KR0169978B1

KR0169978B1 - 돌연변이 프로테아제의 효과적인 제조방법

Info

Publication number: KR0169978B1
Application number: KR1019900012377A
Authority: KR
Inventors: 코넬리스 반 데르 라안 요하네스; 알베르터스 게라더스 반 엘켈렌 크리스티안
Original assignee: 마가렛트 에이. 호른; 제넨코르 인터내셔널 인코퍼레이티드
Priority date: 1989-08-11
Filing date: 1990-08-11
Publication date: 1999-02-01
Also published as: AU6096190A; PT94961A; RU2060276C1; CA2023094A1; CA2023094C; BG92653A; FI110365B; BR9003956A; DK0414297T3; JPH03210177A; PT94961B; DD297187A5; EP0414297A1; AU629970B2; US20040014175A1; DE69028890D1; ATE144283T1; DE69028890T2; EP0414297B1; ES2095233T3

Abstract

내용없음.

Description

돌연변이 프로테아제의 효과적인 제조방법

제1도는 바실루스 노보종 PB92로부터의 알칼리성 프로테아제 유전자의 5' 및 3' 플랭킹 영역 부분이 함유된 플라스미드 pM 58 △의 구성을 도시한다.

제2도는 플라스미드 pE 194 neo-1로부터의 온도-민감성 복제 기원을 플라스미드 pM58△에 도입하여 플라스미드 pE58 △을 산출하는 것을 개략적으로 도시한다.

제3도는 상동 재조합에 의해 플라스미드 pEM 58을 바실루스 균주 PBT 110의 프로테아제 유전자의 5' 플랭킹영역에 도입하는 것을 도시한다.

제4도는 변칙적인 재조합후에 결실된 프로테아제 유전자 주변영역에 대한 간단한 제한지도를 도시한다. PBT 125와 PBT 126의 2가지 균주를 얻었다.

제5도는 PBT 125(a)와 PBT 126(b)의 Hind III 단편의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.

제6도는 프로테아제 유전자를 M13mp18에 도입하는 것을 개략적으로 나타낸다.

제7도는 플라스미드 pBHA-1의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.

제8도는 바실루스 균주 PBT 110의 프로테아제 유전자를 플라스미드 pBHA 1에 도입하는 것을 나타낸다.

제9도는 pBHA1-MXL의 Bam HI 단편이 함유된 F1 ori를 재배향(reorientation)시켜 플라스미드 pBHAR-MXL을 산출하는 것을 나타낸다.

제10도는 고알칼리성 프로테아제의 3'서열을 플라스미드 pBHAR-MXL에 서브클로닝하여 플라스미드 pBHARB-MXL을 산출하는 것을 나타낸다.

제11도는 플라스미드 pBHARB-MXL M216Q로부터 대장균의 서열을 결실시켜 플라스미드 pBHB-MXL M216Q를 산출하는 것을 나타낸다.

제12도는 플라스미드 pE 194 neo-1에서 네오마이신 내성유전자를 재배향시켜서 플라스미드 pE194 neo-3을 산출하는 것을 나타낸다.

제13도는 플라스미드 pE194 neo-3으로부터 온도-민감성 복제 기원을 플라스미드 pBHB-MXL M216Q로 도입하여 플라스미드 pEN₃Q를 산출하는 것을 개략적으로 나타낸다.

제14도는 바실루스 균주 PEP111 균주의 구성을 개략적으로 나타낸다.

제15도는 바실루스 균주 PEP211의 구성을 개략적으로 나타낸다.

[기술분야]

본 발명은 DNA 재조합 기술을 사용하여 단백질 돌연변이체를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 대응되는 변형되지 않은 프로테아제를 제조하는 능력이 제거된 동종 바실루스 숙주 균주를 사용하여 단백질 조작화된 바실루스 프로테아제를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

바실루스는 α-아밀라아제, 중성 프로테아제 및 알칼리성(또는 세린) 프로테아제와 같은 공업적으로 중요한 효소의 제조에 널리 사용된다(예를 들어 Debabov: The industrial use of Bacilli in : The Molecular Biology Bacilli Acad. Press, New York, 1982 참조).

