DE69028890T2 - Ergiebige Herstellung von Protease-Mutanten - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Proteinmutanten mittels DNA- Rekombinationstechniken. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf die effiziente Herstellung von mittels Protein-Engineering entworfener Bacillus-Proteasen unter Verwendung eines homologen Bacillus-Wirtsstammes, wobei diesem die Fähigkeit zur Bildung der entsprechenden nicht veränderten Protease genommen worden ist.
- Bacilli werden oft verwendet, um industriell wichtige Enzyme wie α-Amylasen, neutrale Proteasen und alkalische (oder Serin-)Proteasen herzustellen, siehe, zum Beispiel, Debabaov: "The Industrial Use of Bacilli" in: The Molecular Biology of Bacilli, Acad. Press, New York, 1932.
- Die Hauptvorteile bei der Verwendung von Bacilli sind die grossen Mengen abgeschiedener Proteine, das Ausbleiben gefährlicher Verbindungen und ihre lange Tradition hinsichtlich sicherer industrieller Anwendung. Verschiedene Arten von Bacilli sind daher zur Herstellung von Proteinen zugelassen worden, die zur Verwendung in Lebensmitteln bestimmt sind.
- Palva et al., Gene 19 (1982), 81 bis 87, zeigten, dass es möglich ist, Bacillus subtilis als Expressionswirt für heterologe Proteine zu verwenden, indem sie das α- Amylasegen von B. amyloliquefaciens in B. subtilis exprimierten. Weitere Literaturstellen, in denen die Expression von heterologen Genen in B. subtilis beschrieben wird, sind z.B., Fahnestock und Fisher, J. Bacteriol. 165 (1986), 796 bis 804, die die Expression des Gens des Proteins A von Staphylococcus aureus zeigten; Schein et al., Biotechnology 4 (1986), 719-725, wo die Expression des menschlichen Interferons α2 offenbart wird, und Wang et al. Gene 69 (1988), 39 bis 47, wo die Expression und Sekretion des menschlichen atrialen natriuretischen α-Faktors gezeigt wird. Um eine ausreichende Sekretion dieser heterologen Proteine sicherzustellen, wurde in den beiden ersten Literaturstellen die Signalsequenz der α-Amylase und in der letzten Literaturstelle die Signalsequenz des Subtilisingens von B. subtilis (apre) verwendet, wobei diese an das zu exprimierende Gen fusioniert wurden.
- Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Bacillus Stämmen als Herstellungswirt für rekombinante Proteine ist, dass sie eine Heihe von Proteasen herstellen und sekretieren, die zum Abbau der hergestellten heterologen Proteine neigen. Siehe, z.B., Old und Primrose, "Principles of Gene Manipulation", 3.Aufl. (1985), 289, Blackwell, Oxford.
- In der internationalen Patentanmeldung (PCT) WO89/Q4866 wird auf die Bedeutung extrazellulärer Proteasen hingewiesen; ungefähr 90% der proteolytischen Aktivität wird der neutralen Metalloprotease (npr) und der Serinprotease (alkalische Protease = apr) zugeschrieben.
- Es wurden verschiedene Lösungen zur 0berwindung dieses Problems des Abbaus vorgeschlagen.
- Kawamura und Dol, J. Bacteriol. 160, (1984), 442 bis 444, beschreiben eine Doppelmutante von B. subtilis, der sowohl die extrazelluäre neutrale wie auch die alkalische Protease fehlen. Zuerst wurde B. subtilis DB100 durch Transferieren der nprR2- und nprE18-Mutationen von B. subtilis NT18 negativ hinsichtlich der neutralen Protease gemacht. Anschliessend wurde ein Bruchstück von 178 bp, das ein Teil des apr-Gens enthielt, durch Genumwandlung deletiert.
- Fahnestock und Fisher, Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987), 379 bis 384, beschreiben die Konstruktion eines apr-negativen B. subtilis-Stamms, ausgehend von einem npr- negativen Stamm. Sie verwendeten einen Plasmid-Vektor, der das apr-Gen enthielt, und führten das cat-Gen (das Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht) sowohl als Inaktivator wie auch als selektionierbaren Marker ein. Anschliessend wurde das chromosomale apr-Gen durch dieses Konstrukt ersetzt.
- Sloma et al., J. Bacteriol. 170 (1988), 5557 bis 5563, wiesen ein drittes extrazelluläres Protease-Gen (epr) aus B. subtilis nach und sequenzierten es. Teilweise Deletion dieses Gens zeigte, dass es nur geringfügig zu der extrazellulären Protease-Aktivität beitrug.
- Bei einer genaueren Untersuchung der gebildeten Stämme zeigte sich, dass keiner der genannten B. subtilis Stämme völlig frei von extrazellulärer proteolytischer Aktivität war. Daher besteht immer noch ein Bedarf an verbesserten, protease-freien Bacillus-Stämmen, die in der Herstellung heterologer Proteine verwendet werden können. Dieser Bedarf ist noch ausgeprägter, wenn die Expression mutierter Proteasen das Ziel ist.
- In mehreren Veröffentlichungen wird die Herstellung von Proteasemutanten beschrieben, wobei Bacillus subtilis- Wirte verwendet werden, die zur Exprimierung des Wildtyp- Proteasegens nicht befähigt sind, wodurch Mischungen der Wildtyp-Protease und ihrer Mutanten verinieden werden.
- In EP-A-0246678 (der Inhalt dieser Anmeldung entspricht demjenigen von EP-A-0130756) wird ein Stamm von B. subtilis offenbart, der zur Sekretion von enzymatisch aktivem Subtilisin oder von neutraler Protease nicht befähigt ist, aber der heterologe, von B. amyloliquefaciens isolierte oder abgeleitete Proteasegene exprimiert. Ortsspezifische Sättigungs-Mutagenese wurde an dem Gen von B. amyloliquefaciens durchgeführt und die Mutanten exprimiert. Der negative Hintergrund der Wirtsstämme von B. subtilis wurde durch teilweise Deletion eines der beiden oder beider ursprünglicher Proteasegene erhalten, oder durch Mutagenese mittels N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Es wurde weiter betont, dass der beschriebene B. subtilis-Wirt normalerweise sporulierend ist und dass asporogene Mutanten in der Herstellung (rekombinanter) Proteine unbefriedigend sind.
- In WO 86/01825 (siehe Fahnenstock und Fisher, oben zitiert) werden Bacillus-Stämme, insbesonders B. subtilis, mit verringerten Protease-Spiegeln beschrieben. Das Gen für die alkalische Protease wird durch in vitro-Insertion eines Genes inaktiviert, das ein Protein kodiert, das dem Mikroorganismus ein Phänotypisches Merkmal verleiht. Der Plasmid-Vektor, der das durch Insertion inaktivierte Proteasegen enthält, wird auf B. subtilis transformiert, und das inaktivierte Gen ersetzt das native chromosomale Gen durch homologe Rekombination.
- WO 88/08033 offenbart Subtilisin-Analoga aus Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin BPN', ein apr- Subtilisin aus B. subtilis und ein Subtilisin aus B. mesentericus. Diese Mutanten werden erhalten, indem eine oder mehrere Aminosäuren bei oder in der Nähe der Bindungsstelle für das Calcium durch negativ geladene Aminosäuren ersetzt werden (z.B. Asp oder Glu). Die Mutanten werden in B. subtilis exprimiert.
- WO 89/04866 offenbart einen B. subtilis-Stamm mit einer niedrigen ausgeschiedenen Protease-Aktivität, der durch Einführung einer spoOH-Mutation in eine apr&supmin;/npr&supmin;-Doppelmutante hergestellt wurde, wodurch der Stamm asporogen wurde. Die erhaltene Dreifach-Mutante apr&supmin;/npr&supmin;/spoOH&supmin; zeigte ein sehr niedriges Mass an sekretierter Protease-Aktivität.
