JP2003520571A - ポリペプチドの発現及び分泌のためのペクチン酸リアーゼ - Google Patents
ポリペプチドの発現及び分泌のためのペクチン酸リアーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
外性ポリペプチドに融合された天然ペクチン酸リアーゼを含んで成る融合タンパク質の向上した生産のための細胞及びかかる融合タンパク質の生産方法。
Description
【０００１】
本発明は融合タンパク質の発現を介するポリペプチドの微生物生産に関する。
より詳しくは、本発明は外性ポリペプチドに融合された天然ペクチン酸リアーゼ
を含んで成る融合タンパク質の生産の向上のための細胞、並びに融合タンパク質
及び／又はポリペプチドの生産方法に関する。
より詳しくは、本発明は外性ポリペプチドに融合された天然ペクチン酸リアーゼ
を含んで成る融合タンパク質の生産の向上のための細胞、並びに融合タンパク質
及び／又はポリペプチドの生産方法に関する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質又はポリペプチドは現在多種多様な要領で工業的に生産されており
、全てタンパク質を産生する微生物の培養を包含する。工業的タンパク質を最適
化するいくつかの方法、例えば増殖培地の操作、突然変異等による微生物の改変
、所望のタンパク質をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼすプロモーターやシ
グナル配列等の遺伝的要素の変異、更にはタンパク質の安定性又は活性等を高め
るための遺伝子自体の操作等が当業界において公知であり、且つ日常的に利用さ
れている。
、全てタンパク質を産生する微生物の培養を包含する。工業的タンパク質を最適
化するいくつかの方法、例えば増殖培地の操作、突然変異等による微生物の改変
、所望のタンパク質をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼすプロモーターやシ
グナル配列等の遺伝的要素の変異、更にはタンパク質の安定性又は活性等を高め
るための遺伝子自体の操作等が当業界において公知であり、且つ日常的に利用さ
れている。
【０００３】
融合タンパク質は、本来獲得するのが困難なタンパク質、一例として活性ヒト
抗体を生産するための手段として既に発表されている（Goshorn, S.C. ら、Canc
er Research, (1993) Vol. 53 (9) pp. 2123-2127)。
抗体を生産するための手段として既に発表されている（Goshorn, S.C. ら、Canc
er Research, (1993) Vol. 53 (9) pp. 2123-2127)。
【０００４】
本発明の課題はポリペプチドを高収率で生産するための微生物学的方法に関す
る。
る。
【０００５】
発明の概要
本発明者は次のようなバチルスペクチン酸リアーゼを同定した。それは高収率
で生産されることができ、そして単離された第一ＤＮＡセグメントによりコード
される。このＤＮＡセグメントは外性起源のポリペプチドをコードする第二ＤＮ
Ａセグメントと一本のオープンリーディングフレームとなるように融合されてい
てよい。この融合は適当な条件下で高収率において産生されうる融合タンパク質
をコードするＤＮＡ配列をもたらす。
で生産されることができ、そして単離された第一ＤＮＡセグメントによりコード
される。このＤＮＡセグメントは外性起源のポリペプチドをコードする第二ＤＮ
Ａセグメントと一本のオープンリーディングフレームとなるように融合されてい
てよい。この融合は適当な条件下で高収率において産生されうる融合タンパク質
をコードするＤＮＡ配列をもたらす。
【０００６】
更に、本発明者は所定のアミノ酸配列が、ペクチン酸リアーゼと外性ポリペプ
チドとの間に導入されたときにタンパク質分解切断のための標的部位を担うこと
ができることを見い出した。
チドとの間に導入されたときにタンパク質分解切断のための標的部位を担うこと
ができることを見い出した。
【０００７】
従って、第一の観点において、本発明は一本のオープンリーディングフレーム
へと順次融合された少なくともペクチン酸リアーゼ、タンパク質分解切断標的部
位及び外性起源のポリペプチドといった要素をコードするＤＮＡ配列を含んで成
る細胞に関する。
へと順次融合された少なくともペクチン酸リアーゼ、タンパク質分解切断標的部
位及び外性起源のポリペプチドといった要素をコードするＤＮＡ配列を含んで成
る細胞に関する。
【０００８】
本発明者は更に、所定の状況下でかかる融合タンパク質の安定性を高めるアミ
ノ酸リンカーをペクチン酸リアーゼと外性ポリペプチドとの間に含ませることに
も成功した。
ノ酸リンカーをペクチン酸リアーゼと外性ポリペプチドとの間に含ませることに
も成功した。
【０００９】
従って、第二の観点において、本発明は一本のオープンリーディングフレーム
へと順次融合された少なくともペクチン酸リアーゼ、２個以上のアミノ酸のリン
カー、タンパク質分解切断標的部位及び外性起源のポリペプチドといった要素を
コードするＤＮＡ配列を含んで成る細胞に関する。
へと順次融合された少なくともペクチン酸リアーゼ、２個以上のアミノ酸のリン
カー、タンパク質分解切断標的部位及び外性起源のポリペプチドといった要素を
コードするＤＮＡ配列を含んで成る細胞に関する。
【００１０】
第三の観点において、本発明はタンパク質を生産するための方法に関する。こ
の方法は下記の工程を含んで成る： ｉ）一本のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）へと順次融合された少な
くともペクチン酸リアーゼ、タンパク質分解切断標的部位及び外性起源のポリペ
プチドといった要素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る適当な細胞を構築し； ii）工程（ｉ）で構築した細胞を増殖及び分泌のための適当な条件下で培養し
； iii)かかるタンパク質を回収し；そして iv）任意的にかかるタンパク質を上記標的部位において切断する。
の方法は下記の工程を含んで成る： ｉ）一本のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）へと順次融合された少な
くともペクチン酸リアーゼ、タンパク質分解切断標的部位及び外性起源のポリペ
プチドといった要素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る適当な細胞を構築し； ii）工程（ｉ）で構築した細胞を増殖及び分泌のための適当な条件下で培養し
； iii)かかるタンパク質を回収し；そして iv）任意的にかかるタンパク質を上記標的部位において切断する。
【００１１】
本発明の細胞又は方法を利用することにより、所望の外性ポリペプチド、例え
ばホルモン、機能性ホルモン類似体、酵素及び人工ポリペプチドを高収率で生産
することが可能となり、かくして生産経済性を高め、又は所定のポリペプチドに
関しては、かかる所望のポリペプチドの実用的な開発を経済的に実現できるもの
にさえすることができる。
ばホルモン、機能性ホルモン類似体、酵素及び人工ポリペプチドを高収率で生産
することが可能となり、かくして生産経済性を高め、又は所定のポリペプチドに
関しては、かかる所望のポリペプチドの実用的な開発を経済的に実現できるもの
にさえすることができる。
【００１２】
定義：
本発明の詳細な態様の説明に入る前に、本発明の主たる観点に関連する特定の
用語の定義を提供する。
用語の定義を提供する。
【００１３】
本明細書の中で用いる語「細胞」又は「株」とは、単独生存細胞又は単独の生
存細胞の栄養増殖により発生した生存細胞の集団を意味する。
存細胞の栄養増殖により発生した生存細胞の集団を意味する。
【００１４】
本明細書の中で用いる語「ＤＮＡ配列」又は「ＤＮＡセグメント」又は「ＤＮ
Ａ要素」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の特定の鎖の中の４つの塩基、アデ
ニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニジン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の配列順序を
意味し、それはこの配列又はセグメント又は要素によって特徴付けられる。
Ａ要素」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の特定の鎖の中の４つの塩基、アデ
ニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニジン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の配列順序を
意味し、それはこの配列又はセグメント又は要素によって特徴付けられる。
【００１５】
本発明との関係で、「遺伝子」又は「オープンリーディングフレーム」なる語
は、細胞内でポリペプチド又はタンパク質へと発現されることのできるＤＮＡの
鎖を意味する。従って、かかる遺伝子又はオープンリーディングフレームは開始
コドン（通常は「ＡＴＧ」、「ＧＴＧ」又は「ＴＴＧ」）から出発して停止コド
ン（通常は「ＴＡＡ」、「ＴＡＧ」又は「ＴＧＡ」）で終えるものとして定義さ
れるであろう。
は、細胞内でポリペプチド又はタンパク質へと発現されることのできるＤＮＡの
鎖を意味する。従って、かかる遺伝子又はオープンリーディングフレームは開始
コドン（通常は「ＡＴＧ」、「ＧＴＧ」又は「ＴＴＧ」）から出発して停止コド
ン（通常は「ＴＡＡ」、「ＴＡＧ」又は「ＴＧＡ」）で終えるものとして定義さ
れるであろう。
【００１６】
本明細書の中で用いる語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、ＲＮＡポ
リメラーゼによるオープンリーディングフレーム又は遺伝子のメッセンジャーＲ
ＮＡに至る転写、かかるメッセンジャーＲＮＡのリボソームによる、アミノ酸の
逐次的な付加及びペプチド結合によるその連結を介する翻訳により得られる発現
生成物を意味する。このプロセスは当業界では「セントラルドグマ」として知ら
れる。
リメラーゼによるオープンリーディングフレーム又は遺伝子のメッセンジャーＲ
ＮＡに至る転写、かかるメッセンジャーＲＮＡのリボソームによる、アミノ酸の
逐次的な付加及びペプチド結合によるその連結を介する翻訳により得られる発現
生成物を意味する。このプロセスは当業界では「セントラルドグマ」として知ら
れる。
【００１７】
遺伝子が発現されるためには、当業界において公知の通り、この遺伝子に連結
された、細胞内でのこの遺伝子の発現のために必須の要素がなくてはならない。
このような標準的な要素には、プロモーター、リボソーム結合部位、終止配列が
挙げられ、更には当業界周知のその他の要素であってもよい。
された、細胞内でのこの遺伝子の発現のために必須の要素がなくてはならない。
このような標準的な要素には、プロモーター、リボソーム結合部位、終止配列が
挙げられ、更には当業界周知のその他の要素であってもよい。
【００１８】
本発明との関係で、少なくとも２本の遺伝子、更には可能としてはその他のＤ
ＮＡ要素が合体連結されて一本の単独オープンリーディングフレームを形成し、
そしてこれらの要素がそれらの並んだ順序通りに一本のポリペプチドへと発現さ
れる場合、これらの要素は「順次融合」又は「順次に融合された」といえ、そし
てそのポリペプチドは「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」と称する。
ＮＡ要素が合体連結されて一本の単独オープンリーディングフレームを形成し、
そしてこれらの要素がそれらの並んだ順序通りに一本のポリペプチドへと発現さ
れる場合、これらの要素は「順次融合」又は「順次に融合された」といえ、そし
てそのポリペプチドは「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」と称する。
【００１９】
「ペクチン」とは、ペクテート、ポリガラクツロン酸及びペクチンを意味し、
それは高級又は低級にエステル化されていてよい。
それは高級又は低級にエステル化されていてよい。
【００２０】
本明細書の中で用いる語「ペクチナーゼ」とは、ペクチン系物質、主としてポ
リ（１，４−アルファ−Ｄ−ガラクツロニド及びその誘導体のグリコシド結合を
切断することのできるペクチナーゼ酵素を意味する（Sakai ら、Pectin, pectin
ase and protopectinase : production, properties and applications, pp 213
-294 : Advances in Applied Microbiology vol : 39, 1993を参照のこと）。
リ（１，４−アルファ−Ｄ−ガラクツロニド及びその誘導体のグリコシド結合を
切断することのできるペクチナーゼ酵素を意味する（Sakai ら、Pectin, pectin
ase and protopectinase : production, properties and applications, pp 213
-294 : Advances in Applied Microbiology vol : 39, 1993を参照のこと）。
【００２１】
「ペクチン酸リアーゼ」とは、ペクチン酸、またの名はポリガラクツロン酸内
のアルファ−１，４−グリコシド結合のトランス除去（transelimination）によ
るランダム切断を触媒するペクチナーゼ、例えば酵素クラスポリガラクツロネー
トリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）（ＰＧＬ）、またの名をポリ（１，４−アル
ファ−Ｄ−ガラクツロニド）リアーゼを意味し、更には当業者周知の態様、例え
ばアミノ酸欠失、挿入又は置換、Ｃ末端及び／又はＮ末端切頭（トランケーショ
ン）により、上記の触媒活性が維持されたまま改変されたペクチン酸リアーゼも
含まれる。
のアルファ−１，４−グリコシド結合のトランス除去（transelimination）によ
るランダム切断を触媒するペクチナーゼ、例えば酵素クラスポリガラクツロネー
トリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）（ＰＧＬ）、またの名をポリ（１，４−アル
ファ−Ｄ−ガラクツロニド）リアーゼを意味し、更には当業者周知の態様、例え
ばアミノ酸欠失、挿入又は置換、Ｃ末端及び／又はＮ末端切頭（トランケーショ
ン）により、上記の触媒活性が維持されたまま改変されたペクチン酸リアーゼも
含まれる。
【００２２】
「α−アミラーゼ」又は「アルファ−アミラーゼ」とは、オリゴ糖及び多糖の
中の１，４−アルファ−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒することのでき
る酵素、即ち、酵素命名データーベース（http://www.expasy.ch/enzyme/）に従
いＥＣ３．２．１．１に分類される酵素を意味する。
中の１，４−アルファ−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒することのでき
る酵素、即ち、酵素命名データーベース（http://www.expasy.ch/enzyme/）に従
いＥＣ３．２．１．１に分類される酵素を意味する。
【００２３】
本発明との関係で、「機能性ホルモン類似体」とは天然ペプチドホルモンの誘
導体であって、天然ホルモンの生物活性を、その天然ホルモンが当業界における
任意の標準的方法、例えばアミノ酸欠失、挿入、置換、Ｎ及び／又はＣ末端切頭
にかけられた後も保持している誘導体を意味する。機能性ホルモン類似体の特異
的な例はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４の３４８〜３７８位又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．１６の３５６〜３８６位に示すアミノ酸配列を含んで成るヒトＧＬＰ−１（７
−３７）である。
導体であって、天然ホルモンの生物活性を、その天然ホルモンが当業界における
任意の標準的方法、例えばアミノ酸欠失、挿入、置換、Ｎ及び／又はＣ末端切頭
にかけられた後も保持している誘導体を意味する。機能性ホルモン類似体の特異
的な例はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４の３４８〜３７８位又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．１６の３５６〜３８６位に示すアミノ酸配列を含んで成るヒトＧＬＰ−１（７
−３７）である。
【００２４】
「一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）」とは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８で示す
アミノ酸配列により特定されるプロインスリン類似体を意味する。このタンパク
質配列は引用することで本明細書に組入れるＷＯ９５／３４６６６として公開さ
れた国際特許出願において開示されている。
アミノ酸配列により特定されるプロインスリン類似体を意味する。このタンパク
質配列は引用することで本明細書に組入れるＷＯ９５／３４６６６として公開さ
れた国際特許出願において開示されている。
【００２５】
「コア酵素」とは、修飾又は改変されている又はされておらず、その本来の活
性を保持する単独のドメイン酵素を意味する。当業界公知のその触媒ドメインは
そのままであり、且つ機能を保持している。
性を保持する単独のドメイン酵素を意味する。当業界公知のその触媒ドメインは
そのままであり、且つ機能を保持している。
【００２６】
本明細書の中で用いる「タンパク質分解切断標的部位」とは、プロテアーゼに
より認識され、そしてそのプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列をいうか
、又は化学化合物による処理によって切断されるアミノ酸配列をいう（Current
protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R
., and Cutting, S.M. (編））。
より認識され、そしてそのプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列をいうか
、又は化学化合物による処理によって切断されるアミノ酸配列をいう（Current
protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R
., and Cutting, S.M. (編））。
【００２７】
細胞との関係で本明細書の中で用いる「外性」又は「外性起源」とは、細胞内
の外来遺伝子、即ち、細胞の中に挿入されたその細胞にとって天然でない遺伝子
の存在に基づきかかる細胞により産生されたポリペプチドを意味する。
の外来遺伝子、即ち、細胞の中に挿入されたその細胞にとって天然でない遺伝子
の存在に基づきかかる細胞により産生されたポリペプチドを意味する。
【００２８】
対照的に、特定の微生物起源との関係で本明細書の中で用いる「天然」又は「
内性」とは、その起源内の天然遺伝子、即ち、その起源細胞の中に組換挿入され
たものではなく、天然の遺伝子の存在に基づきその特異的な起源により産生され
たポリペプチドを意味する。
内性」とは、その起源内の天然遺伝子、即ち、その起源細胞の中に組換挿入され
たものではなく、天然の遺伝子の存在に基づきその特異的な起源により産生され
たポリペプチドを意味する。
【００２９】
「リンカー」又は「スペーサー」とは、多重ドメインタンパク質、例えばコア
酵素及び結合ドメイン、例えばセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を含んで成る
酵素、又は任意のその他の酵素ハイブリドのドメイン間に存在しうる、又は融合
ポリペプチド、例えば２つのコア酵素を含んで成る融合タンパク質、又は本発明
の細胞の中に存在するような融合タンパク質として発現される２種類のタンパク
質又はポリペプチド間に存在しうる少なくとも２個のアミノ酸を含んで成るポリ
ペプチドを意味する。例えば、２つのコア酵素の融合タンパク質は第一コア酵素
をコードするＤＮＡ配列、リンカーをコードするＤＮＡ配列、及び第二コア酵素
をコードするＤＮＡ配列を一本のリーディングフレームへと順次融合させ、そし
てこの構築体を発現させることにより提供される。リンカーはタンパク質分解切
断標的部位も含んで成ってよい。
酵素及び結合ドメイン、例えばセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を含んで成る
酵素、又は任意のその他の酵素ハイブリドのドメイン間に存在しうる、又は融合
ポリペプチド、例えば２つのコア酵素を含んで成る融合タンパク質、又は本発明
の細胞の中に存在するような融合タンパク質として発現される２種類のタンパク
質又はポリペプチド間に存在しうる少なくとも２個のアミノ酸を含んで成るポリ
ペプチドを意味する。例えば、２つのコア酵素の融合タンパク質は第一コア酵素
をコードするＤＮＡ配列、リンカーをコードするＤＮＡ配列、及び第二コア酵素
をコードするＤＮＡ配列を一本のリーディングフレームへと順次融合させ、そし
てこの構築体を発現させることにより提供される。リンカーはタンパク質分解切
断標的部位も含んで成ってよい。
【００３０】
発明の詳細な説明
細胞
本発明の細胞は好ましくはグラム陽性菌であり、より好ましくはバチルス細胞