바실루스를 사용하는 중요한 장점은 분비된 단백질의 양이 많다는 점, 해로운 물질을 제조하지 않는다는 점, 그리고 오랫 동안 공업적으로 안전하게 사용되어 왔다는 점이다. 그래서 식품에 사용되는 것으로 정해진 단백질의 제조를 위해 몇가지 바실루스 종이 제안되었다.

Palva 등(Gene 19 (1982) 81-87)은 바실루스 아미노리퀴팩신스로부터 나온 α-아밀라아제 유전자를 바실루스 섭틸리스에서 발현시킴으로써 상동 단백질의 발현 숙주로서의 바실루스 섭틸리스의 사용 가능성을 증명하였다. 바실루스 섭틸리스에서의 상동 유전자 발현이 기술된 다른 참고자료로서는 예를 들어 Fahnestock 및 Fisher(J. Bacteriol. 165 (1986) 796-804)가 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A 유전자의 발현을 밝혔고; Schein등(Biotechnology 4 (1986) 719-725)은 사람의 인터페론-α2의 발현을 개시하였으며; Wang 등(Gene 69 (1988) 39-47)은 사람의 동맥나트륨뇨배설 α-인자의 발현 및 분비를 밝혀내었다. 이러한 이종성 단백질의 적절한 분비를 보장하기 위해, 전자의 두 참고자료에서는 α-아밀라아제 시그널 서열을 사용하였고 후자의 참고자료에서는 발현된 유전자에 융합된 바실루스 섭틸리스 섭틸리신 유전자(aprE)의 시그널 서열을 사용하였다.

재조합 단백질의 제조 숙주로서 바실루스 균주의 중요한 문제점은 제조된 이종성 단백질을 분해(degrade)시키는 경향이 있는 다향한 프로테아제를 제조하여 분비한다는 것이다(예를들어 Old and Primrose Principles of Gene Manipulation, 3rd ed. (1985) 289, Blackwell, Oxford 참조).

국제특허출원(PCT) WO 89/04866 호에서는 세포외 프로테아제의 중요성이 지적되었다; 약 90%의 단백질 분해활성은 중성 메탈로프로테아제(npr) 및 세린 프로테아제(알칼리성 프로테아제 = apr)에 기인한다.

이러한 분해 문제를 극복하기 위해 다양한 해결책이 제시되었다.

Kawamura 와 Doi(J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444)는 세포외의 중성 및 알칼리성 프로테아제 모두에 있어서의 바실루스 섭틸리스 2중 돌연변이체 결함을 개시하였다. 먼저 바실루스 섭틸리스 DB 100은 바실루스 섭틸리스 NT 18로부터 nprR2 및 nprE18 돌연변이를 전달시킴으로써 중성 프로테아제 음성(negative)이 되었다. 그다음에는 apr 유전자의 일부가 함유된 178 bp 단편을 유전자 변환에 의해 결실시켰다.

Fahnestock 과 Fisher(Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987) 379-384)는 npr 음성 균주로부터 시작되는 apr 음성 바실루스 섭틸리스 균주의 구성을 기술하였다. 여기에는 비활성제로서 및 선택가능 마커로서 apr 유전자와 도입된 cat 유전자(클로람페니콜 내성을 부여한다)가 함유된 플라스미드가 사용되었다. 그 다음에는 염색체 apr 유전자를 이 구성체로 치환하였다.

Sloma 등 (J. Bacteriol. 170 (1988) 5557-5563)은 바실루스 섭틸리스로부터 제3의 세포의 프로테아제 유전자(epr)를 검출 및 서열화 하였다. 이 유전자를 부분적으로 결실시킨 결과 이는 세포외 프로테아제 활성에 단지 근소하게 기여한다는 사실이 나타났다.

