JP3921692B2 - 新規な遺伝子及び遺伝子群並びに新規なβ−グルコシダーゼ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のセルロース合成酵素複合体をコードする遺伝子、セルラーゼをコードする遺伝子、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）をコードする遺伝子、及びそれらの遺伝子を含む遺伝子群、並びに新規なβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）自体に関する。
背景技術
酢酸菌におけるセルロースの生合成については、直接の基質がＵＤＰ−グルコースであり、それがセルロース合成酵素と呼ばれる膜上のタンパク複合体によって連結されてセルロースとなって細胞外へと放出されることが知られている。この複合体はセルロース合成酵素遺伝子オペロンにコードされる４つのタンパクから構成されることが報告されており、それぞれｂｃｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けられている（H．C．Wongら、P．N．A．S．８７巻８１３０−８１３４頁（１９９０））。これらの内、ｂｃｓＡ、Ｂ、Ｃ遺伝子はその遺伝子を破壊するとセルロース合成能がなくなることからセルロース合成に必須であることが知られている。また、ｂｃｓＤについては、遺伝子破壊によりセルロースの構造が著しく変化することから、これもセルロース合成に大きな役割を担っていると報告されている（I．M．Saxenaら、J．Bacteriol．１７６巻５７３５−５７５２頁（１９９４））。また最近、一つのセルロース生産菌から２つめのセルロース合成遺伝子オペロンが得られたという報告もある（I．M．Saxenaら、J．Bacteriol．１７７巻５２７６−５２８３頁（１９９５））。
このセルロース合成酵素複合体にはコファクターとして環状ｄｉ−ＧＭＰが必要であり、それを合成するサイクラーゼの遺伝子も報告されている（R．Tal and D．H．Gelfand、ＰＣＴ ＷＯ９３／１１２４４（１９９３））。
また、このセルロース合成酵素遺伝子オペロンの上流にはセルラーゼ遺伝子（ＣＭＣａｓｅ）およびもう一つ別の遺伝子が存在することが報告されている（R．Standalら、J．Bacteriol．１７６巻６６５−６７２頁（１９９４））。
今回、発明者らは、新たにアセトバクター属由来のセルロース合成酵素複合体遺伝子オペロンを獲得すべく研究の結果、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンスから、新規なセルロース合成酵素複合体遺伝子オペロン及びセルラーゼ遺伝子等を含む一連の遺伝子群の塩基配列を決定することに成功した。この新規なセルロース合成酵素複合体遺伝子オペロンの下流に位置する新規な遺伝子の塩基配列を調べたところ、種々の生物のβ−グルコシダーゼで保存されている配列・領域（Y．Kashiwagiら、J．Ferment．Bioeng．７８巻３９４−３９８頁（１９９４））を良く保存しており、この遺伝子がβ−グルコシダーゼ遺伝子であることが確認された。
更に、このβ−グルコシダーゼ遺伝子がコードする酵素タンパク質を実際に精製し、その諸特性を検討した。
発明の開示
即ち、本発明は、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のセルロース合成酵素複合体を構成するタンパク質をコードする遺伝子、特に、配列番号：２〜配列番号：５のいずれか一つに示されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
本発明はまた、配列番号：２〜配列番号：５のいずれか一つに示されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加等によってその一部が異なる改変体であって、セルロース合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
従って、該遺伝子はアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のものに限定される訳ではない。
上記遺伝子のＤＮＡの塩基配列の一具体例として、配列番号：１にｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＣ及びｂｃｓＤで示された塩基配列を挙げることができる。更に、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出来る。
また、かかる塩基配列から成るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、セルロース合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡから成る遺伝子も本発明に含まれる。
更に、本発明は、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のセルラーゼをコードする遺伝子、特に配列番号：６に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
本発明はまた、配列番号：６に示されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加等によってその一部が異なる改変体であって、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
従って、該遺伝子はアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のものに限定される訳ではない。
上記遺伝子のＤＮＡの塩基配列の一具体例として、配列番号：１にＣＭＣａｓｅで示された塩基配列を挙げることができる。更に、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出来る。
また、かかる塩基配列から成るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡから成る遺伝子も本発明に含まれる。
本発明は、又、アセトバクター属に属する微生物、例えば、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）、特に、配列番号：７に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質に係わる。
上記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：７に示されたアミノ酸配列に限られるものではなく、β−グルコシダーゼの活性を有する限り、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加等によってその一部が異なる改変体も当該アミノ酸配列の範疇である。
