JPH02222688A

JPH02222688A - セルラーゼをコードするｄｎａ鎖

Info

Publication number: JPH02222688A
Application number: JP4557089A
Authority: JP
Inventors: Tomoyuki Okamoto; 智之岡本; Katsumi Nakamura; 克己中村
Original assignee: NENRIYOUYOU ARUKOOLE KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI; SHINENERUGII SOGO KAIHATSU KIKO
Current assignee: NENRIYOUYOU ARUKOOLE KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI; SHINENERUGII SOGO KAIHATSU KIKO
Priority date: 1989-02-27
Filing date: 1989-02-27
Publication date: 1990-09-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕く技術分野〉本発明は、アセトバクター−キシリナム（＾ｃｅ〜ｔｏ
ｂａｃｔｅｒ　　ｘｙｌｆｎｕｓ　）　　（Ｉ　Ｆ　０
３２８８）が産生ずるようなセルラーゼの生物工学的産
生能を有するＤＮＡ鎖、に関するものである。

く先行技術〉農林産廃棄物の有効利用は、省資源の意味からも、極め
て重要である。この農林産廃棄物は、セルロースを多量
に含有している。食糧として直接使用するために、ある
いはエタノールのような有用な他の物質の原料として使
用するために、これらのセルロース系廃棄物からグルコ
ースを得ることは有利であろう。セルラーゼは、セルロ
ースをグルコースに変換するうえで、有用な酵素である
。

セルラーゼの生物工学的製造については、すでにセルラ
ーゼ遺伝子のクローニングと発現を行うための試みが行
われている。例えば（イ）　ｖｈｉｔｔ−ｌｅ、Ｄ、Ｊ
、等：　Ｇｅｎｅ（１９８２）１７，１３９、（ｏ　）
　Ｃｏｒｎｅｔ　、　Ｐ。

等：　ＰＥＢ５　Ｍｌｃｒｏ、Ｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ（１９８３）　１６．１３７（ハ）　Ｔｕｓｅ＋Ｄ、
等：　Ｇｅｎｅｔｌｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ、Ｎｅｗｓ（１
９８１）１１月、６頁、（ニ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎ
ｏ、ＨＪ、９ＡＳＭ　Ａｎｎｕ−ａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ
、　１９８１年３月、（ホ）　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ＾Ｓ
Ｍ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　１９８３年３月
、（へ）　ＶＩＩｓｏｎ、Ｄ、Ｂ、等：　Ｂ１ｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏ１ｏｇｙ（１９８３）１゜５９４−８０１　、
　　（ト）　Ｔｅｅｒｉ、Ｔ、等：　Ｂｌｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ（１９８３）　１．６９Ｂ、（チ）　Ｃｏ
ｌｌｍｅｒ、Ａ、等：　Ｂｌｏ／Ｔｅｃｈｎ−ｏｌｏｇ
ｙ（１９８３）１．５９４−８０１、及び（す）特開昭
６２−１７５１７８号公報等を参照されたい。

しかし、これらはいずれもセルラーゼ遺伝子の入手源と
してセルロモナスΦフミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ包
１）、セルロモナス・ラダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ
　ｕｄａ）等を用いており、酢酸菌の産生ずるセルラー
ゼに関する報告はない。

〔発明の概要〕

く要　旨〉本発明は、組換えＤＮＡ技術による新規なセルラーゼの
製造手段を提供するものである。すなわち、本発明によ
るセルラーゼの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖は、
セルラーゼ活性を有していてアミノ酸配列が実質的に第
１図に示されているアミノ酸配列ＡからＢまでのポリペ
プチドをコードする塩基配列を有すること、を特徴とす
るものである。

効果アセトバクターφキシリナムは、バクテリオセルロース
生産菌であり、本菌株が生産するセルラーゼの精製は従
来は非常に困難であった。本発明によれば、セルラーゼ
を形質転換微生物により極めて容易に産生ずることがで
きる。

特に、本発明のセルラーゼ遺伝子で形質転換した大腸菌
による場合は、アセトバクタｍ−キシリナムを培養して
セルラーゼを産生させる場合に比べて、安価な培地によ
り容易な操作でかつ短時間に効率よくセルラーゼを産生
させることが可能である。