であり、そして更により好ましくはバチルス・リシェニホルミス（Bacillus lic
heniformis）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・ブレビ
ス（Bacillus brevis)、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloli
quefaciens）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス・レンタ
ス（Bacillus lentus)、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus)、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus)、バチル
ス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Baci
llus circulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus)、バチルス・スリン
ジエンシス（Bacillus thuringiensis）、及びバチルス・アガラドエレンス（Ba
cillus agaradhaerens）から成る群から選ばれる。
であり、そして更により好ましくはバチルス・リシェニホルミス（Bacillus lic
heniformis）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・ブレビ
ス（Bacillus brevis)、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloli
quefaciens）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス・レンタ
ス（Bacillus lentus)、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus)、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus)、バチル
ス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Baci
llus circulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus)、バチルス・スリン
ジエンシス（Bacillus thuringiensis）、及びバチルス・アガラドエレンス（Ba
cillus agaradhaerens）から成る群から選ばれる。
【００３１】
ペクチン酸リアーゼ
好ましくは、本発明の方法により生産される融合タンパク質の一部として提供
されるペクチン酸リアーゼはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，４，６，８，１０から成
る群から選ばれるアミノ酸配列、並びにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，４，６，８及
び１０のいずれかと少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配
列を含んで成るペクチン酸リアーゼから選ばれる。
されるペクチン酸リアーゼはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，４，６，８，１０から成
る群から選ばれるアミノ酸配列、並びにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，４，６，８及
び１０のいずれかと少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配
列を含んで成るペクチン酸リアーゼから選ばれる。
【００３２】
天然酵素に結合したポリペプチドの異種発現のために極めて有利であることの
証明されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すペクチン酸リアーゼ（対応のＤＮＡ配
列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す）は４種のその他のペクチン酸リアーゼと近
似する。
証明されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示すペクチン酸リアーゼ（対応のＤＮＡ配
列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す）は４種のその他のペクチン酸リアーゼと近
似する。
【００３３】
この４種のペクチン酸リアーゼの完全ＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，
５，７及び９に示す。これらはバチルス属の種の中での外性ポリペプチドの発現
のための融合パートナーとして利用できうるその他のペクチン酸配列の例として
ここでとり挙げている。このような配列はＷＯ９９／２７０８４に開示されてい
る。
５，７及び９に示す。これらはバチルス属の種の中での外性ポリペプチドの発現
のための融合パートナーとして利用できうるその他のペクチン酸配列の例として
ここでとり挙げている。このような配列はＷＯ９９／２７０８４に開示されてい
る。
【００３４】
ペクチン酸リアーゼタンパク質配列は融合タンパク質の発現において利用する
ためのその有利な特徴を維持しながらある程度にまで縮小できるようである。Ｄ
ＮＡ配列、それ故コードされたタンパク質配列のこの縮小化は分子生物学の業界
内の任意の公知の方法により達成できる。
ためのその有利な特徴を維持しながらある程度にまで縮小できるようである。Ｄ
ＮＡ配列、それ故コードされたタンパク質配列のこの縮小化は分子生物学の業界
内の任意の公知の方法により達成できる。
【００３５】
これを行うための一の手段はＰＣＲプライマーを特異的にデザインし、そして
注目のタンパク質に融合されたペクチン酸リアーゼの切頭型バージョンを構築し
、そしてその新規の構築体を発現レベルについて試験することによる。かかる構
築体はペクチン酸リアーゼのＣ末端、ペクチン酸リアーゼのＮ末端、又はその両
端の一部を欠失させてよい。別の手段はペクチン酸リアーゼコード配列をペクチ
ン酸リアーゼのＣ末端をコードする部分が様々な度合へと分解されるようにエン
ドヌクレアーゼで処理することでありうる。注目のペプチドに融合されたペクチ
ン酸リアーゼの様々な長さのＮ末端部分を保持する莫大な数のクローンから成る
ライブラリーを、最良の発現構築体が同定されるようにその発現能力についてス
クリーニングにかけることができる。この手順は、ペクチン酸リアーゼのＮ末端
又はＮ末端及びＣ末端の双方の一部が融合タンパク質の最適な発現のために欠失
されるように、ペクチン酸リアーゼ融合構築体に適用することもできる。
注目のタンパク質に融合されたペクチン酸リアーゼの切頭型バージョンを構築し
、そしてその新規の構築体を発現レベルについて試験することによる。かかる構
築体はペクチン酸リアーゼのＣ末端、ペクチン酸リアーゼのＮ末端、又はその両
端の一部を欠失させてよい。別の手段はペクチン酸リアーゼコード配列をペクチ
ン酸リアーゼのＣ末端をコードする部分が様々な度合へと分解されるようにエン
ドヌクレアーゼで処理することでありうる。注目のペプチドに融合されたペクチ
ン酸リアーゼの様々な長さのＮ末端部分を保持する莫大な数のクローンから成る
ライブラリーを、最良の発現構築体が同定されるようにその発現能力についてス
クリーニングにかけることができる。この手順は、ペクチン酸リアーゼのＮ末端
又はＮ末端及びＣ末端の双方の一部が融合タンパク質の最適な発現のために欠失
されるように、ペクチン酸リアーゼ融合構築体に適用することもできる。
【００３６】
切断部位
タンパク質分解切断標的部位は、本発明の好適な態様において、プロテアーゼ
により認識されて切断されるアミノ酸配列である。
により認識されて切断されるアミノ酸配列である。
【００３７】
戦略的に配置することが融合タンパク質の効率的な切断を促進するいくつかの
アミノ酸配列が論文の中で発表されている。このような戦略のほとんどは母体酵
素と所望の酵素との間のリンカー領域における部位特異的タンパク質分解切断を
包含する（Polyakら (1997) Protein Engineering, Vol. 10 (6) pp. 615-619;
Kjeldsenら (1996) Gene, Vol. 170 (1) pp. 107-112; Sunら (1995) Protein E
xpression and Purification, Vol. 6 (5) pp. 685-692; Martinezら (1995) Bi
ochemical Journal, Vol. 306 (Pt 2) pp. 589-597)。
アミノ酸配列が論文の中で発表されている。このような戦略のほとんどは母体酵
素と所望の酵素との間のリンカー領域における部位特異的タンパク質分解切断を
包含する（Polyakら (1997) Protein Engineering, Vol. 10 (6) pp. 615-619;
Kjeldsenら (1996) Gene, Vol. 170 (1) pp. 107-112; Sunら (1995) Protein E
xpression and Purification, Vol. 6 (5) pp. 685-692; Martinezら (1995) Bi
ochemical Journal, Vol. 306 (Pt 2) pp. 589-597)。
【００３８】
効率的な切断を確保するため、母体酵素（この場合、ペクチン酸リアーゼ）と
外性ポリペプチドとの間に、部位特異的プロテアーゼのための認識部位をコード
するアミノ酸配列を挿入することができる。認識部位とプロテアーゼとの間での
いくつかの組合せが、論文の中に発表されている。以下に、我々はサッカロマイ
セス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母のアルファ−細胞に由来す
るＫｅｘ２−遺伝子でコードされた膜結合プロテイナーゼの利用を示す。Ｋｅｘ
２プロテイナーゼは塩基性アミノ酸対を有するペプチド及びタンパク質を加水分
解し、それはそのペプチド結合のＣ末端において切断される（Bessmertnayaら、
(1997) Biochemistry, Vol. 62 (8) pp. 850-857）。第一及び第二の観点に従う
一の好適な態様において利用されるＫｅｘ２切断部位はＬｙｓ−Ａｒｇ（Ｋ−／
−Ｒ）配列であるが、その他の塩基性アミノ酸の組合せをＫｅｘ２による切断を
最適化するために挿入してよい（Ledgerwood. ら (1995) J. Biochem., Vol. 30
8 (1) pp. 321-325;又はGhosh, S.ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2
) pp. 249-255）。
外性ポリペプチドとの間に、部位特異的プロテアーゼのための認識部位をコード
するアミノ酸配列を挿入することができる。認識部位とプロテアーゼとの間での
いくつかの組合せが、論文の中に発表されている。以下に、我々はサッカロマイ
セス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母のアルファ−細胞に由来す
るＫｅｘ２−遺伝子でコードされた膜結合プロテイナーゼの利用を示す。Ｋｅｘ
２プロテイナーゼは塩基性アミノ酸対を有するペプチド及びタンパク質を加水分
解し、それはそのペプチド結合のＣ末端において切断される（Bessmertnayaら、
(1997) Biochemistry, Vol. 62 (8) pp. 850-857）。第一及び第二の観点に従う
一の好適な態様において利用されるＫｅｘ２切断部位はＬｙｓ−Ａｒｇ（Ｋ−／
−Ｒ）配列であるが、その他の塩基性アミノ酸の組合せをＫｅｘ２による切断を
最適化するために挿入してよい（Ledgerwood. ら (1995) J. Biochem., Vol. 30
8 (1) pp. 321-325;又はGhosh, S.ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2
) pp. 249-255）。
【００３９】
プロテアーゼ及び切断部位のその他の有用な組合せは次の通りである：アミノ
酸配列Ｘ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−／−Ｘの切断を優先するエンテロキナーゼ（La Val
lie ら、(1993) J. Biol. Chem., Vol. 268. pp. 2311-2317）、アミノ酸配列Ｘ
−Ｋ−Ｒ−／−Ｘの切断を優先するトリプシン（Jonassonら (1996) Eur. J. Bi
ochem., Vol. 236 (2) pp. 656-661）、アミノ酸配列Ｘ−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−／−
Ｘの切断を優先するＸａ因子（Nagai ら、(1985) PNAS, Vol. 82, pp. 7252-725
5)、アミノ酸配列Ｐ−Ｘ−／−Ｇ−Ｐ−Ｘ−Ｘの切断を優先するコラゲナーゼ（
Chinery ら (1993) Eur. J. Biochem., Vol. 212 (2) pp. 557-553）、アミノ酸
配列Ｘ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｒ−／−Ｘの切断を優先するトロンビン（Rohman
ら (1992) Cell. Mol. Biol., Vol. 38 (5) pp. 529-542)、リジンの切断を優先
するＡＬＰ（アクロモバクター・リチカス（Achromobacter lyticus)Ｌｙｓ特異
的プロテアーゼ、及びＧｌｕの切断を優先するバチルス・リシェニホルミス由来
のＣ成分プロテアーゼ（Kokudoら (1992) J. Biol. Chem., vol. 267, (33), pp
. 23782-23788）。
酸配列Ｘ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−／−Ｘの切断を優先するエンテロキナーゼ（La Val
lie ら、(1993) J. Biol. Chem., Vol. 268. pp. 2311-2317）、アミノ酸配列Ｘ
−Ｋ−Ｒ−／−Ｘの切断を優先するトリプシン（Jonassonら (1996) Eur. J. Bi
ochem., Vol. 236 (2) pp. 656-661）、アミノ酸配列Ｘ−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−／−
Ｘの切断を優先するＸａ因子（Nagai ら、(1985) PNAS, Vol. 82, pp. 7252-725
5)、アミノ酸配列Ｐ−Ｘ−／−Ｇ−Ｐ−Ｘ−Ｘの切断を優先するコラゲナーゼ（
Chinery ら (1993) Eur. J. Biochem., Vol. 212 (2) pp. 557-553）、アミノ酸
配列Ｘ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｒ−／−Ｘの切断を優先するトロンビン（Rohman
ら (1992) Cell. Mol. Biol., Vol. 38 (5) pp. 529-542)、リジンの切断を優先
するＡＬＰ（アクロモバクター・リチカス（Achromobacter lyticus)Ｌｙｓ特異
的プロテアーゼ、及びＧｌｕの切断を優先するバチルス・リシェニホルミス由来
のＣ成分プロテアーゼ（Kokudoら (1992) J. Biol. Chem., vol. 267, (33), pp
. 23782-23788）。
【００４０】
ペプチドを特異的な標的部位において切断するためのその他の好適な方法は、
Ｘ−Ｍ−／−Ｘを切断する臭化シアン又はＳ−Ｎ−／−Ｇ−Ｘを切断するヒドロ
キシルアミンの如き化学化合物を利用することによる（Current protocols in M
olecular Biology. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting,
S.M. (編））。
Ｘ−Ｍ−／−Ｘを切断する臭化シアン又はＳ−Ｎ−／−Ｇ−Ｘを切断するヒドロ
キシルアミンの如き化学化合物を利用することによる（Current protocols in M
olecular Biology. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting,
S.M. (編））。
【００４１】
リンカー
本発明の好適な態様において、本発明の方法により生産される融合タンパク質
はペクチン酸リアーゼと外性ポリペプチドとの間に挿入されたリンカーを含んで
成る。好ましくは、このリンカーはアミノ酸残基の少なくとも２５％がプロリン
であるアミノ酸配列を含んで成る。より好ましくは、このリンカーはアミノ酸配
列の少なくとも一周期の反復：Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ＰＥＰＴ，Ｅ
ＰＴＰ，ＰＴＥＰ又はＴＰＥＰ）を含んで成り、そして更により好ましくはこの
リンカーはアミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＧＥＲ）の少な
くとも一の反復を含んで成る。
はペクチン酸リアーゼと外性ポリペプチドとの間に挿入されたリンカーを含んで
成る。好ましくは、このリンカーはアミノ酸残基の少なくとも２５％がプロリン
であるアミノ酸配列を含んで成る。より好ましくは、このリンカーはアミノ酸配
列の少なくとも一周期の反復：Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ＰＥＰＴ，Ｅ
ＰＴＰ，ＰＴＥＰ又はＴＰＥＰ）を含んで成り、そして更により好ましくはこの
リンカーはアミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＧＥＲ）の少な
くとも一の反復を含んで成る。
【００４２】
外性ポリペプチド
通常、外性ポリペプチドは本発明の方法の所望の生成物である。外性ポリペプ
チドは本発明の方法により産生される融合タンパク質の一部として有効に発現さ
れうる任意のポリペプチドであってよいと考慮される。
チドは本発明の方法により産生される融合タンパク質の一部として有効に発現さ
れうる任意のポリペプチドであってよいと考慮される。
【００４３】
本発明の好適な態様において、外性ポリペプチドはホルモン、機能性ホルモン
類似体、酵素、及び人工ポリペプチドから成る群から選ばれる。
類似体、酵素、及び人工ポリペプチドから成る群から選ばれる。
【００４４】
人工ポリペプチドの例は、一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）、好ましくはＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１７に示すコドン最適化人工配列によりコードされるＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１８に示すアミノ酸配列を含んで成るインスリンである。外性ポリ
ペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０の３５６〜４０８位に示すアミノ酸配列を
含んで成る一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）を含んで成るもの；又はＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４２の３６６〜４１８に示すアミノ酸配列を含んで成る一本鎖ヒトイ
ンスリン（ＭＩ３）のＭＷ変異体であってもよい。
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１７に示すコドン最適化人工配列によりコードされるＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１８に示すアミノ酸配列を含んで成るインスリンである。外性ポリ
ペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０の３５６〜４０８位に示すアミノ酸配列を
含んで成る一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）を含んで成るもの；又はＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４２の３６６〜４１８に示すアミノ酸配列を含んで成る一本鎖ヒトイ
ンスリン（ＭＩ３）のＭＷ変異体であってもよい。
【００４５】
ホルモンは当業界において公知の任意のペプチドホルモン、例えばヒトＧＬＰ
１の完全アミノ酸配列であってよい。
１の完全アミノ酸配列であってよい。
【００４６】
機能性ホルモン類似体の例はヒトＧＬＰ−１（７−３７）ホルモン類似体、好
ましくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４の３４８〜３７８位又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．１６の３５６〜３８６位に示すアミノ酸配列を含んで成る類似体である。
ましくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４の３４８〜３７８位又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．１６の３５６〜３８６位に示すアミノ酸配列を含んで成る類似体である。
【００４７】
酵素の例はα−アミラーゼである。好適なα−アミラーゼには米国特許第５，
００３，２５７号；ＥＰ ２５２，６６６；ＷＯ９１／００３５３；ＦＲ ２，
６７６，４５６；ＥＰ ２８５，１２３；ＥＰ ５２５，６１０；ＥＰ ３６８
，３４１；及び英国特許明細書第１，２９６，８３９号（Novo）において開示さ
れているものが挙げられる。
００３，２５７号；ＥＰ ２５２，６６６；ＷＯ９１／００３５３；ＦＲ ２，
６７６，４５６；ＥＰ ２８５，１２３；ＥＰ ５２５，６１０；ＥＰ ３６８
，３４１；及び英国特許明細書第１，２９６，８３９号（Novo）において開示さ
れているものが挙げられる。
【００４８】
その他のアミラーゼはＷＯ９４／１８３１４及びＷＯ９６／０５２９５に記載
の安定性の増強されたアミラーゼ、並びにＷＯ９５／１０６０３に開示の直前の
起源において追加の修飾を伴うアミラーゼ変異体である。更に適当なのはＥＰ
２７７，２１６、ＷＯ９５／２６３９７及びＷＯ９６／２３８７３に記載のアミ
ラーゼである。
の安定性の増強されたアミラーゼ、並びにＷＯ９５／１０６０３に開示の直前の
起源において追加の修飾を伴うアミラーゼ変異体である。更に適当なのはＥＰ
２７７，２１６、ＷＯ９５／２６３９７及びＷＯ９６／２３８７３に記載のアミ
ラーゼである。
【００４９】
本発明の好適な態様において、α−アミラーゼはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の
３５０〜８３４位に示すアミノ酸配列を含んで成る。
３５０〜８３４位に示すアミノ酸配列を含んで成る。
【００５０】
商業的なα−アミラーゼ製品の例はＧｅｎｅｎｃｏｒ由来のＰｕｒａｆｅｃｔ
Ｏｘ Ａｍ（登録商標）、並びに全てＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ Ｄ
ｅｎｍａｒｋより入手可能なＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）、Ｂａｎ（登録商標
）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）及びＤｕｒａｍｙｌ（登録商標）である。Ｗ
Ｏ９５／２６３９７にはその他の適当なアミラーゼが記載されている：Ｐｈａｄ
ｅｂａｓ（登録商標）α−アミラーゼ活性アッセイによる測定に従い、２５〜５
５℃の温度範囲及び８〜１０の範囲のpHにおいて、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標
）の比活性よりも少なくとも２５％高い比活性を有することを特徴とするα−ア
ミラーゼ。活性レベル及び熱安定性と高い活性レベルとの組合せとの関係で向上
した特性を有するその他のアミロース分解酵素がＷＯ９５／３５３８２に記載さ
れている。
Ｏｘ Ａｍ（登録商標）、並びに全てＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ Ｄ
ｅｎｍａｒｋより入手可能なＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）、Ｂａｎ（登録商標
）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）及びＤｕｒａｍｙｌ（登録商標）である。Ｗ
Ｏ９５／２６３９７にはその他の適当なアミラーゼが記載されている：Ｐｈａｄ
ｅｂａｓ（登録商標）α−アミラーゼ活性アッセイによる測定に従い、２５〜５
５℃の温度範囲及び８〜１０の範囲のpHにおいて、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標
）の比活性よりも少なくとも２５％高い比活性を有することを特徴とするα−ア
ミラーゼ。活性レベル及び熱安定性と高い活性レベルとの組合せとの関係で向上
した特性を有するその他のアミロース分解酵素がＷＯ９５／３５３８２に記載さ
れている。
【００５１】
本発明の方法により産生されうる好適なアミラーゼの商標名Ｔｅｒｍａｍｙｌ
，Ｄｕｒａｍｙｌ及びＭａｘａｍｙｌで販売されているアミラーゼ、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１２の３５０〜８３４位に示すアミノ酸配列を含んで成るＪＰ１７０
アミラーゼ、及び／又はＷＯ９６／２３８７３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として
開示されている向上した熱安定性を示すα−アミラーゼ変異体である。
，Ｄｕｒａｍｙｌ及びＭａｘａｍｙｌで販売されているアミラーゼ、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１２の３５０〜８３４位に示すアミノ酸配列を含んで成るＪＰ１７０
アミラーゼ、及び／又はＷＯ９６／２３８７３のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として
開示されている向上した熱安定性を示すα−アミラーゼ変異体である。
【００５２】
タンパク質を生産するための方法
本方法における必須の要素は本明細書に記載の細胞の利用にある。当該タンパ
ク質を生産できる細胞の特異的な構築及び培養は当業界の任意の標準的なプロト
コールであってよい（Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.“Molecular
Cloning. A laboratory manual”. Cold Spring Harbor Laboratories, 1982;
Ausubel, F.M., et al. (eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”.
John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)“Mole
cular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990）。
ク質を生産できる細胞の特異的な構築及び培養は当業界の任意の標準的なプロト
コールであってよい（Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.“Molecular
Cloning. A laboratory manual”. Cold Spring Harbor Laboratories, 1982;
Ausubel, F.M., et al. (eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”.
John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)“Mole
cular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990）。
【００５３】
同様に、第三の観点の項目iii)のタンパク質を単離するための特異的な戦略は
、当業者公知の任意の単離プロトコールであってよい；この単離戦略は当業界に
おいて公知の如き、単離の前又は後の多種多様な要領でタンパク質をタンパク質
分解的に切断することを含みうる。
、当業者公知の任意の単離プロトコールであってよい；この単離戦略は当業界に
おいて公知の如き、単離の前又は後の多種多様な要領でタンパク質をタンパク質
分解的に切断することを含みうる。
【００５４】
本発明を以下の非限定的な実施例により更に説明する。
【００５５】
材料と方法
株及びドナー生物
バチルス・リシェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
に示すペクチン酸リアーゼコードＤＮＡを含んで成る。 大腸菌（Ｅ．コリ）ＤＳＭ １１７８９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す本発
明のペクチン酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。
に示すペクチン酸リアーゼコードＤＮＡを含んで成る。 大腸菌（Ｅ．コリ）ＤＳＭ １１７８９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す本発
明のペクチン酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。
【００５６】
大腸菌ＤＳＭ １２４０３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示す本発明のペクチン
酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。 大腸菌ＤＳＭ １２４０４はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示す本発明のペクチン
酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。
酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。 大腸菌ＤＳＭ １２４０４はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示す本発明のペクチン
酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。
【００５７】
大腸菌ＤＳＭ １１７８８はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に示す本発明のペクチン
酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。
酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含むプラスミドを含んで成る。
【００５８】
バチルス属の種ＫＪ５９，ＤＳＭ １２４１９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示
すペクチン酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含んで成る。
すペクチン酸リアーゼコードＤＮＡ配列を含んで成る。
【００５９】
Ｂ．スブチリスＰＬ１８０１。この株は中断されたａｐｒ及びｎｐｒ遺伝子を
有するＢ．スブチリスＤＮ１８８５である（Diderichsen, B., Wedsted, U., He
degaard, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which enc
odes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis
. J. Bacteriol., 172, 4315-4321)。
有するＢ．スブチリスＤＮ１８８５である（Diderichsen, B., Wedsted, U., He
degaard, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which enc
odes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis
. J. Bacteriol., 172, 4315-4321)。
【００６０】
Ｂ．スブチリスＷＢ６００。この株は６種の主要プロテアーゼの欠失したＢ．
スブチリスである（Wu, X- C., S- C. Ng, R.I. Near, and S- L. Wong. 1993.
Efficient production of a functional single-chain antidigoxin antibody v
ia an engineered Bacillus subtilis expression-secretion system. Bio/Tech
nol. 11 : 71-76）。
スブチリスである（Wu, X- C., S- C. Ng, R.I. Near, and S- L. Wong. 1993.
Efficient production of a functional single-chain antidigoxin antibody v
ia an engineered Bacillus subtilis expression-secretion system. Bio/Tech
nol. 11 : 71-76）。
【００６１】
Ｂ．スブチリスＷＢ６００ａｎｓ。この株はａｍｙＥ遺伝子がテトラサイクリ
ンマーカーにより中断されたＷＢ６００株である。更に、ＷＢ６００内のクロラ
ムフェニコールマーカー遺伝子をネオマイシンマーカーで置換する。その株はテ
トラサイクリン、ネオマイシン、スペクチノマイシン及びブレオマイシン耐性と
なる。
ンマーカーにより中断されたＷＢ６００株である。更に、ＷＢ６００内のクロラ
ムフェニコールマーカー遺伝子をネオマイシンマーカーで置換する。その株はテ
トラサイクリン、ネオマイシン、スペクチノマイシン及びブレオマイシン耐性と
なる。
【００６２】
Ｂ．スブチリスＰＬ２３０６。この株はａｐｒ及びｎｐｒ遺伝子が中断され（
Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (
1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, a
n exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321)、公知の
バチルス・スブチリスの転写単位において中断され、セルラーゼ陰性細胞となっ
たＢ．スブチリスＤＮ１８８５である。この中断は本質的に発表されている通り
に実施する（Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch and Richard Losick (1993) Ba
cillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for m
icrobiology, p. 618）。
Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (
1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, a
n exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321)、公知の
バチルス・スブチリスの転写単位において中断され、セルラーゼ陰性細胞となっ
たＢ．スブチリスＤＮ１８８５である。この中断は本質的に発表されている通り
に実施する（Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch and Richard Losick (1993) Ba
cillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for m
icrobiology, p. 618）。
【００６３】
コンピテント細胞はYasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E. (1975) Tr
ansformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis
: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Ba
cteriol, 121 : 296-304に記載の通りにして調製して形質転換した。
ansformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis
: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Ba
cteriol, 121 : 296-304に記載の通りにして調製して形質転換した。
【００６４】
プラスミド
ｐＳＪ１６７８（引用することで本明細書に組入れるＷＯ９４／１９４５４参照
のこと）。
のこと）。
【００６５】
ｐＭＯＬ９４４：
このプラスミドはバチルス・スブチリス内でそのプラスミドを増殖可能による
要素、カナマイシン耐性遺伝子を本質的に含み、且つＢ．リシェニホルミスＡＴ
ＣＣ １４５８０のａｍｙＬ遺伝子からクローニングした強力なプロモーター及
びシグナルペプチドを有するｐＵＢ１１０誘導体である。このシグナルペプチド
は、シグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部をコードするＤＮＡをクロ
ーニングするのに好都合とするＳａｃII部位を含む。これは細胞の外部へと導か
れるプレタンパク質の発現をもたらす。
要素、カナマイシン耐性遺伝子を本質的に含み、且つＢ．リシェニホルミスＡＴ
ＣＣ １４５８０のａｍｙＬ遺伝子からクローニングした強力なプロモーター及
びシグナルペプチドを有するｐＵＢ１１０誘導体である。このシグナルペプチド
は、シグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部をコードするＤＮＡをクロ
ーニングするのに好都合とするＳａｃII部位を含む。これは細胞の外部へと導か
れるプレタンパク質の発現をもたらす。
【００６６】
このプラスミドは以下に簡単に説明する慣用の遺伝子操作技術により構築した
。
。
【００６７】
ｐＭＯＬ９４４の構築：
ｐＵＢ１１０プラスミド（McKenzie, T.ら、1986, Plasmid 15 : 93-103)を固
有の制限酵素、ＮｃｉＩで消化した。プラスミドｐＤＮ１９８１上でコードされ
るａｍｙＬプロモーターから増殖したＰＣＲフラグメント（P.L. Jorgensenら、
1990, Gene, 96, p37-41）をＮｃｉＩで消化し、そしてＮｃｉＩ消化したｐＵＢ
１１０に挿入してプラスミドｐＳＪ２６２４を得た。 使用した２本のプライマーは下記の配列を有する：
有の制限酵素、ＮｃｉＩで消化した。プラスミドｐＤＮ１９８１上でコードされ
るａｍｙＬプロモーターから増殖したＰＣＲフラグメント（P.L. Jorgensenら、
1990, Gene, 96, p37-41）をＮｃｉＩで消化し、そしてＮｃｉＩ消化したｐＵＢ
１１０に挿入してプラスミドｐＳＪ２６２４を得た。 使用した２本のプライマーは下記の配列を有する：
【化１】
【００６８】
プライマー＃ＬＷＮ５４９４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１）はプラスミドにＮ
ｏｔＩ部位を挿入する。
ｏｔＩ部位を挿入する。
【００６９】
次にプラスミドｐＳＪ２６２４をＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、そしてｐＤ
Ｎ１９８１上でコードされたａｍｙＬプロモーターに基づいて増幅したＰＣＲフ
ラグメントをＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、そしてこのＤＮＡフラグメントを
ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化したｐＳＪ２６２４に挿入し、プラスミドｐＳＪ２６７
０を得た。
Ｎ１９８１上でコードされたａｍｙＬプロモーターに基づいて増幅したＰＣＲフ
ラグメントをＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化し、そしてこのＤＮＡフラグメントを
ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化したｐＳＪ２６２４に挿入し、プラスミドｐＳＪ２６７
０を得た。
【００７０】
このクローニングは最初のａｍｙＬプロモーターを同一のプロモーターではあ
るが反対方向で置き換える。ＰＣＲ増幅のために用いた２つのプライマーは以下
の配列を有する：
るが反対方向で置き換える。ＰＣＲ増幅のために用いた２つのプライマーは以下
の配列を有する：
【化２】
【００７１】
プラスミドｐＳＪ２６７０を制限酵素ＰｓｔＩ及びＢｃｌＩで消化し、そして
アルカリ性アミラーゼＳＰ７２２をコードするクローン化ＤＮＡ（引用すること
で本明細書に組入れるＷＯ９５／２６３９７として公開された国際特許出願に開
示）から増幅させたＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩ及びＢｃｌＩで消化し、そし
て挿入してプラスミドｐＭＯＬ９４４にした。ＰＣＲ増幅のために用いた２つの
プライマーは次の配列を有する
アルカリ性アミラーゼＳＰ７２２をコードするクローン化ＤＮＡ（引用すること
で本明細書に組入れるＷＯ９５／２６３９７として公開された国際特許出願に開
示）から増幅させたＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩ及びＢｃｌＩで消化し、そし
て挿入してプラスミドｐＭＯＬ９４４にした。ＰＣＲ増幅のために用いた２つの
プライマーは次の配列を有する
【化３】
プライマー＃ＬＷＮ７９０１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６）はこのプラスミド
ＳａｃII部位を挿入する。
ＳａｃII部位を挿入する。
【００７２】
プラスミドｐＭＢ５４１（構築は下記参照）。
