FI105483B - Menetelmä kiinnostavan endogeenisen entsyymin tuotannon tehostamiseksi alkalofiilisessa Bacillus-isäntäsolussa - Google Patents

Description

105483

Menetelmä kiinnostavan endogeenisen entsyymin tuotannon tehostamiseksi alkalofiilisessa Bacillus-isäntäsolussa Tämän keksinnön aiheena on seriiniproteaasin tehostunut tuotanto Bacillus-kannoissa rekombinaatiomenettelytapoj a käyttäen.

Bacillus-lajeja on käytetty laajalti teollisesti tärkeiden entsyymien kuten alfa-amylaasin, neutraalin proteaasin ja alkalisten proteaasien tai seriiniproteaasien tuotannossa. Yleisesti ottaen bakteeriperäisiä seriiniproteaaseja voidaan saada monista prokaryoottisista organismeista mukaanlukien gram-negatiiviset organismit kuten Serratla- tai Pseudomonas-lajIt ja gram-positiiviset bakteerit kuten Micrococcus- ja Bacillus-laj it. Teollisesti tärkeiden seriiniproteaasien erityisen kiinnostava ryhmä ovat korkean aktiivisuuden emäksisessä ympäristössä omaavat proteaasit. Eri Bacillus-laj ien, mukaanlukien B^ subtilis, B. licheni-formis, B. amyloliquefaciens, B. alcalophilus ja muut ·· Bacillus-laj it, tuottaessa teollisia seriiniproteaaseja, .···. korkea-alkalisia (high alkaline) proteaaseja tuottavat yleensä Bacillus-laj it, jotka kykenevät kasvamaan ’ . emäksisessä pHrssa. Esimerkki tällaisesta Bacillus-lajista on Bacillus novo -laji PB92.

• · • « *·1·1 Proteolyyttisten entsyymien, erityisesti korkea-alkalisten proteaasien, tuottamiseen siten, että saanto on korkea, kykenevien Bacillus-kantoj en kehittämistä kohtaan tunnetaan huomattavaa kiinnostusta.

* I • ·

Useita solunulkoisten Baclllus-entsyymien geenejä on kloo- . nattu menestyksekkäästi, kuten alfa-amylaasigeenit orga- • · ’···' nismeista, B. amyloliquefaciens (Palva et ai., Gene 1E[ (1981) 43-51), B. lichenlformls (Ortlepp, Gene 23 (1983) 267), B. stearothermophilus (Mielenz et ai., Proc. Natl.

• · · · · 2 105483

Acad. Sei. USA 80 (1983) 5975-5979; EPA-0057976 ja B. subtills Yang et al., Nucleic Acids Res. 1A (1983) 237); Te-vaanisukraasigeeni B. subtills (Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); neutraalia proteaasia koodaavat geenit B. stearothermophilus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983) 831), B. amyloliquefaciens (Honjo et al., J. Biotech. 1 (1984) 165) ja B. subtllis (Yang et al., J. Bacteriol. 160 (1984) 115; seriiniproteaasia tai emäksistä proteaasia koodaavat geenit B. subtilis (Wong et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1984) 1184), B. llchenifor-mls (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 12 (1985) 8913) ja B. amyloliquefaciens (Wells et al., Nucleic Acids Res. ll (1983) 7911).

Teollisten seriiniproteaasien tuottamista eri Baclllus- lajeissa kuvataan esimeriksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,674,643; 3,723,250; ja 4,480,043. Emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevien Baclllus-kantojen korkea-alkalisen proteolyyttisen entsyymin tuotantoa kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,723,250; Re. 30,602 ja 4,480,037. Yleiskatsauksen osalta koskien Bacillus-lajien ]··, käyttöä teollisesti tärkeiden entsyymien tuottamiseksi ::: katso esimerkiksi Debabov, 'The Industrial Use of Bacilli' • · · kirjassa The Molecular Biology of Bacilli (Academic Press, t ·

New York, 1982).

• < ' m · · • * • «

Menetelmän B. subtillksen protoplastitransformaation suorittamiseksi ovat kuvanneet Chang ja Cohen (Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115). Samankaltaisia menetelmiä on kuvattu transformoinnin suorittamiseksi menestyksekkäästi, .·.·. kun kyseessä ovat B. meqaterlum-protoplastit (Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Letters 7 (1980) 261-263), B. amylo-• · · ” ^ liquefaciens-protoplastit (Smith et al., Appi. and Env.

• · · " :...: Microbiol. 52 (1986) 634), B. thuringlensls-protoplastit *·”· (Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), B.

.;. sphaerlcus-protoplastit (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 « · « · • · 3 105483 (1984) 203), ja B. larvae-protoplastit (Bakhiet et ai., Appi. and Env. Microbiol. 49 (1985) 577). Bakhiet et ai., supra, ilmoittivat kuitenkin epäonnistumisesta B. popil-laen kohdalla. Mann et ai., Current Microbiol. 1_3 (1986) 131-135, ilmoittivat Taj ien B. polymyxa, B. licheniformls, B. macerans ja B. laterosporus menestyksekkäästä transfor-moinnista. Menetelmä ei kuitenkaan ollut tuloksekas lajien B.coagulans, B. cereus ja B. pumllus kohdalla, vaikka todettiin hyvää protoplastimuodostusta. Muihin menetelmiin DNA:n viemiseksi protoplasteihin kuuluu fuusioiminen DNA:ta sisältäviin liposomeihin, Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97.

Keksinnön kohteena ovat uudet alkalofiiliset Bacillus-kannat sekä menetelmät ja kokoonpanot tällaisten kantojen transformoimiseksi. Keksinnön kohteena on niinikään uusi DNA-sekvenssi, joka käsittää alkalofiilisestä Baclllus-kannasta peräisin olevan korkea-alkalista proteolyyttistä entsyymiä koodaavan geenin. Isäntäsolu, joka omaa edullisesti positiivisen taustan, transformoidaan käyttäen plas-midirakennetta, joka käsittää sanottua korkea-alkalista proteolyyttistä entsyymiä koodaavan geenin. Voidaan käytti tää protoplastitransformointia plasmidirakenteen avulla polyetyleeniglykolin läsnäollessa emäksisessä pH:ssa. DNA- *;; sekvenssiä voidaan ylläpitää kromosominulkoisesti tai se • * · '·'·* voidaan integroida isäntäsolugenomiin.

* · « · · • · ___________...

• ·

Lyhyt kuvaus piirroksista:

Kuviossa l esitetään tulokset histidiini/MOPS-geeli-elektroforeesia josta, joka suoritettiin pUB110:n tai vas- • · .·.·. taavasti pM58 sisältävien B. subtilis DB104 - viljelmien • · · ““ . ’;*· supernatanteilla, verrattuna useihin subtilisiineihin.