- Die oben besprochenen Literaturstellen beschreiben die Expression homologer und heterologer Gene in B. subtilis und die Konstruktion von protease-negativen B. subtius-Stämmen. Es wurde deutlich, dass protease-negative Stämme, die durch teilweise Deletion des Proteasegens odei durch Insertion eines anderen Gens in das Proteasegen hergestellt wurden, mehrere Nachteile aufweisen, Z.B.:
- - das ursprüngliche Gen kann reaktiviert werden. Wird in die Zelle ein Gen eingeführt (z.B. auf einem Plasmid), das homolog zum inaktivierten chromosomalen Gen ist, kann homologe Rekombination zur Reaktivierung des Gens führen.
- - das ursprüngliche Gen, obwohl inaktiviert, kann zur Bildung von Produkten einer teilweisen Expression führen, wenn das Promotor-Gebiet immer noch aktiv ist. Im Hinblick auf den metabolischen Wirkungsgrad ist das unvorteilhaft.
- - Das Einführen von ungewollten Phänotypischen Merkmalen, z.B. Resistenz gegen Antibiotika, je nach der Art des eingeführten Gens.
- - Instabilität des Plasmids, aufgrund einer Homologie zwischen einer Sequenz des Genoms und einem Teil des Plasmids.
- Es ist daher erwünscht, alle Sequenzen mit einer möglichen Homologie zwischen dem Chromosom und dem Plasmid zu deletieren.
- Es treten noch weitere Nachteile bei der Herstellung alkalischer Proteasen oder anderer Enzyme in B. subtilis. Obwohl Wells et al., Nucl. Acids Res. 11, (1983), 7911 bis 7925, zeigen, dass die Expression des BPN'-Subtilisins von B. amyloliquefaciens in B. subtilis mittels seiner eigenen Transkriptionssignale möglich ist, zeigen Jacobs et al. Nucl. Acids Res. 13 (1985), 8913 bis 8926, dass ein solches Vorgehen nicht allgemein anwendbar ist. Es wurde bewiesen, dass das 5'-Gebiet des von B. licheniformis abgeleiteten Gens für Subtilisin Carlsberg keine funktionellen Signale für die Transkription in E. subtilis enthält. Um eine merkliche Herstellung zu erreichen, musste ein B. subtilis-Promotor vor dem fraglichen Gen eingefügt werden. Es wird auch vermutet, dass nicht nur Transkriptions- sondern auch Translations-, Sekretions- und Reifeprozesse in heterologen Wirten weniger effizient ablaufen, aufgrund einer nicht perfekten Shine-Dalgarno-Sequenz oder sogar aufgrund einer Unverträglichkeit des Genproduktes mit dem heterologen Wirt.
- Die oben beschriebenen Schwierigkeiten bei der Expression können vermieden werden, wenn das Produkt in einem homologen Bacillus-Stamm hergestellt wird, bei dem ein hohes Herstellungvermögen nachgewiesen wurde, und mit einer hohen Effizienz, die hohe Ausbeuten ergibt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Proteasen zur Verfügung, die sich in mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp-Protease unterscheiden, wobei dieses Verfahren die Verwendung eines homologen alkalophilen Bacillus-Stamms als Expressionswirten beinhaltet, und dieser Stamm zur Bildung der Wildtyp-Protease nicht befähigt ist.
- In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Gen der hochalkalischen Protease aus dem Chromosom deletiert, und der erhaltene protease-negative Stamm kann als Wirt für die Expression von homologen oder heterologen Proteasen verwendet werden.
- Ineinem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das chromosomale Gen der hochalkalischen Protease durch eine mutierte Kopie dieses Gens ersetzt.
- Es werden ebenfalls Verfahren zur Konstruktion dieser neuen transformierten Stämme und der dafür benötigten Vektoren bereitgestellt, und ein Verfahren zur Herstellung von Proteasemutanten.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Proteasemutanten hergestellt, die eine enge Homologie zu den von dem zugehörigen Stamm ursprünglich hergestellten Proteasen zeigen.
- Bevorzugte Stämme sind die Novo-Arten PB92 von Bacillus, Abkömmlinge davon und eng verwandte Stämme, die durch ein mutiertes, proteasekodierendes Gen transfromiert wurden. Das besagte Gen zeigt mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50% und eher bevorzugt mindestens 80% Homologle mit dem Wildtyp-Gen von Bacillus PB92, das die Serin-Protease kodiert. Das Gen wird bevorzugt von einem Wildtyp-Gen eines, alkalophilen Bacillus-Stamms abgeleitet. Besonders bevorzugte Stämme sind asporogene alkalophile Bacilli.
- Figur 1 zeigt die Konstruktion des Plasmids pM58Δ, das Teile der 5'- und 3'-flankierenden Gebiete des Gens der alkalischen Protease der Novo-Art PB92 von Bacillus enthält.
- Figur 2 zeigt schematisch die Einführung des temperaturempfindlichen Replikationsursprungs vom Plasmid pE194neo-1 in das Plasmid pM58Δ, was das Plasmid pEM58Δ ergibt.
- Figur 3 zeigt die Einführung des Plasmids pEM58Δ in das 5'-flankierende Gebiet des Protease-Gens des Bacillus Stamms PBT110 durch homologe Rekombination.
- Figur 4 zeigt eine vereinfachte Restriktionskarte der Gebiete, die das deletierte Protease-Gen nach illegitimer Rekombination umgeben. Es wurden zwei Stämme erhalten, PBT125 und PBT126.
- Figur 5 Nukleotid-Sequenz der HindIII-Bruchstücke von PBT125 (A) und PBT126 (B)
- Figur 6 Schematische Darstellung der Einführung des Protease-Gens in M13 mp18.
- Figur 7 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pBHA-1.
- Figur 8 zeigt die Einführung des Protease-Gens vom Bacillus-Stamm PBT110 in das Plasmid pBHA1.
- Figur 9 zeigt die Reorientierung des BamHI-Bruchstücks aus pBHA1-MXL mit dem F1-Ursprung, was Plasmid pBHAR-MXL ergibt.
- Figur 10 zeigt die Subklonierung der 3'-Sequenz der hochalkalischen Protease in Plasmid pBHAR-MXL, was Plasmid pBHARB-MXL ergibt.
- Figur 11 zeigt die Deletion der E. coli-Sequenz in Plasmid pBHARB-MXL M216Q, was Plasmid pBHB-MXL M216Q ergibt.
- Figur 12 zeigt die Reorientierung des Neomycin- Resistenzgens in Plasmid pE194neo-1, was Plasmid pE194neo-3 ergibt.
- Figur 13 zeigt schematisch die Einführung des temperaturempfindlichen Replikationsursprungs aus Plasmid pE194neo-3 in Plasmid pBHB-MXL M216Q, was Plasmid pEN&sub3;Q ergibt.
- Figur 14 zeigt schematisch die Konstruktion des Bacillus-Stamms Stamm PEP111.
- Figur 15 zeigt schematisch die Konstruktion des Bacillus-Stamms Stamm PEP211.
- Serinproteasen, die von Stämmen hergestellt werden, die zur Gattung Bacillus gehören, werden im allgemeinen als alkalische Proteasen bezeichnet. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Proteasen sind von alkalophilen Bazillen abgeleitet und werden daher hochalkalische Proteasen genannt.
- Für die Herstellung von hochalkalischen Proteasen werden bevorzugt alkalophile Bacillus-Stämme als Wirtszellen verwendet. Für die Herstellung im Grossmassstab werden industrielle Stämme benötigt. Sie stammen von Organismen ab, die aus dem Boden isoliert werden können oder von Hinterlegungsstellen oder anderen Quellen erhältlich sind und die durch genetische Modifikation solcher Bacillus-Stämme erhalten werden. Industrielle Bacillus-Stämme werden in EP- A-0134048 definiert. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie gegen genetischen Austausch wie die Phagen-Infektion oder die Transformation widerstandsfähig sind. Die Stämme sind stabil und können zur Sporenbildung fähig sein oder auch nicht. Sie sind im allgemeinen prototropisch und sind zur Bildung hoher Erträge endogener Proteinprodukte, wie der Enzyme α-Amylase und verschiedene Proteasen, abgeändert. Der Ertrag eines endogenen Proteinproduktes, das in einem industriellen Herstellungsverfahren erhalten wurde, kann bis zu mindestens 5 g/l (0,5% (g/v)) betragen. Industrielle Stämme sekretieren auch DNasen, was zu einer Degradation von in dem Medium vorhandener DNA führt und für einen Schutz gegen genetischen Austausch sorgt.