【００７３】
ドナー株の増幅
バチルス・リシェニホルミス株ＡＴＣＣ １４５８０をＡＴＣＣ（American T
ype Culture Collection, USA)に指定の通りにして液体培地３の中で増殖させた
。３７℃、３００rpm で１８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、そし
てゲノムＤＮＡを下記の方法により単離した。
ype Culture Collection, USA)に指定の通りにして液体培地３の中で増殖させた
。３７℃、３００rpm で１８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、そし
てゲノムＤＮＡを下記の方法により単離した。
【００７４】
ゲノムＤＮＡの調製
バチルス・リシェニホルミス株を上記の通りにして液体培地の中で増殖させた
。細胞を回収し、そしてPitcher らにより記載の方法により単離した [Pitcher,
D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J; Rapid extraction of bacterial genomic
DNA with guanidium thiocyanate; Lett Appl Microbiol 1989 8 151-156] 。
。細胞を回収し、そしてPitcher らにより記載の方法により単離した [Pitcher,
D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J; Rapid extraction of bacterial genomic
DNA with guanidium thiocyanate; Lett Appl Microbiol 1989 8 151-156] 。
【００７５】
ｐＭＢ５４１の構築
バチルス・リシェニホルミスからのペクチン酸リアーゼのクローニング
バチルス・リシェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０のゲノムＤＮＡを制限酵素
Ｓａｕ３Ａで部分消化し、そして０．７％のアガロースゲル上での電気泳動によ
りサイズ分画した。２〜７kbのサイズのフラグメントをＤＥＡＥ−セルロース紙
上で電気泳動させることにより単離した（Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-
Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA
fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298
）。
Ｓａｕ３Ａで部分消化し、そして０．７％のアガロースゲル上での電気泳動によ
りサイズ分画した。２〜７kbのサイズのフラグメントをＤＥＡＥ−セルロース紙
上で電気泳動させることにより単離した（Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-
Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA
fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298
）。
【００７６】
単離したＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ消化したｐＳＪ１６７８プラスミド
ＤＮＡにライゲーションし、そしてこのライゲーション混合物を大腸菌ＳＪ２の
形質転換のために用いた。バチルス・リシェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０の
ゲノムライブラリー由来の形質転換細胞を１０μｇ／mlのクロラムフェニコール
及び０．７％のポリガラクツロン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ Ｐ−１８７９）を
含むＬＢ−アガープレート上にプレートした。このプレートした細胞を３７℃で
１６時間インキュベーションした。
ＤＮＡにライゲーションし、そしてこのライゲーション混合物を大腸菌ＳＪ２の
形質転換のために用いた。バチルス・リシェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０の
ゲノムライブラリー由来の形質転換細胞を１０μｇ／mlのクロラムフェニコール
及び０．７％のポリガラクツロン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ Ｐ−１８７９）を
含むＬＢ−アガープレート上にプレートした。このプレートした細胞を３７℃で
１６時間インキュベーションした。
【００７７】
これらのコロニーを１０μｇ／mlのクロラムフェニコール及び０．７％のポリ
ガラクツロン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ Ｐ−１８７９）を含む新鮮なＬＢ−ア
ガープレート上にレプリカプレートし、これらのプレートを３７℃で８時間イン
キュベーションした。オリジナルのマスタープレートを５mlの１ＭのＣａＣｌ2
であふれさせ、５〜３０分後、推定ポリガラクツロン酸ナトリウム分解クローン
の周囲に顕著な濁った輪が出現した。対応のマスタープレートクローンを更なる
特性決定のために拾った。これらのクローンは、大腸菌クローンの一夜、３０℃
の液体ＴＹ培養物からプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＱｉａｇｅｎ Ｑｉａ
ｓｐｉｎ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔをその製造者（Qiagen, Germany)に従って用いてプ
ラスミドＤＮＡを調製することにより更に特性決定した。
ガラクツロン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ Ｐ−１８７９）を含む新鮮なＬＢ−ア
ガープレート上にレプリカプレートし、これらのプレートを３７℃で８時間イン
キュベーションした。オリジナルのマスタープレートを５mlの１ＭのＣａＣｌ2
であふれさせ、５〜３０分後、推定ポリガラクツロン酸ナトリウム分解クローン
の周囲に顕著な濁った輪が出現した。対応のマスタープレートクローンを更なる
特性決定のために拾った。これらのクローンは、大腸菌クローンの一夜、３０℃
の液体ＴＹ培養物からプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＱｉａｇｅｎ Ｑｉａ
ｓｐｉｎ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔをその製造者（Qiagen, Germany)に従って用いてプ
ラスミドＤＮＡを調製することにより更に特性決定した。
【００７８】
ペクチン酸リアーゼ陽性クローンバチルス・リシェニホルミスＡＴＣＣ １４
５８０遺伝子ライブラリーをＤＳＭ １１７８９として寄託した。大腸菌ＤＳＭ
１１７８９のプラスミド上でのプライマー歩行の後、バチルス・リシェニホル
ミスＡＴＣＣ １４５８０由来のペクチン酸リアーゼコードＤＮＡのＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１が同定された。
５８０遺伝子ライブラリーをＤＳＭ １１７８９として寄託した。大腸菌ＤＳＭ
１１７８９のプラスミド上でのプライマー歩行の後、バチルス・リシェニホル
ミスＡＴＣＣ １４５８０由来のペクチン酸リアーゼコードＤＮＡのＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１が同定された。
【００７９】
活性による陽性クローンの同定
プレート上でインキュベーションの後、コロニーを一組のＬＢ＋６ ＣＡＭア
ガ−プレート上にレプリカプレートし、次いで３７℃で約２０時間更にインキュ
ベーションした。適当なバッファー中の１％のＨＳＢアガロース、０．７％のポ
リガラクツロン酸ナトリウム塩を含む上層をこのレプリカプレート上に注ぎ、そ
して４０℃で約２０時間インキュベーションした。５mlの１ＭのＣａＣｌ2 で沈
殿させた後、ペクチン酸リアーゼ陽性コロニーが、ペクチン酸リアーゼ陽性クロ
ーンの存在している位置での明瞭な輪の出現により５〜３０分後に同定された。
ガ−プレート上にレプリカプレートし、次いで３７℃で約２０時間更にインキュ
ベーションした。適当なバッファー中の１％のＨＳＢアガロース、０．７％のポ
リガラクツロン酸ナトリウム塩を含む上層をこのレプリカプレート上に注ぎ、そ
して４０℃で約２０時間インキュベーションした。５mlの１ＭのＣａＣｌ2 で沈
殿させた後、ペクチン酸リアーゼ陽性コロニーが、ペクチン酸リアーゼ陽性クロ
ーンの存在している位置での明瞭な輪の出現により５〜３０分後に同定された。
【００８０】
ペクチン酸リアーゼ陽性クローン由来の細胞をアガー上での孤立コロニー単離
のために散布し、そしてペクチン酸リアーゼ産生孤立コロニーを同定したペクチ
ン酸リアーゼ産生コロニー各々について選別した。
のために散布し、そしてペクチン酸リアーゼ産生孤立コロニーを同定したペクチ
ン酸リアーゼ産生コロニー各々について選別した。
【００８１】
陽性クローンの特性決定
再ストリーキングプレートからペクチナーゼ陽性クローンが孤立コロニーとし
て得られ、そしてプラスミドをＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐを用い
その製造者（Qiagen, Germany)の指定に従い抽出した。表現型を大腸菌ＳＪ２の
再形質転換により確認し、そしてプラスミドを制限消化により特性決定した。
て得られ、そしてプラスミドをＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐを用い
その製造者（Qiagen, Germany)の指定に従い抽出した。表現型を大腸菌ＳＪ２の
再形質転換により確認し、そしてプラスミドを制限消化により特性決定した。
【００８２】
バチルス・リシェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０遺伝子ライブラリーのペク
チン酸リアーゼ陽性クローンはＤＳＭ １１７８９として寄託してある。大腸菌
ＤＳＭ １１７８９のプラスミド上でのプライマー歩行を経て、バチルス・リシ
ェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０由来のペクチン酸リアーゼコードＤＮＡのＳ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１が同定された。
チン酸リアーゼ陽性クローンはＤＳＭ １１７８９として寄託してある。大腸菌
ＤＳＭ １１７８９のプラスミド上でのプライマー歩行を経て、バチルス・リシ
ェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０由来のペクチン酸リアーゼコードＤＮＡのＳ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１が同定された。
【００８３】
バチルス・スブチリスにおけるサブクローニング
本発明のペクチン酸リアーゼの成熟部をコードするＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に
より代表される）を次の２本のオリゴヌクレオチドから成るＰＣＲプライマーセ
ットを用いてＰＣＲ増幅した：
ｏ．１のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に
より代表される）を次の２本のオリゴヌクレオチドから成るＰＣＲプライマーセ
ットを用いてＰＣＲ増幅した：
【化４】
制限部位ＳａｃII及びＮｏｔＩに下線を付した。
【００８４】
上記の通りにしてＢ．リシェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０から単離した染
色体ＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer)を用い、
その製造者の仕様書に従ってＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は２０
０μＭづつの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Perkin
-Elmer, Cetus, USA)及び１００pmolづつの各プライマーを含むＰＣＲバッファ
ー（１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mMのＫＣｌ、１．５mMのＭｇＣ
ｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）の中で準備した。
色体ＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer)を用い、
その製造者の仕様書に従ってＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は２０
０μＭづつの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Perkin
-Elmer, Cetus, USA)及び１００pmolづつの各プライマーを含むＰＣＲバッファ
ー（１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mMのＫＣｌ、１．５mMのＭｇＣ
ｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）の中で準備した。
【００８５】
ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー（Landgraf, Germany)を用いて実施し
た。９４℃で１分の１回のインキュベーション、続いて９４℃で３０秒の変性、
６０℃で１分のアニーリング及び７２℃で２分の伸長といったサイクルプロフィ
ールを利用して３０サイクルのＰＣＲを実施した。５μｌのアリコートの増幅生
成物を０．７％のアガロースゲル（NuSieve, FMC）での電気泳動により分析した
。サイズ１．０kbのＤＮＡフラグメントの出現は遺伝子セグメントの適正な増幅
を示した。
た。９４℃で１分の１回のインキュベーション、続いて９４℃で３０秒の変性、
６０℃で１分のアニーリング及び７２℃で２分の伸長といったサイクルプロフィ
ールを利用して３０サイクルのＰＣＲを実施した。５μｌのアリコートの増幅生
成物を０．７％のアガロースゲル（NuSieve, FMC）での電気泳動により分析した
。サイズ１．０kbのＤＮＡフラグメントの出現は遺伝子セグメントの適正な増幅
を示した。
【００８６】
ＰＣＲフラグメントのサブクローニング
ＰＣＲフラグメントのサブクローニングを実施例１に記載の通りにして実施し
たが、但し精製したＰＣＲフラグメントをＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化した。ペ
クチン酸リアーゼ遺伝子を含む１つのクローンを保存し、このクローンをＭＢ５
４１と命名し、そしてＭＢ５４１の中に存在するプラスミドｐＭＢ５４１と命名
した。
たが、但し精製したＰＣＲフラグメントをＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化した。ペ
クチン酸リアーゼ遺伝子を含む１つのクローンを保存し、このクローンをＭＢ５
４１と命名し、そしてＭＢ５４１の中に存在するプラスミドｐＭＢ５４１と命名
した。
【００８７】
ペクチン酸リアーゼの成熟部に対応するＤＮＡをＴａｑ−ターミナルサイクル
シーケンシングキット（Perkin-Elmer, USA)、蛍光ラベル化ターミネーター及び
適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるプライマー歩行によるＤＮ
Ａ配列決定により特性決定した。
シーケンシングキット（Perkin-Elmer, USA)、蛍光ラベル化ターミネーター及び
適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるプライマー歩行によるＤＮ
Ａ配列決定により特性決定した。
【００８８】
配列データーの分析はDevereuxら（1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395に
従って実施した。クローニングしたＤＮＡ配列をＢ．スブチリスの中で発現させ
、そして上清液内で出現した成熟タンパク質に対応するタンパク質をＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１で示す。
従って実施した。クローニングしたＤＮＡ配列をＢ．スブチリスの中で発現させ
、そして上清液内で出現した成熟タンパク質に対応するタンパク質をＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１で示す。
【００８９】
一般分子生物学的方法
何らかのことわりのない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は分子生物学の標準的
な方法を利用して実施した（Sambrookら (1989) Molecular cloning : A labora
tory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F
.M.ら (eds.)“Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and S
ons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)“Molecular Biological
Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990)。
な方法を利用して実施した（Sambrookら (1989) Molecular cloning : A labora
tory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F
.M.ら (eds.)“Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and S
ons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)“Molecular Biological
Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990)。
【００９０】
ＤＮＡ操作のための酵素を供給者の指示に従い利用した（例えば、制限エンド
ヌクレアーゼ、リガーゼ等はNew England Biolabs, Inc. より入手可能）。
ヌクレアーゼ、リガーゼ等はNew England Biolabs, Inc. より入手可能）。
【００９１】
培地
ＴＹ（Ausubel, F.M.ら (eds.)“Current protocols in Molecular Biology”
. John Wiley and Sons, 1995に記載）。ＬＢアガー（Ausubel. F.M.ら (eds.)
“Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995に
記載）。ＬＢＰＧは０．５％のグルコース及び０．０５Ｍのリン酸カリウム、pH
７．０の入ったＬＢアガー。ＢＰＸ培地はＥＰ ０５０６ ７８０（ＷＯ９１／
０９１２９）に記載。ＣＡＬ １８−２培地（１ｌ）：酵母エキス（#0127-17-9
Difco Laboratories, MI, USA）４０ｇ；硫酸マグネシウム（#5886 Merck, Dar
mstadt, Germany)１．３ｇ；Glucidex 12 (Roquette Feres, France)５０ｇ；リ
ン酸二水素ナトリウム（#6346 Merck, Darmstadt, Germany)２０ｇ；ＥＤＦ−微
量金属（処方は下記参照）６．７ml；Ｎａ2 ＭｏＯ4 −微量金属（処方は下記参
照）６．７ml；Pluronic PE6100 (BASF, Germany）０．１ml；イオン交換水で１
０００mlに調整。全てを混合し、容量を調整し、pHを測定し、そしてＮａＯＨを
用いてpH６．０に調整する。培地を１２１℃で２０分オートクレーブにかけるこ
とにより滅菌する。ＥＤＦ−微量金属（１ｌ）：硫酸マンガン（II）（#5963 Me
rck, Darmstadt, Germany)４．４８ｇ；塩化鉄（III)（#3943 Merck, Darmstadt
, Germany)３．３３ｇ；硫酸銅（II）（#2790 Merck, Darmstadt, Germany)０．
６２５ｇ；硫酸亜鉛（#8883 Merck, Darmstadt, Germany)７．１２ｇ；イオン交
換水で１０００mlに調整。全てを混合し、容量を調整する。溶液をフィルター除
菌し、そして４℃で保存する。Ｎａ2 ＭｏＯ4 −微量金属（１ｌ）：モリブデン
酸ナトリウム（#6521 Merck, Darmstadt, Germany)２．０ｇ；イオン交換水で１
０００mlに調整。全てを混合し、容量を調整する。溶液をフィルター除菌し、そ
して４℃で保存する。
. John Wiley and Sons, 1995に記載）。ＬＢアガー（Ausubel. F.M.ら (eds.)
“Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995に
記載）。ＬＢＰＧは０．５％のグルコース及び０．０５Ｍのリン酸カリウム、pH
７．０の入ったＬＢアガー。ＢＰＸ培地はＥＰ ０５０６ ７８０（ＷＯ９１／
０９１２９）に記載。ＣＡＬ １８−２培地（１ｌ）：酵母エキス（#0127-17-9
Difco Laboratories, MI, USA）４０ｇ；硫酸マグネシウム（#5886 Merck, Dar
mstadt, Germany)１．３ｇ；Glucidex 12 (Roquette Feres, France)５０ｇ；リ
ン酸二水素ナトリウム（#6346 Merck, Darmstadt, Germany)２０ｇ；ＥＤＦ−微
量金属（処方は下記参照）６．７ml；Ｎａ2 ＭｏＯ4 −微量金属（処方は下記参
照）６．７ml；Pluronic PE6100 (BASF, Germany）０．１ml；イオン交換水で１
０００mlに調整。全てを混合し、容量を調整し、pHを測定し、そしてＮａＯＨを
用いてpH６．０に調整する。培地を１２１℃で２０分オートクレーブにかけるこ
とにより滅菌する。ＥＤＦ−微量金属（１ｌ）：硫酸マンガン（II）（#5963 Me
rck, Darmstadt, Germany)４．４８ｇ；塩化鉄（III)（#3943 Merck, Darmstadt
, Germany)３．３３ｇ；硫酸銅（II）（#2790 Merck, Darmstadt, Germany)０．
６２５ｇ；硫酸亜鉛（#8883 Merck, Darmstadt, Germany)７．１２ｇ；イオン交
換水で１０００mlに調整。全てを混合し、容量を調整する。溶液をフィルター除
菌し、そして４℃で保存する。Ｎａ2 ＭｏＯ4 −微量金属（１ｌ）：モリブデン
酸ナトリウム（#6521 Merck, Darmstadt, Germany)２．０ｇ；イオン交換水で１
０００mlに調整。全てを混合し、容量を調整する。溶液をフィルター除菌し、そ
して４℃で保存する。
【００９２】
アルファ−アミラーゼ活性のアッセイ
アルファ−アミラーゼ活性は４，６−エチリデン（Ｇ7 ）−ｐ−ニトロフェニ
ル（Ｇ1 ）−ａ，Ｄ−マルトヘプタオシド（エチリデン−Ｇ7 ＰＮＰ）を基質と
して用いる酵素比色試験を採用する方法により決定した（Boehringer Mannheim,
Germany art. 1442309)。特定のセットの条件下で（温度、pH、反応時間、バッ
ファー条件）、１mgの所定のアルファ−アミラーゼは所定量の基質を加水分解し
、そして黄色が発色するであろう。色強度を４０５nmで測定する。測定した吸収
は所定の条件セット下で注目のアルファ−アミラーゼの活性に正比例する。
ル（Ｇ1 ）−ａ，Ｄ−マルトヘプタオシド（エチリデン−Ｇ7 ＰＮＰ）を基質と
して用いる酵素比色試験を採用する方法により決定した（Boehringer Mannheim,
Germany art. 1442309)。特定のセットの条件下で（温度、pH、反応時間、バッ
ファー条件）、１mgの所定のアルファ−アミラーゼは所定量の基質を加水分解し
、そして黄色が発色するであろう。色強度を４０５nmで測定する。測定した吸収
は所定の条件セット下で注目のアルファ−アミラーゼの活性に正比例する。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮｏｖｅｘ（Novex, San Diego）勾配トリシン１０−２０
％ゲル上で、記載の変性及び還元条件下で実施した（ＳｖＨ）。タンパク質バン
ドをＨｏｅｆｅｒブロッティングモジュール中のニトロセルロース上にブロッテ
ィングした。ペクチン酸リアーゼ−インスリン融合体のイムノブロッティングの
場合、Ivan Svendsen, Cell Technologyで製造したモノクローナル抗体Ｆ１９を
一次抗体として用い、ペルオキシダーゼにカップリングしたウサギ抗ネズミ抗体
（Dako Immunogloblins, Copenhagen, Denmark)を二次抗体として用いた。
％ゲル上で、記載の変性及び還元条件下で実施した（ＳｖＨ）。タンパク質バン
ドをＨｏｅｆｅｒブロッティングモジュール中のニトロセルロース上にブロッテ
ィングした。ペクチン酸リアーゼ−インスリン融合体のイムノブロッティングの
場合、Ivan Svendsen, Cell Technologyで製造したモノクローナル抗体Ｆ１９を
一次抗体として用い、ペルオキシダーゼにカップリングしたウサギ抗ネズミ抗体
（Dako Immunogloblins, Copenhagen, Denmark)を二次抗体として用いた。
【００９４】
ペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ−１のイムノブロッティングはPia Kirschhoff B
orre, Cell Technology で製造された一次モノクローナル抗体ａＧＬＰ２６．１
で対応して実施した。ペルオキシダーゼラベル化二次抗体の結合は３−アミノ−
９−エチルカルバゾールと反応により識別化させた。
orre, Cell Technology で製造された一次モノクローナル抗体ａＧＬＰ２６．１
で対応して実施した。ペルオキシダーゼラベル化二次抗体の結合は３−アミノ−
９−エチルカルバゾールと反応により識別化させた。
【００９５】
実施例１
ペクチン酸リアーゼとＪＰ１７０アルファ−アミラーゼとの融合タンパク質の構
築及び発現 ＪＰ１７０アルファ−アミラーゼコードＤＮＡ配列（引用することで本明細書
に組入れるＷＯ９５／２６３９７として公開された国際特許出願）を次のオリゴ
ヌクレオチドから成るＰＣＲプライマーセットを利用してＰＣＲ増幅した：
築及び発現 ＪＰ１７０アルファ−アミラーゼコードＤＮＡ配列（引用することで本明細書
に組入れるＷＯ９５／２６３９７として公開された国際特許出願）を次のオリゴ
ヌクレオチドから成るＰＣＲプライマーセットを利用してＰＣＲ増幅した：
【化５】
制限部位ＳａｌＩ及びＮｈｅＩに下線を付した。最終構築体において、Ｎｈｅ
Ｉ部位をペクチン酸リアーゼ遺伝子の最後のコドンの右隣に挿入する。
Ｉ部位をペクチン酸リアーゼ遺伝子の最後のコドンの右隣に挿入する。
【００９６】
ＪＰ１７０アルファ−アミラーゼをコードするプラスミドＤＮＡサンプル（ｐ
ＭＯＬ９４４）をＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を利
用し、製造者の仕様に従ってＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は２０
０μＭづつの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Perkin
-Elmer, Cetus, USA）及び１００pmolの各プライマーを含むＰＣＲバッファー（
１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mMのＫＣｌ、１．５mMのＭｇＣｌ2
、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）の中で用意した。
ＭＯＬ９４４）をＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を利
用し、製造者の仕様に従ってＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は２０
０μＭづつの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Perkin
-Elmer, Cetus, USA）及び１００pmolの各プライマーを含むＰＣＲバッファー（
１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mMのＫＣｌ、１．５mMのＭｇＣｌ2
、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）の中で用意した。
【００９７】
ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー（MJ Research, PCT-200）を用いて実
施した。９４℃で１分のインキュベーションに、９４℃で３０秒の変性、６０℃
で１分のアニーリング及び７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを利用す
る３０サイクルのＰＣＲを後続させた。増幅生成物のアリコート５μｌを０．７
％のアガロースゲル（NuSieve, FMC)での電気泳動により分析した。約１．６kb
のサイズのＤＮＡフラグメントの出現はこの遺伝子セグメントの適正な増幅を示
唆する。
施した。９４℃で１分のインキュベーションに、９４℃で３０秒の変性、６０℃
で１分のアニーリング及び７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを利用す
る３０サイクルのＰＣＲを後続させた。増幅生成物のアリコート５μｌを０．７
％のアガロースゲル（NuSieve, FMC)での電気泳動により分析した。約１．６kb
のサイズのＤＮＡフラグメントの出現はこの遺伝子セグメントの適正な増幅を示
唆する。
【００９８】
ＰＣＲフラグメントのサブクローニング
ＪＰ１７０をコードする精製ＰＣＲフラグメント及び上述のｐＭＢ５４１プラ
スミドをＳａｌＩ及びＮａｔＩで消化し、そして１６３９bpのＪＰ１７０フラグ
メント及び５７２２bpのｐＭＢ５４１ベクターフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Qiagen, Germany)を用いてアガロー
スゲルから精製した。精製後、２本のフラグメントを１６℃で１６時間かけて、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びバッファー系（Biolab, UK）を用いてライゲーション
した。このライゲーション反応はコンピテントＰＬ１８０１を形質転換するため
に用い、そしてこの細胞を１０mgのカナマイシンの入ったＬＢアガープレート上
にプレートした。一夜培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離することによって
いくつかのクローンを分析した。
スミドをＳａｌＩ及びＮａｔＩで消化し、そして１６３９bpのＪＰ１７０フラグ
メント及び５７２２bpのｐＭＢ５４１ベクターフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Qiagen, Germany)を用いてアガロー
スゲルから精製した。精製後、２本のフラグメントを１６℃で１６時間かけて、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びバッファー系（Biolab, UK）を用いてライゲーション
した。このライゲーション反応はコンピテントＰＬ１８０１を形質転換するため
に用い、そしてこの細胞を１０mgのカナマイシンの入ったＬＢアガープレート上
にプレートした。一夜培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離することによって
いくつかのクローンを分析した。
【００９９】
一のかかる陽性クローンを上記で用いた１０mg／mlのカナマイシンの入ったア
ガープレート上に数回再ストリーキングし、そしてそのクローンをＭＯＬ１５７
８として保存した。このクローンＭＯＬ１５７８をＴＹ−１０μｇのカナマイシ
ンの中で３７℃で一夜増殖させ、そして翌日１mlの細胞を用い、Ｑｉａｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＃２７１０６を利用
し、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製に関する製造者の推奨に従い、その細胞か
らプラスミドを単離した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決定し、そしてペクチン
酸リアーゼ−ＪＰ１７０の融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を示した。この
プラスミドをｐＭＯＬ１５７８と命名した。ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０を
コードするＯＲＦの全ＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に示し、そして誘
導タンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２に示す。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
２において、アミノ酸は次の起源及び特徴を有する：
ガープレート上に数回再ストリーキングし、そしてそのクローンをＭＯＬ１５７
８として保存した。このクローンＭＯＬ１５７８をＴＹ−１０μｇのカナマイシ
ンの中で３７℃で一夜増殖させ、そして翌日１mlの細胞を用い、Ｑｉａｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＃２７１０６を利用
し、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製に関する製造者の推奨に従い、その細胞か
らプラスミドを単離した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決定し、そしてペクチン
酸リアーゼ−ＪＰ１７０の融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を示した。この
プラスミドをｐＭＯＬ１５７８と命名した。ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０を
コードするＯＲＦの全ＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に示し、そして誘
導タンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２に示す。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
２において、アミノ酸は次の起源及び特徴を有する：
【０１００】
ａ．ａ．１〜２９：Ｂ．リシェニホルミス由来のａｍｙＬのシグナルペプチド
ａ．ａ．３０〜３４３：Ｂ．リシェニホルミス由来のペクチン酸リアーゼ
ａ．ａ．３４４〜３４５：クローニング部位ＮｈｅＩ由来の２個のアミノ酸
ａ．ａ．３４６〜３４９：ＩＥＧＲリンカー
ａ．ａ．３５０〜８３４：ＪＰ１７０アミラーゼ
【０１０１】
ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０融合タンパク質の発現及び検出
ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０ハイブリドをコードするＭＯＬ１５７８並び
にＪＰ１７０をコードするＭＯＬ９４４及びペクチン酸リアーゼをコードするＭ
Ｂ５４１の２つの対照株をＢＰＸ−培地の中で３０℃で３００rpm にて５日間イ
ンキュベーションした。１００mlの無細胞上清液を１００mlのＳＤＳ装填バッフ
ァーと混合し、そして２５μｌを４−２０％のＬａｅｍｍｌｉ Ｔｒｉｓ−グリ
シン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＮＯ：ＶＥＸゲル（Novex, USA）に載せた。これらの
サンプルをＸｃｅｌｌTM Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（NO: VEX, USA）で製造者の推奨
に従い電気泳動した。クマジーによる染色、脱色及び乾燥を包含するゲルのその
後の取扱いは全て製造者により記述の通りにして実施した。
にＪＰ１７０をコードするＭＯＬ９４４及びペクチン酸リアーゼをコードするＭ
Ｂ５４１の２つの対照株をＢＰＸ−培地の中で３０℃で３００rpm にて５日間イ
ンキュベーションした。１００mlの無細胞上清液を１００mlのＳＤＳ装填バッフ
ァーと混合し、そして２５μｌを４−２０％のＬａｅｍｍｌｉ Ｔｒｉｓ−グリ
シン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＮＯ：ＶＥＸゲル（Novex, USA）に載せた。これらの
サンプルをＸｃｅｌｌTM Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（NO: VEX, USA）で製造者の推奨
に従い電気泳動した。クマジーによる染色、脱色及び乾燥を包含するゲルのその
後の取扱いは全て製造者により記述の通りにして実施した。
【０１０２】
約９０kDa のタンパク質バンドの出現は、プラスミドｐＭＯＬ１５７８上でコ
ードされるペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０のＢ．スブチリス内での発現を示唆