* · * vyöhyke l: Carlsberq-subtillslinl .:. vyöhyke 2: Bacillus PB92 -proteaasi • · « · • « · • · * • · 4 105483 vyöhyke 3: Bacillus subtills -subtilisiini vyöhyke 4: Bacillus subtills DB104 (pM58) vyöhyke 5: Bacillus subtills DB104 (pUBHO)

Kuviossa 2 esitetään plasmidin pM58 restriktiokartta. Kuvion yläosassa esitetään edelleen sekvenssoimisstrategia. Nuolilla varustetut kiinteät viivat edustavat faagi Ml3 -vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 kloonattuja fragmentteja. Kuvion alaosassa esitetään sekvenssoimisstrategia, jossa käytetään proteaasigeenissä tasaisin välein sijaitsevia 10 oligonukleotidiä.

Kuviossa 3 esitetään koodaavan juosteen nukleotidisekvens-si korreloituna Bacillus PB92 -seriiniproteaasin aminohapposekvenssiin. Promoottorit (P·^ P2)/ ribosomisitoutumis-keskukset (rbs) ja lopetusalueet (term) on niinikään esitetty. Numeroidut kiinteät viivat edustavat sekvensoinnissa käytettyjen 10 oligonukleotidin sijaintikohtia.

Kuviossa 4A esitetään plasmidin pE194-neo rakentaminen.

t « · · ,«·. Kuviossa 4B esitetään plasmidin pMAX-4 rakentaminen.

« « f a * '. Tämän keksinnön mukaan tarjotaan uusia DNA-rakenteita ja

• · I

;·; Bacillus-kantoja proteolyyttisten entsyymien tuottamiseksi I · · siten, että saanto on korkea, sekä menetelmiä niiden vai- * · v.· mistamiseksi. Isäntäsolut transformoidaan yhdistämällä

Bacillus-isäntäkannasta valmistetut protoplastit fuusioi-misolosuhteissa plasmidirakenteeseen, joka käsittää jotain proteolyyttistä entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin.

• · • * · • · ·

Korkea-alkaliset proteaasit ovat seriiniproteaaseja tai • · · subtilisiineja, jotka ovat erittäin aktiivisia emäksisessä • · ·...· ympäristössä. Tarkemmin ottaen korkea-alkalisten proteaa- sien optimiaktllvisuus ilmenee yli noin 9:n ylittävillä pH-arvoilla ja ne säilyttävät tästä optimiaktiivisuudesta • · 4 · • · * • · · 5 105483 ainakin 80 % pH:ssa noin 11 tai jopa yli. Korkea-alkalisia proteaaseja tuottavat yleensä emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevät Baclllus-kannat.

Proteaasigeenin eristyksessä käytetyt menetelmät ovat alalla tunnettuja ja niitä ovat synteesi, eristys genomi-DNArsta, valmistaminen cDNA:sta tai näiden yhdistelmät. Korkea-alkista proteaasia koodaavien geenien eristys ja ilmentäminen on julkistettu tämän patenttihakemuksen pohjana olevassa etuoikeusasiakirjassa, EP-hakemusjulkaisussa n:o EP-A-87200358.7, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä. Eri menetelmät geenien manipuloimiseksi ovat tunnettuja ja niihin lukeutuvat restriktio, pilkkominen, uudelleenpilkkominen (resection), ligatointi, in vitro-mutatointi, alukkeen avulla korjailu (primer repair), liittäjien ja siltasekvenssien käyttö ja muut samankaltaiset menetelmät. Katso Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

.:. Yleisesti ottaen menetelmä käsittää genomikirjaston val- mistamisen korkea-alkalista proteaasia ilmentävästä orga- « · nismista. Luovuttajamikro-organismin genomi eristetään ja * . pilkotaan soveltuvalla restriktioentsyymillä. Saadut luo- • · « ;·; vuttajakannan DNA-fragmentit ligatoidaan sitten kloonaus- • 1 « ’«·1 vektoriin, joka on pilkottu yhteensopivalla restriktioen- • · v.: donukleaasilla.

Insertoidun DNA-fragmentin sisältävät kloonit voidaan tunnistaa resistenssimerkin avulla tai käyttämällä jotain ,.1.1· suoraa tai positiivista valikoimismenettelyä kuten B. sub- • 1 tilikselle (Gryczan 1a Dubnow, Gene 20 (1982) 459-469) ke-» · · “ ^ · · — *;]· hitetty menettely. Lisäksi korkea-alkalista proteaasia il- mentävät kloonit voidaan tunnistaa käyttämällä ilmentymis-tuotteen vastaisia vasta-aineita tai toteamalla kyseisen proteolyyttlsen entsyymin substraatin hävikki tai tuot- ««k» • · « I t • 1 » « · 105483 6 teenmuodostus. Esimerkiksi merkkigeeniä, kuten antibioot-tiresistenssigeeniä, ilmentäviä pesäkkeitä voidaan seuloa proteaasituotannon suhteen, jolloin viimemainittu määritetään kaseiinikehäsaostuman kasvun perusteella kaseiinia sisältäville maljoille maljattujen pesäkkeiden ympärillä.

Kun täydellinen geeni on tunnistettu, joko cDNA:na tai kromosomi-DNA:na, sitä voidaan manipuloida lukuisilla tavoilla ilmaisun aikaansaamiseksi. Voidaan käyttää Bacil-lus-lsäntiä, jotka ovat esimerkiksi alkalofiilisiä bakteereita, mukaanlukien ne alkalofiiliset Bacillus-lajit, jotka jo tuottavat korkea-alkalisia proteaaseja. Edullinen isäntäorganismi on Bacillus novo -laji PB92. Sen vuoksi on käytännöllistä ylläpitää villityyppisekvenssiä, joka omaa säätösignaaleja ja erittyviä johtosekvenssejä, jne., vaikka muistakin Bacillus-lajeista saatuja, kyseisessä Bacillus- isäntäkannassa funktionaalisia kontrollialueita voidaan niinikään käyttää. Jonkin Bacillus-solun transfor-mointiin soveltuva vektori sisältää täten korkea-alkalista proteaasia koodaavan rakennegeenin, joka voidaan saada jostain alkalofiilisesta Bacillus-lajista, esim. säätö-: alueita, kuten esim. promoottorisekvenssin, ribosomisitou- tumiskeskuksen muodostavan sekvenssin ja emäksistä prote-aasia koodaavan geenin transkription ja translaation lope- • · · · tusta sääteleviä sekvenssejä, jotka ovat alkalofiilisessä • · · i Bacillus-isäntäsolussa funktionaalisia.

« · · — II·

Vektori voi sisältää lisäksi merkkigeenin, esimerkiksi tuottamaan resistenssin jollekin antibiootille, jolle kyseinen isäntäkanta on herkkä, sekä jonkin toisiintumisal-

• I

kukohdan, joka kykenee toisiintumaan itsenäisesti isäntä- : solussa. Toisiintumisalkukohta voi käsittää mutaation, jo- ,···] ka tekee sen toiminnasta isäntäsolussa lämpötilaherkän, • · jolloin mahdollistuu kromosomi-integraation eslinseulonta Ehrlichin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1433, ku-vaarnan mukaan.

