquer uma das células hospedeiras familiares daqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, células de mamífero, células de inseto, ou células de planta. Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, células de fungos, tal como levedura, células de inseto tal como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, células de animais tal como CHO, COS ou melanoma de Bowes e adenovírus. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro das habilidades daqueles versados na técnica.
[00242] O vetor pode ser introduzido dentro das células hospedeiras usando qualquer uma de variedade de técnicas, incluindo transformação, transfecção, transdução, infecção viral, armas de gene, ou transferência de gene mediada por Ti. Métodos particulares incluem transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAEDextrano, lipofecção ou eletroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I.,
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Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
[00243] Onde apropriado, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes da invenção. Após transformação de uma cepa hospedeira adequada e cultivo da cepa hospedeira para uma densidade celular apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas por um período adicional para permitir que elas produzam o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
[00244] As células são tipicamente coletadas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos, e o extrato bruto resultante é retido para purificação adicional. Células microbianas empregadas para expressão de proteínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou uso de agentes de lise celular. Tais métodos são bem-conhecidos dos versados da técnica. O polipeptídeo expresso ou fragmento deste pode ser recuperado e purificado das culturas de células recombinantes por métodos que incluem precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração com ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Etapas de reenovelamento de proteína podem ser usadas, conforme necessário, na finalização da configuração do polipeptídeo. Se desejado, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser empregada para as etapas finais de purificação.
[00245] Vários sistemas de expressão de mamífero podem ser empregados para expressar proteína recombinante. Exemplos de sistePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 131/525
126/510 mas de expressão de mamífero incluem as linhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco (descritas por Gluzman, Cell, 23:175, 1981) e outras linhagens celulares capazes de expressar proteínas a partir de um vetor compatível, tal como as linhagens celulares C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK.
[00246] Os construtos em células hospedeiras podem ser usados de uma maneira convencional para produzir o produto gênico codificado pela sequência recombinante. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos pelas células hospedeiras contendo o vetor podem ser glicosilados ou podem ser não-glicosilados. Polipeptídeos da invenção podem ou não incluir um resíduo de aminoácido metionina inicial.
[00247] Alternativamente, os polipeptídeos de sequências de aminoácido da invenção, ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes, podem ser produzidos sinteticamente por sintetizadores de peptídeos convencionais. Em outros aspectos, fragmentos ou porções dos polipeptídeos podem ser empregados para produzir o polipeptídeo de extensão completa correspondente por síntese química; portanto, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para produzir os polipeptídeos de extensão completa.
[00248] Sistemas de tradução sem célula também podem ser empregados para produzir um dos polipeptídeos de sequências de aminoácido da invenção, ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes usando mRNAs transcritos a partir de um construto de DNA que compreendem um promotor operativamente ligado a um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou fragmento deste. Em alguns aspectos, o construto de DNA pode ser linearizado antes da condução
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127/510 de uma reação de transcrição in vitro apropriada. O mRNA transcrito é então incubado com um extrato de tradução sem célula apropriado, tal como um extrato de reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado, ou fragmento deste.
Amplificação de Ácidos Nucléicos [00249] Na prática da invenção, ácidos nucléicos da invenção e ácidos nucléicos que codificam as xilanases e/ou glicanases da invenção, ou ácidos nucléicos modificados da invenção, podem ser reproduzidos por amplificação. Amplificação também pode ser usada para clonar ou modificar os ácidos nucléicos da invenção. Dessa forma, a invenção fornece pares de sequências de iniciadores de amplificação para amplificar ácidos nucléicos da invenção. Um versado na técnica pode desenhar pares de sequências de iniciadores de amplificação para qualquer parte ou para a extensão completa dessas sequências. [00250] Em um aspecto, a invenção fornece um ácido nucléico amplificado por um par de iniciadores da invenção, por exemplo, um par de iniciadores descrito por cerca dos primeiros (a 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos de um ácido nucléico da invenção, e cerca dos (a 5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos da fita complementar.
[00251] A invenção fornece um par de sequências de iniciadores de amplificação para amplificar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, em que o par de iniciadores é capaz de amplificar um ácido nucléico que compreende uma sequência da invenção, ou fragmentos ou subsequências desta. Um ou cada membro do par de sequências de iniciadores de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo que compreende pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da sequência, ou cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 bases consecutivas da sequência. A invenção fornece pares
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128/510 de iniciadores de amplificação em que o par de iniciadores compreende um primeiro membro que tem uma sequência descrita por cerca dos primeiros (a 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 resíduos de um ácido nucléico da invenção, e um segundo membro que tem uma sequência descrita por cerca dos (a 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 primeiros resíduos da fita complementar do primeiro membro. A invenção fornece xilanases e/ou glicanases geradas por amplificação, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), usando um par de iniciadores de amplificação da invenção. A invenção fornece métodos de fazer uma xilanase, mananase e/ou glicanase por amplificação, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), usando um par de iniciadores de amplificação da invenção. Em um aspecto, o par de iniciadores de amplificação amplifica um ácido nucléico a partir de uma biblioteca, por exemplo, uma biblioteca de genes, tal como uma biblioteca ambiental. [00252] Reações de amplificação também podem ser usadas para quantificar a quantidade de ácido nucléico em uma amostra (tal como a quantidade de mensagem em uma amostra celular), marcar o ácido nucléico (por exemplo, aplicá-lo a um arranjo ou blot), detectar o ácido nucléico, ou quantificar a quantidade de um ácido nucléico específico em uma amostra. Em um aspecto da invenção, mensagens isoladas de uma célula ou biblioteca de cDNA são amplificadas.
[00253] O versado na técnica pode selecionar e desenhar iniciadores de amplificação de oligonucleotídeo adequados. Métodos de amplificação também são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, reação em cadeia da polimerase, PCR (veja, por exemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) e PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reação em cadeia da ligase (LCR) (veja, por exemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science
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241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificação por transcrição (veja, por exemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); e, replicação de sequência auto-sustentável (veja, por exemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificação pela replicase Q Beta (veja, por exemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensaio automático de amplificação pela replicase Qbeta (veja, por exemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); veja também Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; Patente U.S. Nos. 4.683.195 e 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564. Determinando o grau de identidade de sequência [00254] A invenção fornece ácidos nucléicos que compreendem
sequências que apresentam pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%,
53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,
65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92% 93% , 94% , 95% , 96%, 97%, 98%, 99%, ou
mais ou identidade de sequência completa (100%) a um ácido nucléico exemplar da invenção (como definido acima) ao longo de uma região de pelo menos cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais resíduos. A invenção fornece polipeptídeos que compreendem sequências que apresentam pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%,
54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,
78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, ou
identidade de sequência completa (100%) a um polipeptídeo exemplar
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130/510 da invenção. A proporção de identidade de sequência (homologia) pode ser determinada usando qualquer programa de computador e parâmetros associados, incluindo aqueles descritos aqui, tal como BLAST 2.2.2. ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros predefinidos.
[00255] Como usado aqui, os termos “computador”, “programa de computador” e “processador” são usados nos seus contextos gerais mais amplos e incorporam todos os aparelhos, descritos em detalhe, abaixo. Uma “sequência codificante de” ou uma “sequência que codifica” um polipeptídeo ou proteína em particular, é uma sequência de ácido nucléico que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo ou proteína quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas.
[00256] A expressão “substancialmente idêntico” no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos se refere a duas ou mais sequências que têm, por exemplo, pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%,
53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,
65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92% 93% , 94% , 95% , 96%, 97%, 98%, 99%, ou
mais identidade de resíduos de aminoácido (sequência) quando comparados e alinhados para correspondência máxima, como medido usando um dos algoritmos de comparação de sequência conhecidos ou por inspeção visual. Tipicamente, existe identidade substancial ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos e o mais comumente as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150-200 resíduos. Em alguns aspectos, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de toda a região codificante.
[00257] Adicionalmente, uma sequência de aminoácido “substanciPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 136/525
131/510 almente idêntica” é uma sequência que difere de uma sequência de referência por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas ou não-conservativas, deleções, ou inserções, particularmente quando tal substituição ocorre em um local que não o sítio ativo da molécula e contanto que tal polipeptídeo retenha essencialmente suas propriedades funcionais. Uma substituição de aminoácido conservativa, por exemplo, substitui um aminoácido por outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro, ou substituição de um aminoácido polar por outro, tal como uma substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina). Um ou mais aminoácidos podem ser deletados, por exemplo, de um polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase, resultando em uma modificação da estrutura do polipeptídeo, sem alterar significativamente sua atividade biológica. Por exemplo, aminoácidos amino- ou carbóxi-terminais que não são necessários para a atividade biológica de xilanase, mananase e/ou glicanase podem ser removidos. Sequências de polipeptídeo modificadas da invenção podem ser testadas quanto a uma atividade biológica de xilanase, mananase e/ou glicanase por vários métodos, incluindo colocar a sequência de polipeptídeo modificada em contato com um substrato de xilanase, mananase e/ou glicanase, e determinar se o polipeptídeo modificado diminui a quantidade de substrato específico no ensaio ou aumenta os bioprodutos da reação enzimática de um polipeptídeo de xilanase, mananase e/ou glicanase funcional com o substrato.
[00258] Sequências de ácido nucléico da invenção podem compreender pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 nucleotídeos consecutivos de uma sequência exemplar da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Sequências de ácido nucléico da invenção podem compreender sequênPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 137/525
132/510 cias homólogas e fragmentos de sequências de ácido nucléico e sequências substancialmente idênticas a elas, se referindo a uma sequência que tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,
57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,
69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,
81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência (homologia) a essas sequências. A homologia pode der determinada usando qualquer programa de computador e parâmetros descritos aqui, incluindo FASTA versão 3.0t78 com os parâmetros predefinidos. Sequências homólogas também incluem sequências de RNA nas quais uridinas substituem as timinas nas sequências de ácido nucléico da invenção. As sequências homólogas podem ser obtidas usando qualquer um dos procedimentos descritos aqui ou podem resultar da correção de um erro de seqüenciamento. Será observado que as sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas podem ser representadas no formato tradicional de um caractere (veja a parte interna da capa de trás de Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed., W. H Freeman & Co., Nova Iorque) ou em qualquer outro formato que registre a identidade dos nucleotídeos em uma sequência.
[00259] Vários programas de comparação de sequência identificados em outros locais nesse relatório de patente são particularmente contemplados para uso nesse aspecto da invenção. Homologias de sequência de proteína e/ou ácido nucléico podem ser avaliadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos e programas de comparação de sequência conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, mas, de nenhuma forma são limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA e CLUSTALW (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. BiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 138/525
133/510 ol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993).
[00260] Homologia ou identidade é freqüentemente medida usando um programa de análise de sequência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package do Genetics Computer Group, Centro de Biotecnologia da Universidade de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal programa pareia sequências similares por designar graus de homologia a várias deleções, substituições e outras modificações. Os termos “homologia” e “identidade” no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucléico ou polipeptídeo, referemse a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou apresentam uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos quando comparados e alinhados para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designada conforme medido usando qualquer número de algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual.
[00261] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência à qual as sequências de testes são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são digitadas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros predefinidos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula o percentual de identidade de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.
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134/510 [00262] Uma “janela de comparação”, como usado aqui, inclui referência a um segmento de qualquer uma das várias posições contíguas selecionadas a partir do grupo que consiste em 20 a 600, geralmente de cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150 nas quais uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contiguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequência para comparação são bem-conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970, pela pesquisa pelo método de similaridade de Person & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual. Outros algoritmos para determinar homologia ou identidade incluem, por exemplo, além do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool no National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de SmithWaterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive SePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 140/525
135/510 quence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) e WHAT-IF. Tais programas de alinhamento também podem ser usados para rastrear bases de dados do genoma para identificar sequências de polinucleotídeo que apresentam sequências substancialmente idênticas. Várias bases de dados do genoma estão disponíveis, por exemplo, uma porção substancial do genoma humano está disponível como parte do Projeto de Seqüenciamento do Genoma Humano. Pelo menos vinte e um outros genomas já foram seqüenciados, incluindo, por exemplo, M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997) e levedura (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997) e D. melanogaster (Adams et al., 2000). Progresso significativo também foi feito no seqüenciamento dos genomas de organismos modelo, tais como camundongo, C. elegans e Arabadopsis sp. Várias bases de dados contendo informação genômica comentados com alguma informação funcional são mantidas por diferentes organizações e são acessíveis pela Internet.
[00263] Um exemplo de um algoritmo útil são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977 e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. Programas para realizar análises BLAST são disponíveis publicamente através do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve primeiro identificar pareamentos de sequência com alto escore (HSPs) por identificar pequenas palavras de extensão W na sequência de entrada, que sejam iguais ou satisfaçam um escore limiar T de valor positivo quando alinhadas com uma palavra da mesma extensão em uma sequência da base de dados. T é
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136/510 referido como o limiar do escore de palavras vizinhas (Altschul et al., supra). Essas combinações de palavras vizinhas iniciais agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longas contendo as mesmas. As combinações das palavras são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência até o ponto em que o escore cumulativo do alinhamento pode ser aumentado. Escores cumulativos são calculados usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos pareados; sempre > 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de escores é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão das combinações de palavras em cada direção é interrompida quando: o escore cumulativo do alinhamento diminui pela quantidade X do seu valor máximo atingido; o escore cumulativo vai para zero ou menor, devido ào acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com escore negativo; ou o final de qualquer uma das sequências tenha sido atingido. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como pré-definições um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como pré-definições um comprimento de palavra de 3 e expectativas (E) de 10 e a matriz de escore BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N= -4 e uma comparação de ambas as fitas.
[00264] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências (veja, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual
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137/510 um pareamento entre duas sequências de ácido nucléico ou aminoácido possam ocorrer ao acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucléico de teste ao ácido nucléico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01 e o mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001.
[00265] Em um aspecto, homologias de sequência de proteína e ácido nucléico são avaliadas usando o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Em particular, cinco programas BLAST são usados para realizar a seguinte tarefa:
(1) BLASTP e BLAST3 comparam uma sequência de aminoácido de entrada contra uma base de dados de sequências de proteína;
(2) BLASTN compara uma sequência de nucleotídeo de entrada contra uma base de dados de sequências de nucleotídeos;
(3) BLASTX compara os produtos conceituais da tradução em seis fases de uma sequência de nucleotídeo de entrada (ambas as fitas) contra uma base de dados de sequência de proteína;
(4) TBLASTN compara uma sequência de proteína de entrada contra uma sequência de nucleotídeo traduzida em todas as seis dases de leitura (ambas as fitas); e (5) TBLASTX compara as traduções das seis fases de leitura de uma sequência de nucleotídeo de entrada contra as traduções das seis fases de uma base de dados de sequências de nucleotídeo. [00266] Os programas BLAST identificam sequências homólogas por identificar segmentos similares, que são referidos aqui como “pareamentos de segmentos com alto escore” entre uma sequência de aminoácido ou ácido nucléico de entrada e uma sequência de teste obtida preferivelmente a partir de uma base de dados de proteína ou
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138/510 ácido nucléico. Pareamentos de segmentos com alto escore são preferivelmente identificados (isto é, alinhados) por meio de uma matriz de escore, muitas das quais são conhecidas na técnica. Preferivelmente, a matriz de escore usada é a matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff & Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993). Menos preferivelmente, as matrizes PAM ou PAM250 também podem ser usadas (veja, por exemplo, Schwartz & Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). Os programas BLAST são acessíveis através U.S. National Library of Medicine.
[00267] Os parâmetros usados com os algoritmos acima podem ser adaptados dependendo do comprimento da sequência e do grau de homologia estudado. Em alguns aspectos, os parâmetros podem ser os parâmetros predefinidos usados pelos algoritmos na ausência de instruções do usuário.
SISTEMAS DE COMPUTADOR E PRODUTOS DE PROGRAMA DE
COMPUTADOR [00268] Para determinar e identificar identidades de sequência, homologias estruturais, motivos e semelhantes in silico, uma sequência de ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção pode ser armazenada, gravada e manipulada em qualquer mídia que pode ser lida e acessada por um computador.
[00269] Conseqüentemente, a invenção fornece computadores, sistemas de computador, meios para leitura em computador, produtos de programas de computador e semelhantes, e gravadas ou armazenadas neles as sequências de ácido nucléico e polipeptídeo da invenção. Como usadas aqui, as palavras “gravado” e “armazenado” referem-se a um processo para armazenar informação em uma mídia de computador. Um versado na técnica pode facilmente adotar qualquer método
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139/510 conhecido para gravar informação em uma mídia para leitura em um computador para gerar fabricações que compreendem uma ou mais das sequências de ácido nucléico e/ou polipeptídeo da invenção. [00270] Os polipeptídeos da invenção incluem as sequências exemplares da invenção, e sequências substancialmente idênticas a elas e fragmentos de qualquer uma das sequências anteriores. Sequências de polipeptídeo substancialmente idênticas, ou homólogas referem-se a uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos
50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%
62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%
74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%
86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%
98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%) a uma sequência exemplar da invenção, por exemplo, sequências de polipeptídeo da invenção.
[00271] Homologia pode ser determinada usando qualquer um dos programas de computador e parâmetros descritos aqui, incluindo FASTA versão 3.0t78 com os parâmetros predefinidos ou com qualquer parâmetro modificado. As sequências homólogas podem ser obtidas usando qualquer um dos procedimentos descritos aqui ou podem resultar da correção de um erro de seqüenciamento. Os fragmentos de polipeptídeo compreendem pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou mais aminoácidos consecutivos dos polipeptídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a eles. Será observado que os códigos de polipeptídeo de sequências de aminoácido da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, podem ser representados no formato tradicional de um caractere ou no formato de três letras (veja, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed., supra) ou em qualquer outro formato relacionado com a identidade dos polipeptídeos em uma sePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 145/525
140/510 quência.
[00272] Uma sequência de ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção pode ser gravada, armazenada e manipulada em qualquer mídia que pode ser lida e acessada por um computador. Como usado aqui, as palavras “gravado” e “armazenado” referem-se a um processo para armazenar informação em uma mídia de computador. Um versado na técnica pode adotar facilmente qualquer um dos métodos atualmente conhecidos para gravar informação em uma mídia para leitura em computador para gerar fabricações que compreendem uma ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, uma ou mais das sequências de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Outro aspecto da invenção é uma mídia para leitura em computador que tem gravado nela pelo menos 2, 5, 10, 15, ou 20 ou mais sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas.
[00273] Outro aspecto da invenção é uma mídia para leitura em computador que tem gravada nela uma ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Outro aspecto da invenção é uma mídia para leitura em computador que tem gravada nela uma ou mais das sequências de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Outro aspecto da invenção é uma mídia para leitura em computador que tem gravada nela pelo menos 2, 5, 10, 15, ou 20 ou mais das sequências descritas acima.
[00274] Mídias para leitura em computador incluem mídias legíveis magneticamente, mídias legíveis opticamente, mídias legíveis eletronicamente, e uma mídia magnética/óptica. Por exemplo, as mídias legíveis em computador podem ser um disco rígido, um disco flexível, uma fita magnética, CD-ROM, disco digital versátil (DVD), memória de
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141/510 acesso aleatório (RAM), ou memória somente de leitura (ROM) assim como outros tipos de meios conhecidos daqueles versados na técnica. [00275] Aspectos da invenção incluem sistemas (por exemplo, sistemas baseados na internet), particularmente sistemas de computador que armazenam a manipulam a informação da sequência descrita aqui. Um exemplo de um sistema de computador 100 é ilustrado na forma de diagrama de blocos na Figura 1. Como usado aqui, um “sistema de computador” se refere componentes de hardware, componentes de programas (software) e componentes de armazenamento de dados usados para analisar uma sequência de nucleotídeo de uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo como descrita nas sequências de aminoácido da invenção. O sistema de computador 100 inclui tipicamente um processador para processar, acessar e manipular os dados da sequência. O processador 105 pode ser qualquer tipo bem-conhecido de unidade de processamento central, tal como por exemplo, Pentium III da Intel Corporation, ou processador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD ou International Business Machines.
[00276] Tipicamente, o sistema de computador 100 é um sistema para finalidades gerais que compreende o processador 105 e um ou mais componentes de armazenamento de dados internos 110 para armazenar dados e um ou mais dispositivos de recuperação para recuperar os dados armazenados nos componentes de armazenamento de dados. Um versado na técnica pode observar facilmente que qualquer um dos sistemas de computador disponíveis atualmente é adequado.
[00277] Em um aspecto particular, o sistema de computador 100 inclui um processador 105 conectado a um barramento que é conectado a uma memória central 115 (preferivelmente implementada como
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RAM) e um ou mais dispositivos de armazenamento de dados internos 110, tal como um disco rígido e/ou outra mídia legível em computador que tem dados armazenados. Em alguns aspectos, o sistema de computador 100 ainda inclui um ou mais dispositivos de recuperação de dados 118 para ler os dados armazenamos nos dispositivos de armazenamento de dados internos 100.
[00278] O dispositivo de recuperação de dados 118 pode representar, por exemplo, uma unidade de disco flexível, uma unidade de disco compacto, uma unidade de fita magnética, ou um modem capaz de conexão a um sistema de armazenamento de dados remoto (por exemplo, através da internet), etc. Em alguns aspectos, o dispositivo de armazenamento de dados interno 110 é uma mídia para leitura em computador removível tal como um disco flexível ou um disco compacto, uma fita magnética, etc. contendo lógica de controle e/ou dados gravados nela. O sistema de computador 100 pode incluir vantajosamente ou ser programado por programas apropriados para leitura da lógica de controle e/ou dados do componente de armazenamento de dados uma vez inseridos no dispositivo de recuperação de dados. [00279] O sistema de computador 100 inclui uma tela 120 que é usada para exibir a informação para um usuário do computador. Deve ser observado que o sistema de computador 100 pode ser ligado a outros sistemas de computador 125a-c em uma rede ou rede de área ampliada para fornecer acesso centralizado ao sistema de computador 100.
[00280] Programas para acessar e processar as sequências de nucleotídeo de uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas (tais como ferramentas de busca, ferramentas de comparação e ferramentas de modelagem, etc.) podem estar na memória principal 115 duranPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 148/525
143/510 te a execução.
[00281] Em alguns aspectos, o sistema de computador 100 pode ainda compreender um algoritmo de comparação de sequência para comparar uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, armazenadas em uma mídia de leitura por computador a sequência(s) de nucleotídeo ou polipeptídeo de referência armazenada(s) em uma mídia legível em computador. Um “algoritmo de comparação de sequência” se refere a um ou mais programas que são implementados (localmente ou remotamente) no sistema de computador 100 para comparar uma sequência de nucleotídeo com outras sequências de nucleotídeo e/ou compostos armazenados dentro de um meio de armazenamento de dados. Por exemplo, o algoritmo de comparação de sequência pode comparar as sequências de nucleotídeo de uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, armazenadas em uma mídia legível em computador, a sequências de referência armazenadas em uma mídia legível em computador para identificar homologias ou motivos estruturais.
[00282] A figura 2 é um fluxograma ilustrando um aspecto de um processo 200 para comparar uma nova sequência de nucleotídeo ou proteína com uma base de dados de sequências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova sequência e as sequências na base de dados. A base de dados de sequências pode ser uma base de dados particular armazenada dentro do sistema de computador 100, ou uma base de dados pública tal como GENBANK que é disponível pela internet.
[00283] O processo 200 começa em um estado de início 201 e enPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 149/525
144/510 tão passa para um estado 202 em que a nova sequência a ser comparada é armazenada em uma memória em um sistema de computador 100. Como discutido acima, a memória poderia ser qualquer tipo de memória, incluindo RAM ou um dispositivo de armazenamento interno. [00284] O processo 200 então passa para um estado 204 em que uma base de dados de sequências é aberta para análise e comparação. O processo 200 então passa para um estado 206 em que a primeira sequência armazenada na base de dados é lida em uma memória no computador. Uma comparação é então realizada em um estado 210 para determinar se a primeira sequência é igual à segunda sequência. É importante observar que essa etapa não está limitada a realizar uma comparação exata entre a nova sequência e a primeira sequência na base de dados. Métodos bem-conhecidos são conhecidos daqueles versados na técnica para comparar duas sequências de nucleotídeo ou proteína, mesmo se elas não forem idênticas. Por exemplo, intervalos podem ser introduzidos em uma sequência a fim de aumentar o nível de homologia entre as duas sequências testadas. Os parâmetros que controlam se intervalos ou outras características são introduzidos em uma sequência durante a comparação são normalmente inseridos pelo usuário do sistema de computador.
[00285] Uma vez que a comparação das duas sequências tenha sido realizada no estado 210, é determinado, em um estado de decisão 210, se as duas sequências são iguais. Logicamente, o termo “igual” não é limitado a sequências que são absolutamente idênticas. Sequências que estão dentro dos parâmetros de homologia inseridos pelo usuário serão marcadas como “iguais” no processo 200.
[00286] Se for determinado que as duas sequências são iguais, o processo 200 passa para um estado 214 em que o nome da sequência da base de dados é exibido para usuário. Esse estado notifica o usuário de que a sequência com o nome exibido satisfaz as restrições de
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145/510 homologia que foram inseridas. Uma vez que o nome da sequência armazenada é exibido para o usuário, o processo 200 passa para um estado de decisão 218 em que é determinado se existem mais sequências na base de dados. Se não existirem mais sequências na base de dados, então o processo 200 termina em um estado final 220. Entretanto, se existirem mais sequências na base de dados, então o processo 200 passa para um estado 224 em que um indicador é movimentado para a sequência seguinte na base de dados a fim de que ela possa ser comparada à nova sequência. Dessa maneira, a nova sequência é alinhada e comparada com cada sequência na base de dados.
[00287] Deve ser observado que se foi determinado no estado de decisão 212 que as sequências não são homólogas, então o processo 200 deve passar imediatamente para o estado de decisão 218 a fim de determinar se alguma outra sequência está disponível na base de dados para comparação.
[00288] Conseqüentemente um aspecto da invenção é um sistema de computador que compreende um processador, um dispositivo de armazenamento de dados que tem armazenado nele uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, um dispositivo de armazenamento de dados que tem armazenadas nele, de forma recuperável, sequências de nucleotídeo ou sequências de polipeptídeo de referência para serem comparadas a uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, e um comparador de sequência para conduzir a comparação. O comparador de sequência pode indicar um nível de homologia entre as sequências comparadas ou identificar motivos estrutuPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 151/525
146/510 rais no código de ácido nucléico acima de sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou ele pode identificar motivos estruturais em sequências que são comparados a esses códigos de ácido nucléico e códigos de polipeptídeo. Em alguns aspectos, o dispositivo de armazenamento de dados pode ter armazenado nele as sequências de pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou sequências de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela.
[00289] Outro aspecto da invenção é um método para determinar o nível de homologia entre uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, e uma sequência de nucleotídeo de referência. O método inclui ler o código do ácido nucléico ou o código do polipeptídeo e a sequência de nucleotídeo ou de polipeptídeo de referência através do uso de um programa de computador que determina os níveis de homologia e determinar homologia entre o código do ácido nucléico ou o código do polipeptídeo e a sequência de nucleotídeo ou de polipeptídeo de referência com o programa de computador. O programa de computador pode ser qualquer um de vários programas de computador para determinar níveis de homologia, incluindo aqueles especificamente citados aqui, (por exemplo, BLAST2N com os parâmetros predefinidos ou com qualquer parâmetro modificado). O método também pode ser implementado usando os sistemas de computador descritos acima. O método também pode ser realizado por ler pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção, ou das sequências de polipeptídeo da invenção descritas acima atraPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 152/525
147/510 vés do uso do programa de computador e determinar a homologia entre os códigos do ácido nucléico ou códigos do polipeptídeo e as sequências de nucleotídeo ou sequências de polipeptídeo de referência. [00290] A figura 3 é um fluxograma que ilustra um aspecto de um processo 250 em um computador para determinar se duas sequências são homólogas. O processo 250 começa em um estado de início 252 e então passa para um estado 254 em que uma primeira sequência a ser comparada é armazenada em uma memória. A segunda sequência a ser comparada é então armazenada em uma memória em um estado 256. O processo 250 passa então para um estado 260 em que o primeiro caractere na primeira sequência é lido e então para um estado 262 em que o primeiro caractere de uma segunda sequência é lido. Deve ser compreendido que se a sequência for uma sequência de nucleotídeo, então o caractere normalmente será A, T, C, G ou U. Se a sequência for uma sequência de proteína, então ela estará preferivelmente no código de aminoácido de uma letra para que a primeira e a segunda sequências possam ser facilmente comparadas.
[00291] É então determinado em um estado de decisão 264 se os dois caracteres são iguais. Se eles forem iguais, então o processo 250 passa para um estado 268 em que os próximos caracteres nas primeira e na segunda sequência são lidos. Então é determinado se os próximos caracteres são iguais. Se forem, então o processo 250 continua esse ciclo até que dois caracteres não sejam iguais. Se for determinado que os próximos dois caracteres não são iguais, o processo 250 passa para um estado de decisão 274 para determinar se há mais caracteres em alguma das sequências para serem lidos.
[00292] Se não houver mais caracteres para serem lidos, então o processo 250 passa para um estado 276 em que o nível de homologia entre a primeira e a segunda sequência é determinado pelo cálculo da proporção de caracteres entre as sequências que eram iguais do núPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 153/525
148/510 mero total de sequências na primeira sequência. Dessa forma, se cada caractere em uma primeira sequência de 100 nucleotídeos alinhou com cada caractere em uma segunda sequência, o nível de homologia seria 100%.
[00293] Alternativamente, o programa de computador pode ser um programa de computador que compara as sequências de nucleotídeo de uma sequência de ácido nucléico descrita na invenção, a uma ou mais sequências de nucleotídeo de referência a fim de determinar se o código de ácido nucléico de uma sequência de ácido nucléico da invenção, e sequências substancialmente idênticas a ela, difere de uma sequência de ácido nucléico de referência em uma ou mais posições. Em um aspecto, tal programa grava o comprimento e identidade de nucleotídeos inseridos, deletados ou substituídos com relação à sequência da sequência de polinucleotídeo ou de ácido nucléico de referência da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Em um aspecto, o programa de computador pode ser um programa que determina se uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela contêm um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) com relação a uma sequência de nucleotídeo de referência.
[00294] Outro aspecto da invenção é um método para determinar se uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela diferem em um ou mais nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeo de referência, compreendendo as etapas de ler o código de ácido nucléico e a sequência nucleotídeo de referência através do uso de um programa de computador que identifica diferenças entre sequências de ácido nucléico, e identificar diferenças entre o código de ácido nucléico e a sequência de nucleotídeo de referência com o programa de computador. Em alguns aspectos, o programa de computador é um programa que identifica polimorfismos
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149/510 de um único nucleotídeo. O método pode ser implementado pelos sistemas de computador descritos acima e o método ilustrado na figura 3. O método também pode ser realizado por ler pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, ou 40 ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, e as sequências de nucleotídeo de referência através do uso do programa de computador e identificar diferenças entre os códigos de ácido nucléico e as sequências de nucleotídeo de referência com o programa de computador.
[00295] Em outros aspectos, o sistema baseado em computador pode ainda compreender um identificador para identificar características dentro de uma sequência de ácido nucléico da invenção ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela.
[00296] Um “identificador” se refere a um ou mais programas que identificam certas características dentro de uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela. Em um aspecto, o identificador pode compreender um programa que identifica uma fase aberta de leitura em uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela.
[00297] A figura 4 é um fluxograma ilustrando um aspecto de um processo identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma sequência. O processo 300 começa em um estado de início 302 e então passa para um estado 304 em que uma primeira sequência que deve ser checada quanto às características é armazenada em uma memória 115 no sistema de computador 100. O processo 300 então passa para um estado 306 em que uma base de dados de sequências é aberta. Tal base de dados deve incluir uma lista de
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150/510 atributos de cada característica junto com o nome da característica. Por exemplo, um nome da característica poderia ser “códon de início” e o atributo seria “ATG”. Outro exemplo seria o nome da característica “TAATAA Box” e o atributo da característica seria “TAATAA”. Um exemplo de tal base de dados é produzido pelo University of Wisconsin Genetics Computer Group. Alternativamente, as características podem ser motivos estruturais do polipeptídeo, tais como alfa hélices, folhas beta, ou motivos funcionais do polipeptídeo, tais como sítios enzimáticos ativos, motivos hélice-volta-hélice ou outros motivos conhecidos daqueles versados na técnica.
[00298] Uma vez que a base de dados de características é aberta no estado 306, o processo 300 passa para um estado 308 em que a primeira característica é lida da base de dados. Uma comparação do atributo da primeira característica com a primeira sequência é então feita num estado 310. Então é determinado em um estado de decisão 316 se atributo da característica foi encontrado na primeira sequência. Se o atributo foi encontrado, então o processo 300 passa para um estado 318 em que o nome da característica encontrada é apresentado ao usuário.
[00299] O processo 300 passa então para um estado de decisão 320 em que é determinado se há mais características na base de dados. Se não existirem mais características, então o processo 300 termina em um estado final 324. Entretanto, se existirem mais características na base de dados, então o processo 300 lê a próxima característica da sequência em um estado 326 e volta para o estado 310 em que o atributo da próxima característica é comparado novamente com a primeira sequência. Deve ser observado, que se o atributo da característica não for encontrado na primeira sequência no estado de decisão 316, o processo 300 passa diretamente para o estado de decisão 320 a fim de determinar se existem mais características na base de dados.
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151/510 [00300] Conseqüentemente, outro aspecto da invenção é um método de identificar uma característica dentro de uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, compreendendo ler o(s) código(s) de ácido nucléico ou código(s) de polipeptídeo através do uso de um programa de computador que identifica características nelas, e identificar características dentro do(s) código(s) do ácido nucléico com o programa de computador. Em um aspecto, o programa de computador compreende um programa de computador que identifica fases abertas de leitura. O método pode ser realizado por ler uma única sequência ou pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, ou 40 das sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, ou das sequências de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, através do uso do programa de computador e identificar características dentro dos códigos de ácido nucléico ou códigos de polipeptídeo com o programa de computador.
[00301] Uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela podem ser armazenadas e manipuladas em uma variedade de programas processadores de dados em uma variedade de formatos. Por exemplo, uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela podem ser armazenadas como texto em um arquivo de processamento de palavras, tal como um arquivo de Microsoft WORD® ou WORDPERFECT® ou como um arquivo ASCII em uma variedade de programas de base de dados familiares daqueles versados na técnica, tais como DB2®, SYBASE®, ou ORACLE®. Além disso, vários programas e bases de dados de
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152/510 computador podem ser usados como algoritmos de comparação de sequências, identificadores, ou fontes de sequências de nucleotídeo ou sequências de polipeptídeo de referência a ser comparadas a uma sequência de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou uma sequência de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela. A seguinte lista não é pretendida para limitar a invenção, mas fornecer sugestões de programas e bases de dados que podem ser úteis com as sequências de ácido nucléico da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou sequências de polipeptídeo da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela.
[00302] Os programas e bases de dados que podem ser usados incluem, mas não são limitados a: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST e BLAST2 (NCBI), BLASTN e BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2. DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), a base de dados MDL Available Chemicals Directory,
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153/510 a base de dados MDL Drug Data Report, a base de dados Comprehensive Medicinal Chemistry, a base de dados Derwents's World Drug Index, a base de dados BioByteMasterFile, a base de dados Genbank e a base de dados Genseqn. Vários outros programas e bases de dados ficarão claros para o versado na técnica na presente descrição. [00303] Motivos que podem ser detectados usando os programas acima incluem sequências que codificam zíperes de leucina, motivos de hélice-volta-hélice, sítios de glicosilação, sítios de ubiquitinação, alfa hélices, e folhas beta, sequências de sinal que codificam peptídeos de sinal que direcionam a secreção das proteínas codificadas, sequências implicadas na regulação da transcrição tais como homeoboxes, extensões ácidas, sítios de enzimáticos ativos, sítios de ligação de substrato e sítios de clivagem enzimática.
HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS [00304] A invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que hibridizam sob condições estringentes a uma sequência exemplar da invenção. As condições estringentes podem ser altamente estringentes, condições de estringência média e/ou condições de baixa estringência, incluindo as condições de estringência alta e reduzida descritas aqui. Em um aspecto, é a estringência das condições de lavagem que estabelecem as condições que determinam se um ácido nucléico está dentro do escopo da invenção, como discutido abaixo.
[00305] Em aspectos alternativos, ácidos nucléicos da invenção, definidos aqui por sua habilidade de hibridizar sob condições estringentes, podem ter entre cinco resíduos e a extensão completa do ácido nucléico da invenção, por exemplo, eles podem ter pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, ou mais resíduos de extensão. Ácidos nucléicos mais curPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 159/525
154/510 tos do que a extensão completa também estão incluídos. Esses ácidos nucléicos podem ser úteis, por exemplo, somo sondas de hibridização, sondas de marcação, sondas de oligonucleotídeos de PCR, iRNA (de fita única ou dupla), sequências anti-sentido ou que codificam peptídeos de ligação de anticorpo (epitopos), motivos, sítios ativos, e semelhantes.
[00306] Em um aspecto, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua habilidade de hibridizar sob condições de alta estringência que compreendem condições de cerca de 50% de formamida a cerca de 37°C a 42°C. Em um aspecto, ácidos nucléicos da inv enção são definidos por sua habilidade de hibridizar sob condições de estringência reduzida que compreendem condições a cerca de 35% a 25% de formamida em cerca de 30°C a 35°C.
[00307] Alternativamente, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua habilidade de hibridizar sob condições de alta estringência que compreendem condições a 42°C em 50% de formamid a, SSPE 5X, SDS 0,3%, e um ácido nucléico bloqueador de sequências repetitivas, tal como DNA de cot-1 ou de esperma de salmão (por exemplo, 200 n/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado). Em um aspecto, ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua habilidade de hibridizar sob condições de estringência reduzida que compreendem 35% de formamida em uma temperatura reduzida de 35°C.
[00308] Em reações de hibridização de ácidos nucléicos, as condições usadas para se obter um nível particular de estringência variarão, dependendo da natureza dos ácidos nucléicos que estão sendo hibridizados. Por exemplo, o comprimento, grau de complementaridade, composição da sequência de nucleotídeo (por exemplo, conteúdo de GC vs. AT) e tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA vs. DNA) das regiões de hibridização dos ácidos nucléicos podem ser considerados
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155/510 ao selecionar as condições de hibridização. Uma consideração adicional é se um dos ácidos nucléicos está imobilizado, por exemplo, em um filtro.
[00309] A hibridização pode ser executada sob condições de estringência baixa, estringência moderada ou estringência alta. Como um exemplo de hibridização de ácido nucléico, uma membrana polimérica contendo ácidos nucléicos desnaturados imobilizados é primeiro préhibridizada por 30 minutos a 45DC em uma solução que consiste em NaCl 0,9 M, NaH2PO4 50 mM, pH 7.0, Na2EDTA 5,0 mM, SDS 0,5%, Denhardt 10X e 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Aproximadamente 2 X 107 cpm (atividade específica de 4 a 9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleotídeo com a extremidade marcada com 32P são então adicionados à solução. Após 12 a 16 horas de incubação, a membrana é lavada por 30 minutos em temperatura ambiente em SET 1X (NaCl 150 mM, cloridrato de Tris 20 mM, pH 7.8, Na2EDTA 1 mM) contendo SDS 0,5%, seguido por uma lavagem de 30 minutos em SET 1X fresco a Tm-10DC para a sonda de oligonucleotídeo. A membrana é então exposta a um filme auto-radiográfico para detecção de sinais de hibridização.
[00310] Todas as hibridizações anteriores serão consideradas como estando sob condições de alta estringência.
[00311] Após a hibridização, um filtro pode ser lavado para remover qualquer sonda detectável não ligada especificamente. A estringência usada para lavar os filtros também pode ser alterada dependendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, do comprimento dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, do grau de complementaridade, da composição da sequência de nucleotídeos (por exemplo, conteúdo de GC vs. AT) e do tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA vs. DNA). Exemplos de lavagens em condições de estringência progressivamente maiores são como segue: SSC 2X, SDS 0,1% em
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156/510 temperatura ambiente por 15 minutos (estringência baixa); SSC 0,1X, SDS 0,5% em temperatura ambiente por 30 minutos a 1 hora (estringência moderada); SSC 0,1X, SDS 0,5% por 15 a 30 minutos entre a temperatura de hibridização e 68°C (estringência alta); e NaCl 0,15M por 15 minutos a 72°C (estringência muito alta). Uma lavagem final de baixa estringência pode ser conduzida em SSC 0,1X em temperatura ambiente. Os exemplos acima são meramente ilustrativos de um conjunto de condições que podem ser usadas para lavar filtros. Um versado na técnica saberá que há vários protocolos para lavagens de diferentes estringências. Outros exemplos são dados abaixo.
[00312] Ácidos nucléicos que hibridizaram à sonda são identificados por autoradiografia ou outras técnicas convencionais.
[00313] O procedimento acima pode ser modificado para identificar ácidos nucléicos que apresentam níveis decrescentes de homologia à sequência da sonda. Por exemplo, para obter ácidos nucléicos de níveis decrescentes de homologia à sonda detectável, condições menos estringentes podem ser usadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser reduzida em incrementos de 5dC de 68DC a 42DC em um tampão de hibridização que tem uma concentração de Na+ de aproximadamente 1M. Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com SSC 2X, SDS 0,5% na temperatura de hibridização. Essas condições são consideradas como sendo condições “moderadas” acima de 50DC e condições “baixas” abaixo de 50DC. Um exemplo específico de condições de hibridização “moderadas” é quando a hibridização acima é conduzida a 55DC. Um exemplo específico de condições de hibridização de “estringência baixa” é quando a hibridização acima é conduzida a 45DC.
[00314] Alternativamente, a hibridização pode ser executada em tampões, tal como SSC 6X, contendo formamida em uma temperatura de 42°C. Nesse caso, a concentração de formamida no tampão de hiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 162/525
157/510 bridização pode ser reduzida em incrementos de 5% de 50% a 0% para identificar clones que apresentam níveis decrescentes de homologia com a sonda. Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com SSC 6X, SDS 0,5% a 50°C. Essas condições são considerad as como sendo condições “moderadas” acima de 25% de formamida e condições “baixas” abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização “moderada” é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização de “baixa estringência” é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida.
[00315] Entretanto, a seleção de um formato de hibridização não é crítico - é a estringência das condições de lavagem que estabelecem as condições que determinam se um ácido nucléico está dentro do escopo da invenção. Condições de lavagem usadas para identificar ácidos nucléicos dentro do escopo da invenção incluem, por exemplo, uma concentração de sal de cerca de 0,02 molar em pH 7 e uma temperatura de pelo menos cerca de 50°C ou cerca de 55 °C a cerca de 60°C; ou, uma concentração de sal de cerca de NaCl 0,15 M a 72°C por cerca de 15 minutos; ou, uma concentração de sal de cerca de SSC 0,2X em uma temperatura de cerca de 50°C ou cerca de 55°C e cerca de 60°C por cerca de 15 a cerca de 20 minutos ; ou o complexo de hibridização é lavado duas vezes com uma solução com uma concentração de sal de cerca de SSC 2X contendo SDS 0,1% em temperatura ambiente por 15 minutos e então lavado duas vezes por SSC 0,1X contendo SDS 0,1% a 68°C por 15 minutos; ou, condições equivalentes. Veja, Sambrook, Tijssen e Ausubel para uma descrição de tampão SSC e condições equivalentes.
[00316] Esses métodos podem ser usados para isolar ácidos nucléicos da invenção. Por exemplo, os métodos anteriores podem ser usados para isolar ácidos nucléicos que apresentam uma sequência
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158/510 com pelo menos cerca de 97%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de homologia a uma sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste em uma das sequências da invenção e sequências substancialmente idênticas a ela, ou fragmentos que compreendem pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas dessa e as sequências complementares a eles. A homologia pode ser medida usando o algoritmo de alinhamento. Por exemplo, os polinucleotídeos homólogos podem ter uma sequência codificante que é uma variante alélica de ocorrência natural de uma das sequências codificantes descritas aqui. Tais variantes alélicas podem ter uma substituição, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos quando comparados com os ácidos nucléicos da invenção ou as sequências complementares a eles.
[00317] Adicionalmente, os procedimentos acima podem ser usados para isolar ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos que apresentam pelo menos cerca de 99%, 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de homologia a um polipeptídeo que tem a sequência de uma das sequências de aminoácido da invenção, ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destas como determinado usando um algoritmo de alinhamento de sequência (por exemplo, tal como o algoritmo FASTA versão 3.0t78 com os parâmetros predefinidos).
SONDAS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS E MÉTODOS PARA USAR AS
MESMAS [00318] A invenção também fornece sondas de ácidos nucléicos
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159/510 que podem ser usadas, por exemplo, para identificar ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo com uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção ou fragmentos destes ou para identificar genes de xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, a sonda compreende pelo menos 10 bases consecutivas de um ácido nucléico da invenção. Alternativamente, uma sonda da invenção pode ter pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 ou cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60 cerca de 30 a 70, bases consecutivas de uma sequência descrita em um ácido nucléico da invenção. As sondas identificam um ácido nucléico por ligação e/ou hibridização. As sondas podem ser usadas em arranjos da invenção, veja a discussão abaixo, incluindo, por exemplo, arranjos capilares. As sondas da invenção também podem ser usadas para isolar outros ácidos nucléicos ou polipeptídeos.
[00319] Os ácidos nucléicos isolados da invenção e sequências substancialmente idênticas a eles, as sequências complementares a eles, ou um fragmento que compreende pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das sequências da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, ou as sequências complementares a elas, também podem ser usadas como sondas para determinar se uma amostra biológica, tal como uma amostra de solo, contém um organismo que tem uma sequência de ácido nucléico da invenção ou um organismo a partir do qual o ácido nucléico foi obtido. Em tais procedimentos, uma amostra biológica que carrega potencialmente o organismo a partir do qual o ácido nucléico foi obtido foi isolado é obtida e ácidos nucléicos são obtidos a partir da amostra. Os ácidos nucléicos são colocados em contato com a sonda sob condições que permitem que a sonda hibridize especificamente a qualquer sequência complementar que esteja prePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 165/525
160/510 sente nela.
[00320] Onde necessário, condições que permitem que a sonda hibridize especificamente a sequências complementares podem ser determinadas por colocar a sonda em contato com sequências complementares de amostras conhecidas por conter a sequência complementar assim como sequências de controle que não contêm a sequência complementar. As condições de hibridização, tal como a concentração de sal do tampão de hibridização, a concentração de formamida do tampão de hibridização, ou a temperatura de hibridização, podem ser alterados para identificar condições que permitem que a sonda hibridize especificamente a ácidos nucléicos complementares. [00321] Se a amostra contém o organismo a partir do qual o ácido nucléico foi isolado, hibridização específica da sonda é então detectada. A hibridização pode ser detectada por marcar a sonda com um agente detectável tal como um isótopo radioativo, um corante fluorescente ou enzima capaz de catalisar a formação de um produto detectável.
[00322] Vários métodos para usar as sondas marcadas para detectar a presença de ácidos nucléicos complementares em uma amostra são familiares daqueles versados na técnica. Esses incluem Southern Blots, Northern Blots, procedimentos de hibridização de colônia e dot blots. Protocolos para cada um desses procedimentos são fornecidos em Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. (1997) e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). [00323] Alternativamente, mais de uma sonda (pelo menos uma das quais é capaz de hibridizar especificamente a qualquer sequência complementar que está presente na amostra de ácido nucléico), pode ser usada em uma reação de amplificação para determinar se a amostra contém um organismo contendo uma sequência de ácido nucléico
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161/510 da invenção (por exemplo, um organismo do qual o ácido nucléico foi isolado). Tipicamente, as sondas compreendem oligonucleotídeos. Em um aspecto, a reação de amplificação pode compreender uma reação de PCR. Protocolos de PCR são descritos em Ausubel & Sambrook, supra. Alternativamente, a reação de amplificação pode compreender uma reação em cadeia da ligase, 3SR, ou reação de deslocamento de fita (veja, Barany, F., “The Ligase Chain Reaction in a PCR World”, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991; E. Fahy et al., “Selfsustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcriptionbased Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991; e Walker G.T. et al., “Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992). Em tais procedimentos, os ácidos nucléicos na amostra são colocados em contato com as sondas, a reação de amplificação é realizada e qualquer produto de amplificação resultante é detectado. O produto de amplificação pode ser detectado por realizar eletroforese em gel dos produtos da reação e corar o gel com um intercalante tal como brometo de etídio. Alternativamente, uma ou mais das sondas podem ser marcadas com um isótopo radioativo e a presença de um produto de amplificação radioativo pode ser detectada por autoradiografia após eletroforese em gel. [00324] Sondas derivadas de sequências próximas das extremidades das sequências da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, também podem ser usadas em procedimentos de caminhada cromossômica para identificar clones que contêm sequências genômicas localizadas adjacentes às sequências da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Tais métodos permitem o isolamento de genes que codificam proteínas adicionais do organismo hospedeiro.
[00325] Os ácidos nucléicos isolados da invenção e sequências
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162/510 substancialmente idênticas a eles, e sequências complementares a eles, ou um fragmento que compreende pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das sequências da invenção e sequências substancialmente idênticas a elas, ou as sequências complementares a elas podem ser usados como sondas para identificar e isolar ácidos nucléicos relacionados. Em alguns aspectos, os ácidos nucléicos relacionados podem ser cDNAs ou DNAs genômicos de organismos diferentes daquele a partir do qual o ácido nucléico foi isolado. Por exemplo, os outros organismos podem ser organismos relacionados. Em tais procedimentos, uma amostra de ácido nucléico é colocada em contato com a sonda sob condições que permitem que a sonda hibridize especificamente a sequências relacionadas. A hibridização da sonda aos ácidos nucléicos do organismo relacionado é então detectada usando qualquer um dos métodos descritos acima.
[00326] Por variar a estringência das condições de hibridização usadas para identificar ácidos nucléicos, tais como cDNAs ou DNAs genômicos, que hibridizam à sonda detectável, ácidos nucléicos que apresentam níveis diferentes de homologia com a sonda podem ser identificados e isolados. A estringência pode ser alterada por conduzir a hibridização em temperaturas variadas abaixo das temperaturas de fusão das sondas. A temperatura de fusão, Tm, é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente complementar. Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais a, ou cerca de 5°C mais baixas que, a Tm para uma sonda particular. A temperatura de fusão da sonda pode ser calculada usando as seguintes fórmulas:
[00327] Para sondas entre 14 e 70 nucleotídeos de extensão a temperatura de fusão (Tm) é calculada usando a fórmula: Tm= 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41(fração de G+C)-(600/N) onde N é o comprimenPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 168/525
163/510 to da sonda.
[00328] Se a hibridização for realizada em uma solução contendo formamida, a temperatura de fusão pode ser calculada usando a equação: Tm= 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41(fração de G+C)-(0,63% formamida)-(600/N) onde N é o comprimento da sonda.
[00329] Pré-hibridização pode ser executada em SSC 6X, reagente de Denhardt 5X, SDS 0,5%, 100Dg de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, ou SSC 6X, reagente de Denhardt 5X, SDS 0,5%, 100Dg de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, 50% de formamida. As fórmulas para as soluções SSC e Denhardt estão listadas em Sambrook et al., supra.
[00330] A hibridização é conduzida por adicionar a sonda detectável às soluções de pré-hibridização listadas acima.
[00331] Quando a sonda compreender DNA de fita dupla, ele é desnaturado antes da adição à solução de hibridização. O filtro é colocado em contato com a solução de hibridização por um período de tempo suficiente para permitir que sonda hibridize a cDNAs ou DNAs genômicos contendo sequências complementares a ela ou homólogas a ela. Para sondas com mais de 200 nucleotídeos de extensão, a hibridização pode ser executada 15-25 DC abaixo da Tm. Para sondas mais curtas, tais como sondas de oligonucleotídeos, a hibridização pode ser conduzida 5-10°C abaixo da Tm. Tipicamente, Para hibridizações em SSC 6X, a hibridização é conduzida a aproximadamente 68°C. Geralmente, para hibridizações em soluções co ntendo 50% de formamida, a hibridização é conduzida a aproximadamente 42°C. INIBINDO A EXPRESSÃO DE GLICOSIL HIDROLASES [00332] A invenção fornece ácidos nucléicos complementares a (por exemplo, sequências anti-sentido para) os ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, ácidos nucléicos que codificam xilanase e/ou glicanase. Sequências anti-sentido são capazes de inibir o transporte,
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164/510 splicing ou transcrição genes que codificam xilanase e/ou glicanase. A inibição pode ser feita por atingir o DNA genômico ou RNA mensageiro. A transcrição ou a função do ácido nucléico atingido pode ser inibida, por exemplo, por hibridização ou clivagem. Um conjunto particularmente útil de inibidores fornecido pela presente invenção inclui oligonucleotídeos que são capazes de se ligar ao gene ou mensagem de xilanase, mananase e/ou glicanase, em um ou outro caso, impedindo ou inibindo a produção ou função da uma xilanase, mananase e/ou glicanase. A associação pode ser através de hibridização específica da sequência. Outra classe útil de inibidores inclui oligonucleotídeos que causam a inativação ou clivagem da mensagem de xilanase, mananase e/ou glicanase. O oligonucleotídeo pode ter atividade enzimática que causa tal clivagem, tais como ribozimas. O oligonucleotídeo pode ser modificado quimicamente ou conjugado a uma enzima ou composição capaz de clivar o ácido nucléico complementar. Um grupo de vários desses oligonucleotídeos diferentes pode ser rastreado por aqueles com a atividade desejada. Dessa forma, a invenção fornece várias composições para a inibição da expressão de xilanase, mananase e/ou glicanase no nível de ácido nucléico ou de proteína, por exemplo, anti-sentido, iRNA e ribozimas que compreendem sequências de xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção e os anticorpos antixilanase, antimananase e/ou antiglicanase da invenção.
[00333] A inibição da expressão de xilanase, mananase e/ou glicanase pode ter uma variedade de aplicações e processos industriais, médicos, farmacêuticos, de pesquisa, alimentos e ração, e processamento de suplementos alimentares, e outros. Por exemplo, a inibição da expressão de uma xilanase, mananase e/ou glicanase pode reduzir ou evitar decomposição. A decomposição pode ocorrer quando polissacarídeos, por exemplo, polissacarídeos estruturais, são degradados enzimaticamente. Isso pode levar à deterioração, ou podridão, de fruPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 170/525
165/510 tas e vegetais. Em um aspecto, o uso de composições da invenção que inibem a expressão e/ou atividade de xilanases e/ou glicanases, por exemplo, anticorpos, oligonucleotídeos anti-sentido, ribozimas e RNAi, são usados para reduzir ou evitar decomposição. Dessa forma, em um aspecto, a invenção fornece métodos e composições que compreendem a aplicação sobre uma planta ou produto da planta (por exemplo, um cereal, um grão, um fruto, uma semente, raiz, folha, etc.) anticorpos, oligonucleotídeos anti-sentido, ribozimas e RNAi da invenção para reduzir ou evitar a decomposição. Essas composições também podem ser expressas pela planta (por exemplo, uma planta transgênica) ou outro organismo (por exemplo, uma bactéria ou outro microorganismo transformado com um gene de xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção).
[00334] As composições da invenção para inibição da expressão de uma xilanase, mananase e/ou glicanase (por exemplo, anti-sentido, iRNA, ribozimas, anticorpos) podem ser usadas como composições farmacêuticas, por exemplo, como agentes antipatógenos ou em outras terapias, por exemplo, como antimicrobianos para, por exemplo, Salmonella.
Oligonucleotídeos anti-sentido [00335] A invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido capazes de se ligar a uma mensagem de xilanase, mananase e/ou glicanase, o que pode inibir a atividade de xilano hidrolase (por exemplo, catalisar hidrólise de ligações p-1,4-xilosídicas internas) por atingir o mRNA. Estratégias para desenhar oligonucleotídeos anti-sentido são bem descritas na literatura científica e de patente, e o versado na técnica pode desenhar tais oligonucleotídeos de xilanase, mananase e/ou glicanase usando os novos reagentes da invenção. Por exemplo, protocolos de gene walking /mapeamento de RNA para rastrear por oligonucleotídeos anti-sentido eficazes são bem-conhecidos na técnica,
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166/510 veja, por exemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, que descreve um ensaio de mapeamento de RNA, que se baseia em técnicas moleculares tradicionais para fornecer um método fácil e seguro para potente seleção de sequência anti-sentido. Veja também, Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198.
[00336] Ácidos nucléicos de ocorrência natural são usados como oligonucleotídeos anti-sentido. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser de qualquer comprimento; por exemplo, em aspectos alternativos, os oligonucleotídeos anti-sentido tem entre cerca de 5 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 60, cerca de 18 a 40. O comprimento ótimo pode ser determinado por rastreamento de rotina. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem estar presentes em qualquer concentração. A concentração ótima pode ser determinada por rastreamento de rotina. Uma grande variedade de análogos de ácido nucléico e nucleotídeo sintéticos, que não ocorrem naturalmente, são conhecidos, os quais podem dirigir-se a esse potencial problema. Por exemplo, ácidos peptídeo nucléicos (PNA) contendo arcabouços não-iônicos, tais como unidades de N-(2-aminoetil) glicina podem ser usados. Oligonucleotídeos anti-sentido que tem ligações de fosforotioato também podem ser usados, como descrito nos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Oligonucleotídeos antisentido que apresentam análogos da cadeia principal de DNA sintético fornecidos pela invenção podem incluir também ácidos nucléicos de fosforo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, e morfolino carbamato, como descrito acima.
[00337] Metodologia de química combinatória pode ser usada para criar vastos números de oligonucleotídeos que podem ser rastreados rapidamente por oligonucleotídeos específicos que apresentam afiniPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 172/525
167/510 dades de ligação apropriadas e especificidades frente a qualquer alvo, tais como as sequências de xilanase, mananase e/ou glicanase antisentido da invenção (veja, por exemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).
Ribozimas inibitórias [00338] A invenção fornece ribozimas capazes de se ligar a uma mensagem de xilanase, mananase e/ou glicanase. Essas ribozimas podem inibir a atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, por exemplo, por atingir o mRNA. Estratégias para desenhar ribozimas e selecionar a sequência anti-sentido específica de xilanase, de mananase e/ou de glicanase para direcionamento estão bem descritas na literatura científica e de patente, e o versado na técnica pode desenhar tais ribozimas usando os novos reagentes da invenção. Ribozimas agem por se ligar a um RNA alvo através da porção de ligação do RNA alvo de uma ribozima que é mantida em proximidade a uma porção enzimática do RNA que cliva o RNA alvo. Dessa forma, a ribozima reconhece e se liga a um RNA alvo através de pareamento de bases complementares, e uma vez ligadas ao local correto, age enzimaticamente para clivar e inativar o RNA alvo. A clivagem de um RNA alvo de tal maneira destruirá sua habilidade de direcionar a síntese de uma proteína codificada se a clivagem ocorrer na sequência codificante. Após uma ribozima ter se ligado e clivado seu RNA alvo, ele pode ser liberado daquele RNA para se ligar e clivar novos alvos repetidamente. [00339] Em alguns casos, a natureza enzimática de uma ribozima pode ser vantajosa sobre outras tecnologias, tal como a tecnologia anti-sentido (onde uma molécula de ácido nucléico simplesmente se liga a um alvo de ácido nucléico para bloquear sua transcrição, tradução ou associação com outra molécula) já que a concentração eficaz de uma ribozima necessária para realizar um tratamento terapêutico pode ser menor do que aquela de um oligonucleotídeo anti-sentido. Essa
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168/510 potencial vantagem reflete a habilidade da ribozima agir enzimaticamente. Dessa forma, uma única molécula de ribozima é capaz de clivar muitas moléculas de RNA alvo. Além disso, uma ribozima é tipicamente um inibidor altamente específico, com a especificidade de inibição dependendo não apenas do mecanismo de ligação por pareamento de bases, mas também do mecanismo pelo qual a molécula inibe a expressão do RNA ao qual ela se liga. Isto é, a inibição é causada por clivagem do RNA alvo e assim a especificidade é definida como a razão da taxa de clivagem do RNA alvo sobre a taxa de clivagem de RNA não-alvo. Esse mecanismo de clivagem depende de fatores adicionais àqueles envolvidos no pareamento de bases. Dessa forma, a especificidade de ação de uma ribozima pode ser maior do que aquela de ligação de oligonucleotídeo anti-sentido ao mesmo sítio de ligação de RNA.
[00340] A ribozima da invenção, por exemplo, uma molécula de RNA ribozima enzimática pode ser formada em um motivo de cabeça de martelo, um motivo em forma de grampo, um motivo de vírus da hepatite delta, um motivo do íntron do grupo I e/ou um RNA semelhante a RNaseP em associação com uma sequência guia de RNA. Exemplos de motivos de cabeça de martelo são descritos, por exemplo, por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; motivos em forma de grampo por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, e Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; o motivo do vírus da hepatite delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; o motivo da RNaseP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; e o íntron do grupo I por Cech Patente U.S. N° 4.987.071. A recitação desses motivos específicos não é pretendida para ser limitante. Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma ribozima da invenção, por exemplo, uma molécula de RNA enzimática dessa invenção pode ter um sítio de ligação de substrato específico complementar a uma ou mais das regiões de RNA
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169/510 do gene alvo. Uma ribozima da invenção pode ter uma sequência de nucleotídeo dentro ou circundando este sítio de ligação do substrato que confere uma atividade de clivagem de RNA à molécula. Interferência de RNA (RNAi) [00341] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula inibidora de RNA, assim chamada molécula de “RNAi”, que compreende uma sequência da enzima xilanase, mananase e/ou glicanase da invenção. A molécula de RNAi pode compreender uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA), por exemplo, siRNA, miRNA e/ou pequenas moléculas de RNA em forma de grampo (shRNA). A molécula de RNAi, por exemplo, siRNA (pequeno RNA inibidor) pode inibir a expressão de um gene de enzima xilanase, mananase e/ou glicanase, e/ou miRNA (micro RNA) pode inibir a tradução de uma mensagem de xilanase, mananase e/ou glicanase. Em um aspecto, a molécula de RNAi, por exemplo, siRNA e/ou miRNA, tem cerca de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou mais nucleotídeos de dúplex de extensão. Embora a invenção não seja limitada a nenhum mecanismo de ação em particular, o RNAi pode entrar em uma célula, e causar a degradação de um RNA fita única (ssRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a RNA de fita dupla (dsRNA), o mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado interferência de RNA (RNAi). Um mecanismo básico possível por trás de RNAi é a quebra de um RNA de fita dupla (dsRNA) que pareia com uma sequência gênica específica em pequenos pedaços chamados pequenos RNAs de interferência, que disparam a degradação de mRNA que pareia com sua sequência. Em um aspecto, os RNAi's da invenção são usados em terapias de silenciamento gênico, veja por exemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para degradar seletivamente RNA usando as molécuPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 175/525
170/510 las de RNAi, por exemplo, siRNA e/ou miRNA, da invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAi da invenção podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. [00342] Em um aspecto, a introdução intracelular do RNAi é por internalização de um ligante específico da célula alvo ligado a uma proteína de ligação de RNA que compreende um RNAi (por exemplo, microRNA) adsorvido. O ligante é específico para um único antígeno da superfície da célula alvo. O ligante pode ser internalizado espontaneamente após a ligação ao antígeno da superfície da célula. Se o único antígeno da superfície da célula alvo não for naturalmente internalizado após ligação ao seu ligante, a internalização pode ser promovida pela incorporação de um peptídeo rico em arginina, ou outro peptídeo permeável à membrana, na estrutura do ligante ou proteína de ligação de RNA ou ligação de tal peptídeo ao ligante ou proteína de ligação de RNA. Veja, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 20060030003; 20060025361; 20060019286; 20060019258. Em um aspecto, a invenção fornece formulações à base de lipídios para liberar, por exemplo, introduzir ácidos nucléicos da invenção como partículas de ácido nucléico-lipídio que compreendem uma molécula de RNAi a uma célula, por exemplo, veja, Publicação de Pedido de Patente U.S. 20060008910.
[00343] Métodos para fazer e usar moléculas de RNAi, por exemplo, siRNA e/ou miRNA, para degradar seletivamente RNA são bemconhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.
MODIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS [00344] A invenção fornece métodos de gerar variantes dos ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, aqueles que codificam uma xilanase, mananase e/ou glicanase. Esses métodos podem ser repetidos
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171/510 ou usados em várias combinações para gerar xilanases e/ou glicanases que apresentam atividade diferente ou alterada ou estabilidade diferente daquela de uma xilanase, mananase e/ou glicanase codificada pelo ácido nucléico molde. Esses métodos também podem ser repetidos ou usados em várias combinações, por exemplo, para gerar variações na expressão de gene/mensagem, tradução de mensagem ou estabilidade de mensagem. Em outro aspecto, a composição genética de uma célula é alterada, por exemplo, pela modificação de um gene homólogo ex vivo, seguida por sua reinserção na célula.
[00345] Um ácido nucléico da invenção pode ser alterado por qualquer meio. Por exemplo, métodos aleatórios ou estocásticos, ou métodos não-estocásticos ou de “evolução dirigida”, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.361.974. Métodos para mutação aleatória de genes são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.830.696. Por exemplo, mutágenos podem ser usados para mutar aleatoriamente um gene. Mutágenos incluem, por exemplo, luz ultravioleta ou irradiação gama, ou um agente mutagênico químico, por exemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoativados, sozinhos ou em combinação, para induzir quebras no DNA suscetíveis a reparo por recombinação. Outros mutágenos químicos incluem, por exemplo, bissulfito de sódio, ácido nitroso, hidrozilamina, hidrazina ou ácido fórmico. Outros mutágenos são análogos de precursores de nucleotídeo, por exemplo, nitrosoguanidina, 5-bromouracila, 2-aminopurina, ou acridina. Esses agentes podem ser adicionados a uma reação de PCR no lugar do precursor de nucleotídeo mutando assim a sequência. Agentes intercalantes tais como proflavina, acriflavina, quinacrina e semelhantes também podem ser usados.
[00346] Qualquer técnica em biologia molecular pode ser usada, por exemplo, mutagênese aleatória por PCR, veja, por exemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; ou, mutagênese
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172/510 combinatória de cassete múltiplo, veja, por exemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196. Alternativamente, ácidos nucléicos, por exemplo, genes, podem ser reagrupados após fragmentação aleatória, ou “estocástica”, veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238; 5.605.793. Em aspectos alternativos, modificações, adições ou deleções são introduzidas por “error-prone” PCR, embaralhamento, mutagênese sítio-direcionada, “assembly” PCR, mutagênese por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de agrupamentos repetitivos, mutagênese de agrupamento exponencial, mutagênese sítio-específica, reagrupamento de genes (por exemplo, GeneReassembly, veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.537.776), Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene (GSSM), reagrupamento por ligação sintética (SLR), recombinação, recombinação de sequência repetitiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese de molde contendo uracila, mutagênese de dúplex interrompido, mutagênese de reparo de mal-pareamentos pontuais, mutagênese por cepas do hospedeiro deficientes em reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese por deleção, mutagênese por seleção de restrição, mutagênese por purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de agrupamentos, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e/ou uma combinações desses e outros métodos.
[00347] As seguintes publicações descrevem uma variedade de procedimentos de recombinação repetitiva e/ou métodos que podem ser incorporados nos métodos da invenção: Stemmer (1999) Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) Evolution of a cytokine using DNA family shuffling Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) Protein evolution by molecular
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173/510 breeding Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution Nature 391:288-291; Crameri (1997) Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer' Journal of Molecular Biology 255:373386; Stemmer (1996) Sexual PCR and Assembly PCR In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova Iorque. pp.447457; Crameri & Stemmer (1995) Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) The Evolution of Molecular Computation Science 270: 1510; Stemmer (1995) Searching Sequence Space Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling Nature 370:389-391; e Stemmer (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
[00348] Métodos mutacionais de gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese sítio-direcionada (Ling et al. (1997) Approaches
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174/510 to DNA mutagenesis: an overview Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) In vitro mutagenesis Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) Strategies and applications of in vitro mutagenesis Science 229:1193-1201; Carter (1986) Site-directed mutagenesis Biochem. J. 237:1-7; e Kunkel (1987) The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. & Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlim)); mutagênese usando moldes contendo uracila (Kunkel (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection Methods in Enzymol. 154, 367-382; e Bass et al. (1988) Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities Science 242:240-245); mutagênese dirigida por oligonucleotídeo (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller (1982) Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors Methods in Enzymol. 100:468-500; e Zoller (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagênese de DNA modificado por fosforotioato (Taylor (1985) The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor (1985) The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye
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175/510 (1986) Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers (1988) Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis Nucl. Acids Res. 16:791-802; e Sayers et al. (1988) Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagênese usando DNA com dúplex interrompido (Kramer et al. (1984) The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA 154:350-367; Kramer (1988) Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz (1988) Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro Nucl. Acids Res. 16: 69876999).
[00349] Protocolos adicionais que podem ser usados para praticar a invenção incluem reparo de mal-pareamento pontual (Kramer (1984) Point Mismatch Repair Cell 38:879-887), mutagênese usando cepas de hospedeiro deficientes em reparo (Carter et al. (1985) Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; e Carter (1987) Improved oligonucleotidedirected mutagenesis using M13 vectors Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh (1986) Use of oligonucleotides to generate large deletions Nucl. Acids Res. 14: 5115), seleção de restrição e seleção de restrição e purificação de restrição (Wells et al. (1986) Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317:
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415-423), mutagênese por síntese total do gene (Nambiar et al. (1984) Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein Science 223: 1299-1301; Sakamar & Khorana (1988) Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites Gene 34:315-323; e Grundstrom et al. (1985) Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparo de quebra de fita dupla (Mandecki (1986); Arnold (1993) Protein engineering for unusual environments Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. Oligonucleotide-directed doublestrand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for sitespecific mutagenesis Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181). Detalhes adicionais sobre vários dos métodos acima podem ser encontrados no Volume 154 de Enzymology, que também descreve controles úteis para identificação e solução de com vários métodos de mutagênese.
[00350] Protocolos que podem ser usados para praticar a invenção são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.605.793 para Stemmer (Feb. 25, 1997), Methods for In Vitro Recombination; Patente U.S. N°. 5.811.238 to Stemmer et al. (Sep. 22, 1998) Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination; Patente U.S. N° 5.830.721 para Stemmer et al. (Nov. 3, 1998), DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly; Patente U.S. N° 5.834.2 52 para Stemmer, et al. (Nov. 10, 1998) End-Complementary Polymerase Reaction; Patente U.S. N° 5.837.458 para Minshull, et al. (17 Nov., 1998), Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering; WO 95/22625, Stemmer & Crameri, Mutagenesis by Random FragPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 182/525
177/510 mentation and Reassembly; WO 96/33207 por Stemmer & Lipschutz End Complementary Polymerase Chain Reaction; WO 97/20078 por Stemmer & Crameri Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination; WO 97/35966 por Minshull & Stemmer, Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering; WO 99/41402 por Punnonen et al. Targeting of Genetic Vaccine Vectors; WO 99/41383 por Punnonen et al. Antigen Library Immunization; WO 99/41369 by Punnonen et al. Genetic Vaccine Vector Engineering; WO 99/41368 por Punnonen et al. Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines; EP 752008 por Stemmer and Crameri, DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly; EP 0932670 por Stemmer Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination; WO 99/23107 por Stemmer et al., Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling; WO 99/21979 por Apt et al., Human Papillomavirus Vectors; WO 98/31837 por del Cardayre et al. Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination; WO 98/27230 por Patten & Stemmer, Methods and Compositions for Polypeptide Engineering; WO 98/27230 por Stemmer et al., Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection, WO 00/00632, Methods for Generating Highly Diverse Libraries, WO 00/09679, Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences, WO 98/42832 por Arnold et al., Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers, WO 99/29902 por Arnold et al., Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences, WO 98/41653 por Vind, An in Vitro Method for Construction of a DNA Library, WO 98/41622 por Borchert et al., Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling, e WO 98/42727 por Pati & Zarling, Sequence Alterations using
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Homologous Recombination.
[00351] Protocolos que podem ser usados para praticar a invenção (fornecendo detalhes com relação a vários métodos de geração de diversidade) são descritos, por exemplo, no pedido de Patente U.S. N° de série (USSN) 09/407.800, SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES por Patten et al. depositado em 28 de setembro de 1999; EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION por del Cardayre et al., Patente dos Estados Unidos No. 6.379.964; OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION por Crameri et al., Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.319.714; 6.368.861; 6.376.246; 6.423.542; 6.426.224 e PCT/US00/01203; USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING por Welch et al., Patente dos Estados Unidos No. 6.436.675; METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS por Selifonov et al., depositado em 18 de janeiro de 2000, (PCT/US00/01202) e, por exemplo, METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS por Selifonov et al., depositado em 18 de julho de 2000 (U.S. No. Ser. 09/618.579); METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS por Selifonov & Stemmer, depositado em 18 de janeiro de 2000 (PCT/US00/01138); e SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION por Affholter, depositado em 6 de setembro de 2000 (U.S. No. Ser. 09/656.549); e Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.177.263; 6.153.410.