本発明はまた、上記β−グルコシダーゼをコードする遺伝子に係わり、該遺伝子のＤＮＡの塩基配列の一具体例として、配列番号：１にβ−glucosidaseで示された塩基配列を挙げることができる。更に、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出来る。
また、かかる塩基配列から成るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡから成る遺伝子も本発明に含まれる。
本発明に於けるアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp．sucrofermentans）の代表例としてＢＰＲ２００１株があり、該菌体は平成５年２月２４日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後、１９９４年２月７日付で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４５）に移管されている。
尚、アセトバクター属に属する微生物の他の例として、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum)ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリアヌス（A. pasteurianus）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等を挙げることができる。
本発明は、更に、本発明のセルロース合成酵素複合体をコードする遺伝子（オペロン）、及びその下流（３′末端側）に位置するアセトバクター属に属する微生物由来のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子群（複合遺伝子）に係わる。
この遺伝子群は、セルロース合成酵素複合体をコードする遺伝子（オペロン）の上流に更に本発明のセルラーゼ遺伝子及び／又はグルカナーゼ遺伝子を含むものでも良い。又、該遺伝子群には、その外の構造遺伝子並びにプロモーター及びオペレーター等の各種調節遺伝子が含有されていてもよい。これらの各遺伝子は適当な数の塩基配列によって隔てられており、例えば、ＢＰＲ２００１株由来のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子はセルロース合成酵素複合体のｂｃｓＤをコードする遺伝子の下流に２１４bp隔てられて位置している。このような本発明の遺伝子群の塩基配列の一具体例を配列番号：１に示す。又、この遺伝子群に含まれている各遺伝子、その塩基配列上の位置及び各遺伝子間の距離等を図１に示す。
尚、配列番号：１に示された遺伝子群に於いて、セルラーゼ遺伝子とセルロース合成酵素複合体のｂｃｓＡをコードする遺伝子の間に、もう一つの遺伝子の読み取り粋（ＯＲＦ２）が存在する。このＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列を配列番号：８に示す。このアミノ酸配列を有するタンパク質の機能は未だ解明されていないが、別の菌体に於いて、同様な位置にある遺伝子を破壊するとセルロースの生合成に支障をきたすとの報告もなされており、このＯＲＦ２で示される遺伝子もセルロースの生合成に関与していることは間違いないものと思われる。
上記本発明の遺伝子及び遺伝子群は、アセトバクター属に於けるセルロースの生産に必要な一連の酵素をコードしているものと考えられ、本発明の遺伝子群は一連のプロモーターによって調節されている一つの転写単位である可能性がある。
本発明の遺伝子及び遺伝子群は、当業者に公知の方法で調製することが出来る。
例えば、まず、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンスの菌株のＤＮＡより公知の方法で遺伝子ライブラリーを作成する。一方、既に知られているセルロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列をもとに合成ＤＮＡから成るプライマーを作成し、上記の遺伝子ライブラリーを鋳型として用いたＰＣＲ法によって本発明の遺伝子を調製することが出来る。
また、こうしてＰＣＲ法によって得られた増幅ＤＮＡ断片又はその塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを使用したハイブリダイゼーション法によっても調製することができる。
更に、本明細書に開示された各遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列に基づいて、当業者であれば、化学合成によっても本発明の遺伝子を容易に調製することが出来る。
従って、本発明の遺伝子群を構成する各遺伝子が同一の微生物（菌株）に由来している必要はない。それぞれに異なる由来を有し個別に調製した各遺伝子を遺伝子工学的手法によって任意に連結して本発明の遺伝子群を調製することもできる。
かかる遺伝子及び遺伝子群は、大腸菌等の宿主細胞に組み込んで上記セルロースの生産に必要な一連の酵素を遺伝子工学的に生産するために利用することができる。
よって、本発明は、上記遺伝子又は遺伝子群を含有するプラスミドベクター等の発現ベクター、並びに該発現ベクターによって形質転換された大腸菌等の組み換え細胞にも係わるものである。
本発明の発現ベクターは、当該遺伝子又は遺伝子群の他に、必要に応じて、更に、エンハンサー、プロモーター、リボソーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、複製開始点及び選択マーカーとなる物質をコードする遺伝子配列等を含むことが出来る。
かかる発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換及び該形質転換細胞を使用したセルロースの生産に必要な一連の酵素は当業者に周知の様々な遺伝子工学的方法によって調製することができる。
従って、本発明は、こうして製造された組み換えタンパク質である上記酵素にも係わる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の新規な遺伝子群に含まれている各遺伝子の塩基配列上の位置を示す。
図２は、本発明のβ−グルコシダーゼ精製標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
図３は、本発明のβ−グルコシダーゼ精製標品の等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
実施例１．遺伝子の調製及び塩基配列の決定