• · · · 1 I • « · • « • · 7 105483

Aminohapposekvenssiä voidaan käyttää sellaisen koettimen suunnittelemiseksi ja rakentamiseksi, jolla seulotaan korkea-alkalista proteaasia koodaavan geenin luovuttajaso-luina kiinnostavista soluista peräisin olevasta mRNA:sta tai DNAista valmistettua genomikirjastoa. Käyttämällä korkea-alkalista proteaasia koodaavaa cDNAita tai sen fragmenttia hybridisaatiokoettimena voidaan helposti kloonata muista organismeista tavattuja rakenteellisia suku-laisgeenejä. Erityisen kiinnostavaa on geenien eristys korkea-alkalisia seriiniproteaaseja ilmentävistä organismeista käyttämällä ollgonukleotidikoettimia, jotka perustuvat alkalofHiisistä Bacillus-kannolsta, mukaanlukien Bacillus novo -lajista PB92, saatavissa olevien korkea-alkalisia seriiniproteaaseja koodaavien nukleotidisekvens-seihin. Tällaiset koettimet voivat olla huomattavasti lyhyempiä kuin sekvenssi kokonaisuudessaan, mutta niiden pituuden tulisi olla vähintään 10, edullisesti vähintään 15 ja edullisemmin 2Ö nukleotidia. Pidemmätkin oligonuk-leotidit ovat hyödyllisiä aina geenin täyteen mittaan asti, jolloin pituus ei edullisesti ylitä 1200 nukleotidia. Voidaan käyttää sekä RNA- että DNA-koettimia.

Käytännössä koettimet leimataan tyypillisesti jollain to-dettavalla tavalla (esim. 32P:llä, 3H:lla, biotiinilla tai avidiinilla), minkä jälkeen niitä inkuboidaan organismis-ta, josta geeniä etsitään, peräisin olevan yksisäikeisen DNA:n tai RNA:n kanssa. Hybridisoituminen todetaan leiman avulla, sen jälkeen kun yksisäikeinen ja kaksisäikeinen (hybridisoitunut) DNA (tai DNA/RNA) on erotettu toisistaan (tyypillisesti nitroselluloosapaperia käyttäen). Alan am-mattilaiset ovat hyvin perillä oligonukleotidien yhteydes- :V: sä käytettäviksi soveltuvista hybridisoimismenettelyistä.

0 « ____ • «

Vaikka koettimia käytetään normaalisti helpon tunnistuksen ’ mahdollistavan todettavan leiman kanssa, myös leimaamatto- mat oligonukleotidit ovat hyödyllisiä sekä leimattujen ko- • · 105483 8 ettimien prekursoreina että käytettäviksi menetelmissä, jotka mahdollistavat kaksisäikeisen DNA:n (tai DNA/RNA:n) suoran toteamisen. Tämän mukaisesti ilmaisu oligonukleoti-dikoetin viittaa sekä leimattuihin että vailla leimaa oleviin muotoihin. Ligatointiseoksella transformoidaan sitten transformoitumiskelpoisia B. subtilis-soluja. Merkkigeeniä valikointikeinona käyttäen voidaan sitten eristää rekombi-nanttiplasmideja, joita voidaan karakterisoida restriktio-analyysin ja sekvenssoinnin avulla.

Korkea-alkalisen proteaasin tuottamiseksi edullinen, jo jotain seriiniproteaasia tuottavien Baclllus-kantojen transformointiin käytettävä DNA-sekvenssi on eräs Bacillus novo -lajista PB92 peräisin oleva sekvenssi. Kyseisen DNA-sekvenssin koodaaman seriiniproteaasin aminohapposekvenssi on seuraava: H2N-A-Q-S-V-P-V7-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-s_l-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- • · « q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- •i m-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-VJ-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- ‘‘: t-A“T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

• · « · » « I » • ·

Vaikka proteaasigeenin saamiseksi edullinen kanta on Bacillus novo -laji PB92, oleellisesti sama seriiniproteaa-si voidaan saada muistakin alkalofiilisistä Baclllus-la-jeista. Tällaiset proteaasigeenit, jotka omaavat vähintään :Y: 70 %:n ja edullisesti yli 80 %:n homologian Bacillus PB92:n aminohapposekvenssin nähden, tulee ymmärtää kysei-sen keksinnön piiriin kuuluviksi.

• · tj·:· Toivottavaa on, että ilmentymistuote erittyy. Koska emäk- sinen proteaasi erittyy, voidaan käyttää villityypin • * 9 - 105483 johto- ja prosessoimissignaaleja. Lisäksi voidaan valmistaa fuusioitu geeni varustamalla rakennegeeni 5'-sekvenssillä, joka koodaa erittyvää johto- ja prosessoimissignaa-lia. Edustavia heterologisia erittyviä johtosekvenssejä ovat Bacillus-amylaasi- ja Bacillus-proteaasigeenien erittyvät johtosekvenssit. Fuusioimalla tarkoituksenmukaisella lukualueella erittyvä johtosekvenssi kiinnostavaan raken-negeeniin kasvualustaan saadaan erittymään kypsä alkalo-fiilinen proteaasi.

Ilmentämiskasetti voi olla täysin tai osittain peräisin luontaisista lähteistä ja olla täysin tai osittain peräisin isäntäsoluun nähden homologisista lähteistä, tai isän-täsoluun nähden heterologisista lähteistä. Keksinnön mukaiset eri DNA-rakenteet (DNA-sekvenssit, vektorit, plas-midit, ilmentämiskasetit) eristetään ja/tai puhdistetaan, tai syntetisoidaan, jolloin ne eivät ole "luontaisesti esiintyviä".

Riippuen siitä, halutaanko rakennegeenin integroituvan isäntäkannan kromosomiin vai kromosominulkoisen yksikön tulevan ylläpidetyksi, voidaan mukaan sisällyttää toi- • i i siintumisjärjestelmä Bacillus-lajla varten tai olla sitä sisällyttämättä, integrointia silmälläpitäen plasmidira-kenteen homologisia jaksoja Bacillus-genomiin nähden voi- • » « I daan käyttää rekombinoitumistodennäköisyyden kasvattami- • ♦ · ***** seksi. Lisäksi lämpötilaherkän toisiintumisalkukohdan si sällyttäminen plasmidirakenteeseen mahdollistaa valikoinnin kromosomi-integraation suhteen. Katso esimerkiksi Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA T5 (1978) 1433.