[00352] Métodos não-estocásticos, ou de “evolução dirigida” incluem, por exemplo, mutagênese de saturação (GSSM), reagrupamento
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179/510 de ligação sintética (SLR), ou uma combinação desses e são usados para modificar os ácidos nucléicos da invenção para gerar xilanases e/ou glicanases com propriedades novas ou alteradas (por exemplo, atividade sob condições altamente ácidas ou alcalinas, temperaturas altas ou baixas, e semelhantes). Polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos modificados podem ser rastreados por uma atividade antes de testar quanto à atividade de hidrólise de xilano ou outra. Qualquer modalidade ou protocolo de teste pode ser usado, por exemplo, usando uma plataforma de arranjo capilar. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.
Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene, ou, GSSM [00353] A invenção também fornece métodos para fazer enzimas usando mutagênese por Saturação do Sítio do Gene, ou GSSM, como descrito que, e também nas Patentes U.S. Nos. 6.171.820 e 6.579.258. Em um aspecto, iniciadores de códon contendo uma sequência N,N,G/T degenerada são usados para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, por exemplo, uma xilanase, mananase e/ou glicanase ou um anticorpo da invenção, a fim de gerar um conjunto de polipeptídeos de progênie nos quais uma gama completa de substituições de um único aminoácido esteja representada em cada posição de aminoácido, por exemplo, um resíduo em um sítio ativo de uma enzima ou sítio de ligação ao ligante direcionado para ser modificado. Esses oligonucleotídeos podem compreender uma primeira sequência homóloga contígua, uma sequência N,N,G/T degenerada, e, em um aspecto, uma segunda sequência homóloga. Os produtos traducionais de progênie à jusante originados do uso de tais oligonucleotídeos incluem todas as alterações de aminoácido possíveis em cada local de aminoácido ao longo do polipeptídeo, porque a degeneração da sequência N,N,G/T inclui códons para todos os 20 aminoácidos. Em um aspecto, tal oligonucleotídeo degenerado (compreendido de,
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180/510 por exemplo, um cassete de N,N,G/T degenerado) é usado para submeter cada códon original em um molde de polinucleotídeo precursor a um gama completa de substituições de códon. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes degenerados são usados - no mesmo oligonucleotídeo ou não, para submeter pelo menos dois códons originais em um molde de polinucleotídeo precursor a uma gama completa de substituições de códon. Por exemplo, mais de uma sequência N,N,G/T pode estar contida em um oligonucleotídeo para introduzir mutações de aminoácido em mais de um local. Essas várias sequências N,N,G/T podem estar diretamente contíguas, ou separadas por uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo adicional(is). Em outro aspecto, oligonucleotídeos úteis para introduzir adições e deleções podem ser usados sozinhos ou em combinação com os códons que contêm uma sequência N,N,G/T, para introduzir qualquer combinação ou permutação de adições, deleções e/ou substituições de aminoácido.
[00354] Em um aspecto, a mutagênese simultânea de duas ou mais posições de aminoácido contiguas é feita usando um oligonucleotídeo que contém trincas de N,N,G/T contíguas, isto é, uma sequência (N,N,G/T)n degenerada. Em outro aspecto, cassetes degenerados que apresentam menos degeneração do que a sequência N,N,G/T são usados. Por exemplo, pode ser desejável em alguns casos usar (por exemplo, em um oligonucleotídeo) uma sequência de trinca degenerada compreendida apenas de um N, onde tal N pode estar na primeira, segunda ou terceira posição da trinca. Quaisquer outras bases, incluindo quaisquer combinações e permutações destas podem ser usadas nas duas posições restantes da trinca. Alternativamente, pode ser desejável, em alguns casos, usar (por exemplo, em um oligo) uma sequência de trinca N,N,N degenerada.
[00355] Em um aspecto, o uso de trincas degeneradas (por exemplo, trincas de N,N,G/T) permite geração sistemática e fácil de uma
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181/510 gama completa de aminoácidos naturais possíveis (para um total de 20 aminoácidos) em cada e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo (em aspectos alternativos, os métodos também incluem degeneração de menos do que todas as substituições possíveis por posição de resíduo de aminoácido, ou códon). Por exemplo, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, 2000 espécies distintas (isto é, 20 aminoácidos possíveis por posição X 100 posições de aminoácido) podem ser geradas. Através do uso de um oligonucleotídeo ou um conjunto de oligonucleotídeos contendo uma trinca N,N,G/T degenerada, 32 sequências individuais podem codificar todos os 20 aminoácidos naturais possíveis. Dessa forma, em um frasco de reação, no qual uma sequência de polinucleotídeo precursora é submetida a mutagênese de saturação usando pelo menos um tal oligonucleotídeo, são gerados 32 polinucleotídeos de progênie distintos que codificam 20 polipeptídeos distintos. Em contraste, o uso de um oligonucleotídeo não degenerado em mutagênese sítio direcionada leva apenas a um produto de polipeptídeo de progênie por frasco de reação. Oligonucleotídeos não degenerados podem, em um aspecto, ser usados em combinação com iniciadores degenerados descritos; por exemplo, oligonucleotídeos não degenerados podem ser usados para gerar mutações pontuais específicas em um polinucleotídeo de trabalho. Isso fornece um meio de gerar mutações pontuais específicas silenciosas, mutações pontuais que levam a alterações de aminoácido correspondentes, e mutações pontuais que causam a geração de códons de parada e a expressão correspondente de fragmentos de polipeptídeo. [00356] Em um aspecto, cada frasco de reação de mutagênese de saturação contém polinucleotídeos que codificam pelo menos 20 moléculas de polipeptídeo de progênie (por exemplo, xilanases e/ou glicanases) tal que todos os 20 aminoácidos naturais estejam representados em uma posição de aminoácido específica que corresponde à
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182/510 posição do códon mutagenizado no polinucleotídeo precursor (outros aspectos usam menos do que todas as 20 combinações naturais). Os polipeptídeos de progênie degenerados 32 vezes gerados a partir de cada frasco de reação de mutagênese de saturação podem ser submetidos à amplificação clonal (por exemplo, clonados em um hospedeiro adequado, por exemplo, hospedeiro de E. coli, usando, por exemplo, um vetor de expressão) e submetidos à rastreamento de expressão. Quando um polipeptídeo de progênie individual é identificado por rastreamento como apresentando uma alteração de propriedade favorável (quando comparado ao polipeptídeo precursor, tal como atividade de hidrólise de xilano aumentada sob condições alcalinas ou ácidas), ele pode ser seqüenciado para identificar a substituição de aminoácido correspondentemente favorável contida nele.
[00357] Em um aspecto, por mutagenizar cada e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo precursor usando mutagênese de saturação, como descrito aqui, alterações de aminoácido favoráveis podem ser identificadas em mais de uma posição de aminoácido. Uma ou mais moléculas de progênie podem ser geradas contendo uma combinação de todas ou parte dessas substituições de aminoácido favoráveis. Por exemplo, se 2 alterações de aminoácido favoráveis são identificadas em cada uma das 3 posições de aminoácido em um polipeptídeo, as permutações incluem 3 possibilidades em cada posição (nenhuma alteração do aminoácido original, e cada uma das duas alterações favoráveis) e 3 posições. Dessa forma, 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, incluindo 7 que foram examinadas anteriormente - 6 mutações pontuais únicas (isto é, 2 em cada uma das três posições) e nenhuma alteração em qualquer posição.
[00358] Em outro aspecto ainda, mutagênese por saturação do sítio pode ser usada junto com embaralhamento, quimerização, recombinação e outros processos mutagenizantes, junto com rastreamento. Essa
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183/510 invenção fornece o uso de qualquer(isquer) processo(s) mutagenizantes, incluindo mutagênese de saturação,de uma maneira repetitiva. Em um exemplo, o uso repetido de qualquer(isquer) processo(s) mutagenizantes é usado em combinação com rastreamento.
[00359] A invenção também fornece o uso de iniciadores de códon patenteados (contendo uma sequência N,N,N degenerada) para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, a fim de gerar um conjunto de polipeptídeos de progênie nos quais uma gama completa de substituições de aminoácido único está representada em cada posição de aminoácido (mutagênese por saturação do sítio do gene (GSSM)). Os oligos usados são compreendidos contiguamente de uma primeira sequência homóloga, uma sequência N,N,N degenerada e preferivelmente, mas não necessariamente, uma segunda sequência homóloga. Os produtos traducionais de progênie à jusante originados do uso de tais oligos incluem todas as alterações de aminoácido possíveis em cada local do aminoácido ao longo do polipeptídeo, porque a degeneração da sequência N,N,N inclui códons para todos os 20 aminoácidos.
[00360] Em um aspecto, tal oligo degenerado (compreendido de um cassete N,N,N degenerado) é usado para submeter cada códon original em um molde de polinucleotídeo precursor a uma gama completa de substituições de códon. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes de N,N,N degenerados são usados - no mesmo oligo ou não, para submeter pelo menos dois códons originais em um molde de polinucleotídeo precursor a uma gama completa de substituições de códon. Dessa forma, mais de uma sequência N,N,N pode estar contida em um oligo para introduzir mutações de aminoácido em mais do que um local. Essa pluralidade de sequências N,N,N pode ser diretamente contígua, ou separada por uma ou mais sequência(s) adicional(is). Em outro aspecto, oligos úteis para introduzir adições e deleções podem
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184/510 ser usados sozinhos ou em combinação com os códons que contêm uma sequência N,N,N, para introduzir qualquer combinação ou permutação de adições, deleções e/ou substituições de aminoácidos.
[00361] Em uma exemplificação particular, é possível mutagenizar simultaneamente duas ou mais posições de aminoácido contíguas usando um oligo que contém trincas N,N,N contíguas, isto é, uma sequência (N,N,N)n degenerada.
[00362] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de cassetes degenerados que apresentam menos degeneração do que a sequência N,N,N. Por exemplo, pode ser desejável em alguns casos, usar (por exemplo, em um oligo) uma sequência de trinca degenerada compreendida de apenas um N, onde o N pode estar na primeira, segunda ou terceira posição da trinca. Qualquer outra base incluindo qualquer combinação e permutação destas pode ser usada nas duas posições restantes da trinca. Alternativamente, pode ser desejável em alguns casos, usar (por exemplo, em um oligo) uma sequência de trinca de N,N,N degenerada, uma sequência de trinca de N,N,G/T, N,N, G/C.
[00363] É observado, entretanto, que o uso de uma trinca degenerada (tal como uma sequência de trinca de N,N,G/T ou N,N, G/C) como descrito na presente invenção é vantajoso por várias razões. Em um aspecto, essa invenção fornece um meio de gerar sistematicamente e de forma relativamente fácil a substituição da gama completa de aminoácidos possíveis (para um total de 20 aminoácidos) em cada e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo. Dessa forma, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, a invenção fornece uma forma de gerar sistematicamente e de forma relativamente fácil 2000 espécies distintas (isto é, 20 aminoácidos possíveis por posição vezes 100 posições de aminoácido). É observado que é fornecido através do uso de um oligo que contém uma sequência de tripla de N,N,G/T ou
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N,N, G/C degenerada, 32 sequências individuais que codificam 20 aminoácidos possíveis. Dessa forma, em um frasco de reação no qual uma sequência de polinucleotídeo precursor é submetida a mutagênese de saturação usando tal oligo, são gerados 32 polinucleotídeos de progênie distintos que codificam 20 polipeptídeos distintos. Em contraste, o uso de um oligo não degenerado em mutagênese sítio direcionada leva a apenas um produto de polipeptídeo de progênie por frasco de reação.
[00364] Essa invenção também fornece uso de oligos não degenerados, que podem, em um aspecto, ser usados em combinação com iniciadores degenerados descritos. É observado que em algumas situações, é vantajoso usar oligos degenerados para gerar mutações pontuais específicas em um polinucleotídeo de trabalho. Isso fornece um meio de gerar mutações pontuais específicas silenciosas, mutações pontuais que levam a alterações de aminoácido correspondentes e mutações pontuais que causam e geração de códons de parada e a expressão correspondente de fragmentos de polipeptídeo.
[00365] Dessa forma, em um aspecto dessa invenção, cada frasco de reação de mutagênese de saturação contém polinucleotídeos que codificam pelo menos 20 moléculas de polipeptídeo de progênie tal que todos os 20 aminoácidos estejam representados em uma posição de aminoácido específica que corresponde à posição do códon mutagenizado no polinucleotídeo precursor. Os polipeptídeos da progênie degenerados 32 vezes gerados de cada frasco de reação de mutagênese de saturação podem ser submetidos à amplificação clonal (por exemplo, clonados em um hospedeiro de E. coli adequado usando um vetor de expressão) e submetidos à rastreamento de expressão. Quando um polipeptídeo de progênie individual é identificado por rastreamento como apresentando uma alteração de propriedade favorável (quando comparado ao polipeptídeo precursor), ele pode ser seqüenPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 191/525
186/510 ciado para identificar a substituição de aminoácido correspondentemente favorável contida nele.
[00366] É observado que por mutagenizar cada e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo precursor usando mutagênese de saturação, como descrito aqui, alterações de aminoácido favoráveis podem ser identificadas em mais de uma posição de aminoácido. Uma ou mais novas moléculas da progênie podem ser geradas contendo uma combinação de todas ou parte dessas substituições de aminoácido favoráveis. Por Por exemplo, se 2 alterações de aminoácido favoráveis específicas são identificadas em cada uma das 3 posições de aminoácido em um polipeptídeo, as permutações incluem 3 possibilidades em cada posição (nenhuma alteração do aminoácido original e cada uma das duas alterações favoráveis) e 3 posições. Dessa forma, há 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, incluindo 7 que foram examinadas anteriormente - 6 mutações pontuais únicas (isto é, 2 em cada uma das três posições) e nenhuma alteração em qualquer posição. [00367] Dessa forma, em um exemplo não limitante, essa invenção fornece o uso de mutagênese de saturação em combinação com processos de mutagenização adicionais, tal como um processo onde dois ou mais polinucleotídeos relacionados são introduzidos em uma célula hospedeira adequada tal que um polinucleotídeo híbrido seja gerado por recombinação e reagrupamento redutor.
[00368] Além de realizar mutagênese ao longo de toda a sequência de um gene, a presente invenção proporciona que a mutagênese possa ser usada para substituir cada uma de qualquer número de bases em uma sequência de polinucleotídeo, em que o número de bases a ser mutagenizado é preferivelmente todos os inteiros entre 15 a 100.000. Dessa forma, ao invés de mutagenizar cada posição ao longo da molécula, pode-se submeter cada ou um número pequeno de bases (preferivelmente um conjunto totalizando 15 a 100.000) à mutagêPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 192/525
187/510 nese. Preferivelmente, um nucleotídeo separado é usado para mutagenizar cada posição ou grupo de posições ao longo de uma sequência de polinucleotídeo. Um grupo de 3 posições a ser mutagenizado pode ser um códon. As mutações são introduzidas preferivelmente usando um iniciador mutagênico, contendo um cassete heterólogo, também referido como um cassete mutagênico. Cassetes exemplares podem ter de 1 a 500 bases. Cada posição de nucleotídeo em tais cassetes heterólogos pode ser N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/G/T, A/C/T, A/C/G, ou E, onde E é qualquer base exceto A, C, G, ou T (E pode ser referido como um oligoprojetado).
[00369] Em um sentido geral, mutagênese de saturação é compreendida por mutagenizar um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem preferivelmente cerca de 1 a 500 bases de extensão) em uma sequência de polinucleotídeo definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada tem preferivelmente cerca de 15 a 100.000 bases de extensão). Dessa forma, um grupo de mutações (variando de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a serem introduzidas em um cassete pode ser diferente ou pode ser o mesmo de um segundo agrupamento de mutações a serem introduzidas em um segundo cassete durante a aplicação de um ciclo de mutagênese de saturação. Tais agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons particulares e agrupamentos de cassetes de nucleotídeo particulares.
[00370] Sequências definidas a serem mutagenizadas incluem um gene inteiro, uma via, um cDNA, uma fase aberta de leitura (ORF) e um promotor inteiro, intensificador, repressor/transativador, origem de replicação, íntron, operador, ou qualquer grupo funcional de polinucleotídeo. Geralmente, “sequências definidas” para essa finalidade podem ser qualquer polinucleotídeo que é uma sequência de polinucleoPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 193/525
188/510 tídeo de 15 bases e sequências de polinucleotídeo de extensões entre 15 bases e 15.000 bases (essa invenção nomeia especificamente todos os inteiros entre essa faixa). Considerações na escolha dos agrupamentos de códons incluem tipos de aminoácidos codificados por um cassete mutagênico degenerado.
[00371] Em um exemplo de um agrupamento de mutações que podem ser introduzidas em um cassete mutagênico, essa invenção fornece especificamente substituições de códon degeneradas (usando oligos degenerados) que codificam 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 aminoácidos em cada posição em uma biblioteca de polipeptídeos codificada dessa forma.
Reagrupamento por ligação sintética (SLR) [00372] A invenção fornece um sistema de modificação gênica nãoestocástico chamado “reagrupamento por ligação sintética”, ou simplesmente “SLR”, um processo de “evolução dirigida”, para gerar polipeptídeos, por exemplo, xilanases e/ou glicanases, ou anticorpos da invenção, com propriedades novas ou alteradas.
[00373] SLR é um método de ligar fragmentos de oligonucleotídeo juntos não-estocasticamente. Esse método difere de embaralhamento de oligonucleotídeo estocástico em que os blocos de construção do ácido nucléico não são embaralhados, concatenados ou quimerizados aleatoriamente, mas ao invés disso, eles não reagrupados nãoestocasticamente. Veja por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.773.900; 6.740.506; 6.713.282; 6.635.449; 6.605.449; 6.537.776. Em um aspecto, SLR compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polinucleotídeo molde, em que o polinucleotídeo molde compreende uma sequência que codifica um gene homólogo; (b) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos de blocos de construção, em que os polinucleotídeos de blocos de construção são desenhados para reagrupar por ligação cruzada com o polinucleotídeo molde em uma sequência predePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 194/525
189/510 terminada, e um polinucleotídeo de bloco de construção compreende uma sequência que é uma variante do gene homólogo e uma sequência homóloga ao polinucleotídeo molde que flanqueia a sequência variante; (c) combinar um polinucleotídeo de bloco de construção com um polinucleotídeo do molde tal que o polinucleotídeo fundamental se reagrupe por ligação cruzada com o polinucleotídeo molde para gerar polinucleotídeos que compreendem variações da sequência do gene homólogo.
[00374] SLR não depende da presença de altos níveis de homologia entre os polinucleotídeos sendo rearranjados. Dessa forma, esse método pode ser usado par gerar não-estocasticamente bibliotecas (ou conjuntos) de moléculas de progênie compreendidas de mais de 10100 quimeras diferentes. SLR pode ser usada para gerar bibliotecas compreendidas de mais do que 101000 quimeras de progênie diferentes. Dessa forma, aspectos da presente invenção incluem métodos não-estocásticos de produzir um conjunto de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas que partilham uma ordem reagrupada geral que é escolhida intencionalmente. Esse método inclui as etapas de gerar intencionalmente uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico específicos que tem extremidades ligáveis mutuamente compatíveis úteis, e reagrupar esses blocos de construção de ácido nucléico, tal que uma ordem de reagrupamento geral projetada seja obtida.
[00375] As extremidades ligáveis mutuamente compatíveis dos blocos de construção de ácidos nucléicos sendo agrupados são consideradas “úteis” para esse tipo de agrupamento ordenado se elas permitirem que os blocos de construção sejam acoplados em ordens predeterminadas. Dessa forma, a ordem de agrupamento geral na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados é especificada pelo desenho das extremidades ligáveis. Se mais de uma etaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 195/525
190/510 pa de agrupamento for usada, então a ordem de agrupamento geral na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados também será especificada pela ordem seqüencial da(s) etapa(s) de agrupamento. Em um aspecto, as peças de construção aneladas são tratadas com uma enzima, tal como uma ligase (por exemplo, T4 DNA ligase), para se obter a ligação covalente das peças de construção. [00376] Em um aspecto, o desenho dos blocos de construção de oligonucleotídeo é obtido por analisar um conjunto de moldes de seqüencias de ácido nucléico progenitoras que servem como uma base para produzir um conjunto de progênie de polinucleotídeos quiméricos finalizados. Esses moldes de oligonucleotídeos precursores servem então como uma fonte de informação de sequência que auxilia no desenho dos blocos de construção de ácido nucléico que serão mutagenenizados, por exemplo, quimerizados ou embaralhados. Em um aspecto deste método, as sequências de vários moldes de ácidos nucléicos precursores são alinhadas a fim de selecionar um ou mais pontos de demarcação. Os pontos de demarcação podem estar localizados em uma área de homologia, e são compreendidos de um ou mais nucleotídeos. Esses pontos de demarcação são preferivelmente compartilhados por pelo menos dois dos moldes progenitores. Os pontos de demarcação podem então ser usados para delinear os limites de blocos de construção de oligonucleotídeos a ser gerados a fim de rearranjar os polinucleotídeos precursores. Os pontos de demarcação identificados e selecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimerização potenciais no agrupamento das moléculas de progênie quiméricas finais. Um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia (compreendida de pelo menos uma base de nucleotídeo homóloga) compartilhada por pelo menos duas sequências de polinucleotídeo precursores. Alternativamente, um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo
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191/510 menos metade das sequências de polinucleotídeo precursor, ou ela pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos dois terços das sequências de polinucleotídeo precursor. Ainda mais preferivelmente, um ponto de demarcação útil é uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos três quartos das sequências de polinucleotídeo precursor, ou ela pode ser compartilhada por quase todas as sequências de polinucleotídeo precursor. Em um aspecto, um ponto de demarcação é uma área de homologia que é compartilhada por todas as sequências de polinucleotídeo precursor.
[00377] Em um aspecto, um processo de reagrupamento por ligação é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca completa de polinucleotídeos quiméricos de progênie. Em outras palavras, todas as combinações ordenadas possíveis dos blocos de construção de ácido nucléico são representadas no conjunto de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas. Ao mesmo tempo, em outro aspecto, a ordem de agrupamento (isto é, a ordem de agrupamento de cada bloco de construção na sequência de 5' para 3' de cada ácido nucléico quimérico finalizado) em cada combinação é intencional (ou nãoestocástica) como descrito acima. Devido à natureza não-estocástica dessa invenção, a possibilidade de produtos secundários indesejados é grandemente reduzida.
[00378] Em outro aspecto, o método de reagrupamento por ligação é realizado sistematicamente. Por exemplo, o método é realizado a fim de gerar uma biblioteca sistematicamente compartimentalizada de moléculas de progênie, com compartimentos que podem ser rastreados sistematicamente, por exemplo, um a um. Em outras palavras, essa invenção proporciona que, através do uso seletivo e criterioso de blocos de construção de ácido nucléico específicos, acoplado com o uso seletivo e criterioso de reações de agrupamento seqüencialmente gradativas, pode ser obtido uma estrutura onde conjuntos específicos de
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192/510 produtos de progênie são feitos em cada um dos vários frascos de reação. Isso permite que um procedimento de exame e rastreamento sistemático seja realizado. Dessa forma, esses métodos permitem que um número potencialmente muito grande de moléculas de progênie seja examinado sistematicamente em grupos menores. Devido à sua habilidade de realizar quimerizações de uma maneira que é altamente flexível ainda que exaustiva e sistemática, particularmente quando há um nível baixo de homologia entre as moléculas progenitoras, esses métodos fornecem a geração de uma biblioteca (ou conjunto) compreendida de um grande número de moléculas de progênie. Devido à natureza não-estocástica da presente invenção de reagrupamento por ligação, as moléculas de progênie geradas compreendem preferivelmente uma biblioteca de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas que apresentam uma ordem de agrupamento geral que é escolhida intencionalmente. Os métodos de mutagênese por saturação evolução dirigida otimizada também podem ser usados para gerar diferentes espécies moleculares de progênie. É observado que a invenção fornece liberdade de escolha e controle com relação à seleção de pontos de demarcação, tamanho e número dos blocos de construção de ácido nucléico, e do tamanho e desenho dos acoplamentos. É observado, ainda, que a necessidade por homologia intermolecular é altamente diminuída para a operabilidade dessa invenção. De fato, pontos de demarcação podem ainda ser escolhidos em áreas de pouca ou nenhuma homologia intermolecular. Por exemplo, devido à oscilação de códons, isto é, a degeneração de códons, substituições de nucleotídeo podem ser introduzidas nos blocos de construção de ácidos nucléicos sem alterar o aminoácido originalmente codificado no molde progenitor correspondente. Alternativamente, um códon pode ser alterado tal que a codificação para um aminoácido original seja alterada. Essa invenção proporciona que tais substituições possam ser introduPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 198/525
193/510 zidas no bloco de construção de ácido nucléico a fim de aumentar a incidência de pontos de demarcação homólogos intermoleculares e assim permitir que um número de acoplamentos aumentado seja obtido entre os blocos de construção, que por sua vez, permite que um maior número de moléculas de progênie seja gerado.
Reagrupamento sintético de gene [00379] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método não-estocástico chamado reagrupamento sintético de gene (por exemplo, GeneReassembly, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.537.776), que difere do embaralhamento estocástico em que os blocos de construção de ácido nucléico não são embaralhados ou concatenados ou quimerizados aleatoriamente, mas não invés disso, são agrupados não-estocasticamente.
[00380] O método de reagrupamento sintético de gene não depende da presença de um alto nível de homologia entre os polinucleotídeos a ser embaralhados. A invenção pode ser usada para gerar nãoestocasticamente bibliotecas (ou conjuntos) de moléculas de progênie compreendidas de mais de 101000 quimeras de progênie diferentes. De forma concebível, o reagrupamento de gene sintético pode ainda ser usado para gerar bibliotecas compreendidas de mais do que 101000 quimeras de progênie diferentes.
[00381] Dessa forma, em um aspecto a invenção fornece um método não estocástico de produzir um conjunto de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas que apresentam uma ordem de agrupamento geral que é escolhida intencionalmente, cujo método é compreendido das etapas de gerar intencionalmente uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico específicos que apresentam extremidades ligáveis mutuamente compatíveis úteis e agrupar esses blocos de construção de ácidos nucléicos, tal que uma ordem de agrupamento geral planejada seja obtida.
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194/510 [00382] Em um aspecto, reagrupamento de gene sintético compreende um método e: 1) preparar uma geração de progênie de molécula(s) (incluindo uma molécula que compreende uma sequência de polinucleotídeo, por exemplo, uma molécula que compreende uma sequência codificante de polipeptídeo), que é mutagenizada para se obter pelo menos uma mutação pontual, adição, deleção e/ou quimerização, a partir de um ou mais molde(s) de geração ancestral ou precursor; 2) rastrear a(s) molécula(s) da geração de progênie, por exemplo, usando um método de alta produtividade, por pelo menos uma propriedade de interesse (tal como uma melhora na atividade enzimática); 3) em um aspecto, obter e/ou catalogar informação estrutural e/ou funcional com relação às moléculas da geração de progênie e 4) em um aspecto, repetir qualquer uma das etapas 1) a 3). Em um aspecto, é gerada (por exemplo, de um molde de polinucleotídeo precursor), no que é chamado “mutagênese por saturação do sítio do códon”, uma geração de progênie de polinucleotídeos, cada uma tendo pelo menos um conjunto de até três mutações pontuais contíguas (isto é, bases diferentes compreendendo um novo códon), tal que todos os códons (ou todas as famílias de códons degenerados que codificam o mesmo aminoácido) estejam representados em cada posição de códon. Correspondendo a, e codificada por essa geração de progênie de polinucleotídeos, também é gerado um conjunto de polipeptídeos, cada um tendo pelo menos uma única mutação de aminoácido pontual. Em um aspecto, é gerada, em que é chamado “mutagênese por saturação do sítio do aminoácido”, um mutante de polipeptídeo para cada uma das 19 substituições de alfa-aminoácido formadoras de polipeptídeo codificadas naturalmente em cada e todas as posições de aminoácido ao longo do polipeptídeo. Isso gera, para cada e toda posição de aminoácido ao longo do polipeptídeo precursor, um total de 20 polipeptídeos de progênie distintos incluindo o aminoácido original, ou potencialmenPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 200/525
195/510 te mais do que 21 polipeptídeos de progênie distintos se aminoácidos adicionais forem usados ao invés, ou além, dos 20 aminoácidos codificados naturalmente.
[00383] Dessa forma, em outro aspecto, essa abordagem também é útil para gerar mutantes contendo, além de e/ou em combinação com os 20 alfa-aminoácidos formadores de polipeptídeo codificados naturalmente, outros aminoácidos e derivados de aminoácidos raros e/ou não codificados naturalmente. Em outro aspecto ainda, essa abordagem também é útil para gerar mutantes pelo uso de, ou em adição a e/ou em combinação com sistemas de reconhecimento de códon natural ou inalterado de hospedeiros adequados, sistemas de reconhecimento de códons alterados, mutagenizados e/ou planejados (tal como em uma célula hospedeira com uma ou mais moléculas de tRNA alteradas).
[00384] Em outro aspecto ainda, essa invenção se refere à recombinação e mais especificamente a um método para preparar polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo por um método de rearranjo de sequências de polinucleotídeo contendo regiões de homologia parcial, agrupando os polinucleotídeos para formar pelo menos um polinucleotídeo e rastrear os polinucleotídeos quanto à produção de polipeptídeo(s) que apresentam uma propriedade útil.
[00385] Em outro aspecto ainda, esse invenção é útil para analisar e catalogar, com relação a qualquer propriedade molecular (por exemplo, uma atividade enzimática) ou combinação de propriedades permitidas pela tecnologia atual, os efeitos de qualquer alteração mutacional obtida (incluindo particularmente mutagênese por saturação). Dessa forma, um método abrangente é fornecido para determinar o efeito de altera cada aminoácido em um polipeptídeo precursor em cada um de pelo menos 19 possíveis substituições. Isso permite que cada aminoácido em um polipeptídeo precursor seja caracterizado e catalogado de
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196/510 acordo com seu espectro de potenciais efeitos sobre uma propriedade mensurável do polipeptídeo.
[00386] Em um aspecto, um íntron pode ser introduzido em uma molécula de progênie quimérica através de um bloco de construção de ácido nucléico. Íntrons freqüentemente apresentam sequências consenso em ambas as terminações a fim de torná-los operacionais. Além de permitir o splicing de genes, os íntron podem servir para um propósito adicional por fornecer sítios de homologia a outros ácidos nucléicos para permitir recombinação homóloga. Para essa finalidade, e potencialmente outras, pode ser algumas vezes desejável gerar um grande bloco de construção de ácido nucléico para introduzir um íntron. Se o tamanho for excessivamente grande não sendo gerado facilmente por síntese química direta de dois oligos de fita única, tal bloco de construção de ácido nucléico especializado também pode ser gerado por síntese direta de mais do que dois oligos de fita única ou pelo uso de uma reação de amplificação baseada em polimerase. [00387] As extremidades ligáveis mutuamente compatíveis dos blocos de construção de ácido nucléico a ser agrupados são consideradas “úteis” para esse tipo de agrupamento ordenado se elas permitirem que os blocos de construção sejam acoplados em ordens predeterminadas. Dessa forma, em um aspecto, a ordem de agrupamento geral na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados é especificada pelo desenho das extremidades ligáveis e, se mais do que uma etapa de agrupamento for usada, então a ordem de agrupamento geral na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados também será especificada pela ordem seqüencial das etapas de agrupamento. Em um aspecto da invenção, as peças de construção aneladas são tratadas com uma enzima, tal como uma ligase (por exemplo, T4 DNA ligase) para se obter a ligação covalente das peças de construção.
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197/510 [00388] O acoplamento pode ocorrer de uma forma que não faz uso de todos os nucleotídeos em uma projeção participante. O acoplamento particularmente terá probabilidade de se manter (por exemplo, em um hospedeiro transformado) se o acoplamento for reforçado pelo tratamento com uma enzima ligase para formar o que pode ser referido como uma “ligação de intervalos” ou uma “ligação intervalada”. Esse tipo de acoplamento pode contribuir para a geração de produto(s) inespecíficos indesejados, mas ele também pode ser usado vantajosamente para aumentar a diversidade da biblioteca de progênie gerada pelo reagrupamento de ligação projetada. Certas projeções são capazes de sofrer auto-acoplamento para formar um acoplamento palindrômico. Um acoplamento é substancialmente fortalecido se ele for reforçado pelo tratamento com uma enzima ligase. A falta de fosfatos 5' nessas projeções pode ser usada vantajosamente para evitar esse tipo auto-ligação palindrômica. Conseqüentemente, essa invenção proporciona que estes blocos de construção de ácido nucléico possam ser feitos quimicamente (ou ordenados) sem um grupo fosfato 5'. Alternativamente, eles podem ser removidos, por exemplo, por tratamento com uma enzima fosfatase, tal como uma fosfatase alcalina intestinal de bovino (CIAP), a fim de evitar autoligações palindrômicas em processos de reagrupamento por ligação.
[00389] Em outro aspecto, o desenho de blocos de construção de ácidos nucléicos é obtido pode análise das sequências de um conjunto de moldes de ácido nucléico progenitores que servem como uma base para produzir um conjunto de progênie de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas. Esses moldes de ácido nucléico progenitores servem então como a fonte de informação da sequência que auxilia no desenho dos blocos de construção de ácido nucléico que devem ser mutagenizados, isto é, quimerizados ou embaralhados.
[00390] Em um exemplo, a invenção fornece a quimerização de
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198/510 uma família de genes relacionados e sua família codificada de produtos relacionados. Em um exemplo particular, os produtos codificados são enzimas. As xilanases e/ou glicanases da presente invenção podem ser mutagenizadas de acordo com os métodos descritos aqui. [00391] Dessa forma, de acordo com um aspecto da invenção, as sequências de vários moldes de ácido nucléico progenitores (por exemplo, polinucleotídeos da invenção) são alinhadas a fim de selecionar um ou mais pontos de demarcação, cujos pontos de demarcação podem estar localizados em uma área de homologia. Os pontos de demarcação podem ser usados para delinear os limites dos blocos de construção de ácido nucléico a ser gerados. Dessa forma, os pontos de demarcação identificados e selecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimerização potenciais no agrupamento de moléculas de progênie.
[00392] Tipicamente, um ponto de demarcação útil está em uma área de homologia (compreendida de pelo menos uma base de nucleotídeo homóloga) partilhada por pelo menos dois moldes de progenitores, mas o ponto de demarcação pode estar em uma área de homologia que é partilhada por pelo menos metade dos moldes progenitores, pelo menos dois terços dos moldes progenitores, pelo menos três quartos dos moldes progenitores e preferivelmente quase todos os moldes progenitores. Ainda mais preferivelmente, um ponto de demarcação ainda útil é uma área de homologia que é partilhada por todos os moldes progenitores.
[00393] Em um aspecto, o processo de reagrupamento de gene é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca completa. Em outras palavras, todas as combinações ordenadas possíveis dos blocos de construção de ácido nucléico são representadas no conjunto de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas. Ao mesmo tempo, a ordem de agrupamento (isto é, a ordem de agrupamento de cada
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199/510 bloco de construção na sequência de 5' para 3' de cada ácido nucléico quimérico finalizado) em cada combinação é intencional (ou nãoestocástica). Devido à natureza não-estocástica do método, a possibilidade de produtos secundários indesejados é grandemente reduzida. [00394] Em outro aspecto, o método proporciona que o processo de reagrupamento de gene seja realizado sistematicamente, por exemplo, para gerar uma biblioteca sistematicamente compartimentalizada, com compartimentos que podem ser rastreados sistematicamente, por exemplo, um a um. Em outras palavras, essa invenção proporciona que, através do uso seletivo e criterioso de blocos de construção de ácido nucléico específicos, acoplado com o uso seletivo e criterioso de reações de agrupamento seqüencialmente gradativas, pode ser obtida uma estrutura onde conjuntos específicos de produtos de progênie são feitos em cada um dos vários frascos de reação. Isso permite que um procedimento de exame e rastreamento sistemático seja realizado. Dessa forma, isso permite que um número potencialmente muito grande de moléculas de progênie seja examinado sistematicamente em grupos menores.
[00395] Devido à sua habilidade de realizar quimerizações de uma maneira que é altamente flexível ainda que exaustiva e sistemática, particularmente quando há um nível baixo de homologia entre as moléculas progenitoras, a presente invenção fornece a geração de uma biblioteca (ou conjunto) compreendida de um grande número de moléculas de progênie. Devido à natureza não-estocástica da presente invenção de reagrupamento de gene, as moléculas de progênie geradas compreendem preferivelmente uma biblioteca de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas que apresentam uma ordem de agrupamento geral que é escolhida intencionalmente. Em um aspecto particular, tal biblioteca gerada é compreendida de mais do que 103 a mais do que 101000 espécies moleculares de progênie diferentes.
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200/510 [00396] Em um aspecto, um conjunto de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas, produzido como descrito, é compreendido de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. De acordo com um aspecto, esse polinucleotídeo é um gene, que pode ser um gene feito pelo homem. De acordo com um aspecto esse polinucleotídeo é um gene, que pode ser um gene feito pelo homem. De acordo com outro aspecto, esse polinucleotídeo é uma via gênica, que pode ser uma via gênica feita pelo homem. Essa invenção proporciona que um ou mais genes feitos pelo homem gerados pela invenção possam ser incorporados em uma via gênica feita pelo homem, tal como uma via operável em um organismo eucariótico (incluindo uma planta).
[00397] Em outro exemplo, a natureza sintética da etapa na qual os blocos de construção são gerados permite o desenho e introdução de nucleotídeos (por exemplo, um ou mais nucleotídeos, que podem ser, por exemplo, códons ou íntrons ou sequências regulatórias) que mais tarde podem, em um aspecto, ser removidas em um processo in vitro (por exemplo, por mutagênese) ou em um processo in vivo (por exemplo, pela utilização da habilidade de splicing e gene de um organismo hospedeiro). É observado que em muitos casos a introdução desses nucletideos também pode ser desejável por muitas outras razões além do beneficio potencial de criar um ponto de demarcação útil.
[00398] Dessa forma, de acordo com outro aspecto, a invenção proporciona que um bloco de construção de ácido nucléico possa ser usado para introduzir íntrons. Dessa forma, a invenção proporciona que íntrons funcionais possam ser introduzidos em um gene feito pelo homem da invenção. A invenção também proporciona que íntrons funcionais possam ser introduzidos em uma via gênica feita pelo homem. Conseqüentemente, a invenção fornece a geração de um polinucleotídeo quimérico que é um gene feito pelo homem que contém um (ou mais) íntrons introduzidos artificialmente.
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201/510 [00399] Conseqüentemente, a invenção também fornece a geração de um polinucleotídeo quimérico que é uma via gênica feita pelo homem que contém um (ou mais) íntrons introduzidos artificialmente. Preferivelmente, o(s) íntron(s) introduzido(s) artificialmente (é)são funcional(is) em uma ou mais células hospedeiras para splicing de gene, a título de que íntrons que ocorrem naturalmente servem funcionalmente no splicing de genes. A invenção fornece um processo de produzir polinucleotídeos contendo íntrons feitos pelo homem para serem introduzidos em organismos hospedeiros para recombinação e/ou splicing.
[00400] Um gene feito pelo homem produzido usando a invenção também pode servir como um substrato para recombinação com outro ácido nucléico. Da mesma forma, uma via de gene feito pelo homem produzida usando a invenção também pode servir como um substrato para recombinação com outro ácido nucléico. Em um aspecto, a recombinação é facilitada por, ou ocorre em áreas de homologia entre o gene contendo íntron, feito pelo homem e um ácido nucléico, que serve como um parceiro de recombinação. Em um aspecto, o parceiro de recombinação também pode ser um ácido nucléico gerado pela invenção, incluindo um gene feito pelo homem, ou via e gene feito pelo homem. A recombinação pode ser facilitada por, ou pode ocorrer em áreas de homologia que existem em um (ou mais) íntron introduzido artificialmente no gene feito pelo homen.
[00401] O método de reagrupamento sintético de gene da invenção utiliza uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico, cada um dos quais tem preferivelmente duas extremidades ligáveis. As duas extremidades ligáveis em cada bloco de construção de ácido nucléico podem ser duas extremidades cegas (isto é, cada uma tendo uma projeção de zero nucleotídeo) ou, preferivelmente, uma extremidade cega e uma projeção ou mais preferivelmente ainda duas projePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 207/525
202/510 ções.
[00402] Uma projeção útil para essa finalidade pode ser uma projeção 3' ou uma projeção 5'. Dessa forma, um bloco de construção de ácido nucléico pode ter uma projeção 3' ou alternativamente uma projeção 5' ou alternativamente duas projeções 3' ou alternativamente duas projeções 5'. A ordem geral na qual os blocos de construção de ácido nucléico são agrupados para formar uma molécula de ácido nucléico quimérica finalizada é determinada por desenho experimental proposto e não é aleatório.
[00403] Em um aspecto, um bloco de construção de ácido nucléico é gerado pela síntese química de dois ácidos nucléicos de fita única (também referidos como oligos de fita única) e colocá-los em contato para permitir que anelem para formar um bloco de construção de ácido nucléico de fita dupla.
[00404] Um bloco de ácido nucléico de fita dupla pode ser de tamanho variável. Os tamanhos desses blocos de construção podem ser pequenos ou grandes. Tamanhos exemplares para blocos de construção variam de 1 par de base (não incluindo nenhuma projeção) a 100.000 pares de base (não incluindo nenhuma projeção). Outras variações exemplares que tem limites inferiores de 1 pb a 10.000 pb (incluindo todos os valos inteiros na intermediários) e limites superiores de 2 pb a 100.000 pb (incluindo todos os valores inteiros intermediários).
[00405] Existem vários métodos úteis para a invenção pelos quais um bloco de construção de ácido nucléico de fita dupla pode ser gerado; e esses são conhecidos na técnica e podem ser facilmente executados pelo versado na técnica.
[00406] De acordo com um aspecto, um bloco de construção de ácido nucléico de fita dupla é gerado por primeiro gerar dois ácidos nucléicos de fita única e permitir que eles anelem para formar um bloPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 208/525
203/510 co de construção de ácido nucléico de fita dupla. As duas fitas de um bloco de construção de ácido nucléico de fita dupla podem ser complementares em todos os nucleotídeos com exceção de qualquer um que forme a projeção; dessa forma, não contendo nenhum malpareamento exceto nas projeções. De acordo com outro aspecto, as duas fitas de um bloco de construção de ácido nucléico de fita dupla são complementares em menos do que todos os nucleotídeos exceto de qualquer um que forme a projeção. Dessa forma, de acordo com esse aspecto, um bloco de construção de ácido nucléico de fita dupla pode ser usado para introduzir degeneração de códon. A degeneração de códon descrita aqui, usando um ou mais cassetes de N,N,G/T ou alternativamente usando um ou mais cassetes de N,N,N.
[00407] O método de recombinação in vivo da invenção pode ser de forma cega em um conjunto de híbridos desconhecidos ou alelos de um polinucleotídeo ou sequência desconhecidas. Entretanto, não é necessário conhecer a sequência de DNA ou RNA real do polinucleotídeo específico.
[00408] A abordagem de usar recombinação dentro de uma população mista de genes pode ser útil para a geração de proteínas úteis, por exemplo, interleucina I, anticorpos, tPA e hormônio do crescimento. Essa abordagem pode ser usada para gerar proteínas que apresentam especificidade ou atividade alterada. A abordagem também pode ser útil para a geração de sequências de ácido nucléico híbridas, por exemplo, regiões promotoras, íntrons, éxons, sequências intensificadoras, 31 regiões não traduzidas ou 51 regiões não traduzidas de genes. Dessa forma, essa abordagem pode ser usada para gerar genes que apresentam taxas de expressão aumentadas. Essa abordagem também pode ser útil no estudo de sequências de DNA repetitivas. Finalmente, essa abordagem pode ser útil para mutar ribozimas ou aptâmeros.
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204/510 [00409] Em um aspecto a invenção descrita aqui é direcionada ao uso de ciclos repetidos de rearranjo redutor, recombinação e seleção que permitem a evolução moléculas dirigida de sequências lineares complexas, tais como DNA, RNA ou proteínas através de recombinação.
Sistema de Evolução Dirigida Otimizada [00410] A invenção fornece um sistema não-estocástico de modificação de gene chamado “sistema de evolução dirigida otimizada” para gerar polipeptídeos, por exemplo, xilanases e/ou glicanases, ou anticorpos da invenção, com propriedades novas ou alteradas. Evolução dirigida otimizada é direcionada ao uso de ciclos repetidos de rearranjo redutor, recombinação e seleção que permitem a evolução molecular dirigida de ácidos nucléicos através de recombinação. A evolução dirigida otimizada permite a geração de uma grande população de sequências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significativamente enriquecida com sequências que tem um número predeterminado de eventos de cruzamento.
[00411] Um evento de cruzamento é um ponto em uma sequência quimérica onde ocorre uma alteração na sequência de uma variante precursora para outra variante precursora. Tal ponto é normalmente a junção de onde os oligonucleotídeos de dois parentes são ligados juntos para formar uma única sequência. Esse método permite o cálculo das concentrações corretas de sequências de oligonucleotídeos para que a população quimérica final de sequências seja enriquecida para o número escolhido de eventos de cruzamento. Isso fornece mais controle sobre a escolha de variantes quiméricas que apresentam um número predeterminado de eventos de cruzamento.
[00412] Além disso, o método fornece um meio conveniente para explorar uma grande quantidade do possível espaço da variante de proteína em comparação com outros sistemas. Anteriormente, se fosPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 210/525
205/510 se gerado, por exemplo, 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, seria extremamente difícil testar tal alto número de variantes quiméricas para uma atividade particular. Além disso, uma porção significativa da população de progênie teria um número muito alto de eventos de cruzamento que resultaria em proteínas que seriam menos prováveis de ter níveis aumentados de uma atividade particular. Dessa forma, embora ainda seja possível gerar 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, cada uma das moléculas escolhidas para análise posterior, terá provavelmente, por exemplo, apenas três eventos de cruzamento. Devido ào fato de que a população de progênie resultante pode ser distorcida para ter um número predeterminado de eventos de cruzamento, os limites na variedade funcional entre as moléculas quiméricas são reduzidos. Isso fornece um número mais controlável de variáveis quando se calcula qual oligonucleotídeo dos polinucleotídeos precursores originais pode ter sido o responsável por afetar uma característica particular.
[00413] Um método para criar uma sequência de polinucleotídeo de progênie quimérica é criar oligonucleotídeos que correspondem a fragmentos ou porções de cada sequência precursora. Cada oligonucleotídeo inclui preferivelmente uma única região de superposição para que a mistura dos oligonucleotídeos resulte em uma nova variante que tem cada um dos fragmentos de oligonucleotídeo agrupados na ordem correta. Informação adicional pode ser encontrada, por exemplo, em USSN 09/332.835; Patente U.S. N° 6.361.974.
[00414] O número de nucleotídeos gerados para cada variante precursora tem uma relação com o número total de cruzamentos resultantes na molécula quimérica que é criada no final. Por exemplo, três variantes de sequência de nucleotídeo precursor podem ser fornecidas para sofrer uma reação de ligação a fim de encontrar uma variante quimérica que tem, por exemplo, maior atividade em alta temperatura.
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Como um exemplo, um conjunto de 50 sequências de oligonucleotídeo pode ser gerado correspondendo a cada porção de cada variante precursora. Conseqüentemente, durante o processo de reagrupamento por ligação poderia haver até 50 eventos de cruzamento dentro de cada uma das sequências quiméricas. A probabilidade de cada um dos polinucleotídeos quiméricos gerados conter oligonucleotídeos de cada variante precursora em ordem alternada é muito alta. Se cada fragmento de oligonucleotídeo estiver presente na reação de ligação na mesma quantidade molar, é provável que em algumas posições oligonucleotídeos do mesmo polinucleotídeo precursor se liguem próximo ao outro e assim isso não resulte em um evento de cruzamento. Se a concentração de cada oligonucleotídeo de cada precursor for mantida constante durante qualquer etapa de ligação nesse exemplo, há 1/3 de chance (considerando 3 precursores) de que um oligonucleotídeo da mesma variante precursora se ligue dentro da sequência quimérica e não produza cruzamento.
[00415] Conseqüentemente, uma função de densidade de probabilidade (PDF) pode ser determinada para prever a população de eventos de cruzamento que são prováveis de ocorrer durante cada etapa em uma reação de ligação dado um número estabelecido de variantes precursoras, um número de oligonucleotídeos que correspondem a cada variante, e as concentrações de cada variante durante cada etapa na reação de ligação. Os cálculos estatísticos e matemáticos por trás da determinação da PDF são descritas abaixo. Por utilizar esses métodos, pode-se calcular tal função de densidade de probabilidade, e assim enriquecer a população de progênie quimérica para um número predeterminado de eventos de cruzamento que resultam de uma reação de ligação em particular. Além disso, um número alvo de eventos de cruzamento pode ser predeterminado, e o sistema então programado para calcular as quantidades iniciais de cada oligonucleotídeo
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207/510 precursor durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probabilidade que se concentra no número predeterminado de eventos de cruzamento. Esses métodos são direcionados para o uso de ciclos repetidos de rearranjo redutor, recombinação e seleção que permitem a evolução molecular dirigida de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo através de recombinação. Esse sistema permite a geração de uma grande população sequências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significativamente enriquecida para sequências que apresentam um número predeterminado de eventos de cruzamento. Um evento de cruzamento é um ponto em uma sequência quimérica onde ocorre uma alteração na sequência de uma variante precursora para outra variante precursora. Tal ponto é normalmente a junção de onde os oligonucleotídeos de duas sequências precursoras são ligados para formar uma única sequência. O método permite o cálculo das concentrações corretas de sequências de oligonucleotídeo para que a população quimérica final de sequências seja enriquecida para o número escolhido de eventos de cruzamento. Isso fornece mais controle sobre a escolha de variantes quiméricas que tem um número predeterminado de eventos de cruzamento.
[00416] Além disso, esses métodos fornecem um meio conveniente para explorar uma grande quantidade do possível espaço da variante proteína em comparação a outros sistemas. Pelo uso dos métodos descritos aqui, a população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida com aquelas variantes que apresentam um número particular de eventos de cruzamento. Dessa forma, embora ainda seja possível gerar 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, cada uma das moléculas escolhida para análise posterior, terá provavelmente, por exemplo, apenas três eventos de cruzamento. Devido ào fato de que a população de progênie resultante pode ser distorcida para ter um núPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 213/525
208/510 mero predeterminado de eventos de cruzamento, os limites na variedade funcional entre as moléculas quiméricas são reduzidos. Isso fornece um número mais controlável de variáveis quando se calcula que oligonucleotídeo dos polinucleotídeos precursores originais pode ter sido responsável por afetar uma característica particular.
[00417] Em um aspecto, o método cria uma sequência de polinucleotídeo de progênie quimérica por criar oligonucleotídeos que correspondem a fragmentos ou porções de cada sequência precursora. Cada oligonucleotídeo inclui preferivelmente uma única região de superposição para que a mistura dos oligonucleotídeos resulte em uma nova variante que tem cada fragmento de oligonucleotídeo reunido na ordem correta. Veja também USSN 09/332.835.
Determinando eventos de cruzamento [00418] Aspectos de invenção incluem um sistema e um programa que recebem uma função de densidade de probabilidade de cruzamento (PDF), e o número de genes precursores a serem rearranjados, e o número de fragmentos no rearranjo como dados de entrada. O dado de saída desse programa é uma “PDF de fragmento” que pode ser usada para determinar uma fórmula para produzir genes rearranjados, e a PDF de cruzamento estimada desses genes. O processamento descrito aqui é preferivelmente realizado em MATLAB® (The Mathworks, Natick, Massachusetts) uma linguagem de programação e ambiente de desenvolvimento para computação técnica.
Processos iterativos [00419] Na prática da invenção, esses processos podem ser repetidos iterativamente. Por exemplo, um ácido nucléico (ou, o ácido nucléico) responsável por um fenótipo de xilanase, mananase e/ou glicanase alterado ou novo é identificado, reisolado, modificado novamente, retestado quanto à atividade. Esse processo pode ser repetido iterativamente até que um fenótipo desejado seja manipulado. Por exemplo,
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209/510 toda a via bioquímica anabólica ou catabólica pode ser manipulada em uma célula, incluindo, por exemplo, uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase.
[00420] Similarmente, se for determinado que um oligonucleotídeo particular não tem nenhum efeito sobre a característica desejada (por exemplo, um novo fenótipo de xilanase, mananase e/ou glicanase), ele pode ser removido como uma variável por sintetizar oligonucleotídeos precursores maiores que incluem a sequência a ser removida. Já que a incorporação da sequência dentro de uma sequência maior evita qualquer evento de cruzamento, não haverá mais nenhuma variação dessa sequência nos polinucleotídeos de progênie. Essa prática iterativa de determinar quais oligonucleotídeos são os mais relacionados com a característica desejada, e quais não são relacionados, permite uma exploração mais eficaz de todas as variantes de proteína possíveis que podem ser fornecidas com uma característica ou atividade particular.
Embaralhamento in vivo [00421] O embaralhamento in vivo de moléculas é usado em métodos da invenção que fornecem variantes de polipeptídeo da invenção, por exemplo, anticorpos, xilanases e semelhantes. Embaralhamento in vivo pode ser realizado utilizando a propriedade natural de células de recombinar multímeros. Embora a recombinação in vivo tenha fornecido o principal caminho natural para a diversidade molecular, a recombinação genética permanece um processo relativamente complexo que envolve 1) o reconhecimento de homologias; 2) clivagem da fita, invasão da fita, e etapas metabólicas que levam à produção de quiasma recombinante; e finalmente 3) a separação do quiasma em moléculas recombinadas distintas. A formação de quiasma requer o reconhecimento de sequências homólogas.
[00422] Em outro aspecto, a invenção inclui um método para produPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 215/525
210/510 zir um polinucleotídeo híbrido a partir de pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo. A invenção pode ser usada para produzir um polinucleotídeo híbrido por introduzir pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo que compartilha pelo menos uma região de homologia de sequência parcial em uma célula hospedeira adequada. As regiões de homologia parcial de sequência promovem processos que resultam em reorganização da sequência produzindo um polinucleotídeo híbrido. O termo “polinucleotídeo híbrido”, como usado aqui, é qualquer sequência de nucleotídeo híbrida que resulta do método da presente invenção e que contém sequências de pelo menos duas sequências de polinucleotídeo originais. Tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de eventos de recombinação intermolecular que promovem integração de sequência entre moléculas de DNA. Além disso, tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de processos de rearranjo redutor intramolecular que utilizam sequências repetidas para alterar uma sequência de nucleotídeo dentro de uma molécula de DNA.
[00423] O rearranjo in vivo é focado em processos “intermoleculares” coletivamente referidos como “recombinação” que, em bactérias, é geralmente visto como um fenômeno “dependente de RecA”. A invenção pode contar com processos de recombinação de uma célula hospedeira para recombinar e rearranjar sequências, ou a capacidade das células de mediar processos redutores para diminuir a complexidade de sequências quase-repetidas na célula por deleção. Esse processo de “rearranjo redutor” ocorre por um processo “intramoleculare” independentes de RecA.
[00424] Portanto em outro aspecto da invenção, novos polinucleotídeos podem ser gerados pelo processo de rearranjo redutor. O método envolve a geração de construtos contendo sequências consecutivas (sequências codificantes originais), sua inserção em um vetor
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211/510 apropriado e sua subseqüente introdução em uma célula hospedeira apropriada. O rearranjo das identidades moleculares individuais ocorre pode processos combinatórios entre as sequências consecutivas no construto que possuem regiões de homologia, ou entre unidades quase-repetidas. O processo de rearranjo recombina e/ou reduz a complexidade e extensão das sequências repetidas e resulta na produção de novas espécies moleculares. Vários tratamentos podem ser aplicados para aumentar a taxa de rearranjo. Eles podem incluir tratamento com luz ultravioleta, ou químicos que danificam o DNA e/ou o uso de linhagens celulares hospedeiras que apresentam níveis aumentados de “instabilidade genética”. Dessa forma o processo de rearranjo pode envolver a recombinação homóloga ou a propriedade natural de sequências quase-repetidas direcionarem sua própria evolução.
[00425] Sequências repetidas ou “quase-repetidas” desempenham um papel na instabilidade genética. Na presente invenção, “quaserepetições” são repetições que não são restritas a sua unidade estrutural original. Unidades quase-repetidas podem ser apresentadas como um arranjo de sequências em um construto; unidades consecutivas de sequências similares. Uma vez ligadas, as junções entre as sequências consecutivas se torna essencialmente invisível ao nível molecular. O processo de deleção que a célula realiza para reduzir a complexidade do construto resultante funciona entre as sequências quaserepetidas. As unidades quase-repetidas fornecem um repertório praticamente ilimitado de moldes pelos quais eventos de erro podem ocorrer. Os construtos contendo as unidades quase-repetidas fornecem eficazmente assim elasticidade molecular suficiente para que eventos de deleção (e potencialmente inserção) possam ocorrem virtualmente em qualquer local dentro das unidades quase-repetidas.
[00426] Quando as sequências quase-repetidas estão todas ligadas na mesma orientação, por exemplo, cabeça para cauda ou vice-versa,
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212/510 a célula não pode distinguir unidades individuais. Conseqüentemente, o processo redutor pode ocorrer ao longo de toda a sequência. Ao contrário, quando, por exemplo, as unidades são apresentadas cabeça para cabeça, ao invés de cabeça para cauda, a inversão delineia os pontos finais da unidade adjacente para que a formação de deleção favoreça a perda de unidades distintas. Dessa forma, é preferível com o presente método que as sequências estejam na mesma orientação. Orientação aleatória de sequências quase-repetidas oferecerá a maior eficácia. Entretanto, embora ter uma quantidade menor das sequências contíguas na mesma orientação diminua a eficácia, isso pode fornecer ainda elasticidade suficiente para a recuperação eficaz de novas moléculas. Os construtos podem ser feitos com as sequências quaserepetidas na mesma orientação para permitir maior eficácia.
[00427] As sequências podem ser agrupadas em uma orientação de cabeça para cauda usando qualquer um de uma variedade de métodos, incluindo os seguintes:
a) Iniciadores que incluem uma cabeça poli-A e uma cauda poli-A que quando transformados em fita única forneceriam orientação podem ser utilizados. Isso é obtido por ter as primeiras poucas bases dos iniciadores feitas de RNA e portanto facilmente removíveis por RNAseH.
b) Iniciadores que incluem sítios de clivagem de restrição únicos podem ser utilizados. Múltiplos sítios, uma bateria de sequências únicas e síntese repetida e etapas de ligação poderiam ser necessários.
c) As poucas bases internas do iniciador poderiam ser tioladas e uma exonuclease usada para produzir moléculas com a cauda apropriada.
[00428] A recuperação das sequências rearranjadas conta com a identificação de vetores de clonagem com um índice repetitivo (RI) rePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 218/525
213/510 duzido. As sequências codificantes rearranjadas podem então ser recuperadas por amplificação. Os produtos são reclonados e expressos. A recuperação de vetores de clonagem com RI reduzida pode ser afetada por:
1) O uso de vetores mantidos apenas estavelmente quando o construto é reduzido em complexidade.
2) A recuperação física de vetores encurtados por procedimentos físicos. Nesse caso, o vetor de clonagem poderia ser recuperado usando procedimentos de isolamento de plasmídeo usuais e fracionado por tamanhão em um gel de agarose ou coluna com um ponto de corte de peso molecular baixo utilizando procedimentos usuais.
3) A recuperação de vetores contendo genes interrompidos que podem ser selecionados quando o tamanho do inserto diminui.
4) O uso de técnicas de seleção direta com um vetor de expressão e a seleção apropriada.
[00429] Sequências codificantes (por exemplo, genes) de organismos relacionados podem demonstrar um alto grau de homologia e codificar produtos protéicos bem diversos. Esses tipos de sequências são particularmente úteis na presente invenção como quaserepetições. Entretanto, embora os exemplos ilustrados abaixo demonstrem o rearranjo de sequências codificantes originais aproximadamente idênticas (quase-repetições), esse processo não é limitado a tais repetições aproximadamente idênticas.
[00430] O seguinte exemplo demonstra um método da invenção. Sequências de ácido nucléico codificantes (quase-repetições) derivadas de três (3) espécies únicas são descritas. Cada sequência codifica uma proteína com um conjunto distinto de propriedades. Cada uma das sequências difere por um único, ou poucos, pares de base em uma única posição na sequência. As sequências quase-repetidas são amplificadas separadamente ou coletivamente e ligadas em agrupaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 219/525
214/510 mentos aleatórios tal que todas as permutações e combinações possíveis estejam disponíveis na população de moléculas ligadas. O número de unidades quase-repetidas pode ser controlado pelas condições de agrupamento. O número médio de unidades quase-repetidas em um construto é definido como o índice repetitivo (RI).
[00431] Uma vez formados, os construtos podem ou não ser fracionados por tamanho e um gel de agarose de acordo com protocolos publicados, inseridos em um vetor de clonagem e transfectados em uma célula hospedeira apropriada. As células são então propagadas e “rearranjo redutor” é realizado. A taxa do processo de rearranjo redutor pode ser estimulada pela introdução de dano no DNA, se desejado. É indiferente se a redução em RI for mediada por formação de deleção entre sequências repetidas por um mecanismo “inter-molecular”, ou for mediada por eventos semelhantes a recombinação através de mecanismos “inter-moleculares”. O resultado final é um rearranjo das moléculas em todas as combinações possíveis.
[00432] Em um aspecto (opcionalmente), o método compreende a etapa adicional de rastrear os membros da biblioteca do grupo embaralhado para identificar membros embaralhados individuais da biblioteca que apresentam a habilidade de se ligar ou interagir de outra forma, ou catalisar uma reação em particular (por exemplo, tal como um domínio catalítico de uma enzima) com uma macromolécula predeterminada, tal como, por exemplo, um receptor de proteína, um oligossacarídeo, vírion, ou outro composto ou estrutura predeterminada.
[00433] Os polipeptídeos que são identificados a partir de tais bibliotecas podem ser usados para fins terapêuticos, diagnósticos, de pesquisa e relacionados (por exemplo, catalisadores, solutos para aumentar a osmolaridade de uma solução aquosa e semelhantes) e/ou podem ser submetidos à um ou mais ciclos adicionais de embaralhamento e/ou seleção.
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215/510 [00434] Em outro aspecto, é previsto que antes ou durante a recombinação, ou rearranjo, os polinucleotídeos gerados pelo método da invenção possam ser submetidos à agentes ou processos que promovam a introdução de mutações nos polinucleotídeos originais. A introdução de tais mutações aumentaria a diversidade de polinucleotídeos híbridos resultantes e polipeptídeos codificados a partir deles. Os agentes ou processos que promovem mutagênese podem incluir, mas não são limitados a: (+)-CC-1065, ou um análogo sintético tal como (+)-CC-1065-(N3-Adenina (veja Sun & Hurley, (1992); um aducto de 4'fluro-4-aminobifenil N-acetilado ou desacetilado capaz de inibir a síntese de DNA (veja por exemplo, van de Poll et al. (1992)); ou um aducto de 4-aminobifenil N-acetilado ou desacetilado capaz de inibir a síntese de DNA (veja também van de Poll et al. (1992), pp. 751-758); um aducto de DNA de cromo trivalente, de um sal de cromo trivalente, de um hidrocarboneto aromático policíclico (PAH) capaz de inibir a replicação do DNA, tal como 7-bromometol-benz[a]antraceno (“BMA”), tris(2,3-dibromopropil)fosfato (“Tris-BP”), 1,2-dibromo-3-cloropropano (“DBCP”), 2-bromoacroleína (2BA), benzo[a]pireno-7,8-diidrodiol-9-10epóxido (“BPDE”), um sal de halogênio de platina(II), N-hidróxi-2amino-3-metilimidazo[4,5-/]-quinolina (“N-hidróxi-IQ”) e N-hidróxi-2amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-/]-piridina (“N-hidróxi-FIP”). Meios exemplares para reduzir ou interromper a amplificação por PCR consistem em luz UV (+)-CC-1065 e (+)-CC-1065-(N3-Adenina). Meios particularmente abrangidos são aductos de DNA ou polinucleotídeos que compreendem os aductos de DNA dos polinucleotídeos ou grupo de polinucleotídeos, que podem ser liberados ou removidos por um processo que inclui aquecer a solução que compreende os polinucleotídeos antes de processamento adicional.
[00435] Outro aspecto da invenção é direcionado para um método de produzir proteínas recombinantes que apresentam uma atividade
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216/510 biológica por tratar uma amostra que compreende polinucleotídeos molde de fita dupla que codificam uma proteína tipo selvagem sob condições de acordo com a invenção que fornecem a produção de polinucleotídeos híbridos ou rearranjados.
Produzindo variantes de sequência [00436] A invenção também fornece métodos adicionais para fazer variantes de sequência das sequências de ácido nucléico (por exemplo, xilanase) da invenção. A invenção também fornece métodos adicionais para isolar xilanases usando os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece variantes de uma sequência codificante de xilanase (por exemplo, um gene, cDNA ou mensagem) da invenção, que pode ser alterada por qualquer meio, incluindo por exemplo, por métodos aleatórios ou estocásticos, ou métodos não-estocásticos, ou de “evolução dirigida”, como descrito acima.
[00437] As variantes isoladas podem ser de ocorrência natural. A variante também pode ser criada in vitro. Variantes podem ser criadas usando técnicas de manipulação genética tais como mutagênese sítiodirecionada, mutagênese química aleatória, procedimentos de deleção por exonucleoase III, e técnicas de clonagem usuais. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos, ou derivados podem ser criados usando síntese química ou procedimentos de modificação. Outros métodos de fazer variantes também são familiares daqueles versados na técnica. Esses incluem procedimentos nos quais sequências de ácido nucléico obtidas de isolados naturais são modificadas para gerar novos ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos que apresentam características que aumentam seu valor em processos e aplicações industriais, médicas, de laboratório (pesquisa), farmacêuticas, de alimentos e rações e suplementos alimentares e de rações e outros. Em tais procedimentos, um grande número de sequências variantes que
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217/510 apresentam uma ou mais diferenças de nucleotídeo com relação à sequência obtida do isolado natural são geradas e caracterizadas. Essas diferenças de nucleotídeo podem resultar em alterações de aminoácido com relação aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos dos isolados naturais.
[00438] Por exemplo, variantes podem ser criadas usando a técnica de “error prone” PCR. Na “error prone” PCR, a PCR é realizada sob condições onde a fidelidade de cópia da DNA polimerase é baixa, tal que uma alta taxa de mutações pontuais é obtida ao longo de toda a extensão do produto de PCR. “Error prone” PCR é descrita, por exemplo, em Leung, D.W., et al., Technique, 1:11-15, 1989) e Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33, 1992. Resumidamente, em tais procedimentos, os ácidos nucléicos a ser mutagenizados são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polimerase e uma concentração apropriada de dNTPs para se obter uma alta taxa de mutação pontual ao longo de toda a extensão do produto de PCR. Por exemplo, a reação pode ser executada usando 20 fmoles de ácido nucléico a ser mutagenizado, 30 pmoles de cada iniciador de PCR, um tampão de reação que compreende KCl 50mM, Tris HCl 10mM (pH 8.3) e gelatina 0,01%, MgCl2 7mM, MnCl2 0,5mM, 5 unidades de Taq polimerase, dGTP 0,2mM, dATP 0,2mM, dCTP 1mM, e dTTP 1mM. PCR pode ser executada por 30 ciclos de 94°C por 1 min, 45°C por 1 min , e 72°C por 1 min. Entretanto, será observado que esses parâmetros podem ser alterado conforme apropriado. Os ácidos nucléicos mutagenizados são clonados em um vetor apropriado e as atividades dos polinucleotídeos codificados pelos ácidos nucléicos mutagenizados são avaliadas.
[00439] As variantes também podem ser criadas usando mutagênese direcionada por oligonucleotídeo para gerar mutações sítioespecíficas em qualquer DNA clonado de interesse. Mutagênese por
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218/510 oligonucleotídeo é descrita, por exemplo, Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Resumidamente, em tais procedimentos uma grande quantidade de oligonucleotídeos de fita dupla carregando uma ou mais mutações a ser introduzidas no DNA clonado são sintetizados e inseridos no DNA clonado a ser mutagenizado. Clones contendo o DNA mutagenizado são recuperados e as atividades dos polinucleotídeos que eles codificam são avaliadas.
[00440] Outro método para gerar variantes é “assembly” PCR. “Assembly” PCR envolve o agrupamento de um produto de PCR de uma mistura de pequenos fragmentos de DNA. Um grande número de diferentes reações de PCR ocorrem um paralelo no mesmo frasco, com os produtos de uma reação iniciando os produtos de outra reação. “Assembly” PCR é descrita, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.965.408. [00441] Outro método ainda de gerar variantes é mutagênese por PCR sexual. Na mutagênese por PCR sexual, recombinação homóloga forçada ocorre entre moléculas de DNA de uma sequência de DNA diferente, mas altamente relacionada in vitro, como um resultado de fragmentação aleatória da molécula de DNA baseada em homologia de sequência, seguido por fixação do cruzamento por extensão do iniciador em uma reação de PCR. Mutagênese por PCR sexual é descrita, por exemplo, em Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Resumidamente, em tais procedimentos uma pluralidade de ácidos nucléicos a serem recombinados são digeridos com DNAse para gerar fragmentos que apresentam um tamanho médio de 50 a 200 nucleotídeos. Fragmentos do tamanho médio desejado são purificados e ressuspensos em uma mistura de PCR. A PCR é conduzida sob condições que facilitam a recombinação entre os fragmentos de ácido nucléico. Por exemplo, a PCR pode ser executada por ressuspender os fragmentos purificados em uma concentração de 10 a 30ng/pl em uma solução de 0,2mM de cada dNTP, 2,2mM de MgCl2,
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50mM de KCL, 10mM de Tris HCl, pH 9.0, e Triton X-100 0,1%. 2,5 unidades de Taq polimerase por 100:l da mistura de reação é adicionada e PCR é executada usando o seguinte regime: 94°C por 60 segundos, 94°C por 30 segundos, 50 a 55°C por 30 segu ndos, 72°C por 30 segundos (30 a 45 vezes) e 72°C por 5 minutos. E ntretanto, será observado que esses parâmetros podem ser alterados como apropriado. Em alguns aspectos, os oligonucleotídeos podem ser incluídos nas reações de PCR. Em outros aspectos, o fragmento de Klenow da DNA polimerase I pode ser usado em um primeiro grupo de reações de PCR e Taq polimerase pode ser usada em um grupo subseqüente de reações de PCR. Sequências recombinantes são isoladas e as atividades dos polipeptídeos que elas codificam são avaliadas.
[00442] Variantes também podem ser criadas por mutagênese in vivo. Em alguns aspectos, mutações aleatórias em uma sequência de interesse são geradas por propagar a sequência de interesse em uma cepa bacteriana, tal como uma cepa de E. coli, que carrega mutações em uma ou mais das vias de reparo de DNA. Tais cepas “mutantes” apresentam uma taxa de mutação maior do que aquela de um precursor tipo selvagem. Propagar o DNA em uma dessas cepas eventualmente irá gerar mutações aleatórias dentro do DNA. Cepas mutantes adequadas para uso em mutagênese in vivo são descritas na Publicação PCT N° WO 91/16427, publicada em 31 de outubro de 1991, intitulado “Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Populations”.
[00443] Variantes também podem ser geradas usando mutagênese de cassete. Na mutagênese de cassete uma pequena região de uma molécula de DNA de fita dupla é substituída por um “cassete” de oligonucleotídeo sintético que difere da sequência nativa. O oligonucleotídeo contém freqüentemente sequência nativa completamente e/ou parcialmente randomizada.
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220/510 [00444] Mutagênese de agrupamentos repetitivos também pode ser usada para gerar variantes. Mutagênese de agrupamentos repetitivos é um algoritmo para manipulação de proteína (mutagênese de proteína) desenvolvido para produzir diversas populações de mutantes fenotipicamente relacionados cujos membros diferem na sequência de aminoácido. Esse método usa um mecanismo de retroalimentação para controlar rodadas sucessivas de mutagênese de cassete combinatória. Mutagênese de agrupamentos repetitivos é descrita em Arkin, A.P. & Youvan, D.C., PNAS, USA, 89:7811-7815, 1992.
[00445] Em alguns aspectos, são criadas variantes usando mutagênese de agrupamento exponencial. Mutagênese de agrupamento exponencial é um processo para gerar bibliotecas combinatórias com uma alta porcentagem de mutantes únicos e funcionais, em que pequenos grupos de resíduos são randomizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, os aminoácidos que levam a proteínas funcionais. A mutagênese de agrupamento exponencial é descrita em Delegrave, S. & Youvan, D.C., Biotechnology Research, 11:15481552, 1993. Mutagênese aleatória e sítio-direcionada são descritos em Arnold, F.H., Current Opinion in Biotechnology, 4:450-455, 1993. [00446] Em alguns aspectos, as variantes são criadas usando procedimentos de embaralhamento em que porções de uma pluralidade de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidos juntos para criar sequências de ácido nucléico quiméricas que codificam polipeptídeos quiméricos como descrito na Patente U.S. N° 5.965.408, depositada em 9 de julho de 1996, intitulada, “Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis” e Patente U.S. N° 5.939.250, depositada em 22 de maio de 1996, intitulada, “Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis.
[00447] As variantes dos polipeptídeos da invenção podem ser variantes nas quais um ou mais dos resíduos de aminoácido dos polipepPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 226/525
221/510 tídeos da invenção são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não-conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser um codificado pelo código genético.