する。しかしながら、ゲル上の主要バンドは２つのコア酵素、ペクチン酸リアー
ゼ（３５kDa)及びＪＰ１７０アミラーゼ（５５kDa)のそれぞれに相当し、融合タ
ンパク質が転移の最中又はその直後にプロセシングされることを示唆する。
ードされるペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０のＢ．スブチリス内での発現を示唆
する。しかしながら、ゲル上の主要バンドは２つのコア酵素、ペクチン酸リアー
ゼ（３５kDa)及びＪＰ１７０アミラーゼ（５５kDa)のそれぞれに相当し、融合タ
ンパク質が転移の最中又はその直後にプロセシングされることを示唆する。
【０１０３】
３つの株、ＭＯＬ１５７８，ＭＯＬ９４４及びＭＢ５４１の各々由来のサンプ
ルを上記の手順に従ってアルファ−アミラーゼについて分析し、ＪＰ１７０の収
率を決定した。表１は、ＪＰ１７０のみをコードするＭＯＬ９４４株と比較した
際の、ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０融合体を有するＭＯＬ１５７８株におけ
るアミラーゼ収率の２．２倍の有意な上昇を示す。まとめると、ペクチン酸リア
ーゼはＪＰ１７０アミラーゼの如き大型酵素のための分泌増強因子として利用で
きうることが明らかとなった。表１ 株 酵素 単位 ＭＯＬ９４４ａ ＪＰ１７０ ０．９３ ＭＯＬ９４４ｂ ＪＰ１７０ １．２６ ＭＯＬ１５７８ａ ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０ ２．３２ ＭＯＬ１５７８ｂ ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０ ２．５２ ＭＢ５４１ａ ペクチン酸リアーゼ ０．１ ＭＢ５４１ｂ ペクチン酸リアーゼ ０．１
ルを上記の手順に従ってアルファ−アミラーゼについて分析し、ＪＰ１７０の収
率を決定した。表１は、ＪＰ１７０のみをコードするＭＯＬ９４４株と比較した
際の、ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０融合体を有するＭＯＬ１５７８株におけ
るアミラーゼ収率の２．２倍の有意な上昇を示す。まとめると、ペクチン酸リア
ーゼはＪＰ１７０アミラーゼの如き大型酵素のための分泌増強因子として利用で
きうることが明らかとなった。表１ 株 酵素 単位 ＭＯＬ９４４ａ ＪＰ１７０ ０．９３ ＭＯＬ９４４ｂ ＪＰ１７０ １．２６ ＭＯＬ１５７８ａ ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０ ２．３２ ＭＯＬ１５７８ｂ ペクチン酸リアーゼ−ＪＰ１７０ ２．５２ ＭＢ５４１ａ ペクチン酸リアーゼ ０．１ ＭＢ５４１ｂ ペクチン酸リアーゼ ０．１
【０１０４】
実施例２
ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ−１との融合タンパク質の構築及び発現
ヒトＧＬＰ−１ホルモンは２型糖尿病の血糖値を正常化する（ＷＯ９５１７５
１０−Ａ１）。ＧＬＰ−１（７−３７）類似体は長さ３１アミノ酸であり、そし
て酵母での伝統的な技術によっては作りにくい（Egel-Mitani ら（印刷中）Yiel
d improvement of various heterologous peptides expressed in YPS1-disrupt
ed Saccharomyces cerevisiae strains）。
１０−Ａ１）。ＧＬＰ−１（７−３７）類似体は長さ３１アミノ酸であり、そし
て酵母での伝統的な技術によっては作りにくい（Egel-Mitani ら（印刷中）Yiel
d improvement of various heterologous peptides expressed in YPS1-disrupt
ed Saccharomyces cerevisiae strains）。
【０１０５】
ＧＬＰ−１遺伝子を下記の重複プライマーセットを用いて増幅させた。特異的
なＫｅｘ２認識部位Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）をコードするＤＮＡ配列をＧＬＰ−
１（７−３７）の第一コドンのすぐ上流に挿入し、ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ
−１（７−３７）との間の特異的な切断を可能にした（Ｋｅｘ２については、例
えばLedgerwood. ら（1995) Biochemical Journal, Vol. 308 (1) pp. 321-325
又はGhosh, S.ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2) pp. 249-255 参照
のこと）。次の２つのプライマーをＧＬＰ−１（７−３７）−Ｋｅｘ２配列の増
幅のために用いた：
なＫｅｘ２認識部位Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）をコードするＤＮＡ配列をＧＬＰ−
１（７−３７）の第一コドンのすぐ上流に挿入し、ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ
−１（７−３７）との間の特異的な切断を可能にした（Ｋｅｘ２については、例
えばLedgerwood. ら（1995) Biochemical Journal, Vol. 308 (1) pp. 321-325
又はGhosh, S.ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2) pp. 249-255 参照
のこと）。次の２つのプライマーをＧＬＰ−１（７−３７）−Ｋｅｘ２配列の増
幅のために用いた：
【化６】
【０１０６】
重複伸長反応は２００μＭづつの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ
ポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）及び１００pmolづつの各プライマー
を含むＰＣＲバッファー（１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mMのＫＣ
ｌ、１．５mMのＭｇＣｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）の中で用意した
。
ポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）及び１００pmolづつの各プライマー
を含むＰＣＲバッファー（１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mMのＫＣ
ｌ、１．５mMのＭｇＣｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）の中で用意した
。
【０１０７】
重複伸長反応はＤＮＡサーマルサイクラー（MJ Research, PCT-200）を用いて
実施した。９４℃で１分の１回のインキュベーションに、５５℃で１分のアニー
リング及び７２℃で０．５分の伸長のサイクルプロフィールを利用する１５回の
サイクルを後続させた。増幅生成物のアリコート５μｌを２．０％アガロースゲ
ル（NuSieve FMC)での電気泳動により分析した。１２９bpのサイズのＤＮＡフラ
グメントの出現は適正な増幅を示唆する。
実施した。９４℃で１分の１回のインキュベーションに、５５℃で１分のアニー
リング及び７２℃で０．５分の伸長のサイクルプロフィールを利用する１５回の
サイクルを後続させた。増幅生成物のアリコート５μｌを２．０％アガロースゲ
ル（NuSieve FMC)での電気泳動により分析した。１２９bpのサイズのＤＮＡフラ
グメントの出現は適正な増幅を示唆する。
【０１０８】
ＧＬＰ−１フラグメントのサブクローニング
ＧＬＰ−１（７−３７）配列をイン・フレームでクローニングして融合構築体
を作るためにｐＭＯＬ１５７８プラスミドをベクターとして用いた。ＧＬＰ−１
（７−３７）フラグメント及びｐＭＯＬ１５７８ベクターをＮｈｅＩ及びＥａｇ
Ｉで消化した。１１９bpのＧＬＰ−１（７−３７）及び５７７９bpのベクターフ
ラグメントをｐＭＯＬ１５７８構築体について説明した通りにして精製及びクロ
ーニングした。
を作るためにｐＭＯＬ１５７８プラスミドをベクターとして用いた。ＧＬＰ−１
（７−３７）フラグメント及びｐＭＯＬ１５７８ベクターをＮｈｅＩ及びＥａｇ
Ｉで消化した。１１９bpのＧＬＰ−１（７−３７）及び５７７９bpのベクターフ
ラグメントをｐＭＯＬ１５７８構築体について説明した通りにして精製及びクロ
ーニングした。
【０１０９】
一のかかる陽性ＰＬ１８０１形質転換クローンを上記で用いた１０mg／mlのカ
ナマイシンの入ったアガープレート上に数回再ストリーキングし、そしてそのク
ローンをＭＯＬ１６３５として保存した。このクローンＭＯＬ１６３５をＴＹ−
１０μｇのカナマイシンの中で３７℃で一夜増殖させ、そして翌日１mlの細胞を
用い、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ
＃２７１０６を利用し、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製に関する製造者の推
奨に従い、その細胞からプラスミドを単離した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決
定し、そしてペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ−１（７−３７）の融合タンパク質に
対応するＤＮＡ配列を示した。このプラスミドをｐＭＯＬ１６２１と命名した。 ペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ−１（７−３７）をコードするＯＲＦの全ＤＮＡ
配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３に示し、そして誘導タンパク質配列はＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１４に示す。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４において、アミノ酸は次の
起源及び特徴を有する：
ナマイシンの入ったアガープレート上に数回再ストリーキングし、そしてそのク
ローンをＭＯＬ１６３５として保存した。このクローンＭＯＬ１６３５をＴＹ−
１０μｇのカナマイシンの中で３７℃で一夜増殖させ、そして翌日１mlの細胞を
用い、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ
＃２７１０６を利用し、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製に関する製造者の推
奨に従い、その細胞からプラスミドを単離した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決
定し、そしてペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ−１（７−３７）の融合タンパク質に
対応するＤＮＡ配列を示した。このプラスミドをｐＭＯＬ１６２１と命名した。 ペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ−１（７−３７）をコードするＯＲＦの全ＤＮＡ
配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３に示し、そして誘導タンパク質配列はＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１４に示す。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４において、アミノ酸は次の
起源及び特徴を有する：
【０１１０】
ａ．ａ．１〜２９：Ｂ．リシェニホルミス由来のａｍｙＬのシグナルペプチド
ａ．ａ．３０〜３４３：Ｂ．リシェニホルミス由来のペクチン酸リアーゼ
ａ．ａ．３４４〜３４５：クローニング部位ＮｈｅＩ由来の２個のアミノ酸
ａ．ａ．３４６〜３４７：Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼプロセシング部位
ａ．ａ．３４８〜３７８：ヒトＧＬＰ−１（７−３７）配列
【０１１１】
ペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ−１（７−３７）融合タンパク質の発現及び検出
弱プロテアーゼバチルス・スブチリス株ＷＢ６００ａｓｎを形質転換するのに
プラスミドｐＭＯＬ１６２１を用いた。ｐＭＯＬ１６２１を有するＷＢ６００ａ
ｓｎの一のかかる株をＭＯＬ１６３６と命名した。この株を１０μｇ／mlのカナ
マイシンを有する培地Ｃａｌ１８−２の中で培養し、２個のバッフルの備った５
００mlの振盪フラスコの中で培地１００mlに１０8 個の細胞を接種し、そして３
７℃、３００rpm で２４時間インキュベーションした。サンプルを採取し、培養
ブロスを遠心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして慣用のウェスタンブ
ロッティングにより分析した（図１及び２参照）。
プラスミドｐＭＯＬ１６２１を用いた。ｐＭＯＬ１６２１を有するＷＢ６００ａ
ｓｎの一のかかる株をＭＯＬ１６３６と命名した。この株を１０μｇ／mlのカナ
マイシンを有する培地Ｃａｌ１８−２の中で培養し、２個のバッフルの備った５
００mlの振盪フラスコの中で培地１００mlに１０8 個の細胞を接種し、そして３
７℃、３００rpm で２４時間インキュベーションした。サンプルを採取し、培養
ブロスを遠心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして慣用のウェスタンブ
ロッティングにより分析した（図１及び２参照）。
【０１１２】
実施例３
ＰＥＰＴリンカーを含むペクチン酸リアーゼとＧＬＰ−１との融合タンパク質の
構築及び発現 ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ−１（７−３７）との間の領域でのタンパク質分
解攻撃を回避するため、安定なリンカー領域を挿入した。選定のリンカー配列は
特許ＷＯ９９／０１５４３において報告されているＰＥＰＴモチーフとした。こ
のリンカーは特許されたセルラーゼの中の母体酵素とＣＢＤ（セルラーゼ結合ド
メイン）との間に存在し、そして本発明においては、ＰＥＰＴリンカーはバチル
ス・スブチリスにおけるタンパク質分解に対して安定なものにすることが証明さ
れた。
構築及び発現 ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ−１（７−３７）との間の領域でのタンパク質分
解攻撃を回避するため、安定なリンカー領域を挿入した。選定のリンカー配列は
特許ＷＯ９９／０１５４３において報告されているＰＥＰＴモチーフとした。こ
のリンカーは特許されたセルラーゼの中の母体酵素とＣＢＤ（セルラーゼ結合ド
メイン）との間に存在し、そして本発明においては、ＰＥＰＴリンカーはバチル
ス・スブチリスにおけるタンパク質分解に対して安定なものにすることが証明さ
れた。
【０１１３】
ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ−１との間の適正な間隔を確保するため、このモ
チーフはＰＥＰＴＰＥＰＴ（２×（ＰＥＰＴ））として２回反復させた。特異的
なＫｅｘ２認識部位Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）をコードするＤＮＡ配列をＧＬＰ−
１（７−３７）の第一コドンのすぐ上流に挿入し、精製後のペクチン酸リアーゼ
とＧＬＰ−１（７−３７）との間での特異的な切断を可能にした（Ｋｅｘ２につ
いては、例えばLedgerwood. ら (1995) Biochemical Journal, Vol. 308 (1) pp
. 321-325 、又はGhosh, S. ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2) pp.
249-255を参照のこと）。
チーフはＰＥＰＴＰＥＰＴ（２×（ＰＥＰＴ））として２回反復させた。特異的
なＫｅｘ２認識部位Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）をコードするＤＮＡ配列をＧＬＰ−
１（７−３７）の第一コドンのすぐ上流に挿入し、精製後のペクチン酸リアーゼ
とＧＬＰ−１（７−３７）との間での特異的な切断を可能にした（Ｋｅｘ２につ
いては、例えばLedgerwood. ら (1995) Biochemical Journal, Vol. 308 (1) pp
. 321-325 、又はGhosh, S. ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2) pp.