• · • · » . .-----— · — - * · · • · :Y: Isäntäsoluun voidaan insertoida rakennegeenistä useampi • · .!.* kuin yksi kopio rakennegeenin ilmentymisen vahvistamisek- **\ si. Rakennegeenin stabiili vahvistuminen voidaan saada in- \ | tegroimalla isäntäsolugenomlin rakennegeenistä vähintään t *:· yksi ylimääräinen kopio ja valikoimalla transformanttien • · « « · · · ψ · 10 105483 suhteen, joissa rakennegeenin kopioita erottavat endogee-niset kromosomaaliset sekvenssit. DNA-rakenteita ja menetelmiä prokaryoottisille järjestelmille kuvataan EP-hake-musjulkaisussa n:o EP-A-87200356.1, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

Toisiintumisjärjestelmän ohella plasmidirakenteeseen sisältyy tavallisesti vähintään yksi merkkigeeni. Merkkigee-nillä tarkoitetaan jossain isännässä ilmentymään kykenevää rakennegeeniä, joka tuottaa biosidi- tai virusresistens-sin, tai resistenssin raskasmetalleille, immuniteetin tai muuta vastaavaa. Biosidiresistenssin kyseessä ollessa tämä saattaa käsittää resistenssin antibiooteille, esimerkiksi neomysUnille, kanamysUnille, tetrasykliinille jne. Merkkigeeni valitaan mahdollistamaan valikointi alhaisten kopiolukujen ja sellaisen antibioottipitoisuuden kyseessä ollessa, joka ei vakavasti häiritse rekombinanttisolujen kasvua. Erityisen kiinnostava on neomysiiniresistenssi.

Eri DNA-sekvenssit voivat olla peräisin vaihtelevista ·.’ lähteistä ja ne voidaan liittää toisiinsa vektorin saami- seksi, joka sisältää yhden tai useamman kätevän, edulli-sesti yksittäisen restriktiokeskuksen, jolloin on mahdol-lista insertoida tai korvata rakennegeenit näihin keskuk- 9 siin plasmidirakenteen saamiseksi.

» · * • » • i • ·

Kun plasmidirakenne on valmistettu, sillä voidaan transformoida soveliaita isäntäsoluja. Bacillus-isäntä voi olla mikä tahansa Bacillus-kanta, joskin soveliasta kantaa va-littaesa otetaan huomioon tekijät, jotka mahdollisesti te- • · J,:,: hostavat korkea-alkalisten proteaasien tuotantoa. Tuotan- toa voidaan tehostaa lukuisilla tavoilla, mukaanlukien • · isännän käyttäminen, jossa halutun tuotteen hajoaminen on alentunut, säätösignaalit tulevat tunnistetuiksi, eritys ] sujuu vaikeuksitta, jne. Täten vaikka edullinen Bacillus- ·:· isäntä tuottaa jotain korkea-alkalista proteaasia, ja on • · * · · • · · • ♦ f ,, - 105483 joko villityypin Bacillus tai mutanttl-Baclllus, Baclllus-isäntä voi niinikään olla jonkin korkea-alkalisen proteaa-sin tuottavan Bacilluksen mutantti, joka ei tuota korkea-alkalista proteaasia.

Korkea-alkalisia proteaaseja tuottavat Bacillus-lajit eivät ole taksonomisesti hyvin luokiteltuja ja niihin viitataan yleensä alkalofHiisinä Baclllus-kantolna. Esimerkkejä emäksisessä pHtssa kasvamaan kykenevistä Bacillus-kannoista kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,723,250; Re. 30,602 ja 4,480,037. Eräs esimerkki edullisesta alkaloflilisesta Bacillus-isäntäkannasta on kanta Bacillus novo -laji PB92, joka on julkaistu mm. US-patenttijulkaisussa n:o Re. 30,602.

Isäntäsoluina voidaan käyttää myös teollisia alkalofiili-siä Baclllus-kantoj a. Teolliset Bacillus-kannat ovat peräisin organismeista, jotka ovat eristettävissä maaperästä tai ovat saatavissa talletuslaitoksista tai muista lähteistä, ja ne saadaan tällaisia Bacillus-kantoja geneetti- f ..U’ sesti modifioimalla. Teollisille Bacillus-kannoille on tunnusomaista vastuskyky geenivaihtoa kohtaan, kuten faa-gitartutusta tai transformointia kohtaan. Kyseiset kannat ovat stabiileja ja ne saattavat valinnaisesti kyetä itiö- ,v, muodostukseen. Ne ovat yleensä prototrofisia ja niitä on yleensä modifioitu tuottamaan endogeenisten proteiinituotteiden, kuten entsyymien alfa-amylaasi ja eri proteaasit, suuria saantoja. Teollisessa tuotantoprosessissa saadun endogeenisen proteiinituotteen saanto saattaa olla ainakin 5 g/1 (0,5 % w/v). Teolliset kannat erittävät myös DNA- • · Γ".--7" ; _v,! aaseja, mistä seurauksena DNA hajoaa kasvualustassa, mikä :Y: puolestaan tuottaa suojan geenivaihtoa vastaan.

«I “ • i I I ^

Alkalofiilisten Bacillus-kantolen transformointiin liittyy • IMI __ - i edullisesti sanotuista kannoista peräisin olevien proto- plastien käyttö. Kuitenkaan Cohenin et ai., supra, kuvaa- * « • « · • »* • « 12 105483 man mukainen tavanomainen protoplastitransformoimisjärjestely ei toimi alkalofiilisten Bacillus-kantoj en kyseessä ollessa. Tämän vuoksi on kehitetty lisäjärjestelyjä.

Alkalofiilisten Bacillus-lajien kyseessä ollessa proto-plastien muodostuminen ja regeneraatio voivat tapahtua korkeassa pH:ssa, edullisesti pH:ssa noin 8. Protoplasteja voidaan valmistaa uudelleensuspendoimalla solut emäksiseen ylläpitoalustaan (Alkaline Holding Medium, AHM), pH 7,8 - 8,5, minkä jälkeen soluja inkuboidaan 30-80 minuutin ajan 37°C:ssa. Esimerkin yhdestä AHM:stä osalta katso esimerkki 5. Saadut protoplastit pestään sitten lysotsyymin poistamiseksi, minkä jälkeen ne uudelleensuspendoidaan AHM:ään. Sitten plasmidirakenne ja alkalofiilinen Bacillus-isäntä-protoplasti yhdistetään sopivan fusogeenin läsnäollessa. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa halutun tehokkuuden tuottavaa fusogeenia, useimmissa tapauksissa polyetylee-niglykolin (mp. 1000 - 8000) on todettu tuottavan erittäin tehokas fuusio, johon yhdistyy hyvin kätevä käyttö. Vastaanottavasta Bacillus-kannasta valmistettuja protoplaste-ja ja plasmidirakennetta sekoitetaan keskenään ei 5 mi-nuuttia ylittävän ajan, edullisesti ei pitempää kuin 2 mi-*;;; nuuttia, polyetyleenigykolin läsnäollessa. Sitten fusogee- ‘ niseos korvataan tavanomaisella ravinnekasvualustalla, .-i’ jossa soluja inkuboidaan korkeintaan 5 tunnin ajan, edul- # · lisesti 2-3 tuntia, ennen kuin ne siirretään regeneroimis-

• I

maljoihin. Regeneroimismaljat sisältävät jotain antibioottia kuten neomysiiniä transformanttien valikoimiseksi.