また、アセトバクター・キシリナムのセルラーゼは分泌
型酵素であるので、膜構造がアセトバクター・キシリナ
ムの構造と似た微生物を宿主に選ぶことによって、この
酵素をペリプラズムまで分泌させることも可能と考えら
れる。ペリプラズムまで分泌させることにより、さらに
高精製のセルラーゼを生産することが容易となる。

〔発明の詳細な説明〕

くセルラーゼの生物工学的生産における本発明の位置づ
け〉本発明はセルラーゼの生物工学的生産能を有するＤＮＡ
鎖、すなわちセルラーゼ遺伝子、に関するが、セルラー
ゼの生物工学的生産は当該遺伝情報の支配に服するもの
であるところから、本発明は一般にセルラーゼの生物工
学的生産に関するものとして把握することができ、また
この本発明の一般思想をこのＤＮＡ鎖の利用に係るセル
ラーゼの生物工学的生産能を有する微生物およびセルラ
ーゼの生物工学的生産法として捉えることもできる。

すなわち、本発明によるＤＮＡ鎖の利用形態の一つであ
るセルラーゼの生物工学的産生能を有する微生物は、セ
ルラーゼ活性を有していてアミノ酸配列が実質的に第１
図に示されているアミノ酸配列ＡからＢまでのポリペプ
チドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖をその遺伝
情報が発現可能な状態で含むプラスミドによって形質転
換されたものである。

また、本発明によるＤＮＡ鎖の利用形態の一つであるセ
ルラーゼの生物工学的製造法は、セルラーゼ活性を有し
ていてアミノ酸配列が実質的に第１図に示されているア
ミノ酸配列ＡからＢまでのポリペプチドをコードする塩
基配列を有するＤＮＡ鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を、こ
れをその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドの
作成、このプラスミドによる微生物の形質転換および得
られた形質転換体の培養からなる工程に付して、培養物
中にセルラーゼを産生させること、によって行われるも
のである。

＜ＤＮＡ鎖（セルラーゼ遺伝子）〉本発明によるセルラーゼの生物工学的産生能を有するＤ
ＮＡ鎖すなわちセルラーゼ遺伝子は、セルラーゼ活性を
有していてアミノ酸配列が実質的に第１図に示されてい
るアミノ酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペ
プチド、をコードするもの、である。ここでｒＤＮＡ鎖
」とは、ある長さを有するポリデオキシリボ核酸の相補
的二本鎖を意味するものである。そして、本発明では、
このｒＤＮＡ鎖」は、それがコードするポリペプチドの
アミノ酸配列によって特定されているところ、このポリ
ペプチドは上記のように有限の長さのものであるから、
このＤＮＡ鎖も有限の長さである。しかし、このＤＮＡ
鎖は、セルラーゼをコードする遺伝子を含んでいてこの
ポリペプチドの生物工学的産生を行わせるに有用なもの
であるところ、この有限の長さのＤＮＡ鎖のみによって
このような生物工学的産生が行えるのでなく、その５′
　−鋼上流および（または）３′　−棚下流に適当な長
さのＤＮＡ鎖が結合した状態でこのポリペプチドの生物
工学的産生が可能となる訳である。

従って、本発明でｒＤＮＡ鎖」というときは、この特定
の長さのもの（第１図の対応アミノ酸配列でいえば、Ａ
−Ｂの長さ）の外にこの特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員
とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含
するものとする。

本発明によるＤＮＡ鎖の存在形態のうち代表的なものは
、このＤＮＡ鎖を構成員の一部とするプラスミドの形態
ならびにプラスミドとして微生物、特に大腸菌、中に存
在する形態、である。本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい
存在形態の一つとしてのプラスミドは、パラセンジャー
ないし外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖と、微生物
中で安定に存在して複製可能なプラスミドベクターとプ
ロモーターとを一体に結合させたものである。プラスミ
ドベクターおよびプロモーターとしては公知のものを適
宜組み合わせて用いることができる。