[00448] Substituições conservativas são aquelas que substituem um dado aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido de características semelhantes. Tipicamente vistas como substituições conservativas são as seguintes substituições: substituições de um aminoácido alifático tal como Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina por outro aminoácido alifático; substituição de uma Serina por uma Treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo ácido tal como ácido Aspártico e ácido Glutâmico por outro resíduo ácido; substituição de um resíduo que carrega um grupo amida, tal como Asparagina e Glutamina, por outro resíduo que carrega um grupo amida; troca de um resíduo básico tal como Lisina e Arginina por outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático por tal como Fenilalanina, Tirosina por outro resíduo aromático.
[00449] Outras variantes são aquelas nas quais um ou mais dos resíduos de aminoácido dos polipeptídeos da invenção inclui um grupo substituinte.
[00450] Outras variantes ainda são aquelas nas quais o polipeptídeo está associado com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol). [00451] Variantes adicionais são aquelas nas quais aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo tal como uma sequência líder, uma sequência secretória, uma sequência de pró-proteína ou uma sequência que facilita a purificação, enriquecimento, ou estabilização do polipeptídeo.
[00452] Em alguns aspectos, os fragmentos, derivados e análogos retêm a mesma função biológica ou atividade que os polipeptídeos da
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222/510 invenção e sequências substancialmente idênticas a elas. Em outros aspectos, o fragmento, derivado, ou análogo inclui uma pró-proteína, e tal que o fragmento, derivado ou análogo possa ser ativado por clivagem da porção de pró-proteína para produzir para produzir um polipeptídeo ativo.
Otimizando códons para obter altos níveis de expressão de proteína em células hospedeiras [00453] A invenção fornece métodos para modificar ácidos nucléicos que codificam xilanase para modificar o uso de códon. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico que codifica uma xilanase para aumentar ou diminuir sua expressão em uma célula hospedeira. A invenção também fornece ácidos nucléicos que codificam uma xilanase modificada para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, xilanase assim modificada e métodos de fazer as xilanases modificadas. O método compreende identificar um códon “não-preferido” ou “menos preferido” em um ácido nucléico que codifica xilanase e substituir um ou mais desses códons não-preferidos ou menos preferidos por um “códon preferido” que codifica o mesmo aminoácido que o códon substituído e pelo menos um códon não-preferido ou menos preferido no ácido nucléico foi substituído por um códon preferido que codifica o mesmo aminoácido. Um códon preferido é super-representado em sequências codificantes em genes na célula hospedeira e um códon não-preferido ou menos preferido é um códon sub-representado em sequências codificantes em genes na célula hospedeira.
[00454] Células hospedeiras para expressar os ácidos nucléicos, cassetes de expressão e vetores da invenção incluem bactérias, levedura, fungos, células de planta ou células de mamífero. Dessa forma, a invenção fornece métodos para otimizar o uso de códon em todas essas células, ácidos nucléicos alterados e polipeptídeos feitos pelos
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223/510 ácidos nucléicos com códon alterado. Células hospedeiras exemplares incluem bactérias gram-negativas, tal como Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens; bactérias gram positivas, tais como Streptomyces diversa, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Células hospedeiras exemplares também incluem organismos eucarióticos, por exemplo, várias leveduras, tais como Saccharomyces sp., incluindo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, e Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, e células e linhagens celulares de mamífero e células e linhagens celulares de inseto. Dessa forma, a invenção também inclui ácidos nucléicos e polipeptídeos otimizados para expressão nesses organismos e espécies.
[00455] Por exemplo, os códons de um ácido nucléico que codifica uma xilanase isolada de uma célula bacteriana são modificados para que o ácido nucléico seja otimamente expresso em uma célula bacteriana diferente da bactéria da qual a xilanase foi derivada, uma levedura, um fungo, uma célula planta ou uma célula de inseto ou uma célula de mamífero. Métodos para otimizar códons são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Veja também Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que descreve otimização de códons em sistemas de camundongo; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, que descreve otimização de códons em levedura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, que descreve otimização de códons em E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252264, que descreve otimização de uso códon que afeta secreção em E. coli.
ANIMAIS TRANSGÊNICOS NÃO-HUMANOS [00456] A invenção fornece animais não-humanos transgênicos que
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224/510 compreendem um ácido nucléico, um polipeptídeo (por exemplo, uma xilanase), um cassete de expressão ou um vetor ou uma célula transfectada ou transformada da invenção. A invenção também fornece métodos de fazer e usar esses animais transgênicos não humanos. [00457] Os animais transgênicos não-humanos podem ser, por exemplo, cabras, coelhos, ovelha, porcos, vacas, ratos, cavalos, cachorros, peixe e camundongos, compreendendo os ácidos nucléicos da invenção. Esses animais podem ser usados, por exemplo, como modelos in vivo para estudar atividade de xilanase, ou como modelos para rastrear por agentes que alteram a atividade de xilanase in vivo. As sequências codificantes para os polipeptídeos a ser expressos nos animais transgênicos não-humanos podem ser desenhados para ser constitutivos, ou sob o controle de fatores regulatórios transcricionais tecido-específicos, específicos do desenvolvimento ou induzíveis. Animais transgênicos não-humanos podem ser projetados e gerados usando qualquer método conhecido na técnica; veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.211.428; 6.187.992; 6.156.952; 6.118.044; 6.111.166; 6.107.541; 5.959.171; 5.922.854; 5.892.070; 5.880.327; 5.891.698; 5.639.940; 5.573.933; 5.387.742; 5.087.571, que descrevem fazer e usar células e ovos transformados em camundongos, ratos, coelhos, ovelhas, porcos, galinhas, cabras, peixe e vacas. Veja também, por exemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147157, que descreve a produção de proteínas recombinantes no leite de animais produtores de leite; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456461, que demonstra a produção de cabras transgênicas. Patente U.S. N° 6.211.428, descreve fazer e usar mamíferos transgênicos não humanos que expressam nos seus cérebros um construto de ácido nucléico que compreende uma sequência de DNA. A Patente U.S. N°. 5.387.742, descreve injetar sequências de DNA clonado e recombinante em ovos de camundongo fertilizados, implantar os ovos injetaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 230/525
225/510 dos em fêmeas pseudo-grávidas, e criar até o nascimento camundongos transgênicos cujas células expressam proteínas relacionadas com a patologia da doença de Alzheimer. Patente U.S. N°. 6.187.992, descreve fazer e usar um camundongo transgênico cujo genoma compreende uma quebra do gene que codifica a proteína precursora de amilóide (APP).
[00458] “Animais knockout’ também podem ser usados para praticar os métodos da invenção. Por exemplo, em um aspecto, os animais transgênicos ou modificados da invenção compreendem um “animal knockout”, por exemplo, um “camundongo knockout”, manipulado para não expressar um gene endógeno, que é substituído por um gene que expressa uma xilanase da invenção, ou, uma proteína de fusão que compreende uma xilanase da invenção.
PLANTAS E SEMENTES TRANSGÊNICAS [00459] A invenção fornece plantas e sementes transgênicas que compreendem um ácido nucléico, um polipeptídeo (por exemplo, uma xilanase), um cassete de expressão ou um vetor ou célula transfectada ou transformada da invenção. A invenção também fornece produtos ou sub-produtos de planta, por exemplo, frutas, óleos, sementes, folhas, extratos e semelhantes, incluindo qualquer parte de planta, que compreende um ácido nucléico e/ou polipeptídeo (por exemplo, uma xilanase) da invenção, por exemplo, em que o ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção é heterólogo para a planta, parte de planta, semente etc. A planta transgênica (que inclui partes de planta, frutas, sementes, etc) pode ser dicotiledônea (dicot.) ou monocotiledônea (monocot.). A invenção também fornece métodos de fazer e usar essas plantas e sementes transgênicas. A planta ou célula de planta transgênica expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com quaisquer métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.309.872.
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226/510 [00460] Ácidos nucléicos e construtos de expressão da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta por qualquer meio. Por exemplo, ácidos nucléicos ou construtos de expressão podem ser introduzidos no genoma de um hospedeiro de planta desejado, ou, os ácidos nucléicos ou construtos de expressão podem ser epissomas. A introdução no genoma de uma planta desejada por ser tal que a produção de xilanase do hospedeiro é regulada por elementos de controle transcricional ou traducional endógenos. A invenção também fornece “plantas knockout” onde a inserção da sequência do gene, por exemplo, por recombinação homóloga, interrompe a expressão do gene endógeno. Meios para gerar plantas “knockout” são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Veja discussão sobre plantas transgênicas, abaixo.
[00461] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser usados para conferir características desejadas a essencialmente qualquer planta, por exemplo, plantas produtoras de amido, tais como batata, trigo arroz, cevada, e semelhantes. Ácidos nucléicos da invenção podem ser usados para manipular vias metabólicas de uma planta a fim de otimizar ou alterar a expressão de xilanase do hospedeiro. Os ácidos nucléicos podem alterar a atividade de xilanase em uma planta. Alternativamente, uma xilanase da invenção pode ser usada na produção de uma planta transgênica para produzir um composto não produzido naturalmente por aquela planta. Isso pode reduzir os custos de produção ou criar um novo produto.
[00462] Em um aspecto, a primeira etapa na produção de uma planta transgênica envolve fazer um construto de expressão para expressão uma célula de planta. Essas metodologias são bem-conhecidas na técnica. Elas podem incluir selecionar e clonar um promotor, uma sequência codificante para facilitar a ligação eficaz de ribossomos ao
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227/510 mRNA e selecionar as sequências gênicas terminadoras apropriadas. Um exemplo de promotor constitutivo é CaMV35S, do vírus do mosaico da couve flor, que geralmente resulta em um alto grau de expressão em plantas. Outros promotores são mais específicos e respondem a sinais no ambiente interno ou externo da planta. Um exemplo de promotor induzível por luz é o promotor do gene cab, que codifica a proteína de ligação de clorofila a/b principal.
[00463] Em um aspecto, o ácido nucléico é modificado para obter maior expressão em uma célula de planta. Por exemplo, uma sequência da invenção provavelmente terá uma porcentagem maior de pares de nucleotídeo A-T em comparação com a vista em uma planta, algumas das quais preferem pares de nucleotídeos G-C. Portanto, nucleotídeos A-T na sequência codificante podem ser substituídos por nucleotídeos G-C sem alterar significativamente a sequência de aminoácido para aumentar a produção do produto do gene em células de planta. [00464] Genes marcadores selecionáveis podem ser adicionais ao construto do gene para identificar células de planta ou tecidos que se integraram com sucesso ao transgene. Isso pode ser necessário porque alcançar incorporação e expressão de genes em células de planta é um evento raro, que ocorre em apenas um baixo percentual de células ou tecidos atingidos. Genes marcadores selecionáveis codificam proteínas que fornecem resistência à agentes que são normalmente tóxicos para plantas, tais como antibióticos ou herbicidas. Apenas células de planta que integraram o gene marcador selecionável irão sobreviver quando cultivadas em um meio que contém o antibiótico ou herbicida apropriado. Da mesma forma que para outros genes inseridos, genes marcadores também requerem sequências promotoras e terminadoras para função apropriada.
[00465] Em um aspecto, fazer plantas transgênicas ou sementes compreende incorporar sequências da invenção e, em um aspecto
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228/510 (opcionalmente), genes marcadores em um construto de expressão alvo (por exemplo, um plasmídeo), junto com posicionamento do promotor e das sequências terminadoras. Isso pode envolver transferir o gene modificado para dentro da planta através de um método adequado. Por exemplo, um construto pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou os construtos podem ser introduzidos diretamente ao tecido da planta usando métodos balísticos, tal como bombardeio de partícula de DNA. Por exemplo, veja Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69, que discutem o uso de bombardeio de partículas para introduzir transgenes em trigo; e Adam (1997) supra, para o uso de bombardeio de partículas para introduzir YACs em células de planta. Por exemplo, Rinehart (1997) supra, usou bombardeio de partículas para gerar plantas de algodão transgênicas. Equipamentos para acelerar partículas são descritos Patente U.S. N°. 5.015.580; e, instrumento de aceleração de partícula PDS-2000 BioRad (Biolistics) disponível comercialmente; veja, por exemplo, John, Patente U.S. N° 5.608.148; e Ellis, Patente U.S. N°. 5.681.730, que descrevem transformação de gimnospermas mediada por partícula. [00466] Em um aspecto, protoplastos podem ser imobilizados e injetados com ácidos nucléicos, por exemplo, um construto de expressão. Embora a regeneração da planta a partir de protoplastos não seja fácil com cereais, a regeneração da planta é possível em legumes usando embriogênese somática de calos derivados de protoplastos. Tecidos organizados podem ser transformados com DNA nu usando técnica de arma de genes, onde o DNA é revestido em microprojéteis de tungstênio, bala de 1/100 do tamanho das células, que carregam o DNA para dentro de células e organelas. Tecido transformado é então
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229/510 induzido a se regenerar, geralmente por embriogênese somática. Essa técnica foi bem sucedida em várias espécies de cereal incluindo milho e arroz.
[00467] Ácidos nucléicos, por exemplo, construtos de expressão, também podem ser introduzidos em células de planta usando vírus recombinantes. Células de planta podem ser transformadas usando vetores virais, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus do mosaico do tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), veja Porta (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants,” Mol. Biotechnol. 5:209-221.
[00468] Alternativamente, ácidos nucléicos, por exemplo um construto de expressão, podem ser combinados com regiões flanqueadoras de T-DNA adequadas e introduzidos em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens direcionarão a inserção do construto e marcador adjacente para o DNA da célula de planta quando a célula for infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediada Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica. Veja por exemplo, Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995). O DNA em uma célula de A. tumefaciens está contido no cromossomo bacteriano assim como em outra estrutura conhecida como um plasmídeo Ti (indutor de tumor). O plasmídeo Ti contém uma extensão de DNA chamada T-DNA (~20 kb de comprimento) que é transferida para a célula de planta no processo de infecção e uma série de genes vir (virulência) que direcionam o processo de infecção. A. tumefaciens pode infectar uma planta apenas através de feridas: quando uma raiz ou caule da planta é ferido ele libera certos sinais químicos, em resposta aos quais, os genes vir de A.
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230/510 tumefaciens se tornam ativados e direcionam uma série de eventos necessários para a transferência do T-DNA do plasmídeo Ti para o cromossomo da planta. O T-DNA então entra na célula da planta através da ferida. Uma especulação é que o T-DNA espere até que o DNA da planta esteja sendo replicado ou transcrito, então se insere no DNA exposto. A fim de usar A. tumefaciens como um vetor de transgene, a seção indutora de tumor de um T-DNA tem que ser removida, enquanto se mantém as regiões de borda do T-DNA e os genes vir. O transgene é então inserido entre as regiões de borda do T-DNA, onde ele é transferido para a célula da planta e se torna integrado aos cromossomos da planta.
[00469] A invenção fornece a transformação de plantas monocotiledôneas usando os ácidos nucléicos da invenção, incluindo cereais importantes, veja Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218. Veja também, por exemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que discutem a integração de T-DNA no DNA genômico. Veja também D'Halluin, Patente U.S. N° 5.712.135, que descreve um processo para a integração estável de um DNA que compreende um gene que é funcional em uma célula de um cereal, ou outra planta monocotiledônea.
[00470] Em um aspecto, a terceira etapa pode envolver seleção e regeneração de plantas inteiras capazes de transmitir o gene alvo incorporado para a próxima geração. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, contando tipicamente com um marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas. A regeneração de planta de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing
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Company, Nova Iorque, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida de calos, explantes, órgãos de planta ou partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486. Para obter plantas inteiras de tecidos transgênicos tais como embriões imaturos, eles podem ser cultivados sob condições ambientais controladas em uma série de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura de tecido. Uma vez que plantas inteiras são geradas e produzem semente, a avaliação da progênie começa.
[00471] Após o cassete de expressão estar integrado estavelmente em plantas transgênicas, ele pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Quaisquer de várias técnicas de reprodução usuais podem ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada. Já que expressão transgênica dos ácidos nucléicos da invenção leva a alterações fenotípicas, plantas que compreendem os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser cruzadas sexualmente com uma segunda planta para obter um produto final. Dessa forma, a semente da invenção pode ser derivada de um cruzamento entre duas plantas transgênicas da invenção, ou um cruzamento entre uma planta da invenção e outra planta. Os efeitos desejados (por exemplo, expressão dos polipeptídeos da invenção para produzir uma planta na qual o comportamento de floração é alterado) podem ser aumentados quando ambas as plantas progenitoras expressam os polipeptídeos (por exemplo, uma xilanase) da invenção. Os efeitos desejados podem ser passados para gerações de plantas futuras por meios de propagação usuais.
[00472] Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção são expressos ou inseridos em qualquer planta ou semente. Plantas transgênicas da invenção podem ser dicotiledôneas ou monocotiledôneas.
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Exemplos de plantas transgênicas monocotiledôneas da invenção são gramas, tais como capim do campo (blue grass, Poa), grama de forragem tais como festuca, azevem, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho graúdo (milho). Exemplos de plantas transgênicas dicotiledôneas da invenção são tabaco, legumes, tais como tremoceiro, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana. Dessa forma, as plantas e sementes transgênicas da invenção incluem uma ampla gama de plantas, incluindo, mas não limitados a, espécies dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Plantas e sementes transgênicas da invenção podem ser qualquer monocotiledônea ou dicotiledônea, por exemplo, um milho monocotiledôneo, cana-de-açúcar, arroz, trigo, cevada, “switchgrass” ou Miscanthus; ou um cultivo de dicotiledônea de semente oleosa, soja, canola, semente de colza, linho, algodão, óleo de palma, cana-de-açúcar, amendoim, árvores, álamo ou tremoceiro.
[00473] Em modalidades alternativas, os ácidos nucléicos da invenção são expressos em plantas (e/ou suas sementes) que contêm células fibrosas, incluindo, por exemplo, algodão, árvore do algodão de seda (sumaúma, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, “winterfat”, pau de balsa, rami, kenaf, cânhamo, hibisco, juta,
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233/510 sisal, abacá, e linho. Em modalidades alternativas, as plantas transgênicas da invenção podem ser membros do gênero Gossypium, incluindo membros de qualquer uma das espécies Gossypium, tais como G. arboreum;. G. herbaceum, G. barbadense, e G. hirsutum.
[00474] A invenção também fornece plantas transgênicas (e/ou suas sementes) para serem usadas para produzir grandes quantidades dos polipeptídeos (por exemplo, uma xilanase ou anticorpo) da invenção. Por exemplo, veja Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296 (que produz proteína beta-caseína de leite humano em plantas de batata transgênica usando um promotor de manopina sintase (mas1',2') bidirecional induzido por auxina com métodos de transformação de disco foliar mediados por Agrobacterium tumefaciens).
[00475] Usando procedimentos conhecidos, um versado na técnica pode pesquisar plantas (e/ou suas sementes) da invenção por detectar o aumento ou diminuição de mRNA ou proteína de transgene em plantas transgênicas. Meios para detectar e quantificar mRNAs ou proteínas são bem-conhecidos na técnica.
POLIPEPTÍDEOS E PEPTÍDEOS [00476] Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos e peptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que apresentam uma atividade de xilanase, mananase e/ou glicanase, ou polipeptídeos e peptídeos capazes de gerar um anticorpo que se liga especificamente a uma xilanase ou uma glicanase, incluindo uma enzima dessa invenção, incluindo as sequências de aminoácido da invenção, que incluem aquelas que apresentam pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%,
55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%,
67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,
79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, ou 100%
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234/510 de identidade de sequência (completa) a um polipeptídeo exemplar da invenção (como definido acima), por exemplo, qualquer uma das sequências exemplares da invenção - que são todas as sequências pares entre SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:636 (veja a listagem de sequência); e fragmentos enzimaticamente ativos destas.
[00477] Várias características e propriedades de polipeptídeos exemplares da invenção são descritos nos Exemplos 13 a 15, abaixo. [00478] A invenção também fornece ácidos nucléicos codificantes de enzima com uma inovação em comum, na qual eles codificam um novo subgrupo de xilanases ou um clado, compreendendo o “módulo X14”. Em um aspecto, a invenção também fornece ácidos nucléicos codificantes de enzimas com uma inovação em comum na qual eles codificam um clado que compreende o “módulo X14” (J Bacteriol., Agosto de 2002; 184(15): 4124-4133). Os membros de xilanase que compreendem X14 deste clado estão listados na Tabela 9 abaixo. Dessa forma, em um aspecto, a invenção fornece um novo gênero de xilanases que compreende os membros de xilanase do clado listado na Tabela 9, abaixo e enzimas relacionadas (por exemplo, xilanases que apresentam 50% de identidade de sequência ou mais a uma enzima exemplar da invenção, conforme listado na Tabela 9 abaixo). As sequências no clado descrito na Tabela 9 abaixo, são únicos em que todos eles contêm um módulo X14 semelhante a CBM, que é muito similar entre todas as xilanases no clado descrito.
TABELA 9
SEQ ID NOS: X14 Clado único
169, 170 y y
195, 196 y y
215, 216 y y
161, 162 y y
225, 226 y y
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SEQ ID NOS: X14 Clado único
159, 160 y y
299, 300 y y
233, 234 y y
181, 182 y y
165, 166 y y
217, 218 y y
153, 154 y y
219, 220 y y
183, 184 y y
253, 254 y y
255, 256 y y
221, 222 y y
191, 192 y
353, 354 y
367, 368 y
261, 262 y
365, 366 y
205, 206 y
211, 212 y
[00479] Em um aspecto, a invenção fornece enzimas quiméricas, incluindo xilanases, glicanases e/ou glicosidades, que apresentam módulos de ligação a carboidrato (CBMs) heterólogos, por exemplo, para uso nos processos da invenção e em várias aplicações e processos industriais, médicos, farmacêuticos, de pesquisa, de alimentos e rações, e suplemento alimentício e de ração e outros. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece enzimas, por exemplo, hidrolases, incluindo glicosil hidrolases (tais como xilanases, glicanases) que compreendem um ou mais CBMs de uma enzima da invenção, incluindo o módulo X14 semelhante a CBM discutido acima, como resumido na tabela 9. Em outro aspecto, CBMs, por exemplo, módulos X14, enPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 241/525
236/510 tre diferentes enzimas da invenção podem ser trocados; ou alternativamente, um ou mais CBMs de uma ou mais enzimas da invenção podem ser unidos em uma enzima, por exemplo, uma hidrolase, por exemplo, qualquer glicosil hidrolase, tal como uma xilanase.
[00480] Glicosil hidrolases que utilizam substratos insolúveis são modulares, compreendendo geralmente módulos catalíticos unidos a um ou mais módulos de ligação a carboidrato (CBMs) não catalíticos. Na natureza, acredita-se que CBMs promovam a interação da glicosil hidrolase com seu polissacarídeo substrato alvo. Por exemplo, como discutido acima, X14 é um módulo de ligação ao xilano. Dessa forma, a invenção fornece enzimas quiméricas tendo substratos heterólogos não-naturais; incluindo enzimas quiméricas tendo múltiplos substratos pela natureza de suas CBMs heterólogas “spliced-in”, por exemplo, um módulo X14 “spliced-in” da invenção - dando assim à enzima quimérica uma nova especificidade por xilano e galactano, ou ligação aumentada ao xilano e galactano. Os CBMs heterólogos das enzimas quiméricas da invenção podem ser projetados para serem modulares, isto é, para estarem unidos a um módulo catalítico ou domínio catalítico (por exemplo, um sítio ativo, que também pode ser heterólogo ou pode ser homólogo à enzima.
[00481] A utilização apenas do módulo catalítico de uma xilanase ou uma glicanase (por exemplo, uma enzima da invenção) se mostrou eficaz. Dessa forma, a invenção fornece peptídeos e polipeptídeos que consistem em, ou compreendem em módulos de sítio ativo/CBM modulares (por exemplo, X14, veja a Tabela 9), que pode ser homologamente pareado ou unido como pares CBM-sítio ativo (heterólogos) quiméricos. Dessa forma, esses polipeptídeos/peptídeos quiméricos da invenção podem ser usados para melhorar ou alterar o desempenho de uma enzima artificial, por exemplo, uma enzima xilanase. O módulo catalítico quimérico da invenção (compreendendo, por exemPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 242/525
237/510 plo, pelo menos um CBM da invenção, por exemplo, X14) pode ser projetado para atingir a enzima para regiões particulares de um substrato, por exemplo, a regiões particulares de uma polpa. Por exemplo, em um aspecto, isso é obtido por fazer fusões da xilanase e vários CBMs (uma xilanase da invenção com um CBM heterólogo, ou um CBM da invenção com outra enzima, por exemplo, hidrolase, tal como uma xilanase. Por exemplo, CBM4, CBM6, e CBM22 são conhecidas por se ligar ao xilano e podem aumentar a eficácia da xilanase em bioalvejamento de polpa (veja por exemplo, Czjzek (2001) J. Biol. Chem. 276(51):48580-7, que observa que CBM4, CBM6, e CBM22 são relacionados e CBM interagem primariamente com o xilano). Em outra modalidade, a fusão de xilanase e CBM3a ou CBM3b, que se liga à celulose cristalina, pode ajudar a xilanase penetrar na complexa matriz de polissacarídeo da polpa e atingir xilanos inacessíveis. Qualquer CBM pode ser usado para praticar a presente invenção, por exemplo, como revisado por Boraston (2004) Biochem. J. 382:769-781:
Família Proteína Código PDB
CBM1 Celulase 7A (Trichoderma reesei) 1CBH
CBM2 Xilanase 10A (Cellulomonas fimi) 1EXG
Xilanase 11A (Cellulomonas fimi) 2XBD
Xilanase 11A (Cellulomonas fimi) 1HEH
CBM3 Estrutural (scaffolding) (Clostridium cellulolyticum) 1G43
Estrutural (Clostridium thermocellum) 1NBC
Celulase 9A (Thermobifida fusca) 1TF4
CBM4 Laminarinase 16A (Thermotoga maritima) 1GUI
Celulase 9B (Cellulomonas fimi) 1ULO; 1GU3
Celulase 9B (Cellulomonas fimi) 1CX1
Xilanase 10A (Rhodothermus marinus) 1K45
CBM5 Celulase 5A (Erwinia chrysanthemi) 1AIW
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Família Proteína Código PDB
CBM6 Quitinase B (Serratia marcescens) Xilanase 11A (Clostridium thermocellum) 1E15 1UXX
CBM9 Xilanase 11A (Clostridium stercorarium) Xilanase 11A (Clostridium stercorarium) Endoglicanase 5A (Cellvibrio mixtus) Xilanase 10A (Thermotoga maritima) 1NAE 1UY4 1UZ0 1I8A
CBM10 Xilanase 10A (Cellvibrio japonicus) 1QLD
CBM12 Quitinase Chi1 (Bacillus circulans) 1ED7
CBM13* Xilanase 10A (Streptomyces olivaceoviridis) 1XYF
CBM14 Xilanase 10A (Streptomyces lividans) Cadeia B da toxina ricina (Ricinus communis) Abrina (Abrus precatorius) Taquicitina (Tachypleus tridentatus) 1MC9 2AAI 1ABR 1DQC
CBM15 Xilanase 10C (Cellvibrio japonicus) 1GNY
CBM17 Celulase 5A (Clostridium cellulovorans) 1J83
CBM18* Aglutinina (Triticum aestivum) 1WGC
CBM20* Peptídeo antimicrobiano (Amaranthus caudatus) Quitinase/aglutinina (Urtica dioica) Glicoamilase (Aspergillus niger) 1MMC 1EIS 1AC0
CBM22 β-amilase (Bacillus cereus) Xilanase 10B (Clostridium thermocellum) 1CQY 1DYO
CBM27 Mananase 5A (Thermotoga maritima) 1OF4
CBM28 Celulase 5A (Bacillus sp. 1139) 1UWW
CBM29 Proteína 1 não catalítica (Pyromyces equi) 1GWK
CBM32 Sialidase 33A (Micromonospora viridifaciens) 1EUU
CBM34* Galactose oxidase (Cladobotryum dendroides) α-Amilase 13A (Thermoactinomyces vulgaris) 1GOF 1UH2
CBM36 Neopululanase (Geobacillus stearothermophilus) Xilanase 43A (Paenibacillus polymyxa) 1J0H 1UX7
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239/510 * Essas famílias contêm registros de estrutura numerosos demais para que todos sejam listados, dessa forma são mostrados apenas representantes.
[00482] Dessa forma, a invenção fornece hidrolases quiméricas da invenção, por exemplo, uma fusão de uma glicosidase com CBMs diferentes (por exemplo, heterólogos) para direcionar a enzima para polissacarídeos insolúveis particulares para aumentar o desempenho em uma aplicação. Em um aspecto, a glicosidade quimérica compreende uma enzima da invenção. Em um aspecto, a enzima quimérica compreende fusões de CBMs diferentes para aumentar o desempenho do bioalvejamento de polpa, por exemplo, para obter maior redução da porcentagem de químicos branqueadores. A invenção também fornece métodos que compreendem recombinar diferentes CBMs com diferentes xilanases (por exemplo, CBMs da invenção e/ou xilanases da invenção) e rastrear os quiméricos resultantes para encontrar a melhor combinação para uma aplicação ou substrato particular.
[00483] Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção compreende uma proteína que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:382, onde a sequência de sinal da xilanase que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:160 (codificada por exemplo, por SEQ ID NO:159) foi removida (a sequência de sinal removida era MISLKRVAALLCVAGLGMSAAN), o “módulo de ligação a carboidrato” (CBM) foi removido, e uma metionina inicial foi adicionada. Essa versão truncada da xilanase da invenção que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:382 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:381).
[00484] Três resíduos de aminoácido foram então removidos da extremidade carbóxi terminal do polipeptídeo SEQ ID NO:382, resultando em SEQ ID NO:384 (codificado por SEQ ID NO:383). Um desses resíduos era um glutamato que quando removido aumentou o pI da proteína. Essa deleção causou um aumento da habilidade da enziPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 245/525
240/510 ma alvejar polpa de madeira em um pH alcalino quando comparado com a enzima tipo selvagem. Em outro aspecto, três resíduos de aminoácido são removidos da extremidade carbóxi terminal de uma variante de GSSM de SEQ ID NO:382, por exemplo, polipeptídeo SEQ ID NO:482 (veja abaixo).
[00485] Dessa forma, a invenção fornece um método para aumentar o desempenho de uma xilanase, por exemplo, em pH alto, por remoção dos resíduos de aminoácido EGG (ou equivalentes) próximos da extremidade C' terminal de uma sequência de xilanase. Em um aspecto, EGG (ou o equivalente) é removido logo (imediatamente) após o domínio de glicosil hidrolase da xilanase a ser modificada.
[00486] Outras variações também estão dentro do escopo dessa invenção, por exemplo, onde um, dois, três, quatro ou cinco ou mais resíduos são removidos das extremidades carbóxi ou amino terminais de qualquer polipeptídeo da invenção. Outra variação inclui modificar qualquer resíduo para aumentar ou diminuir o pI de um polipeptídeo, por exemplo, remover ou modificar (por exemplo, para outro aminoácido) um glutamato. Esse método foi usado como um esquema geral para melhorar as propriedades da enzima sem criar problemas regulatórios já que nenhum aminoácido foi mutado; e esse esquema geral pode ser usado com qualquer polipeptídeo da invenção [00487] O polipeptídeo SEQ ID NO:384 foi ainda evoluído usando GSSM, como está resumido na Tabela 11:
Mutação Posições de nucleotídeo do aminoácido alterado Sequência tipo selva- gem (WT) Sequência de GSSM Outros códons que também codificam o mesmo aminoácido alterado
T4L 10-12 ACC CTT TTA, TTG, CTC, CTA, CTG
S9P 25-27 AGT CCC CCG, CCA, CCT
Q10S 28-30 CAA TCA TCC, TCT, TCG, AGT, AGC
T13F 37-39 ACT TTT TTC
T13Y 37-39 ACT TAC TAT
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Posições de
Mutação nucleotídeo do aminoácido alterado Sequência tipo selva- gem (WT) Sequência de GSSM Outros códons que também codificam o mesmo aminoácido alterado
T13I 37-39 ACT ATA ATT, ATC
T13W 37-39 ACT TGG -
N14H 40-42 AAC CAC CAT
Y18F 52-54 TAT TTC TTT
S25E 73-75 AGT GAG GAA
S25P 73-75 AGT CCC CCG, CCA, CCT
N30V 88-90 AAT GTG GTC, GTA, GTT
Q34C 100-102 CAG TGT TGC
Q34H 100-102 CAG CAT CAC
Q34L 100-102 CAG TTG TTA, CTT, CTC, CTA, CTG
S35E 103-105 TCC GAG GAA
S35D 103-105 TCC GAT GAC
S71T 211-213 TCA ACA ACT, ACC, ACG
S71C 211-213 TCA TGT TGC
S194H 508-582 AGT CAT CAC
[00488] O polipeptídeo SEQ ID NO:384 foi ainda evoluído usando
GSSM para gerar SEQ ID NO:482, codificado, por exemplo, por SEQ ID NO:481:
MAQTCLTSPQTGFHNGFFYSFWKDSPGTVNFCLLEGGR YTSNWSGINNWVGGKGWQTGSRRNITYSGSFNTPGNGYLALYGWT TNPLVEYYVVDSWGSWRPPGSDGTFLGTVNSDGGTYDIYRAQRVN APSIIGNATFYQYWSVRQSKRVGGTITTGNHFDAWASVGLNLGTHNY QIMATEGYQSSGSSDITVS (SEQ ID NO:482)
ATGGCCCAGACCTGCCTCACGTCGCCCCAAACCGGCT
TTCACAATGGCTTCTTCTATTCCTTCTGGAAGGACAGTCCGGGCA
CGGTGAATTTTTGCCTGTTGGAGGGCGGCCGTTACACATCGAACT
GGAGCGGCATCAACAACTGGGTGGGCGGCAAGGGATGGCAGAC
CGGTTCACGCCGGAACATCACGTACTCGGGCAGCTTCAATACACC
GGGCAACGGCTACCTGGCGCTTTACGGATGGACCACCAATCCAC
TCGTCGAGTACTACGTCGTCGATAGCTGGGGGAGCTGGCGTCCG
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CCGGGTTCGGACGGAACGTTCCTGGGGACGGTCAACAGCGATGG
CGGAACGTATGACATCTATCGCGCGCAGCGGGTCAACGCGCCGT
CCATCATCGGCAACGCCACGTTCTATCAATACTGGAGCGTTCGGC
AGTCGAAGCGGGTAGGTGGGACGATCACCACCGGAAACCACTTC
GACGCGTGGGCCAGCGTGGGCCTGAACCTGGGCACTCACAACTA
CCAGATCATGGCGACCGAGGGCTACCAAAGCAGCGGCAGCTCCG
ACATCACGGTGAGTTGA (SEQ ID NO:481)
DIFERENÇAS ENTRE SEQ ID NO:382 E SEQ ID NO:482:
[00489] Primeiro, três aminoácidos foram removidos da terminaçãoC de SEQ ID NO:382. Isso foi feito a fim de aumentar o desempenho de pH da enzima. Segundo, sete aminoácidos foram alterados a fim de aumentar o desempenho da enzima em alta temperatura em um alto pH. Dessa forma a enzima ativa SEQ ID NO:482 no produto compreende um domínio catalítico SEQ ID NO:382 levemente modificado. RESUMO DE ALTERAÇÕES FEITAS À SEQUÊNCIA EXEMPLAR
SEQ ID NO:382 [00490] Um resumo das alterações feitas à sequência exemplar SEQ ID NO:382 da invenção está relacionado na Figura 13; em que a figura ilustra a remoção da sequência EGG C-terminal para dar desempenho aumentado em pH alto; seguida por uma alteração em sete (7) resíduos de aminoácido - esse produto tendo desempenho aumentado em pH alto e alta temperatura; o produto final tem a sequência de SEQ ID NO:482.
DETALHES DAS ALTERAÇÕES DE AMINOÁCIDO ENTRE SEQ ID
NO:382 E SEQ ID NO:482:
Posição de aminoácido 9 13 14 18 34 35 71
SEQ ID NO:382 S T N Y Q S S
SEQ ID NO:482 P F H F L E T
[00491] Dessa forma, a invenção fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que apresentam atividade de xilanase, em
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243/510 que o polipeptídeo tem uma modificação de sequência de qualquer polipeptídeo da invenção, incluindo qualquer sequência de aminoácido exemplar da invenção (como definido acima, incluindo todas as sequências pares entre SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:636 - veja a listagem de sequência), em que a modificação de sequência compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou todas as seguintes alterações: o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 4 de SEQ ID NO:384 é leucina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 9 de SEQ ID NO:384 é prolina, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 10 de SEQ ID NO:384 é serina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é fenilalanina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é tirosina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é isoleucina, o aminoácido que corresponde à treonina no resíduo 13 de SEQ ID NO:384 é triptofano, o aminoácido que corresponde à asparagina no resíduo 14 de SEQ ID NO:384 é histidina, o aminoácido que corresponde à tirosina no resíduo 18 de SEQ ID NO:384 é fenilalanina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 25 de SEQ ID NO:384 é ácido glutâmico, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 25 de SEQ ID NO:384 é prolina, o aminoácido que corresponde à asparagina no resíduo 30 de SEQ ID NO:384 é valina, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 34 de SEQ ID NO:384 é cisteína, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 34 de SEQ ID NO:384 é histidina, o aminoácido que corresponde à glutamina no resíduo 34 de SEQ ID NO:384 é leucina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 35 de SEQ ID NO:384 é ácido glutâmico, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 35 de SEQ ID NO:384 é ácido aspártico, o aminoácido que corresponde à
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244/510 serina no resíduo 71 de SEQ ID NO:384 é treonina, o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 71 de SEQ ID NO:384 é cisteína, ou o aminoácido que corresponde à serina no resíduo 194 de SEQ ID NO:384 é histidina. A(s) alteração(ões) de sequência também pode(m) compreender qualquer modificação de aminoácido para alterar o pI de um polipeptídeo, por exemplo, deleção ou modificação de um glutamato, ou troca de um glutamato por outro resíduo.
[00492] A invenção também fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que apresentam atividade de xilanase, em que o polipeptídeo tem a sequência que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove ou todas as seguintes alterações à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:384: a treonina na posição de aminoácido 4 é leucina, a serina na posição de aminoácido 9 é prolina, a glutamina na posição de aminoácido 10 é serina, a treonina na posição de aminoácido 13 é fenilalanina, a treonina na posição de aminoácido 13 é tirosina, a treonina na posição de aminoácido 13 é isoleucina, a treonina na posição de aminoácido 13 é triptofano, a asparagina na posição de aminoácido 14 é histidina, a tirosina na posição de aminoácido 18 é fenilalanina, a serina na posição de aminoácido 25 é ácido glutâmico, a serina na posição de aminoácido 25 é prolina, a asparagina na posição de aminoácido 30 é valina, a glutamina na posição de aminoácido 34 é cisteína, a glutamina na posição de aminoácido 34 é histidina, a glutamina na posição de aminoácido 34 é leucina, a serina na posição de aminoácido 35 é ácido glutâmico, a serina na posição de aminoácido 35 é ácido aspártico, a serina na posição de aminoácido 71 é treonina, a serina na posição de aminoácido 71 é cisteína, ou a serina na posição de aminoácido 194 é histidina. [00493] A invenção ainda fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que tem uma identidade de sequência (por exemplo,
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245/510 pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%) a uma sequência exemplar da invenção.
[00494] Em um aspecto, o polipeptídeo tem uma atividade de xilanase ou glicanase; por exemplo, em que a atividade de xilanase pode compreender hidrolisar uma ligação glicosídica em um polissacarídeo, por exemplo, um xilano. Em um aspecto, o polipeptídeo tem uma atividade de xilanase compreendendo catalisar a hidrólise de ligações β1,4-xilosídicas internas. Em um aspecto, a atividade de xilanase compreende uma atividade de endo-1,4-beta-xilanase. Em um aspecto, a atividade de xilanase compreende hidrolisar um xilano para produzir uma xilose ou xilo-oligômero de menor peso molecular. Em um aspecto, o xilano compreende um arabinoxilano, tal como um arabinoxilano solúvel em água.
[00495] A invenção fornece polipeptídeos que apresentam atividade de glicanase, por exemplo, o polipeptídeo que tem a sequência de SEQ ID NO:564, codificado por exemplo, por SEQ ID NO:563. Em um aspecto, a atividade de glicanase de um polipeptídeo ou peptídeo da invenção (que inclui proteína ou peptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção) compreende uma atividade de endoglicanase, por exemplo, atividade de endo-1,4- e/ou 1,3-beta-D-glucan 4-glicano hidrolase. Em um aspecto, a atividade de endoglucanase compreende catalisar a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas. Em um aspecto, a atividade de glicanase, por exemplo, endoglicanase, compreende uma atividade de endo-1,4- e/ou 1,3-beta-endoglicanase ou atividade de endo-e-1,4-glicanase. Em um aspecto, a atividade de glicanase (por exemplo, atividade de endo-1,4-beta-D-glucan 4-glicano hidroPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 251/525
246/510 lase) compreende a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (por exemplo, carbóxi metil celulose e hidróxi etil celulose) liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D-glicanos de cereais e outro material de planta que contém partes celulósicas. Em um aspecto, a atividade de glicanase, xilanase, ou mananase compreende hidrolisar uma glicano ou outro polissacarídeo para produzir um beta-glicano, tal como betaglicano solúvel em água.
[00496] A invenção fornece polipeptídeos que apresentam atividade de mananase (por exemplo, endo-1,4-beta-D-mananase), por exemplo, catalisar a hidrólise de uma beta-1,4-manana, por exemplo, uma beta-1,4-manana linear não substituída. A determinação da atividade de mananase pode ser feita usando qualquer método conhecido, por exemplo, o método de Congo Red, como descrito, por exemplo, por Downie (1994) “A new assay for quantifying endo-beta-mannanase activity using Congo red dye. Phytochemistry, julho de 1994, vol. 36, no. 4, p. 829-835; ou como descrito na Patente U.S. N° 6.060.299, por exemplo, por aplicar uma solução a ser testada a orifícios de 4mm de diâmetro perfurados em placas de ágar 0,2% de AZCL galactomanana (alfarroba) ou qualquer substrato para o teste de endo-1,4-beta-Dmananase.
[00497] Qualquer teste de xilanase, glicanase e/ou mananase conhecido na técnica pode ser usado para determinar se um polipeptídeo tem atividade de xilanase, glicanase e/ou mananase e está dentro do escopo da invenção. Por exemplo, ensaios de redução de açúcar, tal como o método de Nelson-Somogy ou o método de ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para testar os produtos de açúcar (e assim, a atividade de xilanase). Em um aspecto, as reações são realizadas pela mistura e incubação de uma diluição da preparação da enzima com uma quantidade conhecida de substrato em um pH tamponado e
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247/510 temperatura ajustada. Testes de xilanases são similares aos testes de celulase exceto que uma solução de xilano (por exemplo, espelta de aveia ou bétula) é substituída por CMC ou papel de filtro. O teste de DNS é mais fácil de usar do que o teste de Nelson-Somogy. O teste de DNS é satisfatório para atividades de celulase, mas tende a superestimar a atividade de xilanase. O procedimento de Nelson-Somogy é mais preciso na determinação de açúcares redutores, para medir atividades específicas e para quantificar a quantidade total de xilanase produzida em condições de crescimento otimizadas, veja, por exemplo, Breuil (1985) Comparison of the 3, 5-dinitrosalicylic acid and Nelson-Somogyi methods of assaying for reducing sugars and determining cellulase activity, Enzyme Microb. Technol. 7:327-332; Somogyi, M. 1952, Notes on sugar determination, J. Biol. Chem. 195:19-23. A invenção incorpora o uso de qualquer ensaio de redução de açúcar, por exemplo, por Nelson-Somogy, por exemplo, baseado nas referências Nelson, N. (1944) J. Biol. Chem. 153:375-380, e Somogyi, M. (1952) J. Biol. Chem. 195:19-23.
[00498] Foi demonstrado que a xilanase que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:182 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:181) (“SEQ ID NO:181/182”) e a xilanase que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:382 (codificada, por exemplo por SEQ ID NO:381) (“SEQ ID NO:381/382”) aumenta o alvejante da polpa em pH 8 em uma quantidade maior do que outras enzimas. O aumento do alvejante é similar para ambas as enzimas quando elas são dosadas em quantidades de unidades iguais. Esses dois desempenhos superiores diferem quando testados em pH 10 com SEQ ID NO:182 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:181) (“SEQ ID NO:181/182”) resultando em níveis de alvejante maiores do que com SEQ ID NO:381/382. SEQ ID NO:181/182 tem um pI de 8.8 e SEQ ID NO:382 (codificada, por exemplo por SEQ ID NO:381) tem um pI de 7.9. SEQ
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ID NO:381/382 tem 197 aminoácidos de extensão. Quando E195, G196 e G194 são removidos, resultando em SEQ ID NO:384 (codificada pela SEQ ID NO:383), o pI torna-se 8.5. Esse construto tem melhor atividade em pH alto por que o pI da proteína é próximo ao da SEQ ID NO:181/182 no construto truncado.
[00499] Os três genes, SEQ ID NO:182 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:181), SEQ ID NO:382 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:381) e SEQ ID NO:384 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:383), foram expressos e os produtos gênicos foram testados usando o ensaio de redução de açúcar de Nelson-Somogy para determinar a U/ml de enzima onde uma unidade é a quantidade de enzima que liberará 1 pmole de xilose min-1. As enzimas foram dosadas em 2 U/g de polpa OD (seca no forno) e testadas de acordo com as aplicações do protocolo de bioalvejamento, descritas no Exemplo 8 abaixo.
[00500] Os resultados do estudo de “bioalvejamento”, mostrados na Figura 12 são: em pH=8: SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:182 agiram melhor do que o controle, C-0,21, como visto anteriormente; em pH=10: SEQ ID NO:382 o desempenho foi abaixo do controle C-0,21, como visto anteriormente; em pH=10, SEQ ID NO:182 NÃO agiu abaixo do controle, C-0,21, como visto anteriormente; SEQ ID NO:384 se agiu melhor do que SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:182 em pH=8; o desempenho de SEQ ID NO:384 em pH=10 não foi abaixo do controle, C-0,21 e foi comparável àquele de SEQ ID NO:182. Esses resultados indicam que SEQ ID NO:384 truncada (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:383) agiu tão bem quanto SEQ ID NO:182 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:181) em pH 10 enquanto que SEQ ID NO:382 agiu pobremente sob essas condições. As enzimas foram usadas para tratar SSWB com um Fator Kappa de 0,18. Na Figura 12, as linhas pretas representam os níveis de alvejante do controle em
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0,18 (linha inferior) e 0,21 (linha superior). Esse estudo de “bioalvejamento” demonstra o uso de truncamento de gene para melhorar as propriedades de enzimas xilanases. Esse estudo de “bioalvejamento” também demonstra que o pI aumentado de uma xilanase leva a um desempenho melhorado de Polpa Marrom de Pinho de Madeira Mole do Sul (SSWB).
[00501] Os polipeptídeos da invenção incluem xilanases em uma forma ativa ou inativa. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção incluem pró-proteínas antes da “maturação” ou o processamento de sequências prepro, por exemplo, por uma enzima de processamento de pró-proteína, tal como a pró-proteína convertase para gerar uma proteína “madura” ativa. Os polipeptídeos da invenção incluem xilanases inativas por outras razões, por exemplo, antes da “ativação” por um evento de processamento pós-traducional, por exemplo, uma ação de endo ou exo-peptidase ou proteinase, um evento de fosforilação, uma amidação, uma glicosilação ou uma sulfatação, um evento de dimerização e semelhantes. Os polipeptídeos da invenção incluem todas as formas ativas, incluindo subsequências ativas, por exemplo, domínios catalíticos ou sítios ativos, da xilanase.
[00502] Métodos para identificar sequências de domínio “prepro” e sequências de sinal são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136. Por exemplo, para identificar uma sequência prepro, a proteína é purificada no espaço extracelular e a sequência N-terminal da proteína é determinada e comparada com a forma não processada.
[00503] A invenção inclui polipeptídeos com ou sem uma sequência de sinal e/ou uma sequência prepro. A invenção inclui polipeptídeos com sequências de sinal heterólogas e/ou sequências prepro. A sequência prepro (incluindo uma sequência da invenção usada como domínio prepro heterólogo) pode estar localizada na extremidade amiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 255/525
250/510 no terminal ou carbóxi terminal da proteína. A invenção também inclui sequências de sinal, sequências prepro e domínios catalíticos (por exemplo, “sítios ativos”) isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem as sequências da invenção.
[00504] O percentual de identidade de sequência pode ser ao longo da extensão completa do polipeptídeo ou a identidade pode ser ao longo de uma região de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos. Polipeptídeos da invenção podem ser mais curtos do que a extensão completa de polipeptídeos exemplares. Em aspectos alternativos, a invenção fornece polipeptídeos (peptídeos, fragmentos) que variam em tamanho entre cerca de 5 e a extensão completa de um polipeptídeo, por exemplo, uma enzima tal como uma xilanase; extensões exemplares sendo de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos, por exemplo, resíduos contíguos de um exemplar de xilanase da invenção.
[00505] Peptídeos da invenção (por exemplo, uma subsequência de um polipeptídeo exemplar da invenção) podem ser úteis como, por exemplo, sondas de marcação, antígenos, toleragenos, motivos, sítios ativos de xilanase (por exemplo, “domínios catalíticos”), sequências de sinal e/ou domínios prepro.
[00506] Polipeptídeos e peptídeos da invenção podem ser isolados de fontes naturais, podem ser sintéticos ou podem ser polipeptídeos gerados recombinantemente. Peptídeos e proteínas podem ser expressos recombinantemente in vitro ou in vivo. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser feitos e isolados usando qualquer método conhecido na técnica. Polipeptídeos e peptídeos da invenção também podem ser sintetizados, como um todo ou em parte, usando métodos químicos bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo,
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Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por exemplo, a síntese de peptídeos pode ser realizada usando várias técnicas em fase sólida (veja, por exemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) e a síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
[00507] Polipeptídeos e peptídeos da invenção também podem ser glicosilados. A glicosilação pode ser adicionada pós-traducionalmente quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, em que o último incorpora o uso de motivos de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à sequência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na sequência codificante de ácido nucléico. A glicosilação pode ser O-ligada ou N-ligada.
[00508] “Aminoácido” ou “sequência de aminoácido” como usado aqui se refere a um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de proteína ou a um fragmento, porção ou subunidade de qualquer uma dessas moléculas que ocorrem naturalmente ou sintéticas. “Aminoácido” ou “sequência de aminoácido” inclui um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de proteína ou um fragmento, porção ou subunidade de qualquer um desses, e moléculas que ocorrem naturalmente ou sintéticas. O termo “polipeptídeo” como usado aqui, se refere a aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isoésteres de peptídeo e podem conter aminoácidos modificados diferentes dos 20 aminoácidos codificados por genes. Os polipeptídeos podem ser modificados por processos naturais, tal como processamento pós-traducional, ou por metodologias de modificação química que são bem-conhecidas na
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252/510 técnica. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, incluindo a cadeia principal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácídos e as terminações amino e carboxila. Será observado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em graus variáveis em vários locais em um dado polipeptídeo. Um dado polipeptídeo também pode ter vários tipos de modificações. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de um fosfitidilinositol, ciclização por ligação cruzada, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gamacarboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoliação, oxidação, peguilação, processamento de xilano hidrolase, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação e adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência à proteína tal como arginilação. (Veja Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2a Ed., W.H. Freeman & Company, Nova Iorque (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-12 (1983)). Os peptídeos e polipeptídeos da invenção também incluem todas as formas “miméticas” e “peptidomiméticas”, como descrito em detalhes adicionais abaixo.
[00509] Polipeptídeos ou proteínas “recombinantes” referem-se a polipeptídeos ou proteínas produzidos por técnicas de DNA recombinante, isto é, produzidos por células transformadas por um construto de DNA exógeno que codifica o polipeptídeo ou proteína desejada. Polipeptídeos ou proteínas “sintéticas” são aquelas preparadas por síntese química. Métodos de síntese química de peptídeo em fase sóPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 258/525
253/510 lida também podem ser usados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos da invenção. Tal método é conhecido na técnica desde o início dos anos de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (veja também Stewart, J. M. & Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12)) e recentemente foram empregados kits laboratoriais de desenho e síntese de peptídeo comercialmente disponíveis (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis utilizaram geralmente os ensinamentos de H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) e possibilitam síntese de peptídeos nas extremidades de uma variedade de “hastes” ou “pinos” todos os quais conectados a uma única placa. Quando tal sistema é utilizado, uma placa de hastes ou pinos é invertida e inserida em uma segunda placa de reservatórios ou cavidades correspondentes, que contêm soluções para a ligação ou ancoragem de um aminoácido apropriado nas extremidades do pino ou haste. Pela repetição de tal etapa do processo, isto é, invertendo e inserindo as extremidades do pino ou haste em soluções apropriadas, os aminoácidos são montados nos peptídeos desejados. Além disso, vários sistemas de síntese de peptídeo FMOC estão disponíveis. Por exemplo, a montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser executada sobre um suporte sólido usando um sintetizador automatizado de peptídeo Applied Biosystems, Inc. Modelo 431A. Tal equipamento fornece rápido acesso aos peptídeos da invenção, tanto por síntese direta quanto por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados usando outras técnicas conhecidas.
[00510] “Fragmentos”, como usado aqui, são uma porção de uma proteína que ocorre naturalmente que podem existir em pelo menos duas conformações diferentes. Fragmentos podem ter a mesma ou substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a proteína
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254/510 que ocorre naturalmente. “Substancialmente a mesma” significa que a sequência de aminoácidos é amplamente, mas não inteiramente, a mesma, mas retém pelo menos uma atividade funcional da sequência com a qual está relacionada. Em geral, duas sequências de aminoácidos são “substancialmente as mesmas” ou “substancialmente homólogas” se elas forem pelo menos cerca de 85% idênticas. Fragmentos que apresentam estruturas tridimensionais diferentes da proteína que ocorre naturalmente também são incluídos. Um exemplo disso é uma molécula “pró-forma”, tal como uma pró-proteína de baixa atividade que pode ser modificada por clivagem para produzir uma enzima madura com atividade significativamente maior.
[00511] Os peptídeos e polipeptídeos da invenção, como definidos acima, incluem todas as formas “miméticas” e “peptidomiméticas”. Os termos “mimético” e “peptidomimético” referem-se a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais dos polipeptídeos da invenção. O mimético pode ser inteiramente composto de análogos sintéticos, não-naturais de aminoácidos ou, é uma molécula quimérica de aminoácidos de peptídeo parcialmente naturais e análogos parcialmente não-naturais de aminoácidos. O mimético também pode incorporar qualquer quantidade de substituições de aminoácidos conservativas naturais desde que tais substituições também não alterem substancialmente a estrutura e/ou atividade do mimético. Da mesma forma que com polipeptídeos da invenção, que são variantes conservativas, experimentação de rotina determinará se um mimético está dentro do escopo da invenção, isto é, que sua estrutura e/ou função não está substancialmente alterada. Assim, em um aspecto, uma composição de mimético está dentro do escopo da invenção se ela tiver uma atividade de xilanase. [00512] Composições miméticas de polipeptídeos da invenção podem conter qualquer combinação de componentes estruturais nãoPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 260/525
255/510 naturais. Em um aspecto alternativo, composições miméticas da invenção incluem um ou todos os três grupos estruturais seguintes: a) grupos de ligação de resíduo diferentes das ligações de amida natural (“ligação peptídica”); b) resíduos não-naturais no lugar de resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente; ou c) resíduos que induzem mimetismo estrutural secundário, isto é, induzir ou estabilizar uma estrutura secundária, por exemplo, conformação em volta beta, volta gama, folha beta, alfa hélice e semelhantes. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser caracterizado como um mimético quando todos ou alguns de seus resíduos estão ligados por meios químicos diferentes de ligações peptídicas naturais. Resíduos peptidomiméticos individuais podem ser ligados por ligações peptídicas, outras ligações químicas ou meios de acoplamento, tais como, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, maleimidas bifuncionais, N,N’-dicicloexilcarbodiimida (DCC) ou N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Grupos de ligação que podem ser uma alternativa para as ligações de amida tradicionais (“ligação peptídica”) incluem, por exemplo, cetometileno (por exemplo, -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioeter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, ou éster (veja, por exemplo Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NY).
[00513] Um polipeptídeo da invenção também pode ser caracterizado como um mimético por conter todos ou alguns dos resíduos nãonaturais no lugar de resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Resíduos não-naturais estão bem descritos na literatura científica e de patente; alguns exemplares de composições não-naturais úteis como miméticos de resíduos de aminoácido naturais e orientações estão descritos abaixo. Miméticos de aminoácidos aromáticos
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256/510 podem ser gerados pela substituição de, por exemplo, D- ou L- nafilalanina; D- ou L- fenilglicina; D- ou L-2 tieneilalanina; D- ou L-1, -2, 3-, ou 4- pireneilalanina; D- ou L-3 tieneilalanina; D- ou L-(2-piridinil)alanina; D- ou L-(3-piridinil)-alanina; D- ou L-(2-pirazinil)-alanina; D- ou L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- ou L-pbifenilfenilalanina; D- ou L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D- ou L-2-indol (alquil)alaninas; e, D- ou L-alquilalaninas, onde alquila pode ser metila, etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, iso-butila, sec-isotila, isopentila substituída ou não substituída, ou aminoácidos não ácidos. Anéis aromáticos de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pirazolila, benzimidazolila, naftila, furanila, pirrolila, e piridila. Miméticos de aminoácidos podem ser gerados pela substituição de, por exemplo, aminoácidos não carboxilados ao mesmo tempo mantendo a carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Grupos laterais de carboxila (por exemplo, aspartil ou glutamil) também podem ser seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R’-N-C-N-R’) tais como, por exemplo, 1cicloexil-3(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3(4-azonia- 4,4dimetolpentil) carbodiimida. Aspartila ou glutamila também podem ser convertidos para resíduos de asparaginila e glutaminila pela reação com íons de amônia. Miméticos de aminoácidos básicos podem ser gerados por substituição, por exemplo, (além de lisina e arginina) com os aminoácidos ornitina, citrulina, ou ácido (guanidino)-acético ou ácido (guanidino)alquil-acético onde alquila é como definido acima. Derivado de nitrila (por exemplo, contendo a porção CN no lugar de COOH) pode ser substituído por asparagina ou glutamina. Resíduos de asparaginila ou glutaminila podem ser desaminados para os resíduos aspartila ou glutamila correspondentes. Miméticos de resíduo de arginina podem ser gerados pela reação de arginila com, por exemplo, um
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257/510 ou mais reagentes convencionais, incluindo, por exemplo, fenilglioxal,
2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona ou ninhidrina, preferivelmente sob condições alcalinas. Miméticos de resíduos de tirosina podem ser gerados pela reação de tirosila com, por exemplo, compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. N-acetilimidizol e tetranitrometano podem ser usados para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Miméticos de resíduos de cisteína podem ser gerados pela reação de resíduos de cisteinila com, por exemplo, alfa-haloacetatos tais como ácido 2-cloroacético ou cloroacetamida e aminas correspondentes; para dar derivados carboximetila ou carboxiamidometila. Miméticos de resíduos de cisteína podem ser gerados pela reação de resíduos de cisteinila com, por exemplo bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoila) propiônico; fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfeto de metil 2-piridila; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4 nitrofenol; ou, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Miméticos de resíduos de cisteína podem ser gerados pela reação de resíduos de cisteinila com, por exemplo bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5imidozoila) propiônico; fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfeto de metil 2-piridila; pcloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4 nitrofenol; ou, cloro-7nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Miméticos de lisina podem ser gerados (e os resíduos de amina terminais podem ser alterados) pela reação de lisinila com, por exemplo, anidrido de ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. Lisina e outros miméticos de resíduo que contém alfa-amino também podem ser gerados pela reação com imidoésteres, tais como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboroidreto, ácido trinitro-benzenessulfônico, Ometilisouréia, 2,4, pentanodiona, e reações com glioxilato catalisadas com transamidase. Miméticos de metionina podem ser gerados pela
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258/510 reação com, por exemplo, sulfóxido de metionina. Miméticos de prolina incluem, por exemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, 3ou 4- hidróxi prolina, deidroprolina, 3- ou 4-metilprolina, ou 3,3,dimetilprolina. Miméticos de resíduo de histidina podem ser gerados pela reação de histidila com, por exemplo, dietilprocarbonato ou brometo de para-bromofenacila. Outros miméticos incluem, por exemplo, aqueles gerados por hidroxilação de prolina e lisina; fosforilação dos grupos de hidroxila de resíduos de serila ou treonila; metilação de grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilação de amina N terminal; metilação de resíduos de amida da cadeia principal ou substituição com N metil aminoácidos; ou amidação de grupos carboxila Cterminais.
[00514] Um resíduo, por exemplo, um aminoácido, de um polipeptídeo da invenção também pode ser substituído por um aminoácido (ou resíduo peptidomimético) da quiralidade oposta. Assim, qualquer aminoácido que ocorre naturalmente na configuração L (que também pode ser referida como R ou S, dependendo da estrutura da entidade química) pode ser substituído pelo aminoácido do mesmo tipo de estrutura química ou um peptidomimético, mas de quiralidade oposta, referido como o D aminoácido, mas também pode ser referido como forma R ou S.
[00515] A invenção também fornece métodos para modificar os polipeptídeos da invenção por processos naturais, tais como processamento pós-traducional (por exemplo, fosforilação, acilação, etc.) ou por técnicas de modificação química e os polipeptídeos resultantes modificados. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, incluindo na cadeia principal do peptídeo, cadeias laterais de aminoácidos e as terminações amina ou carboxila. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em vários graus em diversos sítios em um dado polipeptídeo. Um dado poliPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 264/525
259/510 peptídeo também pode ter vários tipos de modificações. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de um fosfitidilinositol, ciclização por reticulação, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoliação, oxidação, peguilação, processamento de xilano hidrolase, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação e adição de aminoácios à proteína mediada por RNA de transferência tal como arginilação. (Veja Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-12 (1983)).
[00516] Métodos de síntese química de peptídeo em fase sólida também podem ser usados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos da invenção. Tais métodos são conhecidos na técnica desde os primeiros anos de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:21492154, 1963) (veja também Stewart, J. M. & Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 1112)) e tem sido recentemente empregados em kits laboratoriais de desenho e síntese de peptídeo comercialmente disponíveis (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis apresentam utilizado comumente os ensinamentos de H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) e possibilitam síntese de peptídeos nas extremidades de uma variedade de “hastes” ou “pinos” todos os quais conectados a uma única placa. Quando tal sistema é utilizado, uma placa de hastes ou pinos é invertiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 265/525
260/510 da e inserida em uma segunda placa de reservatórios ou cavidades correspondentes, que contêm soluções para a ligação ou ancoragem de um aminoácido apropriado nas extremidades do pino ou haste. Pela repetição de tal etapa do processo, isto é, invertendo e inserindo as extremidades do pino ou haste em soluções apropriadas, os aminoácidos são montados nos peptídeos desejados. Além disso, vários sistemas de síntese de peptídeo FMOC estão disponíveis. Por exemplo, a montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser executada sobre um suporte sólido usando um sintetizador automatizado de peptídeo Applied Biosystems, Inc. Modelo 431A. Tal equipamento fornece rápido acesso aos peptídeos da invenção, tanto por síntese direta quanto por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados usando outras técnicas conhecidas.
[00517] A invenção inclui xilanases da invenção com e sem sinal. O polipeptídeo que compreende uma sequência de sinal da invenção pode ser uma xilanase da invenção ou outra xilanase ou outra enzima ou outro polipeptídeo.
[00518] A invenção inclui xilanases imobilizadas, anticorpos antixilanase e fragmentos desses. A invenção fornece métodos para inibir a atividade da xilanase, por exemplo, usando mutantes dominantes negativos ou anticorpos antixilanase da invenção. A invenção inclui heterocomplexos, por exemplo, proteínas de fusão, heterodímeros, etc., que compreendem as xilanases da invenção.
[00519] Polipeptídeos da invenção podem ter uma atividade de xilanase sob várias condições, por exemplo, extremas em pH e/ou temperatura, agentes oxidantes e semelhantes. A invenção fornece métodos que levam a preparações alternativas de xilanase com eficiências catalíticas e estabilidades diferentes, por exemplo face a condições de temperatura, agentes oxidantes e lavagem alterada. Em um aspecto, variantes de xilanase podem ser produzidas usando técnicas de mutaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 266/525
261/510 gênese sítio direcionada e/ou mutagênese aleatória. Em um aspecto, a evolução dirigida pode ser usada para produzir uma grande variedade de variantes de xilanase com especificidades e estabilidade alternativas.
[00520] As proteínas da invenção também são úteis como reagentes de pesquisa para identificar moduladores de xilanase, por exemplo, ativadores ou inibidores de atividade de xilanase. Resumidamente, amostras de teste (compostos, caldos, extratos e semelhantes) são adicionados a ensaios para xilanase para determinar sua habilidade em inibir a clivagem do substrato. Inibidores identificados dessa maneira podem ser usados na indústria e pesquisa para reduzir ou prevenir proteólise indesejada. Do mesmo modo que as xilanases, inibidores podem ser combinados para aumentar o espectro de atividade. [00521] As enzimas da invenção também são úteis como reagentes de pesquisa para digerir proteínas ou no seqüenciamento de proteína. Por exemplo, xilanases podem ser usadas para decompor polipeptídeos em fragmentos menores para uso em seqüenciamento, por exemplo em um seqüenciador automatizado.
[00522] A invenção também fornece métodos de descoberta de novas xilanases usando os ácidos nucléicos, polipeptídeos e anticorpos da invenção. Em um aspecto, bibliotecas de fagomídeos são rastreadas para descoberta de xilanases baseada em expressão. Em outro aspecto, bibliotecas de fagos lambda são rastreadas para descoberta de xilanases baseada em expressão. O rastreamento de bibliotecas de fago ou fagomídeo pode permitir a detecção de clones tóxicos; melhorar o acesso ao substrato; reduzir a necessidade de manipular um hospedeiro, contornando o potencial para qualquer influência que resulte da excisão maciça da biblioteca; e, crescimento mais rápido com baixas densidades de clones. O rastreamento de bibliotecas de fago ou fagomídeo pode ser em fase líquida ou em fase sólida. Em um asPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 267/525
262/510 pecto, a invenção fornece o rastreamento em fase líquida. Isso dá maior flexibilidade em condições de ensaio; flexibilidade adicional do substrato; maior sensibilidade para clones fracos; e facilidade de automatização sobre o rastreamento em fase sólida.
[00523] A invenção fornece métodos de rastreamento usando as proteínas e ácidos nucléicos da invenção e automação robotizada para permitir a execução de várias centenas de reações biocatalíticas e ensaios de rastreamento em um curto período de tempo, por exemplo, por dia, assim como assegurar um nível elevado de precisão e reprodutibilidade (veja discussão de arranjos, abaixo). Como resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas. Para mais ensinamentos sobre modificações de moléculas, incluindo moléculas pequenas, veja PCT/US94/09174.
[00524] Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo isolado ou purificado que compreende uma sequência da invenção e sequências substancialmente idênticas a esta ou fragmentos que compreendem pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desta. Como discutido acima, tais polipeptídeos podem ser obtidos pela inserção de um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo em um vetor tal que a sequência codificante é operativamente ligada a uma sequência capaz de direcionar a expressão do polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira adequada. Por exemplo, o vetor de expressão pode compreender um promotor, um sítio de ligação a ribossomo para iniciação da tradução e um terminador da transcrição. O vetor pode também incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão.
[00525] Outro aspecto da invenção é polipeptídeos ou fragmentos desses que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo
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263/510 menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais do que cerca de 95% de homologia com um dos polipeptídeos da invenção e sequências substancialmente idênticas a estas ou um fragmento que compreende pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos dessa. A homologia pode ser determinada usando qualquer um dos programas descritos acima que alinha os polipeptídeos ou fragmentos a ser comparados e determina a extensão da identidade de aminoácidos ou a similaridade entre eles. Será apreciado que “homologia” de aminoácidos inclui substituições conservativas de aminoácidos tais como aquelas descritas acima.
[00526] Os polipeptídeos ou fragmentos que tem homologia com um dos polipeptídeos da invenção ou um fragmento que compreende pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos deste podem ser obtidos pelo isolamento do ácido nucléico que os codifica usando as técnicas descritas acima. [00527] Alternativamente, polipeptídeos ou fragmentos homólogos podem ser obtidos através de enriquecimento bioquímico ou procedimentos de purificação. A sequência de polipeptídeos ou fragmentos potencialmente homólogos pode ser determinada pela digestão com xilano hidrolase, eletroforese em gel e/ou microseqüenciamento. A sequência do polipeptídeo ou fragmento homólogo prospectivo pode ser comparada com uma dos polipeptídeos da invenção ou um fragmento que compreende pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desses usando qualquer um dos programas descritos acima.
[00528] Outro aspecto da invenção é um ensaio para identificação de fragmentos ou variantes da invenção, que retêm a função enzimática dos polipeptídeos da invenção. Por exemplo, os fragmentos ou variantes dos ditos polipeptídeos podem ser usados para catalisar reaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 269/525
264/510 ções bioquímicas, que indicam que o fragmento ou variante retém a atividade enzimática dos polipeptídeos da invenção.
[00529] O ensaio para determinar se fragmentos de variantes retêm a atividade enzimática dos polipeptídeos da invenção inclui as etapas de: colocar o fragmento ou variante de polipeptídeo em conato com uma molécula de substrato sob condições que permitem ao fragmento ou variante de polipeptídeo funcionar e detectar tanto uma diminuição no nível de substrato quanto um aumento no nível do produto de reação específico da reação entre o polipeptídeo e o substrato.
[00530] Os polipeptídeos da invenção ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes podem ser usados em uma variedade de aplicações. Por exemplo, os polipeptídeos ou fragmentos desses podem ser usados para catalisar reações bioquímicas. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um processo para utilizar os polipeptídeos da invenção ou polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos para hidrolisar ligações glicosídicas. Em tais procedimentos, uma substância que contém uma ligação glicosídica (por exemplo, um amido) é colocada em contato com um dos polipeptídeos da invenção ou sequências substancialmente idênticas a estes sob condições que facilitam a hidrólise da ligação glicosídica.
[00531] A presente invenção explora as propriedades catalíticas únicas de enzimas. Enquanto o uso de biocatalisadores (isto é, enzimas purificadas ou brutas, células vivas ou não-vivas) em transformações químicas normalmente requer a identificação de um biocatalisador particular que reaja com um composto inicial específico, a presente invenção usa biocatalisadores selecionados e condições de reação que são específicas para grupos funcionais que estão presentes em vários compostos iniciais, tais como moléculas pequenas. Cada biocatalisador é específico para um grupo funcional ou vários grupos funciPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 270/525
265/510 onais relacionados e pode reagir com vários compostos iniciais que contém esse grupo funcional.
[00532] As reações biocatalíticas produzem uma população de derivados a partir de um único composto inicial. Esses derivados podem ser submetidos à outra rodada de reações biocatalíticas para produzir uma segunda população de compostos derivados. Milhares de variações da molécula pequena ou composto original podem ser produzidas com cada iteração de derivatização biocatalítica.
[00533] Enzimas reagem em sítios específicos de um composto inicial sem afetar o resto da molécula, um processo que é muito difícil de se obter usando métodos químicos tradicionais. Esse alto grau de especificidade biocatalítica fornece o meio para identificar um composto ativo único dentro da biblioteca. A biblioteca é caracterizada por uma série de reações biocatalíticas usadas para produzi-la, a assim chamada “história biossintética”. O rastreamento da biblioteca quanto a atividades biológicas e a investigação da história biossintética identifica a sequência de reação específica que produz o composto ativo. A sequência de reação é repetida e a estrutura do composto sintetizado determinada. Esse modo de identificação, diferente de outras abordagens de síntese e rastreamento, não requer tecnologias de imobilização e os compostos podem ser sintetizados e testados livres em solução usando virtualmente qualquer tipo de ensaio de rastreamento. É importante observar que o alto grau de especificidade de reações enzimáticas de grupos funcionais permite o “rastreamento” de reações enzimáticas específicas que constroem a biblioteca produzida biocataliticamente.
[00534] Várias das etapas processuais são realizadas usando automatização robótica que possibilita a execução de vários milhares de reações biocatalíticas e ensaios de rastreamento por dia assim como possibilita um alto grau de precisão e reprodutibilidade. Como resultaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 271/525
266/510 do, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas o que poderia levar anos para produzir usando métodos químicos atuais.
[00535] Em um aspecto particular, a invenção fornece um método para modificar moléculas pequenas, que compreende colocar um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo descrito aqui, ou fragmentos enzimaticamente ativos deste, em contato com uma molécula pequena para produzir uma molécula pequena modificada. Uma biblioteca de moléculas pequenas modificadas é testada para determinar se uma molécula pequena modificada que está presente dentro da biblioteca exibe uma atividade desejada. Uma reação biocatalítica específica que produz a molécula pequena modificada com a atividade desejada é identificada por eliminar sistematicamente cada uma das reações biocatalíticas usadas para produzir uma porção da biblioteca e então testar as moléculas pequenas produzidas na porção da biblioteca quanto à presença ou ausência da molécula pequena modificada com a atividade desejada. As reações biocatalíticas específicas que produzem a molécula pequena modificada de atividade desejada são, em um aspecto (opcionalmente), repetidas. As reações biocatalíticas são conduzidas com um grupo de biocatalisadores que reagem com porções estruturais distintas encontradas dentro da estrutura da molécula pequena, cada biocatalisador é específico para uma porção estrutural ou um grupo de porções estruturais relacionadas; e cada biocatalisador reage com várias moléculas pequenas diferentes que contém a porção estrutural distinta.