Kloonit, joissa DNA-rakenteen ylläpito on episomaalinen, voidaan tunnistaa toteamalla korkea-alkalisen seriinipro- • · · teaasin ilmentyminen. Niiden kloonien tunnistamiseksi, • · · jotka sisältävät ilmentämisrakenteen kromosominsa inte-graalisena osana, kehittyvät kloonit seulotaan eristämällä kokonaissolu-DNA ja valikoimalla ne kloonit, joissa ei ole todettavissa vapaata plasmidi-DNA:ta, mutta joissa plasmi- * « · ♦ « ♦ « · • · 13 105483 din merkkigeeni ilmentyy. Kloonit voidaan sitten seuloa sopivilla tavoilla erittäin emäksisen proteaasin ilmentymisen toteamiseksi.

Eri toteamismenettelyltä ovat spesifisten vasta-aineiden käyttö, DNA- tai RNA-hybridisaatio, entsyymituotteen muodostuminen tai entsyymin substraatin häviäminen, ja niitä voidaan käyttää kloonien seulomiseksi ilmentämisrakenteen ja kiinnostavan rakennegeenin ilmentymisen, eli proteaasi-tuotannon, läsnäolon toteamiseksi. Syntynyttä proteaasia voidaan karakterisoida biokemiallisesti esimerkiksi määrittämällä proteaasin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesiajon, histidiini/MOPS-geelielektro-foreesin avulla ja määrittämällä kineettiset parametrit Km ja vmax, jolloin määritys suoritetaan synteettisen substraatin sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-prolyyli-L-fe-nyylialanyyli-p-nitroanilidin avulla.

Ilmentämisrakenteen episomaalisesti tai kromosomin integroituneena sisältävänä Bacillus-Isäntää viljellään sit-ten ravinnekasvualustässä entsyymin syntetisoitumista suo-'!!! sivissa olosuhteissa. Ravinnekasvualusta sisältää tavaili-

• V

;;; sesti jonkin keinon plasmidin ylläpitämiseksi, jollainen • · φ ‘ on esimerkki jonkin antibiootin läsnäolo, jolle ei-trans- formoitu isäntä on herkkä. Käyttämistä voidaan jatkaa, kunnes kasvatusliemi on tullut loppuunkäytetyksi. Jos tuo-te on erittynyt, tuote voidaan eristää kasvatusliemestä tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi uuttamalla, kro-matografisesti, elektroforeettisesti tai muulla vastaavalla tavalla. Jos tuote on jäänyt sytoplasmaan, solut ote- taan talteen sentrifugoimalla, suodattamalla jne., tuote- • « 1 "

Il taan niihin lyysi mekaanisesti rikkomalla, detergentin tai \\ lysotsyymin avulla, tai muilla menetelmillä, ja eristetään • · · tuote kuten aiemmin on kuvattu. Ei-transformoidun isäntä- :··: solun ollessa korkeä-alkalisen proteaasin tuottaja kyseis- V tä menetelmää käyttämällä voidaan päästä korkea-alkalisen » · · · • 1 i • · · • · 14 105483 proteaasin runsaasti kasvaneisiin saantoihin, jotka ovat tavallisesti vähintään noin 120 % ei-transformoidun isän-täsolun saannosta, vain yhden kromosominulkoisen geeniko-pion avulla.

Seuraavat esimerkit tarjotaan havainnollistamistarkoituk-sessa eikä rajaavassa mielessä.

ESIMERKKI 1

Genomi-DNA-kirjaston valmistus alkalofiilisestä Bacillus novo -lajista PB92 ja serllniproteaasiqeenln eristys

Kromosomi-DNA:ta eristettiin Bacillus novo -lajista PB92 (talletettu numerolla OR-06 talletuslaitokseen Laborato-rium voor Microbiologie, Technical University of Delft, Hollanti; katso US-patenttijulkaisu n:o Re. 30,602) Saito-Miuvan, Biochim. Biophys. Acta. 72 (1963) 619-632, kuvaaman menetelmän mukaan, minkä jälkeen se pilkottiin osittain restriktioentsyymillä Sau3A ja pilkkomistuotteet li-gatoitiin plasmidin pUBHO (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329) BamHI-keskukseen. Plasmidin pUBHO plasmidi-DNA valmistettiin kuten Birnboim ja Doly (Nucl.

• « · '·’ Acids. Res. 7 (1979) 1513-1523) ovat kuvanneet.

Ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-lA40:ää (Bacillus Genetic Stock Centre) Spizizenin et ai., J. Bacteriol. 81_ (1961) 741-746, menetelmän mukaan käyttäen 0,6 - 1 /ug DNA:ta millilitraa transformoitumiskelpoisia soluja kohden. Transformoimisseoksen soluja maljättiin mini-,.t.# maalimaljoille, joissa kasvualusta sisälsi: 2,8 % K2HP04:ää, 1,2 % KH2P04:ää, 0,4 % (NH4) 2S04: ää, 0,2 % tri-•Λ Na-sitraatti.2H20:ta, 0,04 % MgS04.7H20:ta, 0,00005 % :<t<: MnS04.4H20:ta, 0,4 % L-glutamiinihappoa, 0,5 % glukoosia, ·:·: 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metioniinia, 20 /ug/ml lysiiniä, 20 /ug/ml neomysiiniä, • t · · 1 l t « · · • · · • 15 105483 0/4 % kaseiinia ja 1,5 % agaria. Maljojen yön yli kestäneen inkuboinnin 37°C:ssa jälkeen yksi 50 000:stä neomy-siiniresistentistä pesäkkeestä osoitti kasvanutta proteaa-situotantoa, mikä määritettiin kaseiinipilkkoutumistuot-teiden muodostaman saostumakehän kasvusta pesäkkeen ympärillä agar-maljassa. Tästä pesäkkeestä eristettiin plas-midi-DNA Birnboimin ja Dolyn, Nucleic Acids Res. T_ (1979) 1513-1523, kuvaaman menetelmän mukaan ja se nimettiin pM58:ksi.

ESIMERKKI 2 PB92-seriiniproteaaslgeenin ilmentyminen pM58:n sisältävää Bacillus subtilis lA40:ää viljeltiin mi-nimaalikasvualustassa (Spizizen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 44 (1958) 1072-1078), johon oli lisätty 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metio-niinia, 20 /ug/ml lysiiniä ja 20 /ug/ml neomysiiniä. Kun oli kulunut 24 tuntia, viljelmä sentrifugoitiin ja super-natantista määritettiin proteaasiaktiivisuus käyttäen di-metyylikaseiinia substraattina (Lin et ai., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793). Plasmidin pUBHO sisältävää B. sub-’·’/ tills-viljelmä, jota käytettiin kontrollina, osoitti alle ··” l/60-osan pM58:11a transformoidun viljelmän osoittamasta proteaasiaktiivisuudesta. Proteaasiaktiivisuus inhiboitu! • · täysin käsiteltäessä 1 mM fenyylisulfonyylifluoridiliuok-sella (PMSF), mutta ei käsiteltäessä 20 mM EDTA-liuoksel-la.