Murray M．G．& Thonpson W．F．（Nucl．Acids Res．８巻４３２１−４３２５頁（１９８０））の方法によりＢＰＲ２００１株のＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解することにより、約１５−３０kbpの断片に切断した。この断片とコスミドｐＨＣ７９（ＡＴＣＣ３７０３０）のＢａｍＨＩ切断断片をＤＮＡリガーゼにより連結し、市販のDNA in vitro packaging kit(アマシャム社製）を用いてファージ粒子とした。この粒子を大腸菌ＨＢ１０１株（東洋紡より購入）に感染させ、アンピシリン含有Ｌ培地に撒き、コロニーを生じさせることにより遺伝子ライブラリーを作製した。
このコロニーをナイロン膜（アマシャム社製、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に写し取り、添付のプロトコールに従ってアルカリで溶菌してＤＮＡを変性させナイロン膜に固定した。
一方、公知のアセトバクター・キシリナム１３０６−３株のセルロース合成遺伝子の塩基配列（H．C．Wongら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８７巻８１３０−８１３４頁（１９９０年））をもとに、以下の合成ＤＮＡ２種類を作製した。
ＡＣＣＧＡＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴ
ＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＧＣＧＣＡＣＣ
この合成ＤＮＡをプライマーとして用い、上記の方法により調製したＢＰＲ２００１株のＤＮＡを鋳型として用い、通常の条件でＰＣＲ法を行ったところ、セルロース合成酵素遺伝子の一部にあたるＤＮＡ断片が増幅した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離・回収し、プローブとして用いた。
上記のＤＮＡが固定されたナイロン膜と、プローブＤＮＡを用いて、ＥＣＬラベリングキット（アマシャム社製）を用いて添付のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。シグナルが得られたクローンの中より、該遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を有するクローンを選択し、ＡＭ９と命名した。この株は、１９９７年２月１４日付で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２２を付されている。
このＡＭ９株よりプラスミドＤＮＡを調製し、そこに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、図１に示された16.8kbpの塩基配列が存在することが確認された。
この領域について、タンパク質をコードする遺伝子を検索したところ、いくつかの遺伝子が見出された。それらについて、ＤＮＡＳＩＳ（日立）のプログラムを用いて、他のセルロース生産菌株の既知の配列（セルラーゼとＯＲＦ２については、R.Standalら、J．Bacteriol、１７６巻６６５−６７２頁（１９９４））セルロース合成酵素については、H．C．Wongら、P．N．A．S．、８７巻８１３０−８１３４頁（１９９０））と比較した。その結果、ＡＭ９株に組み込まれている遺伝子配列と既知の遺伝子配列の間で、下表に示す通りのＤＮＡ或いはタンパク質における高い相同性を持つことを見出し、取得したＤＮＡがそれぞれの遺伝子であることが確認された。
また、セルロース合成酵素遺伝子の下流に存在する遺伝子について、Gen Bank Data Baseにおいてホモロジー検索を行なったところ、Y．Kashiwagiら、J．Ferment．Bioeng．、７８巻３９４−３９８頁（１９９４）に報告されているCellvibrio gilvusのβ−グルコシダーゼの遺伝子と、ＤＮＡで４９％、タンパク質で３３％と高い相同性を示すことを見出し、この遺伝子がアセトバクターにおけるβ−グルコシダーゼ遺伝子であることを確認した。尚、β−グルコシダーゼ遺伝子の翻訳開始コドンは、ＤＮＡ塩基配列上におけるシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno sequence）の位置に基づき決定した。
以下に配列番号：１の塩基配列中の各遺伝子の位置を示す。
実施例２．β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の精製
Acetobacter xylinum subsp．sucrofermentans ＢＰＲ２００１株をＣＳＬ−Ｆｒｕ培地で内容積３ｌ、培養液張り込み量１，８ｌのジャーファーメンターで培養した。培養温度は３０℃、培養ｐＨは５、培養時間は６８時間であった。得られた培養液（合計約８，０００ml）を遠心分離することで培養上清３，６００mlを得た。この培養上清を６０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた沈殿を遠心分離で回収し、３５２mlの蒸留水に溶解した。この溶解液を蒸留水１５ｌに対して透析した。この際、透析物中に沈殿が発生したので、この沈殿を回収し、０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で３回抽出した。この抽出液にＧ３ａｓｅ活性が含まれていた。この抽出液を０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー製；カラムサイズ直径３．２cm、長さ１３．３cm）に添加し、Ｇ３ａｓｅ活性を吸着させた。次いで、０．１５Ｍから０．７ＭまでＮａＣｌ濃度をリニアグラジエントした。Ｇ３ａｓｅ活性は０．４５〜０．５５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。得られた活性フラクションを限外濾過膜（ミリポア製、ウルトラフリー１５、分画分子量５，０００）で濃縮し、そのフラクションを０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したトヨパールＨＷ５５Ｓカラム（東ソー製；カラムサイズ直径１．５cm、長さ４８cm）に添加した。得られた活性フラクションにＮａＣｌを最終濃度が１．５Ｍになるように添加し、１．５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したButyl−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー製；カラムサイズ直径１．５cm、長さ４cm）に添加し、同バッファーで洗浄後、１．０ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で溶出した。この活性フラクションをセファデックスＧ２５ＰＤ−１０カラム（ファルマシア製）で０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）にバッファー交換したものを集めて精製標品を得た。この精製標品はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に単一であった。比活性は８４０U/mg−タンパク、精製倍率は３３７倍、回収率は培養上清の全酵素活性を１００％とすると５．５％であった。
