DE3856339T2

DE3856339T2 - Transformation von alkalophilen Bazillus-Stämmen

Info

Publication number: DE3856339T2
Application number: DE3856339T
Authority: DE
Inventors: Leonardus Johannes Sofie Marie Mulleners; Johannes Cornelis Van Der Laan; Christiaan Albertus Gerardus Van Eekelen
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-29
Publication date: 1999-11-04
Anticipated expiration: 2008-03-01
Also published as: ATE180016T1; CN88101681A; DK175852B1; PT86864B; FI105483B; NO884423D0; JPH01502876A; FI119028B; DK175738B1; KR0127560B1; FI925413A; KR890700665A; LV10307A; DK200401262A; FI20001152A; HU213220B; LV10307B; DK593988A; BR8805647A; FI106726B

Description

TECHNISCHES GEBIET

Das Gebiet dieser Erfindung betrifft die Herstellung von interessanten Polypeptiden in alkalophilen Bacillus-Stämmen unter Einsatz von Rekombinationstechniken.

HINTERGRUND

Bacilli sind weithin für die Herstellung von industriell wichtigen Enzymen, wie α-Amylase, neutraler Protease und alkalischen oder Serinproteasen, eingesetzt worden. Allgemein können bakterielle Serinproteasen aus vielen prokaryotischen Organismen, einschließlich gram-negativen Organismen, wie Serratia- oder Pseudomonas-Spezies, und gram-positiven Bakterien, wie Micrococcus- oder Bacillus-Spezies, gewonnen werden. Eine Gruppe von industriell wichtigen Serinproteasen von besonderem Interesse sind jene, die hohe Aktivität in alkalischen Medien aufweisen. Obwohl industrielle Serinproteasen von verschiedenen Bacillus-Spezies, einschließlich B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. alcalophilus und anderen Bacillus- Spezies, produziert werden, werden die hochalkalischen Proteasen im allgemeinen von Bacillus-Stämmen produziert, die in der Lage sind, bei alkalischem pH zu wachsen. Ein Beispiel für einen solchen Bacillus ist Bacillus novo species PB92.
Es besteht beträchtliches Interesse daran, Stämme von Bacilli zu entwickeln, die in der Lage sind, proteolytische Enzyme in hoher Ausbeute, insbesondere hochalkalische Proteasen zu produzieren.

RELEVANTE LITERATUR

Mehrere Gene für extrazelluläre Enzyme von Bacilli sind erfolgreich kloniert worden, wie die α-Amylasegene von B. amyloliquefaciens (Palva et al., Gene 15 (1981), 43-51), B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983), 267), B. stearothermophilus (Mielenz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 5975-5979; EP-A-0057976) und B. subtilis (Yang et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 237); das Levansucrase-Gen von B. subtilis (Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 1424), die neutrale Protease kodierenden Gene von B. stearothermophilus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983), 831), B, amyloliquefaciens (Honjo et al., J. Biotech. 1 (1984), 165) und von B. subtilis (Yang et al., J. Bacteriol. 160 (1984), 115); die Serin- oder alkalische Protease kodierenden Gene von B. subtilis (Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1184), B. licheniformis (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 8913) und B. amyloliquefaciens (Wells et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 7911).
Eine Produktion industrieller Serinproteasen in verschiedenen Bacillus-Spezies wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 3,674,643, 3,723,250 und 4,480,043 beschrieben. Eine Produktion von hochalkalischem proteolytischem Enzym durch Bacillus-Stämme, die in der Lage sind, bei alkalischem pH zu wachsen, wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 3,723,250, Re. 30,602 und 4,480,037 beschrieben. Hinsichtlich eines Übersichtsartikels betreffend die Verwendung von Bacilli zur Produktion von industriell wichtigen Enzymen siehe beispielsweise Debabov, "The Industrial Use of Bacilli", in: The Molecular Biology of Bacilli (Acad. Press, New York, 1982).
Ein Protokoll für eine Protoplastentransformation von B. subtilis wurde von Chang und Cohen beschrieben (Mol. Gen. Genet. 168 (1979), 111-115). Ähnliche Protokolle sind für die erfolgreiche Transformation von B. megaterium-Protoplasten (Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Letters 7 (1980), 261-263), B. amyloliquefaciens-Protoplasten (Smith et al., Appl. and Env. Microbiol. 51 (1986), 634), B. thuringiensis-Protoplasten (Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981), 213-217), B. sphaericus-Protoplasten (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 (1984), 203) und B. larvae-Protoplasten (Bakhiet et al., Appl. and Env. Microbiol. 49 (1985), 577) beschrieben worden. Jedoch berichteten Bakhiet et al. (a. a. O.) über erfolglose Ergebnisse mit B. popillae. Mann et al., Current Microbiol. 13 (1986), 131-135, berichteten über eine erfolgreiche Transformation mit B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans und B. laterosporus. Jedoch war das Protokoll nicht erfolgreich mit B. coagulans, B. cerus und B. pumilus, sogar obwohl gute Protoplastenbildung beobachtet worden war. Bourne und Dancer, J. Gen. Micro. (1986) 32, 251, offenbaren die Transformation von Bacillus-Spezies, die eng verwandt ("closely related") mit B. subtilis 168 sind, und berichten über variierende Transformationsraten. Andere Methoden zum Einschleusen von DNA in Protoplasten umfassen eine Fusion mit DNA enthaltenden Liposomen, Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985), 97.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt folglich ein Verfahren zum Verstärken der Produktion eines endogenen Enzyms von Interesse in einer Wirtszelle eines alkalophilen Bacillus-Stamms bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
Zusammengeben eines Protoplasten der Wirtszelle und eines Plasmidkonstrukts, das eine das Enzym kodierende DNA-Sequenz, ein in der Wirtszelle funktionales Replikationssystem und ein Selektionsmarkergen umfaßt, in Gegenwart eines Fusogens bei alkalischem pH, wobei die DNA in die Wirtszelle eingeschleust wird, Selektionieren auf die Wirtszellen, die die DNA stabil darin bewahrt enthalten, und
Züchten der Wirtszellen unter Bedingungen, die eine Synthese des Enzyms von Interesse begünstigen.
Unter einem bevorzugten Aspekt kann das Verfahren umfassen:
Vorbehandeln der Bacillus-Zellen mit Lysozym in einem alkalischen Medium bei ungefähr 20ºC bis ungefähr 37ºC zur Bildung von Protoplasten,
Abtrennen der Protoplasten von dem Lysozym,
Zusammengeben der Protoplasten mit dem Plasmidkonstrukt in Gegenwart eines Fusogens bei ungefähr 20ºC bis ungefähr 37ºC, Verdünnen des Fusogens und Regenerieren der Bacillus-Zellen und Züchten der regenerierten Bacillus-Zellen unter selektiven Bedingungen.
Das Plasmidkonstrukt ist typischerweise eines, das in der Transkriptionsrichtung einen regulatorischen Bereich für die Transkriptions- und Translationsinitiation, eine das Enzym kodierende DNA-Sequenz und einen regulatorischen Bereich für die Transkriptions- und Translationstermination umfaßt, wobei die regulatorischen Bereiche in der Wirtszelle funktional sind.
Der untransformierte Elternstamm der Wirtszelle kann ein Wildtyp- oder mutierter alkalophiler Bacillus sein, der die Serinprotease produziert, oder ein Wildtyp-Bacillus, der keine Serinprotease produziert.
Ein geeigneter Bacillus ist Bacillus novo species PB92.
Das endogene Enzym kann beispielsweise eine Serinprotease, wie eine hochalkalische Serinprotease, sein.
Unter einem weiteren Aspekt ist die DNA stabil in das Genom der Wirtszelle integriert. In einer Ausführungsform sind mindestens zwei Kopien der DNA stabil in das Wirtszellgenom integriert, beispielsweise in einer Tandem-Anordnung in dem Wirtszellchromosom, die durch Plasmidsequenzen voneinander getrennt sind.
Wenn zwei Kopien der das Enzym kodierenden DNA in das Wirtszellgenom integriert sind oder wenn das Markergen ein Antibiotikaresistenzgen ist, bildet die resultierende transformierte alkalophile Bacillus-Wirtszelle einen weiteren Aspekt der Erfindung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer Histidin/MOPS- Gelelektrophorese, ausgeführt an Überständen von Kulturen von B. subtilis DB104, welche pUB110 bzw. pM58 enthalten, im Vergleich mit mehreren Subtilisinen.
Bahn 1: Carlsberg-Subtilisin
Bahn 2: Bacillus PB92-Protease
Bahn 3: Bacillus subtilis-Subtilisin
Bahn 4: Bacillus subtilis DB104 (pM58)
Bahn 5: Bacillus subtilis DB104 (pUB110)
Fig. 2 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pM58. Darüber hinaus ist die Sequenzierungsstrategie in dem oberen Teil der Figur gezeigt. Die als Pfeile ausgeführten durchgezogenen Linien stehen für die Fragmente, die in den M13- Phagenvektoren mp10, mp11 und mp18 kloniert wurden. Der untere Teil der Figur zeigt die Sequenzierungsstrategie unter Verwendung von Oligonukleotiden, die in regelmäßigen Abständen auf dem Proteasegen lokalisiert sind.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz des kodierenden Strangs korreliert mit der Aminosäuresequenz der Bacillus PB92- Serinprotease. Promotoren (P&sub1;, P&sub2;), Ribosomenbindungsstelle (rbs) und Terminationsregionen (term) der DNA-Sequenz sind ebenfalls gezeigt. Die numerierten durchgezogenen Linien stehen für die Lage der zehn Oligonukleotide, die für die Sequenzierung verwendet wurden.
Fig. 4A zeigt die Konstruktion des Plasmids pE19-4-neo.
Fig. 4B zeigt die Konstruktion des Plasmids pMAX-4.

BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue DNA- Konstrukte und Bacillus-Stämme für die Herstellung proteolytischer Enzyme in hoher Ausbeute wie auch Methoden für deren Herstellung bereitgestellt. Wirtszellen werden transformiert, indem aus dem Bacillus-Wirtsstamm hergestellte Protoplasten unter Fusionsbedingungen mit einem Plasmidkonstrukt, welches eine ein proteolytisches Enzym kodierende DNA-Sequenz umfaßt, zusammengegeben werden.
Hochalkalische Proteasen sind Serinproteasen oder Subtilisine mit hoher Aktivität in alkalischem Medium. Spezieller haben hochalkalische Proteasen eine optimale Aktivität bei pH- Werten über ungefähr 9 und bewahren mindestens 80% dieser optimalen Aktivität bei einem pH von ungefähr 11 oder sogar höher. Hochalkalische Proteasen werden allgemein von Bacillus-Stämmen produziert, die in der Lage sind, bei alkalischem pH zu wachsen.
Die beim Isolieren des Proteasegens eingesetzten Techniken sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich Synthese, Isolierung aus genomischer DNA, Herstellung ausgehend von cDNA oder Kombinationen davon. Eine Isolierung und Expression von hochalkalischen Proteasegenen sind in dem Prioritätsdokument, auf dem diese Anmeldung beruht, Europäische Anmeldung Nr. EP-A- 87200358.7, deren Offenbarung in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, offenbart. Die verschiedenen Techniken für eine Manipulation der Gene sind wohlbekannt und umfassen Restriktion, Verdau, Resektion, Ligation, in vitro-Mutagenese, Primer-Repair, Einsatz von Linkem und Adaptoren und ähnliches. Siehe Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Allgemein umfaßt das Verfahren, eine genomische Bibliothek aus einem Organismus, der eine hochalkalische Protease exprimiert, herzustellen. Das Genom des Donor-Mikroorganismus wird isoliert und durch ein geeignetes Restriktionsenzym geschnitten. Die resultierenden DNA-Fragmente des Donorstamms werden dann in einen Klonierungsvektor ligiert, der mit einer kompatiblen Restriktionsendonuklease geschnitten worden ist.
Klone, die das insertierte DNA-Fragment enthalten, können mittels eines Resistenzmarkers oder durch Verwendung eines direkten oder positiven Selektionsverfahrens, wie jenem, das für B. subtilis entwickelt worden ist (Gryczan und Dubnow, Gene 20 (1982), 459-469), identifiziert werden. Zusätzlich können Klone, die eine hochalkalische Protease exprimieren, durch die Verwendung von gegen das Expressionsprodukt gerichteten Antikörpern oder eine Detektion von Substratverlust oder Bildung eines Produkts des proteolytischen Enzyms identifiziert werden. Beispielsweise können Kolonien, die ein Markergen, wie Antibiotikaresistenz, exprimieren, hinsichtlich Proteaseproduktion, die beispielsweise durch erhöhte Präzipitation eines Hofs aus Casein um auf Casein enthaltenden Agarplatten ausplattierte Kolonien herum bestimmt wird, gescreent werden.
Ist einmal ein vollständiges Gen identifiziert worden, entweder als cDNA oder als chromosomale DNA, kann es dann auf eine Vielzahl von Wegen manipuliert werden, um eine Expression zu ermöglichen. Bacillus-Wirte können eingesetzt werden, die beispielsweise alkalophile Bakterien umfassen, einschließlich jenen alkalophilen Bacilli, die bereits Produzenten von hochalkalischen Proteasen sind. Ein bevorzugter Wirtsorganismus ist Bacillus novo sp. PB92. Es ist dementsprechend bequem, die Wildtypsequenz mit regulatorischen Signalen und sekretorischen Leadersequenzen u. s. w. beizubehalten, obwohl von anderen Bacilli abgeleitete Kontrollregionen, die in dem Bacillus-Wirtsstamm funktional sind, ebenfalls verwendet werden können. Ein geeigneter Vektor zum Transformieren einer Bacillus-Zelle umfaßt folglich ein Strukturgen, das eine hochalkalische Protease kodiert, die aus einem alkalophilen Bacillus gewonnen werden kann, einschließlich Kontrollregionen, wie einer Promotorsequenz, einer die Ribosomenbindungsstelle bildenden Sequenz und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation des alkalischen Proteasegens kontrollieren, wobei die Kontrollregionen in einer alkalophilen Bacillus-Wirtszelle funktional sind.
Der Vektor kann zusätzlich ein Markergen, beispielsweise zum Vermitteln einer Resistenz gegen ein Antibiotikum, gegenüber welchem der Wirtsstamm empfindlich ist, und einen Replikationsursprung, der zur autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist, umfassen. Der Replikationsursprung kann einer sein, der eine Mutation aufweist, die dessen Funktionieren in der Wirtszelle temperaturabhängig macht, wodurch eine Selektion hinsichtlich einer chromosomalen Integration ermöglicht wird, wie von Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1433 beschrieben.
Die Aminosäuresequenz kann verwendet werden, um eine Sonde zu gestalten, um eine cDNA- oder genomische DNA-Bibliothek, hergestellt aus mRNA oder DNA aus Zellen, die als Donorzellen für ein hochalkalisches Proteasegen von Interesse sind, zu screenen. Unter Verwendung der cDNA der hochalkalischen Protease oder eines Fragments davon als Hybridisierungssonde können strukturell verwandte Gene, die in anderen Organismen gefunden werden, leicht kloniert werden. Von besonderem Interesse ist die Isolierung von Genen aus Organismen, die hochalkalische Serinproteasen exprimieren, durch Verwendung von Oligonukleotidsonden, die auf den Nukleotidsequenzen von hochalkalische Serinproteasegenen beruhen, die aus alkalophilen Bacillus- Stämmen, einschließlich Bacillus novo species PB92, gewonnen werden können. Solche Sonden können beträchtlich kürzer als die gesamte Sequenz sein, sollten jedoch mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, mehr bevorzugt Nukleotide Länge haben. Längere Oligonukleotide bis zu der vollständigen Länge des Gens, vorzugsweise von nicht mehr als 1200 Nukleotiden Länge sind ebenfalls nützlich. Sowohl RNA- als auch DNA-Sonden können verwendet werden.