Sequências de sinal, prepro e domínios catalíticos de xilanase [00536] A invenção fornece sequências de sinal (por exemplo, peptídeos de sinal (SPs)), domínios prepro e domínios catalíticos (CDs) de xilanase. Os SPs, domínios prepro e/ou CDs da invenção podem ser peptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes ou podem ser parte
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267/510 de uma proteína de fusão, por exemplo, um domínio heterólogo em uma proteína quimérica. A invenção fornece ácidos nucléicos que codificam esses domínios catalíticos (CDs), domínios prepro e sequências de sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo que tem uma sequência que compreende/consiste em resíduos amino terminais de um polipeptídeo da invenção). Em um aspecto, a invenção fornece uma sequência de sinal que compreende um peptídeo que compreende/consiste em uma sequência como descrita nos resíduos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a
24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a
43, 1 a 44, 1 a 45, 1 a 46, 1 a 47, 1 a 48, 1 a 49 ou 1 a 50 de um polipeptídeo da invenção.
[00537] Em um aspecto, a invenção fornece uma sequência de sinal que compreende um peptídeo que compreende/consiste em uma sequência como descrita na Tabela 4 abaixo. Por exemplo, ao ler a Tabela 4, a invenção fornece uma sequência de sinal que compreende/consiste nos resíduos de 1 a 23 de SEQ ID NO:102 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:101), uma sequência de sinal que compreende/consiste nos resíduos de 1 a 41 de SEQ ID NO:104 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:103), etc.
TABELA 4: sequências de sinal exemplares da invenção
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido)
101, 102 1-23
103, 104 1-41
105, 106 1-22
109, 110 1-26
11, 12 1-28
113, 114 1-28
119, 120 1-33
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268/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido)
121, 122 1-20
123, 124 1-20
131, 132 1-26
135, 136 1-25
139, 140 1-24
141, 142 1-25
143, 144 1-32
147, 148 1-28
149, 150 1-18
15, 16 1-20
151, 152 1-21
153, 154 1-16
155, 156 1-21
157, 158 1-29
159, 160 1-23
161, 162 1-32
163, 164 1-26
165, 166 1-23
167, 168 1-36
169, 170 1-24
17, 18 1-31
171, 172 1-29
173, 174 1-22
175, 176 1-27
177, 178 1-26
179, 180 1-19
181, 182 1-25
183, 184 1-32
185, 186 1-27
187, 188 1-28
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269/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido)
19, 20 1-29
191, 192 1-27
193, 194 1-21
195, 196 1-23
197, 198 1-28
199, 200 1-30
203, 204 1-30
205, 206 1-29
207, 208 1-27
209, 210 1-25
21, 22 1-28
211, 212 1-29
215, 216 1-31
217, 218 1-29
219, 220 1-23
221, 222 1-24
223, 224 1-28
225, 226 1-25
227, 228 1-39
229, 230 1-28
23, 24 1-29
231, 232 1-41
233, 234 1-26
235, 236 1-28
237, 238 1-32
239, 240 1-30
241, 242 1-28
243, 244 1-33
245, 246 1-32
249, 250 1-33
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 275/525
270/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de amjnoácjdo)
253, 254 1-24
255, 256 1-51
259, 260 1-24
261, 262 1-26
263, 264 1-29
267, 268 1-30
27, 28 1-27
271, 272 1-22
273, 274 1-74
277, 278 1-19
279, 280 1-22
283, 284 1-28
287, 288 1-23
289, 290 1-22
295, 296 1-26
299, 300 1-24
301, 302 1-28
303, 304 1-74
305, 306 1-32
309, 310 1-20
311, 312 1-33
313, 314 1-22
315, 316 1-28
319, 320 1-27
325, 326 1-27
327, 328 1-29
329, 330 1-35
33, 34 1-23
331, 332 1-28
333, 334 1-30
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 276/525
271/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de amjnoácjdo)
335, 336 1-50
339, 340 1-23
341, 342 1-45
347, 348 1-20
349, 350 1-20
351, 352 1-73
353, 354 1-18
355, 356 1-21
357, 358 1-25
359, 360 1-31
361, 362 1-26
365, 366 1-65
367, 368 1-23
369, 370 1-27
39, 40 1-24
41, 42 1-37
45, 46 1-25
47, 48 1-26
5, 6 1-47
51, 52 1-30
53, 54 1-37
55, 56 1-24
57, 58 1-22
59, 60 1-21
63, 64 1-20
65, 66 1-22
67, 68 1-28
69, 70 1-25
7, 8 1-57
73, 74 1-21
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 277/525
272/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de amjnoácjdo)
75, 76 1-22
77, 78 1-27
79, 80 1-36
83, 84 1-30
87, 88 1-29
89, 90 1-40
9, 10 1-36
95, 96 1-24
99, 100 1-33
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido) Sequência de sinal FONTE
385, 386 1-25 ADLRRRRLLQAAATLPLLGWCSAQA Ambiental
387, 388 1-28 MLKVLRKPVLSGLSLALLLPVGITSVGA Ambiental
389, 390 1-25 MSVKPFWRQWILCFMVMFFSAQAAA Ambiental
391,392 1-22 MMKGFRWCVMAMVVMAATNVRA Ambiental
393, 394 1-36 MVMEGKGLLMRRRSVSLLGLAGL- LAVPLTVLPQAQA Bactéria
395, 396 1-30 MKVFRNSIIRKSVVLFCAVLWILPA- GLSLA Ambiental
397, 398 Ambiental
399, 400 1-28 MTSGRNTCVCLLLIVLAIGLLSKPPASA Ambiental
401,402 1-26 MLKVLRKPIISGLALALLLPAGAAGA Ambiental
403, 404 1-34 MSQLDLNLKLFRRVFFALVLTSIIASVL- SASVAS Ambiental
405, 406 Ambiental
407, 408 1-26 MAFSKDKASFTRRSAIAAGLAAGVSA Ambiental
409, 410 1-19 MKVTAAFAGLLATVLAAPA Ambiental
411,412 1-19 MVAFTSLLAGFAAIAGVLS Ambiental
413, 414 1-34 MKKRQGFIKKGLVLGVSLLLLA- LIMMSATSQTSA Ambiental
415, 416 1-22 MKGFRWCVLAVLMLAATNLRAA Ambiental
417, 418 1-21 MNVLRSGLVTMLLLAAFSVQA Ambiental
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 278/525
273/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido) Sequência de sinal FONTE
419, 420 1-19 MLVRLLIAMTVLFSAFAHA Ambiental
421,422 1-16 MKANIIFCLLAPLVAA Ambiental
423, 424 1-35 MPTGLRAKPCLTRWLAASACALA- PLLLGAPASALA Ambiental
425, 426 1-23 MLQTIALIFLALVILIALLISFR Ambiental
427, 428 Ambiental
429, 430 1-21 MNVLRSGIVTMLLLAAFSVQA Ambiental
431,432 1-19 MVQIKAAALAVLFASNVLS Ambiental
433, 434 1-39 MNTLLPRRRLWSSTAILRTLAAGA- LAAGMVLAPVSAANA Ambiental
435, 436 Cochiiobolus heterostro- phus ATCC 48331
437, 438 1-23 MRKPACATLAVMMSLLFTPFSQA Ambiental
439, 440 Ambiental
441,442 Ambiental
443, 444 Ambiental
445, 446 1-21 MKNIILNLSPVVFALLILTAA Ambiental
447, 448 1-22 MNALRTGAILVLMLAAAQVSAA Ambiental
449, 450 1-22 MMKAFRWCVIALMLAAAPLRAA Ambiental
451,452 Ambiental
453, 454 Cochliobolus heterostro- phus ATCC 48332
455, 456 Bactéria
457, 458 Ambiental
459, 460 Cochliobolus heterostro- phus ATCC 48333
461,462 1-22 MWQRSKTLVLVLGLLLSHQAFA Ambiental
463, 464 Ambiental
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 279/525
274/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido) Sequência de sinal FONTE
465, 466 Ambiental
467, 468 1-16 MKFFTVLLFFLSFVFS Bactéria
469, 470 Ambiental
471,472 1-21 MRIHWLGLSSRASLMTAALLA Ambiental
473, 474 Ambiental
475, 476 1-28 MKTHSFNLRSRITLLTAALLFIGATAGA Ambiental
477, 478 1-29 MKRFLSWSLTGILVASALVALAL- PGSSQA Ambiental
479, 480 1-16 MKVFATLAGLLATALA Ambiental
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido) Sequência de sinal
483, 484 1-33 MKKRLLALIVTLVFIISLFNPIFTTPLTNVAKA
485, 486 487, 488 1-23 MQTVLLTVSLVFLASCMMATTNS
489, 490 1-18 MKPILRSSLSCLGILVLA
491, 492 1-65 MNNYRAFVLGLCWLGGLMLTGCGAD- QGSPDPGTSSATSSTSSSSEGFSSAVSES-
493, 494 1-23 SASAISSSASS MHVLAKICLVVLIALSTCASTMA
495, 496 1-23 MRTRVLTLLGGFLGSTIAASVTV
497, 498 499, 500 1-26 MITFRNTLFTVVILAIVGSGLPACEA
501, 502 1-24 MKYSHVVTLSLALVLCIAGLGVSA
503, 504 1-37 MNTTQTTSKKSSRKRFAYTAFVVLISAL-
TIFVSTALA
505, 506 1-28 MRLKPTLKWAVSLLVTTAAMTFTSAVNA
507, 508 1-29 MLTAKRSRPWVWSLLVTASALLLSAAAHS
509, 510 511, 512 1-27 MKFSHIRSLSLALVLCFTGFGVSTVHA
513, 514 1-27 MRSKRMMFFFIMLVSFALALPAVNVSA
515, 516 1-28 MLHILRKPIIAGLALSLVFSGGMGSVSA
517, 518 1-31 MSFFKTITRNSKTCAATLALAATVSAVSANA
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 280/525
275/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido) Sequência de sinal
519, 520 1-33 MSFASVKNITIAGKGLVALFTFALLSGISSVNA
521, 522 1-28 MSFSRRRFILSATAMLAATQLKSRALAA
523, 524 1-29 MNLKNKLTLKSSIAAAACVAAMSFSTANA
525, 526 1-28 MNNSKDFFYKARGFLSALLLLVPIAAHA
527, 528 1-30 MTAISRRKFLLSSAGALALAQMKVSAIAKA
529, 530 1-34 MKHNVFSTRALRRVLPGGLLIAGLIGATA- TGLQA
531, 532 533, 534 535, 536 1-29 MKLTNKITLKGSLAAAACVAAMGFSTANA
537, 538 1-29 MPSRRQFLLGSAQVTGLMMLAKHQAIASA
539, 540 1-28 MKTLLKITLSTLFAFIVLMGCDMGLRDA
541, 542 543, 544 1-27 MKRKSVKLFLAILFCILLILPAGMVSA
545, 546 1-24 MNKTFRLPIILMGILLTFSSARCS
547, 548 549, 550 551, 552 1-20 MTRLSRRNFLVGSAAVAAMA
553, 554 1-35 MTGISTGRGKNPGRIYTTLSTALVFVVMGA- LESWA
555, 556 1-27 MKFSHIRSLSLALVLCFTGFGVSTVHA
557, 558 559, 560 1-27 MSSLIAGTIACCMMMMPLILAPSQVHA
561, 562 1-35 MSLSKHKSLLLAVSRYTCAALLAGS- LVACGGNTTT
563, 564 1-20 MQSLFLFLVVFFFTQTQVFG
MNSYRALMLGLLGGLILTG-
565, 566 1-60 CGAGQDSPTPGSSSAISSSSESFSSVTSES-
SSSAISSTASS
567, 568 1-28 MTFSRRNFIWGTAAVLAATQLKARALAA
569, 570 571, 572 573, 574 575, 576 1-25 MNNSIKIVLGLIVLVFLLPACSGNS
577, 578 1-29 MFMLSKKILMVLLTISMSFISLFTVTAYA
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 281/525
276/510
SEQ ID NO: Sequência de sinal (posições de aminoácido) Sequência de sinal
579, 580 581, 582 1-23 MSIRNFFTATVILVALGASLTWG
583, 584 1-27 MVKLKLKLKNLLLVISILTLIGNNVFS
585, 586 587, 588 589, 590 1-29 MKKRITSIAIVFALVFGFGVLGCSSNKQG
591, 592 1-39 MLKQIGDQTVNLPLNKLTLKSSL- TAAACVAAMSFSTANA
593, 594 1-29 MNLLSTLPIKRSLTAAACIAAMGFSAANA
595, 596 1-31 MVRSDTRRTRRFALLAVGAMLAGLAALPAAA
597, 598 1-31 MVRSDTTRTRRFALLVVSAMVAGMAVL- PAAA
599, 600 1-29 MGRQLKKIISMVLAFALLIPMMPITAAAA
601,602 1-23 MENKKFVRAIFLITTACCLSANA
603, 604 1-30 MKKILKKLKETSVLHFVVIASIFLSSCGNA
605, 606 1-30 MTFSRRQFLLQTSAGLALLSTAKMRAFARA
607, 608 1-33 MSFASVKNITTAGKGLVALFTFALLFG- TSSVNA
609, 610 611, 612 1-31 MTISRRKFMWGTAALLAATQLKTRALAAAMA
613, 614 1-30 MTFSRRQFLLQTSAGLALLSTAKMRAFARA
615, 616 1-27 MIKRAIFLMTAVLLFSLAFLLPPPAGA
617, 618 619, 620 1-20 MRTFILIPLMLLVLSACTNG
621, 622 1-22 MQLRRFTGGALIMVLCASAAKG
623, 624 1-41 MHIVKSSAYLLLASVSLAL- SACSSSSSSGSETSSSSASSSS
625, 626 1-30 MNPLINRLALKSSLAAATCVAAMSFSTANA
627, 628 1-24 MWKKFKVSLAYVLISVLLVSQGWA
629, 630 1-27 MHSRRKFLLRSAQATGLMLFAKQQAFA
631, 632 1-26 MNNLSRRKFLLGSAGLAALTNLKACA
633, 634 1-20 MRKLLIIWIVLILALLPVIS
635, 636 1-30 MNPLINRLALKSSLAAATCVAAMSFSTANA
[00538] As sequências de sinal (SPs) e/ou sequência prepro de xilanase da invenção podem ser peptídeos isolados ou sequências ligaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 282/525
277/510 das a outra xilanase ou a um polipeptídeo não-xilanase, por exemplo, como uma proteína de fusão (quimérica). Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que compreendem sequências de sinal de xilanase da invenção. Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem sequências de sinal SPs e/ou prepro de xilanase da invenção compreendem sequências heterólogas a uma xilanase da invenção (por exemplo, uma proteína de fusão que compreende uma SP e/ou prepro da invenção e sequências de outra xilanase ou de uma proteína nãoxilanase). Em um aspecto, a invenção fornece xilanases da invenção com SPs e/ou sequências prepro heterólogas, por exemplo, sequências com uma sequência de sinal de levedura. Uma xilanase da invenção pode compreender uma SP e/ou prepro heterólogas em um vetor, por exemplo, um vetor da série pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[00539] Em um aspecto, SPs e/ou sequências prepro da invenção são identificados após a identificação de novos polipeptídeos de xilanase. As vias pelas as proteínas são classificadas e transportadas para as suas localizações celulares apropriadas são geralmente referidas como vias de direcionamento de proteína. Um dos mais importantes elementos em todos esses sistemas de direcionamento é uma sequência de aminoácido curta na terminação amina de um polipeptídeo recentemente sintetizado chamada de sequência de sinal. Essa sequência de sinal direciona a proteína para sua localização apropriada na célula e é removida durante o transporte ou quando a proteína alcança seu destino final. A maioria das proteínas lisossomais, de membrana ou secretadas tem uma sequência de sinal amino-terminal que marca as mesmas para translocação para dentro da luz do retículo endoplasmático. Mais de 100 sequências de sinal para proteínas desse grupo foram determinadas. As sequências de sinal podem variar em extensão entre cerca de 11 a 41 ou entre cerca de 13 a 36 resíduos de aminoácidos. Vários métodos de reconhecimento de sequênPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 283/525
278/510 cias de sinal são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, em um aspecto, novos peptídeos de sinal de xilanase são identificados por um método referido como SignalP. SignalP usa uma rede neural combinada que reconhece os peptídeos de sinal e seus sítios de clivagem, veja, por exemplo, Nielsen (1997) Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10:1-6.
[00540] Deve ficar entendido que, em alguns aspectos, as xilanases da invenção podem não ter SPs e/ou sequências prepro ou “domínios”. Em um aspecto, a invenção fornece xilanases que não apresentam todo ou de parte de uma SP e/ou domínio prepro. Em um aspecto, a invenção fornece uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de sinal (SP) e/ou prepro de uma xilanase operativamente ligada a uma sequência de ácido nucléico de uma xilanase diferente ou, em um aspecto (opcionalmente), uma sequência de sinal (SPs) e/ou domínio prepro de uma proteína não-xilanase pode ser desejado. [00541] A invenção também fornece polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes que compreendem sequências de sinal (SPs), domínio prepro e/ou domínios catalíticos (CDs) da invenção e sequências heterólogas. As sequências heterólogas são sequências não naturalmente associadas (por exemplo, a uma xilanase) com uma SP, domínio prepro e/ou CD. A sequência a qual SP, domínio prepro e/ou CD não estão naturalmente associados pode estar na terminação amina, terminação carboxila de SP, domínio prepro e/ou CD e/ou em ambas as terminações de SP e/ou CD. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante que compreende (ou consiste em) um polipeptídeo que compreende uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção com a condição de que não esteja associada com nenhuma sequência a qual ela está naturalmente associada (por exemplo, uma sequência
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 284/525
279/510 de xilanase). Similarmente, em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados, sintéticos ou recombinantes que codificam esses polipeptídeos. Assim, em um aspecto, o ácido nucléico isolado, sintético ou recombinante da invenção compreende uma sequência codificante para uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção e uma sequência heteróloga (isto é, uma sequência não naturalmente associada com uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção). A sequência heteróloga pode ser sobre a extremidade 3' terminal, 5' terminal e/ou sobre ambas as extremidades da sequência codificante de SP, domínio prepro e/ou CD.
XILANASES HÍBRIDAS (QUIMÉRICAS) E BIBLIOTECAS DE PEPTÍDEO [00542] Em um aspecto, a invenção fornece xilanases híbridas e proteínas de fusão, incluindo bibliotecas de peptídeo, compreendendo as sequências da invenção. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser usadas para isolar moduladores de peptídeo (por exemplo, ativadores ou inibidores) de alvos, tais como substratos de xilanase, receptores, enzimas. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser usadas para identificar parceiros de ligação formais de alvos, tais como ligantes, por exemplo, citocinas, hormônios e semelhantes. Em um aspecto, a invenção fornece proteínas quiméricas que compreendem uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção ou uma combinação desses e uma sequência heteróloga (veja acima).
[00543] Em um aspecto, as proteínas de fusão da invenção (por exemplo, a porção peptídica) são conformacionalmente estabilizadas (em relação a peptídeos lineares) para permitir uma maior afinidade de ligação aos alvos. A invenção fornece fusões de xilanases da invenção e outros peptídeos, incluindo peptídeos conhecidos e aleatórios. Eles
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280/510 podem ser fundidos de tal maneira que a estrutura das xilanases não é significativamente perturbada e o peptídeo é estabilizado conformacionalmente, metabolicamente ou estruturalmente. Isso permite a criação de uma biblioteca de peptídeo que é facilmente monitorada por sua presença dentro da célula e por sua quantidade.
[00544] Variantes de sequência de aminoácidos da invenção podem ser caracterizadas por uma natureza predeterminada da variação, um aspecto que as coloca em separado de uma forma que ocorre naturalmente, por exemplo, uma variação alélica ou inter-espécie de uma sequência de xilanase. Em um aspecto, as variantes da invenção exibem a mesma atividade biológica qualitativa que o análogo que ocorre naturalmente. Alternativamente, as variantes podem ser selecionadas por terem características modificadas. Em um aspecto, enquanto o sítio ou da região para introdução de uma variação de sequência de aminoácido é predeterminado, a mutação em si não precisa ser predeterminada. Por exemplo, a fim de otimizar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, a mutagênese aleatória pode ser conduzida para o códon alvo ou região e as variantes de xilanase expressas rastreadas quanto à combinação ótima de atividade desejada. Técnicas para fazer mutações por substituição em sítios predeterminados no DNA que tem uma sequência conhecida são bem-conhecidas, como discutido aqui, por exemplo, mutagênese por iniciador M13 e mutagênese por PCR. O rastreamento dos mutantes pode ser feito usando, por exemplo, ensaios de hidrólise de xilano. Em aspectos alternativos, substituições de aminoácidos podem ser resíduos únicos; inserções podem ser da ordem de cerca de 1 a 20 aminoácidos, embora inserções consideravelmente maiores possam ser feitas. Deleções podem variar entre cerca de 1 a cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70 ou mais resíduos. Para se obter um derivado final com propriedades ótimas, substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação desses podem
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281/510 ser usadas. Geralmente, essas alterações são feitas sobre alguns aminoácidos para minimizar a alteração da molécula. Entretanto, alterações maiores podem ser toleradas em certas circunstancias.
[00545] A invenção fornece xilanases onde a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo, a estrutura secundária ou terciária, por exemplo, uma estrutura em alfa hélice ou folha beta, foi modificada. Em um aspecto, a carga ou hidrofobicidade foi modificada. Em um aspecto, o volume de uma cadeia lateral foi modificado. Alterações substanciais na função ou identidade imunológica são feitas pela seleção de substituições que são menos conservativas. Por exemplo, podem ser feitas substituições que afetam mais significativamente: a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da alteração, por exemplo, uma estrutura em alfa-hélice ou folha-beta; uma carga ou um sítio hidrofóbico da molécula, que pode ser um sítio ativo; ou uma cadeia lateral. A invenção fornece substituições em polipeptídeos da invenção onde (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serila ou treonila, é substituído por um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanil;a (b) uma cisteína ou prolina é substituída por outro resíduo; (c) um resíduo que tem uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila ou histidila é substituído por um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou (d) um resíduo que tem uma cadeia lateral grande, por exemplo, fenilalanina, é substituído por um que não tem uma cadeia lateral, por exemplo, glicina. As variantes podem exibir a mesma atividade biológica qualitativa (isto é, atividade de xilanase) embora variantes possam ser selecionadas para modificar as características das xilanases como necessário.
[00546] Em um aspecto, xilanases da invenção compreendem epitopos ou sinalizadores de purificação, sequências de sinal ou outras sequências de fusão, etc. Em um aspecto, as xilanases da invenção podem ser fundidas a um peptídeo aleatório para formar um polipeptíPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 287/525
282/510 deo de fusão. Por “fundido” ou “operativamente ligado” entende-se que o peptídeo aleatório e a xilanase estão ligados juntos, de maneira a minimizar a ruptura da estabilidade da estrutura da xilanase, por exemplo, retém a atividade de xilanase. O polipeptídeo de fusão (ou polinucleotídeo de fusão que codifica o polipeptídeo de fusão) pode compreender ainda outros componentes, incluindo múltiplos peptídeos em múltiplas alças.
[00547] Em um aspecto, os peptídeos e ácidos nucléicos que os codificam são randomizados, ou completamente randomizados ou eles induzidos em sua randomização, por exemplo, geralmente na freqüência de nucleotídeo/peptídeo ou por posição. “Randomizado” significa que cada ácido nucléico e peptídeo consiste em nucleotídeos e aminoácidos essencialmente aleatórios, respectivamente. Em um aspecto, os ácidos nucléicos que dão origem aos peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e assim podem incorporar qualquer nucleotídeo em qualquer posição. Assim, quando os ácidos nucléicos são expressos para formar peptídeos, qualquer resíduo de aminoácido pode ser incorporado em qualquer posição. O processo sintético pode ser designado para gerar ácidos nucléicos randomizados, para permitir a formação de todas ou da maioria das combinações possíveis sobre a extensão do ácido nucléico, formando assim uma biblioteca de ácidos nucléicos aleatórios. A biblioteca pode fornecer uma população suficientemente diversa estruturalmente de produtos de expressão para afetar uma faixa probabilisticamente suficiente de respostas celulares para fornecer uma ou mais células que exibem a resposta desejada. Assim, a invenção fornece uma biblioteca de interação grande o suficiente tal que pelo menos um de seus membros terá uma estrutura que dá a ele afinidade por algumas moléculas, proteína ou outro fator.
[00548] Xilanases são enzimas de multidomínios que consistem, em um aspecto (opcionalmente), em um peptídeo de sinal, um módulo
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283/510 de ligação a carboidrato, um domínio catalítico de xilanase, um ligante e/ou outro domínio catalítico.
[00549] A invenção fornece um meio de gerar polipeptídeos quiméricos que podem codificar polipeptídeos híbridos biologicamente ativos (por exemplo, xilanases híbridas). Em um aspecto, os polinucleotídeos originais codificam polipeptídeos biologicamente ativos. O método da invenção produz novos polipeptídeos híbridos pela utilização de processos celulares que integram a sequência do polinucleotídeo original tal que o polinucleotídeo híbrido resultante codifique um polipeptídeo que demonstra atividades derivadas dos polipeptídeos ativos biologicamente originais. Por exemplo, polinucleotídeos originais podem codificar uma enzima particular de microrganismos diferentes. Qualquer enzima codificada por um primeiro polinucleotídeo de um organismo ou uma variante desse, por exemplo, funciona efetivamente sob uma condição ambiental particular, por exemplo, alta salinidade. Uma enzima codificada por um segundo polinucleotídeo de um organismo diferente ou variante pode funcionar efetivamente sob uma condição ambiental diferente, tal como temperaturas extremamente elevadas. Um polinucleotídeo híbrido que contenha sequências do primeiro e segundo polinucleotídeos originais pode codificar uma enzima que exibe características de ambas as enzimas codificadas pelos polinucleotídeos originais. Assim, a enzima codificada pelo polinucleotídeo híbrido pode funcionar efetivamente sob condições ambientais partilhadas por cada uma das enzimas codificadas pelo primeiro e segundo polinucleotídeos, por exemplo, alta salinidade e temperaturas extremas.
[00550] Enzimas codificadas pelos polinucleotídeos da invenção incluem, mas não são limitadas a hidrolases, tais como xilanases. Hidrolases de glicosidase foram inicialmente classificadas em famílias em 1991, veja, por exemplo, Henrissat (1991) Biochem. J. 280:309Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 289/525
284/510
316. Desde então, as classificações tem sido continuamente atualizadas, veja, por exemplo, Henrissat (1993) Biochem. J. 293:781-788; Henrissat (1996) Biochem. J. 316:695-696; Henrissat (2000) Plant Physiology 124:1515-1519. Existem 87 famílias identificadas de hidrolases de glicosidase. Em um aspecto, as xilanases da invenção podem ser classificadas em famílias 8, 10, 11, 26 e 30. Em um aspecto, a invenção também fornece ácidos nucléicos que codificam xilanase com uma novidade em comum pelo fato de que eles são derivados de uma família comum, por exemplo, família 5, 6, 8, 10, 11, 26 ou 30, como descrito na Tabela 5, abaixo.
Tabela 5
SEQ ID
FAMÍLIA
9, 10 8
1, 2 8
5, 6 8
7, 8 8
99, 100 10
11, 12 10
127, 128 10
27, 28 10
97, 98 10
45, 46 10
141, 142 10
107, 108 10
129, 130 10
93, 94 10
63, 64 10
25, 26 10
49, 50 10
67, 68 10
85, 86 10
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285/510
Tabela 5
SEQ ID
29, 30 51,52 35, 36 147, 148 119, 120 123, 124 249, 250 149, 150 83, 84 43, 44 133, 134 113, 114 105, 106 75, 76 111, 112 117, 118 115, 116 125, 126 137, 138 135, 136 69, 70 89, 90 31, 32 13, 14 65, 66 57, 58 77, 78 73, 74 109, 110
FAMÍLIA
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286/510
Tabela 5
SEQ ID
59, 60 71, 72 139, 140 55, 56 15, 16 131, 132 95, 96 101, 102 39, 40 143, 144 103, 104 17, 18 53, 54 21, 22 151, 152 23, 24 121, 122 41, 42 47, 48 247, 248 33, 34 19, 20 87, 88 81, 82 91, 92 61, 62 37, 38 79, 80 231, 232
FAMÍLIA
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287/510
Tabela 5
FAMÍLIA
SEQ ID
157, 158 11
189, 190 11
167, 168 11
207, 208 11
251, 252 11
213, 214 11
177, 178 11
187, 188 11
205, 206 11
211, 212 11
197, 198 11
209, 210 11
185, 186 11
229, 230 11
223, 224 11
179, 180 11
193, 194 11
173, 174 11
217, 218 11
153, 154 11
219, 220 11
183, 184 11
253, 254 11
199, 200 11
255, 256 11
155, 156 11
169, 170 11
195, 196 11
215, 216 11
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288/510
Tabela 5
SEQ ID
191, 192 175, 176 161, 162 221, 222 225, 226 163, 164 159, 160 233, 234 171, 172 203, 204 181, 182 227, 228 165, 166 257, 258 237, 238 241, 242 239, 240 245, 246 235, 236 313, 314 345, 346 321, 322 323, 324 315, 316 201, 202 265, 266 145, 146 287, 288 293, 294
FAMÍLIA
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 294/525
289/510
Tabela 5
SEQ ID FAMÍLIA
351,352 10
311,312 10
279, 280 10
289, 290 10
283, 284 10
373, 374 10
337, 338 10
371, 372 10
291, 292 10
3, 4 10
307, 308 10
343, 344 10
349, 350 10
329, 330 10
355, 356 10
339, 340 10
295, 296 10
333, 334 10
281, 282 10
361, 362 10
347, 348 10
319, 320 10
357, 358 10
365, 366 10
273, 274 10
277, 278 10
271, 272 10
285, 286 10
259, 260 10
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290/510
Tabela 5
SEQ ID FAMÍLIA
325, 326 10
331, 332 10
359, 360 10
303, 304 10
363, 364 10
305, 306 10
341, 342 10
375, 376 11
377, 378 11
379, 380 11
301, 302 11
309, 310 11
263, 264 11
269, 270 11
353, 354 11
299, 300 11
367, 368 11
261, 262 11
369, 370 11
267, 268 11
317, 318 11
297, 298 11
327, 328 5
275, 276 6
[00551] Um polipeptídeo híbrido que resulta de um método da invenção pode exibir atividade de enzima especializada não apresentada nas enzimas originais. Por exemplo, depois de recombinação e/ou reclassificação redutiva de polinucleotídeos que codificam atividades de hidrolase, o polipeptídeo híbrido resultante codificado por um poliPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 296/525
291/510 nucleotídeo híbrido pode ser rastreado para atividades de hidrolase especializadas obtidas a partir de cada uma das enzimas originais, isto é, o tipo de ligação na qual a hidrolase age e a temperatura na qual a hidrolase funciona. Assim, por exemplo, a hidrolase pode ser rastreada para verificar aquelas funcionalidades químicas que distinguem a hidrolase híbrida das hidrolases originais, tais como: (a) amida (ligações peptídicas), isto é, xilanases; (b) ligações de éster, isto é, estearases e lipases; (c) acetais, isto é, glicosidases e, por exemplo, a temperatura, pH ou concentração de sal nas quais o polipeptídeo híbrido funciona. [00552] Fontes dos polinucleotídeos originais podem ser isoladas de organismos individuais (“isolados”), coleções de organismos que tenham crescido em meios definidos (“culturas de enriquecimento”) ou organismos não cultivados (“amostras ambientais”). O uso de uma abordagem independente de cultura para derivar polinucleotídeos que codificam novas bioatividades a partir de amostras ambientais é mais preferível desde que ela permita avaliar recursos de biodiversidade não explorados.
[00553] “Bibliotecas ambientais” são geradas a partir de amostras ambientais e representam os genomas coletivos de organismos que ocorrem naturalmente arquivados em vetores de clonagem que podem ser propagados em hospedeiros procarióticos adequados. Como o DNA clonado é inicialmente extraído diretamente de amostras ambientais, as bibliotecas não são limitadas à pequena fração de procariotos que podem ser cultivados em cultura pura. Além disso, uma normalização do DNA ambiental presente nessas amostras pode permitir uma representação mais idêntica do DNA de todas as espécies presentes na amostra original. Isso pode aumentar dramaticamente a eficiência de descoberta de genes interessantes a partir dos constituintes secundários da amostra que podem estar sub-representados em várias ordens de magnitude comparados com as espécies dominantes.
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292/510 [00554] Por exemplo, bibliotecas de genes geradas a partir de um ou mais microrganismos não cultivados são rastreadas para uma atividade de interesse. Vias potenciais que codificam moléculas bioativas de interesse são capturadas primeiro em células procarióticas na forma de bibliotecas de expressão de gene. Polinucleotídeos que codificam atividades de interesse são isolados de tais bibliotecas e introduzidos em uma célula hospedeira. A célula hospedeira é cultivada sob condições que promovem a recombinação e/ou a reclassificação redutiva criando biomoléculas potencialmente ativas com atividades novas ou intensificadas.
[00555] Além disso, a subclonagem pode ser realizada para isolar sequências de interesse. Na subclonagem, uma porção de DNA é amplificada, digerida, geralmente por enzimas de restrição, para cortar a sequência desejada, a sequência desejada é ligada a um vetor receptor e é amplificada. Em cada etapa de subclonagem, a porção é examinada para a atividade de interesse, a fim de assegurar que o DNA que codifica a proteína estrutural não tenha sido excluído. O inserto pode ser purificado em qualquer etapa da subclonagem, por exemplo, por eletroforese em gel antes da ligação em um vetor ou onde células que contêm o vetor receptor e células que não contêm o vetor receptor são colocadas em meios seletivos contendo, por exemplo, um antibiótico que matará as células que não contêm o vetor receptor. Métodos específicos de subclonar insertos de DNA em vetores são bemconhecidos na técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Em outro aspecto, as enzimas da invenção são subclones. Tais subclones podem diferir do clone precursor, por exemplo, pela extensão, uma mutação, um sinalizador ou um marcador.
[00556] Deve ser compreendido que algumas das xilanases da invenção podem ou não conter sequências de sinal. Pode ser desejável
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293/510 incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de sinal de uma xilanase operativamente ligada a uma sequência de ácido nucléico de uma xilanase diferente ou, em um aspecto (opcionalmente), uma sequência de sinal de uma proteína não-xilanase pode ser desejada.
[00557] Os microrganismos a partir dos quais o polinucleotídeo pode ser preparado incluem microrganismos procarióticos, tais como Eubacteria e Archaebacteria e microrganismos eucarióticos inferiores tais como fungos, algumas algas e protozoários. Polinucleotídeos podem ser isolados de amostras ambientais em cujo caso o ácido nucléico pode ser recuperado sem o cultivo de um organismo ou recuperado a partir de um ou mais organismos cultivados. Em um aspecto, tais microrganismos podem ser extremófilos, tais como hipertermófilos, psicrófilos, psicotróficos, halófilos, barófilos e acidófilos. Polinucleotídeos que codificam enzimas isoladas de microrganismos extremofílicos podem ser usados. Tais enzimas podem funcionar em temperaturas acima de 100°C em fontes quentes terrestres e ventos hidrotermais profundos, em temperaturas abaixo de 0°C em águas árticas, no ambiente saturado de sal do Mar Morto, em valores de pH em torno de 0 em depósitos de carvão e fontes geotérmicas ricas em enxofre ou em valores de pH maiores do que 11 em lama de água de esgoto. Por exemplo, várias estearases e lipases clonadas e expressas a partir de organismos extremofílicos mostram alta atividade em de uma ampla faixa de temperaturas e pHs.
[00558] Polinucleotídeos selecionados e isolados como descrito acima são introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira adequada é qualquer célula que é capaz de promover recombinação e/ou reagrupamento redutor. Os polinucleotídeos selecionados já estão preferivelmente em um vetor que inclui sequências de controle apropriadas. A célula hospedeira pode ser uma célula euPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 299/525
294/510 cariótica superior, tal como uma célula de mamífero, ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, ou preferivelmente, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução do construto na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran ou eletroporação (Davis et al., 1986).
[00559] Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tais como levedura; células de inseto, tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais, tais como CHO, COS ou de melanoma de Bowes; adenovírus; e células de plantas. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada estar dentro do escopo daqueles versados na técnica a partir dos ensinamentos aqui contidos.
[00560] Com referência particular aos vários sistemas de cultura de célula de mamífero que podem ser empregados para expressar proteína recombinante, exemplos de sistema de expressão de mamífero incluem as linhagens COS-7 de fibroblasto de rim de macaco, descritas em “SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman, 1981) e outras linhagens celulares capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo, as linhagens celulares C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Vetores de expressão em mamífero compreenderão uma origem de replicação, um promotor e intensificador adequados e também quaisquer sítios de ligação a ribossomo necessários, sítio de poliadenilação, sítios doador e aceptor de splice, sequências de terminação traducional e sequências 5' flanqueadoras não traduzidas. As sequências de DNA derivadas de sítios de Splice e poliadenilação de SV40 podem ser usadas para fornecer os elementos genéticos não transcritos necessários.
[00561] Em outro aspecto, pretende-se que o método da presente
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295/510 invenção possa ser usado para gerar novos polinucleotídeos que codificam vias bioquímicas de um ou mais óperons ou clusters de genes ou porções desses. Por exemplo, bactérias e vários eucariotos apresentam um mecanismo coordenado para regulação de genes cujos produtos estão envolvidos em processos relacionados. Os genes são agrupados em estruturas referidas como “clusters de gene” sobre um único cromossomo e são transcritos juntos sob o controle de uma única sequência regulatória, incluindo um único promotor que inicia a transcrição do cluster inteiro. Assim um cluster de gene é um grupo de genes adjacentes que são idênticos ou relacionados, geralmente devido às suas funções. Um exemplo de uma via bioquímica codificada por clusters de gene são policetídeos.
[00562] O DNA do cluster de gene pode ser isolado de diferentes organismos e ligado em vetores, particularmente vetores que contêm sequências regulatórias de expressão que podem controlar e regular a produção de uma proteína detectável ou a atividade de um arranjo relacionado a proteína dos clusters de gene ligados. O uso de vetores que tem uma capacidade excepcionalmente grande para introdução de DNA exógeno é particularmente apropriado para uso com tais clusters de gene e está descrito por meio de exemplo aqui para incluir o fator f (ou fator de fertilidade) de E. coli. Esse fator f de E. coli é um plasmídeo que afeta a sua própria transferência de alta freqüência durante a conjugação e é ideal para se obter e propagar estavelmente grandes fragmentos de DNA, tais como clusters de gene de amostras microbianas mistas. Um aspecto da invenção é usar vetores de clonagem, referidos como “fosmídeos” ou vetores de cromossomo bacteriano artificial (BAC). Esses são derivados do fator f de E coli que é capaz de integrar estavelmente grandes segmentos de DNA genômico. Quando integrados com DNA de uma amostra ambiental não cultivada mista, isso torna possível se obter grandes fragmentos genômicos na forma
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296/510 de uma “biblioteca de DNA ambiental” estável. Outro tipo de vetor para uso no presente invenção é um vetor de cosmídeo. Vetores de cosmídeos foram originalmente designados para clonar e propagar grandes segmentos de DNA genômico. A clonagem em vetores de cosmídeos está descrita em detalhes em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Uma vez ligados em um vetor apropriado, dois ou mais vetores contendo diferentes clusters de gene de policetídeo sintase podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Regiões de homologia parcial de sequência partilhadas pelos clusters de gene promoverão processos que resultam em reorganização de sequência resultando em um híbrido do cluster de gene. O novo cluster de gene híbrido pode então ser rastreado quanto as atividades intensificadas não encontradas nos clusters de gene originais.
[00563] Portanto, em um aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um polipeptídeo híbrido biologicamente ativo e rastrear tal polipeptídeo quanto a atividade intensificada por:
1) introduzir pelo menos um primeiro polinucleotídeo em ligação operativa e um segundo polinucleotídeo em ligação operativa, o pelo menos primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo partilhando pelo menos uma região de homologia parcial de sequência, em uma célula hospedeira adequada;
2) cultivar a célula hospedeira sob condições que promovam a reorganização da sequência resultando em um polinucleotídeo híbrido em ligação operativa;
3) expressar o polipeptídeo híbrido codificado pelo polinucleotídeo híbrido;
4) rastrear o polipeptídeo híbrido sob condições que promovam identificação de atividade biológica aumentada; e
5) isolar o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo híbriPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 302/525
297/510 do.
[00564] Métodos para rastrear várias atividades enzimáticas são conhecidos daqueles versados na técnica e são discutidos ao longo do presente pedido. Tais métodos podem ser empregados quando isolar os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção.
METODOLOGIAS DE RASTREAMENTO E EQUIPAMENTOS DE
MONITORAMENTO “ON-LINE” [00565] Na prática dos métodos da invenção, uma variedade de aparelhos e metodologias podem ser usados para, em conjunto com os polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, rastrear polipeptídeos quanto a atividade de xilanase (por exemplo, ensaios tais como hidrólise de caseína em zimogramas, a liberação de fluorescência da gelatina, ou a liberação de p-nitroanilida de vários substratos de peptídeos pequenos), rastrear compostos como moduladores em potencial, por exemplo, ativadores ou inibidores, de uma atividade de xilanase, para anticorpos que se ligam a um polipeptídeo da invenção, para ácidos nucléicos que hibridizam a um ácido nucléico da invenção, para rastrear células que expressam um polipeptídeo da invenção e semelhantes. Além da estrutura de arranjo descrita com detalhes abaixo para o rastreamento de amostras, estruturas alternativas podem ser usadas para praticar os métodos da invenção. Tais estruturas incluem, por exemplo, espectrômetros de massa, cromatógrafos, por exemplo, HPLC de alto rendimento e outras formas de cromatografia líquida e estruturas menores, tais como placas de 1536 cavidades, placas de 384 cavidades e assim por diante. Aparelhos de rastreamento de alto rendimento podem ser adaptados e usados para praticar os métodos da invenção, veja por exemplo, Pedido de Patente U.S. N° 20020001809.
Arranjos Capilares [00566] Ácidos nucléicos ou polipeptídeos da invenção podem ser
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298/510 imobilizados ou aplicados a um arranjo. Arranjos podem ser usados para rastrear ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) quanto a sua habilidade de se ligar ou modular a atividade de um ácido nucléico ou polipeptídeo da invenção. Arranjos capilares, tais como GIGAMATRIX™, Diversa Corporation, San Diego, CA; e arranjos descritos, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. N° 20020080350 A1; WO 0231203 A; WO 0244336 A, fornecem um equipamento alternativo para conter e rastrear amostras. Em um aspecto, o arranjo capilar inclui uma pluralidade de capilares formados em um arranjo de capilares adjacentes, em que cada capilar compreende pelo menos uma parede que define uma cavidade para reter a amostra. A cavidade pode ser cilíndrica, quadrada, hexagonal ou de qualquer outra forma geométrica desde que as paredes formem uma cavidade para retenção de um líquido ou amostra. Os capilares do arranjo capilar podem ser mantidos juntos em estreita proximidade para formar uma estrutura plana. Os capilares podem estar ligados juntos, por estarem fundidos (por exemplo, onde os capilares são feitos de vidro), colados, ligados ou grampeados lado a lado. Além disso, o arranjo capilar pode incluir material intersticial disposto entre capilares adjacentes no arranjo, formando dessa maneira um dispositivo sólido plano que contém uma pluralidade de orifícios.
[00567] Um arranjo capilar pode ser formado por qualquer número de capilares individuais, por exemplo, uma faixa de 100 a 4.000.000 de capilares. Além disso, um arranjo capilar que tem cerca de 100.000 ou mais capilares individuais pode ser formado no tamanho padronizado e na forma de uma placa de Microtiter® para equipar um equipamento de laboratório padronizado. As cavidades são preenchidas manualmente ou automaticamente usando a ação capilar ou microinjeção usando uma agulha fina. As amostras de interesse podem ser subsePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 304/525
299/510 qüentemente removidas dos capilares individuais para análise e caracterização posteriores. Por exemplo, uma sonda fina semelhante a uma agulha é posicionada no fluido de comunicação com um capilar selecionado para adicionar ou retirar material da cavidade.
[00568] Em um ensaio de rastreamento com recipiente único, os componentes do ensaio são misturados rendendo uma solução de interesse, antes da inserção no arranjo capilar. A cavidade é preenchida por ação capilar quando pelo menos uma porção do arranjo é imersa em uma solução de interesse. Reações e/ou atividades químicas ou biológicas são monitoradas quanto a eventos detectáveis. Um evento detectável é geralmente referido como um “hit”, que pode ser geralmente distinguido de capilares que não produzem “hit” por detecção óptica. Assim, arranjos capilares permitem grande detecção paralela de “hits”.
[00569] Em um ensaio de rastreamento de múltiplos recipientes, um polipeptídeo ou ácido nucléico, por exemplo, um ligante, pode ser introduzido em um primeiro componente, que é introduzido em pelo menos uma porção de um capilar de um arranjo capilar. Uma bolha de ar pode então ser introduzida no capilar atrás do primeiro componente. Um segundo componente pode então ser introduzido no capilar, onde o segundo componente é separado do primeiro componente pela bolha de ar. O primeiro e segundo componentes podem então ser misturados pela aplicação de pressão hidrostática em ambos os lados do arranjo capilar para desintegrar a bolha. O arranjo capilar é então monitorizado quanto a um evento detectável que resulta de reação ou não reação dos dois componentes.
[00570] Em um ensaio de rastreamento de ligação, uma amostra de interesse pode ser introduzida como um primeiro líquido marcado com uma partícula detectável em um capilar de um arranjo capilar, no qual a cavidade do capilar é revestida com um material ligante para a ligaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 305/525
300/510 ção da partícula detectável com a cavidade. O primeiro líquido pode então ser removido do tubo capilar, no qual a partícula detectável ligada é mantida dentro do capilar, e um segundo líquido é introduzido no tubo capilar. O capilar é então monitorado quanto a um evento detectável que resulta de reação ou não reação da partícula com o segundo líquido.
Arranjos ou “Biochips” [00571] Ácidos nucléicos e/ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados ou aplicados a um arranjo, por exemplo, um “biochip”. Arranjos podem ser usados para rastrear ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) quanto as suas habilidades de se ligar ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, em um aspecto da invenção, um parâmetro monitorizado é a expressão transcrita de um gene de xilanase. Um ou mais, ou todos os transcritos de uma célula podem ser medidos pela hibridização de uma amostra que compreende transcritos da célula ou ácidos nucléicos representativos ou complementares a transcritos de uma célula, pela hibridização com ácidos nucléicos imobilizados sobre um arranjo ou “biochip”. Pelo uso de um “arranjo” de ácidos nucléicos sobre um microchip, alguns ou todos os transcritos de uma célula podem ser simultaneamente quantificados. Alternativamente, arranjos que compreendem ácido nucléico genômico também podem ser usados para determinar o genótipo de uma cepa recentemente manipulada feita pelos métodos da invenção. “Arranjos” de polipeptídeo também podem ser usados para quantificar simultaneamente uma pluralidade de proteínas. A presente invenção pode ser praticada com qualquer “arranjo” conhecido, também referido como um “microarranjo” ou “arranjo de ácido nucléico” ou “arranjo de polipeptídeo” ou “arranjo de anticorpo” ou “biochip” ou variação desses. Arranjos são genericamente uma pluralidade de
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301/510 “pontos” ou “elementos alvos”, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de uma ou mais moléculas biológicas, por exemplo, oligonucleotídeos, imobilizadas sobre uma área definida de uma superfície de substrato para ligação específica com uma molécula da amostra, por exemplo, transcritos de mRNA.
[00572] Os termos “arranjo” ou “microarranjo” ou “biochip” ou “chip” como usados aqui são uma pluralidade de elementos alvos, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de um ou mais polipeptídeos (incluindo anticorpos) ou ácidos nucléicos imobilizados sobre uma área definida de uma superfície de substrato, como discutido em maiores detalhes abaixo.
[00573] Na prática dos métodos da invenção, qualquer arranjo conhecido e/ou método de fazer ou usar arranjos pode ser incorporado no todo ou em parte, ou variações desses, como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.965.452; 5.959.098; 5.856.174; 5.830.645; 5.770.456; 5.632.957; 5.556.752; 5.143.854; 5.807.522; 5.800.992; 5.744.305; 5.700.637; 5.556.752; 5.434.049; veja também, por exemplo, WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; veja também, por exemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; SolinasToldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32. Veja também pedidos de patente U.S. Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322;
20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765. ANTICORPOS E MÉTODOS DE RASTREAMENTO BASEADOS EM
ANTICORPOS [00574] A invenção fornece anticorpos isolados, sintéticos ou recombinantes que se ligam especificamente a uma xilanase da invenPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 307/525
302/510 ção. Esses anticorpos podem ser usados para isolar, identificar ou quantificar as xilanases da invenção ou polipeptídeos relacionados. Esses anticorpos podem ser usados para isolar outros peptídeos dentro do escopo da invenção ou outras xilanases relacionadas. Os anticorpos podem ser designados para se ligar a um sítio ativo de uma xilanase. Assim, a invenção fornece métodos para inibir xilanases usando os anticorpos da invenção (veja discussão acima com relação a aplicações para as composições antixilanase da invenção).
[00575] A invenção fornece fragmentos de enzimas da invenção, incluindo fragmentos imunogênicos de um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece composições que compreendem um polipeptídeo ou peptídeo da invenção e adjuvantes ou veículos e semelhantes.
[00576] Os anticorpos podem ser usados em imunoprecipitação, coloração, colunas de imunoafinidade e semelhantes. Se desejado, sequências de ácido nucléico que codificam antígenos específicos podem ser geradas pela imunização seguida de isolamento de polipeptídeo ou ácido nucléico, amplificação ou clonagem e imobilização de polipeptídeo em um arranjo da invenção. Alternativamente, os métodos da invenção podem ser usados para modificar a estrutura de um anticorpo produzido por uma célula modificada, por exemplo, a afinidade de um anticorpo pode ser aumentada ou diminuída. Além disso, a habilidade para fazer ou modificar anticorpos pode ser uma manipulação de fenótipo em uma célula pelos métodos da invenção.
[00577] O termo “anticorpo” inclui um peptídeo ou polipeptídeo derivado dele, modelado por, ou substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina ou fragmentos desses, capaz de se ligar especificamente a um antígeno ou epitopo, veja, por exemplo, Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. O termo
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303/510 anticorpo inclui porções que se ligam ao antígeno, isto é, “sítios de ligação ao antígeno” (por exemplo, fragmentos, subsequências e regiões determinantes de complementaridade (CDRs)) que retêm a capacidade de ligação ao antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios de VL, VH, CH e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios de VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios de VL e VH de um braço único de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio de VH e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Anticorpos de cadeias simples também estão incluídos pela referência no termo “anticorpo”.
[00578] Métodos de imunização, produção e isolamento de anticorpos (policlonal e monoclonal) são conhecidos daqueles versados na técnica e descritos na literatura científica e de patente, veja, por exemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, Nova Iorque, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque. Anticorpos também podem ser gerados in vitro, por exemplo, usando bibliotecas de apresentação em fago que expressam sítio de ligação de anticorpo recombinante, além dos métodos tradicionais in vivo usando animais. Veja, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.
[00579] Os polipeptídeos da invenção ou fragmentos que comprePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 309/525
304/510 endem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desses, também podem ser usados para gerar anticorpos que se ligam especificamente aos polipeptídeos ou fragmentos. Os anticorpos resultantes podem ser usados em procedimentos de cromatografia por afinidade para isolar ou purificar o polipeptídeo ou para determinar se o polipeptídeo está presente em uma amostra biológica. Em tais procedimentos, uma preparação de proteína, tal como um extrato ou uma amostra biológica, é contatada com um anticorpo capaz de se ligar especificamente a um dos polipeptídeos da invenção ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desses.
[00580] Em procedimentos de imunoafinidade, o anticorpo é acoplado a um suporte sólido, tal como uma esfera ou outra matriz de coluna. A preparação de proteína é colocada em contato com o anticorpo sob condições nas quais o anticorpo se liga especificamente a um dos polipeptídeos da invenção ou fragmento desse. Após uma lavagem para remover proteínas não especificamente ligadas, os polipeptídeos especificamente ligados são eluídos.
[00581] A habilidade de proteínas em uma amostra biológica se ligarem a um anticorpo pode ser determinada usando qualquer um de uma variedade de procedimentos familiares àqueles versados na técnica. Por exemplo, a ligação pode ser determinada pela marcação do anticorpo com um marcador detectável, tal como um agente fluorescente, um marcador enzimático ou um radioisótopo. Alternativamente, a ligação do anticorpo com a amostra pode ser detectada usando um anticorpo secundário que tem tal marcador detectável sobre ele. Ensaios particulares incluem ensaios ELISA, ensaios sanduíche, radioimunoensaios e Western Blots.
[00582] Anticorpos policlonais gerados contra os polipeptídeos da
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305/510 invenção ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 ou mais aminoácidos consecutivos desses podem ser obtidos pela injeção direta dos polipeptídeos em um animal ou pela administração do polipeptídeos a um animal, por exemplo, um não humano. O anticorpo assim obtido então se ligará ao próprio polipeptídeo. Dessa maneira, até uma sequência que codifica apenas um fragmento do polipeptídeo pode ser usada para gerar anticorpos que se ligam ao polipeptídeo nativo completo. Tais anticorpos podem então ser usados para isolar o polipeptídeo das células que expressam aquele polipeptídeo.
[00583] Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que forneça anticorpos produzidos por culturas de linhagens celulares contínuas pode ser usada. Exemplos incluem a técnica do hibridoma Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497, 1975), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
[00584] As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente U.S. N° 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única para os polipeptídeos da invenção ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desses. Alternativamente, camundongos transgênicos podem ser usados para expressar anticorpos humanizados para esses polipeptídeos ou fragmentos desses.
[00585] Anticorpos gerados contra os polipeptídeos da invenção ou fragmentos que compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos desses podem ser usados para rastrear polipeptídeos similares de outros organismos e
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306/510 amostras. Em tais técnicas, polipeptídeos do organismo são contatados com o anticorpo e aqueles polipeptídeos que se ligam especificamente com o anticorpo são detectados. Qualquer um dos procedimentos descritos acima pode ser utilizado para detectar ligação ao anticorpo. Um de tais ensaios de rastreamento está descrito em “Methods for Measuring Cellulase Activities”, Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116.
KITS [00586] A invenção fornece kits que compreendem as composições, por exemplo, ácidos nucléicos, cassetes de expressão, vetores, células, plantas ou sementes transgênicas ou partes de planta, polipeptídeos (por exemplo, xilanases) e/ou anticorpos da invenção. Os kits também podem conter material instrutivo que ensina as metodologias e aplicações e processos industriais, de pesquisa, médicas, farmacêuticas, de alimentação e nutrição e processamento de suplemento alimentício e nutricional e outras aplicações e processos da invenção como descritos nesses.
MANIPULAÇÃO DE CÉLULA ÍNTEGRA E MEDIDA DE PARÂMETROS METABÓLICOS [00587] Os métodos da invenção fornecem ao desenvolvimento de célula íntegra, ou manipulação da célula íntegra, de uma célula para desenvolver uma nova linhagem celular que tem um novo fenótipo, por exemplo, uma atividade de xilanase nova ou modificada, pela modificação da composição genética da célula. A composição genética pode ser modificada pela adição à célula de um ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma sequência codificante de uma enzima da invenção. Veja, por exemplo, WO0229032; WO0196551.
[00588] Para detectar o novo fenótipo, pelo menos um parâmetro metabólico de uma célula modificada é monitorado na célula em um período em “tempo real” ou “on line”. Em um aspecto, uma pluralidade
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307/510 de células, tais como uma cultura de células, é monitorizada em “tempo real” ou “on line”. Em um aspecto, uma pluralidade de parâmetros metabólicos é monitorizada em “tempo real” ou “on line”. Parâmetros metabólicos podem ser monitorizados usando as xilanases da invenção.
[00589] A análise de fluxo metabólico (MFA) é baseada em um sistema bioquímico conhecido. Uma matriz metabólica linearmente independente é construída com base na lei da conservação das massas e na hipótese do pseudo-estado estacionário (PSSH) dos metabólitos intracelulares. Na prática dos métodos da invenção, são estabelecidas redes metabólicas incluindo a:
• identidade de todos substratos, produtos e metabólitos intermediários das vias • identidade de todas as reações químicas que interconvertem os metabólitos da via, a estequiometria das reações da vias, • identidade de todas as enzimas que catalisam as reações, a cinética da reação enzimática, • as interações regulatórias entre os componentes da via, por exemplo, interações alostéricas, interações enzima-enzima, etc., • compartimentalização intracelular de enzimas ou de qualquer outra organização supramolecular das enzimas, e, • a presença de qualquer gradiente de concentração de metabólitos, enzimas ou moléculas efetoras ou barreiras de difusão aos seus movimentos.
[00590] Uma vez que a rede metabólica para uma dada linhagem é estabelecida, a apresentação matemática pela noção de matriz pode ser introduzida para estimar os fluxos metabólicos intracelulares se os dados do metaboloma on-line estiverem disponíveis. Fenótipo metabólico depende das alterações da rede metabólica completa dentro de uma célula. Fenótipo metabólico depende da alteração de utilização da
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308/510 via com relação a condições ambientais, regulação genética, estado de desenvolvimento e o genótipo, etc. Em um aspecto dos métodos da invenção, após o cálculo de MFA on-line, o comportamento dinâmico das células, seus fenótipos e outras propriedades são analisadas pela investigação da utilização da via. Por exemplo, se o suprimento de glicose está aumentado e o oxigênio diminuído durante a fermentação de levedura, a utilização de vias respiratórias estará reduzida e/ou paralisada e a utilização de vias fermentativas dominará. O controle do estado físico de culturas celulares se tornará possível após a análise da via. Os métodos da invenção podem ajudar a determinar como manipular a fermentação pela determinação de como alterar o suprimento de substrato, temperatura, uso de indutores, etc, para controlar o estado fisiológico das células que mudam para a direção desejada. Na prática dos métodos da invenção, os resultados de MFA também podem ser comparados com os dados de transcriptoma e proteoma para designar experimentos e protocolos para manipulação genética ou embaralhamento de gene, etc.
[00591] Na prática dos métodos da invenção, qualquer fenótipo modificado ou novo pode ser conferido e detectado, incluindo características novas ou melhoradas na célula. Qualquer aspecto do metabolismo ou crescimento pode ser monitorizado.
Monitoramento da expressão de um transcrito de mRNA [00592] Em um aspecto da invenção, o fenótipo manipulado compreende aumentar ou diminuir a expressão de um transcrito de mRNA (por exemplo, uma mensagem de xilanase) ou gerar novos transcritos em uma célula (por exemplo, uma xilanase). Essa expressão aumentada ou diminuída pode ser rastreada testando a presença de uma xilanase da invenção ou pelos ensaios de atividade de xilanase. Transcritos de mRNA ou mensagens também podem ser detectados e quantificados por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por
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309/510 exemplo, Northern blots, reações de amplificação quantitativa, hibridização a arranjos e semelhantes. Reações de amplificação quantitativa incluem, por exemplo, PCR quantitativo, incluindo, por exemplo, reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa ou RT-PCR; RT-PCR quantitativo em tempo real ou “RT-PCR cinético em tempo real” (veja, por exemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914).
[00593] Em um aspecto da invenção, o fenótipo manipulado é gerado por nocautear (knocking out) a expressão de um gene homólogo. A sequência que codifica o gene ou um ou mais elementos de controle transcricional pode ser nocauteada, por exemplo, promotores ou intensificadores. Assim, a expressão do transcrito pode ser completamente abolida ou apenas diminuída.
[00594] Em um aspecto da invenção, o fenótipo manipulado compreende aumentar a expressão de um gene homólogo. Isso pode ser efetuado pelo nocaute de um elemento de controle negativo, incluindo um elemento regulatório transcricional cis- ou trans-atuante ou mutagenizando um elemento de controle positivo. Um ou mais ou todos os transcritos de uma célula podem ser medidos pela hibridização de uma amostra que compreende transcritos da célula ou ácidos nucléicos representativos ou complementares aos transcritos de uma célula, pela hibridização com ácidos nucléicos imobilizados sobre um arranjo. Monitorando a expressão de polipeptídeos, peptídeos e aminoácidos [00595] Em um aspecto da invenção, o fenótipo manipulado compreende aumentar ou diminuir a expressão de um polipeptídeo (por exemplo, uma xilanase) ou gerar novos polipeptídeos em uma célula. Essa expressão aumentada ou diminuída pode ser rastreada pela determinação da quantidade de xilanase presente ou por ensaios de atividade de xilanase. Polipeptídeos, peptídeos e aminoácidos podem ser detectados e quantificados por qualquer método conhecido na técnica,
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310/510 incluindo, por exemplo ressonância magnética nuclear (RMN), espectrofotometria, radiografia (radiomarcação de proteína), eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia em camada delgada (TLC), cromatografia de hiperdifusão, vários métodos imunológicos, por exemplo, imunoprecipitação, imunodifusão, imuno-eletroforese, radioimunoensaios (RIAs), ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imunofluorescentes, eletroforese em gel (por exemplo, SDS-PAGE), coloração com anticorpos, citometria de fluxo (FACS), pirólise, espectrometria de massa, Espectrometria com Infravermelho Transformada de Fourier, Espectroscopia de Raman, GC-MS, LC-Electrospray e espectrometrias de massa cap-LC-tandem-electrospray e semelhantes. Novas bioatividades também podem ser rastreadas usando métodos, ou variações desses, descritos nas Patente U.S. N° 6.057.103. Além disso, como discutido abaixo em detalhes, um ou mais ou todos os polipeptídeos de uma célula podem ser medidos usando um arranjo de proteína.
APLICAÇÕES INDUSTRIAIS, ENERGIA, FARMACÊUTICAS, MÉDICAS, PROCESSAMENTO DE ALIMENTOS E OUTRAS APLICAÇÕES [00596] Polipeptídeos da invenção podem ser usados em qualquer processo industrial, agrícola, alimentício e nutricional e processamento de suplemento nutricional, farmacêutico, médico, de pesquisa (laboratório) e outros processos. A invenção fornece processos industriais que usam enzimas da invenção, por exemplo, na indústria farmacêutica ou de suplemento nutricional (dietético), na indústria de energia (por exemplo, para fazer biocombustíveis “limpos”), nas indústrias alimentícia e nutricional, por exemplo, em métodos para fazer alimentos e produtos nutricionais e aditivos alimentícios e nutricionais. Em um aspecto, a invenção fornece processos que usam enzimas da invenção na indústria médica, por exemplo, para fazer farmacêuticos e auxiliares
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311/510 ou suplementos dietéticos ou suplementos e aditivos alimentícios. Além disso, a invenção fornece métodos para usar as enzimas da invenção na produção de biocombustível, incluindo, por exemplo, um bioálcool, tal como bioetanol, biometanol, biobutanol ou biopropanol, compreendendo assim uma produção de combustível “limpo”.
[00597] As enzimas xilanases da invenção podem ser catalisadores altamente seletivos. Elas podem catalisar reações com estéreo-, régio e quimio-seletividades excelentes que são inigualáveis na química sintética convencional. Além disso, as enzimas são acentuadamente versáteis. As enzimas xilanases da invenção podem ser adaptadas para funcionar em solventes orgânicos, operar em pHs extremos (por exemplo, pHs altos e pHs baixos), temperaturas extremas (por exemplo, temperaturas altas e temperaturas baixas), níveis extremos de salinidade (por exemplo, salinidade alta e salinidade baixa) e catalisar reações com compostos que não são estruturalmente relacionados com seus substratos naturais, fisiológicos.
Tratamentos de madeira, papel e polpa [00598] As xilanases da invenção podem ser usadas em qualquer tratamento ou processo industrial de madeira, produto de madeira, resíduo ou subproduto de madeira, papel, produto de papel polpa de papel, ou madeira, polpa Kraft ou reciclagem de madeira ou papel, por exemplo, qualquer madeira, polpa de madeira, resíduo de papel, tratamento de papel ou polpa ou processo de descolororação de madeira ou papel. Em um aspecto, xilanases da invenção podem ser usadas para tratar/pré-tratar polpa de papel ou papel reciclado ou polpa de papel e semelhantes. Em um aspecto, enzimas da invenção são usadas para aumentar a “alvura” do papel através do seu uso no tratamento/pré-tratamento de polpa de papel ou papel ou polpa de papel reciclados e semelhantes. Quanto maior o grau do papel, maior a alvura; a alvura do papel pode influenciar a capacidade rastreadora do
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312/510 equipamento de rastreamento óptico; assim as enzimas e processos da invenção podem ser usadas para fazer papel de alto grau, “alvo” para, por exemplo, uso em equipamento de rastreamento óptico, incluindo papel de qualidade para impressão a jato de tinta, laser e fotográfica.
[00599] Por exemplo, as enzimas da invenção podem ser usadas em qualquer processo industrial que use as xilanases conhecidas na técnica, por exemplo, tratamento de resíduo de papel, como descrito, por exemplo em USPN 6.767.728 ou 6.426.200; secagem de madeira, por exemplo, para aplicações na indústria alimentícia, como descrito, por exemplo, na USPN 6.623.953; para a produção de xilose a partir de polpa de papel de fibras curtas, como descrito, por exemplo em USPN 6.512.110; tratamento de material bruto lignocelulósico fibroso com uma xilanase em um meio aquoso, como descrito, por exemplo em USPN 6.287.708; dissolver polpa de fibra de celulose, como descrito, por exemplo em USPN 6.254.722; remover tinta e descolorir um papel impresso ou remover a cor de polpa de madeira, como descrito, por exemplo em USPN 6.241.849, 5.834.301 ou 5.582.681; alvejante de polpa química de papel ou polpa de lignocelulose usando uma xilanase, como descrito, por exemplo em USPN 5.645.686 ou 5.618.386; para o tratamento de polpa de madeira que inclui polpa marrom incompletamente lavada, como descrito, por exemplo em USPN 5.591.304; purificar e deslignificar um material residual lignocelulósico, como descrito, por exemplo em USPN 5.503.709; produzir papel ou papelão a partir de fibras de celulose recicladas, como descrito, por exemplo em USPN 5.110.412; retirada de lenha, como descrito, por exemplo em USPN 5.103.883; produzir polpa macia com propriedades de trituração melhorada, como descrito, por exemplo em USPN 5.068.009 e semelhantes. As xilanases da invenção podem ser usadas para processar ou tratar qualquer material celulósico, por exemplo, fiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 318/525
313/510 bras de madeira, algodão, cânhamo, linho ou feito de linho.
[00600] Em um aspecto, a invenção fornece processos de tratamento de madeira, polpa de madeira, papel, polpa de papel, resíduo de papel ou madeira ou reciclagem de papel usando uma xilanase da invenção. Em um aspecto, a xilanase da invenção é aplicável para a redução da necessidade de um agente de alvejamento químico, tal como dióxido de cloro (veja, por exemplo, Exemplo 6 abaixo), e em ambientes com alcalinidade alta e alta temperatura. A maior parte da lignina é solubilizada no estágio de cozimento do processo de formação de polpa. A lignina residual é removida da polpa no processo de alvejante. Em um aspecto, o alvejante da polpa com xilanase (por exemplo, usando uma enzima da invenção) é baseado na hidrólise parcial do xilano, que é o componente principal da hemicelulose. A ação enzimática (por exemplo, de uma enzima da invenção) libera a lignina ligada à hemicelulose e aumenta a capacidade de extração de lignina da polpa no processo de alvejante subseqüente, por exemplo, usando químicos de cloro e oxigênio. Em um aspecto, as xilanases da invenção podem ser usadas para aumentar o alvejante final da polpa em um nível determinado de químicos branqueadores. Em outro aspecto, as xilanases da invenção podem ser usadas para diminuir o número kappa da polpa.
[00601] A invenção fornece processos (métodos) de tratamento de madeira, polpa de madeira, polpa de papel, resíduo de papel ou madeira ou reciclagem de papel usando uma xilanase da invenção, onde o tempo de tratamento (a quantidade de tempo em que a xilanase está em contato com a polpa, papel, madeira, etc.) e/ou tempo de retenção pode ser qualquer um entre cerca de 1 minuto a 12 horas ou entre cerca de 5 minutos a 1 hora ou entre cerca de 15 a 30 minutos; ou o tempo de tratamento e/ou de retenção pode ser qualquer período até cerca de 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou
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314/510 mais horas.
[00602] Em um aspecto, a xilanase da invenção é uma endoxilanase alcalina termoestável que em um aspecto pode efetuar mais do que 25% de redução na necessidade de dióxido de cloro para a polpa Kraft com menos do que 0,5% de perda de rendimento da polpa. Em um aspecto, os parâmetros limitantes são pH 10, 65-85°C e tempo de tratamento de menos do que 60 minutos em uma carga de enzima de menos do que 0,001 p%; em aspectos alternativos, o tempo de tratamento e/ou de retenção é menor do que cerca de de 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11ou 12.
[00603] Um grupo de xilanases pode ser testado quanto à habilidade de hidrolisar xilano marcado com corante, por exemplo, em pH 10 e 60°C. As enzimas que são positivas para o teste sob essas condições podem então ser avaliadas, por exemplo, em pH 10 e 70°C. Alternativamente, as enzimas podem ser testadas em pH 8 e pH 10 a 70°C. Na descoberta de xilanases desejáveis na indústria de polpa e papel, bibliotecas de alta temperatura ou ambientes altamente alcalinos foram visados. Especificamente, essas bibliotecas foram rastreadas para o funcionamento de enzimas em pH alcalino e temperatura de aproximadamente 45°C. Em outro aspecto, as xilanases da invenção são úteis na indústria de polpa e papel na degradação de uma ligação lignina-hemicelulose, a fim de liberar a lignina.
[00604] Enzimas da invenção podem ser usadas para remover a tinta de resíduo de papel impresso, tal como jornal, ou para remover a tinta de resíduo de papel impresso sem contato com a tinta, por exemplo, papel impresso a laser ou xerográfico e misturas de resíduo de papel impresso com e sem contato com tinta, como descrito na USPN 6.767.728 ou 6.426.200; Neo (1986) J. Wood Chem. Tech. 6(2):147. Enzimas da invenção podem ser usadas em processos para a produção de xilose a partir de polpa de papel de fibra curta pela extração do
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315/510 xilano contido na polpa em uma fase líquida, submetendo o xilano na fase líquida obtida a condições suficientes para hidrolisar o xilano em xilose e recuperando a xilose, onde a etapa de extração inclui pelo menos um tratamento de uma suspensão aquosa de polpa ou um material solúvel em álcali a uma enzima xilanase, como descrito, por exemplo, na USPN 6.512.110. Enzimas da invenção podem ser usadas em processos para dissolver a polpa de fibras celulósicas tais como produtos de papel reciclado feitos de fibras de madeira duras, uma mistura de fibras de madeira dura e fibras de madeira macia, resíduo de papel, por exemplo, de envelopes não impressos, envelopes com a tinta removida, papel de jornal não impresso, papel de jornal com a tinta removida e semelhantes, como descrito, por exemplo, na USPN 6.254.722.
[00605] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas em qualquer tratamento ou processo industrial de madeira, produto de madeira, papel, produto de papel, polpa de papel ou madeira, polpa Kraft, ou reciclagem de madeira ou papel, por exemplo, qualquer madeira, polpa de madeira, resíduo de papel, tratamento de papel ou polpa ou processo de remoção de tinta de madeira ou papel como um agente antimicrobiano ou repelente microbiano. Alternativamente, as xilanases da invenção podem ser parte de uma composição de madeira, produto de madeira, papel, produto de papel, polpa de papel ou madeira, polpa Kraft ou de papel reciclado e/ou uma composição que compreende uma ou mais composições de madeira, produto de madeira, papel, produto de papel, polpa de papel ou madeira, polpa Kraft ou de papel reciclado, em que as xilanases da invenção atuam como um antimicrobiano ou repelente microbiano na composição.
Tratamento de fibras e têxteis [00606] A invenção fornece métodos para tratar fibras e tecidos
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316/510 usando uma ou mais xilanases da invenção. As xilanases podem ser usadas em qualquer método de tratamento de fibra ou tecido, que são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.261.828; 6.077.316; 6.024.766; 6.021.536; 6.017.751; 5.980.581; Publicação de Patente U.S. N° 20020142438 A1. Por exemplo, as xilanases da invenção podem ser usadas na remoção de goma de fibra e/ou tecido. Em um aspecto, a textura e aparência de um tecido são melhoradas por um método que compreende contatar o tecido com uma xilanase da invenção em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão. Por exemplo, as xilanases da invenção podem ser usadas na remoção de corantes.