Näytteitä edelläkuvatuista supernatanteista analysoitiin proteiinigeelissä Laemmlin, Nature 227 (1970) 680, mene- • · ♦ telmän mukaan. Näissä geeleissä analysoitaviksi aiotut « I < *...· näytteet valmistettiin käsittelemällä supernatantteja 5-%:isella trikloorietikkahapolla (TCA). Näytteen sentri-fugoinnin jälkeen saostuneen proteiinin muodostama pellet- « 1 « • · · • · · • · 16 105483 ti pestiin kahdesti asetonilla, minkä jälkeen se liuotettiin 40 /ul:aan näytepuskuria (0,5M Tris/HCl, pH 7,5, 10 % v/v 2-merkaptoetanolia, 50 % v/v glyserolia ja 0,05 % bro-mifenolisinistä) keittämällä 10 minuutin ajan. Elektrofo-reesiajon jälkeen geelit värjättiin valmisteella Coomassie Brilliant Blue. Sitten viljelmäsupernatanttinäytteet analysoitiin elektroforeettisesti. Käytettiin kolmea eri B. subtilis lA40-kantaa: kantaa, joka sisälsi pUB110:n; tai pM58:n; tai joka ei sisältänyt plasmidia; sekä Bacillus PB92-proteaasia kontrollina. Elektroforeesiajon jälkeen geelit värjättiin käyttäen valmistetta Coomassie Brilliant Blue ja poistettiin väri. Plasmidin pM58 sisältävästä B. subtills-kannasta 1A40 peräisin oleva näyte sisälsi 31 kD:tä proteiinia, joka migroitui kuten Bacillus PB92-pro-teaasi. Tätä proteiinia ei ollut todettavissa pUB110:n sisältävästä B. subtilis-kannasta 1A40 saadussa kontrolli-vyöhykkeessä.

Kaikilla seriiniproteaaseilla on samankaltainen molekyyli-paino. Tämän vuoksi Bacillus PB92:n kloonattu seriinipro-teaasi erotettiin tunnetuista seriiniproteaaseista (B.

‘il! subtllis-subtilisilnl, Carlsberq-subtilisiinl) transfor- moimalla pM58 ja pUBHO proteaasinegatiiviseen B. sub-'«1 ' tilis-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) ja analysoimalla syntyneet solunulkoiset proteaa- • · ϊ,ν sit. Saatuja transformantteja kasvatettiin minimaalikasvu- :V: alustassa (Spizizen et ai., supra), joka sisälsi 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml histidiiniä ja 20 /ug/ml neomy- siiniä. Kun oli kulunut 24 tuntia, otettiin näytteitä, jotka sentrifugoitiin ja analysoitiin ilman esikäsittelyä histidiini/MOPS-geeleissä, jotka sisälsivät 75 mM kalium- \m hydroksidia, 40 mM histidiiniä, 100 mM MOPS:ää (3-(N-mor- *'/! folino)propaanisulfonihappo), pH 7,5, ja 5 % polyakryyli- amidia. Elektroforeesipuskuri sisälsi 40 mM histidiiniä, ·:··: 100 mM MOPS:ää, pH 6,6. Näytteet ajettiin katodiin päin.

V Proteaasinauhat todettiin Agfa Pan 100 Professional- « • «ta a a i a a • · · a a f 17 105483 filmien avulla (Zuidweg et ai., Biotechnol. and Bioengin.

14 (1972) 685-714). Nämä tulokset on esitetty kuviossa 1. Kuten esitetty pM58 käsittää Bacillus PB92-proteaasia koo-daavan geenin.

ESIMERKKI 3

Bacillus PB92-serliniproteaasigeenin sekvenssointi pM58:n erään Ball-Hpal-fragmentin sekvenssi kokonaisuudessaan määritettiin Sangerin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2i. (1977) 6463, menetelmän mukaan. pM58-restriktiofragment-teja (katso kuvio 2) kloonattiin faagi M13-vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 (Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9_ (1981) 309-321). pM58-fragmentti-insertioiden suhteen seulottiin plakki-hybridisaation avulla. Sekvenssoinnin jälkeen valmistettiin kymmenen geenissä tasaisin välein sijaitsevaa oligonukleotidiä ja toistettiin sekvenssointi, jolloin varmistui kuviossa 3 esitetty sekvenssi.

,i. ESIMERKKI 4 i f I * · • I * • ·

« I

Serliniproteaasin sisältävän plasmidin pMAX-4 rakentaminen « · · * * * ·· Plasmidin pUCN710 (kuvio 4A) rakentamiseksi pUBHOtaa pil- \v kottiin Tacrl;llä ja PvuII:lla. Neomysiiniresistenssin » · :.v tuottavan geenin sisältävää fragmenttia puhdistettiin al haisen sulamispisteen omaavassa agaroosissa ja fragmentista tehtiin tylppäpäinen Klenow-polymeraasin ja NTP-mole-kyylien avulla (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, 1982). Plasmidi pUC7 (Vieira et al., Gene 19^ (1982) 259-268) linearisoitiin Sall:llä ja * · ♦ " siitä tehtiin tylppäpäinen kuten edellä on kuvattu. Frag- « · « mentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasin avulla (Maniatis) ja ligatointituotteella transformoitiin E. coll JM103. Va-likointi suoritettiin 2xTY-maljoissa (1,6 % w/v Bacto- * * » I · > · « • 9 ,. 105483 18 tryptonia, 1 % w/v hlivauutetta, 0,5 % natriumkloridia), jossa kasvualusta sisälsi (lisäksi) 50 /ug/ml ampisillii-niä ja 10 /ug/ml neomysiiniä. Saatua, pUCN710:ksi nimettyä plasmidia pilkottiin BamHI:llä. Plasmidia pE194 (Jordan-escu, Plasmid 1 (1978) 468-479) pilkottiin Bell:llä. Pilkkomisista saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-li-gaasin avulla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtills-kanta 1A40. Valikointi suoritettiin minimaalimal-joissa, joissa kasvualusta sisälsi 20 /ug/ml neomysiiniä (katso esimerkki 1). Saatu plasmidi, pE194-neo (kuvio 4A), sisältää neomysiinigeenin.

Proteaasigeenin alakloonaus integroimisvektoriin pE194-neo suoritettiin seuraavasti: pM58:aa (katso esimerkki 1) pilkottiin Hpal:llä ja Ball:llä ja BglII:lla. Plasmidia pE194-neo pilkottiin Hpal:llä. Saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasilla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-kantaa 1A40. Transformantit valikoitiin neomysiiniresistenssin sekä kasvaneen proteaasi-tuotannon suhteen, jolloin viimemainittu pääteltiin kase-·: iinin pilkkoutumistuotesaostumasta (kehämuodostus, katso ; esimerkki 1). Saatiin plasmidi pMAX-4, jonka rakenteesta varmistuttiin restriktioentsyymianalyysin avulla (katso kuvio 4B).