제조된 균주를 더욱 면밀하게 관찰한 결과, 참조된 바실루스 섭틸리스 중의 어느것도 세포외 단백질분해 활성이 완전히 결여되지는 않았다는 것이 밝혀졌다. 그러므로 이종성 단백질의 제조에 사용될 수 있는 개선된 프로테아제 결여 바실루스 균주가 여전히 요구된다. 이와같은 요구는 돌연변이된 프로테아제의 발현을 목적으로 하는 경우에 더욱 절실하다.

몇가지 공보에는 야생형 프로테아제 유전자를 발현시킬수 없는 바실루스 섭틸리스 숙주 균주를 이용하여 따라서 돌연변이체와 야생형 프로테아제의 혼합을 회피할 수 있는 프로테아제 돌연변이체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

EP-A-0246678(EP-A-0130756에 대응하는 본출원의 내용)에는 효소적 활성 섭틸리신 또는 중성 프로테아제를 분비할수 없으나 바실루스 아밀로리퀴팩신으로부터 단리 또는 유래된 이종성 프로테아제 유전자를 발현시키는 바실루스 섭틸리스 균주가 개시되어 있다. 바실루스 아밀로리퀴팩신 유전자에서 위치-특이적 포화 돌연변이 유발이 수행되어 돌연변이체가 발현되었다. 바실루스 섭틸리스 숙주 균주의 음성 배경은 원래의 프로테아제 유전자 둘중 하나 또는 두가지 모두를 부분적으로 결실시키거나 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 돌연변이 유발에 의해서 얻어진다. 또한 기술된 바실루스 섭틸리스 숙주가 대개 포자성이고 무포자성 돌연변이체는 (재조합) 단백질의 제조에 합당치 않다는 것이 강조된다.

W086/01825(Fahnestock 및 Fisher, 상기 참조)에 있어서, 바실루스 균주, 특히 세포외 프로테아제 수준이 감소된 특별한 바실루스 섭틸리스가 개시되어 있다. 알칼리성 프로테아제 유전자는 미생물에 표현형 특성을 부여하는 단백질 코딩 유전자를 시험관에서 삽입시킴으로써 비활성화되엇다. 삽입에 의해 비활성화된 유전자가 함유된 플라스미드 벡터를 바실루스 섭틸리스로 형질전환시키고 비활성화된 유전자가 상동 재조합에 의해 원래의 염색체 유전자를 치환하게 된다.

W088/08033호에는 바실루스 섭틸리스로부터의 섭틸리신 Carlsberg,, 섭틸리신 DY, 섭틸리스 BPN' 및 apr 섭틸리신, 그리고 바실루스 메센테리커스로부터의 섭틸리신의 유사체들이 개시되어 있다. 이 돌연변이체들은 칼슘 결합부위내 또는 부근에 있는 한 개 이상의 아미노산을 음전하를 띤 아미노산(예를 들어 Asp 또는 Glu)으로 치환함으로써 얻어진다. 이 돌연변이체들은 바실루스 섭틸리스에서 발현된다.

WO 89/04866 호에는 분비된 프로테아제의 활성이 낮은 바실루스 섭틸리스 균주가 개시되어 있으며 이것은 apr-npr-이중 돌연변이체 Spo0H 돌연변이를 도입하여 상기 균주를 무포자성을 만들었다. 얻어진 3중 돌연변이체 apr-npr-Spo0H^-는 매우 낮은 분비된 프로테아제 활성을 나타낸다.

상기 참고자료에는 바실루스 섭틸리스에서 동종성의 또는 이종성의 유전자의 발현 및 프로테아제-음성 바실루스 균주의 구성이 개시되어 있다. 프로테아제 유전자가 부분적으로 결실되거나 프로테아제 유전자에 다른 유전자가 삽입되어 제조된 프로테아제-음성 균주는 다음과 같은 몇가지 결점을 나타내는 것으로 나타났다;

- 원래의 유전자가 재활성화될 수 있다. 만일 비활성화 염색체 유전자와 상동성인 유전자가 세포내에 도입(예를 들어 플라스미드에)되면, 상동 재조합이 진행되어 유전자가 재활성화될 수 있다.