尚、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の活性は次のように行った。２μｌの酵素溶液に２μｌの１％（w/v）のセロトリオース（Ｇ３：生化学工業製）溶液、ならびに２μｌの０．３％（v/v）のTriton X-100（Sigma製）を混合し、３０℃で２時間反応後、グルコース測定キット（Glucose ＣIIテストワコー；和光純薬製）の反応液３００μｌを添加し、１５分室温反応後、５０５nmの吸光度から、グルコース量を求めた。１活性単位（Ｕ）はＧ３から１μmolのグルコースを、３０℃、２時間で生成するのに必要な酵素量と定義した。
実施例３．β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）精製標品の分子量と等電点
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によるβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の精製標品の分子量は約81,200であった（図２）。また、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（IEF-PAGE）による等電点（pl）は約６．０であった（図３）。
実施例４．β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）のＮ末端アミノ酸配列
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）により、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）を分離後、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜にエレクトロブロッティングし、クーマシーブリリアントブルーで染色し、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）のバンドを可視化した。そのバンドの部分を切り出したものをサンプルとし、自動アミノ酸シーケンサー（Hewlett Packard社製、HP G1005A）でＮ末端アミノ酸配列分析を行った。結果は、RHAHDGGGDQADARARQVLASMSLEDKMS（アミノ酸は１文字表記）であった。この配列は、配列番号：１に示されるβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）遺伝子から推定されるアミノ酸配列（配列番号：７）の２７番目のＲ（アルギニン）以降の配列と完全に一致した。すなわち、このβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）遺伝子には２６アミノ酸残基よりなるシグナル配列が存在していた。
実施例５．ｐＨ・温度の影響
β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）のｐＨに対する安定性について調べた。β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）を各ｐＨで、３０℃、３時間処理し、残存する酵素活性を調べたところ、８０％以上の残存活性を示すｐＨ域はｐＨ３．６〜７．０であり、失活するｐＨはｐＨ３以下およびｐＨ８以上であった。また、活性の至適ｐＨは約５．５であった。一方、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の温度に対する安定性について調べた。β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）を各温度でｐＨ５．５、３０分処理し、残存する酵素活性を調べたところ、３０℃以下で安定であり、５０℃以上で失活した。活性の至適温度は約４０℃であった。
実施例６．金属イオン・化学薬剤の影響
各種金属イオンおよび化学薬剤１mM存在下におけるβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）活性の影響を調べた。結果を表３に示した。金属イオンについては、Hg++イオンは若干活性は低下（無添加を１００％としたとき８５．５％）させたが、その他の金属イオンは大きな影響を与えなかった。一方、化学薬剤においては、ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシイミド）は活性を完全に失活させた。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）も部分的に失活させた（３１．３％）。一方、ＳＨ基修飾剤である２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール）、ＩＡＡ（ヨード酢酸）、及び金属キレート剤であるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）は影響を与えなかった。
実施例７．β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の基質特異性
セロオリゴ糖（セロビオース（Ｇ２）、セロトリオース（Ｇ３）、セロテトラオース（Ｇ４）、セロペンタオース（Ｇ５）、セロヘキサオース（Ｇ６））を基質として、各基質に対する反応速度パラメータ（ミカエリス定数Ｋm、分子活性ｋo）を測定した。結果を表４に示した。β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）はＧ２を基質としたときのＫmが他の基質に比べ非常に大きく、ｋoは非常に小さいことがわかる。すなわち、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）は他のセロオリゴ糖の分解力に比べＧ２の分解力が非常に小さいことがわかる。また、本酵素は、glucono−δ−lactoneおよびconduritol−β epoxideにより拮抗的に阻害された（表５）。さらに、高分子のセルロース基質（ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、リケナン、ＢＣ（バクテリアセルロース）、アビセル、ＰＲＣ（リン酸膨潤セルロース））に対しては分解力が非常に小さかった（表６）。
数値は添加した各基質の全量に対する生成したグルコースの量のパーセンテージを表わす。
産業上の利用可能性