- Es ist vorteilhaft, als Wirtsstamm denjenigen Stamm zu verwenden, aus dem das Proteasegen ursprünglich isoliert wurde, da man nur in dem Fall sicher sein kann, dass alle zur Expression benötigten Signale funktionell sind.
- Ein zusätzlicher Vorteil bei der Verwendung alkalophiler Bacilli als Herstellungswirte ist das sehr geringe Risiko der Kontamination mit anderen Mikroorganismen, da der pH während der Gärung alkalisch ist.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren offenbart, in dem ein Gen zur Kodierung einer Bacillus Protease so aus dem Genom deletiert wird, dass eine Umkehrung nicht möglich ist. Die besagte Deletion kann eine teilweise Deletion sein (solange die im Chromosom belassenen Sequenzen für eine homologe Rekombination mit dem auf dem Plasmid liegenden Protease-Gen zu kurz sind), aber eher bevorzugt wird das Gen völlig deletiert. Der durch dieses Verfahren erhaltene protease-negative Stamm wird zur Herstellung homologer Proteasemutanten eingesetzt, nachdem ein Expressionsvektor mit dem diese Proteasemutante kodierenden Gen eingeführt worden ist. Es ist jedoch offensichtlich, dass ein solcher protease-negativer Stamm vorteilhaft auch für die Expression anderer, sowohl homologer wie auch heterologer Proteine herangezogen werden kann. In diesem Zusammenhang bezeichnen wir als hornologe Expression die Expression von Proteasemutanten unter Verwendung derjenigen Zellen als Wirt, von denen das Wildtyp-Gen isoliert wurde.
- Es wurde gefunden, dass bei Verwendung eines industriellen, proteaseherstellenden Bacillus-Stamms als Wirt für die Herstellung der Mutanten dieser Protease die hohe Effizienz bei der Bildung der ursprünglichen Protease auf die Proteasemutante übertragen wird. Das ergibt eine im Vergleich zu den Laboratoriumsstämmen überraschend höhere Herstellungseffizienz. Eine chromosomale Kopie des mutierten Gens gibt in einem industriellen Stamm bei der Expression und Sekretion einen höheren Ertrag als 50 Plasmidkopien mit dem mutierten Gen in einem Laboratoriumsstamm.
- Es ist ein Aspekt dieser Erfindung, dass Proteasemutanten effizient mit einem homologen Bacillus-Stamm hergestellt werden können, indem das chromosomale Gen oder ein Teil davon durch das entsprechende mutierte Gen ausgetauscht wird. Auf diese Weise wird die Fähigkeit zur Herstellung der Wildtyp-Protease zerstört, wobei gleichzeitig die Fähigkeit zur Bildung einer Proteasemutanten eingeführt wird.
- Als Wirtszellen zur Expression von mutierten Genen, die abgeänderte oder mittels sogenanntem Protein-Engineering entworfene Proteine kodieren, werden bevorzugt Zellen eingesetzt, in denen die Gene strukturell in einem hohen Mass exprimiert werden.
- In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass asporogene Bacilli eingesetzt werden können, um die Expression des protease- Gens in einem hohem Mass zu erhalten.
- Die vorliegende Erfindung zeigt auch (Tabelle 1), dass es im Hinblick auf eine hohe Bildung der von Bacillus PB92 abgeleiteten hochalkalischen Protease in B. subtilis bevorzugt ist, einen in B. subtilis aktiven Promotor vor dem Gen einzufügen. Werden in B. subtilis Enzyme hergestellt, die von anderen Bacilli abgeleitet wurden, kann es erforderlich sein, einen in B. subtilis aktiven Promotor oder andere Expressionssignale einzufügen, was einen zusätzlichen Schritt erfordert.
- Bazillen, die hochalkalische Protease herstellen, sind taxonomisch nicht gut eingeordnet und werden im allgemeinen als alkalophile Bacillus-Stämme bezeichnet. Für die vorliegende Erfindung definieren wir als alkalophile Bazillen diejenigen Bacillus-Stämme, die unter alkalischen Bedingungen, pH 9 bis 11, wachsen (Horikoshi, K. und T. Akiba, 1982, Alkalophilic Microorganisms, Springer Verlag, New York) . Die von solchen Bazillen hergestellten alkalischen Proteasen werden auch als hochalkalische Proteasen bezeichnet. Beispiele für Bacillus-Stämme, die zum Wachstum bei alkalischem pH fähig sind, sind zum Beispiel in US-A- 3723250, US-Re.-30602 und US-A-4480037 beschrieben. Ein Beispiel für einen alkalophilen Bacillus-Wirtsstamm ist die Navo-Art PB92 von Bacillus, die unter anderem in US-Re.30602 offenbar wird. Abkömmlinge dieser alkalophilen Bacillus-Stämme, die im Hinblick auf die Proteaseherstellung optimiert wurden, werden eingesetzt, um ihre Proteasen im industriellen Massstab herzustellen (siehe EP-A-0284126). Die Produkte werden in verschiedenen industriellen Anwendungen, z.B. als Additive in Waschmitteln, eingesetzt. Beispiele für solche Produkte sind Maxacal (Gist-Brocades/IBIS), Savinase (NOVO), Esperase (NOVO) . Mutanten solcher Produkte sind in WO 89/06279 beschrieben worden, wo gesagt wird, dass sie von Bacillus lentus-Stämmen abgeleitet sind, und in der nicht vorveröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A-0328 229.
- Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden transformierte Bacillus-Stämme zur Verfügung gestellt, die die in EP-A-0328229 und W089/06279 beschriebenen Mutanten herstellen, bevorzugt in industriellem Massstab.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung wird zweckmässig ein Bacillus-Stamm eingesetzt, insbesonders ein alkalophiler Bacillus, bevorzugt die Novo-Art P892 von Bacillus. Eine andere bevorzugte Gruppe von Bacillus-Stämmen sind die asporogenen Mutanten, von denen PBT110 und seine Abkömmlinge besonders bevorzugt sind.
- Die Transformation der alkalophilen Bacillus-Stämme wird bevorzugt die Verwendung von Protoplasten aus diesen Stämmen beinhalten. Das übliche Protoplasten-Transformationsverfahren, wie es von Chang, S. und S.M. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168 (1979), 111 bis 115 beschrieben wurde, ist für alkalophile Bacillus-Stämme nicht geeignet. Die für diese Stämme benötigten Verfahren sind in EP-A-0283075, das hier als Literaturhinweis beigefügt wird, offenbart worden.
- Die Expression von Genen für Proteasemutanten in homologen Wirten benötigt die Ersetzung und/oder Inaktivierung des Wildtyp-Gens. Es können mehrere Verfahren angewendet werden.
- A) Ein Verfahren besteht darin, das Gen oder einen Teil davon zu klonieren, es durch zielgerichtete Mutagenese abzuwandeln und das Gen(-bruchstück) auf einem Plasmid wieder in die Zelle einzuführen. Das Gen kann durch homologe Rekombination in das Chromosom eingefügt werden. Das ergibt eine Situation, in der ein Wildtyp-Gen und die Genmutante hintereinander angeordnet sind. Nach einer zweiten Rekombination wird die abgeänderte Sequenz im Chromosom zurückgelassen, womit die Mutation effektiv in das chromosomale Gen eingefügt ist (wie in Figur 14 beschrieben).