Bei einer Verwendung werden die Sonden typischerweise in einer detektierbaren Weise markiert (z. B. mit ³²P, ³H, Biotin oder Avidin) und werden mit einzelsträngiger DNA oder RNA aus dem Organismus, in dem ein Gen gesucht wird, inkubiert. Eine Hybridisierung wird mittels der Markierung detektiert, nachdem einzelsträngige und doppelsträngige (hybridisierte) DNA (oder DNA/RNA) getrennt worden sind (typischerweise unter Verwendung von Nitrocellulosepapier). Für eine Verwendung mit Oligonukleotiden geeignete Hybridisierungstechniken sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Obwohl Sonden normalerweise mit einer detektierbaren Markierung verwendet werden, welche eine leichte Identifizierung ermöglicht, sind auch unmarkierte Oligonukleotide nützlich, sowohl als Vorläufer markierter Sonden als auch für eine Verwendung in Methoden, die eine direkte Detektion doppelsträngiger DNA (oder DNA/RNA) ermöglichen. Dementsprechend bezieht sich der Begriff Oligonukleotidsonde sowohl auf markierte als auch unmarkierte Formen. Die Ligationsmischung wird dann verwendet, um kompetente B. subtilis-Zellen zu transformieren. Unter Verwendung des Markergens als Selektionsmittel können dann rekombinante Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung charakterisiert werden.
Für eine Produktion hochalkalischer Protease ist eine bevorzugte DNA-Sequenz für eine Verwendung zum Transformieren von Bacillus-Stämmen, welche bereits Serinprotease produzieren, eine Sequenz, die aus Bacillus novo species PB92 stammt. Die Aminosäuresequenz der von der DNA-Sequenz kodierten Serinprotease ist, wie folgt:
H&sub2;N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
Obwohl der bevorzugte Stamm zum Bereitstellen des Proteasegens Bacillus novo species PB92 ist, kann im wesentlichen die gleiche Serinprotease aus anderen alkalophilen Bacilli erhalten werden. Solche Proteasegene, die mindestens ungefähr 70% und vorzugsweise ab ungefähr 80% Homologie zu der Aminosäuresequenz von Bacillus PB92 aufweisen, sollen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Es ist wünschenswert, daß das Expressionsprodukt sezerniert wird. Da die alkalische Protease sezerniert wird, können die sekretorischen Leadersignale und Prozessierungssignale der Wildtypsequenz verwendet werden. Zusätzlich kann ein fusioniertes Gen hergestellt werden, indem eine 5'-Sequenz an dem Strukturgen vorgesehen wird, die eine sekretorische Leadersequenz und ein Prozessierungssignal kodiert. Beispielhafte heterologe sekretorische Leadersequenzen umfassen die sekretorischen Leadersequenzen von Bacillus-Amylase- und -Proteasegenen. Durch Fusion der sekretorischen Leadersequenz mit dem Strukturgen von Interesse innerhalb des korrekten Leserasters kann die reife alkalophile Protease in das Kulturmedium sezerniert werden.
Die Expressionskassette kann vollständig oder teilweise von natürlichen Quellen und entweder vollständig oder teilweise von zu der Wirtszelle homologen Quellen oder von zu der Wirtszelle heterologen Quellen abgeleitet sein. Die verschiedenen DNA-Konstrukte (DNA-Sequenzen, Vektoren, Plasmide, Expressionskassetten) der Erfindung werden isoliert und/oder gereinigt oder synthetisiert und sind folglich nicht "natürlich vorkommend".
Abhängig davon, ob eine Integration des Strukturgens in das Chromosom des Wirtsstamms oder eine Beibehaltung auf einem extrachromosomalen Element gewünscht wird, kann ein Replikationssystem für Bacillus mitumfaßt sein oder nicht. Für eine Integration können in dem Plasmidkonstrukt Abschnitte von Homologie mit dem Bacillus-Genom verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination zu erhöhen. Darüber hinaus erlaubt der Einbau eines temperaturempfindlichen Replikationsursprungs in das Plasmidkonstrukt eine Selektion hinsichtlich einer chromosomalen Integration. Siehe beispielsweise Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1433.
Mehr als eine Kopie des Strukturgens kann in die Wirtszelle insertiert werden, um die Expression des Strukturgens zu amplifizieren. Eine stabile Amplifikation des Strukturgens kann erzielt werden, indem mindestens eine zusätzliche Kopie des Strukturgens in das Wirtszellgenom integriert und hinsichtlich Transformanten selektiert wird, in denen Kopien des Strukturgens durch endogene chromosomale Sequenzen voneinander getrennt sind. DNA-Konstrukte und Methoden für prokaryotische Systeme sind in der Europäischen Anmeldung Nr. EP-A-87200356.1, deren Offenbarung in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben.
Zusätzlich zu dem Replikationssystem wird üblicherweise mindestens ein Markergen in das Plasmidkonstrukt eingebaut werden. Mit Markergen wird ein Strukturgen gemeint, das in einem Wirt exprimiert werden kann und eine Biozid- oder Virusresistenz oder Resistenz gegenüber Schwermetallen, Immunität und ähnliches bereitstellt. Bezüglich Biozidresistenz kann dies eine Resistenz gegenüber Antibiotika, beispielsweise Neomycin, Kanamycin, Tetracyclin, u. s. w. umfassen. Das Markergen wird so ausgewählt, daß eine Selektion bei geringer Kopienzahl bei einer Antibiotikakonzentration, die das Wachstum rekombinanter Zellen nicht schwerwiegend behindert, gewährleistet wird.
Die verschiedenen DNA-Sequenzen können von verschiedenen Quellen abgeleitet und miteinander verknüpft sein, um einen Vektor bereitzustellen, der eine oder mehrere passende, vorzugsweise nur einmal vorkommende Restriktionsschnittstellen um faßt, um eine Insertion oder Substitution der Strukturgene an solchen Stellen zu ermöglichen, um das Plasmidkonstrukt bereitzustellen.
Ist das Plasmidkonstrukt einmal hergestellt, kann es verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Der Wirts-Bacillus kann jeder Bacillus-Stamm sein, jedoch berücksichtigt eine Wahl eines geeigneten Stamms Faktoren, die eine Produktion hochalkalischer Proteasen erhöhen können. Eine Produktion kann auf eine Vielzahl von Wegen erhöht werden, einschließlich einer Verwendung eines Wirts, in dem das gewünschte Produkt in geringerem Ausmaß abgebaut wird, Erkennung von regulatorischen Signalen, Einfachheit der Sekretion u. s. w. Obwohl ein bevorzugter Wirts-Bacillus ein Produzent einer hochalkalischen Protease ist, entweder ein Wildtyp-Bacillus oder ein mutierter Bacillus, kann folglich der Wirts-Bacillus auch eine Mutante eines Produzenten von hochalkalischer Protease sein, der hochalkalische Protease nicht produziert.