適当なプラスミドベクターおよびプロモーターとしては
、後記したところを参照されたい。

くこの遺伝子がコードするポリペプチド〉上記のように
、本発明によるＤＮＡ鎖は、これがコードするアミノ酸
配列によって特定されている。このポリペプチドは、セ
ルラーゼ活性を有していて、アミノ酸配列が実質的に第
１図に示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでの
ものである。ここで「アミノ酸配列が実質的に第１図に
示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのもの」
ということは、このペプチドがセルラーゼ活性を有する
限りアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加など
があってもよいことを示すものである。

本発明での典型的なセルラーゼ活性を有するポリペプチ
ドは、第１図のアミノ酸配列のうちＡからＢのものであ
って、３４６個のアミノ酸からなるものであり、従来そ
のアミノ酸配列は知られていなかったものである。

＜ＤＮＡ鎖の塩基配列〉セルラーゼをコードするＤＮＡ鎖は、第１図のＡ−Ｂの
塩基配列を持つものまたはその縮重異性体並びに上記の
ようなセルラーゼのアミノ酸配列の変化に対応する塩基
配列を持つものまたはその縮重異性体、である。ここで
「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なって
いる同一のポリペプチドをコードすることのできるＤＮ
Ａ鎖を意味する。たとえば第１図のＡ−Ｂの塩基配列を
持つＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ酸のどれかに対応す
るコドンたとえばＣ−末端から２番目のＡｌａに対応す
るコドン（ＯＣＴ）が、これと縮重関係にあるたとえば
ＧＣＣに変わったものを本発明では縮重異性体と呼ぶも
のとする。本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例は、
３′　−末端に接して停止コドン（例えばＴＡＡ）を少
なくとも１個を持つものである。さらに、本発明の５′
側上流および（または）３′　−棚下流には、非翻訳領
域としてのＤＮＡ鎖（３′　−棚下流の最初の部分は、
ＴＡＡのような停止コドンであることがふつうである）
がある長さで続いていてもよい。

なお、第１図に示したＤＮＡ鎖の塩基配列は、アセトバ
クター・キシリナム（Ｉ　Ｆ０３２８８）より分離した
セルラーゼをコードする遺伝子について、ダイデオキシ
法によって決定したものである。

＜ＤＮＡ鎖の取得〉上記のセルラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は、核酸合成の
方法に従ってその鎖長の少なくとも一部を化学合成する
ことである。

結合アミノ酸が少なくとも３４６個であるということを
考えれば、この化学合成法よりもアセトバクター譬キシ
リナム（ＩＦ０３２８８）の染色体遺伝子のライブラリ
ーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば
適当なプローブによるハイブリダイゼイション法、によ
りこれを取得する方が好ましいといえる。

なお、本発明者らは、アセトバクター・キシリナム（Ｉ
Ｆ０３２８８）のセルラーゼをコードする塩基配列及び
アミノ酸配列が未知であったため、ショットガン法を用
いて、前記の遺伝子ライブラリーより本発明によるＤＮ
Ａ鎖をスクリーニングした（詳細後記実施例参照）。

く形質転換体〉上記のようにして取得される本発明ＤＮＡ鎖はセルラー
ゼ蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるので、これ
を生物工学的手法によって微生物に導入して形質転換体
をつくり、この形質転換微生物にセルラーゼ蛋白をつく
らせることができる。

（１）宿主微生物適当なプラスミドベクターが存在する限り、各種の微生
物が本発明ＤＮＡ鎖を構成員として含むプラスミドによ
り形質転換の対象となりうる。そのような微生物は、例
えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ）　、ザ
イモモナスΦモビリス（Ｚｙ＊ｏｍｏｎａｓｍｏｂｌｌ
ｌｓ　）等の細菌、酵母（サツカロミセス・セレビシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ
）　、などである。

（２）形質転換前記のように本発明ＤＮＡ鎖の持つ遺伝子情報が微生物
中で発現したということは本発明によってはじめて確認
されたことであるが、形質転換体の作成（およびそれに
よるセルラーゼの産生）のための手順ないし方法そのも
のは、分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野に
おいて慣用されているものでありうるので、本発明にお
いても下記したところ以外のものについてはこれら慣用
技術に準じて実施すればよい。