[00607] As xilanases da invenção podem ser usadas para tratar qualquer material celulósico, incluindo fibras (por exemplo, fibras de algodão, cânhamo, linho ou feitas de linho), tecidos costurados e não costurados, por exemplo, roupas tricotadas, bordadas, jeans, e atoalhados feitos de algodão, misturas de algodão ou celulósicos naturais ou feitos pelo homem (por exemplo, que se originam de fibras de celulose que contém xilano tais como polpa de madeira) ou misturas desses. Exemplos de misturas são misturas de algodão ou raiom/viscose com um ou mais materiais concomitantes tais como lã, fibras sintéticas (por exemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de álcool polivinílico, fibras de cloreto de polivinila, fibras de cloreto de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliuréia, fibras de aramida) e fibras que contém celulose (por exemplo, raiom/viscose, rami, cânhamo, linho, juta, fibras de acetato de celulose, lyocell). [00608] Os processos de tratamento de têxteis da invenção (usando as xilanases da invenção) podem ser usados em conjunto com outros tratamentos de têxteis, por exemplo, limpeza e alvejante. Limpeza é a remoção de material não-celulósico da fibra de algodão, por exemplo, a cutícula (constituída principalmente por ceras) e parede celular priPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 322/525
317/510 mária (constituída principalmente por pectina, proteína e xiloglicano). A remoção apropriada da cera é necessária para obtenção de alta umidade. Isso é necessário para o tingimento. A remoção de paredes celulares primárias pelos processos da invenção melhora a remoção da cera e assegura tingimento por igual. Tratamento de têxteis com os processos da invenção pode melhorar a brancura no processo de alvejante. O principal químico usado na limpeza é o hidróxido de sódio em altas concentrações e em altas temperaturas. Alvejante compreende oxidação do têxtil. O alvejante envolve tipicamente o uso de peróxido de hidrogênio como agente oxidante a fim de se obter tanto um tecido completamente branqueado (branco) quanto para assegurar uma tonalidade pura do corante.
[00609] A invenção também fornece xilanases alcalinas (xilanases ativas sob condições alcalinas). Elas apresentam uma ampla faixa de aplicações no processamento têxtil, degomação de fibras de planta (por exemplo, fibras de plantas liberianas), tratamento de efluentes de pectina, produção de papel e fermentações de café e chá. Veja, por exemplo, Hoondal (2002) Applied Microbiology and Biotechnology 59:409-418.
[00610] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas em qualquer processo de tratamento de fibra e/ou tecido como antimicrobiano ou repelente microbiano. Alternativamente, as xilanases da invenção podem ser parte de uma composição de fibra e/ou tecido, onde as xilanases da invenção agem como antimicrobiano ou repelente microbiano na fibra e/ou tecido. Composições detergentes, desinfetantes e de limpeza [00611] A invenção fornece composições detergentes, desinfetantes ou limpadores (de limpeza ou removedores) que compreendem um ou mais polipeptídeos (por exemplo, xilanases) da invenção e métodos para fazer e usar essas composições. A invenção incorpora todos os
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318/510 métodos de fazer e usar composições detergentes, desinfetantes ou limpadores, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. As composições detergentes, desinfetantes ou limpadores podem ser composições com uma ou duas partes aquosas, composição líquida não-aquosa, um sólido moldado, uma forma granular, uma forma particulada, um tablete comprimido, um gel e/ou uma pasta e uma forma de pasta. As xilanases da invenção também podem ser usadas como um produto aditivo de detergente, desinfetante ou limpador em uma forma sólida ou líquida. Tais produtos aditivos são pretendidos suplementar ou aumentar o desempenho de composições de detergentes convencionais e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza.
[00612] O conteúdo real de enzima ativa depende do método de produção da composição de detergente, desinfetante ou limpador e não é importante, presumindo que a solução de detergente tenha a atividade enzimática desejada. Em um aspecto, a quantidade de xilanase presente na solução final varia entre cerca de 0,001 mg a 0,5 mg por grama de composição de detergente. A enzima em particular escolhida para uso no processo e produtos dessa invenção depende das condições de utilização finais, incluindo a forma física do produto, pH de uso, temperatura de uso e tipos de solos a serem degradados ou alterados. A enzima pode ser escolhida para fornecer atividade e estabilidade ótimas para qualquer grupo de condições de utilização. Em um aspecto, as xilanases da presente invenção são ativas nas faixas de pH entre cerca de 4 a cerca de 12 e na faixa de temperatura entre cerca de 20°C a cerca de 95°C. Os detergentes da invenção podem compreender tensoativos catiônicos, semi-polares aniônicos ou zwitteriônicos e misturas desses.
[00613] Xilanases da invenção podem ser formuladas em detergentes, desinfetantes ou limpadores em pó ou líquidos, que tem pH entre
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4.0 e 12.0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (preferivelmente 0,1% a 0,5%) do peso. Essas composições de detergentes, desinfetantes ou limpadores também podem incluir outras enzimas tais como xilanases, celulases, lipases, esterases, proteases, ou endoglicosidases, endo-beta.-1,4-glicanases, beta-glicanases, endo-beta-1,3(4)glicanases, cutinases, peroxidases, catalases, lacases, amilases, glicoamilases, pectinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemicelulases, mananases, xiloglicanases, xilanases, pectina acetil esterases, ramnogalacturonano acetil esterases, poligalacturonases, ramnogalacturonases, galactanases, pectina liases, pectina metilesterases, celobiohidrolases e/ou transglutaminases. Essas composições de detergentes, desinfetantes ou limpadores também podem incluir pigmentos, corantes, flavorizantes, branqueadores, tampões, intensificadores, “agentes que intensificam” enzimas (veja, por exemplo, pedido de Patente U.S. N° 20030096394) e estabilizadores.
[00614] A adição de xilanases da invenção à composições limpadoras convencionais não cria qualquer limitação especial de uso. Em outras palavras, qualquer temperatura e pH adequados para o detergente também são adequados para as composições da invenção desde que a enzima seja ativa ou tolerante ao pH e/ou temperatura do uso pretendido. Além disso, as xilanases da invenção podem ser usadas em composições de limpeza sem detergentes, novamente tanto sozinhas quanto em combinação com intensificadores e estabilizadores. [00615] A presente invenção fornece composições de limpeza incluindo composições de detergentes para limpeza de superfícies sólidas, composições de detergentes para limpeza de tecidos, composições para lavagem de louças, composições para limpeza oral, composições para limpeza de próteses dentárias, e soluções para limpeza de lentes de contato.
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320/510 [00616] Em um aspecto, a invenção fornece um método para lavar um objeto que compreende contatar o objeto com um polipeptídeo da invenção sob condições suficientes para a lavagem. Uma xilanase da invenção pode ser incluída como um aditivo para detergente, desinfetante ou limpador. A composição de detergente, desinfetante ou limpador da invenção pode, por exemplo, ser formulada como uma composição de detergente, desinfetante ou limpador compreendendo um polipeptídeo da invenção para lavagem manual ou para máquina de lavar. Um aditivo de lavagem adequado para o pré-tratamento de tecidos coloridos pode compreender um polipeptídeo da invenção. Uma composição amaciante de tecido pode compreender uma xilanase da invenção. Alternativamente, uma xilanase da invenção pode ser formulada como uma composição detergente, desinfetante ou limpadora para uso em operações de limpeza de superfícies difíceis domésticas em geral. Em aspectos alternativos, aditivos para detergente, desinfetante ou limpador e composições de detergente, desinfetante ou limpador da invenção podem compreender uma ou mais outras enzimas tais como uma xilanase, uma lipase, uma protease, uma cutinase, uma esterase, outra xilanase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, um oxidase, por exemplo, uma lactase, e/ou uma peroxidase (veja também acima). As propriedades da(s) enzima(s) da invenção são escolhidas para serem compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e as enzimas estão presentes em quantidades eficazes. Em um aspecto, as enzimas xilanases da invenção são usadas para remover materiais malcheirosos de tecidos. Várias composições de detergente e métodos para fazê-las que podem ser usados na prática da invenção estão descritos, por exemplo em Patentes U.S. Nos. 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038; 6.309.871; 6.204.232;
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6.197.070; 5.856.164.
[00617] Quando formuladas como composições adequadas para uso em um método de lavagem em máquina de lavar, as xilanases da invenção podem compreender ambos um tensoativo e um composto intensificador. Elas podem compreender, além disso, um ou mais componentes detergentes, por exemplo, compostos poliméricos orgânicos, agentes branqueadores, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dispersantes de sabão cáustico (lime), agentes de suspensão e anti-redeposição de detritos e inibidores de corrosão. Composições para lavagem de roupa da invenção também podem conter agentes amaciantes, como componentes detergentes adicionais. Tais composições que contém carboidrase podem fornecer a limpeza do tecido, remoção de pigmento, manutenção da brancura, amaciamento, aspecto da cor, inibição de transferência de corante e higienização quando formuladas como composições de detergente para lavanderia.
[00618] A densidade das composições de detergente, desinfetante ou limpador de lavanderia da invenção pode variar entre cerca de 200 a 1500 h/litro ou cerca de 400 a 1200 g/litro ou cerca de 500 a 950 g/litro ou 600 a 800 g/litro de composição; isso pode ser medido em cerca de 20°C.
[00619] Em um aspecto, a forma “compacta” de composições de detergente, desinfetante ou limpador de lavanderia da invenção é melhor refletida pela densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal inorgânico de preenchimento. Sais de preenchimento inorgânicos são ingredientes convencionais de composições detergentes em forma de pó. Em composições detergentes convencionais, os sais de preenchimento estão presentes em quantidades substanciais, tipicamente de 17 a 35% do peso da composição total. Em um aspecto das composições compactas, o sal de preenchimento está presente
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322/510 em quantidades que não excedem 15% do total da composição ou não excedem 10% ou não excedem 5% do peso da composição. Os sais de preenchimento inorgânicos podem ser selecionados entre sulfatos e cloretos de sais de metal alcalino e alcalino terroso, por exemplo, sulfato de sódio.
[00620] Composições líquidas de detergente da invenção também podem estar em uma “forma concentrada”. Em um aspecto, composições líquidas de detergente, desinfetante ou limpador podem conter uma quantidade menor de água, comparadas a detergentes, desinfetantes ou limpadores líquidos convencionais. Em aspectos alternativos, o conteúdo de água do detergente líquido concentrado é menor do que 40% ou menor do que 30% ou menor do que 20% do peso da composição de detergente, desinfetante ou limpador. Compostos de detergente, desinfetante ou limpador da invenção podem compreender formulações como descrito na WO 97/01629.
[00621] Xilanases da invenção podem ser úteis na formulação de várias composições de detergente, desinfetante ou limpador. Numerosos compostos conhecidos são tensoativos adequados, incluindo detergentes não-iônicos, aniônicos, catiônicos ou zwitteriônicos, que podem ser usados, por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.404.128; 4.261.868; 5.204.015. Além disso, xilanases podem ser usadas, por exemplo em aplicações de sabão em barra ou líquido, formulações para limpeza de louça, soluções ou produtos de limpeza de lente de contato, hidrólise de peptídeo, tratamento de resíduo, aplicações têxteis, como enzimas de fusão-clivagem na produção de proteína e semelhantes. Xilanases podem fornecer desempenho melhorado em uma composição detergente quando comparada com outra xilanase detergente, ou seja, o grupo de enzimas pode aumentar a limpeza de certas manchas sensíveis à enzima tais como grama ou sangue, como determinado pela avaliação comum após um ciclo de
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323/510 lavagem padronizada. Xilanases podem ser formuladas em detergentes em pó e líquidos que tem pH entre 6.5 e 12.0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (por exemplo, cerca de 0,1% a 0,5%) do peso. Essas composições detergentes de limpeza também podem incluir outras enzimas tais como xilanases conhecidas, xilanases, proteases, amilases, celulases, mananases, lipases ou endoglicosidases, enzimas de redox tais como catalases e lacases, assim como intensificadores, estabilizadores, fragrâncias e pigmentos.
[00622] Em um aspecto, a invenção fornece composições de detergente, desinfetante ou limpador. que tem atividade de xilanase (uma xilanase da invenção) para uso com fruta, vegetais e/ou compostos de barro ou argila (veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.786.316).
[00623] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas em qualquer processo de produção de detergente, desinfetante ou limpador (solução de limpeza), em que a xilanase é usada como um antimicrobiano ou repelente microbiano. Alternativamente, as xilanases da invenção podem ser usadas em qualquer processo de limpeza ou lavagem, em que a xilanase é usada como um antimicrobiano ou repelente microbiano. Em outro aspecto da invenção, a xilanase da invenção pode ser incluída em qualquer composição detergente ou de limpeza, em que as xilanases da invenção atuam como um antimicrobiano ou repelente microbiano na composição.
[00624] Tratamento de alimentos e processamento de alimento [00625] As xilanases da invenção apresentam numerosas aplicações na indústria de processamento de alimento. Por exemplo, em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas para melhorar a extração de óleo de um material de planta rica em óleo, por exemplo, sementes ricas em óleo, por exemplo, óleo de soja de feijões de soja, óleo de oliva de azeitonas, óleo de semente de colza da colza e/ou
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324/510 óleo de girassol das sementes de girassol.
[00626] As xilanases da invenção podem ser usadas para separação de componentes de materiais de célula de planta. Por exemplo, xilanases da invenção podem ser usadas na separação de material rico em xilano (por exemplo, células de planta) em componentes. Em um aspecto, xilanases da invenção podem ser usadas para separar culturas ricas em xilano ou ricas em óleo em frações valiosas de proteína e óleo e cascas. O processo de separação pode ser realizada pelo uso de métodos conhecidos na técnica.
[00627] As xilanases da invenção podem ser usadas na preparação de sucos de frutas ou vegetais, xaropes, extratos e semelhantes para aumentar o rendimento, As xilanases da invenção podem ser usadas no tratamento enzimático (por exemplo, hidrólise de materiais de planta que compreendem xilano) de vários materiais derivados de parede de célula de planta ou materiais residuais, por exemplo, de cereais, grãos, produção de vinho ou suco, ou resíduos agrícolas tais como cascas de vegetais, cascas de feijão, polpa de beterraba, polpa de azeitona, polpa de batata e semelhantes. As xilanases podem ser usadas para modificar a consistência e aspecto de vegetais ou frutas processadas. As xilanases da invenção podem ser usadas para tratar material de planta para facilitar o processamento de material de planta, incluindo alimentos, facilitar a purificação ou extração de componentes de planta. As xilanases da invenção podem ser usadas para melhorar o valor nutricional, diminuir a capacidade de ligação com água, melhorar a degradabilidade de resíduos de plantas aquáticas e/ou melhorar a conversão de material de planta em ensilagem e semelhantes. [00628] Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas em aplicações de cozimento, por exemplo, biscoitos e bolachas, para hidrolisar xilanos tais como arabinoxilano. Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas para criar massas de farinha não pegajosas
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325/510 que não são difíceis de processar e para reduzir o tamanho do biscoito. Xilanases da invenção podem ser usadas para hidrolisar arabinoxilanos para prevenir a rápida reidratação do produto assado que resulta em perda da crocância e prazo de validade reduzido. Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas como aditivos no processamento de massas de farinha. Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas no condicionamento de massa de farinha, em que em um aspecto as xilanases possuem alta atividade sobre uma faixa de temperatura de cerca de 25-35°C e em pH próximo de neutro (7.0-7.5). Em um aspecto, enzimas que condicionam massa de farinha podem ser inativadas em temperaturas extremas de cozimento [>260°C (>500°F)]. As enzimas da invenção podem ser usadas em conjunção com qualquer protocolo de processamento da massas de farinha, por exemplo, como no Pedido de Patente U.S. N°. 2005028 1916.
[00629] Em um aspecto, xilanases da invenção são usadas como aditivos no processamento de massa de farinha agirem otimamente sob as condições de pH e temperatura da massa de farinha. Em um aspecto, uma enzima da invenção é usada para o condicionamento de massa de farinha. Em um aspecto, uma xilanase da invenção possui alta atividade sobre uma faixa de temperatura de cerca de 25-35°C e em pH próximo de neutro (7.0-7.5). Em um aspecto, enzima que condiciona massa de farinha é inativada em temperaturas extremas de cozimento, por exemplo >500°F.
[00630] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas em qualquer tratamento de alimento ou bebida ou processo de processamento de alimento ou bebida, no qual a xilanase é usada como antimicrobiano ou repelente microbiano. Em outro aspecto da invenção, a xilanase da invenção pode ser incluída em qualquer composição de alimento ou bebida, no qual as xilanases da invenção atuam como antimicrobianos ou repelentes microbianos.
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Rações e alimento para animais ou aditivos para ração ou alimento (suplementos) [00631] A invenção fornece métodos para tratar rações e alimentos para animais e aditivos para alimento e ração (suplementos) usando xilanases da invenção, animais que incluam mamíferos ( por exemplo, seres humanos), pássaros, peixe e semelhantes. A invenção fornece rações animais, alimentos e aditivos (suplementos) que compreendem xilanases da invenção. Em um aspecto, o tratamento de rações animais, alimentos e aditivos usando xilanases da invenção podem ajudar na disponibilização de nutrientes, por exemplo, amido, proteína e semelhantes, na ração animal ou aditivo (suplementos). Pela decomposição de proteínas difíceis de digerir ou pela exposição indiretamente ou diretamente de amido (ou outros nutrientes), as xilanases tornam os nutrientes mais acessíveis a outras enzimas endógenas ou exógenas. A xilanase pode também causar simplesmente a liberação de nutrientes e açúcares rapidamente digestíveis e facilmente absorvíveis. [00632] Quando adicionadas à ração animal, as xilanases da invenção melhoram a decomposição in vivo de material de parede celular de planta, parcialmente devido à redução da viscosidade intestinal (veja, por exemplo, Bedford et al., Proceedings of the 1st Symposium on Enzymes in Animal Nutrition, 1993, pp. 73-77), através do que uma melhor utilização dos nutrientes da planta pelo animal é obtida. Assim, pelo uso de xilanases da invenção em rações, a taxa de crescimento e/ou a taxa de conversão do alimento (isto é, o peso do alimento ingerido em relação ao ganho de peso) do animal é melhorada.
[00633] O aditivo para ração animal da invenção pode ser um produto granulado de enzima que pode ser rapidamente misturado com componentes alimentícios. Alternativamente, aditivos para ração da invenção podem formar um componente de uma pré-mistura. O produto granulado de enzima da invenção pode ser revestido ou não revesPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 332/525
327/510 tido. O tamanho da partícula de granulados de enzima pode ser compatível com aquele da ração e componentes pré-mistura. Isso fornece um meio seguro e conveniente de incorporar enzimas em rações. Alternativamente, o aditivo para ração animal da invenção pode ser uma composição líquida estabilizada. Essa pode ser uma pasta aquosa ou baseada em óleo. Veja, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.245.546. [00634] Xilanases da presente invenção, na modificação de ração animal ou alimento, podem processar o alimento ou ração tanto in vitro (pela modificação dos componentes da ração ou alimento) quanto in vivo. Xilanases podem ser adicionadas à ração animal ou composições alimentícias que contém altas quantidades de xilanos, por exemplo, ração ou alimento que contém material de planta de cereais, grãos e semelhantes. Quando adicionada a ração ou alimento, a xilanase melhora significativamente a decomposição de material que contém xilano, por exemplo, paredes de célula de planta, através do que uma melhor utilização dos nutrientes da planta pelo animal (por exemplo, ser humano) é obtida. Em um aspecto, a taxa de crescimento e/ou taxa de conversão do alimento (isto é, o peso do alimento ingerido em relação ao ganho de peso) do animal é melhorada. Por exemplo, uma proteína que compreende xilano parcialmente ou indigerível é totalmente ou parcialmente degradada por uma xilanase da invenção, por exemplo, em combinação com outra enzima, por exemplo, betagalactosidase, em peptídeos e galactose e/ou galactoligômeros. Esses produtos de digestão da enzima são mais digeríveis para o animal. Assim, xilanases da invenção podem contribuir para a energia disponível da ração ou alimento. Também, pela contribuição à degradação de proteínas que compreendem xilano, uma xilanase da invenção pode melhorar a digestibilidade e absorção de carboidrato e constituintes não carboidratos de ração ou alimento, tais como proteína, gordura e minerais.
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328/510 [00635] Em outro aspecto, a xilanase da invenção pode ser fornecida para expressar as enzimas diretamente em culturas de alimentos transgênicos (como, por exemplo, plantas, sementes transgênicas e semelhantes), tais como grãos, cereais, milho, soja, colza, lupino e semelhantes. Como discutido acima, a invenção fornece plantas transgênicas, partes de planta e células de planta que compreendem uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Em um aspecto, o ácido nucléico é expresso tal que a xilanase da invenção é produzida em quantidades recuperáveis. A xilanase pode ser recuperada de qualquer planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta que contém o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal melhorando a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorando o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir um fator antinutritivo.
[00636] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para remover oligossacarídeos da ração antes do consumo pelo animal usando uma xilanase da invenção. Nesse processo, uma ração é formada tendo um valor de energia metabolizável aumentada. Além das xilanases da invenção, galactosidases, celulases e combinações dessas podem ser usadas. Em um aspecto, a enzima é adicionada em uma quantidade igual entre cerca de 0,1% e 1% do peso do material da ração. Em um aspecto, a ração é um material de cereal, trigo, um grão, soja (por exemplo, soja triturada). Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.399.123.
[00637] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para utilizar xilanase como um suplemento nutricional nas dietas de animais preparando um suplemento nutricional que contém uma enzima xilanase recombinante que compreende pelo menos trinta aminoácidos contíguos de uma sequência da invenção e administrando o suplemento nutricioPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 334/525
329/510 nal a um animal para aumentar a utilização do xilano contido no alimento ingerido pelo animal.
[00638] Em outro aspecto, a invenção fornece uma matriz de liberação de enzima peletizada comestível e método de uso para a liberação de xilanase para um animal, por exemplo, como suplemento nutricional. A matriz de liberação de enzima libera prontamente um enzima xilanase, tal como aquela que tem uma sequência de aminoácidos da invenção ou pelo menos 30 aminoácidos contíguos dessa, em meio aquoso, tal como, por exemplo, o fluido digestivo de um animal. A matriz de liberação de enzima da invenção é preparada a partir de um veículo granulado comestível selecionado a partir de tais componentes como gérmen de grão que é pobre em óleo, feno, alfafa, grama timothy, casca de soja, farinha de semente de girassol, farelo de trigo e semelhantes, que dispersam rapidamente a enzima recombinante contida neles em meio aquoso. Em uso, a matriz de liberação de enzima peletizada comestível é administrada a um animal para liberar xilanase para o animal. Substratos baseados em grão adequados podem compreender ou ser derivados de qualquer grão comestível adequado, tal como trigo, milho, soja, sorgo, alfafa, cevada e semelhantes. Um exemplar de substrato baseado em grão é um substrato baseado em milho. O substrato pode ser derivado de qualquer parte adequada do grão, mas é preferivelmente um gérmen de grão aprovado para uso em ração animal, tal como germe de milho que é obtido em um processo de moagem à úmido ou a seco. O grão germinado preferivelmente compreende um germe exaurido, que é um gérmen de grão do qual o óleo tenha sido expelido, tal como por prensagem ou extração com hexano ou outro solvente. Alternativamente, o gérmen de grão é extraído por extrusão, ou seja, o óleo foi removido por prensagem. [00639] A matriz de liberação de enzima da invenção está na forma de muitas partículas, péletes ou grânulos individuais. Por “grânulos”
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330/510 entendem-se partículas que são comprimidas ou compactadas, tais como por peletização, extrusão ou compactação similar para remover água da matriz. Tal compressão ou compactação das partículas também promove a coesão intra-partícula das partículas. Por exemplo, os grânulos podem ser preparados pela peletização do substrato baseado em grão em um moinho de pélete. Os péletes preparados dessa maneira são triturados ou esfarelados até um tamanho de grânulo desejado para uso como adjuvante em ração animal. Como a matriz está aprovada por si própria para uso em ração animal, ela pode ser usada como um diluente para liberação de enzimas em ração animal.
[00640] A matriz de liberação de enzima pode estar na forma de grânulos que tem um tamanho de grânulo que varia entre cerca de 4 a cerca de 400 mesh (USS); mais preferivelmente, cerca de 8 a cerca de 80 mesh; e mais preferivelmente cerca de 14 a cerca de 20 mesh. Se o gérmen do grão é tem o óleo retirado através de extração com solvente, o uso de um agente lubrificante tal como óleo de milho pode ser necessário no peletizador, mas tal agente lubrificante geralmente não é necessário se o gérmen é expelido por extração. Em outros aspectos da invenção, a matriz é preparada por outros processos de compactação ou compressão, tais como, por exemplo, pela extrusão de um substrato baseado em grão através de um molde e trituração do extrusado até um tamanho de grânulo adequado.
[00641] A matriz de liberação de enzima pode ainda incluir um componente de polissacarídeo como um agente de coesão para aumentar a aderência dos grânulos da matriz. O agente de coesão é tido como fornecedor de grupos hidroxila adicionais, que aumentam a ligação entre grãos de proteína dentro da matriz granular. Acredita-se ainda que os grupos adicionais de hidroxila funcionam assim para intensificar a ligação do hidrogênio de proteínas ao amido e outras proteínas. O agente de coesão pode estar presente em qualquer quantidade
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331/510 adequada para intensificar a adesão dos grânulos da matriz de liberação de enzima. Agentes de coesão adequados incluem uma ou mais de dextrinas, maltodextrinas, amido, tal como amido de milho, farinhas, celulósicos, hemicelulósicos e semelhantes. Por exemplo, o percentual de gérmen de grão e agente de coesão na matriz (não incluindo a enzima) é de 78% de farinha de gérmen de milho e 20% do peso de amido de milho.
[00642] Como a matriz que libera enzima da invenção é feita de materiais biodegradáveis e contém mistura, a matriz pode ser submetida a decomposição, tal como por mofo. Para prevenir ou inibir tal mofo, a matriz pode incluir um inibidor de mofo, tal como um sal de propionato, que pode estar presente em qualquer quantidade suficiente para inibir o mofo da matriz que libera enzima, fornecendo assim uma matriz de liberação em uma formulação estável que não requer refrigeração.
[00643] A enzima xilanase contida na matriz de liberação de enzima e métodos da invenção é preferivelmente uma xilanase termoestável, como descrita nesse, a fim de resistir a inativação da xilanase durante a fabricação onde temperaturas elevadas e/ou vapor podem ser empregados para preparar a matriz de liberação de enzima peletizada. Durante a digestão da ração que contém a matriz de liberação de enzima da invenção, fluidos digestivos aquosos causarão a liberação da enzima ativa. Outros tipos de enzimas termoestáveis e suplementos nutricionais que são termoestáveis podem ser incorporados na matriz de liberação para liberar sob qualquer tipo de condição aquosa.
[00644] Um revestimento pode ser aplicado a partículas de matriz de enzima da invenção por muitos propósitos diferentes, tais como adicionar sabor ou suplemento nutricional a ração animal, para retardar a liberação de suplementos e enzimas da ração animal em condições gástricas e semelhantes. Ou, a cobertura pode ser aplicada para
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332/510 se obter uma meta funcional, por exemplo, sempre que é desejado retardar a liberação da enzima das partículas de matriz ou controlar as condições sob as quais a enzima será liberada. A composição do material de revestimento pode ser tal que ela é seletivamente degradada por um agente ao qual ela é suscetível (tal como calor, ácido ou base, enzimas ou outros químicos). Alternativamente, duas ou mais coberturas suscetíveis para tais agentes de degradação diferentes podem ser consecutivamente aplicadas às partículas da matriz.
[00645] A invenção também é dirigida para um processo de preparar uma matriz que libera enzima. De acordo com a invenção, o processo compreende fornecer várias partículas individuais de um substrato baseado em grão em um tamanho de partícula particular adequado para uso como uma matriz que libera enzima, em que as partículas compreendem a enzima xilanase codificada por uma sequência de aminoácidos da invenção ou pelo menos 30 aminoácidos contíguos dessa. Preferivelmente, o processo inclui compactar ou comprimir as partículas da matriz que libera enzima em grânulos o que pode ser obtido pela peletização. O inibidor de mofo e agente de coesão, quando usados, podem ser adicionados em qualquer momento adequado e podem ser misturados com o substrato baseado em grão nas proporções desejadas antes da peletização do substrato baseado em grão. O conteúdo da mistura da ração no moinho de péletes pode estar nas faixas descritas acima com relação ao conteúdo da mistura no produto final, e pode ser cerca de 14 a 15%. Em um aspecto, a mistura é adicionada à ração na forma de uma preparação aquosa da enzima para introduzir na ração esse conteúdo da mistura. A temperatura desse moinho de péletes pode ser levada para cerca de 82°C com vapor. O moinho de pélete pode ser utilizado sob quaisquer condições que transmitem trabalho suficiente à matéria-prima para fornecer péletes. O processo de peletização por si só é um processo eficiente para rePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 338/525
333/510 moção de água da composição que contém enzima.
[00646] Em um aspecto, o moinho de pélete é operado com um molde de 0,3175 cm (1/8 de polegada) por 5,08 cm (2 polegadas) a 756 g/s (100 lb/min) de pressão a 82°C para fornecer péletes, que são então triturados em um triturador para fornecer várias partículas individuais que tem um tamanho de partícula capaz de passar através de uma tela de malha 8, mas ser retidas numa tela de malha 20.
[00647] As xilanases termoestáveis da invenção podem ser usadas nos péletes da invenção. Eles podem ter temperaturas ótimas elevadas e alta resistência ào calor tal que uma reação enzimática pode ser conseguida em uma temperatura até então não executada. O gene que codifica a xilanase de acordo com a presente invenção (por exemplo, como descrito em qualquer uma das sequências da invenção) pode ser usado na preparação de xilanases (por exemplo, usando GSSM como descrito nesse) que tem características diferentes daquelas das xilanases da invenção (em termos de pH ótimo, temperatura ótima, resistência ào calor, estabilidade para solventes, atividade específica, afinidade com o substrato, habilidade de secreção, taxa de tradução, controle de transcrição e semelhantes). Além disso, um polinucleotídeo da invenção pode ser empregado para o rastreamento de xilanases variantes preparadas pelos métodos descritos nesse para determinar aquelas que tem a atividade desejada, tais como termoestabilidade ou termotolerância melhorada ou modificada. Por exemplo, Patente U.S. N°. 5.830.732 descreve um ensaio de rastreamento para determinar a termotelerância de uma xilanase.
[00648] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas em qualquer ração animal, alimento para animal ou processo de produção de aditivo para ração, em que a xilanase é usada como um antimicrobiano ou repelente microbiano. Em outro aspecto da invenção, a xilanase da invenção pode ser incluída
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334/510 em qualquer ração animal, alimento para animal composição de aditivo para ração, no qual as xilanases da invenção atuam como antimicrobianos ou repelentes microbianos.
Tratamento de resíduo [00649] As xilanases da invenção podem ser usadas em uma variedade de outras aplicações industriais, por exemplo, no tratamento de resíduos. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um processo de digestão de resíduo sólido usando as xilanases da invenção. Os métodos podem compreender reduzir a massa e o volume de resíduo sólido substancialmente não tratado. O resíduo sólido pode ser tratado com um processo de digestão enzimática na presença de uma solução enzimática (incluindo as xilanases da invenção) em uma temperatura controlada. Isso resulta em uma reação sem fermentação bacteriana apreciável dos microrganismos adicionados. O resíduo sólido é convertido em um resíduo liquefeito e algum resíduo sólido remanescente. O resíduo liquefeito resultante pode ser separado do dito resíduo sólido remanescente. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.709.796.
[00650] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas em qualquer processo de tratamento de resíduo, no qual a xilanase é usada como um antimicrobiano ou repelente microbiano. Em outro aspecto da invenção, a xilanase da invenção pode ser incluída em qualquer composição de tratamento de resíduo, no qual as xilanases da invenção atuam como antimicrobianos ou repelentes microbianos na composição.
Produtos para higiene oral [00651] A invenção fornece produto para higiene oral que compreende xilanases da invenção, incluindo as misturas de enzimas ou “coquetéis” da invenção. Produtos para higiene oral exemplares incluem pastas de dente, cremes dentais, géis ou pós dentais, enxagüantes
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335/510 bucais, formulações para limpeza pré e pós-escovação, gomas de mascar, comprimidos, ou bala. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.264.925.
[00652] Em outro aspecto da invenção, xilanases da invenção, incluindo as misturas de enzimas ou “coquetéis” da invenção, também podem ser usados em qualquer processo de fabricação de composição para higiene oral, no qual as xilanases da invenção atuam como antimicrobianos ou repelentes microbianos na composição.
Produção de cerveja e fermentação [00653] A invenção fornece métodos para produzir cerveja (por exemplo, fermentação) compreendendo as xilanases da invenção, incluindo as misturas de enzimas ou “coquetéis” da invenção. Em um processo exemplar, os materiais brutos que contém amido são desintegrados e processados para formar o malte. Uma xilanase da invenção é usada em qualquer ponto no processo de fermentação. Por exemplo, xilanases da invenção podem ser usadas no processamento de malte de cevada. O material bruto principal da produção de cerveja é o malte de cevada. Isso pode ser em um processo de três estágios. Primeiro, o grão de cevada pode imerso em água para aumentar o conteúdo de água, por exemplo, por volta de 40%. Segundo, o grão pode ser germinado pela incubação a 15 a 25°C por 3 a 6 dias quando a síntese enzimática é estimulada sob controle de giberelinas. Em um aspecto, xilanases de invenção são adicionadas a esse (ou qualquer outro) estágio do processo. Xilanases da invenção podem ser usadas no processo de produção de cerveja ou qualquer bebida alcoólica, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.7 62.991; 5.536.650; 5.405.624; 5.021.246; 4.788.066.
[00654] Em um aspecto, uma enzima da invenção é usada para melhorar a filtrbilidade e a viscosidade do mosto e para obter uma hidrólise mais completa de componentes do endosperma. O uso de uma
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336/510 enzima da invenção pode também aumentar o rendimento do extrato. O processo de produção de cerveja envolve a germinação do grão de cevada (maltagem) seguida da extração e degradação dos carboidratos armazenados para se obter açúcares simples que são usados pela levedura para fermentação alcoólica. A degradação eficiente das reservas de carboidrato presentes no endosperma da cevada e suplementos cervejeiros requer a atividade de várias enzimas diferentes. [00655] Em um aspecto, uma enzima da invenção tem atividade em acidificar levemente o pH (por exemplo, 5.5-6.0) em, por exemplo, uma faixa de temperatura de 40°C a 70°C; e em um aspecto, com inativação a 95°C. A atividade sob tais condições pode ser ótima, mas não é um requisito essencial para eficácia. Em um aspecto, uma enzima da invenção tem atividade entre 40-75°C e pH 5.5-6.0; estabilidade a 70°C por pelo menos 50 minutos e, em um aspecto, é inativada a 96100°C. Enzimas da invenção podem ser usadas com outras enzimas, por exemplo, beta-1,4-endoglicanases e amilases.
[00656] Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção, incluindo a mistura de enzimas ou “coquetéis” da invenção também podem ser usadas em qualquer processo cervejeiro ou de fermentação, no qual a xilanase é usada como um antimicrobiano ou repelente microbiano. Em outro aspecto da invenção, a xilanase da invenção pode ser incluída em qualquer composição de para fazer cerveja ou fermentada, na qual as xilanases da invenção atuam como antimicrobianos ou repelentes microbianos na composição.
Conversão de biomassa e produção de biocombustível [00657] A invenção fornece métodos e processos para conversão de biomassa, por exemplo, para um biocombustível, tal como bioetanol, biometanol, biopropanol e/ou biobutanol e semelhantes, usando as enzimas da invenção, incluindo a mistura de enzimas ou “coquetéis” da invenção. Assim, a invenção fornece combustíveis, por exemPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 342/525
337/510 plo, biocombustíveis, tais como bio-etanóis, que compreendem um polipeptídeo da invenção, incluindo a mistura de enzimas ou “coquetéis” da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. Em aspectos alternativos, o combustível é derivado de um material de planta, que opcionalmente compreende batatas, soja (colza), cevada, centeio, milho, aveia, beterraba ou cana-de-açúcar e opcionalmente o combustível compreende um bioetanol ou mistura de gasolina-etanol.
[00658] A invenção fornece métodos para fazer um combustível que compreendem contatar uma composição que compreende um xilano, hemicelulose, celulose ou um açúcar fermentável com um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção ou qualquer uma das misturas ou “coquetéis” ou produtos fabricados da invenção. Em modalidades alternativas, a composição compreende um xilano, hemicelulose, celulose ou um açúcar fermentável que compreende uma planta, produto de planta ou derivado de planta e a planta ou produto de planta pode compreender plantas ou produtos de planta de cana-de-açúcar, beterrabas, trigo, milho, soja, batata, arroz ou cevada. Em modalidades alternativas, o polipeptídeo tem atividade que compreende catalisar a hidrólise de ligações internas p-1,4-xilosídicas ou ligações endo- p-1,4-glicanase; e/ou degradar um polissacarídeo linear de beta-1,4-xilano em xilose. Em um aspecto, o combustível compreende um bioetanol ou uma mistura de gasolinaetanol, ou biopropanol ou uma mistura de gasolina-propanol, ou um biobutanol ou uma mistura de gasolina-butanol, ou um biometanol ou uma mistura de gasolina-metanol ou qualquer combinação desses. [00659] A invenção fornece métodos para fazer bioetanol, biobutanol, biometanol, e/ou biopropanol que compreendem contatar uma composição que compreende um xilano, hemicelulose, celulose ou um açúcar fermentável com um polipeptídeo da invenção ou um polipeptíPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 343/525
338/510 deo codificado por um ácido nucléico da invenção ou qualquer uma das misturas ou “coquetéis” ou produtos fabricados da invenção. Em modalidades alternativas, a composição compreende um xilano, hemicelulose, celulose ou um açúcar fermentável que compreende uma planta, produto de planta ou derivado de planta e a planta ou produto de planta pode compreender plantas ou produtos de planta de canade-açúcar, beterrabas, trigo, milho, soja, batata, arroz ou cevada e o polipeptídeo pode ter atividade que compreende atividade de celulase, glicanase, celobioidrolase, beta-glicosidase, xilanase, mananse, βxilosidase, e/ou arabinofuranosidase.
[00660] A invenção fornece conjuntos de enzimas, ou “coquetel”, para despolimerização de polímeros celulósicos e hemicelulósicos em porções de carbono metabolizáveis que compreendem um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção. Em modalidades alternativas, o polipeptídeo tem atividade que compreende catalisar a hidrólise de ligações internas β-1,4xilosídicas ou ligações endo- e-1,4-glicanase; e/ou degradar um polissacarídeo linear de beta-1,4-xilano em xilose. Os conjuntos de enzimas ou “coquetéis” da invenção podem estar na forma de uma composição (por exemplo, uma formulação, líquida ou sólida), por exemplo, como um produto de fabricação.
[00661] A invenção fornece composições (incluindo produtos de fabricação, grupos de de enzimas ou “coquetéis”) que compreendem uma mistura (ou “coquetel”) de enzimas que hidrolisam hemicelulose e celulose, em que as enzimas que hidrolisam o xilano compreendem pelo menos uma de cada xilanase da invenção e pelo menos uma, várias ou todas celulase, glicanase, celobioidrolase e/ou β -glicosidase. Em modalidades alternativas, as misturas que hidrolisam o xilano e/ou hemicelulose da invenção compreendem pelo menos uma de cada xilanase da invenção e pelo menos uma ou ambas β-xilosidase e/ou
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339/510 uma arabinofuranosidase.
[00662] A invenção fornece composições (incluindo produtos de fabricação, grupos de enzimas ou “coquetéis”) que compreendem uma mistura (ou “coquetel”) de enzimas que hidrolisam o xilano, hemicelulose e/ou celulose que compreendem pelo menos uma, várias ou todas de celulase, uma glicanase, uma celobioidrolase e/ou uma arabinofuranosidase, e uma xilanase dessa invenção.
[00663] A invenção fornece composições (incluindo produtos de fabricação, grupos de enzimas ou “coquetéis”) que compreendem uma mistura (ou “coquetel”) de enzimas que hidrolisam o xilano, hemicelulose e/ou celulose que compreendem pelo menos uma, várias ou todas de celulase, uma glicanase; uma celobioidrolase; uma arabinofuranosidase; uma xilanase; uma β -glicosidase; uma β -xilosidase; e pelo menos uma enzima da invenção.
[00664] A invenção fornece composições (incluindo produtos de fabricação, grupos de enzimas ou “coquetéis”) que compreendem uma mistura (ou “coquetel”) de enzimas que compreendem, além de pelo menos uma enzima da invenção: (1) uma glicanase que cliva ligações β-1,4 internas que resulta em glico-oligossacarídeos curtos; (2) uma celobioidrolase que atua de uma maneira “exo” liberando progressivamente unidades de celobiose (dissacarídeo de β-1,4 glicose - glicose) e/ou (3) uma β-glicosidase para liberar monômeros de glicose a partir de celo-oligossacarídeos curtos (por exemplo, celobiose).
Conversão de biomassa e produção de biocombustíveis limpos [00665] A invenção fornece composições e processos que usam enzimas dessa invenção, incluindo misturas ou “coquetéis” de enzimas da invenção, para a conversão de uma biomassa ou qualquer material orgânico, por exemplo, um material que compreende xilano ou lignocelulósico (por exemplo, qualquer composição compreendendo um xilano, celulose, hemicelulose e/ou lignina) em um combustível, tal como
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340/510 um biocombustível (por exemplo, bioetanol, biobutanol, biometanol, e/ou biopropanol), incluindo biodieseis, além de rações, alimentos, suplementos alimentícios ou para ração (aditivos), fármacos e químicos. Assim as composições e métodos da invenção fornecem alternativas eficazes e sustentáveis ou auxiliares para uso com produtos baseados em petróleo, por exemplo como uma mistura de um biocombustível (por exemplo, bioetanol, biobutanol, biometanol, e/ou biopropanol) e gasolina e/ou um combustível de diesel.
[00666] A invenção fornece células e/ou organismos que expressam enzimas da invenção (por exemplo, em que as células ou organismos compreendem como ácidos nucléicos heterólogos uma sequência dessa invenção) para participação em ciclos químicos que envolvem conversão de biomassa natural (por exemplo, planta). Em um aspecto, enzimas e métodos para a conversão são usados em conjuntos de enzimas (ou “coquetéis”) para despolimerização eficiente de composições que compreendem xilano, ou polímeros de xilano, celulósicos ou hemicelulósicos em porções de carbono metabolizáveis. A invenção fornece métodos para descobrir e implementar a mais eficaz das enzimas para possibilitar esses novos processos industriais importantes de conversão de biomassa e energia alternativa.
[00667] Os métodos da invenção também incluem utilizar o material de biomassa (por exemplo, lignocelulósico) convertida (processada pelas enzimas da invenção) e transformá-lo em um combustível (por exemplo, um biocombustível tal como bioetanol, biobutanol, biometanol, biopropanol ou biodiesel) pela fermentação e/ou síntese química. Em um aspecto, os açúcares produzidos são fermentados e/ou os produtos não fermentáveis são gaseificados.
[00668] As enzimas da invenção (incluindo, por exemplo, organismos tais como microrganismos, por exemplo, fungos, levedura ou bactérias e plantas e células de plantas e partes de plantas, por exemplo,
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341/510 sementes, que produzem e em alguns aspectos secretam enzimas recombinantes da invenção) podem ser usadas ou incluídas/integradas em qualquer estágio de qualquer processo de conversão de matéria orgânica/biomassa, por exemplo, em uma etapa qualquer, várias etapas ou incluídas em todas as etapas ou todos os seguintes métodos do processo de conversão de biomassa ou em todos esses biocombustíveis alternativos:
[00669] Combustão direta: a queima do material pelo calor direto e é a tecnologia de biomassa mais simples; pode ser muito econômica se a fonte da biomassa é próxima.
[00670] 1 Pirólise: é a degradação térmica da biomassa pelo calor na ausência de oxigênio. Em um aspecto, a biomassa é aquecida a uma temperatura entre cerca de 800 a 1400 graus Fahrenheit, mas nenhum oxigênio é introduzido para suportar a combustão resultante na criação de gás, óleo combustível e carvão.
[00671] 2 Gaseificação: a biomassa pode ser usada para produzir metano através do aquecimento ou digestão anaeróbica. Gás de síntese, uma mistura de monóxido de carbono e hidrogênio pode ser derivado de biomassa.
[00672] Gás Natural: é gerado pela decomposição (digestão anaeróbica) de lixo enterrado em aterros sanitários. Quando o resíduo orgânico se decompõe, ela gera gás que consiste em aproximadamente 50% de metano, o principal componente do gás natural.
[00673] Digestão anaeróbica: converte a matéria orgânica em uma mistura de metano, o principal componente do gás natural, e dióxido de carbono. Em um aspecto, biomassa tal como água de esgoto (esgoto), adubo ou resíduo de processamento de alimento, é misturado com água e alimentado em um tanque digestor sem ar.
Fermentação:
[00674] Fermentação alcoólica: álcool combustível é produzido pela
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342/510 conversão de amido em açúcar, fermentação do açúcar em álcool, então separando a mistura de álcool água por destilação. Matériasprimas tais como trigo, cevada, batatas e resíduos de papel, serragem e palha que contém açúcar, amido ou celulose podem ser convertidos para álcool pela fermentação com levedura.
[00675] Transesterificação: um exemplar de reação para converter óleo em biodiesel é chamada de transesterificação. O processo de transesterificação reage um álccol (como metanol) com os óleos de triglicerídeo contidos em óleos vegetais, gorduras animais ou graxas recicladas, formando ésteres alquil de ácido graxo (biodiesel) e glicerina. A reação requer calor e uma base catalisadora forte, tal como hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio.
[00676] Biodiesel: Biodiesel é uma mistura de ésteres alquil de ácido graxo feitos a partir de óleos vegetais, gorduras animais ou graxas recicladas. Biodiesel pode ser usado como combustível para veículos na sua forma pura, mas geralmente é usado como um aditivo para o diesel de petróleo para reduzir os níveis de particulados, monóxido de carbono, hidrocarbonetos e gases tóxicos de veículos movidos à diesel.
[00677] Hidrólise: inclui hidrólise de um composto, por exemplo, uma biomassa, tal como um material lignocelulósico, catalisado usando uma enzima da presente invenção.
[00678] Cogeração: é a produção simultânea de mais de uma forma de energia usando um único combustível e equipamento. Em um aspecto, a cogeração de biomassa tem maior potencial de desenvolvimento do que a geração de biomassa apenas, por que a cogeração produz ambos calor e eletricidade.
[00679] Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção tem atividade enzimática suficiente ou podem ser usados com outras enzimas em um processo para gerar um biodiesel ou um combustível, por exemplo,
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343/510 um biocombustível tal como bioetanol, biobutanol, biometanol, biopropanol, a partir de um material orgânico, por exemplo, uma biomassa, tal como as composições derivadas de plantas e animais, incluindo qualquer cultura agrícola ou outras matérias-primas renováveis, um resíduo agrícola ou um resíduo animal ou os componentes orgânicos de resíduos municipais e industriais ou microrganismos tais como algas ou levedura.
[00680] Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção são usados em processos para conversão de um material orgânico, por exemplo, uma biomassa, tal como uma biomassa lignocelulósica, em um biocombustível, tal como bioetanol, biobutanol, biometanol, biopropanol ou, por outro lado, são usados em processos para hidrolisar ou digerir bio-materiais tal que eles possam ser usados como um biocombustível (incluindo biodiesel ou bioetanol, biobutanol, biometanol, biopropanol) ou par tornar mais fácil a biomassa ser processada em um combustível. Em um aspecto alternativo, os polipeptídeos da invenção são usados em processos para um processo de transesterificação que reage um álcool (como metanol, butanol, propanol, etanol) com um óleo de triglicerídeo contido em óleos vegetais, gorduras animais ou graxas recicladas, formando ésteres alquil de ácido graxo (biodiesel) e glicerina. Em um aspecto, biodiesel é feito de óleo de soja ou óleos culinários reciclados. Gorduras animais, outros óleos vegetais e outros óleos reciclados também podem ser usados para produzir biodiesel, dependendo de seus custos e disponibilidade. Em outro aspecto, misturas de todos os tipos de gorduras e óleos são usadas para produzir um biodiesel da invenção.
[00681] Enzimas da invenção também podem ser usadas no refino de glicerina. O subproduto de glicerina contém catalisadores e sabões não reagidos que são neutralizados com um ácido. Água e álcool são removidos para produzir 50 a 80% de glicerina bruta. Os contaminanPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 349/525
344/510 tes restantes incluem gorduras e óleos não reagidos, que podem ser processados usando os polipeptídeos da invenção. Na grande escala de plantas de biodiesel da invenção, a glicerina pode ainda ser purificada, por exemplo, para 99% de pureza ou mais, para as indústrias farmacêutica e cosmética.
[00682] Ambos, o biodiesel e bioetanol, feitos usando os polipeptídeos da invenção podem ser usados como oxigenatos de combustível para melhorar as características da combustão. Adicionar oxigênio resulta em combustão mais completa, o que reduz as emissões de monóxido de carbono. Esse é outro benefício ambiental da substituição de combustíveis de petróleo por biocombustíveis (por exemplo, um combustível da invenção). Um bioetanol feito usando as composições e/ou métodos dessa invenção pode ser misturado com gasolina para formar um combustível E10 (cerca de 5% a 10% de etanol e cerca de 90% a 95% de gasolina), mas ele pode ser usado em concentrações mais elevadas tal como E85 ou em sua forma pura. Um bioetanol feito usando as composições e/ou métodos dessa invenção pode ser misturado com diesel de petróleo para formar uma mistura B20 (20% de biodiesel e 80% de diesel de petróleo), embora outros níveis de misturas possam ser usados até B100 (biodiesel puro).
[00683] Em um aspecto, os polipeptídeos dessa invenção são usados em processos para converter material orgânico, por exemplo, uma biomassa, tal como biomassa lignocelulósica, em metanol, butanol, propanol e/ou etanol. A invenção também fornece processos para fazer etanol (“bioetanol”), metanol, butanol e/ou propanol a partir de composições que compreendem material orgânico, por exemplo, uma biomassa, tal como biomassa lignocelulósica. O material orgânico, por exemplo, uma biomassa, tal como biomassa lignocelulósica pode ser obtido de culturas agrícolas, como um subproduto de produção de alimento ou ração ou como biomassa de produtos residuais, tais como
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345/510 resíduos de planta e resíduos de papel. Exemplos de resíduos de plantas adequados para tratamento com polipeptídeos da invenção incluem grãos, sementes, caules, folhas, cascas, pericarpo, espigas de milho, palhas de milho, talos, gramas (por exemplo grama indiana, tal como Sorghastrum nutans; ou switch Grass, por exemplo da espécie Panicum, tal como Panicum virgatum) e semelhantes, assim como madeira lascas de madeira, polpa de madeira e serragem. Exemplos de resíduos de papel adequados para tratamento com polipeptídeos da invenção incluem papel de fotocópia descartado, papel de impressora, papel agenda, papel de caderna, papel para impressão e semelhantes, assim como jornais, revistas, papelão e materiais de embalagem baseados em papel.
[00684] Em um aspecto, as enzimas e métodos da invenção podem ser usados em conjunto com meios mais “tradicionais” de fazer metanol, butanol, propanol e/ou etanol de biomassa, por exemplo, como métodos que compreendem hidrolisar a biomassa (por exemplo, materiais lignocelulósicos) pela submissão de material de biomassa seco em um raetor a um catalisador compreendido por uma solução diluída de um ácido forte ou sal de metal; isso pode diminuir a energia de ativação ou a temperatura da hidrólise da celulose para se obter maiores rendimentos de açúcar; por exemplo, veja Patentes U.S. Nos. 6.660.506; 6.423.145.
[00685] Outro método exemplar que incorporou o uso de enzimas da invenção compreende hidrolisar biomassa (por exemplo, materiais lignocelulósicos) que contém xilano, hemicelulose, celulose e/ou lignina pela submissão do material a um primeiro estágio da etapa de hidrólise em um meio aquoso em uma temperatura e pressão escolhidas para efetuar a despolimerização primariamente de hemicelulose sem a despolimerização principal de celulose para glicose. Essa etapa resulta em uma pasta em que a fase líquida aquosa contém monossacaríPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 351/525
346/510 deos dissolvidos que resultam da despolimerização da hemicelulose e uma fase sólida que contém celulose e lignina. Um segundo estágio da etapa de hidrólise pode compreender condições tais que pelo menos uma porção principaç de celulose é despolimerizada, tal etapa resultando em uma fase líquida aquosa que contém produtos de despolimerização de celulose dissolvidos/solúveis. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.536.325. Enzimas da invenção podem ser adicionadas em qualquer estágio desse processo exemplar.
[00686] Outro método exemplar que incorporou o uso de enzimas da invenção compreende processar um material de biomassa por um ou mais estágios de hidrólise com ácido diluído com cerca de 0,4 a 2% de ácido forte; e tratar o componente lignocelulósico sólido não reagido do material de biomassa hidrolisada com ácido pela deslignificação para produzir precursores para termoplásticos biodegradáveis e derivados. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.409.841. Enzimas da invenção podem ser adicionadas em qualquer estágio desse processo exemplar.
[00687] Outro método exemplar que incorporou o uso de enzimas da invenção compreende pré-hidrolisar biomassa (por exemplo, materiais lignocelulósicos) em um reator de pré-hidrólise; adicionar um líquido ácido ao material lignocelulósico sólido para fazer uma mistura; aquecer a mistura até a temperatura de reação; manter a temperatura de reação por tempo suficiente para fracionar o material lignocelulósico em uma porção solubilizada que contém pelo menos cerca de 20% da lignina do material lignocelulósico e uma fração sólida que contém celulose; remover a porção solubilizada da fração sólida na ou próximo da temperatura de reação enquanto a celulose na fração sólida está mais sensível à digestão enzimática; e recuperar a porção solubilizada. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.705.369. Enzimas da invenção podem ser adicionadas em qualquer estágio desse processo
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347/510 exemplar.
[00688] A invenção fornece métodos para fazer composições combustíveis para motor (por exemplo, para motores de combustão interna) baseados em misturas de hidrocarbonetos líquidos com um álcool anidro feito com o uso de uma enzima ou um método da invenção. Em um aspecto, os combustíveis feitos com uma enzima da invenção compreendem, por exemplo, misturas de gás liquefeito de carvão ou gás natural líquido-etanol. Em um aspecto, um co-solvente é 2metiltetraidrofurano (MTHF) derivado de biomassa. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.712.866.
[00689] Em um aspecto, métodos da invenção para a degradação enzimática de biomassa (por exemplo, materiais lignocelulósicos), por exemplo, para a produção de um biocombustível, por exemplo, um etanol, a partir de uma biomassa ou qualquer material orgânico, também podem compreender o uso de tratamento ultrassônico de um material de biomassa; veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.333.181. [00690] Em outro aspecto, métodos da invenção para a produção de um biocombustível, por exemplo, um etanol (um bioetanol) a partir de substrato de biomassa (por exemplo, um celulósico) compreendem fornecer uma mistura de reação na forma de uma pasta que compreende substrato de biomassa (por exemplo, um celulósico), uma enzima dessa invenção e um agente de fermentação (por exemplo, dentro de um vaso de reação, tal como um bioreator alimentado com sólidos semi-continuamente) e a mistura de reação é reagida sob condições suficientes para iniciar e manter uma reação de fermentação (como descrita, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. N°. 20060014260). Em um aspecto, ou cálculos experimentais ou teóricos podem determinar uma freqüência de alimentação ótima. Em um aspecto, quantidades adicionais de substrato de biomassa (por exemplo, um celulósico) e enzima são fornecidas ao vaso de reação em intervaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 353/525
348/510 lo (s) de acordo com a freqüência de alimentação otimizada.
[00691] Outro processo exemplar para fazer biocombustíveis e biodiseis da invenção está descrito nos Pedidos de Patente U.S. Publicados Nos. 20050069998; 20020164730; e em um aspecto, compreende estágios de triturar a biomassa (por exemplo, material lignocelulósico) (por exemplo, para um tamanho de 15-30 mm), submeter o produto obtido a um pré-tratamento de explosão a vapor (por exemplo, em uma temperatura de 190-230°C) entre 1 e 10 minutos em um reator; coletar o material pré-tratado em um ciclone ou produto de fabricação relacionado; e separar as frações líquidas e sólidas por filtração em um filtro de pressão, introduzir a fração sólida em um depósito de fermentação e adicionar uma ou mais enzimas da invenção e, em um aspecto, outra enzima também é adicionada, por exemplo, uma enzima celulase e/ou beta-glicosidase (por exemplo, dissolvida em tampão de citrato pH 4.8).
[00692] Outro processo exemplar para fazer biocombustíveis e biodieseis da invenção, que compreendem metanol, butanol, propanol e/ou etanol, usando enzimas da invenção compreende pré-tratar um material inicial que compreende uma matéria bruta de biomassa (por exemplo, um lignocelulósico) que compreende pelo menos um xilano, uma hemicelulose e/ou uma celulose. Em um aspecto, o material inicial compreende batatas, soja (colza), cevada, centeio, milho, aveia, trigo, beterraba ou cana-de-açúcar ou um componente ou resíduo ou subproduto de produção de alimento ou ração. O material inicial (“matéria-prima”) é reagido em condições que rompem a estrutura de fibras da plantapara efetuar pelo menos uma hidrólise parcial da biomassa (por exemplo, hemicelulose e/ou celulose). As condições de ruptura podem compreender, por exemplo, submeter o material inicial a uma temperatura média de 180°C a 270°C em pH de 0.5 a 2.5 por um período de 5 segundos a 120 segundos ou equivalente. Isso gera uma maPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 354/525
349/510 téria-prima com acessibilidade aumentada para ser digerida por uma enzima, por exemplo, uma enzima celulase da invenção. Patente U.S. N° 6.090.595.
[00693] Condições exemplares para hidrólise de biomassa (por exemplo, material lignocelulósico) por uma enzima dessa invenção incluem reações em temperaturas entre 30°C e 48°C e/ou um pH entre cerca de 4.0 e 6.0. Outras condições exemplares incluem temperaturas entre cerca de 30°C e 60°C e um pH entre cerca de 4.0 a 8.0. Biocombustíveis e alcoóis produzidos biologicamente.
[00694] A invenção fornece biocombustíveis e combustíveis sintéticos, incluindo líquidos e gases (por exemplo, gás de síntese) e alcoois produzidos biologicamente, e métodos para fazê-los, usando as composições (por exemplo, enzima e ácidos nucléicos, plantas transgênicas, animais, sementes e microrganismos) e métodos da invenção. A invenção fornece biocombustíveis e álcoois produzidos biologicamente que compreendem enzimas, ácidos nucléicos, plantas transgênicas, animais (por exemplo microrganismos tais como bactérias e levedura) e/ou sementes da invenção. Em um aspecto, esses biocombustíveis e álcoois produzidos biologicamente são produzidos a partir de biomassa.
[00695] A invenção fornece álcoois produzidos biologicamente, tais como etanol, metanol, propanol e butanol, produzidos pelos métodos da invenção que incluem a ação de micróbios e enzimas da invenção através de fermentação (hidrólise) para resultar em um álcool combustível.
Biocombustíveis como um líquido ou uma gasolina [00696] A invenção fornece biocombustíveis e combustíveis sintéticos na firma de um gás ou gasolina, por exemplo, um gás de síntese. Em um aspecto, métodos da invenção que compreendem o uso de enzimas da invenção para ciclos químicos para conversão de biomasPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 355/525
350/510 sa natural, por exemplo, para a hidrólise da biomassa para fazer um biocombustível, por exemplo, um bioetanol, biopropanol, biobutanol ou um biometanol ou um combustível sintético na forma de um líquido ou como um gás, tal como um “gás de síntese”.
[00697] Por exemplo, a invenção fornece métodos para fazer gases de biocombustível e combustíveis de gás de síntese (“syngas”), que compreendem um bioetanol, biopropanol, biobutanol e/ou biometanol, feitos usando um polipeptídeo da invenção ou feitos usando um método da invenção; e em um aspecto, esse gás de biocombustível da invenção é misturado com um gás natural (pode também ser produzido de biomassa, por exemplo, um gás combustível baseado em hidrogênio ou um hidrocarboneto.
[00698] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para processar biomassa em um combustível sintético, por exemplo um gás de síntese, tal como um gás de síntese produzido a partir de uma biomassa por gaseificação. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para fazer um gás de etanol, propanol, butanol e/ou metanol a partir de cana-de-açúcar, por exemplo, um bagaço. Em um aspecto, esse combustível ou gás é usado como combustível de motor, por exemplo, combustível automotivo, de caminhão, avião, barco, motor pequeno, etc. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para fazer um etanol, propanol, butanol e/ou metanol de uma planta, por exemplo, milho, ou produto de planta, por exemplo, forragem ou palha (por exemplo, palha de arroz ou palha de trigo ou qualquer caule seco de qualquer planta de cereal) ou um resíduo de produto agrícola. Etanol, propanol, butanol e/ou metanol celulósicos podem ser produzidos a partir de uma planta, por exemplo, milho, ou produto de planta, por exemplo, forragem ou palha ou um resíduo de produto agrícola (por exemplo, como processado por Iogen Corporation de Ontário, Canadá).
[00699] Em um aspecto, o etanol, propanol, butanol e/ou metanol
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351/510 feitos usando um método de composição da invenção pode ser usado como um aditivo para combustível (por exemplo, uma gasolina) (por exemplo um oxigenador) ou em um uso direto como um combustível. Por exemplo, etanol, propanol, butanol e/ou metanol, incluindo um combustível, feitos pelo método da invenção podem ser misturados com um éter butil etil terciário (ETBA) ou uma mistura de ETBE tal como ETBE contendo 47% de etanol como um biocombustível ou com MTBE (eter butil metil terciário). Em outro aspecto, etanol, propanol, butanol e/ou metanol, incluindo um combustível, feitos pelo método da invenção podem ser misturados com:
Nome IUPAC Nome comum
but-1-eno a-butileno
c/s-but-2-eno c/s-p-butileno
frans-but-2-eno frans-p-butileno
2-metilpropeno isobutileno
[00700] Um butanol e/ou etanol feitos por um método da invenção (por exemplo, usando uma enzima da invenção) podem ser processados ainda usando fermentação “A.B.E.” (Acetona, Butanol, Etanol); em um aspecto, butanol sendo o único produto líquido. Em um aspecto, esse butanol e/ou etanol é queimado “diretamente” em motores a gasolina existentes (sem modificação do motor ou do carro), produz mais energia e é menos corrosivo e menos solúvel em água do que o etanol e pode ser distribuído através das infra-estruturas existentes.
[00701] A invenção também fornece alcoóis misturados nos quais um, vários ou todos os alcoóis são feitos pelos processos que compreendem pelo menos um método da invenção (por exemplo, usando uma enzima da invenção), por exemplo, compreendendo uma mistura de etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol e heptanol, tal como ECALENE™ (Power Energy Fuels, Inc., Lakewood, CO), por exemplo.:
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Combustível Exemplar da Invenção
Componente Peso%
Metanol 0%
Etanol 75%
Propanol 9%
Butanol 7%
Pentanol 5%
Hexanol & Superiores 4%
[00702] Em um aspecto, um, vários ou todos esses alcoóis são feitos por um processo da invenção usando uma enzima da invenção e o processo pode compreender ainda uma tecnologia de biomassa para líquido, por exemplo, um processo de gaseificação para produzir gás de síntese seguido pela síntese catalítica ou pela bioconversão de biomassa em um combustível de álcool misturado.
[00703] A invenção também fornece processos que compreendem o uso de uma enzima da invenção que incorpora (ou incorporada em) processos de “gás para líquido” ou GTL; ou “carvão para líquido” ou CTL; ou “biomassa para líquido” ou BTL; ou “areias oleíferas para líquido” ou OTL; e em um aspecto, esses processos da invenção compreendem fazer um biocombustível (por exemplo, um combustível sintético) de uma biomassa usando, por exemplo, o assim chamado processo de “Fischer Tropsch” (uma reação química catalisada na qual o monóxido de carbono e hidrogênio são convertidos em hidrocarbonetos líquidos de várias formas; catalisadores típicos usados são baseados em ferro e cobalto; o propósito principal desse processo é produzir um substituto sintético do petróleo para uso como óleo lubrificante sintético ou como combustível sintético). Em um aspecto, esse biocombustível sintético da invenção pode conter oxigênio e pode ser usado como aditivo em diesel e gasolina de alta qualidade.
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353/510 [00704] Em aspectos alternativos, os processos da invenção usam vários pré-tratamentos, que podem ser agrupados em três categorias: físico, químico e múltiplo (físico + químico). Quaisquer químicos podem ser usados como um agente de pré-tratamento, por exemplo, ácidos, álcalis, gases, celulose, solventes, alcoóis, agentes oxidantes e agentes redutores. Entre esses químicos, álcali é o agente de prétratamento mais popular por que ele é relativamente barato e resulta em menos degradação de celulose. Os álcalis comuns, hidróxido de sódio e cal também podem ser usados como agentes de prétratamento. Embora o hidróxido de sódio aumente significativamente a digestibilidade da biomassa, ele é difícil de reciclar, é relativamente caro e é perigoso de manusear. Em contraste, cal tem muitas vantagens: é segura e muito barata e pode ser recuperada pela carbonatação da água de lvagem com dióxido de carbono.
[00705] Em um aspecto, a invenção fornece um sistema de multienzima (incluindo pelo menos uma enzima da invenção) que pode hidrolisar polissacarídeos em biomassa, por exemplo, cana-de-açúcar, por exemplo, bagaço, um componente de cana-de-açúcar processado em moinhos de açúcar. Em um aspecto, a biomassa é processada por uma enzima da invenção feita por um organismo (por exemplo, animal transgênico, planta ou microrganismo transformado) e/ou subproduto (por exemplo, planta colhida, fruto, semente) que expressa uma enzima da invenção. Em um aspecto, a enzima é uma enzima recombinante feita pela planta ou biomassa que é para ser processada em um combustível, por exemplo, a invenção fornece um bagaço de cana-deaçúcar transgênica que compreende uma enzima da invenção. Em um aspecto, essas composições e produtos usados nos métodos da invenção compreendem ciclos químicos para conversão de biomassa natural, por exemplo, para a hidrólise de uma biomassa para fazer um biocombustível, por exemplo, bioetanol, biopropanol, biobutanol, bioPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 359/525
354/510 metanol, um combustível sintético na forma de um líquido ou um gás, tal como um “gás de síntese”.
[00706] Em um aspecto, a invenção fornece um biocombustível, por exemplo, um biogás, produzido pelo processo de digestão anaeróbica de material orgânico por anaeróbios, em que o processo compreende o uso de uma enzima da invenção ou de um método da invenção. Esse biocombustível, por exemplo, um biogás, pode ser produzido tanto a partir de materiais residuais biodegradáveis quanto pelo uso de culturas energéticas alimentadas em digestores anaeróbicos para suplementar a produção de gás. O produto sólido, biofertilizante, também pode ser usado como um biocombustível.
[00707] Em um aspecto, a invenção fornece um biocombustível, por exemplo, um biogás, que compreende metano, em que o processo compreende o uso de uma enzima da invenção ou um método da invenção. Esse biocombustível, por exemplo, um biogás, pode ser recuperado em digestores anaeróbicos industriais e sistemas de tratamento mecânico biológico. O gás natural pode ser ainda processado usando uma enzima dessa invenção ou um processo dessa invenção; antes do processamento, o gás natural pode ser uma forma menos limpa de biogás produzido em aterros sanitários através da digestão anaeróbica que ocorre naturalmente. Paradoxalmente, se o gás natural é deixado escapar para a atmosfera, ele é um potente gás para o efeito estufa.
[00708] A invenção fornece métodos para fazer óleos e gases biologicamente produzidos a partir de vários resíduos, nos quais o processo compreende o uso de uma enzima da invenção ou um método da invenção. Em um aspecto, esses métodos compreendem a despolimerização térmica do resíduo para extrair metano e outros óleos similares ao petróleo; ou, por exemplo, um sistema de biorreator que utilize algas fotossintéticas não tóxicas para captar gases de chaminés e
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355/510 produzir biocombustíveis tais como biodiesel, biogás e um combustível seco comparável ao carvão, por exemplo, como designado por GreenFuel Technologies Corporation, de Cambridge, MA.
[00709] A invenção fornece métodos para fazer óleos biologicamente produzidos, incluindo óleos brutos e gases que podem ser usados em motores a diesel, nos quais o processo compreende o uso de uma enzima da invenção ou um método da invenção. Em um aspecto, esses métodos podem refinar petróleo, por exemplo, óleos brutos, em querosene, petróleo, diesel e outras frações.
[00710] A invenção fornece métodos (usando uma enzima da invenção ou um método da invenção) para fazer óleos biologicamente produzidos a partir de:
»Óleo vegetal puro (SVO).
»Resíduo de óleo vegetal (VWO) — resíduos de óleos culinários e gorduras produzidas em quantidade principalmente em cozinhas comerciais.
• Biodiesel obtido da transesterificação de gorduras de animal e óleo vegetal, utilizável diretamente em motores a diesel de petróleo.
• Óleo bruto biologicamente derivado, junto com biogás e sólidos de carbono através de despolimerização térmica de materiais orgânicos complexos incluindo materiais que não são baseados em óleo; por exemplo, produtos residuais tais como pneus velhos, partes não comestíveis de animal, madeira e plástico.
• Óleo de pirólise; que pode ser produzido de biomassa, resíduo de madeira, etc., usando calor apenas para desencadear o processo de pirólise (o óleo deve ser tratado antes de usar em sistemas de combustível convencional ou motores de combustão interna) • Madeira, carvão e estrume seco.
Aplicações médicas e de pesquisa
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356/510 [00711] Xilanases da invenção, incluindo as misturas de enzima ou “coquetéis” da invenção podem ser usadas como agentes antimicrobianos devido às suas propriedades bacteriolíticas. Xilanases da invenção podem ser usadas para eliminar ou proteger animais de salmonelas, como descrito, por exemplo, no Pedido PCT Nos. WO0049890 e WO9903497. Em outro aspecto da invenção, as xilanases da invenção também podem ser usadas como um limpador antimicrobiano de superfície ou repelente microbiano.
Outras aplicações industriais e médicas [00712] Como discutido acima, xilanases da invenção, incluindo as misturas de enzima ou “coquetéis” da invenção, podem ser usadas, por exemplo, em uma grande variedade de processos industriais, aplicações médicas e de pesquisa (laboratório) e aplicações em alimentos, ração animal e bebida. Novas xilanases são descobertas pelo rastreamento de bibliotecas existentes e bibliotecas de DNA construídas a partir de localizações mesofílicas e termofílicas diversas assim como fontes intencionais incluindo a flora digestiva, microrganismos em resíduo animal, bactérias do solo e habitats altamente alcalinos.
[00713] A bio-captura e estratégias de enriquecimento primário usando substratos de arabinoxilano e/ou frações de polissacarídeos não solúveis de material de ração animal também são úteis.
[00714] Duas formas de rastreamento (baseado na atividade e baseado na sequência)são usadas na descoberta de novas xilanases. A abordagem baseada na atividade é o rastreamento direto para a atividade de xilanase em placas de ágar que usam um substrato tal como azo-xilano (Megazyme). Alternativamente, a abordagem baseada na sequência pode ser usada, a qual se apóia na bioinformática e biologia molecular para designar sondas para hibridização e bio-rastreamento. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.054.267, 6.030.779, 6.368.798, 6.344.328. Achados do rastreamento são purificados, sePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 362/525
357/510 qüenciados, caracterizados (por exemplo, determinação de especificidade, temperatura e pH ótimos), analisados usando bioinformática, subclonados e expressos para caracterização bioquímica básica. Esses métodos podem ser usados no rastreamento de xilanases úteis em uma miríade de aplicações, incluindo condicionamento de massa de trigo e como enzimas aditivas para ração animal.
[00715] Na caracterização de enzimas obtidas pelo rastreamento, a utilidade exemplar no processamento de massa e aplicações de cozimento pode ser avaliada. A caracterização pode incluir, por exemplo, medida de especificidade de substrato (xilano, arabinoxilano, CMC, BBG), estabilidade de temperatura e pH e atividade específica. Uma enzima comercial pode ser usada como medida padrão. Em um aspecto, as enzimas da invenção tem atividade significativa em pH > 7 e 25-35°C, são inativas em xilano solúvel, são estáveis e ativas em 5067% de sacarose.
[00716] Em outro aspecto, utilidade como aditivos para ração pode ser avaliada a partir da caracterização de enzimas candidatas. A caracterização pode incluir, por exemplo, a medida da especificidade do substrato (xilano, arabinoxilano, CMC, BpG), estabilidade de temperatura e pH, atividade específica e estabilidade gástrica. Em um aspecto, a ração é designada para um animal monogástrico e em outro aspecto a ração é designada para um animal ruminante. Em um aspecto, as enzimas da invenção tem atividade significativa em pH 2-4 e 35-40°C, uma meia-vida maior do que 30 minutos no fluido gástrico, meia-vida da formulação (em tampão ou células) maior do que 5 minutos a 85°C e são usadas como aditivo para ração de animal monogástrico. Em outro aspecto, as enzimas da invenção tem uma ou mais das seguintes características: atividade significativa em pH 6.5 a 7.0 e 35 a 40°C, uma meia-vida maior do que 30 minutos no fluido do rúmen, estabilidade da formulação tão estável quanto um pó seco e são usadas coPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 363/525
358/510 mo aditivo para ração de animal ruminante.