アセトバクター属に属する微生物からセルロース合成に関与する新規な遺伝子及び遺伝子群を取得し、その塩基配列を決定した。これらの遺伝子及び遺伝子群は、遺伝子工学的に微生物を形質転換させ、該形質転換菌を利用してセルロースを生産させる手段として有用である。
〔配列表〕
配列番号：１
配列番号：２
配列番号：３
配列番号：４
配列番号：５
配列番号：６
配列番号：７
配列番号：８
本発明は、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のセルロース合成酵素複合体をコードする遺伝子、セルラーゼをコードする遺伝子、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）をコードする遺伝子、及びそれらの遺伝子を含む遺伝子群、並びに新規なβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）自体に関する。
背景技術
酢酸菌におけるセルロースの生合成については、直接の基質がＵＤＰ−グルコースであり、それがセルロース合成酵素と呼ばれる膜上のタンパク複合体によって連結されてセルロースとなって細胞外へと放出されることが知られている。この複合体はセルロース合成酵素遺伝子オペロンにコードされる４つのタンパクから構成されることが報告されており、それぞれｂｃｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けられている（H．C．Wongら、P．N．A．S．８７巻８１３０−８１３４頁（１９９０））。これらの内、ｂｃｓＡ、Ｂ、Ｃ遺伝子はその遺伝子を破壊するとセルロース合成能がなくなることからセルロース合成に必須であることが知られている。また、ｂｃｓＤについては、遺伝子破壊によりセルロースの構造が著しく変化することから、これもセルロース合成に大きな役割を担っていると報告されている（I．M．Saxenaら、J．Bacteriol．１７６巻５７３５−５７５２頁（１９９４））。また最近、一つのセルロース生産菌から２つめのセルロース合成遺伝子オペロンが得られたという報告もある（I．M．Saxenaら、J．Bacteriol．１７７巻５２７６−５２８３頁（１９９５））。
このセルロース合成酵素複合体にはコファクターとして環状ｄｉ−ＧＭＰが必要であり、それを合成するサイクラーゼの遺伝子も報告されている（R．Tal and D．H．Gelfand、ＰＣＴ ＷＯ９３／１１２４４（１９９３））。
また、このセルロース合成酵素遺伝子オペロンの上流にはセルラーゼ遺伝子（ＣＭＣａｓｅ）およびもう一つ別の遺伝子が存在することが報告されている（R．Standalら、J．Bacteriol．１７６巻６６５−６７２頁（１９９４））。
今回、発明者らは、新たにアセトバクター属由来のセルロース合成酵素複合体遺伝子オペロンを獲得すべく研究の結果、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンスから、新規なセルロース合成酵素複合体遺伝子オペロン及びセルラーゼ遺伝子等を含む一連の遺伝子群の塩基配列を決定することに成功した。この新規なセルロース合成酵素複合体遺伝子オペロンの下流に位置する新規な遺伝子の塩基配列を調べたところ、種々の生物のβ−グルコシダーゼで保存されている配列・領域（Y．Kashiwagiら、J．Ferment．Bioeng．７８巻３９４−３９８頁（１９９４））を良く保存しており、この遺伝子がβ−グルコシダーゼ遺伝子であることが確認された。
更に、このβ−グルコシダーゼ遺伝子がコードする酵素タンパク質を実際に精製し、その諸特性を検討した。
発明の開示
即ち、本発明は、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のセルロース合成酵素複合体を構成するタンパク質をコードする遺伝子、特に、配列番号：２〜配列番号：５のいずれか一つに示されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
本発明はまた、配列番号：２〜配列番号：５のいずれか一つに示されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加等によってその一部が異なる改変体であって、セルロース合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
従って、該遺伝子はアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のものに限定される訳ではない。
上記遺伝子のＤＮＡの塩基配列の一具体例として、配列番号：１にｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＣ及びｂｃｓＤで示された塩基配列を挙げることができる。更に、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出来る。
また、かかる塩基配列から成るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、セルロース合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡから成る遺伝子も本発明に含まれる。
更に、本発明は、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のセルラーゼをコードする遺伝子、特に配列番号：６に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
本発明はまた、配列番号：６に示されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加等によってその一部が異なる改変体であって、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に係わる。
従って、該遺伝子はアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のものに限定される訳ではない。
上記遺伝子のＤＮＡの塩基配列の一具体例として、配列番号：１にＣＭＣａｓｅで示された塩基配列を挙げることができる。更に、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出来る。
また、かかる塩基配列から成るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡから成る遺伝子も本発明に含まれる。
本発明は、又、アセトバクター属に属する微生物、例えば、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス由来のβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）、特に、配列番号：７に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質に係わる。