- B) In einem anderen Verfahren wird die chromosomale Kopie des Gens durch Deletion inaktiviert. Wird die Deletion des Gens als Vorgehen gewählt, wird bevorzugt dasjenige chromosomale Genbruchstück deletiert, das den gesamten kodierenden Bereich darstellt. Nach der Inaktivierung wird ein Kopie der Mutante des inaktivierten Gens auf einem Klonierungsvektor in die Zelle eingeführt.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Bacillus Stämme, von denen bekannt ist, dass sie effiziente Proteasehersteller sind. In einem der bevorzugten Verfahren wird der gesamte, die hochalkalische Protease kodierende Bereich von dem Chromosom deletiert. In dieser Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der das Gen für die alkalische Protease einschliesslich seiner 5'- und 3'-Gebiete enthält. Das Proteasegen wird von dem Vektor in vivo deletiert, wobei die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen übrigbleiben. Dieser Vektor wird in den alkalophilen Bacillus-Stamm eingeführt. Der Vektor wird mittels homologer Rekombination an dem flankierenden Bereich in das Chromosom integriert. Aussenrekombination und Auftrennung führt zu einem Bacillus Stamm, in dem das Protease-Gen deletiert ist. Der verwendete Vektor ist bevorzugt ein Plasmid. Um die Selektion zu ermöglichen, wird ein selektionierbarer Marker, bevorzugt die Resistenz gegen ein Antibiotikum, z.B. gegen Neomycin, in das Plasmid eingeführt. Bevorzugt kann der Vektor selektiv in das Chromosom integriert werden, wobei dies durch Einführen eines induzierbaren Replikationsursprungs, z.B. eines temperaturempfindlichen Ursprungs wie derjenige von pE194, erreicht werden kann. Besagtes Plasmid wird in eine homologe Wirtszelle eingeführt. Bei einer hohen Temperatur kann sich das Plasmid nicht vervielfältigen, so dass nach chromosomalen Integranten selektioniert werden kann. Bei hohen Temperaturen, in Gegenwart des fraglichen Antibiotikums (z.B. Neomycin), wird nach Integranten selektioniert. Die Abtrennung des Plasmids von dem Wirtschromosom kann die flankierenden Bereiche im Chromosom zurücklassen, während der kodierende Bereich entfernt wird. An Schluss hat die sich ergebende Mutante, nach der selektioniert wurde, das Gen mit dem selektionierbaren Marker verloren (ist empfindlich auf Neomycin) und ist protease-negativ. Die schlussendliche chromosomale Konfiguration wird durch Restriktionsanalyse und Southern-Blotting bestimmt. WO88/06623 beschreibt ausführlich die möglichen Integrationsmechanismen. Das durch zielgerichtete Mutagenese abgeänderte Protease- Gen wird nun auf einem geeigneten Expressionsvektor in die protease-negative Zelle eingeführt. Es wird darauf geachtet, dass das Plasmid kurze oder bevorzugt gar keine zum Chromosom homologe Sequenzen trägt, um Instabilität des Plasmids zu vermeiden.
- Anstatt das mutierte Protease-Gen von einem Vektor aus zu exprimieren, ist es auch möglich, das mutierte Protease-Gen in das Chromosom des protease-negativen Stamms zu integrieren. Das kann erreicht werden, indem die flankierenden Bereiche des Protease-Gens, die an das mutierte Protease-Gen angrenzen, im Plasmid zurückgelassen werden. Das Einführen eines solchen Plasmids kann eine homologe Rekombination in den flankierenden Bereichen bewirken, wodurch das mutierte Protease-Gen in das Chromosom des proteasenegativen Stamms eingeführt wird. Das ist vor allem dann vorteilhaft, wenn sich das Plasmid als unstabil herausstellt. Die vorliegende Erfindung zeigt auch, dass die erhaltene Menge der rekombinaten Wildtyp-Protease oder der Mutanten bei Einfügen einer Kopie des Gens in das Genom vergleichbar oder sogar höher ist, als wenn mehrere durch ein Plasmid kodierte Kopien vorhanden sind.
- In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das chromosomale Gen für die hochalkalische Protease unter homologer Rekombination durch eine Genmutante ersetzt, ohne dass vorgängig ein protease-negativer Stamm isoliert wird.
- Die Protease wird exprimiert und kann entweder aus den Zellen isoliert werden, oder, wenn sie sekretiert wird, aus dem Medium. Nach der Gewinnung der Protease kann sie gereinigt und als Reinigungsmittelzusammensetzung formuliert werden. Da im beschriebenen Herstellungssystem das Wildtyp-Gen vollständig deletiert worden ist, ist das Präparat mit der Proteasemutante völlig frei von Wildtyp- Protease.
- Das Plasmid pM58, wie in EP-A-0284126 beschrieben konstruiert, enthält das Gen der hochalkalischen Protease. Um das Inaktivations-Plasmid zu erhalten wird das kodierende Gebiet des Protease-Gens durch Doppelabbau mittels BalI/HpaI deletiert. Der temperaturempfindliche Replikationsursprung aus pE194neo-1 wird anschliessend eingeführt. Das Konstrukt pEM58 Δ wird in den Bacillus-Stamm PBT110 eingeführt.
- Die Integration über den sogenannten Mechanismus nach Campbell fand im 5'-flankierenden Gebiet des Proteasegens statt, woraus sich ein protease-positiver Stamm ergibt, der im Chromosom am Protease-Locus den gesamten Plasmid-Vektor trägt (wie in Figur 3 gezeigt).
- Anschliessende Selektion nach protease-negativen Abkömmlingen dieses Stamms ergab zwei Stämme, PBT125 und PBT126, die das Protease-Gen und den Neomycin-Marker verloren hatten. Die weitere Untersuchung zeigte, dass bei diesem zweiten Schritt illegitime Rekombination stattgefunden hatte.
- Da die erhaltenen Bacillus-Stämme keine erkennbare Protease-Aktivität hatten, konnten sie für die Expression abgeänderter Protease-Gen verwendet werden. Es ist offensichtlich, dass PBT125 und PBT126 nur Beispiele sind. Da die illegitime Rekombination andere Ergebnisse liefern wird, wird es unerlässlich sein, festzustellen, ob das gesamte Gen deletiert worden ist. Um spezifischere Stämme zu erhalten, hätten homologe Rekombinanten hergestellt werden können.
- Die hier aufgeführten Beispiele zeigen zwei besondere Ausführungsformen der Erfindung. Eine ist die Herstellung einer Proteasemutante, die von einem Plasmid kodiert wird, in einem protease-negativen Stamm. Die andere ist die Herstellung einer Proteasemutante unter Einführung des mutierten Gens durch Genaustausch in das Genom. Für den Fachmann wird es sofort offensichtlich sein, dass andere Ausführungsformen möglich sind, so zum Beispiel: chromosornale Integration in einen protease-negativen Stamm; eine Kopie des mutierten Gens sowohl auf einem Plasmid wie auch in das Chromosom integriert; mehr als eine Kopie des mutierten Gens im Chromosom entweder hintereinanderliegend oder auf verschiedene Positionen verteilt. Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung der Erfindung gedacht.
- Das Plasmid pM58 (siehe EP-A-0284126) wurde mittels der Restriktionsenzyme BalI und HpaI abgebaut. Das grosse Bruchstück mit Teilen der flankierenden Sequenzen des Protease-Gens wurde gereinigt (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) und ligasiert. Die Ligasierungsmischung wurde auf Bacillus subtilis DB104 (Kawamura und Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) und ligasiert transformiert (Spizizen et al. J. Bacteriol. 81 (1961), 741 bis 746) und eine Selektion nach Neomycin-resistenten und Protease-negativen Transformanten auf Minimal-Platten mit 0,4% Casein und 20µg/ml Neomycin durchgeführt.
- Das Plasmid pM58 Δ wurde isoliert und mittels Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Wie in Figur 1 gezeigt, enthält das Plasmid pM58 Δ die flankierenden Sequenzen des hochalkalischen Protease-Gens, das die Neomycin- Resistenz kodierende Gen und einen Bacillus-Replikationsursprung.