249-255を参照のこと）。
【０１１４】
２通りの独立のＰＣＲ反応を鋳型としてｐＭＯＬ１６２１を用いて実施した。
ＰＣＲ条件は実施例１に記載の通りにして実施した。２本のプライマーペアーの
配列は次の通りである：
ＰＣＲ条件は実施例１に記載の通りにして実施した。２本のプライマーペアーの
配列は次の通りである：
【化７】
【０１１５】
２通りのＰＣＲ反応体をＱｉａｇｅｎカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製
キット＃２８１０６）を用い、２２０bp及び４００bpフラグメントとして用いた
。ＳＯＥ（配列重複伸長）反応を１０ngづつのフラグメントを用い、上記のＰＣ
Ｒ条件において用意した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分のインキュベーショ
ン１回、それに続く９４℃で１０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び
７２℃で２分の伸長といったサイクルプロフィール１０サイクルで実施した。１
００pmolの隣接プライマー１４２６７０フォワード（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６
）及び１０１４５０リバース（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４）をこの反応体に加え
、そしてＰＣＲサイクルを更に２０サイクル続けた。５μｌの増幅生成物を２．
０％のアガロースゲル（NuSieve, FMC）での電気泳動により分析した。６００bp
のサイズのＤＮＡフラグメントの出現は適正な増幅を示唆する。
キット＃２８１０６）を用い、２２０bp及び４００bpフラグメントとして用いた
。ＳＯＥ（配列重複伸長）反応を１０ngづつのフラグメントを用い、上記のＰＣ
Ｒ条件において用意した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分のインキュベーショ
ン１回、それに続く９４℃で１０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び
７２℃で２分の伸長といったサイクルプロフィール１０サイクルで実施した。１
００pmolの隣接プライマー１４２６７０フォワード（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６
）及び１０１４５０リバース（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４）をこの反応体に加え
、そしてＰＣＲサイクルを更に２０サイクル続けた。５μｌの増幅生成物を２．
０％のアガロースゲル（NuSieve, FMC）での電気泳動により分析した。６００bp
のサイズのＤＮＡフラグメントの出現は適正な増幅を示唆する。
【０１１６】
ＧＬＰ１フラグメントのサブクローニング
融合タンパク質を作るため、ｐＭＯＬ１５７８プラスミドを上記の２×（ＰＥ
ＰＴ）−ＧＬＰ−１（７−３７）遺伝子をイン・フレームでクローニングするベ
クターとして用いた。ＰＥＰＴ−ＧＬＰ−１（７−３７）配列を担持する６００
bpのＰＣＲフラグメント及びｐＭＯＬ１５７８ベクターをＮｈｅＩ及びＥａｇＩ
で消化した。１３７bpのＰＥＰＴ−ＧＬＰ−１（７−３７）フラグメント及び５
７７９bpのベクターフラグメントをｐＭＯＬ１５７８構築体について説明の通り
にして精製してクローニングした。
ＰＴ）−ＧＬＰ−１（７−３７）遺伝子をイン・フレームでクローニングするベ
クターとして用いた。ＰＥＰＴ−ＧＬＰ−１（７−３７）配列を担持する６００
bpのＰＣＲフラグメント及びｐＭＯＬ１５７８ベクターをＮｈｅＩ及びＥａｇＩ
で消化した。１３７bpのＰＥＰＴ−ＧＬＰ−１（７−３７）フラグメント及び５
７７９bpのベクターフラグメントをｐＭＯＬ１５７８構築体について説明の通り
にして精製してクローニングした。
【０１１７】
一の陽性ＷＢ６００ａｓｎ形質転換クローンを上記で用いた１０mg／mlのカナ
マイシンの入ったアガープレート上に数回再ストリーキングし、そしてそのクロ
ーンをＭＯＬ１６９８として保存した。このクローンＭＯＬ１６９８をＴＹ−１
０μｇのカナマイシンの中で３７℃で一夜増殖させ、そして翌日１mlの細胞を用
い、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ
＃２７１０６を利用し、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製に関する製造者の推奨
に従い、その細胞からプラスミドを単離した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決定
し、そしてペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ１の融合タンパク質に対応するＤＮＡ配
列を示した。このプラスミドをｐＭＯＬ１６９８と命名した。 ペクチン酸リアーゼ−リンカーをコードするＯＲＦの全ＤＮＡ配列をＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１５に示し、そして誘導タンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
６に示す。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６において、アミノ酸は次の起源及び特徴を
有する：
マイシンの入ったアガープレート上に数回再ストリーキングし、そしてそのクロ
ーンをＭＯＬ１６９８として保存した。このクローンＭＯＬ１６９８をＴＹ−１
０μｇのカナマイシンの中で３７℃で一夜増殖させ、そして翌日１mlの細胞を用
い、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ
＃２７１０６を利用し、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製に関する製造者の推奨
に従い、その細胞からプラスミドを単離した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決定
し、そしてペクチン酸リアーゼ−ＧＬＰ１の融合タンパク質に対応するＤＮＡ配
列を示した。このプラスミドをｐＭＯＬ１６９８と命名した。 ペクチン酸リアーゼ−リンカーをコードするＯＲＦの全ＤＮＡ配列をＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１５に示し、そして誘導タンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
６に示す。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６において、アミノ酸は次の起源及び特徴を
有する：
【０１１８】
ａ．ａ．１〜２９：Ｂ．リシェニホルミス由来のａｍｙＬのシグナルペプチド
ａ．ａ．３０〜３４３：Ｂ．リシェニホルミス由来のペクチン酸リアーゼ
ａ．ａ．３４４〜３４５：クローニング部位ＮｈｅＩ由来の２個のアミノ酸
ａ．ａ．３４６〜３５３：ＰＥＰＴＰＥＰＴリンカー
ａ．ａ．３５４〜３５５：Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼプロセシング部位
ａ．ａ．３５６〜３８６：ヒトＧＬＰ−１（７−３７）配列
【０１１９】
ペクチン酸リアーゼ−リンカー−ＧＬＰ−１（７−３７）融合タンパク質の発現
及び検出 ペクチン酸リアーゼハイブリドをコードするＭＯＬ１６９８を１０μｇ／mlの
カナマイシンの入ったＣａｌ１８−２培地の中で培養した。２個のバッフルの備
った５００mlの振盪フラスコの中で、１００mlの培地に約１０8 個の細胞を接種
し、そして３７℃、３００rpm で２４時間インキュベーションした。サンプルを
採取し、培養ブロスを遠心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして慣用の
ウェスタンブロッティングにより分析し、そして２５μｌを４−２０％のＬａｅ
ｍｍｌｉ Ｔｒｉｓ−グリシン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＮＯ：ＶＥＸゲル（Novex,
USA）に載せた。そのサンプルをＸｃｅｌｌTM Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（NO: VEX,
USA）で製造者の推奨に従い電気泳動し、クマジーによる染色、脱色及び乾燥を
含むゲルのその後の取扱いは全て製造者の推奨通りに実施した（図３参照）。
及び検出 ペクチン酸リアーゼハイブリドをコードするＭＯＬ１６９８を１０μｇ／mlの
カナマイシンの入ったＣａｌ１８−２培地の中で培養した。２個のバッフルの備
った５００mlの振盪フラスコの中で、１００mlの培地に約１０8 個の細胞を接種
し、そして３７℃、３００rpm で２４時間インキュベーションした。サンプルを
採取し、培養ブロスを遠心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして慣用の
ウェスタンブロッティングにより分析し、そして２５μｌを４−２０％のＬａｅ
ｍｍｌｉ Ｔｒｉｓ−グリシン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＮＯ：ＶＥＸゲル（Novex,
USA）に載せた。そのサンプルをＸｃｅｌｌTM Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（NO: VEX,
USA）で製造者の推奨に従い電気泳動し、クマジーによる染色、脱色及び乾燥を
含むゲルのその後の取扱いは全て製造者の推奨通りに実施した（図３参照）。
【０１２０】
実施例４
ペクチン酸リアーゼと一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）との融合タンパク質の構
築及び発現 ヒトインスリンＭＩ３をコードするＤＮＡ配列を配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
８により特定するこのタンパク質の逆転写から誘導した。このタンパク質配列を
カバーする一の特許出願についてはＷＯ９５／３４６６６を参照のこと。このＤ
ＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に記載のペクチン酸リアーゼにおいて見い出
せるコドン用法に近づいたコドン用法のために最適化した。これはＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１８に見い出せるＭＩ３分子をコードするコドンとして、ペクチン酸リ
アーゼＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の最も好適なコドンを利用することにより簡単に
成し遂げられる。この実験のための好適なＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
７に示す。
築及び発現 ヒトインスリンＭＩ３をコードするＤＮＡ配列を配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
８により特定するこのタンパク質の逆転写から誘導した。このタンパク質配列を
カバーする一の特許出願についてはＷＯ９５／３４６６６を参照のこと。このＤ
ＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に記載のペクチン酸リアーゼにおいて見い出
せるコドン用法に近づいたコドン用法のために最適化した。これはＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１８に見い出せるＭＩ３分子をコードするコドンとして、ペクチン酸リ
アーゼＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の最も好適なコドンを利用することにより簡単に
成し遂げられる。この実験のための好適なＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
７に示す。
【０１２１】
ペクチン酸リアーゼとＭＩ３との間にフレキシブル領域（リンカー）を設ける
ため、我々はＰＥＰＴ反復から成るリンカーを用いた。詳しくは、この実験のた
めに我々はこのＰＥＰＴの２回の反復を利用した。ここでも、コドンはペクチン
酸リアーゼのコドン用法に近づけるために最適化した。
ため、我々はＰＥＰＴ反復から成るリンカーを用いた。詳しくは、この実験のた
めに我々はこのＰＥＰＴの２回の反復を利用した。ここでも、コドンはペクチン
酸リアーゼのコドン用法に近づけるために最適化した。
【０１２２】
培養細胞の上清液から融合タンパク質を精製してからペクチン酸リアーゼから
ＭＩ３を切断する可能性を得るため、Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼプロセシング
部位をリンカーの直後、且つＭＩ３タンパク質の前に導入した（Ｋｅｘ２につい
ては、例えばLedgerwood. ら (1995) Biochemical Journal, Vol. 308 (1) pp.
321-325 、又はGhosh, S. ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2) pp. 2
49-255を参照のこと）。ここで用いたＫｅｘ２部位はＬｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）で
ある。
ＭＩ３を切断する可能性を得るため、Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼプロセシング
部位をリンカーの直後、且つＭＩ３タンパク質の前に導入した（Ｋｅｘ２につい
ては、例えばLedgerwood. ら (1995) Biochemical Journal, Vol. 308 (1) pp.
321-325 、又はGhosh, S. ら (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176 (1-2) pp. 2
49-255を参照のこと）。ここで用いたＫｅｘ２部位はＬｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）で
ある。
【０１２３】
ペクチン酸リアーゼ−リンカー−Ｋｅｘ−ＭＩ３をコードするプラスミドの構
築は下記の通りに実施した： ２種類の重複オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ反応において互いと一緒に用いた
とき、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７の配列、リンカーコード配列、プロテアーゼ切
断部位コード配列、及びＤＮＡフラグメントのサブクローニングのために必要な
２つの制限エンドヌクレアーゼ部位から主として成るＤＮＡフラグメントの形成
をもたらすように設計した。
築は下記の通りに実施した： ２種類の重複オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ反応において互いと一緒に用いた
とき、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７の配列、リンカーコード配列、プロテアーゼ切
断部位コード配列、及びＤＮＡフラグメントのサブクローニングのために必要な
２つの制限エンドヌクレアーゼ部位から主として成るＤＮＡフラグメントの形成
をもたらすように設計した。
【０１２４】
ＤＮＡフラグメントの構築は次の通りとした：
２種の重複オリゴヌクレオチド：
【化８】
制限部位ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩに下線を付した。
【０１２５】
これらのオリゴヌクレオチドを２００μＭづつのｄＮＴＰ、２．６単位のＨｉ
ＦｉｄｅｌｉｔｙTM Ｅｘｐａｎｄ酵素混合物及び２００pmolづつの各プライマ
ーの入ったＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙTM ＰＣＲバッファー（Boehringer Mannheim,
Germany）中のＰＣＲ反応に用いた。
ＦｉｄｅｌｉｔｙTM Ｅｘｐａｎｄ酵素混合物及び２００pmolづつの各プライマ
ーの入ったＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙTM ＰＣＲバッファー（Boehringer Mannheim,
Germany）中のＰＣＲ反応に用いた。
【０１２６】
ＰＣＲ反応をＤＮＡサーマルサイクラー（Landgraf, Germany)を用いて実施し
た。９４℃で１分のインキュベーション１回、続いて９４℃で１５秒の変性、６
０℃で６０秒のアニーリング及び７２℃で１２０秒の伸長のサイクルプロフィー
ルを利用して実施するＰＣＲ １０サイクル、続いて９４℃で１５秒の変性、６
０℃で６０秒及び７２℃で１２０秒（この伸長工程では、全サイクルに２０秒追
加した）のサイクル２０回。この増幅生成物のアリコート５μｌを１．５％のア
ガロースゲル（NuSieve, FMC）で、サイズマーカーとしてＲｅａｄｙＬｏａｄ
１００bp ＤＮＡラダー（GibcoBRL, Denmark)と共に電気泳動することにより分
析した。０．２kbの明瞭なＤＮＡフラグメントは２本のプライマーの適正なアセ
ンブリーを示唆する。
た。９４℃で１分のインキュベーション１回、続いて９４℃で１５秒の変性、６
０℃で６０秒のアニーリング及び７２℃で１２０秒の伸長のサイクルプロフィー
ルを利用して実施するＰＣＲ １０サイクル、続いて９４℃で１５秒の変性、６
０℃で６０秒及び７２℃で１２０秒（この伸長工程では、全サイクルに２０秒追
加した）のサイクル２０回。この増幅生成物のアリコート５μｌを１．５％のア
ガロースゲル（NuSieve, FMC）で、サイズマーカーとしてＲｅａｄｙＬｏａｄ
１００bp ＤＮＡラダー（GibcoBRL, Denmark)と共に電気泳動することにより分
析した。０．２kbの明瞭なＤＮＡフラグメントは２本のプライマーの適正なアセ
ンブリーを示唆する。
【０１２７】
上記の通りにして作製したＰＣＲ生成物のアリコート４５μｌをＱＩＡｑｕｉ
ｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen, USA)を用い、製造者の指示に従って精製した
。精製したＤＮＡを５０μｌの１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．５で溶出させ
た。
ｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen, USA)を用い、製造者の指示に従って精製した
。精製したＤＮＡを５０μｌの１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．５で溶出させ
た。
【０１２８】
５μｇのｐＭＯＬ１５７８及び２５μｌの精製ＰＣＲフラグメントをＮｈｅＩ
及びＮｏｔＩで消化し、消化したｐＭＯＬ１５７８を０．８％の低温ゲル化アガ
ロース（SeaPlaque GTG, FMC）ゲルで電気泳動し、対応のフラグメントをゲルか
ら切り出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, USA)を用い、そ
の製造者の仕様書に従って精製した。単離したＰＣＲ ＤＮＡフラグメントを消
化してからＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen, USA)を用い、製造者
の仕様に従って簡単に精製した。精製したＤＮＡを５０μｌの１０mMのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、pH８．５で溶出させた。
及びＮｏｔＩで消化し、消化したｐＭＯＬ１５７８を０．８％の低温ゲル化アガ
ロース（SeaPlaque GTG, FMC）ゲルで電気泳動し、対応のフラグメントをゲルか
ら切り出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, USA)を用い、そ
の製造者の仕様書に従って精製した。単離したＰＣＲ ＤＮＡフラグメントを消
化してからＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen, USA)を用い、製造者
の仕様に従って簡単に精製した。精製したＤＮＡを５０μｌの１０mMのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、pH８．５で溶出させた。
【０１２９】
次にＰＣＲフラグメント及びプラスミドを、ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ消化し且つ精
製したｐＭＯＬ１５７８にライゲーションさせた。ライゲーションは１６℃で一
夜かけて、０．５μｇづつの各ＤＮＡフラグメント、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ及びＴ４リガーゼバッファー（Boehringer Mannheim, Germany）を用いて実施
した。
製したｐＭＯＬ１５７８にライゲーションさせた。ライゲーションは１６℃で一
夜かけて、０．５μｇづつの各ＤＮＡフラグメント、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ及びＴ４リガーゼバッファー（Boehringer Mannheim, Germany）を用いて実施
した。
【０１３０】
このライゲーション混合物をコンピテントＢ．スブチリスＰＬ２３０６の形質
転換のために用いた。この形質転換細胞をＬＢＰＧ−１０μｇ／mlのカナマイシ
ンプレート上にプレートした。３７℃で１８時間のインキュベーション後、いく
つかのクローンを新鮮なアガープレート上に再ストリーキングし、そして更に１
０μｇ／mlのカナマイシンの入った液体ＴＹ培地の中で増殖させ、そして３７℃
で一夜インキュベーションした。翌日、１mlの細胞を用いて、Ｑｉａｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＃２７１０６を利用し
、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製についてのその製造者の推奨に従ってその細
胞からプラスミドを単離した。このプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定のための
鋳型として用いた。
転換のために用いた。この形質転換細胞をＬＢＰＧ−１０μｇ／mlのカナマイシ
ンプレート上にプレートした。３７℃で１８時間のインキュベーション後、いく
つかのクローンを新鮮なアガープレート上に再ストリーキングし、そして更に１
０μｇ／mlのカナマイシンの入った液体ＴＹ培地の中で増殖させ、そして３７℃
で一夜インキュベーションした。翌日、１mlの細胞を用いて、Ｑｉａｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＃２７１０６を利用し
、Ｂ．スブチリスプラスミドの調製についてのその製造者の推奨に従ってその細
胞からプラスミドを単離した。このプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定のための
鋳型として用いた。
【０１３１】
リンカー及びＭＩ３遺伝子と融合したペクチン酸リアーゼに対応するＤＮＡ配
列を含む２つのクローンを保存し、これらのクローンをＭＢ９２９−１及びＭＢ
９２９−３と命名した。シグナルペプチド−ペクチン酸リアーゼ−リンカー−Ｍ
Ｉ３をコードするＯＲＦのＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９に示し、そし
て誘導タンパク質配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０に示す。