上記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：７に示されたアミノ酸配列に限られるものではなく、β−グルコシダーゼの活性を有する限り、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加等によってその一部が異なる改変体も当該アミノ酸配列の範疇である。
本発明はまた、上記β−グルコシダーゼをコードする遺伝子に係わり、該遺伝子のＤＮＡの塩基配列の一具体例として、配列番号：１にβ−glucosidaseで示された塩基配列を挙げることができる。更に、遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出来る。
また、かかる塩基配列から成るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡから成る遺伝子も本発明に含まれる。
本発明に於けるアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp．sucrofermentans）の代表例としてＢＰＲ２００１株があり、該菌体は平成５年２月２４日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後、１９９４年２月７日付で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４５）に移管されている。
尚、アセトバクター属に属する微生物の他の例として、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum)ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリアヌス（A. pasteurianus）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等を挙げることができる。
本発明は、更に、本発明のセルロース合成酵素複合体をコードする遺伝子（オペロン）、及びその下流（３′末端側）に位置するアセトバクター属に属する微生物由来のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子群（複合遺伝子）に係わる。
この遺伝子群は、セルロース合成酵素複合体をコードする遺伝子（オペロン）の上流に更に本発明のセルラーゼ遺伝子及び／又はグルカナーゼ遺伝子を含むものでも良い。又、該遺伝子群には、その外の構造遺伝子並びにプロモーター及びオペレーター等の各種調節遺伝子が含有されていてもよい。これらの各遺伝子は適当な数の塩基配列によって隔てられており、例えば、ＢＰＲ２００１株由来のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子はセルロース合成酵素複合体のｂｃｓＤをコードする遺伝子の下流に２１４bp隔てられて位置している。このような本発明の遺伝子群の塩基配列の一具体例を配列番号：１に示す。又、この遺伝子群に含まれている各遺伝子、その塩基配列上の位置及び各遺伝子間の距離等を図１に示す。
尚、配列番号：１に示された遺伝子群に於いて、セルラーゼ遺伝子とセルロース合成酵素複合体のｂｃｓＡをコードする遺伝子の間に、もう一つの遺伝子の読み取り粋（ＯＲＦ２）が存在する。このＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列を配列番号：８に示す。このアミノ酸配列を有するタンパク質の機能は未だ解明されていないが、別の菌体に於いて、同様な位置にある遺伝子を破壊するとセルロースの生合成に支障をきたすとの報告もなされており、このＯＲＦ２で示される遺伝子もセルロースの生合成に関与していることは間違いないものと思われる。
上記本発明の遺伝子及び遺伝子群は、アセトバクター属に於けるセルロースの生産に必要な一連の酵素をコードしているものと考えられ、本発明の遺伝子群は一連のプロモーターによって調節されている一つの転写単位である可能性がある。
本発明の遺伝子及び遺伝子群は、当業者に公知の方法で調製することが出来る。
例えば、まず、アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンスの菌株のＤＮＡより公知の方法で遺伝子ライブラリーを作成する。一方、既に知られているセルロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列をもとに合成ＤＮＡから成るプライマーを作成し、上記の遺伝子ライブラリーを鋳型として用いたＰＣＲ法によって本発明の遺伝子を調製することが出来る。
また、こうしてＰＣＲ法によって得られた増幅ＤＮＡ断片又はその塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを使用したハイブリダイゼーション法によっても調製することができる。
更に、本明細書に開示された各遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列に基づいて、当業者であれば、化学合成によっても本発明の遺伝子を容易に調製することが出来る。
従って、本発明の遺伝子群を構成する各遺伝子が同一の微生物（菌株）に由来している必要はない。それぞれに異なる由来を有し個別に調製した各遺伝子を遺伝子工学的手法によって任意に連結して本発明の遺伝子群を調製することもできる。
かかる遺伝子及び遺伝子群は、大腸菌等の宿主細胞に組み込んで上記セルロースの生産に必要な一連の酵素を遺伝子工学的に生産するために利用することができる。
よって、本発明は、上記遺伝子又は遺伝子群を含有するプラスミドベクター等の発現ベクター、並びに該発現ベクターによって形質転換された大腸菌等の組み換え細胞にも係わるものである。
本発明の発現ベクターは、当該遺伝子又は遺伝子群の他に、必要に応じて、更に、エンハンサー、プロモーター、リボソーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、複製開始点及び選択マーカーとなる物質をコードする遺伝子配列等を含むことが出来る。
かかる発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換及び該形質転換細胞を使用したセルロースの生産に必要な一連の酵素は当業者に周知の様々な遺伝子工学的方法によって調製することができる。
従って、本発明は、こうして製造された組み換えタンパク質である上記酵素にも係わる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の新規な遺伝子群に含まれている各遺伝子の塩基配列上の位置を示す。
図２は、本発明のβ−グルコシダーゼ精製標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