- Zur Konstruktion eines Integrationsplasmids mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung wurde pM58 Δ mittels der Restriktionsenzyme XbaI und BglII abgebaut. Das die flankierenden Sequenzen der hochalkalischen Protease enthaltende Bruchstück wurde gereinigt und an das (gereinigte) XbaI/BglII-Bruchstück von pE194neo-1 (EP-A-0284126) mit dem von pE194 abgeleiteten (Jordanescu et al., Plasmid 1 (1978), 468 bis 479) temperaturempfindlichen Replikationsursprung ligasiert, nachdem besagtes Bruchstück wie vorher beschrieben gereinigt worden war. Die Ligasierungsmischung wurde auf B.subtilis DB104 transformiert und es wur de nach Neomycin-Resistenz selektioniert (siehe oben). Das Plasmid pEM58 Δ wurde isoliert und charakterisiert (Figur 2). Es enthält des Neomycin-Resistenzgen, den temperaturempfindlichen Replikationsursprung aus pE194 und die flankierenden Sequenzen des Gens der alkalischen Protease.
- Diese Plasmid pEM58 Δ wurde für die Transformation des Bacillus-Stamms PBT110 verwendet.
- Der Bacillus-Stamm PBT100 ist eine asporogene Mutante der Novo-Art PB92 von Bacillus (US-Re.-30602) und wurde mittels klassischer (UV-) Mutationsverfahren erhalten. Dieser Stamm wurde mit dem Plasmid pEM58 Δ ähnlich dem in EP- A-0284126 beschriebenen Verfahren transformiert. Vor den Integrationsversuchen wurde er durch Restriktionsenzym- Analyse auf das Vorhandensein des fraglichen Plasmids in den Transformanten untersucht.
- Die Integration von pEM58 Δ in das Chromosom des Bacillus-Stamms pEM58 wurde wie in EP-A-0284126 beschrieben durchgeführt. Die Selektion nach Integranten wurde bei einer Neomycin-Konzentration von 1 µg/ml durchgeführt. Die genetische Organisation des Integranten wurde mittels Restriktionsenzym-Analyse, gefolgt von Southern-Blotting und Hybridisierungsanalyse bestimmt und ist in Figur 3 gezeigt. Es zeigte sich, dass die Integration von pEM58 Δ durch homologe Rekombination in dem 5'-flankierenden Gebiet des Gens der alkalischen Protease über einen sogenannten Mechanismus nach Campbell erfolgte, was den Bacillus-Stamm PBT110-INT5 ergab.
- Der Bacillus-Stamm PBT110-INT5 wurde in 100 ml Trypton-Soja-Extrakt (TSE) eingeimpft, die 1 µg Neomycin enthielt, und es wurde während 24 Stunden bei 50ºC inkubiert.
- Nach 24 Stunden wurden 0,1 ml der erhaltenen Kultur in einen 500ml-Schüttelkolben gegeben, der 100 ml PBT- Minimalmedium enthielt: K&sub2;HPO&sub4; 17,42 g/l; Glutamat 13,36 g/l; Natriumcitrat-Hydrat 2 g/l; FeSO&sub4;-Heptahydrat 0,05 g/l; ZnSO&sub4;-Heptahydrat 1 mg/l; MnSO&sub4;-Hydrat 1 mg/l; CaCl&sub2;- Dihydrat 10 mg/l; MgSO&sub4;-Heptahydrat 0,2 g/l; CuSO&sub4;- Pentahydrat 0,5 mg/l; H&sub3;BO&sub3; 0,5 mg/l; Na&sub2;MoO&sub4;-Dihydrat 0,5 mg/l; CoCl&sub2;-Hexahydrat 0,5 mg/l; Biotin 0,5 mg/l; Saccharose 20 g/l; (pH 8,0, während 20 min bei 120ºC sterilisiert). Nach der Sterilisation wurde 1 mg/l Thiamin zugegeben.
- Diese Kultur wurde während 4 Tagen bei 37ºC inkubiert. Nach 4 Tagen wurde 1 ml der Kultur mit 100 ml des selben Mediums verdünnt und während 4 Tagen inkubiert. Nach vier Tagen wurde die Kultur auf Platten mit PBT-Minimalmedium und zusätzlich 0,4% Casein und 15 g/l Agar plattiert. Diejenigen Kolonien, denen ein erkennbarer Protease- Hof fehlte, wurden als Protease-negativ angesehen und wur den auf das Fehlen des Gens untersucht, das die alkalische Protease von PBT110 kodiert.
- Diejenigen Stämme, die auf den im vorigen Abschnitt beschriebenen Casein-Platten keine erkennbaren Hof zeigten, wurden zuerst auf das Vorhandensein eines neomycin-empfindlichen und asporogenen Phänotypus untersucht. Zwei Stämme, Bacillus PBT125 und PBT126, die den Protease-negativen und asporogenen Phänotypus zeigten, wurden wie in US-Re.-30602 beschrieben in 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml Protease- Bildungsmedium auf die Herstellung von Protease untersucht. Keiner der beiden Stämme stellte messbare Proteasemengen her.
- Die genetische Organisation der zwei Stämme wurde mittels Restriktionsenzym-Analyse und Chromosomen-Blotting bestimmt und ist in Figur 4 gezeigt. Es hatte keine homologe, sondern eine illegitime Rekombination stattgefunden, woraus sich zwei Stämme ergaben, in denen die Gene für die Protease und die Neomycin-Resistenz vollständig deletiert waren. Es schien jedoch, dass ein kleines Plasmidbruchstück nach der Deletion des Protease-Gens im Chromosom übrigblieb. Die Sequenz dieses Fragments wurde wie folgt bestimmt. Die chromosomalen HindIII-Bruchstücke der Stämme PBT125 und PBT126, die die Plasmid/Chromosom-Verknüpfungsstellen enthielten, wurden in den Phagenvektor M13 mp18 ligasiert (Messing et al. Nucl. Acids Res. 9 (1981), 303 bis 321) und gemäss dem von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 2110 bis 2114, beschriebenen Verfahren auf E. coli JM101 transformiert. Nach Phagenpropagation in E. coli JM101 wurde einzelsträngige DNA isoliert (Heidecker et al. Gene 10, (1980), 69 bis 73.
- Die eingeschobenen Bruchstücke wurden nach dem von Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 6463, beschriebenen Verfahren sequenziert. Die Ergebnisse sind in den Figuren 5A resp. 5B gezeigt.
- Das Plasmid pM58 wurde mit HpaI und BalI abgebaut. Nach Reinigung des DNA-Bruchstücks, das das Proteasegen enthält (Maniatis, 1982) wurde dieses Bruchstück in den Phagen M13 mp18 ligasiert, wobei dieser mit SmaI abgebaut worden war. Die Ligasierungsmischung wurde auf E. coli JM101 transfiziert (Cohen et al. siehe oben). Nach Phagenvervielfältigung in E. coli JM101 wurde doppelsträngige DNA gemäss dem von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1513 bis 1523) beschriebenen Verfahren isoliert. Das eingeschobene Bruchstück und seine Orientierung wurden mittels Restriktionsenzym-Analyse überprüft. Der Vektor mp18 MXL wurde für weitere Subklonierungsversuche verwendet und ist in Figur 6 gezeigt.