[00717] Enzimas são reativas frente a uma ampla faixa de substratos naturais e não-naturais, possibilitando assim a modificação de virtualmente qualquer composto de chumbo orgânico. Além disso, diferente dos catalisadores químicos tradicionais, as enzimas são altamente enantio e régio-seletivas. O alto grau de especificidade funcional por grupo exibida pelas enzimas possibilita que se observe cada reação de uma sequência sintética que leva a um novo composto ativo. Enzimas também são capazes de catalisar várias reações diversas não relacionadas com suas funções fisiológicas na natureza. Por exemplo, peroxidases catalisam a oxidação de fenóis pelo peróxido de hidrogênio. Peroxidases também podem catalisar reações de hidroxilação que não estão relacionadas com a função nativa da enzima. Outros exemplos são xilanases que catalisam a decomposição de polipeptídeos. Em solução orgânica algumas xilanases podem também acilar açúcares, uma função não relacionada com a função nativa dessas enzimas. Apesar do uso de biocatalisadores (isto é, enzimas purificadas ou brutas, células vivas ou não-vivas) em transformações químicas normalmente requerer a identificação de um biocatalisador em particular que reage com um composto inicial específico, a presente invenção usa biocatalisadores selecionados e condições de reação que são específicas para grupos funcionais que estão presentes em vários compostos iniciais. Cada biocatalisador é específico para um grupo funcional ou vários grupos funcionais relacionados e pode reagir com vários compostos iniciais que contém esse grupo funcional. Essas reações biocatalíticas produzem uma população de derivados a partir de um único composto inicial. Esses derivados podem ser submetidos à outra rodada de reações biocatalíticas para produzir uma segunda população de compostos derivados. Milhares de variações do composto original podem ser produzidas com cada interação de derivatização
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359/510 biocatalítica.
[00718] Enzimas reagem em sítios específicos de um composto inicial sem afetar o resto da molécula, um processo que é muito difícil de se obter usando métodos químicos tradicionais. O alto grau de especificidade biocatalítica fornece o meio para identificar um único composto ativo dentro da biblioteca. A biblioteca é caracterizada pela série de reações biocatalíticas usadas para produzi-la, a assim chamada “história biossintética”. Rastrear a biblioteca quanto a atividades biológicas e traçar a história biossintética identifica a sequência de reação específica que produz o composto ativo. A sequência de reação é repetida e a estrutura do composto sintetizado é determinada, Esse modo de identificação, diferente de outras abordagens de síntese e rastreamento, não requer tecnologias de imobilização e os compostos podem ser sintetizados e testados livres na solução usando virtualmente qualquer tipo de ensaio de rastreamento. É importante observar que o alto grau de especificidade de reações enzimáticas sobre grupos funcionais permite “seguir a pista” de reações enzimáticas específicas que fazem a biblioteca biocataliticamente produzida.
[00719] Várias etapas processuais são realizadas usando automação robótica que permite a execução de vários milhares de reações biocatalíticas e ensaios de rastreamento por dia assim como assegurando um alto nível de precisão e reprodutibilidade. Como resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas o que poderia levar anos para produzir usando métodos químicos comuns. (Para outros ensinamentos sobre modificação de moléculas, incluindo moléculas pequenas, veja PCT/US94/09174).
[00720] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende pelo menos um polímero muco-adesivo que é capaz de formar um hidrogel e pelo menos um polímero solúvel em água e uma
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360/510 ou mais enzimas da invenção. Essa formulação pode ser usada em qualquer processamento industrial, alimentício ou para ração ou aplicação médica ou de pesquisa da invenção, isto é, qualquer aplicação que usa uma enzima ou ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, a formulação forma um hidrogel em solução aquosa que tem propriedades muco-adesivas; isso pode ser capaz de liberar enzimas, microrganismos capazes de gerar enzimas da invenção ou anticorpos da invenção, durante um período de tempo prolongado. Alternativamente, o hidrogel pode aprisionar enzimas, microrganismos capazes de gerar enzimas da invenção ou anticorpos da invenção e liberá-los durante um período de tempo definido (por exemplo, prolongado).
[00721] A invenção será ainda descrita com relação aos seguintes exemplos; entretanto, é para ser entendido que a invenção não está limitada a tais exemplos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: DESCOBERTA DE ENZIMA ENDOGLICOSIDASE BASEADA EM PLACA: PESQUISA DE EXPRESSÃO [00722] Determinação do título da Biblioteca Lambda: Adicionar 1,0 mL de estoque de biblioteca Lambda Zap Express amplificada a 600mL de células MRF' de E. coli (OD600=1,0). Diluir o estoque de MRF' com 10mM de MgS04. Incubar a mistura a 37°C por 15 minutos, então transferir a suspensão para 5 a 6 mL de NZY top ágar a 50 °C e misture gentilmente. Imediatamente derrame a solução de ágar sobre placas grades (150 mm) de meio NZY e deixe o top ágar solidificar completamente (aproximadamente 30 minutos). Inverta a placa. Incube a placa a 39°C por 8 a 12 horas. (O número de placas é aproximado. A titulação dos fagos é determinada para dar 50.000 pfu/placa. Dilua uma alíquota de fagos da biblioteca com tampão SM se necessário.) [00723] Pesquisa de substrato: Adicionar Lambda Zap Express (50.000 pfu) da biblioteca amplificada a 600pL de células MRF' de E.
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361/510 coli (OD600=1,0) e incube a 37°C por 15 minutos. Enquanto a suspensão fago/célula esta incubando, adicionar 1,0 mL do substrato desejado de polissacarídeo marcado com corante (geralmente 1 a 2% p/v) a 5,- mL de NZY top ágar a 50°C e misture vigorosamente. (solução mantida a 50°C até necessário.) transfira a suspensão celular para solução de substrato/top ágar e misture gentilmente. Imediatamente derrame a solução sobre placas grandes (150 mm) de meio NZY. Deixe o top ágar solidificar completamente (aproximadamente 30 minutos), e então inverta a placa. Incube a placa a 39°C por 8 a 12 horas. Observe a placa quanto a áreas claras (halos) ao redor das colônias. Remova as colônias com halos do ágar e transfira para um microtubo estéril. (uma ponteira de pipeta com orifício largo de 200 mL funciona para remover (perfurar) o ágar contendo a colônia desejada). Ressuspenda os fagos em 500mL em tampão SM. Adicione 20mL de clorofórmio para inibir qualquer crescimento celular adicional.
[00724] Isolamento de clones puros: Adicione 5mL de suspensão de fagos ressuspensos a 500mL de células MRF' de E. coli (OD600=1,0). Incube a 37°C por 15 minutos. Enquanto a suspensão de fagos/célula está incubando, adicione 600mL do substrato desejado de polissacarídeo marcado com corante (geralmente 1 a 2% p/v) a 3,0mL de NZY top ágar a 50°C e misture vigorosamente. (solução mantida a 50°C até necessário.) Transfira a suspensão celular para a solução de substrato/top ágar e misture gentilmente. Imediatamente derrame a solução sobre placas pequenas (90 mm) de meio NZY e deixe o top ágar solidificar completamente (aproximadamente 30 minutos), e então inverta a placa. Incube a placa a 39°C por 8 a 12 horas. As placas são observadas quanto a uma zona clara (halo) ao redor de uma colônia única (clone puro). (Se uma única colônia não puder ser isolada, ajuste a titulação e replaqueie e suspensão de fagos). Os fagos são ressupensos em 500mL de tampão SM e 20mL de clorofórmio são adicionados
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362/510 para inibir qualquer crescimento celular adicional.
[00725] Remoção de clone puro: Deixe a suspensão de fagos puros incubar em temperatura ambiente por 2 a 3 horas ou durante a noite a 4°C. Adicione 100gL de suspensão de fagos puros a 200mL de células MRF' de E. coli (OD600=1,0). Adicione 1,0gL de fagos auxiliares ExAssist (>1 x 106 pfu/mL; Stratagene). Incube a suspensão a 37°C por 15 minutos. Adicione 3,0 mL de meio 2 x YT à suspensão celular. Incube a 37°C por 2 a 2,5 horas durante agitação. Transfira o tubo para 70°C por 20 minutos. Transfira 50 a 100 mL de suspensão de fagomídeo a microtubos contendo 200mL de células Exp 505 de E. coli (OD600=1.0). Incube a suspensão a 37°C por 45 minutos. Plaqueie 100 mL de suspensão celular sobre meio LBcan 50 (meio LB com canamicina 50mg/mL). Incube a placa a 37°C por 8 a 12 horas. Observe a placa quanto a colônias. Qualquer colônia que cresça contém o fagomídeo puro. Pegue uma colônia a cultive uma pequena cultura líquida (3 a 10 mL) por 8 a 12 horas. O meio de cultura é LB can 50 líquido.
[00726] Verificação de atividade: Transfira 1,0 mL de cultura líquida a um microtubo estéril. Centrifugue a 13200 rpm (16000 g's) por 1 minuto. Descarte o sobrenadante e adicione 200mL de tampão de fosfato pH 6.2. Sonique por 5 a 10 segundos sobre gelo usando uma micro ponteira. Adicione 200 mL do substrato apropriado, misture gentilmente e incube a 37 °C por 1,5 a 2 horas. Um controle negativo contendo apenas tampão e substrato deve ser realizado também. Adicione 1,0mL de etanol absoluto (200 proof) à suspensão e misture. Centrifugue a 13200 rpm por 10 minutos. Observe a cor do sobrenadante. A quantidade de coloração pode variar, mas qualquer tubo com mais coloração do que o controle é considerado positivo quanto a atividade. Um espectrofotômetro pode ser usado para esta etapa se assim desejado ou necessário. (Para azo-xilano, Megazyme, leia a 590nm). [00727] RFLP de clones puros das mesmas Bibliotecas: Transfira
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1,0mL de cultura líquida a um microtubo estéril. Centrifugue a 13200 rpm (16000 g's) por 1 minuto. Siga o protocolo do QIAprep spin mini kit (Qiagen) para o isolamento do plasmídeo e use 40 mL água pura (holy water) como o tampão de eluição. Transfira 10 mL de DNA de plasmídeo a um microtubo estéril. Adicione 1,5mL de Tampão 3 (New England Biolabs), 1,5mL de solução de BSA 100X (New England Biolabs) e 2,0mL de água pura. Adicione a isso 1,0mL de Not 1 e 1,0mL de endonucleases de restrição Pst 1 (New England Biolabs). Incube por 1,5 horas a 37°C. Adicione 3,0mL de tampão de corrida 6X (Invitrogen). Corra 15mL da amostra digerida em um gel de agarose a 1,0% por 1 a
1,5 horas a 120 volts. Observe o gel com um visualizados de gel. Faça análise de sequência em todos os clones com um padrão de digestão diferente.
[00728] A Tabela 6 descreve várias propriedades de enzimas exemplares da invenção.
TABELA 6
SEQ ID NO. Topt* Tstab** pHopt* Atividades significati- vas pl Mw Notas
151, 152 50°C <1 min a 65°C 5,5-9,0 AZO-xilano 5,7 40,2
155, 156 50°C <1 min a 65°C 5,5-8,0 AZO-xilano 8,8 62,7
169, 170 50°C > 1 min a 65°C; < 1 min a 85°C 7,0 AZO-xilano 8,7 36,7
195, 196 50°C >1 min a 65°C < 10 min, < 1 min 85°C 5,5 AZO-xilano 8,5 36,7
215, 216 85°C <3 min a 85°C 5,5-8,0 AZO-xilano 8,6 34,8
47, 48 50°C < 0,5 min a 65°C; < 1 min a 85°C 7,0-8,0 AZO-xilano 6,2 40,3
191, 192 385°C > 30 seg a 85°C 5,5 AZO-xilano 7,8 34,6
247, 248 50°C < 1 min a 65°C 8,0 AZO-xilano 9,4 43,5
7, 8 50°C > 1 min 85°C < 5 min 5,5 AZO-xilano 4,5 55,3
221,222 50-65°C <1 min a 75°C 5,5 AZO-xilano 8,3 34,6
163, 164 65°C <1 min a 65°C 7,0 AZO-xilano 6,3 36,0
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SEQ ID NO. Topt* Tstab** pHopt* Atividades significati- vas pi Mw Notas
19, 20 37°C <5 min a 50:C 7,0 - 8,0 AZO-xilano 9,2 41,5
87, 88 37 - 50°C < 1 min a 85°C 8,0 AZO-xilano 5,2 36,7
81, 82 50°C < 1 min a 65°C 7,0 - 9,0 AZO-xilano 5,3 38,8
91, 92 50°C < 1 min a 65°C 7 - 8 AZO-xilano, AZO-CMC 5,4 39,0
61,62 37°C <5 min a 50°C 7,0 - 9,0 AZO-xilano, AZO-CMC 5,4 40
159, 160 85°C < 30 seg a 85°C 5,5 AZO-xilano 8,3 34,5
233, 234 50°C > 30 seg < 1 min a 65°c; < 1 min a 85°C 7,0 AZO-xilano 8,5 35,1
203, 204 50 - 65°C > 1 min a 65°C < 5 min, < 1 min 85°C 5,5 AZO-xilano 9,5 21,7
181, 182 385°C > 1 min a 85°C 5,5-8,0 AZO-xilano 8,8 35,5
227, 228 65°C >1 min a 85°C < 5 min 5,5 - 7,0 AZO-xilano 7,8 25,8
45, 46 345O 35 min 45°C, <0,5 min 55°C > 5,5 AZO-xilano 6,7 40,4 ***
231,232 65°C >10 min a 50°C 5,5 - 7,0 AZO-xilano 8,4 31,4
129, 130 65°C <1min a 75°C 5,5 AZO-xilano 5,1 116
93, 94 50°C < 1 min a 60°C 8,0 - 9,0 AZO-xilano 5,3 39,1
189, 190 65°C <1 min a 65°C 5,5 AZO-xilano 9,2 20,3 ****
49, 50 70°C <20 min 70°C >5 AZO-xilano 5,7 38,9
85, 86 50°C >5 min a 85°C 5,5 - 7,0 AZO-xilano 6,1 48,4
99, 100 50°C <1 min a 75°C 5,5 - 8,0 AZO-xilano 10,8 36,6
123, 124 385°C <30 seg 100 °C 5,5-7,0 AZO-xilano 6,1 44,1
249, 250 45°C >1 min 75°C < 10 min 5,5 AZO-xilano 5,3 93
167, 168 85°C < 5 min 85°C 5,5 AZO-xilano 9,5 21,7
207, 208 75°C < 5 min 65 °C 5,5 AZO-xilano 9,1 20,4
251,252 65-75°C < 1 min 85 °C 5,5 AZO-xilano 8,8 20,4 *****
11, 12 <90°C <40 min 70°C >6 AZO-xilano 6,8 43,9
177, 178 65°C < 1 min a 75°C 5,5 AZO-xilano 8,7 44,6
9, 10 50°C <1min a 65°C 5,5 - 7,0 AZO-xilano 4,9 46,1
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365/510
SEQ ID NO. Topt* Tstab** pHopt* Atividades significati- vas pi Mw Notas
43, 44 370 instável 5,5-7,0 AZO-xilano 4,9 39,1
113, 114 65 - 750 < 1 min a 750 5,5 - 8,0 AZO-xilano 5 41,2
75, 76 500 < 1 min 85C 7,0 - 9,0 AZO-xilano 4,7 39,4
111, 112 370 >10 min 50C 7 - 8 AZO-xilano 5,6 41,0
117, 118 370 instável 7-8 AZO-xilano 9,1 53,3
115, 116 - - - AZO-xilano 8,9 50,8
125, 126 370 - 8,0 AZO-xilano 5,3 41,1
137, 138 500 < 30 seg a 65C 5,5 AZO-xilano 5,7 38,5
69, 70 385O < 5 min a 85C 5,5-9,0 AZO-xilano 6,4 58,0
205, 206 500 <1min a 65C 5,5 - 8 AZO-xilano 4,3 35,1
211,212 500 <1min a 65C 5,5 AZO-xilano 4,4 35,4
197, 198 650 <1 min a 65C 5,5 AZO-xilano 8,8 20,1
31, 32 370 instável 7,0 AZO-xilano 5,1 54,4
13, 14 500 <1 min a 65C 7 AZO-xilano 5,5 40,0
65, 66 500 < 1 min a 65C 5,5 AZO-xilano, AZO-CMC 4,8 55,5
257, 258 370 instável 5,5 AZO-xilano, AZO- βglicano de cevada, AZO-CMC 5,3 100,8
57, 58 500 <1min a 65C 7,0 AZO-xilano 4,8 56,7
185, 186 50-75°C < 1 min a 800 5,5 AZO-xilano 8,8 23,2
243, 244 75°C >0,5 min @ 85°C 5,5 AZO-xilano 8,8 44,4
77, 78 500 < 5 min a 650, < 1 min 850 5,5 AZO-xilano 5,3 44,5
229, 230 370 330 min 55°C, < 5 min 750 5,5 AZO-xilano 8,7 20,6 ******
109, 110 65°C >0,5 min @ 75°C 5,5 AZO-xilano 4,9 45,2
193, 194 650 < 1 min a 75C 5,5 AZO-xilano 5,4 29,1
173, 174 65°C < 1 min a 800 7,0 AZO-xilano 7,6 51,6
59, 60 370 <1min a 65C 7,0 AZO-xilano 6,6 42,5
101, 102 50°C >0,5 min @ 65°C 7,0 AZO-xilano 8,7 41,1
55, 56 370 > 5 min a 50C; < 1 7,0 AZO-xilano 6,5 41,8
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366/510
SEQ ID NO. Topt* Tstab** pHopt* Atividades significati- vas pi Mw Notas
min a 85°C
15, 16 50°C < 1 min a 65°C 7,0 AZO-xilano 6,4 40,2
131, 132 - - - AZO-xilano 5,6 42,1
145, 146 65-85°C < 1 min a 85°C 5,5 AZO-xilano 5,2 43,7
219, 220 - - 5,5 AZO-xilano 6,6 34,5
253, 254 65°C >,5 min a 85°C 5,5 - 7 AZO-xilano 7,8 34,6
255, 256 65°C > 1 min 65°C <3 min 5,5-7,0 AZO-xilano 8,3 35,0
* pH ou temperatura ótima determinada pelas taxas iniciais usando AZO-AZO-xilano como um substrato
** estabilidade térmica, tempo que a enzima manteve atividade significativa (aprox. > 50%)
*** condicionamento de massa **** precursor de GSSM para evolução de tolerância térmica para aplicações em ração animal ***** mutação N35D feita para aumentar a atividade em pH baixo com base em conhecimento publico - atividade relativa da enzima mutante em pH 4 significativamente aumentada ****** Condicionamento de massa
EXEMPLO 2: PESQUISA DE GSSM PARA MUTANTES TOLERANTES [00729] O seguinte exemplo descreve um método exemplar para pesquisar enzimas termicamente tolerantes.
[00730] Placas Master: Prepare placas para um coletor de colônias por marcar placas de 96 cavidades e aliquote 200 pL de LB Amp100 em cada cavidade (~20ml necessários por placa de 96 cavidades). Após as placas terem retornado do coletor, remova o meio da coluna 6 da placa A. Substitua com uma inoculação de SEQ ID NO: 189. Coloque em uma incubadora úmida a 37°C durante a noite.
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367/510 [00731] Ensaio em Placa: Aplique as culturas em uma placa de 96 cavidades (200 mL /cavidade LB Amp100). Remova a cobertura plástica e substitua por lacre permeável ao gás. Coloque em uma incubadora úmida durante a noite. Remova o lacre e substitua a tampa de plástico. Centrifugue as culturas em uma centrífuga tabletop a 3000 rpm por 10 min. Remova o sobrenadante por inversão sobre uma toalha de papel. Aliquote 45 mL de tampão Cit-Fos-KCl pH 6 em cada cavidade. Substitua a tampa plástica por um lacre de placa de alumínio. Use um rolo para obter um bom lacre. Ressuspenda as células em um agitador de placa no nível 6 a 7 por ~30 segundos.
[00732] Coloque a placa de 96 cavidades em uma incubadora a 80°C por 20 minutos. Não empilhar. A seguir, remova imediatamente as placas para água gelada para resfriar por alguns minutos. Remova o lacre de alumínio e substitua por uma tampa de plástico. Adicione 30 mL de 2% Azo-xilano. Misture como antes em um agitador de placa. Incube a 37°C em uma incubadora úmida durante a noite.
[00733] Adicione 200 mL de etanol a cada cavidade e misture por sucção com pipeta. Como uma alternativa para a troca de ponteiras a cada vez, enxágüe em um banho de etanol e seque por expelir o etanol em uma toalha de papel. Centrifugue as placas a 3000 rpm por 10 minutos. Remova 100 mL de sobrenadante para uma nova placa de 96 cavidades. Leia a OD590.
EXEMPLO 3: ENSAIO DE GSSM PARA VERIFICAÇÃO DE SUCESSO DE MUTANTES TOLERANTES À TEMPERATURA [00734] O exemplo a seguir descreve um método exemplar para teste enzimas termicamente tolerantes.
[00735] Aplique ou selecione clones em duplicata em placas de 96 (200ul /cavidade LB Amp100). Remova a cobertura plástica e substitua por um lacre permeável a gás. Coloque em uma incubadora úmida durante a noite. Remova o lacre e substitua por uma tampa de plástico.
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Aplique os clones sobre ágar sólido. Centrifugue as culturas em uma centrifuga tabletop a 3000 rpm por 10 min.Remova o sobrenadante por inversão sobre uma tolha de papel. Aliquote 25 ql de solução de BPER/Lisozima/DNase (veja abaixo) em cada cavidade. Ressuspenda as células em um agitador de placa no nível 6 a 7 por ~30 segundos [00736] Incube a placa sobre gelo por 15 minutos. Adicione 20 qL de tampão Cit-Fos-KCl pH 6 em cada cavidade. Substitua a tampa de plástico por um lacre de placa de alumínio. Use um rolo para obter um bom lacre. Misture em um agitador de placa no nível 6 a 7 por ~30segundos.
[00737] Coloque uma placa de 96 cavidades em uma incubadora a 80°C por 20 minutos e a outra a 37°C. Não empilhar. Remova imediatamente as placas para água gelada para resfriar por alguns minutos (use uma bandeja de plástico grande se necessário). Remova o lacre de alumínio. Adicione 30 ql de 2% Azo-xilano. Lacre com um lacre permeável a gás. Misture como antes no agitador de placas. Incube um grupo de placas de 37°C e 80°C em uma incubadora úmida a 37°C por 2 horas e outro grupo por 4 horas.
[00738] Após incubação, deixe a placa repousar por ~5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 200 qL de etanol a cada cavidade e misture por sucção com pipeta. Ao invés de trocar as ponteiras a cada vez, enxágüe em um banho de etanol e seque por expeli-lo em uma toalha de papel. Mas, use um novo conjunto de ponteiras para cada clone. Centrifugue as placas a 3000 rpm por 10 minutos. Remova 100 qL de sobrenadante a uma nova placa de 96 cavidades. Leia a OD590. [00739] Solução de BPER/Lisozima /DNase (total de 4,74 mL): [00740] 4,5 mL de BPR [00741] 200 qL de Lisozima a 10 mg/mL (feita recentemente em tampão Cit-fos pH 6) [00742] 40 qL de DNase I a 5 mg/mL (feita recentemente em tamPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 374/525
369/510 pão Cit-fos pH 6)
EXEMPLO 4: ENSAIO DE XILANASE COM ARABINOXILANO DE
TRIGO COMO SUBSTRATO [00743] O exemplo a seguir descreve como um ensaio de xilanase exemplar que pode ser usado, por exemplo, para determinar se uma enzima está dentro do escopo da invenção.
[00744] SEQ ID NOS: 11, 12, 69, 70, 77, 78, 113, 114, 149, 150, 159, 160, 163, 164, 167, 168, 181, 182, 197, e 198 foram submetidos à um ensaio em pH 8 (tampão de Na-fosfato) e 70°C usa ndo arabinoxilano de trigo como um substrato. As enzimas foram caracterizadas como descrito na Tabela 7.
TABELA 7
SEQ ID NOS: Concentração de proteína (mg/ml) Volume de lisado adicionado a cada frasco # de frascos Unida- des/ml* Proteína (mg/mL) U/mg
11, 12 42 0,5 10 163 22,0 7,4
113, 114 37 0,6 10 66 22,0 3,0
163, 164 35 0,6 10 25 22,0 1,1
197, 198 23 1,0 10 31 22,0 1,4
167, 168 10 2,2 10 228 22,0 10,4
77, 78 47 0,5 10 29 22,0 1,3
69, 70 18 1,3 10 36 22,0 1,7
181, 182 28 0,8 10 24 22,0 1,1
159, 160 25 0,9 10 43 22,0 2,0
149, 150 42 0,5 10 24 22,0 1,1
* Baseado na adição de 1 mL de água a cada amostra.
[00745] Unidades são umoles de xilose liberados por minuto com
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370/510 base em um ensaio redutor de açúcar.
EXEMPLO 5: GERAÇÃO DE UMA XILANASE EXEMPLAR DA INVENÇÃO [00746] O exemplo a seguir descreve a geração de uma xilanase exemplar da invenção usando mutagênese por tecnologia de mutagênese por saturação do sítio do gene (GSSM), designado a variante ou mutante “9x” (o ácido nucléico descrito em SEQ ID NO:377, a sequência de polipeptídeo descrita em SEQ ID NO:378).
[00747] GSSM foi usada para criar uma grande biblioteca de mutações pontuais na SEQ ID NO:190 exemplar, xilanase “tipo selvagem” (codificada por SEQ ID NO:189). A pesquisa de termotolerância de xilanase descrita acima identificou nove mutantes de um único sítio de aminoácido (Figura 6A) (D8F, Q11H, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A & S79P) que melhorou a tolerância térmica em relação à enzima tipo selvagem (medida após um estímulo com calor a 80DC por 20 minutos). Enzima tipo selvagem e todos os 9 mutantes de um único sítio de aminoácido foram produzidos em E. coli e purificados utilizando um sinalizador de hexahistidina N-terminal. Não houve diferença notável na atividade devido ào sinalizador.
[00748] A Figura 6 ilustra os nove mutantes de um único sítio de aminoácido da “variante 9x”, ou, como descrito em SEQ ID NO:378 (codificada por SEQ ID NO:377), geradas por Mutagênese por Saturação do Sítio do Gene (GSSM) da enzima exemplar SEQ ID NO:190 “tipo selvagem” (codificada por SEQ ID NO:189). A Figura 6A é um diagrama esquemático que ilustra a posição, numeração, e alteração de aminoácido para os mutantes pontuais termotolerantes de gene “tipo selvagem” (SEQ ID NO:190, codificada por SEQ ID NO:189). Uma biblioteca de todos os 64 códons foi gerada para cada posição de aminoácido no gene (~13,000 mutantes) e rastreada quanto a mutações que aumentam a tolerância térmica. A variante “9X” foi gerada
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371/510 por combinar todos os 9 mutantes de sítio único em uma enzima. O ponto médio de transição de temperatura de fusão (Tm) determinado por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) para cada enzima mutante e a variante “9X” (SEQ ID NO:378) é mostrado à direita. A Figura 6B ilustra o desenovelamento das enzimas “tipo selvagem” (SEQ ID NO:190) e “9X” (SEQ ID NO:378). As enzimas “variante/mutante” foram monitoradas por DSC em uma taxa de rastreamento de 1°C/min. Os dados de DSC subtraídos do basal foram normalizados para concentração de proteína.
[00749] Medidas de DSC foram feitas usando um microcalorímetro VP-DSC (Micro-Cal) em duplicata. O volume de amostra necessário foi de 540 pL. As concentrações da proteína foram entre 0,1 a 0,5 mg/mL em HEPES 50mM, pH 7.2 e o tempão de diálise foi mantido para os controles basais. Cada amostra foi aquecida de 40oC a 110oC. As amostras e/ou tampão foram aquecidos e resfriados em uma taxa de rastreamento de 90oC/h. Os valores basais do tampão foram registrado múltiplas vezes até que o sistema atingiu um estágio estável. O valor de Tm era a temperatura onde o calor máximo foi liberado.
Ensaios de atividade de xilanase [00750] As atividades enzimáticas foram determinadas usando 400 ^L de Azo-xilano a 2% como substrato em 550 ^L de tampão CP (citrato-fosfato)m pH 6.0 nas temperaturas indicadas. As medidas de atividade como uma função de pH foram determinadas usando soluções de tampão Britton e Robinson 50 mM (pH 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0) preparadas por misturar soluções de ácido fosfórico 0,1 M, ácido bórico 0,1 M e ácido acético 0,1 M seguido por ajuste do pH com hidróxido de sódio 1 M. As reações foram iniciadas por adicionar 50 ^L de 0,1 mg/ml de enzima purificada. Os pontos de tempo foram tirados de 0 a 15 minutos onde 50 ^L da mistura de reação foram adicionados a 200 ^L de solução de precipitação (etanol 100%). Quando todos os pontos
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372/510 de tempo foram tomados, as amostras foram misturadas, incubadas por 10 minutos e centrifugadas a 3000 g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante (150 ^L) foi aliquotado em uma nova placa de 96 cavidades e a absorbância foi medida a 590 nm. Os valores de A590 foram plotados contra o tempo e a taxa inicial foi determinada a partir da inclinação da linha.
Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).
[00751] A calorimetria foi realizada usando um equipamento de DSC Modelo 6100 Nano II (Calorimetry Sciences Corporation, American Fork, UT) usando o pacote de programas DSCRun para aquisição dos dados, CpCalc para análise, CpConvert para conversão em capacidade calorífica molar de microwatts e CpDeconvolute para deconvolução. Análise foi realizada com 1mg/ml de proteína recombinante em fosfato de potássio 20 mM (pH 7.0) e KCl 100 mM em uma taxa de rastreamento de 1°C/min. Uma pressão constante de 5 atm foi mantida durante os experimentos de DSC para evitar possível degaseificação da solução no aquecimento. as linhas basais instrumentais foram registrados rotineiramente antes dos experimentos com ambas as células cheias com tampão. A reversibilidade das transições induzidas termicamente foi testada por reaquecer a solução na célula do calorímetro imediatamente após resfriar a primeira corrida.
Determinação de tolerância térmica [00752] Todas as enzimas foram analisadas quanto a tolerância térmica a 80°C em fosfato de potássio 20 mM (pH 7.0) e KCl 100 mM. As enzimas foram aquecidas a 80°C por 0, 5, 10 ou 3 0 minutos em tubos de parede fina e foram resfriadas em gelo. As atividades residuais foram determinadas com Azo-xilano como substrato usando o ensaio descrito acima para medida de atividade.
Análise da impressão digital de polissacarídeo [00753] As impressões digitais dos polissacarídeos foram determiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 378/525
373/510 nadas por análise do polissacarídeo usando eletroforese em gel de carboidrato (PACE). Xilano (beechwood) (0,1 mg/mL, 100 ^L. Sigma, Poole, Dorset, UK) ou xilooligosacarídeos (1 mM, 20 ^L, Megazyme, Wicklow, Irlanda) foram tratados com enzima (1 a 3 ^g) em um volume total de 250 ^L por 16 horas. A reação foi tamponada em acetato de amônio 0,1 M pH 5.5. Os controles sem substratos ou enzimas foram realizados sob as mesmas condições para identificar qualquer composto inespecífico nas enzimas, polissacarídeos/oligossacarídeos ou reagentes de marcação. As reações foram paralisadas por aquecer por 20 min. Os ensaios foram realizados de forma independente pelo menos 2 vezes para cada condição. Derivatização usando ANTS (ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trissulfônico, Molecular Probes, Leiden, Holanda), eletroforese e aquisição de imagem foram feitos como descrito (Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. & Dupree, P. (2002) Anal. Biochem. 300, 53-68).
Cálculo de aptidão [00754] A aptidão (fitness (Fn)), para uma dada variante de enzima, n, foi calculada por avaliar igualmente um aumento no ponto médio de transição da temperatura (Tm) de desnaturação e aumento (ou diminuição) na atividade enzimática com relação à maior diferença em cada parâmetro para todas as variantes: Fn = FTn + FVn, onde FTn = Tm fator de aptidão da variante e FVn = fator de aptidão de atividade da variante. Os fatores de aptidão para cada (Tm e atividade) são relativas à maior diferença na Tm ou taxa entre todas as variantes. FTn = (Tm - TmL) / (TmH - TmL) onde Tmn é Tm para a dada variante, n, e TmL é a menor Tm entre todas as variantes e TmH é a maior Tm entre todas as variantes e FVn = (Vn - VL) / (VH - VL) onde Vn é a taxa relativa para a dada variante, n, e VL é a menor taxa entre todas as variantes e VH é a maior taxa entre todas as variantes.
Evolução pelo método de GSSM
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374/510 [00755] A tecnologia de GSSM foi usada para criar uma biblioteca abrangente de mutações pontuais na xilanase exemplar da invenção SEQ ID NO:190 (codificada por SEQ ID NO:189); incluindo a xilanase exemplar da invenção SEQ ID NO:378 (codificada por SEQ ID NO:377). O rastreamento de termotolerância de xilanase descrito cima identificou nove mutantes de único sítio de aminoácido (Figura 6A), D8F, Q11H, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A & S79P, que tiveram tolerância térmica melhorada em relação à enzima “tipo selvagem” exemplar SEQ ID NO:190 (codificada por SEQ ID NO:189), como medido após estímulo com calor a 80°C por 20 minutos. A enzima tipo selvagem e todos os nove mutantes de único sítio de aminoácido foram produzidos em E. coli e purificados utilizando um sinalizador de hexahistidina N-terminal. Não houve diferença notável na atividade devido ào sinalizador.
[00756] Para determinar o efeito de mutações de um único aminoácido sobre a atividade enzimática, todos os nove mutantes foram purificados e sua atividade de xilanase (taxas iniciais na temperatura ótima da tipo selvagem, 70°C) foi comparada com aquela da enzima “tipo selvagem” exemplar SEQ ID NO:190. As atividades enzimáticas foram comparáveis à tipo selvagem (taxa inicial normalizada para 1,0) para os mutantes D8F, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V G68A e S79P (taxas iniciais relativas 0,65, 0,68, 0,76, 1,1, 1,0, 1,2, 0,98 e 0,84 respectivamente) confirmando que essas mutações não alteram significativamente a atividade enzimática. As taxas iniciais foram medidas 3 ou mais vezes e a variância foi menor do que 10%. Ao contrário desses oito mutantes, uma redução notável na atividade enzimática foi observada para o melhor tolerante térmico, o mutante de sítio único, Q11H (taxa inicial relativa de 0,35).
Temperatura de fusão (Tm) das enzimas “tipo selvagem” e mutantes de sítio único de aminoácido termotolerante.
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375/510 [00757] A xilanase “tipo selvagem” SEQ ID NO:190 purificada e os nove mutantes de sítio único de aminoácido tolerantes à temperatura foram analisados usando calorimetria exploratória diferencial (DSC). Agregação foi visível na enzima tipo selvagem como evidenciado por uma saliência no traço de DSC para sua desnaturação térmica, veja a figura 6B. As enzimas mutantes evoluídas não mostraram indícios de agregação. Para todas as enzimas, a desnaturação induzida termicamente foi irreversível e nenhuma transição discernível foi observada em uma segunda pesquisa da amostra. Devido à irreversibilidade da desnaturação, apenas a Tm aparente (temperatura de fusão) pôde ser calculada (como descrito, por exemplo, por Sanchez-Ruiz (1992) Biophys. J. 61:921-935; Beldarrain (2000) Biotechnol. Appl. Biochem. 31:77-84). A Tm da enzima tipo selvagem foi de 61°C enquanto que as Tm's de todos os mutantes pontuais foram aumentadas e variaram de 64°C a 70°C (Figura 6A). A mutação Q11H introduziu o maior aumento (Tm = 70°C) sobre a tipo selvagem, seguida por P64V (69°C), G17I (67°C) and D8F (67°C).
A enzima de GSSM combinada exemplar “9X” SEQ ID NO:378 [00758] A “9X” enzima (SEQ ID NO:378) foi construída por combinar as alterações em único-sítio das nove mutantes tolerantes térmicas por mutagênese sítio direcionada (Figura 6A). A enzima “9X” (SEQ ID NO:378) foi expressa em E. coli e purificada para homogeneidade. DSC foi realizada para determinar a temperatura de fusão. A Tm da enzima “9X” foi 34 graus maior do que a de SEQ ID NO: 190, a enzima “tipo selvagem”, demonstrando uma dramática alteração na sua estabilidade térmica (Figura 6B).
[00759] Para avaliar o efeito das mutações combinadas e elevada temperatura de fusão sobre as propriedades bioquímicas da enzima, os perfis de pH e temperatura foram construídos e comparados a SEQ ID NO:190, a enzima “tipo selvagem”. A figura 7 ilustra a dependência
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376/510 do pH da atividade das enzimas tipo selvagem e mutante 9X evoluída. A atividade de xilanase foi medida a 37°C em cada pH e a velocidade inicial foi plotada contra a absorbância a 590 nm para determinar as taxas iniciais. A Figura 7B ilustra a dependência da temperatura da atividade das enzimas tipo selvagem e mutante 9X evoluída. As temperaturas ótimas das enzimas tipo selvagem e mutante 9X foram medidas ao longo de uma faixa de temperatura de 25 a 100°C e pH 6.0 e são baseadas nas taxas iniciais medidas por 5 minutos. A figura 7C ilustra a estabilidade térmica das enzimas tipo selvagem e mutante 9X evoluída. A dependência térmica da atividade das enzimas tipo selvagem e mutante 9X evoluída foi medida por primeiro aquecer as enzimas em cada uma das temperaturas indicadas por 5 minutos, seguido por resfriar para temperatura ambiente e medir a atividade residual (taxa inicial a 37°C, pH 6.0). para todos os experimentos, as taxas iniciais foram medidas 2 ou mais vezes e a variação foi menor do que 10%.
[00760] As enzimas SEQ ID NO:190 e SEQ ID NO:378 (o mutante “9X”) tiveram perfis de atividade/pH comparáveis com a maior atividade entre pH 5 e 6 (Figura 7A). Ambas as enzimas tiveram taxa inicial/temperatura ótimas similares a 70oC, entretanto, SEQ ID NO:190, a enzima “tipo selvagem” teve maior atividade em temperaturas mais baixas (25 a 50°C) enquanto que SEQ ID NO:378 (o mutante “9X”) reteve mais do que 60% da sua atividade até 100°C (determinado pela taxa inicial) na presença de substrato (Figura 7B). A atividade de SEQ ID NO:190, a enzima “tipo selvagem” não foi detectável em temperaturas acima de 70°C.
[00761] Para determinar o efeito das 9 mutações combinadas sobre a tolerância térmica da enzima, a atividade residual foi medida e comparada a SEQ ID NO:190, a enzima “tipo selvagem”. A atividade residual foi determinada por um estímulo com calor por 5 minutos em cada
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377/510 temperatura (37, 50, 60, 70, 80 e 90°C) seguido por medidas de atividade a 37°C. SEQ ID NO:190 foi completamente inativada acima de 70°C, enquanto a mutante 9X evoluída apresentou atividade significativa após aquecimento a 70, 80 e até mesmo 90°C (Fi gura 7C). Além disso, embora a atividade da enzima tipo selvagem tenha diminuído com a temperatura aumentada, a variante 9X foi atividade em alguma extensão pelo aquecimento em temperaturas de até 60°C.
Geração de variantes combinatórias de GSSM usando tecnologia GeneReassembly [00762] Para identificar variantes combinatórias dos 9 mutantes de único sítio de aminoácido com a maior tolerância térmica e atividades em comparação com SEQ ID NO:378 (a variante “9X”) construída por adição, uma biblioteca de GeneReassembly (Patente U.S. N° 6.537.776) de todas as combinações mutantes possíveis (29) foi construída e rastreada. Usando a tolerância térmica como critério de rastreamento, 22 combinações únicas das nove mutações foram identificadas como foi a variante 9X original. Um rastreamento secundário foi realizado para selecionar variantes com maior atividade/expressão do que 9X evoluída. Esse rastreamento produziu 10 variantes com sequências possuindo entre 6 e 8 das mutações de único sítio originais em várias combinações, como ilustrado na Figura 8A. A Figura 8 ilustra as variantes combinatórias identificadas usando tecnologia GeneReassembly. A Figura 8A ilustra a biblioteca de GeneReassembly de todas a combinações possíveis das 9 mutações pontuais de GSSM que foi construída e rastreada por variantes com tolerância térmica a atividade melhoradas. Onze variantes incluindo a variante 9X foram obtidas. Como mostrado na figura, as variantes possuíam 6, 7, 8, ou 9 das mutações pontuais ma várias combinações. O ponto médio transição de temperatura de fusão (Tm) correspondente determinado por DSC de cada variante é mostrado à direita. A Figura 8B ilustra a ativiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 383/525
378/510 dade relativa (taxa inicial medida por período de tempo de 5 minutos) das variantes 6X-2 e 9X em comparação a tipo selvagem na temperatura ótima (70°C) e pH 6.0. as barras de erro mostram a variação na taxa inicial para as 3 medições.
[00763] A temperatura de fusão (Tm) de cada uma das variantes combinatórias foi pelo menos 28°C maior do que o tipo selvagem (Figura 8A) e todas as variantes de reagrupamento apresentaram atividade relativa maior do que a enzima 9X. A atividade de uma variante em particular, 6X-2, foi maior do que a da enzima tipo selvagem e significativamente melhor (1,7X) do que a da enzima 9X (Figura 8B). Comparação de sequência das variantes de reagrupamento identificou pelo menos 6 mutações que eram necessárias para a termoestabilidade aumentada (>20 graus). Todas as 33 variantes únicas encontradas no rastreamento de termoestabilidade inicial continham ambas as mutações Q11H e G17I demonstrando sua importância para tolerância térmica.
Análise das impressões digitais do produto polissacarídico tipo selvagem e variante [00764] Os produtos gerados pelas variantes “tipo selvagem”, 6X-2 e 9X foram comparados por análise de polissacarídeo usando eletroforese em gel de carboidrato (PACE); diferentes substratos (oligossacarídeos e polissacarídeos) foram testados por hidrólise por xilanases. Os produtos de digestão das 3 xilanases testadas foram muito similares, como ilustrado na Figura 9. Toda as três enzimas hidrolisaram (Xyl)6 e (Xyl)5, principalmente em (Xyl)3 e (Xyl)2; e (Xyl)4 foi hidrolisada para (Xyl)2 (Figura 9A). Apenas uma pequena quantidade de hidrólise de (Xyl)3 em (Xyl)2 e Xyl foi observada indicando que (Xyl)3 é um substrato relativamente pobre para a enzima. Nenhuma atividade foi detectada sobre (Xyl)2. Xilano de madeira de faia (beechwood), que contém resíduos de glicuronosila, foi hidrolisada por todas as três enPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 384/525
379/510 zimas principalmente em (Xyl)2 e (Xyl)3, mas outras bandas que migraram entre as bandas de oligoxilano foram detectadas (Figura 9B). Na análise de PACE, cada oligossacarídeo tece uma migração específica dependendo da composição de açúcar e grau de polimerização (Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. and Dupree, P. (2002) Anal. Biochem. 300, 53-68), dessa forma, essas bandas provavelmente correspondem a oligoglicuronoxilanos. Portanto, as enzimas envolvidas retiveram a especificidade de substrato da enzima “tipo selvagem”.
[00765] Como observado acima, a Figura 9 ilustra as impressões digitais do produto de SEQ ID NO:190 “tipo selvagem” (codificada por SEQ ID NO:189), enzima variante 6X-2 (SEQ ID NO:380, codificada por SEQ ID NO:379) e SEQ ID NO:378 (o mutante “9X”), como determinado por PACE. A Figura 9A ilustra as impressões digitais obtidas após hidrólise de oligoxilanos (Xyl)3, (Xyl)4, (Xyl)5 e (Xyl)6 por enzimas “selvagens” e variantes. As raias de controle contêm oligossacarídeo incubado sob as condições de ensaio na ausência de enzima. A figura 9B ilustra as impressões digitais obtidas após hidrólise de xilano de madeira de faia (beechwood) pelas enzimas selvagens e variantes. Os padrões continham (Xyl)2, (Xyl)3, (Xyl)4. Todos os testes foram realizados a 37°C e pH 5.5.
[00766] Uma combinação de estratégias de evolução de gene laboratoriais foi usada para gerar rapidamente uma xilanase altamente ativa, termoestável otimizada para compatibilidade de processo em várias aplicações do mercado industrial. A metodologia de GSSM foi empregada para pesquisar a sequência completa da xilanase exemplar “tipo selvagem” SEQ ID NO:190 (codificada por SEQ ID NO: 189) e para identificar 9 mutações pontuais que melhoram sua tolerância térmica. Embora ela não tenha efeito discernível sobre o perfil de produtos de hidrólise da enzima, como ilustrado na Figura 9, a adição das 9 mutações à sequência de proteína resultou em uma redução moderada
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380/510 na atividade enzimática específica na temperatura ótima da SEQ ID NO:190 (a “tipo selvagem”), 70DC, veja Figura 9B. Usando o método de GeneReassembly para gerar uma biblioteca combinatória de 9 mutantes de único sítio de aminoácido, essa redução na atividade foi superada. As variantes termoestáveis (Tm's entre 89°C e 94°C) com atividade melhor do que a variante “9X” foram obtidas a partir do rastreamento da biblioteca de GeneReassembly. Com uma Tm de 90°C, atividade enzimática específica superior à tipo selvagem e uma impressão digital de produto inalterada e comparável à SEQ ID NO:190 (a “tipo selvagem”), a variante 6X-2 (SEQ ID NO:380, codificada por SEQ ID NO:379) é particularmente notável. Pelo que sabemos, a alteração Tm obtida para essas variantes é o maior aumento relatado da aplicação de tecnologias de evolução direcionada.
[00767] SEQ ID NO:380 (a 6X-2 variante) inclui as seguintes alterações, quando comparada com SEQ ID NO:190 (a “tipo selvagem”): D8F, Q11H, G17I, G60H, S65V e G68A. SEQ ID NO:379 inclui as seguintes alterações de nucleotídeo, quando comparado com a “tipo selvagem” SEQ ID NO:189: os nucleotídeos nas posições 22 a 24 são TTC, os nucleotídeos nas posições 31 a 33 são CAC, os nucleotídeos nas posições 49 a 51 são ATA, os nucleotídeos nas posições 178 a 180 são CAC, os nucleotídeos nas posições 193 a 195 são GTG, os nucleotídeos nas posições 202 a 204 são GCT.
[00768] A fim de medir a eficácia de mistura combinatória versus adição das mutações pontuais ao fenótipo desejado, um parâmetro de aptidão que combina atribuições tanto das alterações na atividade enzimática como termoestabilidade foi calculado para cada mutante. O termo aptidão, descrito aqui, não é uma medida objetiva que pode ser empregada a outras enzimas, mas ao invés disso, é um termo que permite a medida do sucesso da evolução dirigida dessa xilanase particular. Já que aptidão de enzimas, F, é calculada por avaliar igualmenPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 386/525
381/510 te alterações na Tm e atividade enzimática para esse grupo de variantes, o valor de aptidão máximo possível é 2 (FT <D1 e FV <1, veja acima). Em outras palavras, se a variante com a melhor atividade também tivesse a maior Tm, seu valor de aptidão seria 2. Com um valor de aptidão próximo de 2 (veja Fig. 10B), a variante 6X-2 (SEQ ID NO:380, codificada por SEQ ID NO:379) é a mais próxima de possuir a melhor combinação possível de estabilidade térmica e atividade enzimática. A mutação de único sítio que confere maior valor de aptidão é S65V. Embora a Tm do mutante S65V seja menor do que aquela do mutante Q11H (66DC versus 70DC respectivamente), ele tem um valor de aptidão maior já que sua atividade específica não é reduzida em relação a da tipo selvagem.
[00769] Figura 10A é um diagrama esquemático ilustrando o nível de melhora da estabilidade térmica (representado por Tm) sobre “tipo selvagem” obtido por evolução de GSSM. O mutante de único sítio de aminoácido e a variante combinatória com a maior estabilidade térmica (Q11H e “9X” (SEQ ID NO:378), respectivamente) são mostrados em comparação com a tipo selvagem. Figura 10B ilustra um “diagrama de aptidão” da melhora da enzima obtida por combinar as tecnologias de GSSM e GeneReassembly. A aptidão foi determinada usando a fórmula F = FT + FV onde aptidão (F) é calculada por avaliar igualmente a aptidão de tolerância térmica (FT) e aptidão de tolerância relativa (FV) como descrito acima. A mutação pontual que confere a maior aptidão é mostrada (S65V). Combinar as 9 mutações pontuais também melhorou a aptidão (SEQ ID NO:378, a variante “9X”). Entretanto, a maior melhora na aptidão foi obtida por combinar os métodos de GSSM e GeneReassembly para obter a melhor variante, 6X-2 (SEQ ID NO:380).
[00770] O método de GeneReassembly também permitiu a identificação de resíduos importantes que parecem ser absolutamente nePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 387/525
382/510 cessários para estabilidade térmica melhorada. Dois resíduos chave Q11H E G17I, estavam presentes em cada variante de GeneReassembly identificada com base na tolerância térmica (veja Figura 6A). os determinantes estruturais para estabilidade térmica de proteína foram estudados e várias teorias foram documentadas, por exemplo, por Kinjo (2001) Eur. Biophys. J. 30:378-384; Britton (1999) J. Mol. Biol. 293:1121-1132; Ladenstein (1998) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 61:37-85; Britton (1995) Eur. J. Biochem. 229:688-695; Tanner (1996) Biochemistry 35:2597-2609; Vetriani (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2300-2305. Padrões de ligação de hidrogênio, interações iônicas, empacotamento hidrofóbico, e comprimento reduzido de alças de superfície estão entre os fatores chave mesmo que a contribuição de cada um pra a estabilidade da proteína não seja completamente compreendida. Dado que a maioria das substituições pontuais benéficas identificadas a partir do teste de todas as substituições possíveis de um único aminoácido envolveu a substituição de resíduos relativamente polares, carregados ou pequenos (glicina) por resíduos hidrofóbicos muito maiores, pode ser inferido que as interações hidrofóbicas desempenham o papel mais significativo em aumentar a termoestabilidade dessa proteína. Mesmo com um bom conhecimento das interações ótimas para aumentar a tolerância térmica, a previsão de onde fazer as mutações que introduzem tais interações não é óbvia. Uma abordagem não racional usando o método de GSSM, entretanto, permite rápida amostragem de todas as cadeias laterais em todas as posições dentro da estrutura de uma proteína. Tal abordagem leva à descoberta de substituições de aminoácido que introduzem interações funcionais que poderiam não ter sido previstas.
EXEMPLO 6: PRÉ-TRATAMENTO DE POLPA DE PAPEL COM XILANASES DA INVENÇÃO [00771] Em um aspecto, xilanases da invenção são usadas para
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383/510 tratar/pré-tratar polpa de papel ou papel reciclado ou polpa de papel e semelhantes. Em um aspecto, enzima(s) da invenção é(são) usadas para aumentar a “alvura” do papel através de seu uso no tratamento/pré-tratamento de polpa de papel ou papel reciclado ou polpa de papel e semelhantes.
[00772] Em um aspecto, xilanases da invenção são usadas para tratar/pré-tratar polpa de papel ou papel reciclado ou polpa de papel e semelhantes para reduzir o número Kappa. O número Kappa é definido como um valor numérico que indica o conteúdo relativo de lignina do papel - quanto maior o número Kappa, maior o conteúdo de lignina. Foi observado nesses testes de moagem uma redução consistente de 1 a 2 pontos no número Kappa com xilanases dessa invenção, por exemplo, com SEQ ID NO:381/382 (isto é, usando a enzima que tem a SEQ ID NO:382, codificada por exemplo, por SEQ ID NO: 381) e tratamento com SEQ ID NO:481/482. Em alguns aspectos, essa redução no número Kappa traz benefícios quando se trata polpa não alvejada (número kappa 70 a 90), quando então é usada para, por exemplo, processamento, tal como na produção de papelão. Em alguns aspectos, uma redução em Kappa ao longo do estágio X permite o uso menor de alcalinos no cozimento ou cozimento para um número de kappa alvo mais elevado. Em alguns aspectos, isso resulta em maior resistência da polpa, menor refinamento das máquinas e maior velocidade das máquinas. Em alguns aspectos, tais resultados são vistos usando aditivos de digestão (tensoativos) em moinhos de papelão de revestimento; isso pode permitir melhor penetração de líquido e permitir um menor carregamento de alcalinos eficaz levando a maior resistência da polpa, menor refinamento e um aumento de 200 fpm (pés por minuto) na velocidade da máquina.
[00773] Esse exemplo descreve um protocolo rotineiro de rastreamento exemplar para determinar se uma xilanase é útil para pré-tratar
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384/510 polpa de papel; por exemplo, na redução do uso de químicos branqueadores (por exemplo, dióxido de cloro, ClO2) quando usados para pré-tratar polpa de papel Kraft.
[00774] O protocolo de rastreamento tem dois parâmetros de teste alternativos: Impacto de tratamento com xilanase após uma etapa de deslignificação com oxigênio (polpa pós- O2); e impacto de xilanase em um processo que não inclui deslignificação com oxigênio (polpa marrom pré- O2).
[00775] A invenção fornece condições de tratamento de polpa ou papel que simulam condições de processamento em situações industriais, por exemplo, fábricas: por exemplo, pH de cerca de 8.0; 70°C; 60 minutos de duração. Por exemplo, um processo exemplar da invenção está descrito esquematicamente no fluxograma da Figura 11; veja também a Figura 14. Entretanto, as condições de um processo do método da invenção podem ser ajustadas para qualquer temperatura, tempo de duração e/ou pH, dependendo da(s) enzima(s) exemplar(es) da invenção usada(s) e do objetivo do processo; por exemplo, existe uma variedade de meios de ajustar o pH em vários processamentos de polpa e papel da invenção:
adicionar ácido e/ou base:
Ácido clorídrico (HCl)
Hidróxido de sódio (NaOH)
H2SO4 (ácido sulfúrico)
NaHSO4 (hidrogenossulfato de sódio)
H2SO3 (ácido sulfuroso)
H3PO4 (acido fosfórico)
HF (ácido fluorídrico)
CH3CO2H (ácido acético)
H2CO3 (ácido carbônico)
H2S (sulfeto de hidrogênio)
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385/510
NaH2PO4 (diidrogenofosfato de sódio)
NH4Cl (cloreto de amônio)
HCN (ácido hidrociânico)
Na2SO4 (sulfato de sódio)
NaCl (cloreto de sódio)
NaCH3CO2 (acetato de sódio)
NaHCO3 (bicarbonato de sódio)
Na2HPO4 (hidrogenofosfato de sódio)
Na2SO3 (sulfeto de sódio)
NaCN (cianeto de sódio)
NH3 (amônia aquosa)
Na2CO3 (carbonato de sódio)
Na3PO4 (fosfato de sódio) borbulhamento em gás, por exemplo CO2 (que forma um ácido com água quando dissolvido ) [00776] Vinte xilanases foram identificadas em testes bioquímicos que estavam ativos sob essas condições. Das 20 xilanases, 6 foram capazes de reduzir significativamente a demanda de ClO2 quando elas foram usadas para preparar polpa Kraft antes dela ser alvejada quimicamente. As seis são: SEQ ID NO:182 (codificada por SEQ ID NO:181); SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159); SEQ ID NO:198 (codificada por SEQ ID NO:197); SEQ ID NO:168 (codificada por SEQ ID NO:167); SEQ ID NO:216 (codificada por SEQ ID NO:215); SEQ ID NO:260 (codificada por SEQ ID NO:259). Outras mostraram alguma atividade, mas não foram tão boas. As xilanases SEQ ID NO:182 (codificada por SEQ ID NO:181) e SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159) são modulares e contêm um módulo de ligação de carboidrato além do domínio catalítico de xilanase. Foi demonstrado que derivados truncados dessas 2 xilanases contendo apenas o domínio catalítico são mais eficazes nessa aplicação. A mePetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 391/525
386/510
Ihor xilanase, SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159) foi estudada mais completamente. Os resultados podem ser resumidos como segue:
- pré-tratamento de polpa spruce/pinho/abeto (SPF) pós-O2 com 2 unidades/g de SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159) reduz em 22% o uso subseqüente de ClO2 para obter 65% de alvura GE;
- pré-tratamento de polpa marrom SPF pré-O2 com 0,5 unidades/g de SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159) reduz em 13% o uso subseqüente de ClO2 para obter 65% de alvura GE;
- pré-tratamento de polpa Aspen pré-O2 com 0,5 unidades/g de SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159) reduz em pelo menos 22% o uso de ClO2;
- pré-tratamento de polpa de Douglas Fir/Hemlock pré-O2 com 0,5 unidades/g de SEQ ID NO:160 (codificada por SEQ ID NO:159) reduz o uso de ClO2 em pelo menos 22%;
- sob as condições de tratamento empregadas, a redução no rendimento do tratamento de xilanase não excedeu 0,5% quando comparado com polpa que havia sido alvejada no mesmo fator kappa, mas não tratada com xilanase;
- as condições ótimas para tratar polpa SPF pós-O2 com SEQ ID NOS:159, 160 foram: pH 6-7, dose de enzima 0,3 unidades/g, tempo de tratamento 20 a 25 min. Sob essas condições, uma redução no uso de ClO2 de 28% foi possível para atingir 69% de alvura GE. [00777] Em experimentos adicionais:
[00778] SEQ ID NO:160 (XYLA), codificada por SEQ ID NO: 159 = xilanase tipo selvagem de extensão completa:
· XYLA (E.c) = variante truncada de SEQ ID NOS: 159, 160 contendo apenas o domínio catalítico da xilanase expressa em E.coli ·XYLA (P.f) = idem, mas expressa em P. fluorescens
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387/510
SEQ ID NO:182 (codificada por SEQ ID NO: 181) = segunda xilanase tipo selvagem de extensão completa:
· XYLB (E.c) = variante truncada etc, etc expressa in E.coli ·XYLB (P.f) = idem, mas expressa em P. fluorescens
Dados de Resposta de Dose para Utilização de Xilanases em Polpa
Marrom Pré-O2
Condições para o estágio de xilanase (Estágio-X) como segue:
pH: 8
Temperatura: 70oC
Tempo: 60 min
Fator Kappa: 0,24
Para controle sem enzima, o fator kappa foi de 0,30 [00779] Os resultados mostraram um aumento dependente da dose na alvura para amostras tratadas com xilanase em uma carga de dióxido de cloro baixa (ClO2) (Kf 0.24 vs Kf 0.30).
[00780] Em cada caso, o derivado truncado pareceu ser mais eficaz do que a xilanase de extensão completa. A dose de xilanase ótima pareceu ser em torno de 0,6 a 0,7 U/g de polpa.
Pré-tratamento de Polpa Marrom Intercontinental Pré-O2 com as 4 melhores Xilanases [00781] Determinação de resposta com dose de ClO2 em Do [00782] Desenho Experimental · Polpa marrom pré-O2 Brownstock oKappa inicial: 31,5 · Condições do estágio X oQuantidade de xilanase: 0,7 U/gm oTemperatura: 70oC opH: 8 oTempo de tratamento: 1 hr oConsistência da polpa: 10%
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388/510 · Sequência de alvejante XDEp oFator Kappa 0,22; 0,26 e 0,30 (%D na polpa: 2,63; 3,12 e
3,60)
Alvura final após sequência de alvejante estágio-3 versus fator kappa (quantidade de ClO2):
· XYLB - Em alvura final de 61,5, estágio-X permite redução no uso de ClO2 de 3,89 kg/ton. de polpa.
· XYLB (E.c) - Em alvura final de 61,5, estágio-X permite redução da quantidade de ClO2 de 4,07 kg/ton de polpa.
· XYLA - Em alvura final de 61,5, estágio-X permite redução no uso de ClO2 de 4,07 kg/ton polpa.
· XYLA (E.c) - Em alvura final de 61,5, estágio-X permite redução no uso de ClO2 de 4,90 kg/ton polpa.
Enzima Economias em ClO2 em Do (kg/ton OD) Redução de Kf em Do
XYLB 3,89 11,7%
XYLB (E.c) 5,08 15,8%
XYLA 4,07 12,2%
XYLA (E.c) 4,90 14,7%
Determinação de resposta em dose de ClO2 em Do:
Xilanase 0,7 U/g, pH 8.0, 70 °C, 1 hr
Polpa: Polpa marrom pré -O2, kappa inicial 31,5 [00783] Percentual de economia de ClO2 tem pouco significado na industria,. Sua preocupação primária são lbs de ClO2 economizadas do que uma redução percentual total menor para atingir a alvura alvo. Relação entre alvura, rendimento e fator kappa para polpa de controle alvejada:
[00784] Os resultados mostraram que alvejante com doses aumentadas de ClO2 para atingir a maior alvura alvo resulta em perda no rendimento da polpa. Este é um problema porque a polpa neste estáPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 394/525
389/510 gio do processo tem um valor de quase $400 por tonelada e perda de celulose significa gasto de dinheiro.
[00785] Um benefício da xilanase (por exemplo, uma xilanase da invenção) é que o uso de uma dose menor de ClO2 pode reduzir as perdas no rendimento contanto que a ação da xilanase em si não cancele o ganho.
Dados de resposta com a dose para o pré-tratamento de polpa marrom pré-O2 com xilanase XYLB (P.f):
Desenho experimental • Polpa marrom do Norte Pré-O2
- Kappa inicial 28,0
- consistência inicial 32,46%
- alvura inicial 28,37 • Condições do estágio X
- quantidade de xilanase 0 a 2,70 U/gm -Temperatura 58oc a 61 oc
-pH 8.2 a 8.5
- Tempo de tratamento 1hr • sequência de alvejante XDEp
- fator Kappa 0,24 • Economia de ClO2 calculada para fatores Kappa entre
0,24 e 0,30 [00786] O propósito desse experimento foi avaliar a melhor das 4 xilanases sobre polpa marrom SPF não lavada. Os resultados mostraram aumentos dose-dependentes na alvura final para polpa tratada com XYLB (E.c), com a alvura obtida na presença de xilanase em um Kf menor de 0,24, aproximando-se da alvura obtida em um Kf maior de 0,30 assintoticamente.
Relação entre dose de xilanase XYLB (E.c) e economia de dióxido de cloro (polpa marrom pré-O?):
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390/510 [00787] A dose ótima de xilanase está entre 0,5 e 0,9 U/gm A dose ótima se encontra na faixa de 0,5 a 0,9 U/g. Acima dessa dose há uma diminuição de retorno por adição de unidade de xilanase. Reduções na dose de dióxido de cloro por tonelada de polpa tratada dessa magnitude são comercialmente significativos.
Economia de ClO2 na% de polpa OD Economia de ClO2 em kg/ton de polpa Dose de xilanase em U/gm
0,299% 2,99 0,31
0,363% 3,63 0,51
0,406% 4,06 0,71
0,439% 4,39 0,91
0,483% 4,83 1,26
0,523% 5,32 1,80
0,587% 5,87 2,70
Procedimento de biobranqueameto em três estágios A invenção fornece um procedimento de bioalvejamento em três estágios, e em um aspecto, esse processo compreende pelo menos uma enzima da invenção. Esse procedimento de bioalvejamento em três estágios exemplar foi desenvolvido para simular rigorosamente as operações de alvejante reais em uma fábrica de alvejante de polpa de celulose (veja (figura 11). Essa sequência de alvejante é designada por (X)DoEp, na qual X representa o estágio de tratamento com xilanase, D para estádio de alvejante com dióxido de cloro, e Ep para estágio de extração de peróxido alcalino. O material bruto primário usado em nossos testes de aplicação foi Polpa Marrom Kraft de Madeira Mole do Sul (sem deslignificação por oxigênio).
[00790] Os candidatos de xilanase mais eficazes (enzimas da invenção) que mostraram alto potencial de redução de químico de alvejante nos ensaios de bioalvejamento também foram testados em duas espécies de polpa Kraft de madeira dura (bordo e aspen). Após o térPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 396/525
391/510 mino de cada ciclo de bioalvejamento, a polpa resultante foi usada para produzir folhas de papel de acordo com as normas técnicas de TAPPI (Technical Association of Pulp and Paper Industries, a associação técnica para a indústria de polpa, papel e conversão mundial). O% de alvura GE de cada folha de papel foi medido, e os valores da alvura foram usados como um indício do quão bem cada enzima agiu sobre a polpa durante o estágio de pré-tratamento enzimático (X).
RESULTADOS:
[00791] Dentre aproximadamente 110 xilanases que foram testadas usando a sequência de bioalvejamento (X)DoEp, 4 enzimas, isto é, XYLA (P.f); XYLB (P.f); SEQ ID NO216 (codificada por SEQ ID NO:215); SEQ ID NO:176 (codificada por SEQ ID NO: 175)mostraram o melhor potencial para reduzir o uso de químicos branqueadores. Embora XYLA (P.f) e XYLB (P.f) tenham exibido desempenho igualmente alto (melhores dentre as quatro enzimas com bom desempenho), XYLA (P.f) mostrou uma melhor tolerância ao pH do que XYLB (P.f). Os resultados podem ser resumidos como segue:
·É possível atingir uma alvura da folha de papel de 60 (GE%) usando uma sequência de alvejante em três estágios [(X)DoEp] que envolve pré-tratamento de Polpa Marrom de Madeira Mole do Sul com as quatro enzimas a seguir nas seguintes quantidades listadas abaixo (pH=8, 65 oC e 1 h):
o XYLA (P.f) a 0,55 U/g de polpa o XYLB (P.f) a 0,75 U/g de polpa o SEQ ID NOS:215, 216 a 1,80 U/g de polpa o SEQ ID NOS:175, 176 a 1,98 U/g de polpa · Pré-tratamento de Polpa Marrom Kraft de Madeira Mole do Sul com 2 U/g de polpa de XYLA (P.f) reduz o uso de ClO2 em 18,7% para atingir uma% de alvura GE final de 61.
· XYLA (P.f) exibe boa tolerância em pH mais elevado e
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392/510 fornece mais do que 14% de economia de reagentes químicos quando o estágio de pré-tratamento enzimático é executado em pH=10.
· Pré-tratamento de Polpa Marrom Kraft de Madeira Mole do Sul com 2 U/g de plpa de XYLB (P.f) reduz o uso de ClO2 em 16,3% para atingir uma% de alvura GE final de 60,5.
· Pré-tratamento de Polpa Kraft de aspen com 2 U/g de polpa de XYLA (P.f) e XYLB (P.f) reduz o uso de ClO2 em cerca de 35% para atingir um% de alvura GE final de 77.
· Pré-tratamento de Polpa Kraft de bordo com 2 U/g d polpa de XYLA (P.f) e XYLB (P.f) reduz o uso de ClO2 em cerca de 38% para atingir um% de alvura GE final de 79. As duas xilanases que agiram melhor, isto é, XYLA (P.f) e XYLB (P.f), são enzimas truncadas, contendo apenas o domínio catalítico, e foram produzidas em Pseudomonas fluorescens. EXEMPLO 7: XILANASES EXEMPLARES PARA PROCESSAMENTO DE POLPA E PAPEL [00793] O alvo técnico para a xilanase evoluída foi aumentar a termotolerância na aplicação (por exemplo, até e incluindo 90oC) assim como perfil de pH mais amplo (desempenho em pH 8 a 10). O polipeptídeo que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:384, codificada por exemplo, por SEQ ID NO:383 (“SEQ ID NO:383/384”) foi evoluída para ser compatível como especificações alvo por criar e rastrear bibliotecas de GSSM seguido por reagrupamento de genes de mutantes únicos superiores encontrados. O ponto inicial para a GSSM foi SEQ ID NO:383/384, um truncamento C-terminal de três aminoácidos (3-aa) de SEQ ID NO:381/382. O rastreamento foi realizado em um hospedeiro de E. coli, as sequências do gene precursor (SEQ ID NO:383/384) são dadas abaixo.
ATGGCTCAGACCTGCCTCACGTCGAGTCAAACCGGCA
CTAACAATGGCTTCTATTATTCCTTCTGGAAGGACAGTCCGGGCA
CGGTGAATTTTTGCCTGCAGTCCGGCGGCCGTTACACATCGAACT
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393/510
GGAGCGGCATCAACAACTGGGTGGGCGGCAAGGGATGGCAGAC
CGGTTCACGCCGGAACATCACGTACTCGGGCAGCTTCAATTCACC
GGGCAACGGCTACCTGGCGCTTTACGGATGGACCACCAATCCAC
TCGTCGAGTACTACGTCGTCGATAGCTGGGGGAGCTGGCGTCCG
CCGGGTTCGGACGGAACGTTCCTGGGGACGGTCAACAGCGATGG
CGGAACGTATGACATCTATCGCGCGCAGCGGGTCAACGCGCCGT
CCATCATCGGCAACGCCACGTTCTATCAATACTGGAGCGTTCGGC
AGTCGAAGCGGGTAGGTGGGACGATCACCACCGGAAACCACTTC
GACGCGTGGGCCAGCGTGGGCCTGAACCTGGGCACTCACAACTA
CCAGATCATGGCGACCGAGGGCTACCAAAGCAGCGGCAGCTCCG
ACATCACGGTGAGTTAA (SEQ ID NO:383)
MAQTCLTSSQTGTNNGFYYSFWKDSPGTVNFCLQSGGR
YTSNWSGINNWVGGKGWQTGSR
RNITYSGSFNSPGNGYLALYGWTTNPLVEYYVVDSWGS
WRPPGSDGTFLGTVNSDGGTYD
IYRAQRVNAPSIIGNATFYQYWSVRQSKRVGGTITTGNHF DAWASVGLNLGTH NYQI MAT
EGYQSSGSSDITVS (SEQ ID NO:384) [00794] A biblioteca de GSSM foi submetida a estímulo térmico de 74oC, e então rastreada por clones que exibem a atividade mais alta sobre substrato solúvel de azo-xilano. Os candidatos superiores foram reconfirmados em azo-xilano durante rastreamento secundário e terciário. 15 mutantes únicos superiores foram selecionados para reagrupamento de genes. A lista de mutantes únicos gerados:
Posição de AA Mutação
4 T4L
9 S9P
10 Q10S
13 T13F
13 T13Y
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394/510
Posição de AA Mutação
14 N14H
18 Y18F
25 S25E
30 N30V
34 Q34C
34 Q34H
34 Q34L
35 S35E
71 S71T
194 S194H
[00795] As propriedades de termotolerância dos mutantes únicos selecionados são dadas na tabela abaixo:
Temperatura máxima tolerada pelos mutantes únicos de GSSM selecionados
Clone Mantém desempenho até:
(baseado em ensaio de atividade de azoxilano)
wt 72 oC
S9P 80 oC
T13F 80 oC
N14H 82,5 oC
Y18F 80 oC
Q34C 80 oC
[00796] O rastreamento de reagrupamento foi executado em substrato de azo-xilano da mesma forma que o rastreamento da biblioteca de GSSM. A estringência do rastreamento foi aumentada para 90oC e 1 para a etapa de estímulo com calor. Os clones recombinados superiores foram caracterizados por seu desempenho sobre os substratos
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395/510 da aplicação, em protocolos de bioalvejamento em saco. Abaixo está a lista dos clones selecionados para o teste da aplicação, com as alterações de aminoácido em relação à SEQ ID NO:384 precursora.
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 401/525
POSIÇÃO DE AMINOÁCIDO
Clone 4 9 10 13 14 18 25 30 34 35 71 194 NOTAS
precursor (WT) T S Q T N Y S N Q S S s Mutações listadas incorporadas pela sequência tipo selvagem, branco significa aa tipo selvagem selecionado
Xyl1 P Y H F E C E T H
Xyl2 P F H F L E T
Xyl3 s F H C E T H
Xyl4 P F H E H E H
Xyl5 P s H F E H E T H
Xyl6 P s Y H F E L E T H
Xyl7 P F H F E C E T
Xyl8 P F H F E C E T H
Xyl9 P s F H E V c E T H
Xyl 10 P s Y H E V L E T H
Xyl 11 P Y H E V L E H
Xyl 12 P Y H E V L E T H
Xyl 13 P s H F E C E T
Xyl 14 P s H F E V H E T
Xyl 15 P s F H F E C E H
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POSIÇÃO DE AMINOÁCIDO
Clone 4 9 10 13 14 18 25 30 34 35 71 194 NOTAS
Xyl16 P S F H F E H E T H
Xyl17 P Y H E L E T H
Xyl18 P S Y H F E H E T H
Xyl19 P S H F E V L E T
Xyl20 P Y H C E T H
Xyl21 P Y H E H E T
Xyl22 Y F T Trinca
Xyl23 P H F C E Quinteto
Xyl24 L H E C E Quinteto
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398/510 [00797] Com base nos resultados dos testes aplicados, dois clones foram selecionados. Eles são Xyl2 e Xyl4. Suas atividades específicas em U/mg foram determinadas usando o ensaio redutor de açúcar de arabinoxilano (chamado “ ensaio de Nelson-Somogyi”, discutido acima). Esses dados estão listados abaixo.
Clone Calibração U/mL Concentração de proteína Calibração U/mg
SEQ ID NO:382 172,6 1,62 106,4
SEQ ID NO:384 1032,4 9,85 104,9
Xyl2 723,8 5,94 121,9
Xyl4 2217,8 17,73 125,1
[00798] Os resultados da calorimetria exploratória diferencial para os mutantes pontuais selecionados e achados reagrupados superiores:
Medidas de DSC dos candidatos de xilanase superiores vs. xilanases precursoras
Temperatura de transição na qual a enzima é irreversivelmente inativada (desenovelada)
Temperatura de fusão
SEQ ID NO:382 80,9 oC
SEQ ID NO:384 86,6 oC
Xyl2 103,5 oC
Xyl4 102,2 oC [00799] Em um aspecto, as mutações únicas observadas acima foram combinadas para gerar uma enzima que tem pelo menos duas, várias ou todas as mutações observadas acima; veja, por exemplo, a Tabela 10 abaixo. Dessa forma, a invenção fornece polipeptídeos que apresentam atividade de xilanase tendo uma, pelo menos duas, várias ou todas as mutações pontuais observadas acima, e ácidos nucléicos que os codificam.