Hochalkalische Protease produzierende Bacilli sind taxonomisch nicht gut klassifiziert und werden im allgemeinen als alkalophile Bacillus-Stämme bezeichnet, Beispiele von Bacillus- Stämmen, die in der Lage sind, bei alkalischem pH zu wachsen, sind beispielsweise in den US-Patenten Nr. 3,723,250, Re. 30,602 und 4,480,037 beschrieben. Ein Beispiel eines bevorzugten alkalophilen Bacillus-Wirtsstamms ist der Stamm Bacillus novo species PB92, der u. a. in dem US-Patent Nr. Re. 30,602 offenbart ist.
Industrielle alkalophile Bacillus-Stämme können ebenfalls als Wirtszellen verwendet werden. Industrielle Bacillus-Stämme stammen von Organismen ab, die aus dem Boden isoliert oder von Hinterlegungsstellen oder anderen Quellen erhalten werden können, und werden durch genetische Modifizierung solcher Bacillus-Stämme erhalten. Die industriellen Bacillus-Stämme sind dadurch gekennzeichnet, daß sie gegenüber genetischem Austausch, wie Phageninfektion oder Transformation, resistent sind. Die Stämme sind stabil und können zu Sporenbildung in der Lage sein oder nicht. Sie sind üblicherweise prototroph und modifiziert, so daß sie hohe Ausbeuten an endogenen Proteinprodukten, wie den Enzymen α-Amylase und verschiedenen Proteasen, gewährleisten. Die Ausbeute an endogenem Proteinprodukt, die in einem industriellen Produktionsprozeß erhalten wird, kann sich auf mindestens 5 g/l (0,5% (Gew./Vol.)) belaufen. Industrielle Stämme sezernieren auch DNasen, die zu einem Abbau von DNA in dem Medium führen, was einen Schutz gegenüber genetischem Austausch gewährleistet.
Eine Transformation alkalophiler Bacillus-Stämme umfaßt vorzugsweise die Verwendung von Protoplasten dieser Stämme. Jedoch funktioniert das herkömmliche Protoplastentransformationsprotokoll, wie es von Cohen et al. (a. a. O.) beschrieben wurde, nicht für alkalophile Bacillus-Stämme. Dementsprechend mußten zusätzliche Protokolle entwickelt werden.
Bei alkalophilen Bacilli kann eine Bildung und Regeneration von Protoplasten bei hohem pH, vorzugsweise bei ungefähr pH 8, erfolgen. Protoplasten können hergestellt werden, indem die Zellen in einem alkalischen Holding-Medium (AHM), pH 7, 8 bis 8,5, resuspendiert werden, und dann die Zellen 30-80 min bei 37ºC inkubiert werden. Bezüglich eines Beispiels eines AHM siehe Beispiel 5. Die resultierenden Protoplasten werden dann gewaschen, um Lysozym zu entfernen, dann in AHM resuspendiert. Das Plasmidkonstrukt und der alkalophile Bacillus- Wirtsprotoplast werden dann in Gegenwart eines geeigneten Fusogens zusammengegeben. Obwohl jedes Fusogen eingesetzt werden kann, das die gewünschte Effizienz bereitstellt, wird zumeist festgestellt, daß Polyethylenglycol (Molekulargewicht 1000- 8000) eine Fusion hoher Effizienz überaus bequem gewährleistet. Aus dem Bacillus-Akzeptorstamm hergestellte Protoplasten werden mit dem Plasmidkonstrukt nicht mehr als 5 min. vorzugsweise nicht länger als 2 min. in Gegenwart von Polyethylenglycol gemischt. Die Fusogenmischung wird dann durch ein herkömmliches Nährmedium ersetzt, in dem die Zellen bis zu 5 h, vorzugsweise 2-3 h inkubiert werden, bevor sie auf Regenerationsplatten transferiert werden. Die Regenerationsplatten enthalten ein Antibiotikum, wie Neomycin, für eine Selektion von Transformanten.
Klone mit episomaler Beibehaltung des DNA-Konstrukts können durch Detektion einer Expression der hochalkalischen Serinprotease identifiziert werden. Um jene Klone zu identifizieren, die das Expressionskonstrukt als integralen Teil ihrer Chromosomen enthalten, werden sich entwickelnde Klone durch Isolierung der gesamten zellulären DNA und Selektion auf jene Klone, in denen keine freie Plasmid-DNA nachgewiesen werden kann, jedoch das Markergen des Plasmids exprimiert wird, gescreent. Die Klone können dann auf geeignete Weisen zur Detektion der Expression der hochalkalischen Serinprotease gescreent werden.
Verschiedene Detektionstechniken umfassen eine Verwendung spezifischer Antikörper, DNA- oder RNA-Hybridisierung, Bildung von Enzymprodukt oder Verschwinden von Enzymsubstrat und können zum Screening der Klone eingesetzt werden, um die Gegenwart des Expressionskonstrukts und eine Expression des Strukturgens von Interesse, nämlich eine Proteaseproduktion, zu bestimmen. Die produzierte Protease kann biochemisch charakterisiert werden beispielsweise durch Bestimmung des Molekulargewichts der Protease bei SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Histidin-MOPS-Gelelektrophorese und Bestimmung der kinetischen Parameter Km und Vmax, die mittels des synthetischen Substrats Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanalid gemessen werden.
Der Bacillus-Wirt, der das Expressionskonstrukt episomal oder chromosomal integriert enthält, wird dann in einem Nährmedium unter Bedingungen gezüchtet, die eine Enzymsynthese begünstigen. Das Nährmedium umfaßt üblicherweise ein Mittel zum Aufrechterhalten des Plasmids, wie die Gegenwart eines Antibiotikums, gegenüber dem der untransformierte Wirt empfindlich ist. Die Fermentation kann fortgesetzt werden, bis die Brühe erschöpft ist. Wo das Produkt sezerniert worden ist, kann das Produkt aus der Brühe durch herkömmliche Techniken, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie, Elektrophorese oder ähnliches, isoliert werden. Wo das Produkt im Cytoplasma zurückgehalten wird, können die Zellen durch Zentrifugation, Filtration, u. s. w. geerntet werden, durch mechanische Scherung, Detergens, Lysozym oder andere Techniken lysiert und das Produkt, wie bereits früher beschrieben, isoliert werden. Wenn die untransformierte Wirtszelle ein Produzent einer hochalkalischen Protease ist, können durch Einsetzen der vorliegenden Methode stark erhöhte Ausbeuten an hochalkalischer Serinprotease erzielt werden, üblicherweise mindestens ungefähr 120% im Vergleich zu der Ausbeute der untransformierten Wirtszelle, mit einer einzigen extrachromosomalen Genkopie.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben.