列を含む２つのクローンを保存し、これらのクローンをＭＢ９２９−１及びＭＢ
９２９−３と命名した。シグナルペプチド−ペクチン酸リアーゼ−リンカー−Ｍ
Ｉ３をコードするＯＲＦのＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９に示し、そし
て誘導タンパク質配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０に示す。
【０１３２】
ａ．ａ．１〜２９：Ｂ．リシェニホルミス由来のａｍｙＬのシグナルペプチド
ａ．ａ．３０〜３４３：Ｂ．リシェニホルミス由来のペクチン酸リアーゼ
ａ．ａ．３４４〜３４５：クローニング部位ＮｈｅＩ由来の２個のアミノ酸
ａ．ａ．３４６〜３５３：ＰＥＰＴリンカー
ａ．ａ．３５４〜３５５：Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼプロセシング部位
ａ．ａ．３５６〜４０８：ヒト一本鎖インスリンＭＩ３
【０１３３】
上述の通りのクローニングから、全長ペクチン酸リアーゼ−リンカー−ＭＩ３
を作らないクローンを単離した。このクローンをｐＭＢ９２９−５と命名した。
ＤＮＡ配列決定することにより、ＰＥＰＴ−ＫＲＦＶＮ配列の直前に停止コドン
が導入されていることが示された。このクローンを発現及び検出分析のコントロ
ールとして用いた。
を作らないクローンを単離した。このクローンをｐＭＢ９２９−５と命名した。
ＤＮＡ配列決定することにより、ＰＥＰＴ−ＫＲＦＶＮ配列の直前に停止コドン
が導入されていることが示された。このクローンを発現及び検出分析のコントロ
ールとして用いた。
【０１３４】
ペクチン酸リアーゼ−リンカー−ＭＩ３融合タンパク質の発現
ｐＭＢ９２９プラスミドを用い、弱プロテアーゼバチルス・スブチリス株ＷＢ
６００ａｓｎを形質転換した。ｐＭＢ９２９−１を有するＷＢ６００ａｓｎの一
のかかる株をＭＢ１００９−１と命名した。ｐＭＢ９２９−３を有するＷＢ６０
０ａｓｎの一のかかる株をＭＢ１００９−４と命名した。ｐＭＢ９２９−５を有
するＷＢ６００ａｓｎの一のかかる株をＭＢ１００９−７と命名し、そして陰性
コントロール株として用いた（上述の通り）。これらの株を１０μｇ／mlのカナ
マイシンの入ったＣａｌ１８−２培地の中で培養した。２個のバッフルの備った
５００mlの振盪フラスコの中で、１００mlの培地を約１０8 個の細胞で接種し、
そして３７℃、３００rpm で２４時間インキュベーションした。サンプルを採取
し、培養ブロスを遠心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして慣用のウェ
スタンブロッティングにより分析した（図４参照）。
６００ａｓｎを形質転換した。ｐＭＢ９２９−１を有するＷＢ６００ａｓｎの一
のかかる株をＭＢ１００９−１と命名した。ｐＭＢ９２９−３を有するＷＢ６０
０ａｓｎの一のかかる株をＭＢ１００９−４と命名した。ｐＭＢ９２９−５を有
するＷＢ６００ａｓｎの一のかかる株をＭＢ１００９−７と命名し、そして陰性
コントロール株として用いた（上述の通り）。これらの株を１０μｇ／mlのカナ
マイシンの入ったＣａｌ１８−２培地の中で培養した。２個のバッフルの備った
５００mlの振盪フラスコの中で、１００mlの培地を約１０8 個の細胞で接種し、
そして３７℃、３００rpm で２４時間インキュベーションした。サンプルを採取
し、培養ブロスを遠心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして慣用のウェ
スタンブロッティングにより分析した（図４参照）。
【０１３５】
実施例５
ペクチン酸リアーゼとＧＬＰ−１との融合タンパク質の発現及びＫｅｘ２ｐ切断
弱プロテアーゼ株ＷＢ６００ａｓｎをプラスミドｐＭＯＬ１６２１で形質転換
し、ペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）融合生成物の過剰発
現及び切断のための準備を整えた。この株を１０μｇ／mlのカナマイシンの入っ
たＣａｌ１８−２培地の中で培養し、２個のバッフルの備った５００mlの振盪フ
ラスコ中の１００mlの培地に約１０8 個の細胞を接種し、そして３７℃、３００
rpm にて２４時間インキュベーションした。サンプルを採取し、培養ブロスを遠
心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして分析した。Ｋｅｘ２ｐ−切断は
下記の通りに実施した： ａ）０．８mlの上清液 ｂ）０．１mlの１ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、pH７．５ ｃ）０．１mlのＫｅｘ２ｐを加える（調製no. KMK0087, Steen B. Mortensen,
Novo Nordisk より贈呈） ｄ）３７℃の湯浴中で２時間のインキュベーション ｅ）サンプルを瞬間凍結し、そして−２０℃で保存する。
し、ペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）融合生成物の過剰発
現及び切断のための準備を整えた。この株を１０μｇ／mlのカナマイシンの入っ
たＣａｌ１８−２培地の中で培養し、２個のバッフルの備った５００mlの振盪フ
ラスコ中の１００mlの培地に約１０8 個の細胞を接種し、そして３７℃、３００
rpm にて２４時間インキュベーションした。サンプルを採取し、培養ブロスを遠
心分離し、そして無細胞上清液を回収し、そして分析した。Ｋｅｘ２ｐ−切断は
下記の通りに実施した： ａ）０．８mlの上清液 ｂ）０．１mlの１ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、pH７．５ ｃ）０．１mlのＫｅｘ２ｐを加える（調製no. KMK0087, Steen B. Mortensen,
Novo Nordisk より贈呈） ｄ）３７℃の湯浴中で２時間のインキュベーション ｅ）サンプルを瞬間凍結し、そして−２０℃で保存する。
【０１３６】
サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥの実行直前に解凍させた。３０μｌのサンプルを
２０μｌのサンプルバッファー及び５μｌのＰＭＳＦ（イソプロパノールに溶解
）及び５μｌの２５％（ｗ／ｖ）のＤＴＴで処理し、次いで煮沸した。１０μｌ
をウェルに適用した。個々のサンプルをワークシートに記載する。その他の条件
は全て「材料と方法」において前述した通りである。
２０μｌのサンプルバッファー及び５μｌのＰＭＳＦ（イソプロパノールに溶解
）及び５μｌの２５％（ｗ／ｖ）のＤＴＴで処理し、次いで煮沸した。１０μｌ
をウェルに適用した。個々のサンプルをワークシートに記載する。その他の条件
は全て「材料と方法」において前述した通りである。
【０１３７】
図５はペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）融合タンパク質
がＫｅｘ２ｐにより効率的に切断され、ＧＬＰ１抗体により認識させるＧＬＰ１
生成物が残ることを示す。ＧＬＰ１の収率は５０mg／ｌ程度であった。
がＫｅｘ２ｐにより効率的に切断され、ＧＬＰ１抗体により認識させるＧＬＰ１
生成物が残ることを示す。ＧＬＰ１の収率は５０mg／ｌ程度であった。
【図１】
実施例２に係る融合ポリペプチドペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（
７−３７）の発現を示すウェスタンブロット。図の汎例：レーン１：ペクチン酸
リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルス培養物；レーン２：ＧＬ
Ｐ１標準品１００mg／ｌ。
７−３７）の発現を示すウェスタンブロット。図の汎例：レーン１：ペクチン酸
リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルス培養物；レーン２：ＧＬ
Ｐ１標準品１００mg／ｌ。
【図２】
実施例２に係る融合ポリペプチドペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（
７−３７）の発現を示すウェスタンブロット。図２の汎例：レーン１：精製ペク
チン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）１０倍希釈；レーン２：ＭＩ
３（１２．５mg／ｌ）とＧＬＰ１（２５mg／ｌ）との混合標準品。
７−３７）の発現を示すウェスタンブロット。図２の汎例：レーン１：精製ペク
チン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）１０倍希釈；レーン２：ＭＩ
３（１２．５mg／ｌ）とＧＬＰ１（２５mg／ｌ）との混合標準品。
【図３】
実施例３に係る融合ポリペプチドペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰ
ＴＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルススブチリス培養物による発現を示すウ
ェスタンブロット。図３の汎例：レーン１：培養物（コントロール）；レーン２ ：ＧＬＰ−１標準品（１００mg／ｌ）；レーン３：ＧＬＰ１標準品（５０mg／ｌ
）；レーン４：ＧＬＰ１標準品（２５mg／ｌ）。
ＴＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルススブチリス培養物による発現を示すウ
ェスタンブロット。図３の汎例：レーン１：培養物（コントロール）；レーン２ ：ＧＬＰ−１標準品（１００mg／ｌ）；レーン３：ＧＬＰ１標準品（５０mg／ｌ
）；レーン４：ＧＬＰ１標準品（２５mg／ｌ）。
【図４】
実施例４に係る融合ポリペプチドペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰ
ＴＫＲ−ＭＩ３の発現を示すウェスタンブロット。図４の汎例：レーン１：ＭＢ
１００９−１（ペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰＴＫＲ−ＭＩ３）； レーン２ ：ＭＢ１００９−１（ペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰＴＫ
Ｒ−ＭＩ３）；レーン３：ＭＢ１００９−４（ペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥ
ＰＴＰＥＰＴＫＲ−ＭＩ３）；レーン４：ＭＢ１００９−４（ペクチン酸リアー
ゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰＴＫＲ−ＭＩ３）；レーン５：ＭＢ１００９−７（陰
性コントロール）；レーン６：ＭＢ１００９−７（陰性コントロール）；レーン ７ ：ＭＢ１００９−７（陰性コントロール）；レーン８：標準ＭＩ３、５０mg／
ｌ；レーン９：標準ＭＩ３、２５mg／ｌ；レーン１０：標準ＭＩ３、１２．５mg
／ｌ。
ＴＫＲ−ＭＩ３の発現を示すウェスタンブロット。図４の汎例：レーン１：ＭＢ
１００９−１（ペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰＴＫＲ−ＭＩ３）； レーン２ ：ＭＢ１００９−１（ペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰＴＫ
Ｒ−ＭＩ３）；レーン３：ＭＢ１００９−４（ペクチン酸リアーゼ−ＡＳ−ＰＥ
ＰＴＰＥＰＴＫＲ−ＭＩ３）；レーン４：ＭＢ１００９−４（ペクチン酸リアー
ゼ−ＡＳ−ＰＥＰＴＰＥＰＴＫＲ−ＭＩ３）；レーン５：ＭＢ１００９−７（陰
性コントロール）；レーン６：ＭＢ１００９−７（陰性コントロール）；レーン ７ ：ＭＢ１００９−７（陰性コントロール）；レーン８：標準ＭＩ３、５０mg／
ｌ；レーン９：標準ＭＩ３、２５mg／ｌ；レーン１０：標準ＭＩ３、１２．５mg
／ｌ。
【図５】
実施例５に係る融合ポリペプチドペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（
７−３７）の発現及びＧＬＰ１（７−３７）を遊離するＫｅｘ２ｐ−切断を示す
ウェスタンブロット。図５の汎例：レーン１：Ｋｅｘプロテアーゼで処理したペ
クチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルス培養物；レーン ２ ：ペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルス培養物； レーン３ ：ＧＬＰ１の標準品（１２．５mg／ｌ）；レーン４：ＧＬＰ１の標準品
（２５mg／ｌ）；レーン５：ＧＬＰ１の標準品（５０mg／ｌ）。
７−３７）の発現及びＧＬＰ１（７−３７）を遊離するＫｅｘ２ｐ−切断を示す
ウェスタンブロット。図５の汎例：レーン１：Ｋｅｘプロテアーゼで処理したペ
クチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルス培養物；レーン ２ ：ペクチン酸リアーゼ−ＡＳＫＲ−ＧＬＰ１（７−３７）のバチルス培養物； レーン３ ：ＧＬＰ１の標準品（１２．５mg／ｌ）；レーン４：ＧＬＰ１の標準品
（２５mg／ｌ）；レーン５：ＧＬＰ１の標準品（５０mg／ｌ）。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08
Ｃ１２Ｒ 1:07） 1:09
(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:08）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:09）
(Ｃ１２Ｎ 9/88
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ
，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，
ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ
Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，
ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ
Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ディエルス，イバン
デンマーク国，デーコー−3500 ベールレ
ーセ，モーセガール パーク85
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 CA07 CA10
DA07 EA04 GA11 HA01 HA12
4B050 CC05 DD02 GG06 LL01
4B065 AA15X AA15Y AA19X AB01
AC14 BA02 CA27 CA44
Claims (23)
- 【請求項１】 一本のオープンリーディングフレームへと順次融合された少
なくともペクチン酸リアーゼ、タンパク質分解切断標的部位及び外性起源のポリ
ペプチドといった要素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る細胞。 - 【請求項２】 一本のオープンリーディングフレームへと順次融合された少
なくともペクチン酸リアーゼ、２個以上のアミノ酸のリンカー、タンパク質分解
切断標的部位及び外性起源のポリペプチドといった要素をコードするＤＮＡ配列
を含んで成る細胞。 - 【請求項３】 前記細胞がグラム陽性微生物細胞である、請求項１又は２記
載の細胞。 - 【請求項４】 前記細胞がバチルス細胞である、請求項１〜３のいずれか１
項記載の細胞。 - 【請求項５】 前記細胞がバチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheni
formis）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・ブレビス（
Bacillus brevis)、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquef
aciens）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス・レンタス（
Bacillus lentus)、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearotherm
ophilus)、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus)、バチルス・
コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus
circulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus)、バチルス・スリンジエ
ンシス（Bacillus thuringiensis）、及びバチルス・アガラドエレンス（Bacill
us agaradhaerens）から成る群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項記載
の細胞。 - 【請求項６】 タンパク質分解切断標的部位がプロテアーゼにより認識され
て切断されるアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項７】 前記タンパク質分解切断標的部位がアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ（ＫＲ）である、請求項６記載の細胞。 - 【請求項８】 前記タンパク質分解切断標的部位がアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）である、請求項６記載の細胞。 - 【請求項９】 前記タンパク質分解切断標的部位が、前記細胞により前記融
合ポリペプチドが分泌されると切断されるアミノ酸配列である、請求項１〜５の
いずれか１項記載の細胞。 - 【請求項１０】 前記タンパク質分解切断標的部位が化学化合物により切断
されることのできるアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の細
胞。 - 【請求項１１】 前記化学化合物が臭化シアン又はヒドロキシルアミンであ
る、請求項１０記載の細胞。 - 【請求項１２】 前記ペクチン酸リアーゼがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，４，
６，８及び１０から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含んで成るペクチン酸リ
アーゼの群から選ばれる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項１３】 前記ペクチン酸リアーゼがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，４，
６，８及び１０から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含んで成るペクチン酸リ
アーゼと７０％のアミノ酸配列類似性を有する相同体である、請求項１〜１２の
いずれか１項記載の細胞。 - 【請求項１４】 前記リンカー内に存在するアミノ酸残基の少なくとも２５
％がプロリンである、請求項２〜１３のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項１５】 前記リンカーがＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ，Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ，Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ又はＴｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（ＰＥＰＴ，ＥＰＴＰ，ＰＴＥＰ又はＴＰＥＰ）といったア
ミノ酸配列の少なくとも一周期反復を含んで成る、請求項２〜１４のいずれか１
項記載の細胞。 - 【請求項１６】 前記リンカーがアミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ（ＩＥＧＲ）の反復を少なくとも一組含んで成る、請求項２〜１３のいずれ
か１項記載の細胞。 - 【請求項１７】 前記外性ポリペプチドがホルモン、機能性ホルモン類似体
、酵素及び人工ポリペプチドから成る群から選ばれる、請求項１〜１６のいずれ
か１項記載の細胞。 - 【請求項１８】 前記外性ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の３５
０〜８３４位に示すアミノ酸配列を含んで成るα−アミラーゼである、請求項１
〜１６のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項１９】 前記外性ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４の３４
８〜３７８位又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の３５６〜３８６位に示すアミノ酸
配列を含んで成るヒトＧＬＰ−１（７−３７）ホルモン類似体である、請求項１
〜１６のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項２０】 前記外性ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８に示す
アミノ酸配列を含んで成る一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）である、請求項１〜
１６のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項２１】 前記外性ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０の３５
６〜４０８位に示すアミノ酸配列を含んで成る一本鎖ヒトインスリン（ＭＩ３）
を含んで成る、請求項１〜１６のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項２２】 タンパク質を生産する方法であって、 ｉ）一本のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）へと順次融合された少な
くともペクチン酸リアーゼ、タンパク質分解切断標的部位及び外性起源のポリペ
プチドといった要素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る適当な細胞を構築し、 ii）工程（ｉ）で構築した細胞を増殖及び分泌のための適当な条件下で培養し
；そして iii)外性起源のポリペプチドを含んで成るタンパク質を回収する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２３】 前記外性起源のポリペプチドの回収の前又は後にタンパク
質分解切断工程を更に含んで成る、請求項２２記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199900780 | 1999-06-02 | ||
| DK199900780 | 1999-06-02 | ||
| US13869299P | 1999-06-11 | 1999-06-11 | |
| US60/138,692 | 1999-06-11 | ||
| PCT/DK2000/000296 WO2000075344A1 (en) | 1999-06-02 | 2000-05-31 | Pectate lyase fusion for expression and secretion of polypeptides |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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