ESIMERKKI 5

Bacillus-kannan PB92 protoplastitransformolnti pMAX-4:llä

Bacillus-kantaa PB92 kasvatettiin yön yli 100 ml:ssa NBSG- :Y: X-kasvualustaa (Thorne et ai., J. Bacteriol. 91_ (1966) :Y: 1012-1020). Viljelmää sentrifugoitiin 10 minuutin ajan • « 4500 kierr./min kierrosnopeudella Sorvall-GSA-roottorilla '··'. varustetussa sentrifugissa. Protoplastit valmistettiin in- ] kuboimalla Bacillus-mlkrobeja tunnin ajan 37°C:ssa 10 ·:· ml:ssa valmistetta Alkaline Holding Medium (AHM), joka si- * · i „ - 105483 sälsi 0,5M sakkaroosia, 0,02M magnesiumkloridia jaj 0,02M Tris/maleaattia, pH 8,0, steriilissä vedessä ja johon oli lisätty 0,4 mg/ml lysotsyymiä. Protoplastit pelletoitiin (10 minuuttia, 4500 kierr./min), uudelleensuspendoitiin 5 ml:aan AHM+-puskuria, pH 8,0 (AHM-puskuri, johon oli lisätty 3,5 % w/v valmistetta Bacto Penassay Broth ja 0,04 % w/v valmistetta Albumine Merieux), sekoitettin ja uudel-leenpelletoitiin kuten edellä. Pelletti uudelleensuspendoitiin 5,0 ml:aan AHM:ää, minkä jälkeen 0,5 ml tätä pro-toplastisuspensiota sekoitettiin 5 /ug:aan demineralisoi-tua vettä, joka sisälsi 1 /ug:n plasmidi-DNA:ta, ja inku-boitiin 2 minuutin ajan 30-%:isen w/v polyetyleeniglykoli 8000 -liuokseen, pH 8,0, läsnäollessa. Laimennettiin suhteessa 1:3 AHM+-kasvualustaan, pH 8,0, ja sentrifugoitiin, minkä jälkeen pelletti uudelleensuspendoitiin pieneen tilavuuteen (1 ml) AHM+-kasvualustaa ja inkuboitiin 2-3 tunnin ajan. Sadan mikrolitran näyte-eriä maljättiin vasta-valmistettuihin regeneroimismaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 0,5M Na-sukkinaatti/HCl:ää, pH 8,0, 1,5 % w/v aga-ria, 0,5 % w/v kasaminohappoja, 0,5 % w/v hiivauutetta, ;:· 0,031M fosfaattipuskuria, pH 8,0, 0,5 % w/v glukoosia, 0,02M magnesiumkloridia ja 0,02 % w/v Albumine Merieux -valmistetta. Nämä maljat sisälsivät niinikään 1000 /ug/ml neomysiiniä valikointia silmälläpitäen. Maljoja inkuboi-"" tiin 37°C:ssa vähintään 72 tunnin ajan, minkä jälkeen pe- II säkkeet kopiomaljattiin Heart Infusion -valmiste-agar- • * · *·*·' maljoille, jotka sisälsivät 20 /ug/ml neomysiiniä.

ESIMERKKI 6 * · pMAX-4:n integrointi Bacillus-kannan PB92 kromosomiin 0 0 • * · ' ' ' • 4 pMAX-4:n sisältävä Bacillus-kantaa PB92 viljeltiin 20 /ug/ml neomysiiniä sisältävässä Heart Infusion -valmiste-maljassa ja eräs pesäke siitä siirrostettiin 100 ml:aan valmistetta Tryptone Soya Broth (TSB), joka sisälsi 1 • · 20 105483 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37°C:ssa. Kahden millilitran erä viljelmää (noin 109 so-lua/ml) laimennettiin 100 ml:aan samaa kasvualustaa, joka sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50eC:ssa. 24 tunnin kuluttua 5 ml:n erä viljelmää (noin 109 solua/ml) laimennettiin toistamiseen kuten edellä on kuvattu, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50°C:ssa 1 /ug/ml neomysiiniä läsnäollessa. Viimemainittu menettely toistettiin edelleen kerran. Sitten solususpensio laimennettiin satakertaisesti, minkä jälkeen se maljättiin Heart Infusion - (HI) - valmiste-agar- (Difco) maljoille, joissa kasvualusta sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä. Maljoja inkuboitiin 16 tunnin ajan 50°C:ssa. Neomysiiniresistentit pesäkkeet eristettiin ja niitä viljeltiin 10 ml:ssa TSB-kasvu-alustaa, joka sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä, 16 tunnin ajan 37°C:ssa. Näistä viljelmistä eristettiin kokonais-DNA (Holmes et ai., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197) ja plasmidin puuttumisesta varmistuttiin ajamalla DNA:n elektroforeesi agaroosigeelissä. Plasmidin puuttuminen näytteistä, joista plasmidi-DNA ei ollut todettavissa, varmistettiin transformoimalla kokonais-DNA:11a B. subti-

» · I · M

: * *': lis-kantaa 1A40. Näytteet, jotka eivät kyenneet transfor- moimaan B. subtills-kantaa 1A40, katsottiin plasmidia si-sältämättömiksi. Saatiin neomysiiniresistentti, plasmidia ]·”’. vailla oleva Bacillus-kanta, joka nimettiin PBTl09:ksi.

• · · Tämä kanta sisälsi kopion plasmidista pMAX-4 kromosomiinsa integroituneena.

Integroituminen kantaan PBT109 tapahtui niinkutsutun Campbell-tyyppisen mekanismin välityksellä homologisena • · i.i.: rekombinaationa, jonka tuloksena kaksi peräkkäin järjes- :V: täytynyttä proteaasigeeniä sijaitsi kromosomissa plasmidi- ..V sekvenssien erottamina. Tämä kannan PBT109 geneettinen järjestely vahvistettiin kuten on esitetty vireillä ole-| vassa, tämän kanssa samanaikaisesti jätetyssä EPA-hakemus- _·:* julkaisussa (EPA-0 000 000), joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

• * 21 105483 ESIMERKKI 7

Transformoitujen kantojen proteaasltuotanto

Transformoitujen kantojen proteaasituotantoa testattiin lisäämällä 0,2 ml noin 10^ solua/ml sisältävää TSB-vil-jelmää 500 ml:n ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 100 ml US-patenttijulkaisussa n:o Re. 30,602 kuvattua tuotan-toviljelmää. Testattaessa B. subtilis-kantoj a pH säädettiin kuitenkin 7,Oraan. Kun kyseessä olivat kannat DB104 (pUBHQ), DB104 (pMAX-4), PB92 (pMAX-4), neomysiiniä lisättiin 20 /ug/ml ja PBTl09:n kysessä ollessa 1 /ug/ml. Näiden solulinjojen suhteellinen proteaasltuotanto on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Proteaasltuotanto transformoidussa Bacillus-lajeissa kanta suhteellinen pro- neomysiini- _teaasltuotanto** lisäys_

Bacillus PB92 100,0 % .:. Bacillus PB92 (pMAX-4) 120,0 % + !v. Bacillus PBT109 120,0 % + .V. B. subtills DB104 (pUBHO)1 1,5 % + B. subtilis DB104 (pMAX-4) 10,0 % +

Proteaasituotannon mittaamiseksi vain pMAX-4:n proteaa-sigeenistä tämä plasmidi transformoitiin (Spizizen et • « v.i ai., (1961) supra) myös eksoproteaasinegatiiviseen B.

subtilis-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) kuvattu esimerkissä 2.