EXPERIMENTELLER ABSCHNITT

BEISPIEL 1

Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek aus alkalophilem Bacillus novo sp. PB92 und Isolierung des Serinproteasegens

Aus Bacillus novo sp. PB92 (hinterlegt unter Nr. OR-60 beim Laboratorium voor Microbiologie, Technical University of Delft, Niederlande, siehe US-Patent Nr. Re. 30,602) gemäß der Vorgehensweise, beschrieben von Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Acta 72 (1963), 619-632, isolierte chromosomale DNA wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut und in die BamHI- Stelle des Plasmids pUB110 (Gryczan et al., J. Bacteriol. 134 (1978), 318-329) ligiert. pUB110-Plasmid-DNA wurde hergestellt, wie von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1513- 1523) beschrieben.
B. subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock Centre) wurde mit der Ligationsmischung gemäß der Methode von Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 (1961), 741-746, unter Verwendung von 0,6 bis 1 ug DNA pro ml kompetenter Zellen transformiert. Zellen aus der Transformationsmischung wurden auf Minimalplatten, enthaltend: 2,8% K&sub2;HPO&sub4;, 1,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,4% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,2% Tri-Na-citri-Na-citrat · 2H&sub2;O, 0,04% MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,00005% MnSO&sub4; · 4H&sub2;O, 0,4% L-Glutaminsäure, 0,5% Glucose, 0,02% Casaminosäuren, 50 ug/ml Tryptophan, 20 ug/ml Methionin, 20 ug/ml Lysin, 20 ug/ml Neomycin, 0,4% Casein und 1,5% Agar, ausplattiert. Nach Inkubation der Platten über Nacht bei 37ºC zeigte eine von 50000 Neomycin-resistenten Kolonien erhöhte Proteaseproduktion, wie aufgrund einer erhöhten Präzipitation eines Hofs aus Caseinspaltprodukten um die Kolonie auf der Agarplatte herum bestimmt wurde. Aus dieser Kolonie wurde Plasmid-DNA gemäß dem von Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523, beschriebenen Verfahren isoliert und pM58 genannt.