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EXEMPLO 8: NOVO ENSAIO DE BIOALVEJAMENTO PARA AVALIAR O DESEMPENHO DA XILANASE EM AUMENTAR A ALVURA DE POLPA [00800] Esse exemplo descreve um protocolo exemplar, um “ensaio de bioalvejamento” que pode ser usado para determinar se um polipeptídeo tem atividade de xilanase e está dentro do escopo da invenção. Esse ensaio pode ser usado para avaliar o desempenho de uma enzima exemplar da invenção que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:384 (codificada por exemplo, por SEQ ID NO:383) em aumentar a alvura de polpa Kraft. Essa e qualquer outra enzima xilanase da invenção podem ser usadas para aumentar a alvura de uma polpa, por exemplo, uma polpa Kraft.
[00801] A invenção fornece procedimentos de bioalvejamento, por exemplo, um procedimento de bioalvejamento em três estágios que simula rigorosamente as condições de uma fábrica de alvejante de polpa de celulose real, como ilustrado na Figura 11; incluindo um processo ilustrado na Figura 14. Essa sequência de alvejante é designada por (X)DoEp, na qual X representa o estágio de tratamento com xilanase (usando, por exemplo, uma enzima da invenção), D para estágio de alvejante com dióxido de cloro e Ep para estágio de extração de peróxido alcalino. O material bruto usado nos testes foi Polpa Marrom Kraft de Madeira Mole do Sul (sem deslignificação com oxigênio). Após o término de cada ciclo de bioalvejamento, a polpa resultante foi usada para produzir folhas de papel de acordo com as normas de TAPPI (Technical Association of Pulp and Paper Industries). O% de alvura GE de cada folha de papel foi medido e os valores de alvura foram usados como o indício de quão bem a enzima agiu sobre a polpa durante o estágio de pré-tratamento enzimático (X).
[00802] Bioalvejamento de polpa: A polpa foi alvejada em bateladas de 10 g em sacos plásticos lacrados usando uma sequência (X)DoEp
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400/510 de três estágio, como ilustrado na Figura 11. As condições do tratamento nos três estágios podem ser resumidas como segue:
❖ Estágio X: consistência de 10% (p/v) a 65oC e pH=8 por min ❖ Estágio Do: consistência de 4% (p/v) a 60oC por 30 min; fator Kappa =0,18 para amostras tratadas com enzima,e 0,18 e 0,21 para controles sem enzima.
❖ Estágio Ep: consistência de 10% (p/v) a 75oC por 90 min; quantidade de cáustico: 1,7% (p NaOH/p polpa OD) e quantidade de H2O2: 0,5% (p/p) [00803] Como observado na Figura 11, a polpa bruta foi lavada para reduzir o pH para pH 8.5. A polpa foi filtrada com pressão e dividida em sacos. Em cada estágio, os sacos foram incubados em um banhomaria na temperatura desejada e cada saco foi então retirado e amassado a cada 10 min para garantir uma massa uniforme e transferência de calor dentro da massa da polpa. Após cada tratamento, a polpa foi filtrada, lavada com 2L de água DI e filtrada novamente antes de receber o próximo tratamento. O conteúdo de umidade da polpa foi medido usando um analisador de umidade Mettler-Toledo (Fisher Scientific, USA).
[00804] Como observado na Figura 11, após a polpa ter sido filtrada com pressão e dividida em sacos, no estágio X, a polpa foi ressuspensa, filtrada com pressão, e o pH foi ajustado; e então incubada com enzima a 10% de sólidos, 65oC, 1 hora; e então amassada por 10 minutos. No estágio Do a polpa foi ressuspensa, lavada, o pH ajustado para 4.0 e filtrada com pressão; e então impregnada com Cl02 a 4% de sólidos (isto é, consistência de 4% (p/v)) a 60oC por 30 min; e então trabalhada por 10 minutos. No estágio Do fator Kappa=0,18 para amostras tratadas com enzima, e 0,18 e 0,21 para controles sem enzima. No estágio Ep a polpa foi ressuspensa, lavada, e filtrada com
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401/510 pressão; então incubada com NaOH e H2 O2 a 10% de sólidos (isto é, consistência de 10% (p/v)) a 75oC por 90 min; e então amassada por 10 minutos. A quantidade de cáustico: 1,7% (p NaOH/p polpa OD) e quantidade de H2O2: 0,5% (p/p). Após amassar, as folhas de papel foram formadas.
[00805] Folhas de papel: como observado na figura 11, as folhas de papel foram formadas (4 m de polpa, pH de cerca de 6.5); as folhas de papel foram feitas a partir de polpa não alvejada e alvejada usando equipamento de TAPPI (Kalamazoo Paper Chemicals, Richland, MI) de acordo com método de TAPPI T-272 sp-97. O% de alvura GE de cada folha de papel foi medido usando um a BRIGHTMETER MICRO S-5/BC™ (Technidyne Corp., New Albany, IN) de acordo com o método de TAPPI T-452 om-98 (referência a 457 nm).
EXEMPLO 9: NOVO PROCESSO DE BIOALVEJAMENTO [00806] Esse exemplo descreve um novo processo de bioalvejamento da invenção, como ilustrado na Figura 14. Esse processo pode ser praticado usando qualquer enzima xilanase, incluindo um polipeptídeo da invenção, incluindo qualquer enzima exemplar da invenção, por exemplo, qualquer polipeptídeo que tem a sequência de SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:636.
[00807] Esse processo exemplar da invenção pode ter um material inicial que compreende “polpa marrom”, que pode ser descrita como 1) preparação de matéria bruta - troncos que entram no moinho de papel são descascados, picados e examinados para remover lascas muito grandes, resíduos, nós e matéria estranha, 2) polpagem - lascas de madeira são cozidas a 160°C até 190°C sob pressão p or várias horas em um licor concentrado de hidróxido de sódio e sulfeto de sódio para separar as fibras de celulose e aumentar o conteúdo de celulose por extrair a maior parte da lignina indesejada. O resultado dessa etapa é referido como “polpa marrom”.
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402/510 [00808] Esse processo da invenção compreende uma “Etapa de alvejante” - um processo de múltiplos estágios pelo qual a lignina residual e outros cromóforos são removidos para alvejar a polpa até a alvura pretendida na preparação para fazer papel e outros produtos. A polpa é tratada com agentes químicos oxidantes, por exemplo, cloro e dióxido de cloro, que atacam preferivelmente a lignina. Em um aspecto, o processo compreende uma sequência de alvejante onde a polpa é reagida com dióxido de cloro, o estágio “D0” (veja também a figura 13, e exemplo 8, o estágio “D0”); extraída com álcalis na presença de peróxido de hidrogênio, o estágio “Ep” (veja também a Figura 13, o estágio “Ep”); reagida com dióxido de cloro uma segunda vez, o “estágio D1”; extraída com álcali e peróxido de hidrogênio, um estágio Ep; e reagida com dióxido de cloro uma terceira vez, um estágio D2. Na prática desse processo, o alvejante pode ser submetido a muitas variações com relação ao tipo e quantidade de agentes químicos oxidantes usados e o número de etapas do processo (entretanto, dióxido de cloro é geralmente o agente químico oxidante mais amplamente usado). Em um aspecto, esse processo compreende pré-tratamento da polpa cozida com oxigênio sob pressão; o reator de oxigênio pode estar em alta pressão - cerca de 200 a 23013 e pH 12 a 14 (e ssa é uma primeira etapa comum no alvejante, conhecida como “deslignificação por oxigênio”).
[00809] Em um aspecto esse processo compreende refinação. Por exemplo, antes da formação do papel, a polpa alvejada é picada mecanicamente para causar colapso das fibras de celulose em tiras achatadas, fibrilar suas superfícies e melhoras suas características físicas para produção de papel. Em qualquer estágio do processo após a polpação, a polpa pode ser desaguada, lavada e ajustada para uma consistência desejada pela adição de água limpa ou fluxos reciclados. [00810] Xilanase (por exemplo, uma enzima da invenção) pode ser
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403/510 adicionada logo após a polpação, no reator de oxigênio ou no recipiente de armazenamento antes do reator de oxigênio. A xilanase (por exemplo, uma enzima da invenção) pode ser adicionada em vários pontos (ou ou mais ou todos os pontos) no processo de alvejante. Em um aspecto, uma lacase é adicionada para catalisar a quebra da lignina. A lacase pode ser adicionada em qualquer estágio do processo, incluindo no reator de oxigênio. A polpa pode liberar vários componentes que auto-mediam a lacase (veja, por exemplo, DE 19723890 que descreve um sistema que oxidação que compreende um mediador orgânico e uma lacase; mediadores exemplares alternativos incluem 2,2'-azinobis(3-etilbenzt-iazolina-5-sulfonato) (ABTS) como um mediador orgânico exemplar e octacianomolibdato de potássio [K4Mo(CN) 8] como um mediador inorgânico exemplar). Mediadores descritos no pedido de Patente U.S. N° 20030096394, também podem ser usados no processo da invenção, incluindo qualquer composto capaz de aumentar as atividades da lacase e enzimas relacionadas a lacase.
[00811] Em um aspecto, uma esterase, por exemplo, uma lipase, ou oxidorredutase, por exemplo, peroxidase é adicionada. Além disso, o pH e/ou temperatura podem ser modificados no reator. Ao monitorar as reações da invenção, qualquer técnica de medição do conteúdo de lignina pode ser usada, por exemplo, veja o Pedido de Patente U.S. N° 20020144795, que descreve um método para medir o número kappa ou conteúdo de lignina em polpas Kraft com base na medida volumétrica de reações catalíticas que envolvem lignina e mediadores redox [00812] Enzimas da invenção também podem ser usadas em alvejante com processos de oxigênio-alcalino (deslignificação com oxigênio) descritos por exemplo, na Patente U.S. 6.824.646, o processo compreendendo alvejar polpa de lignocelulose em uma solução alcalina aquosa com oxigênio e tratar a polpa com hemicelulase, enquanto
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404/510 uma fração de líquido liberada da etapa de tratamento com enzima é separada da mistura de reação tratada com hemicelulase, e submetida a um tratamento de penetração através de membrana de separação, por exemplo, membrana de osmose reversa, para separar uma fração permeada de uma fração não permeada; e então a fração permeada é alimentada na etapa de alvejante com oxigênio-álcali (deslignificação com oxigênio) compreendendo o uso de uma enzima da invenção. [00813] Em aspectos alternativos dessa ou qualquer outro processo (método) da invenção, xilanases (por exemplo, enzimas da invenção) são usadas para reduzir a quantidade de agentes químicos branqueadores, por exemplo, cloro, dióxido de cloro, cáusticos, peróxido ou qualquer combinação destes; e em aspectos alternativos, uma redução de até cerca de 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais, ou 100%, de agentes químicos pode ser vista na prática dos métodos e uso das enzimas da invenção. Em um aspecto, uma redução de 100% nos agentes químicos pode ser obtida quando a xilanase é usada em combinação com uma lacase ou outra enzima, por exemplo, pelo uso de coquetéis de enzimas; observando que a invenção fornece misturas de enzimas, ou “coquetéis” que compreendem pelo menos uma enzima da invenção e uma ou mais outra(s) enzima(s), que pode(m) ser outra xilanase, ou qualquer outra enzima.
[00814] Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas para reduzir o dióxido de cloro para permitir reciclagem de água no processo; desta forma, há menos água usada e menos água despejada no esgoto. Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas para permitir que mais polpa rica em lignina entre na fábrica de alvejante, permitindo melhor rendimento da polpa e melhor qualidade da polpa (isto é, menos destruição durante o processo de cozimento. Em um aspecto, as xilanases da invenção são usadas para reduzir o número
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405/510 kappa da polpa.
[00815] As xilanases da invenção podem ser usadas, e os processos da invenção podem ser praticados em todos os tipos de madeira, incluindo, por exemplo, um madeira dura, com por exemplo, deslignificação por oxigênio e madeira dura sem deslignificação por oxigênio, madeira mole com deslignificação por oxigênio e madeira mole sem deslignificação por oxigênio e semelhantes. As xilanases da invenção podem ser usadas, e os processos da invenção podem ser praticados para processamento de papel e/ou polpa reciclada.
[00816] A deslignificação por oxigênio tipicamente requer a adição de uma torre de reação entre uma lavadora de polpa marrom e uma fábrica de alvejante. Tipicamente, oxigênio e hidróxido de sódio são adicionados à polpa marrom. A redução de agentes químicos branqueadores em 50% pode ser obtida no processo de alvejante se precedido por deslignificação com oxigênio. Lavagem segue a deslignificação com oxigênio; o efluente pode ser recuperado ou descartado. Deslignificação com ozônio pode ser usada no lugar de deslignificação com oxigênio.
EXEMPLO 10: NOVO ENSAIO DE BIOALVEJAMENTO [00817] Os dados desse exemplo demonstram a atividade de xilanase em polipeptídeos exemplares da invenção. Estes estudos de atividade de xilanase foram baseados naqueles descritos por Nelson (1944) J. Biol. Chem. 153:375-380, “Reducing Sugar Assay for Xylanase”; e, Somogyi (1952) J. Biol. Chem. 195:19-23. Esse ensaio de “Nelson-Somogyi” é usado para determinar unidades de atividade; os dados dos ensaios de “Nelson- Somogyi” demonstrando a atividade de xilanase em polipeptídeos exemplares da invenção por determinar unidades de atividade, é descrito abaixo.
[00818] As determinações de unidade de enzima foram feitas usando o ensaio de Nelson-Somogyi. Ensaios de alvejante foram baseados
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406/510 nos métodos da TAPPI (Technical Association of Pulp and Paper Industries, veja acima). Abaixo uma descrição junto com diferenças dos protocolos da TAPPI.
[00819] Polpa: duas bateladas de polpa marrom Kraft de madeira mole do sul foram obtidos do Department of Wood and Fiber Science na North Carolina State University (Raleigh, NC). Os números de kappa da polpa foram determinados como sendo 21,4 ou 29,7 respectivamente, usando o método TAPPI T-236 om-99 {TAPPI Test Methods (2000-2001), 2003 173 /id}.
[00820] Bioalvejamento de polpa: a polpa foi pré-tratada com xilanase e alvejada em lotes 10g em sacos plásticos lacrados usando uma sequência de 3 estágios de xilanase/dióxido de cloro/peróxido alcalino:(X)DoEp (veja explicação acima). As condições de tratamento nos três estágios foram como segue:
[00821] Estágio X: consistência de 10% (p/v) a 65oC e pH 8 por 60 min.
[00822] Estágio Do: consistência de 4% (p/v) a 60 oC por 30 min; um fator kappa de 0,18 foi usado para amostras tratadas com enzima, e 0,18 e 0,21 para controles sem enzima. A concentração de dióxido de cloro usada durante o estágio Do foi calculada usando a equação (1):
ClO.% = K x K # (1) 2 2.63 [00823] Onde ClO2% era igual a g de dióxido de cloro puro por 100 g de polpa seca em forno (OD) KF era o fator kappa e K# era o número kappa da polpa como determinado pelo método TAPPI T-236 om99{TAPPI Test Methods (2000-2001), 2003 173 /id} [00824] Estágio Ep: consistência de 10% (p/v) a 75 oC por 90 min; quantidade de cáusticos foi de 1,7% na polpa (p/p) e a quantidade de H2O2 foi de 0,5% na polpa (p/p).
[00825] Em cada estágio, sacos em duplicata foram incubados em
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407/510 um banho-maria na temperatura desejada e amassados vigorosamente a cada 10 minutos para garantir massa uniforme e transferência de calor dentro da massa da polpa. Após cada estágio, a polpa foi filtrada através de um funil de Buchner forrado com um filtro de polipropileno rígido (297-micron mesh, Spectrum Labs, Ft. Lauderdale, FL). O filtrado foi reciclado uma vez para capturar os resíduos, e a torta de polpa foi lavada com 2 L de água DI. A torta de polpa foi então ressuspensa em 1,5 L de água DI e o pH foi ajustado para pH 8 e pH 4 antes dos estágios X e Do, respectivamente. O conteúdo de umidade da polpa foi medido usando um analisador de umidade Mettler-Toledo (Fisher Scientific, USA).
[00826] Folhas de papel foram feitas a partir da polpa alvejada usando equipamento padrão TAPPI (Kalamazoo Paper Chemicals, Richland, MI) de acordo com o método TAPPI T-272 sp-97{TAPPI Test Methods (2000-2001), 2003 173 /id}. A % de alvura GE da cada folha de papel foi medido usando Technidyne BrightimeterTM Micro S-5/BC (Technidyne Corp., New Albany, IN) de acordo com o método TAPPI
T-452 om-98.
COMPONENTES usados no ensaio (1)
. NaOH 1M · Tampão de fosfato de sódio 0,5 M pH 8 · Arabinoxilano 1% - (Megazyme #P-WAXYM) preparada de acordo com as instruções do fabricante · Xilose - prepare padrões de 0,15 mM- 2mM usando D-xilose dissolvida em H2O · Placa de PCR de 96 cavidades (Fisher 05 500-48) · Lacres de placa de PCR · Placas claras de 96 cavidades padrão . Solução 1 : 12g de K+/Na+ tartrato; 24g de Na2CO3; 16g de NaHCOs; 144g de Na2SO4 em 800 mL de H2O · Solução 2 : 4g de Cu- SO4*5H2O; 36 g de Na2SO4 em 200 mL de H2O · Reagente A : Misture 4 volumes de solução 1 com 1 volume da solução 2. Nota- faça novo diariamente · Reagente B : 25g de (NH4)2MoO4 em 450 mL de H2O; adicione 21 mL de H2SO4 conc. Misture Dissolva 3g de
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COMPONENTES usados no ensaio (1)
. Tubos de 1 mL (E&K 671511RC) para o bloco de 96 cavidades Na2HAsO4*7H2O em 25 mL de dH2O; misture com solução de molibdato de amônio e incube o reagente a 37°C por 24 a 48 h. Armazene a solução em um frasco escuro isto é, longe da luz em temperatura ambiente.
PROCEDIMENTO
1. Prepare o reagente A
2. Pipete 5 uL de NaOH 1 M em cada cavidade de uma placa de PCR de 96 cavidades. Mantenha a placa sobre gelo.
3. Prepare a mistura de reação. Alternativamente, você pode fazer uma mistura estoque (master mix) para várias amostras. Esta é a mistura 1X. Adicione aos tubos de 1 mL e coloque no bloco de 96 cavidades.
a. 50 uL de tampão Na-fosfato pH8
b. 250 uL de substrato a 1% (para fazer uma concentração final de 0,5%)
c. 150 uL de H2O
4. Pré-aqueça a mistura de reação para a temperatura desejada por 3 minutos.
5. Dilua o tampão de fosfato 0,5 M para 5 mM pH 8 e faça diluições de enzima usando esse tampão.
6. Pipete 75 uL de enzima diluída em um cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades.
7. Pipete 50 uL de enzima diluída no tubo de 1 mL contendo a mistura de reação.
8. No momento desejado, pipete 50 uL de cada mistura de reação em tubos contendo NaOH (o NaOH aumentará o pH para 12, paralisando a reação).
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9. Adicione cada 50 uL de padrão a tubos separados contendo também NaOH. Os padrões são lineares dentro da faixa de 0,25 mM de xilose a 2,0 mM. Use pelo menos 4 padrões para gerar a curva padrão.
10. Adicione 50 uL de Reagente A a cada cavidade. Lacre a placa o filme Microseal™ ‘A’.
11. Aqueça a placa por 20 min. a 100°C em uma máquina de PCR. Ajuste a máquina para resfriar para 4°C após aquecer as amostras.
12. Adicione 50 uL de reagente B a cada tubo, misture.
13. -nota: uma quantidade significativa de CO2 é formada após a adição do reagente B. Deve ser tomado cuidado para que a amostra não contamine os cavidades adjacentes.
14. Pipete 100 uL de cada amostra ou padrão em cavidades separados de uma placa de microtitulação de 96 cavidades.
15. Leia a placa a 560 nm.
16. Faça um gráfico dos dados da curva padrão e expresso padrões como pmoles de xilose isto é, 50 pL de xilose 2,5 mM é 0,125 pmoles de xilose.
17. Subtraia o controle do tampão dos dados da amostra para cada ponto de tempo e plote os dados.
18. Divida o valor da inclinação da curva no ponto de tempo pelo valor da inclinação da curva padrão de xilose
19. Multiplique por 10 (contas para as amostras de 50 pL (1/10 do volume de ensaio total)
20. Divida pelo volume usado no ensaio (0,05) para ter pmoles de xilose liberados por minuto por mL de enzima ou U/mL de enzima.
21. Divida esse número pela concentração de proteína para ter U/mg.
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410/510 [00827] Os dados dos ensaios de “Nelson- Somogyi” demonstrando a atividade de xilanase em polipeptídeos exemplares da invenção são descritos na Tabela 8, abaixo. Como observado acima, as condições de ensaio compreenderam pH 8; 65oC U/mL, ou, pH 8; 40oC (U/mL). [00828] Na Tabela 8, para auxiliar a leitura da Tabela 8, “SEQ ID NO:151, 152” significa “o polipeptídeo que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:152, codificado, por exemplo, por um ácido nucléico que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:151”, etc.:
TABELA 8
SEQ ID NO: pH 8; 65 C U/mL ph 8; 40 C (U/mL)
151, 152 baixo 17,3
155, 156 13,5
169, 170 ND 1,62
195, 196 6,3 6,47
23, 24 ND 1
215, 216 34,7 55,9
5, 6 ND 6,3
121, 122 ND 139,4
405, 406 ND 41,34
47, 48 ND 31,2
191, 192 23 5
353, 354 ND 7
247, 248 5 146,3
307, 308 2,2 18
175, 176 37,7 36,2
7, 8 ND 16,1
161, 162 65 39,5
33, 34 Nenhuma atividade aparente nas condições testadas 18,9
221, 222 2,2 2
225, 226 ND 9,5
27, 28 ND 10,1
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411/510
SEQ ID NO:
163, 164 19, 20 81,82 91, 92 61, 62
469, 470 159, 160 299, 300 349, 350 233, 234 171, 172 203, 204 181, 182 227, 228 165, 166 335, 336 339, 340 141, 142 231, 232 367, 368 333, 334 281, 282 361, 362 261, 262 319, 320 357, 358 365, 366 273, 274 277, 278 455, 456 129, 130 pH 8; 65 C U/mL
1186,44273
ND
ND
ND
224
1.3 577
0,55
11,5
282
ND
ND
4.1
5.4 32
24,9 baixo
190
450
850
2.1 ph 8; 40 C (U/mL)
670,1
12,2
434
194
0,9
0,19
128
2,1
15.4
5.4
3,34
1,9
544,63
10,18
3,7
ND
49.5 0
65.5 51
16,65
74.4
423,02
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 417/525
412/510
SEQ ID NO: pH 8; 65 C U/mL ph 8; 40 C (U/mL)
271,272 ND 3
285, 286 25 11
259, 260 235 240,8
325, 326 1,5 7,4
359, 360 13 5,2
303, 304 ND 13,4
363, 364 2,1
93, 94 ND 24
157, 158 ND 2,6
189, 190 0,8 ND
25, 26 baixo 13,2
323, 324 260 51
49, 50 ND 0,05
85, 86 8 3,4
29, 30 3
51, 52 0,2 ND
35, 36 11,2 6,53
287, 288 1,45
293, 294 1042 219,23
99, 100 11,1 5,7
351, 352 ND 2
119, 120 3,4 19,36
123, 124 169 18,2
249, 250 2
311, 312 467 78,9
149, 150 9
167, 168 1500 46,8
207, 208 83 44,81
213, 214 ND 0,06
177, 178 12,1 7,6
113, 114 158 22,6
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 418/525
413/510
EQ ID NO: pH 8; 65 C U/mL ph 8; 40 C (U/mL)
289, 290 ND 16,65
75, 76 1
111, 112 ND 4,8
117, 118 ND 134,4
115, 116 36 15,9
125, 126 ND 31,5
137, 138 ND 2
451, 452 235 23,8
69, 70 44 2,1
205, 206 baixo 75
211, 212 baixo 159
197, 198 40 16,5
373, 374 ND 17,91
89, 90 12
31, 32 ND 11,4
13, 14 ND 20,7
65, 66 3,5
257, 258 ND 0,28
57, 58 ND 9,13
185, 186 49,9 119,3
77, 78 81
73, 74 ND 3,5
243, 244 8,6
229, 230 27 24,4
223, 224 1,5 2
109, 110 98 25,7
291, 292 17,65 3,8
179, 180 ND 5,7
3, 4 77,1
193, 194 24 8,5
173, 174 baixo 15
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 419/525
414/510
SEQ ID NO: pH 8; 65 C U/mL ph 8; 40 C (U/mL)
217, 218 2,7 0,17
59, 60 ND 34,5
71, 72 ND 6,6
101, 102 ND 9
39, 40 99 61
269, 270 ND 3,2
139, 140 13,2
55, 56 133 81,2
15, 16 ND 242,4
131, 132 ND 11,6
95, 96 146 136,3
143, 144 13 0,94
17, 18 7,2 2,6
21, 22 ND 8,1
153, 154 1,7 2
127, 128 0,46
253, 254 12,6 28,3
255, 256 13,15
[00829] Dados de “Unidades de Atividade” dos ensaios de “NelsonSomogyi” foram usados para determinar a dosagem em ensaios de bioalvejamento (com base nos métodos de TAPPI), como resumido na Tabela 9, abaixo (para auxiliar na leitura da Tabela 9, “SEQ ID NO:151, 152” significa “o polipeptídeo que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:152, codificado, por exemplo, por um ácido nucléico que tem uma sequência descrita em SEQ ID NO:151”, etc.):
TABELA 9
SEQ ID Temp. pH Unidades de xila- Tipo de polpa
NO: nase adicionadas
151, 152 40 8 2 SSW
169, 40 8 2 Nova SPB
Resultado
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415/510
SEQ ID NO: Temp. pH Unidades de xilanase adicionadas Tipo de polpa Resultado
170
195, 196 40 8 2 Nova SPB --
121, 122 40 8 2 Nova SPB +
191, 192 40 8 2 Nova SPB --
247, 248 65 8 2 SSW +
161, 162 40 8 2 Nova SPB +
225, 226 40 8 2 Nova SPB --
27, 28 40 8 2 Nova SPB --
81, 82 40 8 2 Nova SPB --
91, 92 40 8 2 Nova SPB --
61, 62 40 8 2 Nova SPB --
233, 234 40 8 2 Nova SPB --
171, 172 40 8 2 Nova SPB --
141, 142 40 8 2 Nova SPB --
231, 232 40 8 2 Nova SPB +
367, 368 40 8 2 Nova SPB +
261, 262 40 8 2 Nova SPB --
357, 358 40 8 2 Nova SPB --
365, 366 40 8 2 Nova SPB --
273, 274 40 8 2 Nova SPB -
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 421/525
416/510
SEQ ID NO: Temp. pH Unidades de xilanase adicionadas Tipo de polpa Resultado
277, 278 65 8 2 Nova SPB -
271, 272 40 8 2 Nova SPB +
285, 286 65 8 2 SSW -
325, 326 40 8 2 Nova SPB --
93, 94 40 8 2 Nova SPB -
157, 158 40 8 2 Nova SPB -
25, 26 65 8 2 Nova SPB --
85, 86 40 8 2 Nova SPB --
167, 168 65 8 2 Nova SPB +
9, 10 40 8 2 SSW -
43, 44 40 8 2 Nova SPB -
75, 76 40 8 2 Nova SPB --
111, 112 40 8 2 Nova SPB --
117, 118 40 8 2 Nova SPB --
115, 116 40 8 2 Nova SPB --
125, 126 40 8 2 Nova SPB --
69, 70 40 8 2 Nova SPB --
205, 206 40 8 2 Nova SPB --
211, 212 40 8 2 Nova SPB -
197, 198 65 8 2 SSW +
31, 32 40 8 2 Nova SPB -
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 422/525
417/510
SEQ ID NO: Temp. pH Unidades de xilanase adicionadas Tipo de polpa Resultado
13, 14 40 8 2 Nova SPB --
65, 66 40 8 2 Nova SPB --
57, 58 40 8 2 Nova SPB --
73, 74 40 8 2 SSW --
229, 230 40 8 2 SSW +
179, 180 40 8 2 Nova SPB +
3, 4 40 8 2 Nova SPB +
193, 194 40 8 2 Nova SPB --
173, 174 40 8 2 Nova SPB --
59, 60 40 8 2 Nova SPB --
71, 72 40 8 2 Nova SPB -
101, 102 40 8 2 Nova SPB -
39, 40 40 8 2 Nova SPB +
15, 16 40 8 2 Nova SPB -
131, 132 40 8 2 Nova SPB --
95, 96 40 8 2 Nova SPB -
143, 144 40 8 2 SSW --
393, 394 65 8 2 Nova SPB --
21, 22 40 8 2 Nova SPB -
255, 256 40 8 2 Nova SPB --
215, 216 65 8 2 Nova SPB ++
175, 176 65 8 2 Nova SPB +
203, 40 8 2 Nova SPB +
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 423/525
418/510
SEQ ID NO:
204
253,
254
Temp. pH
8
Unidades de xilanase adicionadas
Tipo de polpa Resultado
SSW ++
DEFINIÇÕES DE RESULTADO NA TABELA 9:
+ = maior do que o ponto médio dos controles de Fator Kappa até o controle de Fator Kappa alto ++ = maior do que o controle de Fator Kappa alto
- = menor ou igual ao ponto médio dos controles de Fator Kappa, mas não menor do que o controle de Fator Kappa baixo
-- = menor do que o controle do Fator Kappa baixo
Termo chave para a Tabela 9: SPB = Spruce Pinho Bétula; SSW =
Madeira Mole do Sul [00830] Nos estudos resumidos na Tabela 9, para enzimas que exibiram desempenho abaixo do controle do fator kappa baixo, infere-se que o material na amostra da enzima contribuiu para reduzir a alvura. A remoção desse material por enriquecimento ou purificação adicional do candidato de xilanase na amostra de enzima poderia melhorar o desempenho.
[00831] Em um aspecto, as mutações de um único resíduo de aminoácido descritas aqui foram combinadas para gerar uma enzima xilanase que tem pelo menos duas, várias ou todas as mutações pontuais, por exemplo, como descrito na Tabela 10, abaixo. A coluna do “no. da enzima” na Tabela 10 está correlacionada com a coluna “no. da enzima” na Figura 15, discutida abaixo.
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419/510
TABELA 10A, B, C: mutantes combinados, mutantes pontuais superiores (upmutants), mutantes superiores misturados curtos
Tabela 10A
Mutantes combinados Posição de aminoácido em SEQ ID NO:384
Enzyme No. 4 9 10 13 14 18 25 30 34 35 71 194
Tipo selvagem T S Q T N Y S N Q S S S
20 P Y H F E C E T H
21 P F H F L E T
22 S F H C E T H
23 P F H E H E H
24 P S H F E H E T H
25 P S Y H F E L E T H
26 P F H F E C E T
27 P F H F E C E T H
28 P S F H E V C E T H
29 P S Y H F E C E T H
30 P Y H E V L E H
31 P Y H E V L E T H
32 P S H F E C E T
33 P S H F E V H E T
34 P S F H F E C E H
35 P S F H F E H E T H
36 P Y H E L E T H
37 P S Y H F E H E T H
38 P S H F E V L E T
39 P Y H C E T H
40 P Y H E H E T
41 P Y H F E C E T H
15 Y F T
16 P H F C E
17 L H E C E
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 425/525
420/510
Tabela 10B
Mutantes pontuais superiores
Mutação Códon
1 T4L CTT
2 S9P CCC
3 Q10S TCA
4 T13Y TAC
5 T13F TTT
6 T13W TGG
7 Y18F TTC
8 S25E GAG
9 Q34L TTG
10 Q34H CAT
11 Q34C TGT
12 S35E GAG
13 S71T ACA
14 S194H CAT
Tabela 10C
Mutantes Superiores Curtos Misturados
15 16 17 13Y 18F 71T 9P 14H 18F 34C 35E 4L 14H 25E 34C 25E
[00832] A Figura 15 é uma tabela que resume dados que demonstram a atividade enzimática de enzimas exemplares da invenção que apresentam sequências descritas na Tabela 10 acima, onde está indicado que todas essas enzimas são variações da sequência de SEQ ID NO:384, como descrito na Tabela 10. Por exemplo, na “enzima 20”: a posição de aminoácido 9 é P, ou uma prolina (onde a “tipo selvagem”, ou SEQ ID NO:384, é S, ou uma serina), a posição de aminoácido 13 é “Y”, ou uma tirosina (onde a “tipo selvagem”, ou SEQ ID NO:384, é
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 426/525
421/510
T, ou uma treonina), etc. A menos que especificado de outra forma, todos os estudos foram feitos em polpa marrom de madeira mole do norte (por exemplo, SSWB é polpa marrom de madeira mole do Sul). Os fatores kappa altos/baixos estão indicados. A metodologia é discutida acima (por exemplo, para estágio “X”, “Do” e “E1”, ou “Ep”, veja explicação nos Exemplos 9 e 10, acima). Alvura e “economia de químicos” estão indicadas; “economia de químicos” indicando menos uso de branqueador químico tal como cloro (cloro elementar ou dióxido de cloro), hidrossulfito de sódio e/ou hipoclorito de sódio em uma segunda etapa de alvejante químico: onde uma enzima hemicelulolítica da invenção (xilanase) é usada inicialmente para degradar (hidrolisar) hemicelulose, e em uma segunda etapa de alvejante químico é usada para degradar a lignina restante).
[00833] Como observado acima, as enzimas e processos da invenção também podem ser usados em conjunto com uma segunda abordagem para alvejante químico usando enzimas oxidativas tais como lacase e/ou peroxidase de manganês (MnP) para deslignificar polpa. Dessas enzimas, a lacase é preferida, porque MnP requer peróxido de hidrogênio, íons manganês e um quelante. A lacase pode causar deslignificação de polpa sob pequena pressão de oxigênio, mas é consideravelmente mais eficaz quando mediadores são adicionados, como discutido acima.
[00834] Métodos de deslignificação melhorados por catalisadores também podem ser usados em conjunto com os métodos da invenção, por exemplo, polissulfeto ou antraquinona. Antraquinona é um catalisador de reação de polpação que pode aumentar a velocidade de polpação, aumentar o rendimento, e reduzir o uso de químicos de polpação em até 10%. É possível usar antraquinona e polissufeto juntos. [00835] Em um aspecto, a lacase é usada em conjunto com os métodos da invenção, como discutido acima. Por exemplo, lacase é usaPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 427/525
422/510 da em um reator de oxigênio em um processo da invenção, onde a lacase quebra a lignina no reator de oxigênio. Embora a polpa possa liberar vários componentes que auto-mediam a lacase, em um aspecto, mediadores orgânicos ou inorgânicos são adicionados (veja discussão acima, por exemplo mediadores exemplares alternativos incluem 2,2'-azinobis(3-etilbenzt- iazolina-5-sulfonato) (ABTS) como um mediador orgânico exemplar e octacianomolibdato de potássio [K4Mo(CN) 8] como um mediador inorgânico exemplar, ou mediadores descritos no pedido de patente U.S. 20030096394). Em um aspecto, outra hidrolase, tal como uma esterase (por exemplo, uma lipase) e/ou uma oxidorredutase (por exemplo, uma peroxidase) também são adicionadas. Em aspectos alternativos, o pH e/ou temperatura são modificados no reator.
EXEMPLO 11: ESTUDOS DEMONSTRANDO A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE SEQ ID NO:382 [00836] Este exemplo descreve estudos demonstrando a atividade enzimática da enzima xilanase exemplar da invenção que tem uma sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO:382 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:381).
[00837] A atividade enzimática de SEQ ID NO:382 foi demonstrada em Madeira Mole do Sul (SSWB), o desempenho da enzima sobre SSWB está resumido na Figura 16, Figura 17, Figura 18 e Figura 19. [00838] Para polpa marrom: SEQ ID NO:382 agiu muito bem na faixa de temperatura de 40 a 70°C, e na faixa de pH de 5 a 8. Economia de agentes químicos sob essas condições variou de 18% a 22%. A estabilidade de SEQ ID NO:382 permitiu que ela agisse sobre SSWB em temperatura de até 90°C, pH 8 (economia de agentes químicos depende das condições).
[00839] Para pós-O2, SSW-O2 precisou de apenas 0,05U de SEQ ID NO:382 por grama de polpa OD. SEQ ID NO:382 exibiu excelente
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 428/525
423/510 estabilidade a uma variedade de condições de processamento, incluindo temperatura, pH,% de sólidos, tempo de tratamento, quando usada para pré-tratar SSW-O2. Economia de químicos pode ser superior a 22% (economias apenas do estágio Do) em SSW-O2.
[00840] Figura 16 é uma tabela que ilustra a atividade de SEQ ID NO:382 e resume dados de (X)DoEp (veja acima para explicação detalhada) em SSWB 0803 (número Kappa 22,8); X: 10% de sólidos e 60 minutos; filtrado de polpa ajustado para o pH desejado - sistema nãotamponado. Na figura 16, SEQ ID NO:382, demonstrou atividade a 0,6 U /g de polpa OD, que forneceu um economia de químicos de 18%. [00841] Figura 17 é uma tabela que ilustra a atividade de SEQ ID NO:382 e resume os dados de (X)DoEp em SSWB 0803 (número Kappa 22,8); X: pH=8 e 30 minutos, 10% de sólidos; Filtrado de polpa ajustado para pH 8 - sistema não-tamponado. Na figura 17, SEQ ID NO:382, demonstrou atividade fornecendo uma economia de 14% a 0,9 U/g, 40°C e 50°C, pH 8, 30 minutos em SSWB-GP B runswick. [00842] Figura 18 é uma tabela que ilustra a atividade de SEQ ID NO:382 e resume os dados de (X)DoEp em SSWB 0803 (número Kappa 22,8); X: 40°C, 30 minutos e 10% de sólidos; o filtrado de polpa foi ajustado para o pH desejado - sistema não-tamponado. Na Figura 18, SEQ ID NO:382, demonstrou atividade mostrando que o prétratamento de SSWB-Brunswick com SEQ ID NO:382 forneceu uma economia de químicos de 18% e mostrou um desempenho um pouco melhor em um pH mais baixo pH (pH 6), 40°C, 30 minutos.
[00843] Figura 19 é uma tabela que ilustra a atividade de SEQ ID NO:382 e resume os dados de (X)DoEp em SSWB 0803 (número Kappa 22,8); (X)DoEp em SSWB (número Kappa 28,6) X: 40°C, pH=7, 30 minutos e 4,5% de sólidos; o filtrado de polpa foi ajustado para o pH desejado - sistema não-tamponado. Na figura 19, SEQ ID NO:382, demonstrou atividade mostrando que o pré-tratamento de SSWBPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 429/525
424/510
Brunswick com SEQ ID NO:382 em 4,5% de sólidos forneceu 18% de economia de químicos.
[00844] Figura 20 é uma tabela que ilustra que SEQ ID NO:382 também é eficaz sobre Madeira Dura do Norte (NHW) pós-O2 na faixa de pH de 6 a 8,5, retendo atividade mesmo em pH 10; 60°C e 90°C. Na figura 20, bioalvejamento com (X)DoEp Madeira do Norte NSWB (número Kappa 24,8). X: 0,7U/g, pH=10, 60 min, 10% de sólidos. [00845] Em resumo: SEQ ID NO:382 é ativa sobre todos os tipos de polpa, incluindo por exemplo, madeira mole, madeira dura, kappa baixo, kappa alto, etc.; SEQ ID NO:382 tem uma alta tolerância para variação de condições de processamento, incluindo, por exemplo, temperatura, pH,% de sólidos, tempo de tratamento; SEQ ID NO:382 age sobre uma ampla gama de temperaturas de operação (de 39°C a 90°C), com o melhor desempenho até 70°C; SEQ ID NO: 382 é ativa em uma ampla faixa de pH (pelo menos a faixa de pH 5.2 a 10.0 testada) e ótima na faixa de pH 6.0 a 8.0; SEQ ID NO:382 pode obter o efeito de pré-alvejante desejado em aproximadamente 20 minutos, permitindo taxas de alimentação aumentadas; e SEQ ID NO:382 age bem em várias as consistências de polpa (cerca de 3% a 10%), permitindo uma opção de alimentação aumentada durante o estágio X. EXEMPLO 12: ESTUDOS DEMONSTRANDO A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE ENZIMAS DA INVENÇÃO [00846] Esse exemplo descreve estudos que demonstram a atividade enzimática das enzimas xilanases exemplares da invenção, incluindo as enzimas xilanases exemplares da invenção que apresentam as sequências de aminoácido de SEQ ID NO:482 (codificada por exemplo, por SEQ ID NO:481), SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:502, SEQ ID NO:504 e SEQ ID NO:512. As atividades em pH 10 e em temperaturas de 45oC, 50oC, e 55oC para a xilanase exemplar da invenção que tem a sequência SEQ ID NO:512 são descritas.
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 430/525
425/510 [00847] Um ensaio exemplar para avaliar essas xilanases:
1. Rastreamento inicial - usando um substrato de azoxilano (baseado em solução)
a. Acertos descobertos foram subclonados em um vetor de expressão adequado
b. Subclones de xilanase foram expressos em frascos de agitação de 1 L sob condições usuais
c. Os níveis de expressão dos subclones foram determinados por SDS-PAGE.
d. O nível de atividade enzimática das enzimas foi determinado pelo ensaio de Azo-xilano usando substrato Azo-xilano de madeira de bétula (Birchwood) de Megazyme® em fosfato de sódio 100 mM, pH 8, de acordo com o protocolo de ensaio recomendado pelo fabricante. As concentrações de amostras de enzima foram ajustadas tal que elas tinham quantidades iguais de atividade de xilanase em pH8.
e. O ensaio de azo-xilano foi então repetido com amostras normalizadas em tampão de borato de sódio 100 mM em pH 10,4. [00848] Os dados do ensaio de azo-xilano desse protocolo usando enzimas exemplares da invenção que apresentam as sequências de aminoácido de SEQ ID NO:482, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:502, SEQ ID NO:504 e SEQ ID NO:512, são mostrados na Figura 21.
2. Rastreamento Inicial - ENZ-CHEK ULTRA XYLANASE ASSAY KIT™ (Invitrogen)
a. Amostras de xilanase foram preparadas da mesma maneira que para o ensaio de Azo-xilano (sessão 1, acima).
b. O nível de atividade enzimática de enzimas foi medido por empregar um kit de ensaio comercialmente disponível vendido pela Invitrogen sob o nome ENZ-CHEK ULTRA XYLANASE ASSAY KIT™ (número do produto E33650). O substrato do kit ENZ-CHEK™
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426/510 produz sinal fluorescente na presença de xilanases, o qual pode ser usado para quantificar as atividades usando padrões fornecidos pelo kit. O protocolo usado para testar as enzimas xilanases foi o protocolo recomendado pelo fabricante ligeiramente modificado. As modificações envolveram primariamente testar as xilanases em pH e temperatura diferente daquela que é recomendada pelo fabricante.
3. Rastreamento secundário - ensaios de polpa exemplares
a. As enzimas do ensaio de azo-xilano tiveram a atividade testada em arabinoxilano de trigo usando o ensaio de Nelson-Somogyi como já descrito aqui. Elas foram então testadas em ensaios de alvejante em escala laboratorial para determinar a quantidade de economia de químicos que pode ser obtida para um dado tipo de polpa e quantidade de dióxido de cloro. Aquelas que preencheram as características de desempenho desejadas foram testadas em ensaio de bioalvejamento em saco TAPPI em triplicata em uma faixa de quantidades e níveis de pH.
b. Os dados típicos para esse ensaio são mostrados na Figura 22 e na Figura 23.
4. Rastreamento de caracterização de enzima exemplar perfil de temperatura
a. A termotolerância de xilanases pode ser testada usando ensaio de azo-xilano em pH 8 e pH 10.4 em temperaturas progressivamente mais elevadas; e enzimas da invenção foram testadas usando esse ensaio. As taxas iniciais de reação em cada temperatura foram registradas e plotadas para determinar a temperatura ótima de desempenho de xilanases. Gráficos de perfil térmico exemplares são mostrados na Figura 24 e na Figura 25.
b. Atividade residual - Outro ensaio exemplar que pode ser empregado para testar a termoestabilidade de enzimas é o método
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427/510 de atividade residual, pelo qual uma amostra de enzima é tratada em uma temperatura elevada e em um pH particular por um período de tempo específico, e então testada sob condições usuais sob temperatura permissiva (tipicamente 37oC). A meia vida em uma temperatura particular é então determinada e fornece uma medida da aptidão de uma dada enzima sob essas condições de temperatura. Um gráfico de atividades residuais em pH 10 e temperaturas de 45oC, 50oC, e 55oC de uma das xilanases exemplares da invenção que tem a sequência de aminoácido SEQ ID NO:512 são mostradas na Figura 26.
EXEMPLO 13: CRISTALIZAÇÃO E COLETA DE DADOS PARA ANÁLISE DE ESTRUTURA [00849] Esse exemplo descreve e demonstra a cristalização e coleta de dados e análise de estrutura, para as xilanases exemplares da invenção que apresentam a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 482 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:481).
Cristalização e coleta de dados [00850] Cristais de SEQ ID NO:482 (21g/l em ddH20) cresceram a 20°C em PEG 400 55% (p/v), sulfato de lítio 0,15 M, acetato tri-sódico 0,1 M (pH 5.1). Os cristais cresceram durante um período de dois a três dias e foram crio-protegidos no líquido original. Cristais de SEQ ID NO: 382 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO:381) (21g/l em ddH20) foram formados a 20°C em PEG 8000 12% (p/v), Tris/HCl 0,1 M (pH 9). Os cristais também foram observados após dois a três dias e crio-resfriados no líquido original contendo 30% (v/v) de glicerol adicional. Dados de difração em uma resolução máxima de 1.8Â para SEQ ID NO:382 e 1.9Â para SEQ ID NO:482 foram registrados a partir de cristais únicos a 100 K usando um detector de imagem de placa RAXIS-IV equipado com uma fonte de raio X de anodo rotatório MicroMax 007 (cobre 1,5418 Â). Os dados de difração foram integrados em MOSFLM e escalonados em SCALA. Todos os outros cálculos foram
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428/510 feitos com programas da suite CCP4. Ambos os conjuntos de dados continham um total de 250 imagens cada e foram coletados com um ângulo de oscilação de 1°.
Resolução estrutural [00851] Os dados de difração revelaram que os cristais de SEQ ID NO:482 pertenciam ao grupo espacial C2 com dimensões de cela unitária de a=64,7 A, b=33,6 A, c=83,1 A, α=90,00° β=101,90° γ=90,00° e com uma molécula ocupando a unidade cristalográfica assimétrica. A estrutura de SEQ ID NO:482 foi resolvida por substituição molecular em MOLREP usando uma estrutura previamente determinada da XynA de Bacillus circulans (número de acesso PDB 1xnb; PDB é a base de dados de proteína (Protein Data Bank) disponibilizado pelo website do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)), como modelo de pesquisa. Ciclos de reconstrução manual em Coot foram intercaladas com refinamento posicional em REFMAC. Moléculas solventes de água foram adicionadas usando Arp_waters e checadas manualmente usando Coot.
[00852] Dados de difração que resultaram dos cristais de SEQ ID NO:382 pertenciam ao grupo espacial P212121, com dimensões de celas unitárias de a=36,3 A, õ=63,2 A, c=75,1 A, α=90,00° β=90,00° Y=90,00°também com uma molécula ocupando a unidade cristalográfica assimétrica. A estrutura de SEQ ID NO:382 foi resolvida por substituição molecular em MOLREP usando a estrutura da SEQ ID NO:482 como modelo de pesquisa. O refinamento foi então realizado de maneira similar ao da SEQ ID NO:482.
EXEMPLO 14: ATIVIDADE ENZIMÁTICA E CARACTERIZAÇÃO DE
ENZIMAS DA INVENÇÃO [00853] Esse exemplo descreve várias características de enzimas xilanase exemplares da invenção e ensaios exemplares para fazer essas determinações.
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429/510 [00854] O Mr da enzima madura exemplar da invenção SEQ ID NO:382 foi de 23 kDa determinado por SDS-PAGE. O tamanho da enzima nativa, estimado por cromatografia de exclusão de tamanho, foi de 25 kDa, indicando que a enzima é monomérica. SEQ ID NO:382 hidrolisou rapidamente xilano de espelta de aveia com um kcat de 155000±2700 min-1 e Km de 2,6 ± 1,4 mg/ml. A enzima exibiu termoestabilidade significativa e não sofreu inativação térmica acima de 70°C. A Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) (descrita em detalhes acima) mostrou que a xilanase tinha uma temperatura de fusão de 74,2°C. A termodinâmica de desenovelamento não pôde ser investigada já que o desenovelamento térmico da proteína foi irreversível; não foi possível obter um exame de reenovelamento e houve evidência de precipitação da proteína. Tentativas de obter o DG entre a forma enovelada e não-enovelada da xilanase também foram mal sucedidas já que o dicroísmo circular e a espectroscopia de fluorescência revelaram que a proteína não pôde ser desnaturada mesmo quando incubada por três meses em cloridrato de guanidina 6M a 37°C.
[00855] Os mutantes de aminoácido único S9P, N14H, T13F, Y18F, Q34L, S35E e S71T e a enzima exemplar da invenção de SEQ ID NO:482 foram purificados até homogeneidade eletroforética por cromatografia de troca de ânion. A atividade desses mutantes mostrou que todas as atividades específicas que eles tinham não estavam comprometidas em relação à enzima “tipo selvagem”, o que foi satisfatório já que alterações da estrutura da enzima que aumentam a estabilidade resultam freqüentemente em eficiência catalítica diminuída. A retenção da atividade catalítica total relatada aqui reflete, provavelmente, a estratégia de rastreamento empregada.
[00856] A Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) dos mutantes de xilanase mostrou que todas as variantes contendo uma única alteração de aminoácido mostraram Tms elevados, variando entre 2-11°
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430/510 (graus) acima daquele da enzima “tipo selvagem”. A xilanase “mutante” combinada exemplar da invenção SEQ ID NO:482 teve um Tm de 103oC que é 29o maior do que da xilanase precursora. Para investigar a resistência à inativação térmica, SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:482 foram aquecidas por 15 minutos em várias temperaturas e testadas na temperatura permissiva de 37°C; veja Figura 27, que ilustra a inativação térmica da xilanase “tipo selvagem” exemplar da invenção SEQ ID NO:382 e a xilanase variante ou “mutante” exemplar da invenção SEQ ID NO:482. As duas enzimas foram incubadas nas várias temperaturas mostradas, alíquotas foram removidas em vários períodos de tempo e testadas para atividade residual de xilanase a 37°C usando 4nitrofenil-b-Dxilotriosideo como substrato.
[00857] As constantes da taxa de pseudo-primeira ordem para inativação térmica a 79°C foram 0,573±0,054 min-1 e 0,0026 ± 0,00029 min-1 para SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:482 exemplares, respectivamente. Coletivamente, os estudos de inativação térmica são consistentes com os dados de Tm na demonstração de que as sete mutações introduzidas na SEQ ID NO:382 para gerar a SEQ ID NO:482 aumentaram muito a termoestabilidade da xilanase.
[00858] Para explorar a diferença na energia de inativação de SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:482 exemplares, a inativação térmica foi medida em várias temperaturas e os dados foram usados para construir gráficos de Arrhenius; veja Figura 28 que ilustra esse gráfico de Arrhenius: o log da taxa de inativação de pseudo-primeira ordem foi plotado contra a recíproca da temperatura. A inclinação das linhas dá a energia de inativação. A energia de inativação de SEQ ID NO:482 (68,6 kcal mol-1) está aumentada em comparação com a enzima tipo selvagem (54,5 kcal mol-1) em 14,1 kcal mol-1. Não foi possível explorar o □ G de desenovelamento de SEQ ID NO:482 já que o cloridrato de guanidina não desnaturou a proteína mesmo depois de incubação proPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 436/525
431/510 longada em temperaturas elevadas.
[00859] Para explorar o mecanismo pelo qual as substituições de aminoácidos aumentaram a estabilidade térmica das enzimas exemplares da invenção SEQ ID NO:482, as estruturas cristalinas da enzima “tipo selvagem” (a enzima exemplar da invenção SEQ ID NO:382) e da enzima SEQ ID NO:482 foram determinadas, com uma resolução de 1.8Â e 1.9Â, respectivamente, por substituição molecular usando a xilanase XynA de Bacillus circulans (número de acesso PDB 1xnb), que exibe 59% de identidade de sequência com SEQ ID NO:382) como modelo de pesquisa. Os aminoácidos que se estendem entre Gln-3 e Gly-197 estavam claramente visíveis na estrutura cristalina indicando que os três resíduos N terminais da enzima clonada estavam altamente desordenados ou tinham sido processados proteoliticamente. A enzima “tipo selvagem” (a enzima exemplar da invenção SEQ ID NO:382) exibe o enovelamento “β-jelly roll” típico das xilanases GH11. De fato, a conformação das enzimas GH11 foi comparada com a forma de uma mão direita com os “dedos” no alto, a “palma” na base e o polegar no lado direito da molécula. O modelo final da enzima contém uma α-hélice e duas folhas-β curvadas anti-paralelas que compreendem 6 e 8 fitas-β, respectivamente. Uma pesquisa DALI mostrou que a estrutura tridimensional de SEQ ID NO:382 é mais similar a endo-1,4xilanase II de Trichoderma reesei com um RMSD de 0,76 Â e exibe de fato um RMSD de <1,0 Â para 36 proteínas que são todas xilanases GH11.
[00860] A maior folha-β côncava da enzima exemplar da invenção SEQ ID NO:382 compreende a fenda de ligação ao substrato. No centro do sítio ativo há dois resíduos catalíticos, Glu-89 (nucleófilo catalítico) e Glu-181 (ácido-base catalítico) sobre as fitas-β 9 e 13 respectivamente. Os dois glutamatos, que são invariáveis nas enzimas GH11, são separados por ~6 Â, totalmente compatível com o aparato catalítiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 437/525
432/510 co de glicosídeo hidrolases “de retenção”, que hidrolisam ligações glicosídicas por um mecanismo de deslocamento duplo. Os pH ótimos das xilanases GH11 são influenciados pelo aminoácido adjacente ao catalisador ácido/base. Nas enzimas que apresentam um pH ótimo ácido, esse resíduo é ácido aspártico, enquanto ele é asparagina naquelas que funcionam sob condições mais alcalinas. Em SEQ ID NO:382, o resíduo adjacente a Glu-181, o catalisador ácido/base, é Asn-48, compatível com o pH ótimo alcalino exibido pela enzima. A topologia da fenda de ligação ao substrato indica que a enzima contém cinco sub-sítios de ligação de açúcar, três gliconas (-3 a -1) e duas agliconas (+1 e +2) do sítio de clivagem da ligação.
[00861] A estrutura cristalina da enzima exemplar da invenção SEQ ID NO:482 é extremamente similar a da enzima de “tipo selvagem” - a enzima exemplar SEQ ID NO:382 da invenção. As diferenças de aminoácidos entre a xilanase SEQ ID NO:382 “tipo selvagem” e a “mutante” SEQ ID NO:482, que estão todas na região N-terminal da proteína, estão localizadas nas fitas-β 2, 3 e 4 e nas alças que conectam as fitas-β 1 e 2 e 5 e 6. Os mecanismos pelos quais essas alterações de aminoácido aumentam a termoestabilidade da enzima são intrigantes. As mutações N14H causam o aumento mais significativo na termoestabilidade da enzima com um Tm 11o maior do que a enzima de tipo selvagem e ainda as interações entre esses aminoácidos e o resíduo equivalente na enzima de tipo selvagem, Asn-14, são muito semelhantes. Assim, a cadeia principal O e N de ambos os resíduos faz pontes de hidrogênio com a carbonila e amina, respectivamente do resíduo
17. Nd2 de Asn-14 na enzima de “tipo selvagem” (SEQ ID NO:382) e Ne2 de His-14 em SEQ ID NO:482 fazem, ambas, um ponte de hidrogênio com a cadeia principal de carbonila do aminoácido 34, enquanto as cadeias laterais de histidina e asparagina também podem fazer uma interação fraca adicional com Asn-15, embora a geometria desPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 438/525
433/510 sas interações seja sub-ótima para pontes de hidrogênio ideais. A nuvem de elétrons do anel de imidazol de His-14 está colocada entre Asn-15 e Leu-33 e assim fará contatos de van der Waals com esses dois resíduos e é possível que essas interações contribuam para a estabilidade global da proteína. O mecanismo preciso pelo qual a mutação N14H causa tal aumento substancial na termoestabilidade está atualmente muito vago e aponta para como alterações extremamente sutis na estrutura da proteína podem ter um impacto substancial sobre a estabilidade térmica. A mutação S9P também resulta em um aumento substancial no Tm (4,6 oC) da enzima, entretanto a base molecular para esse aumento na estabilidade não está precisamente esclarecida. A prolina no mutante faz interações hidrofóbicas fracas com a cadeia lateral aromática de Phe-21, entretanto, Oy de Ser-9 na xilanase tipo selvagem forma pontes de hidrogênio com a cadeia principal carbonila e NH de Lys-23. Como o resíduo 9 está na região que conecta as fitas β 1 e 2, é possível que o anel de prolina possa contribuir para a estabilidade da proteína pelo fechamento da conformação dessa alça em uma conformação ótima para o enovelamento global da proteína. A fenilalanina introduzida no mutante T13F faz vários contatos de van der Waals com Phe-18, enquanto a hidroxila de Thr-13 na enzima tipo selvagem não faz pontes de hidrogênio diretas dentro da proteína. Assim, a termoestabilidade aumentada exibida pelo mutante T13F, comparada a da enzima tipo selvagem (SEQ ID NO:382), é o resultado de interações hidrofóbicas entre Phe-13e Phe-18. O aumento da estabilidade fornecido pelas mutações Y18F e Q34L é intrigante. A substituição da glutamina por leucina resulta na perda de três pontes de hidrogênio diretas entre a cadeia lateral de Gln-34 e Ne2 de Gln-3 e o Oy de Thr-40 e a cadeia principal carbonila de Cys-32 dentro da proteína. A perda dessas ligações de hidrogênio pode ser compensada, em algum grau, pelos contatos de van der Waals entre Leu-34 e a cadeia de hiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 439/525
434/510 drocarboneto de Arg-38. Parece, entretanto, que é improvável que Tyr18 e Leu-34 aumentem a termoestabilidade pelo aumento direto de interações dentro da molécula da proteína. É interessante notar, entretanto, que existem extensas redes de pontes de hidrogênio mediadas por solvente entre Oq de Tyr-18 e Gln-56 e Asn-174, enquanto que Oe1 de Gln-34 também faz interações mediadas por água com Gln-3, Ser-35 e Arg-38. É possível que a perda de duas e cinco moléculas de água através das mutações Q34L e Y18F, respectivamente, possa aumentar a entropia associada com o enovelamento da proteína e portanto a termoestabilidade. O aumento da termoestabilidade fornecido pela mutação S35E é particularmente intrigante. A cadeia lateral do glutamato introduzido não faz nenhuma interação com a proteína e, de fato, ela é altamente desordenada e foi modelada em quatro conformações diferentes. Embora a estabilização significativa por resíduos carregados na superfície seja devida a formação de ponte de sal, foi mostrado que a colocação ótima de resíduos superficiais individuais carregados na rede eletrostática global fornece um modelo geral para a estabilidade hipertermofílica da proteína. Ainda é possível que, já que a dessolvatação de cadeias laterais carregadas é desestabilizante, a introdução de carga possa limitar a conformação local, estabilizando a alça que conecta as fitas-β 4 e 5 (Glu-35 está bem no final da fita-β 4) e melhorando a cooperatividade. Se a interrupção dessa alça inicia o processo de desenovelamento, então o argumento para a influência dramática da mutação S35E sobre a estabilidade da proteína é mais evidente.
[00862] Esse estudo demonstra a metodologia poderosa da evolução de Gene Site Saturation Mutagenesis™ (GSSMtm) para desenhar enzimas (incluindo polipeptídeos da invenção) com estabilidade aumentada em um nível estrutural. De forma intrigante, a maioria das mutações não media interações tipicamente associadas com estabiliPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 440/525
435/510 dade aumentada, tal como a introdução de pares de íons, pontes de dissulfeto, preenchimento de cavidades com resíduos hidrofóbicos ou redes de pontes de hidrogênio aumentadas dentro da proteína. Excepcionalmente, a mutação mais termoestabilizante, N14H, que causa um aumento no Tm de 8o, parece mediar seu efeito através da introdução de alguns contatos de van der Waals entre o anel de imidazol da histidina e resíduos adjacentes. Não é esperado que essas interações relativamente fracas possam causar tal aumento dramático na estabilidade, embora a mutação Y18F não pareça ter efeito sobre interações diretas dentro da proteína, mas pode aumentar a estabilidade pela ruptura de uma rede de pontes de hidrogênio mediada por solvente. A análise estrutural cristalográfica mostra que mesmo em retrospectiva, o mecanismo pelo qual as mutações em SEQ ID NO:482 contribuem para a termoestabilidade não está claro. Esse método destaca o poder da abordagem não estocástica do método GSSM feito aqui, utilizando evolução por GSSM e rastreamento de alta produtividade.
[00863] As propriedades bioquímicas e biofísicas das SEQ ID NO:382 e SEQ ID NO:482 exemplares tornam essas enzimas da invenção atraentes para uso industrial e outros usos; elas - e todas as enzimas dessa invenção - apresentam várias aplicações potenciais em diversas indústrias baseadas em biotecnologia incluindo os setores de ração animal, papel/polpa e bioenergia.
EXEMPLO 15: ATIVIDADE ENZIMÁTICA E CARACTERIZAÇÃO DE
ENZIMAS DA INVENÇÃO [00864] Esse exemplo descreve várias características de enzimas xilanases exemplares da invenção, incluindo, por exemplo, atividade enzimática (incluindo atividade determinada pela identidade de sequência - ou homologia - com enzimas conhecidas), fonte inicial do polipeptídeo e semelhantes, como explicado em detalhes abaixo. [00865] Por exemplo, para auxiliar na leitura da tabela imediataPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 441/525
436/510 mente abaixo, na primeira coluna, com referência ao polipeptídeo que tem a sequência de SEQ ID NO:484, codificado por exemplo, por SEQ ID NO:483, a fonte inicial dessa sequência exemplar é desconhecida, tomando como base a homologia de sequência a enzimas conhecidas ele pode ser classificado na Família 10 de xilanases, com base na homologia de sequência a enzimas conhecidas ele tem o número EC “previsto” de 3.2.1.8 e tem atividade de xilanase; na última coluna à direita, os resultados de atividade enzimática sobre azo-xilano (o ensaio está descrito acima).
[00866] A segunda tabela, abaixo, são diagramas que descrevem características selecionadas de ácidos nucléicos e polipeptídeos exemplares da invenção, incluindo comparação de identidade de sequência das sequências exemplares com bases de dados públicas. Todas as sequências descritas nas Tabelas 2 e 3 (todas as sequências exemplares da invenção) foram submetidas a uma pesquisa com BLAST (como descrito em detalhes abaixo) contra dois grupos de base de dados. O primeiro grupo de base de dados está disponível através do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Todos os resultados das pesquisas contra essas bases de dados são encontrados nas colunas designadas “Descrição de NR”, “Código de Acesso de NR”, “Valor-E de NR” ou “Organismo de NR”. “NR” se refere à base de dados de nucleotídeo não redundante mantida pelo NCBI. Essa base de dados é uma combinação de GenBank, atualizações do GenBank e atualizações de EMBL. As entradas na coluna “Descrição de NR” se referem à linha de definição em qualquer registro dado de NCBI, que inclui uma descrição da sequência, tal como o organismo fonte, nome do gene/nome da proteína e alguma descrição da função da sequência. As entradas na coluna “Código de Acesso na NR” referem-se ao identificador único dado a um registro de sequência. As entradas na coluna “Valor-E de NR” referem-se ao valor Esperado (Valor-E), que
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437/510 representa a probabilidade de que um escore de alinhamento tão bom quanto um encontrado entre a sequência pesquisada (as sequências da invenção) e a sequência da base de dados possa ser encontrada no mesmo número de comparações entre sequências aleatórias como foi feito na presente pesquisa BLAST. As entradas na coluna “Organismo de NR” referem-se ao organismo fonte da sequência identificada como a mais próxima da encontrada no BLAST. O segundo grupo de base de dados é coletivamente conhecido como base de dados GENESEQ™, que está disponível através de Thomson Derwent (Filadélfia, PA). Todos os resultados das pesquisas contra essa base de dados são encontrados nas colunas designadas “Descrição de Proteína de GENESEQTM”, “Código de Acesso de Proteína GENESEQTM”, “Valor E de Proteína GENESEQTM”, “Descrição de DNA de GENESEQTM”, “Código de Acesso de DNA de GENESEQTM”, ou “Valor E de DNA de GENESEQTM”. A informação encontrada nessas colunas é comparável à informação encontrada nas colunas de NR descritas acima, exceto que ela foi derivada de pesquisas BLAST contra a base de dados GENESEQTM ao invés da base de dados do NCBI. Além disso, essa tabela inclui a coluna “No. EC Previsto”. Um número EC é o número designado para um tipo de enzima de acordo com um esquema de nomenclatura padronizada de enzima desenvolvido pelo Enzyme Commission of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Os resultados na coluna “No EC Previsto” são determinados por uma pesquisa BLAST contra a base de dados Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Se a combinação mais importante de BLAST tem um Valor E igual ou menor a e-6, o número EC designado para a combinação mais importante é inserido na tabela. O número EC da combinação mais importante é usado como um guia para o provável número EC da sequência da invenção. As colunas “Extensão do DNA ExamiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 443/525
438/510 nado” e “Extensão da Proteína Examinada” referem-se ao número de nucleotídeos ou número de aminoácidos, respectivamente, na sequência da invenção que foi pesquisada ou examinada contra as bases de dados NCBI ou GENESEQ™. As colunas “Extensão do DNA de GENESEQTM ou NR” e “Extensão da Proteína de GENESEQTM ou NR”, referem-se ao número de nucleotídeos ou número de aminoácidos, respectivamente, na sequência da combinação mais importante da pesquisa BLAST. Os resultados fornecidos nessas colunas são da pesquisa que retornou o Valor E mais baixo tanto da base de dados NCBI quanto da base de dados Geneseq. As colunas “% de ID de Proteína de GENESEQTM ou NR” e “% de ID de DNA de GENESEQTM ou NR” referem-se ao percentual de identidade de sequência entre a sequência da invenção e a sequência da combinação mais importante de BLAST. Os resultados fornecidos por essas colunas são da pesquisa que retornou o valor-E mais baixo tanto da base de dados NCBI quanto da base de dados GENESEQTM.
SEQ ID NO: Fonte Família Número EC Previsto Classe de Atividade Atividade Enzimática em Azo-Xilano
483, 484 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
485, 486 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Nenhuma observada sob as condições testadas
487, 488 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase ++
489, 490 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Baixa
491,492 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Baixa
493, 494 Desconhecida 10 Xilanase
495, 496 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase +
497, 498 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase Alguma
499, 500 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Alguma
501,502 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
503, 504 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
505, 506 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase Alguma
507, 508 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase Alguma
509, 510 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Nenhuma observa-
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SEQ ID NO: Fonte Família Número EC Previsto Classe de Atividade Atividade Enzimática em Azo-Xilano
da sob as condições testadas
511, 512 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
513, 514 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase Alguma
515, 516 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Alguma
517, 518 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
519, 520 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
521, 522 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Alguma
523, 524 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase Nenhuma observada sob as condições testadas
525, 526 Desconhecida 10 e 43 3.2.1.8 Xilanase
527, 528 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Nenhuma observada sob as condições testadas
529, 530 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
531,532 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
533, 534 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
535, 536 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase Alguma
537, 538 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase ++
539, 540 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase Alguma
541, 542 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase +
543, 544 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
545, 546 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
547, 548 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
549, 550 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
551,552 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
553, 554 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
555, 556 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
557, 558 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
559, 560 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
561, 562 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
563, 564 Desconhecida 8 Xila- nase/Glica nase
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 445/525
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SEQ ID NO: Fonte Família Número EC Previsto Classe de Atividade Atividade Enzimática em Azo-Xilano
565,566 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
567, 568 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
569, 570 Desconhecida 30 Xilanase
571,572 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
573, 574 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
575, 576 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
577, 578 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
579, 580 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
581,582 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
583, 584 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
585, 586 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
587, 588 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
589, 590 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
591,592 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
593, 594 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
595, 596 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
597, 598 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
599, 600 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
601,602 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
603, 604 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
605, 606 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
607, 608 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
609, 610 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
611,612 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
613, 614 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
615, 616 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
617, 618 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
619, 620 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
621,622 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
623, 624 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
625, 626 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
627, 628 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
629, 630 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
631,632 Desconhecida 10 3.2.1.8 Xilanase
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SEQ ID NO: Fonte Família Número EC Previsto Classe de Atividade Atividade Enzimática em Azo-Xilano
633, 634 Desconhecida 8 Xilanase
635, 636 Desconhecida 11 3.2.1.8 Xilanase
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 447/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
385, 386 Família F xilanase [Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici]. 2124424 1 1,00E- 105 Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 2,00E-54 Fragmento de proteína de S. spinosa codificado por ORF24, SEQ ID 55.
387, 388 xilanase T-6 [Geobacillus stearothermophilus] 498820 0 Geobacillus stearother- mophilus Xilanase endo1,4-beta-Dxilanase alcalina termoestável. AAR76550 1,00E-135 endo-1,4-beta-Dxilanase alcalina termoestável.
389, 390 endoglicanase [Erwinia rhapontici]. 7688166 1,00E- 136 Erwinia rhapontici Gene de celulase. AAP70396 9,00E-97 Gene de celulase.
391, 392 Provável precursor de endoglicanase [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150] 5612977 6 1,00E- 175 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-130 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574.
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 448/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
393, 394 Produto protéico não nomeado [Bacillus circulans] 39416 6,00E-85 Bacillus circulans Proteína celulase alcalina de uma espécie de Bacilo. AAO20964 3,00E-82 Sequência codificante SEQ ID 229, expressa diferencialmente na osteogênese.
395, 396 endoglicanaseN257 [Bacillus circulans]. 1582375 2 0 Bacillus circulans Proteína celulase alcalina de uma espécie de Bacilo. AAO20964 0 Proteína celulase alcalina de uma espécie de Bacilo.
397, 398 endo-1,4-betaxilanase A [Thermotoga maritima]. 1564283 6 1,00E-79 Thermotoga maritima Enzimas endoxilanases de Thermotoga neopolitana AAW14319 6,00E-75 Xilanase A.
399, 400 alfa-L- arabinofuranosidase ArfA [Clostridium cellulovorans]. 2598957 7 1,00E- 173 Clostridium cellulovo- rans Sequência codificante de arabinase de B. subtilis AAW48290 1,00E-158 Sequência de nucleotídeo relacionada ao câncer de cólon humano SEQ ID NO:3665.
401,402 xilanase T-6 [Geobacillus stearothermophilus] 498820 1,00E- 168 Geobacillus stearother- mophilus endo-1,4-beta-Dxilanase termoestável alcalina AAR76550 1,00E-126 endo-1,4-beta-Dxilanase termoestável alcalina.
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
403, 404 Precursor de xilanase [Bacteroides ovatus] 450852 1,00E- 100 Bacteroides ovatus Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces SP AAW93151 2,00E-72 Fragmento do gene de xilanase obtido por amplificação de DNA do solo.
405, 406 beta-1;4xilanase [bactéria não cultivada] 1847619 1 2,00E-66 bactéria não cultivada Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp.. AAW93150 5,00E-66 Fragmento do gene de xilanase obtido por amplificação de DNA do solo.
407, 408 glicosil hidrolase, família 10 [Caulobacter crescentus]. 1612703 5 1,00E-96 Caulobacter crescentus xilanase de Streptomyces olivaceoviridis. AAY81494 2,00E-36 Fragmento de proteína de Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 76191.
409, 410 PRECURSOR DE ENDO-1,4BETA- XILANASE I (XILANASE I) (1,4-BETA-D- 1722897 5,00E-94 Aspergillus niger Sequência de proteína mutante de xilanase A23T de Aspergillus niger AAU96951 9,00E-95 Sequência de lipase pre-pro l.
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
XILAN XILA- NOIDROLASE I).
411,412 endoxilanase II; pI 9 [Hypocrea jecorina] 455907 1,00E- 118 Hypocrea jecorina Iniciador 3'para clonar o gene xln1 de T. reesei em vetor de expressão. AAW67567 1,00E-119 Iniciador 3'para clonar o gene xln1 de T. reesei em vetor de expressão.
413, 414 COG3405: Endoglicanase Y [Clostridium thermocellum ATCC 27405] 4886043 4 3,00E-55 Clostridium thermo- cellum ATCC 27405 Sequência de precursor de calcitonina com extensão 5' para processamento in vitro AAR20472 2,00E-32 Gene E2 de celu- lase de Thermomonospora fusca.