- 비활성화 되었더라도 프로모터 영역이 활성인 경우에 원래의 유전자는 부분적으로 발현산물을 제조할 수 있다. 이는 대사효율의 면에서 불리하다.

- 삽입된 유전자에 따라, 예컨대 항생물질에 대한 내성과 같이 원하지 않는 표현형의 특성 도입.

- 게놈서열과 일부의 플라스미드 사이의 상동성에 기인한 플라스미드 불안정성.

그러므로 염색체와 플라스미드간에 상동성일수 있는 모든 서열을 결실시키는 것이 바람직하다.

또한 바실루스 섭틸리스에는 알칼리 프로테아제나 다른 효소를 제조하는데 있어서의 다른 결점이 있다. Wells 등(Nucl. Acids. Res. 11 (1983) 7911-7925)은 바실루스 섭틸리스내에서의 바실루스 아밀로리퀴팩신스 섭틸리스 BPN'의 발현이 그 자체의 전사 시그널을 사용함으로써 가능하다는 것을 밝혓으나, Jacobs등(Nucl. Acids. Res. 13 (1985) 8913-8926)은 이러한 방법이 일반적으로 사용될 수 없음을 밝혔다. 바실루스 리케니포미스에서 유래된 섭틸리신 Carsberg 유전자의 5' 영역에는 바실루스 섭틸리스내의 전사를 위해 기능적인 시그널이 함유되어 있지 않다. 다량의 제조를 위해서는 해당되는 유전자 앞에 바실루스 섭틸리스 프로모터를 삽입할 필요가 있다. 또한 전사뿐만 아니라 번역상의, 분비 또는 성숙 과정은, 불완전한 샤인 달가노(Shine Dalgano) 서열 때문에 또는 유전자산물이 이종성 숙주와 양립할 수 없기 때문에 이종성 숙주내에서는 덜 효율적이다.

높은 제조능력이 입증된 동종성 바실루스 균주에서 제조물이 높은 효율로 합성되어 높은 제조수준을 초래하는 경우에는 상기 발현상의 문제점들을 피할수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 적어도 하나의 아미노산이 야생형 프로테아제와 다른 프로테아제 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 야생형 프로테아제를 제조할 수 없는 동종성 친알칼리성 바실루스 균주를 발현숙주로 사용하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 일면에 있어서는 고알칼리성 프로테아제 유전자를 염색체로부터 결실시키고, 얻어진 프로테아제 음성 균주는 동종성 또는 이종성 프로테아제의 발현을 위한 숙주로서 사용될수 있다.

본 발명의 다른면에 있어서, 염색체의 고알칼리성 프로테아제 유전자는 이 유전자의 돌연변이된 복사체로 치환된다.

또한 신규 형질전환된 균주를 구성하는 방법, 여기에 사용된 벡터 및 돌연변이체 프로테아제를 제조하는 방법이 제공된다.

바람직한 실시에 있어서, 대응 균주에 의해 원래 제조된 프로테아제와 밀접한 동종성을 나타내는 돌연변이체 프로테아제가 제조된다.

바람직한 균주는 돌연변이된 프로테아제 코드화 유전자에 의해 형질전환된 바실루스 노보종 PB92, 이것의 유도체 및 밀접하게 관련된 균주이다.

상기 유전자는 세린 프로테아제를 코드화하는 바실루스 PB92의 야생형 유전자와 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 나타낸다. 유전자는 친알칼리성 바실루스 균주의 야생형 유전자에서 유래되는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 균주는 무포자성 친알칼리성 바실루스이다.