BEISPIEL 2

Expression des PB92-Serinproteasegens

Bacillus subtilis 1A40, enthaltend pM58, wurde in Minimalmedium (Spizizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44, (1958), 1072-1078), dem 0,02% Casaminosäuren, 50 ug/ml Tryptophan, 20 ug/ml Methionin, 20 ug/ml Lysin und 20 ug/ml Neomycin zugesetzt worden waren, gezüchtet. Nach 24 h wurde die Kultur zentrifugiert und der Überstand einem Assay auf Proteaseaktivität unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat (Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969), 789-793) unterzogen. Eine Kultur von B. subtilis 1A40, die das Plasmid pUB110 enthielt und als Kontrolle verwendet wurde, zeigte weniger als 1/60 der Proteaseaktivität, die von der durch pM58 transformierten Kultur gezeigt wurde. Proteaseaktivität wurde vollständig durch Behandlung mit 1 mM Phenylsulfonylfluorid (PMSF) inhibiert, nicht jedoch durch Behandlung mit 20 mM EDTA.
Aliquots der vorstehend beschriebenen Überstände wurden auf einem Proteingel gemäß dem Verfahren von Laemmli, Nature 227 (1970), 680, analysiert. Proben für eine Analyse auf diesen Gelen wurden hergestellt durch Behandlung der Überstände mit 5% Trichloressigsäure (TCA). Nach einer Zentrifugation der Probe wurde das Pellet aus präzipitiertem Protein zweimal mit Aceton gewaschen, dann in 40 ul Probenpuffer (0,5 M Tris/HCl, pH 7,5, 10% (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol, 50% (Vol./Vol.) Glycerol und 0,05% Bromphenolblau) durch zehnminütiges Kochen gelöst. Nach einer Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Kulturüberstandproben wurden dann durch Elektrophorese analysiert. Drei verschiedene B. sub tilis 1A40-Stämme wurden verwendet: ein pUB110 enthaltender Stamm, ein pM58 enthaltender Stamm oder ein kein Plasmid enthaltender Stamm, und Bacillus PB92-Protease als Kontrolle. Nach einer Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue gefärbt und entfärbt. Die Probe von dem pM58 enthaltenden B. subtilis-Stamm 1A40 enthielt ein 31 kD- Protein, das mit Bacillus PB92-Protease comigriert. Dieses Protein wurde auf der Kontrollbahn des pUB110 enthaltenden B. subtilis-Stammes 1A40 nicht detektiert.
Alle Serinproteasen haben ähnliche Molekulargewichte. Die klonierte Serinprotease von Bacillus PB92 wurde dementsprechend von bekannten Serinproteasen (B. subtilis-Subtilisin, Carlsberg-Subtilisin) unterschieden, indem der Protease-negative B. subtilis-Stamm DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984), 442- 444) mit pM58 und pUB110 transformiert wurde und die produzierten extrazellulären Proteasen analysiert wurden. Die erhaltenen Transformanten wurden in Minimalmedium (Spizizen et ab, a. a. O.), das 0,02% Casaminosäuren, 50 ug/ml Histidin und 20 ug/ml Neomycin enthielt, gezüchtet. Nach 24 h wurden Proben genommen, zentrifugiert und ohne Vorbehandlung auf Histidin/MOPS- Gelen, enthaltend 75 mM KOH, 40 mM Histidin, 100 mM MOPS (3-(N- Morpholino)-propansulfonsäure), pH 7,5, und 5% Polyacrylamid, analysiert. Der Elektrophoresepuffer enthielt 40 mM Histidin, 100 mM MOPS, pH 6,6. Proben wurden einer Elektrophorese in Richtung der Kathode unterworfen. Proteasebanden wurden mit Agfa Pan 100 Professional-Filmen (Zuidweg et al., Biotechnol. and Bioengin. 14 (1972), 685-714) detektiert. Diese Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Wie gezeigt, beherbergt pM58 das Bacillus PB92-Protease kodierende Gen.

BEISPIEL 3

Sequenzierung des Bacillus PB92-Serinproteasegens

Die vollständige Sequenz eines BalI-HpaI-Fragments von pM58 wurde durch das Verfahren von Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 6463, bestimmt. Restriktionsfragmente von pM58 (siehe Fig. 2) wurden in M13-Phagenvektoren mp10, mp11 und mp18 (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309-321, kloniert. Auf Insertionen von pM58-Fragmenten wurde durch Plaquehybridisierung gescreent. Nach einer Sequenzierung wurden zehn Oligonukleotide, die in regelmäßigen Abständen auf dem Gen lokalisiert waren, hergestellt und die Sequenzierung wiederholt, wodurch die in Fig. 3 gezeigte Sequenz bestätigt wurde.