微生物中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現させるために
は、まずその微生物中で安定に存在するプラスミドベク
ター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。この際
用いられるプラスミドベクターは、大腸菌に対してはｐ
ＢＲ３２２など、酵母に対してはＹＲｐ７など、ザイモ
モナス属細菌に対してはｐＺＡ２２　（特開昭６２−２
２８２７８号公報参照）など種々知られているものすべ
てが用いられる。

一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を微生物で発現させるた
めには、そのＤＮＡをｍＲＮＡへ転写させる必要がある
。そのためには、転写のためのシグナルであるプロモー
ターの遺伝子を本発明ＤＮＡ鎖の５′　−側上流に組込
めばよい。このプロモーターについてはすでにｔｒｐ、
ｌａｃ。

ｏｍｐＦ　（以上、大腸菌用）　、ＡＤＨＩ、ＧＡＬ７
、ＰＧＫＳＴＲＰＩ　（以上、酵母用）等種々類られて
おり、本発明でもこれらのいずれをも利用することがで
きる。

また、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させる段階で蛋白合成の場
であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するため
に必要な配列（大腸菌ではＳＤ配列と呼ばれる）を、蛋
白合成の開始信号であるＡＴＧの前につける必要がある
。

さて、一般的には、セルラーゼ蛋白をつくろうとすれば
、上記のような操作が必要であるが、セルラーゼ蛋白を
つくる場合にセルラーゼ活性さえ保持されれば、第１図
に示されているＡ−Ｂのポリペプチドに１個以上のアミ
ノ酸を挿入または付加するか、あるいは１個以上のアミ
ノ酸を欠落させるかまたは別のアミノ酸で置換してもよ
いことは前Ｓこしたところである。

また、読み枠の調節その他の目的で適当な長さのＤＮＡ
鎖をリンカ−として結合させることもできる。このよう
なりＮＡ鎖の加工は、現在の遺伝子工学技術では、制限
酵素およびＤＮＡ化学合成技術を利用すれば容易に実施
することができる。

このようにしてつくったプラスミドによる微生物の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されて
いる合目的的な任意の方法によって行うことができる。

その一般的な事項については適当な底置または総説、た
とえばＴ、Ｍａｎｌａｔｉｓ、Ｅ。

Ｐ、Ｐｒ１ｔｓｃｈ、Ｊ、５ａｉｂｒｏｏｋ：　　ｒＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ　ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　　Ｊ　　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　！、ａｂ−ｏｒａＬｏｒｙ、　
（１９８２）、を参照することができる。

形質転換体は、本発明ＤＮＡ鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質（すなわちセルラーゼの産生能）
および使用ベクター由来の形質ならびに場合によって生
じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベクターから
の一部の遺伝情報の欠落による対応遺伝子の欠落を除け
ば、そのジェノタイプないしフェノタイプあるいは菌学
的性質において使用宿主微生物と同じである。

本発明による形質転換体の一例は、微工研菌寄第１０５
６１号（ＦＥＰＮ　Ｐ−１０５６１）として寄託されて
いる。

く遺伝情報の発現／蛋白の生産〉上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物中にセルラーゼを産生ずる。

形質転換体の培養ないし培養条件は、使用宿主微生物に
対するそれと本質的には変わらない。また、培養物すな
わち菌体内および（または）培養液からの産生蛋白の回
収も常法に従って行うことができる。

実施例（１）セルラーゼ生産株染色体ＤＮＡの精製アセトバク
タｍ−キシリナム（ＩＦ０３２８８）を１００ｍ１のＹ
ＰＤ培地（１，０％酵母エキス、２．０％ペプトン、２
，０％グルコース、ｐＨ６，８）で３０℃で２４時間通
気培養することにより、０．７ｇの湿菌体を得た。これ
を、３０ｍ１の緩衝液（５０ｍＭ　　）リス−ＨＣｌ５
ｐＨ８，０，５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁させた。次
いで、４００μｇ　／　ｍｌのリゾチーム（生化学工業
製）、１０℃ｇ　／　ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグ
マ社製）で３７℃で１５分間処理した。これに、７０ｍ
１の緩衝液（５０ｍＭ　　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）　、５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を加えた。

次に、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）お
よび５０℃ｇ　／　ｍｌのブロテイナーゼＫ（シグマ社
製）で６５℃で３０分間処理した。