415, 416 Provável precursor de endoglicanase [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. 5612977 6 1,00E- 166 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-125 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574.
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
ATCC 9150]
417, 418 precursor de endoglicanase [Escherichia coli CFT073] gi|26110594|gb| AAN82779.1| precursor de endoglicanase [Escherichia coli CFT073] 2625016 5 0 Escherichia coli CFT073 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-161 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574.
419, 420 |I40696| endoglicanase Cellulomonas uda 2147354 1,00E- 119 Gene de celulase. AAP70396 1,00E-120 Gene de celulase.
421,422 xilanase III [Hypocrea jecorina]. 7328936 1,00E- 164 Hypocrea jecorina Iniciador de PCR X18 para DNA que codifica um polipeptídeo de xilanase estável ao calor AAY93607 1,00E-109 Polinucleotídeo de Aspergillus oryzae SEQ ID NO 3150.
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 452/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
423, 424 COG3405: Endoglicanase Y [Ralstonia eutropha JMP134] 4551607 7 1,00E- 139 Ralstonia eutropha JMP134 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-55 Peptídeo Lpembb codificado por embB de Myco- bacterium leprae
425, 426 s beta-1;4xilanase [Streptomyces avermitilis MA-4680] 2983152 7 1,00E-39 Strep- tomyces avermitilis MA-4680 Fragmento do gene de xilanase obtido por amplificação de DNA do solo. AAW09777 1,00E-38 iniciador reverso do DNA da região G3 de soja 240O17, SEQ ID NO: 416.
427, 428 |1N82|B estrutura cristalina de alta resolução de Ixt6; Uma xilanase intracelular termofílica de G. Stearothermophilus 3965424 3 0 Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp.. AAW93149 6,00E-99 endo-1,4-beta-D- xilanase termoestável alcalina.
429, 430 suposta endoglicanase [Escherichia coli 1580407 4 0 Escherichia coli O157:H7 DNA que codifica nova proteína humana de diag- ABG24489 1,00E-162 DNA que codifica nova proteína humana de diag-
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 453/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
O157:H7 EDL933]. EDL933 nóstico #20574. nóstico #20574.
431,432 PRECURSOR DE ENDO-1,4BETA- XILANASE (XILANASE) (1,4BETA-D-XILAN XILANOIDROLASE) (FIAXILANASE). 3915310 0 Aspergillus aculeatus Enzima de degradação de arabinoxilano de Aspergillus niger. AAW14598 1,00E-172 xilanase de Aspergillus aculeatus II.
433, 434 xilanase I [Streptomyces thermoviolaceus] 3852446 1 1,00E- 119 Strep- tomyces thermovio- laceus Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp.. AAW93158 1,00E-119 xilanase de Streptomyces olivaceoviridis.
435, 436 xilanase da Família F [Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici]. 2981135 1,00E- 166 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici C. minitans novel xilanase Cxy1. AAB29041 0 GPD1 de Chrysoporium parcial.
437, 438 |I40696| endo- 2147354 1,00E- Gene de celulase. AAP70396 1,00E-116 Vetor de integra-
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 454/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
glicanase Cellulomonas uda 115 ção de celY celZ, pLOI2352.
439, 440 xilanase intracelular [Bacillus stearothermophilus]. 4056655 1,00E- 128 Geobacillus stearother- mophilus Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp.. AAW93149 3,00E-94 Fragmento de proteína delta-6desaturase de T. thermophila SEQ ID 5.
441,442 ORF_ID:tlr1902 ~provável endo1,4-betaxilanase [Thermosynechococcus elongatus BP-1]. 2229944 5 1,00E-25 Thermosyne mosyne- chococcus elongatus BP-1 Iniciador TokcelR usado para isolar o gene celE de Tok7B.1. AAE16323 4,00E-16 Polipeptídeo de Drosophila melanogaster SEQ ID NO 24465.
443, 444 COG3693: Beta-1;4-xilanase [Microbulbifer degradans 240] 4886225 3 1,00E- 112 Microbulbifer degradans 2-40 DNA de endoglicanase de Vibrio harveyi. AAW34988 1,00E-169 DNA de endoglicanase de Vibrio harveyi.
445, 446 xilanase intra- 3158072 2,00E-77 bactéria não Iniciador TokcelR AAE16323 3,00E-70 Sequência codifi-
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 455/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
celular [bactéria não cultivada] 3 cultivada usado para isolar o gene celE de Tok7B.1. cante An17 reguladora da expressão do gene FLO11.
447, 448 Suposta endoglicanase [Escherichia coli O157:H7 EDL933]. 1580407 4 1,00E- 162 Escherichia coli O157:H7 EDL933 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-117 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574.
449, 450 endo-1,4-Dglicanase [Salmonella typhimurium LT2]. 1676690 3 1,00E- 166 Salmonella typhimurium LT2 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-123 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574.
451,452 |I39760| endo1;4-betaxilanase (EC 3.2.1.8) - Bacillus stearothermophilus 2126856 1,00E- 103 Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp.. AAW93149 7,00E-69 Iniciador de seqüenciamento da subunidade alfaD de integrina Beta2 de camundongo #19.
453, 454 Proteína hipoté- 4255538 1,00E- Gibberella Iniciador de PCR, AAU99346 3,00E-80 cDNA de xilanase
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 456/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
tica FG06445.1 [Gibberella zeae PH-1] 7 108 zeae PH-1 12207, usado para amplificar o cassete de expressão dentro de A. niger. de Myceliophthora thermophila.
455, 456 COG3693: Beta-1;4-xilanase [Clostridium thermocellum ATCC 27405] 4885843 5 0 Clostridium thermo- cellum ATCC 27405 DNA de xilanase A de Clostridium stercorarium. AAY70518 0 DNA de xilanase A de Clostridium stercorarium
457, 458 Provável precursor de endoglicanase [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150] 5612977 6 1,00E- 151 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574. ABG24489 1,00E-119 DNA que codifica nova proteína humana de diagnóstico #20574.
459, 460 endoxilanase [Alternaria alternata]. 6179887 1,00E- 141 Alternaria alternata nova xilanase Cxy1 de C. minitans. AAB29041 6,00E-97 xilanase II de Aspergillus aculeatus.
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 457/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
461,462 precursor de endo-1,4-betaD-glicanase [Pectobacterium chrysanthemi]. 1224004 9 1,00E- 114 Pectobacte- rium chrysanthe mi Gene de celulase. AAP70396 1,00E-111 Gene de celulase.
463, 464 |1N82|B estrutura cristalina de alta resolução de Ixt6; Uma xilanase intracelular termofílica de G. Stearothermophilus 3965424 3 1,00E- 125 Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp.. AAW93149 1,00E-97 Fragmento do gene de xilanase obtido por amplificação de DNA do solo.
465, 466 xilanase [Thermotoga neapolitana] 603892 0 Thermotoga neapolitana enzimas endoxilanase de Thermotoga neopolitana AAW14319 0 enzimas endoxilanase de Thermotoga neopolitana.
467, 468 Fragmento de endoglicanase 1560658 6 0 Aquifex aeolicus Iniciador de amplificação 1 do gene AAW69760 9,00E-22 Gene associado ao sistema imune
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 458/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
[Aquifex aeolicus]. que codifica celulose sintetase complexa humano SEQ ID NO: 59.
469, 470 COG3693: Beta-1;4-xilanase [Clostridium thermocellum ATCC 27405] 4886019 6 1,00E- 130 Clostridium thermo- cellum ATCC 27405 Polipeptídeo herbicidamente ativo SEQ ID NO 2. ABB91388 1,00E-76 Sequência de proteína de ORF 529 de Neisseria meningitidis, SEQ ID NO:1522.
471,472 precursor de xilanase [Bacteroides ovatus] 450852 1,00E-73 Bacteroides ovatus Xilanase A. AAR87013 3,00E-64 Fragmento do gene de xilanase obtido por amplificação de DNA do solo.
473, 474 xilanase intracelular [bactéria não cultivada] 3158072 3 5,00E-60 bactéria não cultivada Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp. AAW93149 1,00E-54 Polipeptídeo de Drosophila melanogaster, SEQ ID NO 24465.
475, 476 endo-1,4-betaxilanase [Thermobacillus xylanilyticus]. 2980618 1,00E-64 Thermobacillus xylanilyticus Xilanase A. AAR87013 6,00E-57 xilanase de Streptomyces olivaceoviridis.
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 459/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
477, 478 quitosanaseglicanase [Bacillus sp. D-2]. 1555294 5 1,00E- 123 Bacillus sp. D-2 Proteína celulase alcalina de uma espécie de Bacilo. AAO20964 5,00E-84 Fusarium venenatum EST SEQ ID NO:1176.
479, 480 xilanase [Aspergillus niger] 4423873 1 9,00E-89 Aspergillus niger Iniciador de PCR PGP02 para amplificar o promotor PGK de levedura. AAR22039 7,00E-89 Sequência do iniciador de PCR do gene de glutelina, 3'Gtl.4.
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Ge- neseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
483, 484 Família 10 de xilanase [Caldicellulosiruptor sp. Rt69B.1] 2760908 0 Caldicellulosiruptor sp. Rt69B.1 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34904 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3490 3
485, 486 Xilanase, glicosil hidrolase da família 10 [Clostridium 15004819 5,00E-75 Clostridium acetobutyli- cum Xilanase de uma amostra ambiental seq id ADJ34864 1,00E-78 Gene que codifica proteína de enzima hu- AAD482 89
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
acetobutyli- cum]. 14. mana
487, 488 Endo-1,4- beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.17E+08 3,00E-88 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35142 1,00E-93 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3491 5
489, 490 Endo-1,4- beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4- 1.17E+08 1,00E- 115 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35142 1,00E-132 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3488 1
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076]
491, 492 Biossintese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 90023252 0 Saccha- rophagus degradans 2-40 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans SEQ ID 8. AEH81891 0 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans SEQ ID 8. AEH818 92
493, 494 Glicosídeo hidrolase, família 10: enzima de celulosoma de Clostridium, doquerina tipo I:ligação de carboidrato, semelhante a CenC [Clostri- 67873837 5,00E-33 Clostridium thermo- cellum ATCC 27405 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34854 4,00E-32 Proteína imunogênica de Propionibacterium acnes #28612. AAS5954 4
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
dium thermo- cellum ATCC 27405] gi|67851540|g b|EAM47104. 1| Glicosídeo hidrolase, família 10: enzima de celulosoma de Clostridium, doquerina tipo I:
495, 496 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase 1.17E+08 1,00E- 112 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34920 1,00E-141 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3488 1
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
[Solibacter usitatus Ellin6076]
497, 498 precursor de endo-1;4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 46253616 1,00E- 107 Bactéria não cultivada Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34978 1,00E-108 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3496 3
499, 500 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.17E+08 1,00E- 122 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35142 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3514 1
501, 502 endo-1;4- beta-xilanase 1.1E+08 4,00E-79 Cellulomonas flavige- Xilanase de uma amos- ADJ34996 1,00E-112 Xilanase de uma amos- ADJ3499 5
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
Xynl [Cellulomonas flavigena] na tra ambiental seq id 14. tra ambiental seq id 14.
503, 504 endo-beta- 1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 757807 1,00E- 100 Cellvibrio mixtus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34976 1,00E-107 lniciador de PCR para sequência codificante de xilanase de Pseudomonas fluorescens AAA0724 6
505, 506 xila- nase/quitina desacetilase like [Saccharophagus degradans 2-40] 90022703 1,00E- 104 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34990 1,00E-171 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3498 9
507, 508 xila- nase/quitina desacetilase like [Saccharophagus de- 90022703 1,00E- 106 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34996 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3498 9
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
gradans 2-40]
509, 510 Família de ligação de carboidrato 6 [Clostridium cellulolyticum H10] gi|118663312| gb|EAV69968. 1| Família de ligação de carboidrato 6 [Clostridium cellulolyticum H10] 1.19E+08 2,00E-79 Clostridium cellulolyticum H10 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34872 1,00E-69 Proteína humana associada ao câncer HP13- 036.1. ABD328 15
511, 512 beta-1,4xilanase [Pseudomonas sp. ND137]. 17826947 1,00E- 106 Pseudomonas sp. ND137 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35152 1,00E-148 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3498 9
513, 514 endo-1; 4beta-xilanase 1334251 1,00E- 147 Bacillus sp. YA-335 Xilanase de uma amos- ADJ34948 1,00E-147 endo-1,4- beta-D- AAQ928 78
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
[Bacillus sp. YA-335] tra ambiental seq id 14. xilanase termoestável alcalina.
515, 516 Precursor de endoxilanase alcalina ativa [Bacillus halodurans] 56567273 0 Bacillus halodurans Polipeptídeo bacteriano #10001. ADS28252 0 endo-1,4- beta-D- xilanase termoestável alcalina AAQ928 62
517, 518 xila- nase/quitina desacetilase like [Saccharophagus degradans 2-40] 90022703 1,00E- 132 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35046 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3504 5
519, 520 xila- nase/quitina desacetilase like [Saccharophagus degradans 2-40] 90022703 1,00E- 132 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35046 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3499 5
521, xilanase [or- 57639627 1,00E- organismo Xilanase de ADJ35110 0 Xilanase de ADJ3510
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
522 ganismo não cultivado] 142 não cultivado uma amostra ambiental seq id 14. uma amostra ambiental seq id 14. 9
523, 524 endo-beta- 1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 757807 3,00E-59 Cellvibrio mixtus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34998 4,00E-60 Human immune/haemato poietic antigen geno- mic sequence SEQ ID NO:41436. AAK7261 3
525, 526 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 90023252 0 Saccha- rophagus degradans 2-40 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans - SEQ ID 8. AEH81891 0 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans - SEQ ID 8. AEH818 84
527, 528 xilanase [organismo não 57639627 1,00E- 117 organismo não cultiva- Xilanase de uma amos- ADJ34932 1,00E-132 Polipeptídeo bacteriano ADS636 54
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
cultivado] do tra ambiental seq id 14. #10001.
529, 530 xilanase [bactéria não cultivada ] 1.19E+08 5,00E-80 bactéria não cultivada Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34952 6,00E-98 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3499 5
531, 532 endo-beta- 1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 757807 2,00E-59 Cellvibrio mixtus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34976 2,00E-58 Oligonucleotide SEQ ID NO:62. AAA0570 1
533, 534 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 90023252 1,00E- 170 Saccha- rophagus degradans 2-40 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans - SEQ ID 8. AEH81891 1,00E-171 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans - SEQ ID 8. AEH818 84
535, endo-beta- 662884 1,00E- Bacillus sp. Xilanase de ADJ34918 1,00E-136 Xilanase de ADJ3482
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
536 1;4-xilanase [Bacillus sp.] 133 uma amostra ambiental seq id 14. uma amostra ambiental seq id 14. 7
537, 538 Endo-1;4- beta-xilanase [Saccharophagus degradans 2-40] 90022278 1,00E- 125 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 1,00E-135 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3510 9
539, 540 endo-1;4- beta-xilanase [Thermobifida fusca YX] 72161617 5,00E-96 Thermobifi- da fusca YX T. fusca xilanase. AAR73967 1,00E-96 Xilanase de T. fusca. AAQ903 88
541, 542 xilanase X [Paenibacillus sp. BL11] 82491944 1,00E- 102 Paenibacillus sp. BL11 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34948 1,00E-104 endo-1,4- beta-D- xilanase termoestável alcalina AAQ928 77
543, 544 xilanase intracelular [bactéria não culti- 31580723 1,00E- 128 bactéria não cultivada Xilanase de uma amostra ambien- ADJ34846 1,00E-137 Xilanase de uma amostra ambien- ADJ3487 7
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
vada] tal seq id 14. tal seq id 14.
545, 546 PRECURSOR DE ENDO1,4-BETAXILANASE A (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE A). 1722904 1,00E- 120 Bacteroides ovatus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35118 1,00E-152 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3490 5
547, 548 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 112 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 1,00E-123 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3493 1
549, 550 endo-beta1;4-xilanase [Bacillus sp.] 662884 1,00E- 120 Bacillus sp. Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34918 1,00E-122 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3509 5
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 471/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
551, 552 PRECURSOR DE ENDO1,4-BETAXILANASE A (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE A) (XYLA). 2506385 1,00E- 107 Pseudomonas fluorescens Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35136 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3513 5
553, 554 precursor de endo-1,4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 46253618 1,00E-83 bactéria não cultivada Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35054 1,00E-140 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3505 3
555, 556 xilanase [Microbulbifer hydrolyticus] 50727108 1,00E- 108 Microbulbifer hydrolyticus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35152 1,00E-150 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3498 9
557, xila- 90022703 1,00E- Saccha- Xilanase de ADJ34996 1,00E-169 Xilanase de ADJ3499
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 472/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
558 nase/quitina desacetilaselike [Saccharophagus degradans 2-40] 103 rophagus degradans 2-40 uma amostra ambiental seq id 14. uma amostra ambiental seq id 14. 5
559, 560 endo-beta1;4-xilanase [Bacillus sp.] 662884 1,00E- 115 Bacillus sp. Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34878 1,00E-119 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3484 5
561, 562 ENDO-1,4- BETA- XILANASE A PRECURSOR (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE A) (XYLA). 2506385 1,00E- 107 Pseudomonas fluorescens Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35136 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3513 5
563, 564 Proteína grande de 1.11E+08 1,00E-53 Cytophaga hutchinsonii Polipeptídeo bacteriano ADS21231 2,00E-53 Human soft tissue sar- ADQ214 53
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
CHU; candidata a bglicosidase; proteína glicosídeo hidrolase da família 8 [Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406] ATCC 33406 #10001. coma- upregulated protein SEQ ID 40.
565, 566 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 90023252 0 Saccha- rophagus degradans 2-40 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans - SEQ ID 8 AEH81891 0 Xilanase XYNB. AAT0720 0
567, 568 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 140 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35110 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3510 9
569, Possível en- 15004822 6,00E-40 Clostridium Xilanase de ADJ35028 8,00E-27 Proteína ADQ086
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
570 zima de degradação de xilano (glicosil hidrolase domínio semelhante a família 30 e domínio semelhante a Ricina B) [Clostridium acetobutylicum]. acetobutyli- cum uma amostra ambiental seq id 14. associada ao sistema nervoso Ciona intestinalis SeqID62. 27
571, 572 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter 1.17E+08 1,00E- 123 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35142 1,00E-165 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3514 1
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
usitatus Ellin6076]
573, 574 PRECURSOR DE ENDO1,4-BETAXILANASE A (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE A) (XYLA). 2506385 1,00E- 105 Pseudomonas fluores- cens Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35136 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3513 5
575, 576 Ligação de carboidrato família 6 [Clostridium cellulolyticum H10] gi|118663312| gb|EAV69968. 1| ligação da carboidrato 1.19E+08 1,00E- 135 Clostridium cellulolyticum H10 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34872 2,00E-84 Nova proteína secretada humana seqid 151. ADN417 61
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 476/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
família 6 [Clostridium cellulolyticum H10]
577, 578 precursor de endo-1,4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 46255070 1,00E- 120 bactéria não cultivada Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34942 1,00E-120 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3494 1
579, 580 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.17E+08 1,00E- 129 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35142 1,00E-167 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3514 1
581, precursor de 46253618 4,00E-78 bactéria não Xilanase de ADJ35082 0 Xilanase de ADJ3495
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
582 endo-1,4beta-xilanase [bactéria não cultivada] cultivada uma amostra ambiental seq id 14. uma amostra ambiental seq id 14. 7
583, 584 família 10 glicosil hidrolase XynB [Fibrobacter succinogenes S85]. 11526752 5,00E-79 Fibrobacter succinogenes S85 Proteína do sistema de celulase de Microbulbifer degradans - SEQ ID 8. AEH81883 6,00E-79 Nova proteína humana SEQ ID NO 122. ADB315 15
585, 586 beta-1,4- celobiosidase [Pseudomonas sp. PE2]. 25137524 3,00E-84 Pseudomonas sp. PE2 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35132 1,00E-89 Gene de proteína humana secretada 36 SEQ ID NO:46. AAC999 35
587, 588 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 111 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 1,00E-112 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3491 5
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 478/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
589, 590 PRECURSOR DE ENDO1,4-BETAXILANASE (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE A). 1722904 1,00E- 123 Bacteroides ovatus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35118 1,00E-158 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3504 3
591, 592 xila- nase/quitina desacetilaselike [Saccharophagus degradans 2-40] 90022703 1,00E- 112 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35046 1,00E-172 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3498 9
593, 594 endo-beta- 1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 757807 1,00E-57 Cellvibrio mixtus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34976 4,00E-60 Novel mouse gene sequence #5. ADO357 32
595, endo-1;4- 72163190 1,00E- Thermobifi- Xilanase de ADJ35080 1,00E-103 Xilanase de ADJ3507
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
596 beta-xilanase [Thermobifida fusca YX] 102 da fusca YX uma amostra ambiental seq id 14. uma amostra ambiental seq id 14. 9
597, 598 Surface protein from Gram-positive cocci, anchor region [Clostridium phytofermentans ISDg] gi|106768036| gb|EAT24745. 1| Surface protein from Gram-positive cocci, anchor region [Clostridium phytofermentans ISDg] 1.07E+08 3,00E-61 Clostridium phytofer- mentans ISDg Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35068 2,00E-50 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3484 1
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 480/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
599, 600 xilanase XynA GH 10 [Paenibacillus sp. JDR-2] 62990090 0 Paenibacillus sp. JDR-2 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34858 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3485 7
601, 602 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.17E+08 1,00E-84 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34882 5,00E-91 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3488 1
603, 604 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.17E+08 1,00E- 119 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35142 1,00E-152 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3506 1
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 481/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076]
605, 606 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 120 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3493 1
607, 608 xila- nase/quitina desacetilaselike [Saccharophagus degradans 2-40] 90022703 1,00E- 134 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35046 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3499 5
609, 610 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 144 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id ADJ35110 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id ADJ3510 9
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
14. 14.
611, 612 xilanase IXT6 intra-cellular [Geobacillus stearother- mophilus] 1.14E+08 1,00E- 113 Geobacillus stearother- mophilus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35078 1,00E-114 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3513 9
613, 614 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 121 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3493 1
615, 616 celoxilanase CelW [Clostridium stercorarium]. 23304849 1,00E- 116 Clostridium stercorarium Fragmento de RNA de RBS do gene BgaI de Streptomyces sp. AAW93148 1,00E-117 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3479 5
617, 618 PRECURSOR DE ENDO1,4-BETAXILANASE 1722904 1,00E- 127 Bacteroides ovatus Xilanase de uma amostra ambiental seq id ADJ35044 1,00E-140 Xilanase de uma amostra ambiental seq id ADJ3490 5
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 483/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
(XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE A). 14. 14.
619, 620 endo-1; 4- beta-xilanase [Bacillus sp. YA-335] 1334251 4,00E-56 Bacillus sp. YA-335 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35102 2,00E-86 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3510 1
621, 622 Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961| gb|ABJ83670. 1| Endo-1,4beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.17E+08 2,00E-95 Solibacter usitatus Ellin6076 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35056 1,00E-173 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3505 5
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 484/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
623, 624 endo-beta- 1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 757809 6,00E-97 Cellvibrio mixtus Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35126 3,00E-97 DNA de endoglucanase Vibrio harveyi. AAT9419 6
625, 626 xila- nase/quitina desacetilaselike [Saccharophagus degradans 2-40] 90022703 1,00E- 114 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ35046 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3499 5
627, 628 xilanase 5 [Aeromonas punctata]. 27227837 0 Aeromonas punctata Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34858 0 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3485 7
629, 630 Endo-1;4- beta-xilanase [Saccharophagus degradans 2-40] 90022278 1,00E- 126 Saccha- rophagus degradans 2-40 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 1,00E-138 Polipeptídeo bacteriano #10001. ADS636 54
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 485/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
631, 632 xilanase [organismo não cultivado] 57639627 1,00E- 116 organismo não cultivado Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34932 1,00E-130 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3493 1
633, 634 glicosídeo hidrolase, família 8 [Clostridium cellulolyticum H10] gi|118665052| gb|EAV71675. 1| glicosídeo hidrolase, família 8 [Clostridium cellulolyticum H10] 1.19E+08 2,00E-66 Clostridium cellulolyticum H10 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ34792 8,00E-66 Xilanase de uma amostra ambiental seq id 14. ADJ3478 9
635, 636 endo-beta- 1;4-xilanase [Cellvibrio 757807 1,00E-58 Cellvibrio mixtus Xilanase de uma amostra ambien- ADJ34960 4,00E-60 Domínio #7 semelhante a EGF do AAD028 09
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 486/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de NR Valor-e de NR Organismo de NR Descrição de Proteína de Geneseq Código de Acesso de Proteína de Geneseq Valor-E de proteína de Geneseq Descrição de DNA de Geneseq
mixtus] tal seq id 14. clone HWAAQ40 da proteína semelhante a atractina humana.
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Geneseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
385, 386 família F xilanase [Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici]. AAF8831 5 0,27 3.2.1.4 1122 373 1155 384 52 62
387, 388 xilanase T-6 [Geobacillus stearothermophilus] AAQ9286 2 2,00E-05 3.2.1.8 1221 406 0 407 75 64
389, endoglicanase AAN7061 2,00E-05 3.2.1.4 1008 335 1002 333 66 66
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 487/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
390 [Erwinia rhapontici]. 7
391, 392 provável precursor de endoglicanase [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150] AAS9014 5 1,00E-21 3.2.1.4 1116 371 0 369 77 75
393, 394 produto de proteína não nomeado [Bacillus circulans] ABZ3486 4 0,11 1677 558 0 409 31 39
395, 396 endoglicanaseN257 [Bacillus circulans]. AAK9979 8 0 1224 407 1224 407 97 94
397, 398 endo-1,4-betaxilanase A [Thermotoga maritima]. AAT0814 3 1,00E-08 3.2.1.8 741 246 3180 1059 56 64
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 488/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
399, 400 alfa-L- arabinofurano- sidase ArfA [Clostridium celulovorans]. ABQ5836 2 0,65 3.2.1.55 2637 878 1479 492 32 30
401, 402 xilanase T-6 [Geobacillus stearothermophilus] AAQ9286 2 2,00E-11 3.2.1.8 1242 413 0 407 71 68
403, 404 precursor de xilanase [Bacteroides ovatus] AAT6356 6 5,00E-09 3.2.1.8 1158 385 0 376 45 53
405, 406 beta-1 ;4xilanase [bactéria não cultivada] AAT6356 1 2,00E-08 3.2.1.8 1065 354 0 360 39 48
407, 408 glicosil hidrolase, família 10 [Caulobacter crescentus]. AAC4954 3 1,1 3.2.1.8 1173 390 1131 376 50 59
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 489/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
409, 410 PRECURSOR DE ENDO-1,4BETA- XILANASE I (XILANASE I) (1,4-BETA-DXILAN XILA- NOIDROLASE I). AAQ4268 5 1,00E-32 3.2.1.8 630 209 2059 211 77 76
411, 412 endoxilanase II; pI 9 [Hypocrea jecorina] AAV8133 2 ####### 3.2.1.8 666 221 1015 223 92 86
413, 414 COG3405: Endoglicanase Y [Clostridium thermocellum ATCC 27405] AAV0716 4 0,14 3.2.1.8 2244 747 0 477 20 31
415, 416 provável precursor de endoglicanase [Salmonella enterica subsp. enterica sero- AAS8867 6 2,00E-26 3.2.1.4 1107 368 0 369 74 73
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
var Paratypi A str. ATCC 9150]
417, 418 precursor de endoglicanase [Escherichia coli CFT073] gi|26110594|gb |AAN82779.1| precursor de endoglicanase [Escherichia coli CFT073] AAS8867 6 0 3.2.1.4 1107 368 0 370 100 100
419, 420 |I40696| endoglicanase Cellulomonas uda AAN7061 7 2,00E-17 3.2.1.4 990 329 1828 359 61 68
421, 422 xilanase III [Hypocrea jecorina]. ABZ5181 8 0,97 3.2.1.8 1044 347 1044 347 82 75
423, 424 COG3405: Endoglicanase Y [Ralstonia AAV5893 9 0,32 3.2.1.4 1335 444 0 392 58 62
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
eutropha JMP134]
425, 426 putative beta1 ;4-xilanase [Streptomyces avermitilis MA4680] AAI61373 0,29 3.2.1.8 1221 406 0 451 29 43
427, 428 |1N82|B estrutura cristalina de alta resolução de Ixt6; Uma xilanase intracelular termofílica de G. Stearothermophilus AAQ9286 2 0,001 3.2.1.8 996 331 0 331 99 54
429, 430 Suposta endoglicanase [Escherichia coli O157:H7 EDL933]. AAS8867 6 0 3.2.1.4 1107 368 1107 368 99 98
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 492/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
431, 432 ENDO-1,4- BETA- PRECURSOR DE XILANASE (XILANASE) (1,4-BETA-DXYLAN XYLANOHYDROLASE) (FIAXILANASE). AAQ7463 6 0 3.2.1.8 984 327 0 327 98
433, 434 xilanase I [Streptomyces thermoviolaceus] AAA1298 6 5,00E-18 3.2.1.8 1134 377 0 476 59
435, 436 família F xilanase [Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici]. AAI72046 2,00E-88 3.2.1.8 1116 371 3028 384 74
437, 438 |I40696| endoglicanase Cellulomonas uda ABK1305 0 3,00E-07 3.2.1.4 993 330 11772 359 59
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
439, 440 xilanase intracellular [Bacillus stearothermophilus]. AAF6194 8 0,97 3.2.1.8 1041 346 996 331 61 60
441, 442 ORF_ID:tlr190 2~provável endo-1,4-beta- xilanase [Thermosynechococcus elongatus BP1]. ABL2951 5 0,29 3.2.1.8 1239 412 1158 385 26 44
443, 444 COG3693: Beta-1;4xilanase [Microbulbifer degradans 240] AAT9419 6 0 3.2.1.8 912 303 849 282 92
445, 446 xilanase intracellular [bactéria não cultivada] ABQ9422 5 4,4 3.2.1.8 1191 396 0 336 38
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SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
447, 448 suposta endoglicanase [Escherichia coli O157:H7 EDL933]. AAS9014 5 2,00E-17 3.2.1.4 1107 368 1107 368 71 70
449, 450 endo-1,4-D- glucanase [Salmonella typhimurium LT2]. AAS9014 5 3,00E-19 3.2.1.4 1107 368 1110 369 73 72
451, 452 |I39760| endo1 ;4-betaxilanase (EC 3.2.1.8) - proteína hipotética de Bacillus stearother- mophilus ABK8244 2 0,61 3.2.1.8 681 226 0 330 76
453, 454 FG06445.1 [Gibberella zeae PH-1] AAT7407 4 7,00E-14 3.2.1.8 1002 333 0 367 56
455, 456 COG3693: Beta-1 ;4- AAZ5181 7 0 3.2.1.8 2823 940 0 1077 99
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 495/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
xilanase [Clostridium thermo- cellum ATCC 27405]
457, 458 provável precursor de endoglicanase [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. ATCC 9150] AAS9420 8 1,00E-21 3.2.1.4 984 327 0 369 74
459, 460 endoxilanase [Alternaria alternata]. AAQ7463 6 1,00E-07 3.2.1.8 1524 507 1281 426 55 56
461, 462 Precursor de endo-1,4-betaD-glucanase [Pectobacterium chrysanthemi]. AAN7061 7 2,00E-20 3.2.1.4 990 329 999 332 58 64
490/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 496/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
463, 464 |1N82|B estrutura cristalina de alta resolução de Ixt6; Uma xilanase intracelular termofílica de G. Stearothermophilus AAT6357 1 0,004 3.2.1.8 1023 340 0 331 62
465, 466 xilanase [Thermotoga neapolitana] AAT6258 9 2,00E-68 3.2.1.8 2142 713 0 1055 75
467, 468 fragmento de endoglicanase [Aquifex aeolicus]. ABL3432 6 0,9 3.2.1.4 978 325 978 325 100 100
469, 470 COG3693: Beta-1 ;4xilanase [Clostridium thermo- cellum ATCC 27405] AAZ5429 6 1,9 3.2.1.8 1929 642 0 639 35
491/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 497/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Código de acesso de DNA de Geneseq Valor-E de DNA de Ge- neseq Número EC previsto Extensão do DNA examinado Extensão da proteína examinada Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Geneseq/NR %ID de de DNA de Gene- ne- seq/NR
471, 472 precursor de xilanase [Bacteroides ovatus] AAT6356 6 0,001 3.2.1.8 1119 372 0 376 40
473, 474 xilanase intracelular [bactéria não cultivada] ABL1819 3 0,061 3.2.1.8 1020 339 0 336 36
475, 476 endo-1,4-beta- xilanase [Thermobacillus xylanilyticus]. AAA1298 9 0,005 3.2.1.8 1248 415 1104 367 35 50
477, 478 quitosanaseglucanase [Bacillus sp. D-2]. AAF0803 1 0,54 2199 732 2394 797 38 54
479, 480 xilanase [Aspergillus niger] AAV1912 6 1,00E-14 3.2.1.8 636 211 558 211 72
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 498/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
483, 484 família 10 xilanase [Caldicellulosiruptor sp. Rt69B.1] 0 2532 843 0 1595 79
485, 486 Xilanase, glicosil hidrolase família 10 [Clostridium acetobutylicum]. 3.4 1242 413 3433 430
487, 488 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 2.00E-07 1152 383 1218 384
489, 490 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 2.00E-16 1170 389 1407 384
493/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 499/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
491,492 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 7.00E-05 1530 509 0 1186 67
493, 494 Glicosídeo Hidrolase, família 10:Enzima de celulosoma de Clostridium, doquerina tipo I:ligação de carboidrato, CenC-like [Clostridium thermocellum ATCC 27405] gi|67851540|gb|EAM47 104.1| Glicosídeo Hidrolase, família 10:Enzima de celulosoma de Clostridium, doquerina tipo I 0.022 1959 652 0 639 22
494/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 500/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
495, 496 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.00E-11 1125 374 1407 389
497, 498 Precursor de endo-1;4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 1.00E-11 1008 335 852 279
499, 500 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 0 1155 384 1155 384
501, 502 endo-1;4-beta-xilanase XynI [Cellulomonas flavigena] 1.00E-66 744 247 1086 361
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 501/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
503, 504 endo-beta-1 ;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 8.00E-14 1545 514 847 350
505, 506 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 2.00E-62 1059 352 1068 355
507, 508 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 1.00E-131 1062 353 1068 361
509, 510 Ligação de carboidrato família 6 [Clostridium cellulolyticum H10] gi|118663312|gb|EAV69 968.1| Ligação de carboidrato família 6 [Clostridium cellulolyticum H10] 0.11 2325 774 0 541
496/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 502/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
511, 512 beta-1,4-xilanase [Pseudomonas sp. ND137]. 1.00E-42 1107 368 1068 445
513, 514 endo-1; 4-beta-xilanase [Bacillus sp. YA-335] 1.00E-08 1089 362 0 354 68
515, 516 precursor endoxilanase ativa alcalina [Bacillus halodurans] 3.00E-31 1188 395 0 396 77
517, 518 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 6.00E-49 1728 575 1629 542
519, 520 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 6.00E-64 1473 490 1086 542
521, 522 xilanase [uncultured organism] 2.00E-26 1155 384 1146 381
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Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 503/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
523, 524 endo-beta-1 ;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 7.00E-05 1533 510 8298 303
525, 526 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 4.00E-11 3048 1015 0 1186 65
527, 528 xilanase [uncultured organism] 6.00E-11 1140 379 1116 381
529, 530 xilanase [bactéria não cultivada] 4.00E-29 696 231 1086 222
531, 532 endo-beta-1 ;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 0.069 1551 516 0 656 32
533, 534 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 1.00E-06 1359 452 1725 1186
535, 536 endo-beta-1 ;4-xilanase [Bacillus sp.] 2.00E-10 1002 333 1011 336
498/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 504/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
537, 538 Endo-1 ;4-beta-xilanase [Saccharophagus degradans 2-40] 2.00E-04 1137 378 1146 381
539, 540 endo-1 ;4-beta-xilanase [Thermobifida fusca YX] 1.00E-08 1092 363 1273 338
541, 542 xilanase X [Paenibacillus sp. BL11] 4.00E-24 1155 384 164 355
543, 544 xilanase intra-celular [bactéria não cultivada] 2.00E-04 1014 337 1011 346
545, 546 PRECURSOR DE ENDO-1,4-BETAXILANASE A (XILA- NASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILANOIDROLASE A). 6.00E-11 1143 380 1905 383
547, 548 xilanase [organismo não cultivado] 0.003 1149 382 1146 381
549, 550 endo-beta-1 ;4-xilanase [Bacillus sp.] 2.00E-04 981 326 3972 336
499/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 505/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
551, 552 PRECURSOR DE EN- DO-1,4-BETAXILANASE A (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILANOIDROLASE A) (XYLA). 7.00E-11 1470 489 1860 619
553, 554 precursor de endo-1;4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 4.00E-67 1116 371 1110 369
555, 556 xilanase [Microbulbifer hydrolyticus] 1.00E-42 1071 356 1068 445
557, 558 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 7.00E-17 1371 456 1086 361
559, 560 endo-beta-1 ;4-xilanase [Bacillus sp.] 3.00E-06 996 331 1041 336
500/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 506/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
561, 562 PRECURSOR DE ENDO-1,4-BETAXILANASE A (XILA- NASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILANOIDROLASE A). (XYLA). 3.00E-26 1809 602 1860 619
563, 564 Proteína grande de CHU; candidata a bglicosidase; proteína glicosídeo hidrolase da família 8 [Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406] 0.37 2067 688 0 1152 29
565, 566 Biossíntese de metionina MetW [Saccharophagus degradans 240] 2.00E-08 1515 504 0 1186 68
567, 568 xilanase [organismo não cultivado] 1.00E-42 1158 385 1146 381
501/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 507/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
569, 570 Possível enzima de degradação de xilano (glicosil hidrolase domínio semelhante a família 30 e domínio semelhante a Ricina B) [Clostridium acetobutylicum]. 0.73 1062 353 1761 586 33 46
571, 572 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 3.00E-25 1149 382 1155 384
573, 574 PRECURSOR DE ENDO-1,4-BETAXILANASE A (XILA- NASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILANOIDROLASE A) (XYLA). 2.00E-11 1326 441 1860 619
502/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 508/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
575, 576 Ligação de carboidrato família 6 [Clostridium cellulolyticum H10] gi|118663312|gb|EAV69 968.1| Ligação de carboidrato família 6 [Clostridium cellulolyticum H10] 0.01 876 291 0 541
577, 578 precursor de endo-1;4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 0 642 213 0 214 97
579, 580 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 1.00E-11 1158 385 1155 384
503/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 509/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
581, 582 precursor de endo-1;4beta-xilanase [bactéria não cultivada] 3.00E-04 1596 531 1503 613
583, 584 família 10 glicosil hidrolase XynB [Fibrobacter succinogenes S85]. 2.00E-04 1362 453 1761 586 38 51
585, 586 beta-1,4-celobiosidase [Pseudomonas sp. PE2]. 3.2 1188 395 798 597
587, 588 xilanase [organismo não cultivado] 0.003 1095 364 1218 381
589, 590 PRECURSOR DE EN- DO-1,4-BETAXILANASE A (XILANASE A) (1,4-BETA-DXILAN XILANOIDRO- LASE A) 1.00E-05 1149 382 1143 383
504/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 510/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
591, 592 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 5.00E-16 2094 697 1068 542
593, 594 endo-beta-1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 3.00E-06 1137 378 2557 350
595, 596 endo-1;4-beta-xilanase [Thermobifida fusca YX] 3.00E-21 978 325 1134 377
597, 598 Proteína de superfície de cocos grampositivos, região de âncora [Clostridium phytofermentans ISDg] gi|106768036|gb|EAT24 745.1| Proteína de superfície de cocos grampositivos, região de âncora [Clostridium phytofermentans ISDg] 0.021 1842 613 0 806 29
505/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 511/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
599, 600 xilanase XynA GH 10 [Paenibacillus sp. JDR2] 1.00E-08 3801 1266 0 1467 58
601,602 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 3.00E-10 1536 511 1407 468
603, 604 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 0.003 1167 388 1128 384
605, 606 xilanase [organismo não cultivado] 0 1146 381 1146 381
506/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 512/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
607, 608 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 9.00E-60 1515 504 1086 542
609, 610 xilanase [organismo não cultivado] 0 1146 381 1146 381
611,612 xilanase intra-celular IXT6 [Geobacillus stearothermophilus] 7.00E-07 993 330 1125 333
613, 614 xilanase [organismo não cultivado] 0 1146 381 1146 381
615, 616 celoxilanase CelW [Clostridium stercorarium]. 0.33 1875 624 1224 388
617, 618 ENDO-1,4-BETA- XILANASE A PRECURSOR (XILANASE A) (1,4-BETA-D-XYLAN XYLANOHYDROLASE A). 4.00E-12 1152 383 1905 380
507/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 513/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
619, 620 endo-1; 4-beta-xilanase [Bacillus sp. YA-335] 1.00E-16 582 193 1695 564
621,622 Endo-1,4-beta-xilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] gi|116224961|gb|ABJ83 670.1| Endo-1,4-betaxilanase [Solibacter usitatus Ellin6076] 4.00E-67 1134 377 1128 375
623, 624 endo-beta-1 ;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 0.054 1215 404 849 448
625, 626 xilanase/quitina desacetilase-like [Saccharophagus degradans 240] 9.00E-11 1812 603 1086 542
627, 628 xilanase 5 [Aeromonas punctata]. 4.00E-05 3354 1117 3981 1326 44
629, 630 Endo-1 ;4-beta-xilanase [Saccharophagus degradans 2-40] 2.00E-04 1143 380 1116 381
508/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 514/525
SEQ ID NO: Descrição de NR Valor-E de DNA de Geneseq Extensão do DNA examinado Número EC previsto Extensão do DNA de Geneseq/NR Extensão da proteína de Geneseq/NR %ID de proteína de Gene- ne- seq/NR %ID de de DNA de ne- seq/NR
631,632 xilanase [organismo não cultivado] 1.00E-08 1143 380 1146 381
633, 634 Glicosídeo Hidrolase, família 8 [Clostridium cellulolyticum H10] gi|118665052|gb|EAV71 675.1| Glicosídeo Hidrolase, família 8 [Clostridium cellulolyticum H10] 7.00E-11 1398 465 0 477
635, 636 endo-beta-1;4-xilanase [Cellvibrio mixtus] 0.009 834 277 2109 350
509/510
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 515/525
510/510 [00867] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com relação a certos aspectos preferidos desta, será compreendido que modificações e variações estão dentro do escopo daquilo que é descrito e reivindicado.
Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 516/525
1/3

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ácido nucléico isolado, sintético ou recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) um ácido nucléico de SEQ ID NO: 383;
    em que o ácido nucléico codifica um polipeptídeo que apresenta uma atividade de xilanase, (b) o ácido nucleico de (a), ainda compreendendo modificação dos nucleotídeos nos resíduos 40 a 42, em que os nucleotídeos são modificados para CAC ou CAT e em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo que apresenta atividade de xilanase, ou (c) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que apresenta atividade de xilanase, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de SEQ ID NO: 384.
  2. 2. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo em:
    os nucleotídeos nos resíduos 10 a 12 são modificados para CTT, TTA, TTG, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos nos resíduos 25 a 27 são modificados para CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos nos resíduos 28 a 30 são modificados para TCA, TCC, TCT, TCG, AGT ou AGC, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são modificados para TTT ou TTC, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são modificados para TAC ou TAT, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são modificados para ATA, ATT ou ATC, os nucleotídeos nos resíduos 37 a 39 são modificados para
    TGG,
    Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 517/525
    2/3 os nucleotídeos nos resíduos 52 a 54 são modificados para TTC ou TTT, os nucleotídeos nos resíduos 73 a 75 são modificados para GAG ou GAA, os nucleotídeos nos resíduos 73 a 75 são modificados para CCC, CCG, CCA ou CCT, os nucleotídeos nos resíduos 88 a 90 são modificados para GTG, GTC, GTA ou GTT, os nucleotídeos nos resíduos 100 a 102 são modificados para TGT ou TGC, os nucleotídeos nos resíduos 100 a 102 são modificados para CAT ou CAC, os nucleotídeos nos resíduos 100 a 102 são modificados para TTG, TTA, CTT, CTC, CTA ou CTG, os nucleotídeos nos resíduos 103 a 105 são modificados para GAG ou GAA, os nucleotídeos nos resíduos 103 a 105 são modificados para GAT ou GAC, os nucleotídeos nos resíduos 211 a 213 são modificados para ACA, ACT, ACC ou ACG, os nucleotídeos nos resíduos 211 a 213 são modificados para TGT ou TGC, e os nucleotídeos nos resíduos 508 a 582 são modificados para CAT ou CAC, em que o dito ácido nucleico codifica um polipeptídeo que apresenta atividade de xilanase.
  3. 3. Cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucléico, como definido na reivindicação 1 ou 2, sendo que o veículo de clonagem compreende um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriófago, ou um cromossomo artificiPetição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 518/525
    3/3 al, e sendo que o vetor viral compreende um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno-associado, ou o cromossomo artificial compreende um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um vetor derivado de bacteriófago P1 (PAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC) ou um cromossomo artificial de mamífero (MAC).
  4. 4. Célula hospedeira isolada transformada, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucléico, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou compreendendo um cassete de expressão, um vetor ou um veículo de clonagem, como definido na reivindicação 3, sendo que a dita célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula fúngica ou uma célula de levedura.
  5. 5. Método para produzir um polipeptídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (I) (a) fornecer um ácido nucléico, como definido na reivindicação 1 ou 2; e (b) expressar o ácido nucléico de (a) sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo, produzindo assim um polipeptídeo recombinante, e o dito método compreende ainda transformar uma célula hospedeira isolada com o ácido nucléico de (a) seguido pela expressão do ácido nucléico de (a), produzindo assim um polipeptídeo recombinante em uma célula hospedeira isolada transformada, ou (II) (a) fornecer um vetor compreendendo o ácido nucleico, como definido na reivindicação 1 ou 2; e (b) expressar o vetor de (a), sendo que a expressão é afetada pelo uso de um promotor de alta atividade, um vetor dicistrônico ou pela amplificação gênica do vetor.
    Petição 870180014858, de 23/02/2018, pág. 519/525
    1/28
BRPI0707784-0A 2006-02-14 2007-02-14 Ácido nucléico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula hospedeira isolada transformada, e método para produção de um polipeptídeo recombinante BRPI0707784B1 (pt)

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Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2305820A1 (en) 2002-06-14 2011-04-06 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7024800B2 (en) 2004-07-19 2006-04-11 Earthrenew, Inc. Process and system for drying and heat treating materials
US7685737B2 (en) 2004-07-19 2010-03-30 Earthrenew, Inc. Process and system for drying and heat treating materials
US7610692B2 (en) 2006-01-18 2009-11-03 Earthrenew, Inc. Systems for prevention of HAP emissions and for efficient drying/dehydration processes
EP2548955A1 (en) 2006-02-14 2013-01-23 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2009042622A2 (en) * 2007-09-25 2009-04-02 Novozymes A/S Process for the production of a fermentation product from a wood-containing material, wherein the wood-containing material is treated with esterases
WO2009045627A2 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20090158663A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 General Electric Company Method of biomass gasification
WO2009103026A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing isopropanol
US20110091941A1 (en) * 2008-07-03 2011-04-21 Novozymes A/S Process For Producing Fermentation Products
US20100077726A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-01 General Electric Company Plenum air preheat for cold startup of liquid-fueled pulse detonation engines
EA201170879A1 (ru) * 2008-12-23 2012-02-28 Даниско А/С Полипептиды с ксиланазной активностью
EP2382311A4 (en) * 2008-12-23 2012-08-15 POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY
WO2010141604A2 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Combinatorial discovery of enzymes with utility in biomass transformation
KR101091152B1 (ko) * 2009-07-23 2011-12-09 한국화학연구원 알칼리성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 ｓｐ. ＨＰＬ―002 균주, 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법
AR077920A1 (es) * 2009-08-13 2011-10-05 Geosynfuels Llc Aparato y proceso para la fermentacion de biomasa hidrolizada
BRPI1005181A2 (pt) * 2009-08-13 2019-07-02 Geosynfuels Llc processo para a produção de produtos de alto valor de biomassa
UA117654C2 (uk) * 2009-11-06 2018-09-10 Агрівіда, Інк. Трансгенна рослина, яка експресує фермент, що деградує клітинну стінку, і вектор експресії
US10407742B2 (en) 2009-11-06 2019-09-10 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
US20130071884A1 (en) 2009-11-06 2013-03-21 Agrivida, Inc. Plants expressing cell wall degrading enzymes and expression vectors
US8420387B2 (en) 2009-11-06 2013-04-16 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
EP2536842A1 (en) 2010-02-15 2012-12-26 Yeda Research and Development Co. Ltd. Bio-engineered multi-enzyme complexes comprising xylanases and uses thereof
FR2957598B1 (fr) * 2010-03-17 2015-12-04 Lfb Biotechnologies Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes
JP5628544B2 (ja) * 2010-04-07 2014-11-19 株式会社豊田中央研究所 クロストリジウム・サーモセラム由来のタンパク質複合体を構築するためのタンパク質及びその利用
ES2371317B1 (es) * 2010-06-14 2012-11-07 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Endoxilanasa termorresistente obtenida por mutagénesis y su aplicación al proceso de obtención de bioetanol.
US9598700B2 (en) 2010-06-25 2017-03-21 Agrivida, Inc. Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
US10443068B2 (en) 2010-06-25 2019-10-15 Agrivida, Inc. Plants with engineered endogenous genes
WO2012014227A1 (en) * 2010-07-26 2012-02-02 Advanced Enzyme Technologies Ltd. An enzyme preparation and method for preparing protein concentrate from soy protein containing materials
BR112013005686A2 (pt) * 2010-09-10 2016-06-28 Syngenta Participations Ag xilanases ativas durante o pré-tratamento de biomassa celulósica.
CN106244622B (zh) 2011-03-07 2020-06-12 谷万达公司 在工程植物中表达多种蛋白的表达盒和表达载体及制备工程植物和生产可溶性糖的方法
EP2712363A1 (en) * 2011-04-29 2014-04-02 Danisco US Inc. Detergent compositions containing geobacillus tepidamans mannanase and methods of use thereof
JP6084617B2 (ja) * 2011-09-14 2017-02-22 デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス 酵素
JP2015527065A (ja) * 2012-08-03 2015-09-17 デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス 酵素
WO2014020142A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Xylanases for solubilising arabinoxylan-containing material
CN104662044B (zh) 2012-08-24 2018-10-30 加利福尼亚大学董事会 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
US9145551B2 (en) 2012-09-19 2015-09-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Multifunctional cellulase and hemicellulase
WO2014055782A1 (en) 2012-10-03 2014-04-10 Agrivida, Inc. Intein-modified proteases, their production and industrial applications
US20140230097A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-14 Novozymes Inc. Polypeptides Having Xylanase Activity and Polynucleotides Encoding Same
GB201308853D0 (en) 2013-03-12 2013-07-03 Verenium Corp Genes encoding xylanase
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
ES2751408T3 (es) * 2013-05-18 2020-03-31 Direvo Ind Biotechnology Gmbh Composiciones de enzimas para la mejora de los procesos y subproductos de fermentación
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10542961B2 (en) 2015-06-15 2020-01-28 The Research Foundation For The State University Of New York System and method for infrasonic cardiac monitoring
AU2017289270B2 (en) 2016-06-27 2023-05-04 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
IL247569A0 (en) 2016-08-30 2016-11-30 Yeda Res & Dev An enzymatic complex for the breakdown of lignocellulosic material
CA3036575A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Basf Se Methods of modifying pulp comprising cellulase enzymes and products thereof
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN109402091B (zh) * 2017-08-18 2022-02-11 潍坊康地恩生物科技有限公司 木聚糖酶突变体
CN107604739B (zh) * 2017-09-26 2019-06-07 江南大学 一种过滤用棉秆皮纤维与壳聚糖复合非织布的制备方法
WO2020186052A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 The Procter & Gamble Company Method for treating cotton
MX2021011104A (es) 2019-03-14 2021-10-22 Procter & Gamble Composiciones de limpieza que comprenden enzimas.
WO2020206233A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Vanderbilt University Therapeutic antibodies for treating lung cancer
CN113906173B (zh) * 2019-04-10 2024-03-22 益若维新有限公司 纸纱、纸布和织物产品
CN110117586B (zh) * 2019-05-06 2022-04-01 武汉轻工大学 一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用
CN111748542B (zh) * 2020-07-14 2021-11-26 云南师范大学 一种内切木聚糖酶突变体s07a11及制备方法和应用
EP4230791A1 (en) * 2022-02-18 2023-08-23 AB Enzymes GmbH A bleaching process
WO2024005099A1 (ja) 2022-06-28 2024-01-04 株式会社Mizkan Holdings でんぷん含有膨化組成物及びその製造方法、並びに、発酵組成物及びその製造方法、並びに発酵酵素処理組成物及びその製造方法

Family Cites Families (262)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1202A (en) 1839-06-27 priestley peters
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
US4261868A (en) 1979-08-08 1981-04-14 Lever Brothers Company Stabilized enzymatic liquid detergent composition containing a polyalkanolamine and a boron compound
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4404128A (en) 1981-05-29 1983-09-13 The Procter & Gamble Company Enzyme detergent composition
US5021246A (en) 1984-03-30 1991-06-04 Anheuser-Busch, Incorporated Step mashing process for producing low alcohol beer
US5204015A (en) 1984-05-29 1993-04-20 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
EP0229046B1 (fr) 1985-03-30 1994-05-04 BALLIVET, Marc Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn
US4725544A (en) 1986-04-25 1988-02-16 Tan Larry U Method for purifying xylanase
US5780292A (en) 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
GB8610670D0 (en) 1986-05-01 1986-06-04 British Petroleum Co Plc Enzyme
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
US4788066A (en) 1987-12-14 1988-11-29 Grain Processing Corporation Preparation of low alcohol beer
US5116746A (en) 1988-03-04 1992-05-26 Institut Armand Frappier Cellulase-free endo-xylanase enzyme of use in pulp delignification
FR2629108A1 (fr) 1988-03-22 1989-09-29 Du Pin Cellulose Procede de fabrication de papiers ou cartons a partir de fibres recyclees, traitees avec des enzymes
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5179021A (en) 1989-02-10 1993-01-12 Gil Inc. (Now Ici Canada Inc.) Pulp bleaching process comprising oxygen delignification and xylanase enzyme treatment
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
FI87372C (fi) 1989-03-30 1992-12-28 Genencor Int Europ Foerfarande foer framstaellning av fluffmassa med foerbaettrad rivbarhet
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
NZ235679A (en) 1989-10-18 1993-01-27 Int Paper Co Bleaching lignocellulosic pulp using (a) treatment with xylanase and (b) one or more chemical bleaching stages
FI83182C (fi) 1989-12-27 1991-06-10 Kone Oy Foerfarande och anordning foer avbarkning av traed.
SE465320B (sv) 1990-01-10 1991-08-26 Korsnaes Ab Preparat som uppvisar enzymatisk delignifieringsaktivitet, saett att framstaella detsamma och tillaempningar daerav
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
FI89814C (fi) 1990-02-02 1993-11-25 Enso Gutzeit Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa
EP0528881A4 (en) 1990-04-24 1993-05-26 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
US5326477A (en) 1990-05-07 1994-07-05 Bio-Sep, Inc. Process for digesting solid waste
DK115890D0 (da) * 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
CA2084071C (en) 1990-05-29 2004-09-28 Douglas Walter Fodge Hemicellulase supplement to improve the energy efficiency of hemicellulose-containing food and animal feed
WO1991019810A1 (en) 1990-06-15 1991-12-26 California Biotechnology Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
GB9018426D0 (en) 1990-08-22 1990-10-03 Sandoz Ltd Improvements in or relating to novel compounds
DK203490D0 (da) 1990-08-24 1990-08-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til behandling af lignocellulosepulp og apparat til udfoerelse af processen
DK30991D0 (da) 1991-02-22 1991-02-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte enzymer
ATE191931T1 (de) 1990-11-23 2000-05-15 Plant Genetic Systems Nv Verfahren zur transformation monokotyler pflanzen
GB9027303D0 (en) 1990-12-17 1991-02-06 Enzymatix Ltd Enzyme formulation
DE69131017T2 (de) 1990-12-20 1999-07-15 Ixsys Inc Optimierung von bindenden proteinen
NL9100050A (nl) 1991-01-11 1992-08-03 Heineken Technische Beheer Bv Werkwijze voor het continu bereiden van wort.
FR2672066B1 (fr) 1991-01-25 1997-01-31 Du Pin Cellulose Traitement enzymatique d'une pate ligno-cellulosique chimique.
US5405624A (en) 1991-02-14 1995-04-11 Bio-Technical Resources Process for producing a product with an intensified beer flavor
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
FI108800B (fi) 1991-05-07 2002-03-28 Iogen Corp Menetelmä ja laitteisto entsyymin käyttämiseksi paperimassan valmistuksessa ja valkaisussa
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
CA2048322A1 (en) 1991-08-08 1993-02-09 Dieter Kluepfel Xylanase for biobleaching
DK175391D0 (da) 1991-10-18 1991-10-18 Novo Nordisk As Nye enzymer
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
CA2082185C (en) 1991-11-26 2004-01-20 Alexander R. Pokora Protease catalyzed treatments of lignocellulose materials
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
US5369024A (en) 1992-03-25 1994-11-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Xylanase from streptomyces roseiscleroticus NRRL-11019 for removing color from kraft wood pulps
US5498534A (en) 1992-03-25 1996-03-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of removing color from wood pulp using xylanase from streptomyces roseiscleroticus NRRL B-11019
DK87092D0 (da) 1992-07-02 1992-07-02 Novo Nordisk As Nyt enzym
DE4226528A1 (de) 1992-08-11 1994-02-17 Roehm Gmbh Batterien-Xylanase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie dafür geeigneter Bakterienstamm, Plasmid mit zugehörigem Strukturgen, sowie Backmittel und Backverfahren zur Herstellung von Brot und Backwaren unter Verwendung der Xylanase
DK105592D0 (da) 1992-08-26 1992-08-26 Novo Nordisk As Nyt enzym
US5785811A (en) 1992-11-09 1998-07-28 The Mead Corporation Process for treating lignocellulosic material with soybean peroxidase in the presence of peroxide
AU5676394A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
DE59305188D1 (de) 1992-12-31 1997-02-27 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur herstellung von bier
US6021536A (en) 1993-03-04 2000-02-08 Wasinger; Eric Mechanical desizing and abrading device
US5405769A (en) 1993-04-08 1995-04-11 National Research Council Of Canada Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase
GB2279955B (en) 1993-07-15 1998-02-18 Solvay Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof
JPH08509871A (ja) 1993-09-30 1996-10-22 アグラシータス インコーポレイテッド 異種ペルオキシダーゼを生産するトランスジェニック綿植物
CN1134726A (zh) 1993-10-04 1996-10-30 诺沃挪第克公司 一种包含修饰酶的酶制剂
BE1007651A3 (fr) 1993-10-22 1995-09-05 Solvay Interox Procede pour le blanchiment d'une pate a papier chimique.
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
CA2156048C (en) 1993-12-24 2010-11-16 Pieter Van Solingen Alkali-tolerant xylanases
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
AU692841B2 (en) 1994-03-09 1998-06-18 Abbott Laboratories Transgenic animals producing oligosaccharides and glycoconjugates
NZ279676A (en) 1994-03-09 1998-04-27 Abbott Lab Humanized milk produced by non-human transgenic mammal transformed with a heterologous gene coding for human enzyme producing human oligosaccharides and glycoconjugates
BR9507229A (pt) 1994-03-29 1997-09-16 Novo Nordisk As Amilase composição detergente aditivo detergente uso de um detergente e de uma amilase construç~o de dna vetor de expressão recombinante célula e processo para produzir amilase
AUPM493594A0 (en) 1994-04-11 1994-05-05 Biotech International Limited Bacterial xylanase
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
PL183432B1 (pl) 1994-06-14 2002-06-28 Bergquist Peter Leonard Ksylanaza, wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji
AU2669195A (en) 1994-06-15 1996-01-05 Novo Nordisk A/S Pyrodictium xylanase, amylase and pullulanase
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5582681A (en) 1994-06-29 1996-12-10 Kimberly-Clark Corporation Production of soft paper products from old newspaper
US5830732A (en) 1994-07-05 1998-11-03 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Phytase
BE1008751A3 (fr) 1994-07-26 1996-07-02 Solvay Xylanase, microorganismes la produisant, molecules d'adn, procedes de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci.
US5503709A (en) 1994-07-27 1996-04-02 Burton; Steven W. Environmentally improved process for preparing recycled lignocellulosic materials for bleaching
US5871730A (en) 1994-07-29 1999-02-16 Universite De Sherbrooke Thermostable xylanase DNA, protein and methods of use
US5935836A (en) 1994-07-29 1999-08-10 Rohm Enzyme Finland Oy Actinomadura xylanase sequences and methods of use
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
GB9416841D0 (en) 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
US6099844A (en) 1994-08-22 2000-08-08 Triarco Industries, Inc. Increasing yield of extractable substances from botanicals with an enzyme composition
JPH10504964A (ja) 1994-09-01 1998-05-19 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 家族性型ヒトアミロイド前駆タンパク質を発現するトランスジェニック動物
US6426200B1 (en) 1994-09-15 2002-07-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for enzymatic deinking of waste paper
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5786316A (en) 1994-10-27 1998-07-28 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising xylanases
US5770012A (en) 1994-11-18 1998-06-23 P. H. Glatfelter Co. Process for treating paper machine stock containing bleached hardwood pulp with an enzyme mixture to reduce vessel element picking
US5725732A (en) 1994-11-18 1998-03-10 P. H. Glatfelter Company Process for treating hardwood pulp with an enzyme mixture to reduce vessel element picking
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5633440A (en) 1994-12-20 1997-05-27 Dna Plant Technology Corporation P119 promoters and their uses
JP3435946B2 (ja) 1994-12-21 2003-08-11 王子製紙株式会社 耐熱性キシラナーゼ
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
ES2169219T5 (es) 1995-01-26 2009-09-01 Novozymes A/S Aditivos alimenticios para animales que comprenden xilanasa.
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
EP0831854A4 (en) 1995-06-06 2001-01-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGONUCLEOTIDS WITH PHOSPHOROTHIOATE BINDINGS OF HIGH CHIRAL PURITY
GB0112226D0 (en) 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
WO1997001629A1 (en) 1995-06-28 1997-01-16 Novo Nordisk A/S A cellulase with reduced mobility
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5720971A (en) 1995-07-05 1998-02-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Canada Enzyme additives for ruminant feeds
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US6030779A (en) 1995-07-18 2000-02-29 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
WO1997004160A1 (en) 1995-07-19 1997-02-06 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
AU7294396A (en) 1995-10-13 1997-04-30 Gist-Brocades B.V. Protein detection
HUP9900738A2 (hu) 1995-10-17 1999-06-28 Institut National De La Recherche Agronomique Xilanáz, azt kódoló oligonukleotid-szekvencia és alkalmazásai
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
WO1997018286A1 (en) 1995-11-15 1997-05-22 Novo Nordisk A/S A process for combined desizing and 'stone-washing' of dyed denim
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6368798B1 (en) 1995-12-07 2002-04-09 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
WO1997022691A1 (en) 1995-12-18 1997-06-26 Röhm Enzyme Finland OY Novel xylanases and uses thereof
US6030933A (en) 1995-12-29 2000-02-29 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising immobilized enzymes
CN1209838A (zh) 1996-01-29 1999-03-03 诺沃挪第克公司 纤维素织物的脱浆方法
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6254722B1 (en) 1996-03-27 2001-07-03 North Carolina State University Method for making dissolving pulp from paper products containing hardwood fibers
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
US6197070B1 (en) 1996-05-15 2001-03-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping
US6057100A (en) 1996-06-07 2000-05-02 Eos Biotechnology, Inc. Oligonucleotide arrays
DE19628263A1 (de) 1996-07-12 1998-01-15 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Herstellung von Celluloselösungen in wasserhaltigem Aminoxid
US5759840A (en) 1996-09-09 1998-06-02 National Research Council Of Canada Modification of xylanase to improve thermophilicity, alkalophilicity and thermostability
US6326341B1 (en) 1996-09-11 2001-12-04 The Procter & Gamble Company Low foaming automatic dishwashing compositions
US6057438A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Eastman Chemical Company Process for the co-production of dissolving-grade pulp and xylan
WO1998016191A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 Novo Nordisk A/S CELLULOSE BINDING DOMAINS (CBDs) FOR ORAL CARE PRODUCTS
US5948667A (en) 1996-11-13 1999-09-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Xylanase obtained from an anaerobic fungus
US6069122A (en) 1997-06-16 2000-05-30 The Procter & Gamble Company Dishwashing detergent compositions containing organic diamines for improved grease cleaning, sudsing, low temperature stability and dissolution
FI970158A (fi) 1997-01-14 1998-07-15 Neste Oy Uusi kuitulevyliima
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
CA2276064C (en) 1997-01-17 2013-12-17 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DE19703364A1 (de) 1997-01-30 1998-08-06 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel
JP3921692B2 (ja) * 1997-03-04 2007-05-30 味の素株式会社 新規な遺伝子及び遺伝子群並びに新規なβ−グルコシダーゼ
EP0996718B1 (en) 1997-03-18 2008-12-24 Novozymes A/S Method for constructing a library using dna shuffling
CA2284253A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Jesper Vind An in vitro method for construction of a dna library
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
DE19723890A1 (de) 1997-06-06 1998-12-10 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur Herstellung von aromatischen und heteroaromatischen Aldehyden und Ketonen
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
AU7768798A (en) 1997-06-10 1998-12-30 Xyrofin Oy Process for the production of sylose from a paper-grade, hardwood pulp
US7019827B2 (en) 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
GB2327345B (en) 1997-07-18 1999-06-23 Finnfeeds Int Ltd Use of an enzyme for manufacturing an agent for controlling bacterial infection
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
CA2300940A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US5981233A (en) 1997-08-21 1999-11-09 Roche Vitamins Inc. Process for manufacturing a xylanase enzyme complex from pre-treated thin stillage of rye
ES2190591T3 (es) 1997-09-11 2003-08-01 Bioventures Inc Metodo de producir disposiciones ordenadas de alta densidad.
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
US6204232B1 (en) 1997-10-30 2001-03-20 Novo Nordisk A/S α-amlase mutants
AU1449499A (en) 1997-10-31 1999-05-24 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
CA2309252C (en) 1997-11-10 2003-12-30 The Procter & Gamble Company Process for preparing a detergent tablet
CA2251263A1 (en) 1997-11-14 1999-05-14 Hajime Karasuyama Transgenic animal allergy models and methods for their use
US6187580B1 (en) 1997-11-24 2001-02-13 Novo Nordisk A/S Pectate lyases
DK1036198T3 (da) 1997-12-08 2013-01-02 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
JP2002507392A (ja) 1998-02-11 2002-03-12 マキシジェン， インコーポレイテッド 遺伝子ワクチンの免疫調節特性の最適化
JP2002507393A (ja) 1998-02-11 2002-03-12 マキシジェン， インコーポレイテッド 抗原ライブラリー免疫
US6015703A (en) 1998-03-10 2000-01-18 Iogen Corporation Genetic constructs and genetically modified microbes for enhanced production of beta-glucosidase
EP1068356B8 (en) 1998-04-03 2007-01-03 Adnexus Therapeutics, Inc. Addressable protein arrays
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
AU3408199A (en) 1998-05-01 1999-11-23 Novo Nordisk A/S Enhancers such as n-hydroxyacetanilide
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
DE19824705A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Henkel Kgaa Amylase und Protease enthaltende Wasch- und Reinigungsmittel
US6060299A (en) 1998-06-10 2000-05-09 Novo Nordisk A/S Enzyme exhibiting mannase activity, cleaning compositions, and methods of use
EP1092039B1 (en) 1998-06-29 2012-02-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for generating highly diverse libraries
JP4335995B2 (ja) 1998-07-22 2009-09-30 昭 神谷 環境保全型粒状洗浄用組成物
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
GB2340755B (en) 1998-08-24 2002-09-25 Cannon Rubber Ltd Breast pump insert
WO2000014243A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Phenolic acid esterases, coding sequences and methods
US5980581A (en) 1998-09-08 1999-11-09 The Virkler Company Process for desizing and cleaning woven fabrics and garments
US6241849B1 (en) 1998-09-17 2001-06-05 Novo Nordisk Biochem North America, Inc. Methods for deinking and decolorizing printed paper
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
EP1131447B2 (en) 1998-11-16 2011-10-12 National Research Council Of Canada Thermostable xylanases
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
PT1141254E (pt) 1998-12-23 2006-06-30 Danisco Utilizacao de uma xilanase para a preparacao de um produto alimentar
ES2212859T3 (es) 1998-12-31 2004-08-01 Ets Robert Stiernon S.A./N.V. Utilizacion de una composicion enzimatica y procedimiento para el refinado de la madera verde.
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6024766A (en) 1999-01-27 2000-02-15 Wasinger; Eric M. Process for enzymatic desizing of garments and enzyme deactivation
JP2000245356A (ja) 1999-02-26 2000-09-12 Fuji Oil Co Ltd マンノース含有コプラミール組成物
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
US6824646B2 (en) 1999-03-23 2004-11-30 Oji Paper Co., Ltd. Process for oxygen bleaching and enzyme treating lignocellulosic pulp with liquid treatment and recovery
US6309871B1 (en) 1999-03-31 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline α-amylase activity
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6121034A (en) * 1999-05-13 2000-09-19 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Coniothyrium minitans xylanase gene Cxy1
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
CA2382609C (en) 1999-09-09 2012-08-07 Iogen Bio-Products Corporation Expression of proteins in genetically modified fungi
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
CA2293223C (en) 1999-12-23 2004-02-10 Michael G. Paice Electrochemical method for determinating lignin content of pulp
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
DE60136267D1 (de) 2000-02-17 2008-12-04 Biogasol Ipr Aps Methode zur behandlung von lignin- und zellulosehaltigen stoffen
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
PT1263941E (pt) 2000-03-08 2011-01-20 Danisco Variantes de xilanase tendo sensibilidade alterada a inibidores de xilanase
CA2405954C (en) * 2000-04-13 2015-06-30 Mark Aaron Emalfarb Novel expression-regulating sequences and expression products in the field of filamentous fungi
US6399123B1 (en) 2000-05-25 2002-06-04 University Of Missouri Board Of Curators Oligosaccharide removal from animal feed
AU2001266978A1 (en) 2000-06-14 2001-12-24 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
WO2002029032A2 (en) 2000-09-30 2002-04-11 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
IL150020A0 (en) 2000-10-10 2002-12-01 Diversa Corp High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
CA2425671A1 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Exelixis, Inc. Human ect2 and methods of use
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
AU2002230784A1 (en) 2000-11-10 2002-05-21 Xencor Novel thermostable alkaliphilic xylanase
US7459172B2 (en) 2000-11-30 2008-12-02 Verenium Corporation Method of making a protein polymer and uses of the polymer
WO2002052100A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 Iogen Bio-Products Corporation Alkaline extraction stages comprising xylanase
WO2002057541A2 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Iogen Bio-Products Corporation Use of xylanase in pulp bleaching
US20060019913A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
GB0121387D0 (en) 2001-09-04 2001-10-24 Danisco Modified hydrolases
US20030096394A1 (en) 2001-09-10 2003-05-22 Cheng Huai N. Laccase activity enhancers
CN100346030C (zh) 2002-03-06 2007-10-31 埃欧金生物制品公司 化学纸浆的木聚糖酶处理
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
EP2305820A1 (en) 2002-06-14 2011-04-06 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7033077B2 (en) 2002-07-16 2006-04-25 Peter Taylor Sealable bags made of plastics or other materials and method of making plastic sheeting for manufacturing sealable bags
US20040112555A1 (en) 2002-12-03 2004-06-17 Jeffrey Tolan Bleaching stage using xylanase with hydrogen peroxide, peracids, or a combination thereof
WO2004066945A2 (en) 2003-01-24 2004-08-12 Diversa Corporation Enzymes and the nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2004324514A1 (en) * 2003-12-19 2006-06-22 Michael Richard Bedford Microbially expressed xylanases and their use as feed additives and other uses
US20060014260A1 (en) 2004-05-07 2006-01-19 Zhiliang Fan Lower cellulase requirements for biomass cellulose hydrolysis and fermentation
US20060030003A1 (en) 2004-05-12 2006-02-09 Simon Michael R Composition and method for introduction of RNA interference sequences into targeted cells and tissues
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
US7635563B2 (en) 2004-06-30 2009-12-22 Massachusetts Institute Of Technology High throughput methods relating to microRNA expression analysis
US20060019258A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for detection of small interfering RNA and micro-RNA
EP2548955A1 (en) * 2006-02-14 2013-01-23 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2674721C (en) * 2007-01-30 2018-04-03 Verenium Corporation Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN105452839B (zh) 2013-06-21 2019-01-15 伯乐生命医学产品有限公司 具有流体收集管的微流体系统
US9618579B2 (en) 2015-04-28 2017-04-11 Lattice Semiconductor Corporation Programmable circuits for correcting scan-test circuitry defects in integrated circuit designs

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