« · il • · · · ψ · · • · 1 • 1 22 105483 ** Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen dimetyylika-seiinia substraattina kuten kuvanneet Lin et ai., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793.

Suuremman mittakaavan (10 litraa) fermentaatioissa Bacillus PB92 (pMAX-4) osoitti PBT109:ään verrattuna epästabiilisuutta ja alentunutta tuotantoa, ellei käymisalustaan lisätty neomysiiniä.

Edellä saatujen tuloksien nojalla on selvää, että keksintö koskee yksinkertaista ja tehokasta menettelytapaa serii-niproteaasin tuottamiseksi, jossa homologinen tai hetero-loginen seriiniproteaasia koodaava geeni viedään stabii-listi teollisten Bacillus-kantojen kromosomiin. Keksintö koskee myös seriiniproteaasin tehostunutta tuotantoa ja jotain seriiniproteaasia tuottavassa Bacillus-isännässä. Kun plasmidirakenteet integroituvat isäntäsolukromosomei-hin, päästään stabiilimpaan tilanteeseen tuotantofermen-taatioita ja suuresti tehostunutta proteaasituotantoa silmälläpitäen, kuin jos läsnä on kromosominulkoisia plasmi-dirakenteita.

Ill· I I (

Kaikki tässä patenttijulkaisussa mainitut julkaisut ja pa-tenttihakemusjulkaisut osoittavat viitteellisesti tämän keksinnön koskeman alan ammattilaisten teknisen taidon ta-I son. Kaikki julkaisut ja patenttihakemus julkaisut sisälly- ***** tetään tähän viitteinä samassa määrin, kuin jos kukin yk sittäinen julkaisu tai patenttihakemusjulkaisu olisi nimenomaisesti ja itsenäisesti osoitettu sisällytettäväksi viitteeksi.

• · « « · t t · • · :Y: Kuvattuamme keksinnön nyt kokonaisuudessaan alan keskimää- • · t..V räiselle taitajalle lienee ilmeistä, että siihen voidaan

I I

tehdä useita muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta 1 oheisten patenttivaatimuksien hengestä tai piiristä.

• · ·« • ·

Claims (13)

1. 23 105483
2. 1. Menetelmä kiinnostavan endogeenisen entsyymin tuotannon tehostamiseksi alkalofiilisessa Bacillus-isäntä-solussa, tunnettu siitä, että yhdistetään fusogeenin läsnäollessa emäksisessä pH:ssa kyseisen isäntäsolun protoplasti ja plasmidirakenne, joka sisältää mainittua entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin, kyseisessä isäntäsolussa funktionaalisen repiikaatiojärjestelmän ja valintamerkkigeenin, jolloin kyseinen DNA tulee sisällytetyksi sanottuun isäntäsoluun, valitaan mainitun DNA:n stabiilisti sisältävien isän-täsolujen suhteen ja viljellään näitä isäntäsoluja mainitun kiinnostavan entsyymin synteesiä suosivissa olosuhteissa.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että , esikäsitellään mainittuja Bacillus-soluja lysotsyymillä emäksisessä alustassa noin 20 °C - noin 37 °C:ssa proto-plastien muodostamiseksi, < « I * · · • _ erotetaan protoplast it lysotsyymistä, — • · • · · i « « • * yhdistetään nämä protoplastit mainittuun plasmidiraken- • · teeseen fusogeenin läsnäollessa noin 20 °C - noin 37 °C: .*··. ssa, • · ·♦· ··· • · • · T laimennetaan fusogeeni ja regeneroidaan mainitut Bacil- ' lus-solut, ja «· « " viljellään regeneroituja Bacillus-soluja valikoivissa : olosuhteissa. _ • ♦ · • * 24 105483
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu plasmidirakenne sisältää transkription suunnassa transkription ja translaation aloituksen säätelyalueen, mainittua entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin ja transkription ja translaation lopetuksen säätelyalueen, jolloin mainitut säätelyalueet ovat funktionaalisia kyseisessä isäntäsolussa.
5. 4. Jonkin edellä esitetyistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun isäntäsolun transformoimaton kanta on villityyppinen tai mutantti alkalofiili Bacillus, joka tuottaa mainittua entsyymiä, jolloin entsyymin endogeeninen tuotanto isäntäsolussa tehostuu.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun isäntäsolun transformoimaton kanta on villityyppisen Bacilluksen mutanttikanta, joka ei tuota mainittua kiinnostavaa endogeenista entsyymiä.
7. 6. Jonkin edellä esitetyistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että villityyppinen Bacil- '·· lus on Bacillus novo -laji PB92. .· · 7. Jonkin edellä esitetyistä patenttivaatimuksista mukai- it'·' nen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu endogeeninen entsyymi on seriiniproteaasi. • · • · · • · • *
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu #···. siitä, että mainittu seriiniproteaasi on korkea-alkalinen P p seriiniproteaasi. I · • 9 ·
9. 9. Jonkin edellä esitetyistä patenttivaatimuksista mukai- • I I nen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on korkea-alkalinen seriiniproteaasi, jolla on ainakin 70 • * .. ; %:n homologia aminohapposekvenssiin: • · · • · 25 105483 . HjN-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-O-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-Ii-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-Li-V-K-Q-K.-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G- L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
10. 10. Jonkin edellä esitetyistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA on pysyvästi integroitu isäntäsolun perimään.
11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseisen DNA:n vähintään kaksi kopiota on pysyvästi integroitu isäntäsolun perimään.
12. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteaasigeenin kaksi kopiota sijaitsevat peräkkäin isäntäsolun kromosomissa plasmidisekvenssien erottamina. « · · • 1 4
13. 13. Jonkin edellä esitetyistä patenttivaatimuksista t · r · mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkigeeni on antibioottinen resistenssigeeni. • · I 1 · • · · • · • 1 • · 1 - - — - · - • · · • · *·« • · "· · • · · ··· • · • · « 26 105483