次に、フェノール抽出を２回、フェノール：クロロホル
ム（１：　１）抽出を１回行った。これをエタノール沈
澱後、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　
　（ｐＨ８，０）　、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に溶かした
。次に１００μｇ／ｍｌのりボヌクレアーゼＡで３７℃
で１時間処理した後、フェノール抽出とフェノール：ク
ロロホルム（１：　１）抽出を１回ずつ行なった。これ
をエタノール沈澱後、２ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし、１
リツトルのＴＥ緩衝液に対して透析して、３６０μｇの
染色体ＤＮＡを得た。

（２）コスミドライブラリーの作成（１）で得られた染色体ＤＮＡＩＩμｇを制限酵素５ａ
ｕ３ＡＩで３７℃２０分間反応させて部分消化を行い、
次に１０〜４０％の蔗糖密度勾配の条件で超遠心を行い
、３５〜４５ｋｂの大きさのＤＮＡ鎖を回収した。これ
を４．２μｇのｐＪＢ８アーム（アマ−ジャム社製）と
混ぜ、Ｔ４リガーゼで１２℃で一夜反応させて連結した
。インビトロバツケイジングキット（アマ−ジャム社製
）を用いて、このライゲーション混合液で大腸菌Ｅ、　
　ｃｏｌｔ　　　ＤＨＩ　　（Ｆ　　　　ｒｅｃＡｌ、
ｅｎｄＡｌ、ｇｙｒＡ９６、　ｔｈｉ−１、ｈ　ｓ　ｄ
　Ｒ１７（ｒ　ｋ％　Ｉｎ　ｋ）　、ｓ　ｕ　ｐ　Ｅ　
４４、ｒ　ｅ　Ｉ　Ａ　１　？、ＡＴＣＣ３３８４９）
を形質転換した。Ａｐｒの形質転換株１０００株を得た
。

（３）セルラーゼ遺伝子保持味のスクリーニング（２）
で得た遺伝子ライブラリーによりセルラーゼ活性を示す
株を選び出すことにより、セルラーゼ遺伝子保持味を得
た。

具体的には、遺伝子ライブラリー１０００株を、０．５
％カルボキシメチルセルロース（ｃ　Ｍｃ　。

シグマ社製、Ｎ　ｏ　Ｃ８７５８）　、５０　ｕ　ｇ　
／　ｍｌアンピシリンを含むＬ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）寒天に
レプリカし、３７℃で２４時間培養後、Ｔｅａｔｈｅｒ
らのコンゴーレッド染色法（Ａｐｐｔ、Ｅｎｖｌ−ｒｏ
ｎ、Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ　、４３　、７７７　（１９ｇ
２））により、コロニの周辺にハローを作る株１株を得
た。本クローンのプラスミドをｐＡｃＯと命名した。

（４）セルラーゼ遺伝子の塩基配列決定ｐＡｃｏから、
サブクローニングを行うことにより、制限酵素Ｓｍａｌ
と制限酵素Ｘｂａｌとの二重消化により切り出される２
５６８ｂｐのＤＮＡ断片がセルラーゼ活性物をコードし
ていることが示された。この２５６８ｂｐ断片をプラス
ミドｐＵｃ１８　（宝酒造社製）のＳｍａ　Ｉ。

Ｘｂａ１間に挿入したプラスミドをｐＡＣ２と命名した
。２５６８ｂｐ断片についてグイデオキシ法（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４．
５４６３（１９７７）　）によりＤＮＡ塩基配列を決定
した（第１図参照）。

（５）セルラーゼ遺伝子の必須領域の決定（４）で塩基
配列を決定した２５６８ｂｐ断片内のセルラーゼ活性の
発現に必要な領域を決定するために行った。ｐＡＣ２を
Ｓｍａ　Ｉ及びＳａｃ　１により切断した後、５′　−
上流側からヌクレアーゼＥｘｏｍで切り縮めＴ４リガー
ゼでセルフライゲーションさせ、大腸菌を形質転換した
。以下（３）に示した方法を用い、セルラーゼ活性を有
する株を検索した。これらの株のプラスミドを調べ、セ
ルラーゼ遺伝子領域が一番小さくなったプラスミドをｐ
ＡＣ３と命名した。ｐＡＣ３のセルラーゼ遺伝子領域よ
り、第１図のアミノ酸配列のうちＡからＢまでのポリペ
プチドをコードする塩基配列がセルラーゼ活性の発現に
必要な領域であることが明らかとなった。ここには、ア
ミノ酸３４６個、分子量約３万８千の蛋白がコードされ
ている。