図３は、本発明のβ−グルコシダーゼ精製標品の等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
実施例１．遺伝子の調製及び塩基配列の決定
Murray M．G．& Thonpson W．F．（Nucl．Acids Res．８巻４３２１−４３２５頁（１９８０））の方法によりＢＰＲ２００１株のＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解することにより、約１５−３０kbpの断片に切断した。この断片とコスミドｐＨＣ７９（ＡＴＣＣ３７０３０）のＢａｍＨＩ切断断片をＤＮＡリガーゼにより連結し、市販のDNA in vitro packaging kit(アマシャム社製）を用いてファージ粒子とした。この粒子を大腸菌ＨＢ１０１株（東洋紡より購入）に感染させ、アンピシリン含有Ｌ培地に撒き、コロニーを生じさせることにより遺伝子ライブラリーを作製した。
このコロニーをナイロン膜（アマシャム社製、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に写し取り、添付のプロトコールに従ってアルカリで溶菌してＤＮＡを変性させナイロン膜に固定した。
一方、公知のアセトバクター・キシリナム１３０６−３株のセルロース合成遺伝子の塩基配列（H．C．Wongら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８７巻８１３０−８１３４頁（１９９０年））をもとに、以下の合成ＤＮＡ２種類を作製した。
ＡＣＣＧＡＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴ
ＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＧＣＧＣＡＣＣ
この合成ＤＮＡをプライマーとして用い、上記の方法により調製したＢＰＲ２００１株のＤＮＡを鋳型として用い、通常の条件でＰＣＲ法を行ったところ、セルロース合成酵素遺伝子の一部にあたるＤＮＡ断片が増幅した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離・回収し、プローブとして用いた。
上記のＤＮＡが固定されたナイロン膜と、プローブＤＮＡを用いて、ＥＣＬラベリングキット（アマシャム社製）を用いて添付のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。シグナルが得られたクローンの中より、該遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を有するクローンを選択し、ＡＭ９と命名した。この株は、１９９７年２月１４日付で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２２を付されている。
このＡＭ９株よりプラスミドＤＮＡを調製し、そこに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、図１に示された16.8kbpの塩基配列が存在することが確認された。
この領域について、タンパク質をコードする遺伝子を検索したところ、いくつかの遺伝子が見出された。それらについて、ＤＮＡＳＩＳ（日立）のプログラムを用いて、他のセルロース生産菌株の既知の配列（セルラーゼとＯＲＦ２については、R.Standalら、J．Bacteriol、１７６巻６６５−６７２頁（１９９４））セルロース合成酵素については、H．C．Wongら、P．N．A．S．、８７巻８１３０−８１３４頁（１９９０））と比較した。その結果、ＡＭ９株に組み込まれている遺伝子配列と既知の遺伝子配列の間で、下表に示す通りのＤＮＡ或いはタンパク質における高い相同性を持つことを見出し、取得したＤＮＡがそれぞれの遺伝子であることが確認された。
以下に配列番号：１の塩基配列中の各遺伝子の位置を示す。
Acetobacter xylinum subsp．sucrofermentans ＢＰＲ２００１株をＣＳＬ−Ｆｒｕ培地で内容積３ｌ、培養液張り込み量１，８ｌのジャーファーメンターで培養した。培養温度は３０℃、培養ｐＨは５、培養時間は６８時間であった。得られた培養液（合計約８，０００ml）を遠心分離することで培養上清３，６００mlを得た。この培養上清を６０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた沈殿を遠心分離で回収し、３５２mlの蒸留水に溶解した。この溶解液を蒸留水１５ｌに対して透析した。この際、透析物中に沈殿が発生したので、この沈殿を回収し、０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で３回抽出した。この抽出液にＧ３ａｓｅ活性が含まれていた。この抽出液を０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー製；カラムサイズ直径３．２cm、長さ１３．３cm）に添加し、Ｇ３ａｓｅ活性を吸着させた。次いで、０．１５Ｍから０．７ＭまでＮａＣｌ濃度をリニアグラジエントした。Ｇ３ａｓｅ活性は０．４５〜０．５５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。得られた活性フラクションを限外濾過膜（ミリポア製、ウルトラフリー１５、分画分子量５，０００）で濃縮し、そのフラクションを０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したトヨパールＨＷ５５Ｓカラム（東ソー製；カラムサイズ直径１．５cm、長さ４８cm）に添加した。得られた活性フラクションにＮａＣｌを最終濃度が１．５Ｍになるように添加し、１．５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したButyl−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー製；カラムサイズ直径１．５cm、長さ４cm）に添加し、同バッファーで洗浄後、１．０ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で溶出した。この活性フラクションをセファデックスＧ２５ＰＤ−１０カラム（ファルマシア製）で０．１５ＭのＮａＣｌを含んだ２０mM酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）にバッファー交換したものを集めて精製標品を得た。この精製標品はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に単一であった。比活性は８４０U/mg−タンパク、精製倍率は３３７倍、回収率は培養上清の全酵素活性を１００％とすると５．５％であった。