BEISPIEL 4

Konstruktion des Serinprotease enthaltenden Plasmids pMAX-4

Um das Plasmid pUCN710 (Fig. 4A) zu konstruieren, wurde pUB110 mit TaqI und PvuII verdaut. Das Fragment, das das Neomycinresistenz verleihende Gen enthielt, wurde auf bei niedriger Temperatur erstarrender Agarose gereinigt und mittels Klenow- Polymerase und NTPs mit stumpfen Enden versehen (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Das Plasmid pUC7 (Vieira et al., Gene 19 (1982), 259-268) wurde mit SalI linearisiert und wie vorstehend beschrieben mit stumpfen Enden versehen. Beide Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert (Maniatis) und damit E. coli JP103 transformiert. Eine Selektion erfolgte auf 2xTY-Platten (1,6% (Gew./Vol.) Bactotrypton, 1% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,5% NaCl), die 50 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Neomycin enthielten. Das resultierende, als pUCN7100K bezeichnete Plasmid wurde mit BamHI verdaut. Das Plasmid pE194 (Jordanescu, Plasmid 1 (1978), 468-479) wurde mit BclI verdaut. Die Fragmente aus beiden Verdauen wurden mit T4- Ligase ligiert und damit B. subtilis 1A40 transformiert. Eine Selektion erfolgte auf Minimalplatten, enthaltend 20 ug/ml Neomycin (siehe Beispiel 1). Das erhaltene Plasmid, pE194-neo (Fig. 4A) enthält das Neomycin-Gen.
Eine Subklonierung des Proteasegens in den Integrationsvektor pE194-neo wurde, wie folgt, ausgeführt: pM58 (siehe Beispiel 1) wurde mit HpaI und BalI und BglII verdaut. Das Plasmid pE194- neo wurde mit HpaI verdaut. Diese Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert und damit B. subtilis 1A40 transformiert. Transformanten wurden beruhend auf Neomycinresistenz und einer Zunahme der Proteaseproduktion, wie anhand einer Präzipitation von Caseinspaltprodukten (Hofbildung, siehe Beispiel 1) beurteilt wurde, selektiert. Es wurde das Plasmid pMAX-4 erhalten, dessen Struktur durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt wurde (siehe Fig. 4B).

BEISPIEL 5

Protoplastentransformation des Bacillus-Stamms PB92 durch pMAX-4

Der Bacillus-Stamm PB92 wurde über Nacht in 100 ml NBSG-X- Medium (Thorne et al., J. Bacteriol. 91 (1966), 1012-1020) gezüchtet. Die Kultur wurde 10 min bei 4500 Upm in einem Sorvall- Modell-GSA-Rotor zentrifugiert. Protoplasten wurden hergestellt, indem die Bacilli 1 h bei 37ºC in 10 ml Alkaline Holding Medium (AHM), enthaltend 0,5 M Saccharose, 0,02 M MgCl&sub2; und 0,02 M Tris/Maleat, pH 8,0, in sterilem Wasser, zu dem 0,4 mg/ml Lysozym zugesetzt wurde, inkubiert wurden. Die Protoplasten wurden pelletiert (5 min bei 4500 Upm), in 5 ml des Puffers AHM&spplus;, pH 8,0, (AHM-Puffer, zu dem 3,5% (Gew./Vol.) Bacto Penassay Broth und 0,04% (Gew./Vol.) Albumine Merieux zugesetzt worden waren) resuspendiert, gemischt, dann erneut wie oben pelletiert. Nach einer Resuspendierung in 5,0 ml Alkaline Holding Medium wurden 0,5 ml dieser Protoplastensuspension mit 5 ug entmineralisiertem Wasser, enthaltend 1 ug Plasmid-DNA, gemischt und 2 min in Gegenwart von 30% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol 8000, pH 8,0, inkubiert. Nach einer 1 : 3-Verdünnung mit Medium AHM&spplus;, pH 8,0, und Zentrifugation wurde das Pellet in einem kleinen Volumen (1 ml) AHM&spplus; resuspendiert und 2-3 h inkubiert. 100 ul-Aliquots wurden auf frisch hergestellten Regenerationsplatten, enthaltend 0,5 M Na-succinat/HCl, pH 8,0, 1,5% (Gew./Vol.) Agar, 0,5% (Gew./Vol.) Casaminosäuren, 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,031 M Phosphatpuffer, pH 8,0, 0,5% (Gew./Vol.) Glucose, 0,02 M MgCl&sub2; und 0,02% (Gew./Vol.) Albumine Merieux, ausplattiert. Diese Platten enthielten auch 1000 ug/ml Neomycin für eine Selektion. Nach einer Inkubation bei 37ºC für mindestens 72 h wurden die Kolonien auf Heart-Infusion-Agarplatten, enthaltend 20 ug/ml Neomycin, replikaplat tiert.

BEISPIEL 6

Integration von pMAX-4 in das Chromosom des Bacillus-Stamms PB92

100 ml Tryptone Soya Broth (TSB), enthaltend 1 ug/ml Neomycin, wurden mit einer Kolonie des pMAX-4 enthaltenden Bacillus-Stamms PB92, der auf einer Heart-Infusion-Platte, enthaltend 20 ug/ml Neomycin, gezüchtet worden war, inokuliert und 24 h bei 37ºC inkubiert. Zwei 2 ml der Kultur (ungefähr 10&sup9; Zellen/ml) wurden in 100 ml des gleichen Mediums, das 1 ug/ml Neomycin enthielt, verdünnt und 24 h bei 50ºC inkubiert. Nach 24 h wurden 5 ml der Kultur (ungefähr 109 Zellen/ml) erneut, wie vorstehend beschrieben, verdünnt und 24 h bei 50ºC in Gegenwart von 1 ug/ml Neomycin inkubiert. Die letzte Prozedur wurde noch einmal wiederholt. Die Zellsuspension wurde dann hundertfach verdünnt und auf Heart-Infusion (HI)-Agar (Difco)- Platten, enthaltend 1 ug/ml Neomycin, ausplattiert. Die Platten wurden 16 h bei 50ºC inkubiert. Neomycin-resistente Kolonien wurden isoliert und in 10 ml TSB-Medium, enthaltend 1 ug/ml Neomycin, 16 h bei 37ºC gezüchtet. Aus diesen Kulturen wurde Gesamt-DNA isoliert (Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (1981), 193-197) und hinsichtlich eines Fehlens von Plasmid durch DNA- Elektrophorese auf einem Agarosegel überprüft. Proben, in denen Plasmid-DNA nicht nachweisbar war, wurden erneut durch Transformation von B. subtilis 1A40 mit Gesamt-DNA überprüft. Proben, denen die Fähigkeit zur Transformation von B. subtilis 1A40 fehlte, wurden als plasmidfrei angesehen. Es wurde ein Neomycin-resistenter, plasmidfreier, von Bacillus PB92 abgeleiteter Stamm isoliert und als PBT109 bezeichnet. Dieser Stamm enthielt eine Kopie des Plasmids pMAX-4 in dessen Chromosom integriert.
Eine Integration in den Stamm PBT109 erfolgte durch einen sogenannten Mechanismus vom Campbell-Typ durch homologe Rekombination, die zu zwei in Tandemanordnung angeordneten Proteasegenen auf dem Chromosom, getrennt durch Plasmidsequenzen, führ te. Diese genetische Organisation des Stamms PBT109 wurde bestätigt, wie in der gleichzeitig anhängigen EP-A-0 284 126, die gleichzeitig mit dieser Anmeldung eingereicht wurde und deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird, gezeigt.