（６）大腸菌形質転換株によるセルラーゼの生産各種形
質転換株によるセルラーゼの生産を検討した。プラスミ
ドｐＡＣ２（ｐＵｃ１８に、第１図に示す２５６８ｂｐ
のＤＮＡ断片を挿入したもの）　、ｐＡＣ３（ｐＵｃ１
８に、第１図の８１９番目〜２５６８番目の塩基で示さ
れるＤＮＡ断片を挿入したもの）およびｐＵｃ１８を保
持するＥ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９株（ｒｅｃＡｌ、Δ
１ａｃｐｒｏ、ｅｎｄＡｌ、ｇｙｒＡ９６゜ｔｈｉ−１
、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｌＡｌ、Ｆ′ｔｒａＤ３６、ｐｒ
ｏＡＢＳ　１ａｃｌｑ。

ｇＺΔＭ１５、宝酒造（株）製）を１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むし培地にて、３７℃で１時間振盪培養
後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド、シグマ社製）を１ｍＭ加えて、さらに３７℃
で一夜振盪培養した。

対照として、アセトバクター・キシリナム（ｌＰＯ３２
８８）をアビセル２％を加えたＧＹＰ培地（２，０％グ
リセロール、１．０％酵母エキス、０．５％ペプトン、
ｐＨ６，５）にて、３０℃で４８時間振盪培養した。

セルラーゼ活性の測定に用いる酵素源として、大腸菌、
アセトバクターともに培養菌体をＭ／１５リン酸緩衝液
ｐＨ５，５に懸濁後、超音波処理（２０ＫＨｚ、３ｍ１
ｎ　）Ｌ、遠心上清液を用いた。

（７）セルラーゼ活性の測定セルラーゼ活性の測定は、２ｍｌの１％ＣＭＣ溶液（Ｍ
７’１５リン酸緩衝液ｐＨ５，５）に０．１ｍｌの酵素
液を加え、３７℃で一定時間反応させ、生じた還元糖を
ジニトロサリチルサン法（Ａｎａ　ｌ　。

Ｃｈｅｗ、　３１．４２６（１９５９））にてグルコー
ス換算として定量した。セルラーゼの１ユニツト（Ｕ）
は、１分間に１μｓｏｌのグルコースを遊離させる酵素
量として定義した。

得られた測定結果は、第１表に示す通りであった。

第　　１　　表アセトバクター・キシリナム（ｌＰＯ３２８８）　　　
　　　　０．４Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　　ＪＭ１０９　（ｐＵ
ｃ１８）　　　　　　　ＯＥ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９
　（ｐＡＣ２）　　　　　　４９．ＯＥ、ｃｏｌｔ　　
ＪＭ１０９　（ｐＡＣ３）　　　　　　１５３．０アセ
トバクター・キシリナムは培地で多量のセルロースを生
産するため、菌体外のセルラーゼがセルロースに吸着し
、セルラーゼ活性の測定が困難である。このため、アセ
トバクター・キシリナムのセルラーゼと大腸菌のものと
の生産性について比較するのは困難であるが、培養液１
．ｍｌ当りで比較するとＥ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９（
ｐＡ、Ｃ３）はアセトバクター・キシリナムの約３８０
倍の活性を示すようである。

微生物の寄託本発明に関係する微生物は、工業技術院微生物工業技術
研究所に下記の通りに寄託されている。

微　生　物　　　　受託番号　　　　　受託年月日

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるセルラーゼ遺伝子の塩基配列を
示す説明図である。

Claims

【特許請求の範囲】

セルラーゼ活性を有していて、アミノ酸配列が実質的に
第１図に示されているアミノ酸配列ＡからＢまでのもの
であるポリペプチドをコードする塩基配列を有すること
を特徴とする、セルラーゼの生物工学的生産能を有する
ＤＮＡ鎖。