- Figur 7 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pBHA1. Dieses Plasmid ist von dem von Stanssens et al. (Nucl. Acids Res. 17 (1989), 4441 bis 4454) beschriebenen Doppelvektorsystem pMa/c5-8 abgeleitet, in dieses wurde ein zusätzlicher Promotor eingefügt. Plasmid pBHA1 besteht aus den folgenden Bruchstücken:
- Position 11 bis 105 : Bacteriophage FD, Terminator;
- Position 121 bis 215 : Bacteriophage FD, Terminator;
- Position 221 bis 307 : Ein Teil des Plasmids pBR322 (d.h. Position 2069 bis 2153);
- Position 313 bis 768 : Bakteriophage F1, Replikationsursprung (d.h. Position 5482 bis 5943);
- Position 772 bis 2571 : Teil des Plasmids pBR322, d.h. der Replikationsursprung und das β-Lactamasegen;
- Position 2572 bis 2685 : Transposon Tn903, vollständiges Genom;
- Position 2719 bis 2772 : Tryptophan-Terminator (doppelt);
- Position 2773 bis 3729 : Transposon Tn9, das Chloramphenicol-Acetyltransferase- (=cat-) Gen. Die Nukleotide bei Position 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) und 3409 (A) unterscheiden sich von der cat-kodierenden Wildtypsequenz. Die Mutationen wurden eingeführt, um die NcoI-, BalI-, EcoRI- und PvuII-Stellen zu entfernen;
- Position 3730 bis 3804 : Mehrfach-Klonierungsstelle;
- Position 3807 bis 7264 : Teil des Plasmids pUB110 (d.h. die Replikationsfunktion und das Kanamycin-Resistenzgen, EcoRI/PvuII-Bruchstück) (McKenzie et al., Plasmid 15 (1986) 93 bis 103 und Plasmid 17 (1987), 83 bis 85;
- Position 7267 bis 7331 : Mehrfach-Klonierungsstelle.
- Die Bruchstücke wurden unter Verwendung bekannter Klonierungstechniken wie z.B. Einfügen kohäsiver Enden mittels Klenow, Adapter-Klonierung, usw. zusammengefügt. Alle Daten wurden der Genbank National Nucleic Acid Sequence Data Bank NIH, USA, entnommen. Das Plasmid pMc5-8 wurde unter DSM 4566 hinterlegt.
- Vor den Mutationsschritten wurde das Doppelvektorsystem pBHA/C-1 wie folgt abgewandelt, um das Doppelvektorsystem pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL zu erhalten:
- 1. Der Vektor mp18 XL wurde mit KpnI und HincII abgebaut. Das DNA-Bruchstück, das das Protease-Gen enthielt, wurde gereinigt und in pBHA1 ligasiert, das mit EcoRV und KpnI abgebaut war. Die Ligasierungsmischung wurde auf E. coli JM101 transformiert (Maniatis, 1982) und auf LC&spplus;- Platten plattiert, die 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt (Difco), 8 g/l NaCl, 25 mg/l Thymin, 1 g/l MgSO&sub4;- Heptahydrat, 100 µg/ml Ampillicin und 20 µg/ml Neomycin, bei pH 7,0, enthielten. Die Plasmid-DNA der Transformanten wurde isoliert (Birnboim, siehe oben) und mittels Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Auf diese Weise wurde pBHA1-MXL isoliert (siehe Figur 8)
- 2. Um die in das Protease-Gen eingeführten Mutationen mit einem verfügbaren Satz von Oligonukleotiden zu sequenzieren, musste die Orientierung des F1-Ursprungs gegenüber dem Protease-Gen umgekehrt werden. Dies wurde auf die folgende Art durchgeführt: Das Plasmid pBHA1-MXL wurde mit BamHI abgebaut und religasiert. Die Ligasierungsmischung wurde auf E. coli WK6 (Maniatis, siehe oben) transformiert und dann wurde nach Resistenz gegen Neomycin oder Ampillicin auf LC&spplus;-Platten selektioniert, die 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt (Difco), 8 g/l NaCl, 25 mg/l Thymin, 1 g/l MgSO&sub4;-Heptahydrat, 100 µg/ml Ampillicin und 20 µg/ml Neomycin, bei pH 7,0, enthielten. Die Plasmid-DNA der Transformanten wurde isoliert (Birnboim, siehe oben) und durch Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Auf diese Weise wurde pBHAR-MXL isoliert, das sich insofern von pBHA1-MXL unterscheidet, als dass die Orientierung der E. coli Sequenz umgekehrt ist (siehe Figur 9).
- 3. Für das Einführen der zusätzlichen flankierenden Sequenzen in das Plasmid pBHAR-MXL wurden die folgenden Abbauschritte unternommen. Das Plasmid pM58 wurde mit SphI und HindIII abgebaut. Das Plasmid pBHAR-MXL (Figur 10) wurde mit SphI und HindIII abgebaut. Das grössere Bruchstück wurde gereinigt. Beide Abbauprodukte wurden ligasiert, auf B. subtilis DB104 transformiert und es wurde nach Neomycin- Resistenz und Protease-Aktivität auf Minimal-Platten, enthaltend 10 µg/ml Neomycin und 0,4% Casein, selektioniert. Die Transformanten wurden durch Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Eine von ihnen, pBHARB-MXL (Figur 10), wurde für weitere Experimente verwendet.
- Die Mutagenese wurde mit dem Doppelvektor-System pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL (Stanssens, siehe oben) durchgeführt.
- Es wurde ein Verfahren nach dem Gapped-Duplex-Prinzip (Kramer et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 9441) und ein Phasmid (Phage/Plasmid-Hybrid) angewendet. Im Wesentlichen beruht das Verfahren auf einem gapped-duplex DNA-Zwischenprodukt, dieses besteht aus einern lückenhaften Strang (-Strang) mit einem Antibiotikum-Resistenzmarker eines Wildtyp, und einem Schablonenstrang (+Strang) mit einer Amber- Mutation in dem Resistenz gegen das Antibiotikum verleihenden Gen. Nach dem Verschmelzen wird das mutagene Oligonukleotid während der in vitro-Auffüllung der Lücke und der Versiegelungsreaktion in den lückenhaften Strang eingefügt. Die sich ergebenden Moleküle werden verwendet, um einen Wirt zu transformieren, der zur Behebung von Fehlpaarungen nicht befähigt ist (Mut S) und in dem die Verknüpfung zwischen der beabsichtigten Mutation und dem Antibiotikum- Resistenzmarker bestehen bleibt. Die gemischte Phasmid- Population, die von diesem Stamm isoliert wird, wird dann in einem Suppressor-negativen Stamm auftrennen gelassen. Die Transformanten werden auf einem antibiotikum-haltigen Medium plattiert, wodurch eine Selektion nach den Nachkommen, die von dem lückenhaften Strang abstammen, erzwungen wird.
- In dem pMa-artigen Vektor ist das Nukleotid 3409 von G in A abgeändert, während im pMc-artigen Vektor das Nukleotid 2238 von G in C abgeändert ist, wodurch Amber- Stopcodons im Gen der Chloramphenicol-Acetyltransferase resp. im Gen der β-Lactamase erzeugt werden, was diese Gene inaktiviert.
- Zur Durchführung der Mutagenese wird das DNA-Zielbruchstück in die mehrfache Klonierungsstelle von pMa5-8 oder eines Abkömmlings davon kloniert. Ein Gapped-Duplex zwischen pMa5-8, enthaltend die Ziel-DNA, und pMc5-8 wird dann konstruiert.
- Die Einzelstrang-Lücke, bestehend aus der Ziel-DNA, kann der Mutagenese mit einem mutagenen Oligonukleotid, mit langen, synthetischen Oligonukleotiden, die eine kleine Anzahl von fehlbesetzten Nukleotiden enthalten, und mit chemisch oder enzymatisch bewirktem Fehleinbau von Nukleotiden unterworfen werden. Für eine ausführliche Beschreibung siehe Ausubel et al. 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. New York; oder B. Perbal, 1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd ed. John Wiley & Sons Inc; New York.
- Nach dem Einführen der gewünschten Mutation(en) in das Plasmid pBHARB-MXL wurden die unerwünschten E. coli- Sequenzen wie folgt aus dem Plasmid deletiert: Das Plasmid pBHARB-MXL, das die Mutation von Bedeutung enthielt, wurde mittels BamHI abgebaut und unter verdünnten Bedingungen religasiert. Die Ligasierungsmischung wurde auf B. subtilis DB104 transformiert und es wurde auf Minimal-Platten, enthaltend 20µg Neomycin und 0,4% Casein, nach Neomycin- Resistenz und Protease-Aktivität selektioniert. Die DNA der Transformanten wurde isoliert und mittels Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Auf diese Weise wurden Vektoren isoliert, denen E. coli-DNA fehlte und die für die industrielle Herstellung von Proteinen geeignet sind.