尚、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の活性は次のように行った。２μｌの酵素溶液に２μｌの１％（w/v）のセロトリオース（Ｇ３：生化学工業製）溶液、ならびに２μｌの０．３％（v/v）のTriton X-100（Sigma製）を混合し、３０℃で２時間反応後、グルコース測定キット（Glucose ＣIIテストワコー；和光純薬製）の反応液３００μｌを添加し、１５分室温反応後、５０５nmの吸光度から、グルコース量を求めた。１活性単位（Ｕ）はＧ３から１μmolのグルコースを、３０℃、２時間で生成するのに必要な酵素量と定義した。
実施例３．β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）精製標品の分子量と等電点
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によるβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の精製標品の分子量は約81,200であった（図２）。また、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（IEF-PAGE）による等電点（pl）は約６．０であった（図３）。
実施例４．β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）のＮ末端アミノ酸配列
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）により、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）を分離後、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜にエレクトロブロッティングし、クーマシーブリリアントブルーで染色し、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）のバンドを可視化した。そのバンドの部分を切り出したものをサンプルとし、自動アミノ酸シーケンサー（Hewlett Packard社製、HP G1005A）でＮ末端アミノ酸配列分析を行った。結果は、RHAHDGGGDQADARARQVLASMSLEDKMS（アミノ酸は１文字表記）であった。この配列は、配列番号：１に示されるβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）遺伝子から推定されるアミノ酸配列（配列番号：７）の２７番目のＲ（アルギニン）以降の配列と完全に一致した。すなわち、このβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）遺伝子には２６アミノ酸残基よりなるシグナル配列が存在していた。
実施例５．ｐＨ・温度の影響
β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）のｐＨに対する安定性について調べた。β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）を各ｐＨで、３０℃、３時間処理し、残存する酵素活性を調べたところ、８０％以上の残存活性を示すｐＨ域はｐＨ３．６〜７．０であり、失活するｐＨはｐＨ３以下およびｐＨ８以上であった。また、活性の至適ｐＨは約５．５であった。一方、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）の温度に対する安定性について調べた。β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）を各温度でｐＨ５．５、３０分処理し、残存する酵素活性を調べたところ、３０℃以下で安定であり、５０℃以上で失活した。活性の至適温度は約４０℃であった。
実施例６．金属イオン・化学薬剤の影響
各種金属イオンおよび化学薬剤１mM存在下におけるβ−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）活性の影響を調べた。結果を表３に示した。金属イオンについては、Hg++イオンは若干活性は低下（無添加を１００％としたとき８５．５％）させたが、その他の金属イオンは大きな影響を与えなかった。一方、化学薬剤においては、ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシイミド）は活性を完全に失活させた。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）も部分的に失活させた（３１．３％）。一方、ＳＨ基修飾剤である２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール）、ＩＡＡ（ヨード酢酸）、及び金属キレート剤であるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）は影響を与えなかった。
セロオリゴ糖（セロビオース（Ｇ２）、セロトリオース（Ｇ３）、セロテトラオース（Ｇ４）、セロペンタオース（Ｇ５）、セロヘキサオース（Ｇ６））を基質として、各基質に対する反応速度パラメータ（ミカエリス定数Ｋm、分子活性ｋo）を測定した。結果を表４に示した。β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）はＧ２を基質としたときのＫmが他の基質に比べ非常に大きく、ｋoは非常に小さいことがわかる。すなわち、β−グルコシダーゼ（Ｇ３ａｓｅ）は他のセロオリゴ糖の分解力に比べＧ２の分解力が非常に小さいことがわかる。また、本酵素は、glucono−δ−lactoneおよびconduritol−β epoxideにより拮抗的に阻害された（表５）。さらに、高分子のセルロース基質（ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、リケナン、ＢＣ（バクテリアセルロース）、アビセル、ＰＲＣ（リン酸膨潤セルロース））に対しては分解力が非常に小さかった（表６）。
産業上の利用可能性
アセトバクター属に属する微生物からセルロース合成に関与する新規な遺伝子及び遺伝子群を取得し、その塩基配列を決定した。これらの遺伝子及び遺伝子群は、遺伝子工学的に微生物を形質転換させ、該形質転換菌を利用してセルロースを生産させる手段として有用である。
〔配列表〕
配列番号：１
Claims (3)
- 配列番号７に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１の第１２４４８〜１４６５５番目の塩基配列から成るＤＮＡからなる遺伝子。
- 配列番号７に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質であるβ−グルコシダーゼ。
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