BEISPIEL 7

Proteaseproduktion der transformierten Stämme

Eine Proteaseproduktion der transformierten Stämme wurde untersucht, indem 0,2 ml einer ungefähr 109 Zellen/ml enthaltenden TSB-Kultur 500 ml-Schüttelkolben, die 100 ml des in dem US-Patent Nr. Re. 30,602 beschriebenen Produktionsmediums enthielten, zugesetzt wurde. Wenn B. subtilis-Stämme untersucht wurden, wurde jedoch der pH auf pH 7,0 eingestellt. Neomycin wurde zu einer Konzentration von 20 ug/ml für die Stämme DB104 (pUB110), DB104 (pMAX-4), PB92 (pMAX-4) und zu einer Konzentration von 1 ug/ml für PBT109 zugesetzt. Die relative Proteaseproduktion für diese Zellinien ist in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Proteaseproduktion in transformierten Bacilli
* Um eine Proteaseproduktion ausgehend allein von dem Proteasegen von pMAX-4 zu messen, wurde auch der Exoproteasenegative B. subtilis-Stamm DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984), 442-444), wie in Beispiel 2 beschrieben, mit diesem Plasmid transformiert (Spizizen et al., (1961), a. a. O.).
** Proteaseaktivität wurde unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat bestimmt, wie von Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969), 789-793, beschrieben.
Bei Fermentationen in einem größeren Maßstab (10 l) zeigte Bacillus PB92 (pMAX-4) Instabilität und eine Abnahme der Produktion im Vergleich zu PBT109, wenn kein Neomycin dem Fermentationsmedium zugesetzt wurde.
Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen ist es evident, daß ein einfaches und effizientes Verfahren für die Produktion von Serinprotease bereitgestellt wird, indem ein homologes oder heterologes Gen, das Serinprotease kodiert, in das Chromosom industrieller Bacillus-Stämme stabil eingebaut wird. Eine verstärkte Produktion einer Serinprotease in einem Bacillus-Wirt, der bereits eine Serinprotease produziert, wird ebenfalls bereitgestellt. Eine Integration von Plasmidkonstrukten in die Wirtszellchromosome führt zu einer stabileren Situation für Produktionsfermentationen und für eine bedeutend verstärkte Proteaseproduktion als wenn extrachromosomale Plasmidkonstrukte vorliegen.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, zeigen das Niveau der Fachkenntnisse der Fachleute auf dem Gebiet, das diese Erfindung betrifft, an.
Nachdem die Erfindung jetzt vollständig beschrieben ist, ist es für den normal qualifizierten Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich, daß viele Abänderungen und Modifizierungen daran vorgenommen werden können, ohne von dem Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zum Verstärken der Produktion eines endogenen Enzyms von Interesse in einer Wirtszelle eines alkalophilen Bacillus-Stamms, wobei das Verfahren umfaßt:

in Gegenwart eines Fusogens bei alkalischem pH einen Protoplasten der Wirtszelle und ein Plasmidkonstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, ein in der Wirtszelle funktionales Replikationssystem und ein Selektionsmarkergen, zusammenzubringen, wodurch die DNA in die Wirtszelle eingeschleust wird,

auf die Wirtszellen zu selektieren, die die DNA stabil bewahrt enthalten, und

die Wirtszellen unter Bedingungen zu züchten, die eine Synthese des Enzyms von Interesse begünstigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, welches umfaßt:

die Bacillus-Zellen mit Lysozym in einem alkalischen Medium bei ungefähr 20ºC bis ungefähr 37ºC zur Bildung von Protoplasten vorzubehandeln,

die Protoplasten von dem Lysozym abzutrennen,

die Protoplasten mit dem Plasmidkonstrukt in Gegenwart eines Fusogens bei ungefähr 20ºC bis ungefähr 37ºC zusammenzubringen,

das Fusogen zu verdünnen und die Bacillus-Zellen zu regenerieren und

die regenerierten Bacillus-Zellen unter selektiven Bedingungen zu züchten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Plasmidkonstrukt in Transkriptionsrichtung einen Transkriptions- und Translationsinitiationsregulationsbereich, eine das Enzym kodierende DNA-Sequenz und einen Transkriptions- und Translationster minationsregulationsbereich, wobei die Regulationsbereiche in der Wirtszelle funktional sind.

4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei eine nicht-transformierte Elternzelle der Wirtszelle ein alkalophiler Wildtyp-Bacillus oder ein mutierter alkalophiler Bacillus ist, der die Serinprotease produziert, wodurch eine endogene Produktion des Enzyms in der Wirtszelle verstärkt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine nicht-transformierte Elternzelle der Wirtszelle ein mutierter Stamm eines Wildtyp-Bacillus ist, der keine Serinprotease produziert.

6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Wirtszelle oder der Wildtyp-Bacillus Bacillus novo species PB92 ist.

7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das endogene Enzym eine Serinprotease ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Serinprotease eine hochalkalische Serinprotease ist.

9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Enzym eine hochalkalische Serinprotease ist, die mindestens 70% Homologie zu der folgenden Aminosäuresequenz aufweist:

H&sub2;N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V- A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q- D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A- E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N- G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G- V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A- T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T- Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K- N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G- L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die DNA stabil in das Genom der Wirtszelle integriert ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei mindestens zwei Kopien der DNA stabil in das Genom der Wirtszelle integriert sind.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei zwei Kopien des Proteasegens in Tandemanordnung in dem Wirtszellchromosom angeordnet sind, wobei sie durch Plasmidsequenzen voneinander getrennt sind.

13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Markergen ein Antibiotikaresistenzgen ist.