- Das vorherige Verfahren wurd durch Figur 11 veranschaulicht, wo die Mutation M216Q als Beispiel genommen wird und die das Plasmid pBHB-MXL M216Q ergibt. M216Q, und auch die hier weiter unten aufgeführten M2165, S160D und N212D, sind Proteasemutanten des Bacillus PB92, der in EP- A-0328229 beschrieben ist.
- Der Bacillus-Stamm PBT125 wurde gemäss den in EP-A- 0284126 beschriebenen Transformationsverfahren mit Plasmid pBHB-MXL oder mit von diesern abgeleiteten Plasmiden, die Mutanten des Proteasegens enthielten, transformiert. Vor den Herstellungsversuchen wurden die Transformanten mittels Restriktionsenzym-Analyse auf das Vorhandensein des fraglichen Plasmids überprüft.
- Das Plasmid pE194neo-1 (EP-A-0284126) wurde mittels Sal1 abgebaut und religasiert. Die Ligasierungsmischung wurde auf B. subtilis DB104 transformiert und es wurde auf Minimal-Platten, enthaltend 20µg/ml Neomycin, nach Neomycin-Resistenz selektioniert. Das Plasmid pe194neo-3 wurde isoliert und auf das Vorhandensein des Neomycin-Resistenzgens in einer umgekehrten Orientierung überprüft (siehe Figur 12). Das Plasmid pE194neo-3 wurde mit HpaI und BglII abgebaut. Das den temperaturempfindlichen Replikationsursprung enthaltende Bruchstück wurde gereinigt (Maniatis, siehe oben).
- Das Plasmid pBHB-MXL M216Q (siehe Beispiel 3 und Figur 11) wurde mit BglII und BalI abgebaut. Das das Proteasegen enthaltende Bruchstück wurde gereinigt. Beide Bruchstücke wurden ligasiert. Die Ligasierungsmischung wurde auf B. subtilis DB104 transformiert und es wurde wie vorher beschrieben nach Protease-Aktivität und Neomycin-Resistenz selektioniert. Die Transformanten wurden durch Abbau mittels Restriktionsenzymen charakterisiert. Eine von ihnen, enthaltend das Plasmid pEN&sub3;Q, wurde ausgewählt (Figur 13). Dieses Plasmid enthielt das Neomycin-Resistenzgen, den temperaturempfindlichen Replikationsursprung vom Plasmid pE194neo-3 und die M216Q-Mutation in dem Proteasegen von PB92.
- Wie für den Integrationsvektor pEN&sub3;Q beschrieben, wurde pEN&sub3;S konstruiert, wobei pBHARB-MXL M216S als Ausgangsvektor verwendet wurde.
- Der Bacillus-Stamm PBT110 wurde wie in EP-A-0284126 beschrieben mit Plasmid pEN&sub3;Q transformiert. Vor den Integrationsversuchen wurde er mittels Restriktionsenzym-Analyse auf das Vorhandensein des fraglichen Plasmids in den Transformanten untersucht.
- Die Versuche zur Integration des Plasmids pEN3Q in das Chromosom des Bacillus-Stamms PBT110 wurden wie in EP- A-0284126 beschrieben durchgeführt. Die Selektion nach Integranten geschah bei einer Neomycin-Konzentration von 1µg/ml und bei einer für die Plasmid-Replikation nichtpermissiven Temperatur (50ºC). Zur Überprüfung der Integration von PEN&sub3;Q in das Chromosom wurde chromosomale DNA der mutmasslichen Integranten isoliert, mit HindIII oder ClaI abgebaut, auf einem Agarose-Gel mit 0,8% DNA entwickelt und auf Nitrocellulose aufgetragen (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503 bis 517) und mit ³²P-markierter, nicktranslatierter DNA aus pEN&sub3;Q hybridisiert (Maniatis, 1982).
- Es wurde gezeigt, dass die Integration von pEN&sub3;Q durch homologe Rekombination erfolgt war, woraus sich ein Stamm ergab (PBT110M/Q), der zwei Protease-Gene enthielt (ein Wildtyp und eine M216Q-Mutante), wobei diese hintereinander auf dem Chromosom lagen. Die Integration erfolgte also gemäss einem sogenannten Mechanismus nach Campbell, wie in Figur 14 gezeigt (siehe auch EP-A-0284126).
- Es wurde nach Neomycin-empfindlichen Rekombinanten selektioniert, die entweder den Wildtyp oder die Mutante des Proteasegens im Chromosom enthielten (diese werden hier im Folgenden als "Aussenrekombinanten" bezeichnet) . Das Selektionsverfahren gleicht dem vorher in Bespiel 2C beschriebenen Verfahren.
- Der Stamm PBT110 M/Q wurde als Ausgangsstamm verwendet. Nach Inkubation des Stamms PBT110 M/Q in Minimalmedium PBT wurde die Kultur auf Platten mit Minimalmedium PBT, enthaltend 0,4% Casein und 15g/l Agar, plattiert. Diese Platten wurden während 48 Stunden bei 37ºC inkubiert und auf Infusionsplatten nach Heart (HI-Platten), enthaltend 1µg/ml Neomycin beziehungsweise kein Neomycin, replikaplattiert. Die Neomycin-enpfindlichen Kolonien wurden als Aussenrekombinanten angesehen.
- Chromosomale DNA der mutmasslichen Aussenrekombinanten wurde isoliert, mit ClaI oder HindIII abgebaut, auf 0,5%igem Agarose-Gel entwickelt, auf Nitrocellulose aufgetragen (Southern, 1975) und mit ³²P-markierter, nicktranslatiertem PEN&sub3;Q hybridisiert (Maniatis, 1982). Da die Mutation M216Q die Entfernung der ClaI-Stelle bewirkt, können die Stämme, die einen Wiltdyp oder eine Mutante des Proteasegens enthalten, und der Zwischenstamm PBT110 M/Q leicht unterschieden werden, siehe Figur 14.
- Eine Aussenrekombinante, die die M216Q-Mutante des Proteasegens von PB92 enthält, wurde isoliert. Nachdem gezeigt worden war, dass ein Genaustausch des Wildtyps der Protease aus PB92 durch die Proteasemutante von PB92 stattgefunden hatte, wurde das Produkt des Stamms mittels seiner biochemischen Parameter (kcat, Km), seiner Widerstandsfähigkeit gegen Oxidation, seiner spezifische Aktivität und seiner Leistung beim Waschen wie in EP-A-0328229 beschrieben charakterisiert. Alle Ergebnisse waren identisch mit denjenigen einer Bezugsprotease M216Q, was darauf hindeutete, dass das Produkt des transformierten Stamms tatsächlich die PB92-Protease mit der Mutation M216Q war. Dieser transformierte Stamm wird Bacillus PEP111 genannt.
- Ahnliche Versuche wurden unter Verwendung des Vektors pEN&sub3;S durchgeführt, wodurch der Bacillus-Stamm PEP112 konstruiert wurde, der die Protease aus PB92 mit der Mutation M216S enthält.
- Der Bacillus-Stamm PEP111 wurde mittels des in EP-A- 0284126 beschriebenen Verfahrens mit Plasmid PEN&sub3;Q transformiert. Vor dem Integrationsversuch wurde er mittels Restriktionsenzym-Analyse auf das Vorhandensein des fraglichen Plasmids in den Transformanten untersucht. Das Integrationsverfahren und die Selektion nach Integranten (bei einer Neomycin-Konzentration von 20µg/ml und bei einer für die Plasmid-Replikation nicht permissiven Temperatur von 50ºC) wurde wie in EP-A-0284126 beschrieben durchgeführt.
- Um die Integration des Plasmids pEN&sub3;Q in das Chromosom zu überprüfen, wurde chromosomale DNA der mutmasslichen Integranten isoliert und mit HindIII abgebaut, auf 0,8%igen Agarosegelen entwickelt, auf Nitrocellulose aufgetragen (Southern et al., 1979) und mit ³²P-markiertem, nicktranslatiertem pEN&sub3;Q hybridisiert. Es wurde gezeigt, dass ein Stamm isoliert worden war, der zwei Mutanten (M216Q) des Proteasegens aus PB92 enthielt, wobei diese getrennt auf dem Chromosom lagen. Dieser Stamm wird PEP211 genannt. Sein chromosomaler Aufbau ist in Figur 15 gezeigt.
- Zum Bildung eines analogen Stamms, der zwei Proteasegene mit der Mutation M216S enthält, wurde der Stamm PEP112, der nach Genaustausch des Wildtyp-Gens eine Genmutante (M216S) enthält, mit dem Plasmid pEN&sub3;S transformiert, wobei die oben beschriebenen Verfahren befolgt wurden. Diese Versuche ergaben den Stamm PEP212, der zwei getrennt auf dem Chromosom liegende Proteasegene aus P892 init der Mutation M216S aufweist.
- Die Herstellung der Proteasemutanten wurde mit transformierten Bacillus-Stämmen durchgeführt, in denen das die Proteasemutante kodierende Gen entweder auf einem Plasmid oder auf dem Chromosom lag.
- Für die Plasmid-kodierte Herstellung wurden 2 Arten von Stämmen verwendet, der alkalophile Stamm Bacillus PBT125, wie er hier beschrieben ist, und der Stamm B. subtilis DS12367, ein asporogener, von B. subtilis DB104 abgeleiteter Stamm. Diese Stämme wurden mit von pBHB-MXL abgeleiteten Plasmiden transformiert. Bacillus PBT125 und B. subtilis DS12367, die keine die Protease kodierenden Plasmide aufweisen, wurden als Bezugsstämme verwendet.
- Zur Herstellung mittels Stämmen, die chromosomal integrierte Mutanten des Proteasegens enthielten, wurden die PEP-Stämme von Bacillus, wie sie hier beschrieben sind, verwendet. Die Bacillus-Stämme PBT108 und PBT110, die den Wildtyp des Proteasegens enthielten, wurden als Bezugsstämme verwendet. PBT108 ist ein Stamm, der zwei getrennt auf dem Chromosom liegende Wildtyp-Proteasegene enthält, siehe EP-A-0284126. Für PBT110 siehe Beispiel 2A.
- Zur Überprüfung der Aktivität des ursprünglichen Promotors des Proteasegens aus PB92 in B. subtilis wurde ein Konstrukt hergestellt, pBHB-MXLR, in dem die Orientierung des Proteasegens zum HpaII-Promotor hin (Zyprian et al., DNA 5 (1986), 219 bis 225) umgedreht ist, so dass die Expression des Proteasegens nur durch den ursprünglichen Promotor gesteuert wird.
- Die Herstellungen wurden in 500ml-Schüttelflaschen durchgeführt, die 100 ml Protease-Herstellungsmedium enthielten.
- Bei Verwendung alkalophiler Bacillus-Stämme wurden die Kulturen nach der Animpfung während 40 Stunden bei 37ºC in einem Herstellungsmedium inkubiert, wie es in US-Re.30602 beschrieben ist. Bei den Plasmid-haltigen Stämmen wurde Neomycin (20 µg/ml) zugegeben.
- Wurden die B. subtilis-Stämme DS12367 verwendet, wurde ein ähnliches Medium angewendet, dieses war ein 0,2 M Phosphatpuffer von pH 6,8 und enthielt 12,5 g/l Hefeextrakt (Difco), 0,97 g/l CaCl&sub2;-Hexahydrat, 2,25 g/l MgCl&sub2;-Hexahydrat, 20 mg/l MnSO&sub4;-Tetrahydrat, 1 mg/l CoCl&sub2;-Hexahydrat, 0,5 g/l Citrat, 0,5 ml Schaumhemmer 5693 und 6% (g/g) Maltose. Bei Plasmid-haltigen Stämmen wurde Neomycin (20 µg/ml) zugegeben.
- Kulturen, die B. subtilis-Stämme enthielten, wurden während 65 Stunden bei 37ºC inkubiert. In allen Fällen wurden die Schüttelkolben mit 0,1 ml einer 20 µg/ml Neomycin enthaltenden Kultur des fraglichen Stamms in Trypton-Soja- Extrakt, die während 24 Stunden bei 37ºC inkubiert worden war, angeimpft.
- Die Proteaseaktivität wurde unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat bestimmt, wie von Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969), 789 bis 793, beschrieben. Die spezifischen Aktivitäten der Proteasemutanten (EP-A-0328229) wurden verwendet, urn die Produktion im mg-Massstab zu bestimmen.
- Die Ergebnisse der Gärversuche sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1
- Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen (einschliesslich Patentanmeldungen) sind dem fachlichen Verständnis der Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet, angemessen. Alle Veröffentlichungen sind hiermit durch Bezugnahme in gleichem Ausmass eingeschlossen, wie wenn jede einzelne Veröffentlichung besonders und für sich als durch Bezugnahme eingeschlossen erklärt worden wäre.
- Obwohl die vorige Erfindung in gewissen Einzelheiten mittels Veranschaulichungen und Beispielen im Hinblick auf Klarheit und Verständnis beschrieben worden ist, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass Etliches an ihr ausgetauscht und abgeändert werden kann, ohne den Sinn und den Schutzbereich der angehängten Ansprüche zu verlassen.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von Proteasen, die sich
in mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp-Protease
unterscheiden, umfassend die Verwendung eines homologen,
alkalophilen, zur Bildung der Wildtyp-Protease nicht
befähigten Bacillus-Stamms als Patentansprüche Expressionswirt,
wobei in besagtem Bacillus-Stamm das Wildtyp-Gen für die
hochalkalische Protease durch Austausch dieses Wildtyp-Gens
für die hochalkalische Protease durch mindestens eine Kopie
der Genmutanten für hochalkalische Protease deletiert
worden ist, oder wobei in besagtem Bacillus-Stamm das Wildtyp-
Gen für die hochalkalische Protease so deletiert worden
ist, dass die im Chromosom verbleibenden Sequenzen für eine
homologe Rekombination mit einem Plasmid-kodierten
Protease-Gen zu kurz sind und worin mindestens eine Kopie einer
Genmutanten für hochalkalische Protease in das Genom
eingefügt oder Plasmid-kodiert ist.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei als
Expressionswirt ein Protease-negativer alkalophiler Bacillus-Stamm
verwendet wird.
3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2,
wobei ein Protease-negativer Abkömmling der Novo-Art PB92 von
Bacillus eingesetzt wird.
4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei ein asporogener alkalophiler Bacillus-Stamm eingesetzt
wird.
5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4,
wobei ein asporogener Bacillus eingesetzt wird, in dem das
Wildtyp-Gen für die Protease durch homologe oder illegitime
Rekombination deletiert worden ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, in dem die
hochalkalische Wildtyp-Protease im wesentlichen die
Aminosäuresequenz der Protease der Novo-Art PB92 von Bacillus aufweist.
7. Verfahren zur Herstellung eines alkalophilen
Bacillus-Stamms, der zur Bildung von Proteasen befähigt ist,
die sich in mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp-
Protease unterscheiden, wobei von einem Bacillus-Stamm das
Wildtyp-Gen für die hochalkalische Protease deletiert wird,
indem das besagte Wildtyp-Gen für die hochalkalische
Protease durch mindestens eine Kopie der Genmutanten für eine
hochalkalische Protease ersetzt wird, oder wobei in
besagtem Bacillus-Stamm das Wildtyp-Gen für die hochalkalische
Protease so deletiert wird, dass die im Chromosom
verbleibenden Sequenzen für eine homologe Rekombination mit einem
Plasmid-kodierten Protease-Gen zu kurz sind und worin
mindestens eine Kopie einer Genmutanten für eine
hochalkalische Protease in das Genom eingefügt oder Plasmid-kodiert
ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, wobei besagter
alkalophiler Bacillus-Stamm die Novo-Art PB92 von Bacillus oder
einer seiner Abkömmlinge ist.
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