[발명의 상세한 설명]

바실루스 속(genus)에 속하는 균주에 의해 제조되는 세린 프로테아제는 일반적으로 알칼리성 프로테아제라고 불리운다. 본 발명에 사용되는 프로테아제는 친알칼리성(alkalophilic)바실루스에서 유래되므로 고알칼리성성 프로테아제라고 불리운다.

고알칼리성성 프로테아제의 제조를 위해 친알칼리성 바실루스 균주를 숙주세포로 사용하는 것이 바람직하다. 대규모의 제조를 위해서는 공업용 균주가 필요하다. 이것은 토양에서 단리될 수 있는 유기체로부터 연유하거나 이러한 바실루스 균주를 유전적 변형시킴으로써 얻어진다. 공업용 바실루스 균주는 EP-A-0134048 호에 정의되어 있다. 이것들은 예컨대 파아지 감염 또는 형질전환과 같은 유전적 교환에 대한 내성을 가지는 특징이 있다. 이 균주는 안정하며 포자를 형성할수도 있고 형성할수 없을 수도 있다. 이것들은 대개 원 영양균(prototrophic)이고 변형되면 예컨대 α-아밀라아제 및 여러 가지 프로테아제와 같은 내인성 단백질 산물을 높은 수율로 제공한다. 공업제조과정에서 얻어진 내인성 단백질 산물의 수율은 적어도 5g/ℓ(0.5% w/v)까지의 양일수 있다. 공업용 균주는 또한 DNase를 분비할 수 있으며 이로써 배지내에서 DNA의 분해를 초래하여 유전적 교환을 방지하게 된다.

프로테아제 유전자가 원래 단리되어 나오는 균주를 숙주 균주로 사용하는 것이 유리하며, 이는 발현에 필요한 모든 시그널이 기능적임을 상기 경우에만 확신할 수 있기 때문이다.

생산 균주로서 친알칼리성 바실루스를 사용하는 또다른 장점은 발효하는 동안의 알칼리성 pH 때문에 다른 미생물에 의한 오염의 위험이 최소라는 것이다.

본 발명에 따르면 본 방법은 복귀 돌연변이가 불가능해지는 방법으로 게놈으로부터 바실루스 프로테아제 코드화 유전자를 결실시키기 위해 개시되었다. 상기 결실은 부분적 결실일 수 있으나(염색체에 남아있는 서열이 플라스미드 코드화 프로테아제 유전자와 상동 재조합하기에 짧은 경우) 유전자가 완전히 결실되는 것이 바람직하다. 이 방법에 의해 얻어지는 프로테아제 음성 균주는 돌연변이 프로테아제를 코드화하는 유전자를 운반하는 발현벡터를 도입한후 동종성 돌연변이 프로테아제를 제조하기 위해 사용된다. 그러나 이러한 프로테아제 음성 균주는 또한 동종성이거나 또는 이종성인 다른 단백질의 발현에도 유리하게 사용될수 있다. 이러한 맥락에서, 야생형 유전자가 단리되어 나오는 세포를 숙주 세포로 사용하는 돌연변이 프로테아제의 발현은 동종성 발현이라고 생각된다.

이러한 프로테아제의 돌연변이체를 제조하기 위한 숙주로서 공업용 프로테아제를 생산하는 바실루스 균주를 사용하여, 원래의 프로테아제 생산의 높은 효율이 돌연변이 프로테아제에 전가됨이 발견되었다. 이 결과로서 실험용 균주에 비해 훨씬 탁월한 생산 효율이 초래되었다. 돌연변이된 유전자의 염색체 복사체 1개는 공업용 균주에서의 발현 및 분비시에 실험용 균주에서 돌연변이 유전자가 함유된 50개 플라스미드 복사체보다 훨씬 높은 수율을 제공한다.

본 발명의 일면에 있어서, 돌연변이 프로테아제는 염색체 유전자나 이것의 일부를 대응하는 돌연변이된 유전자로 교환함으로써 동종성 바실루스 균주에 의해 효율적으로 제조될수 있다. 이런식으로, 야생형 프로테아제 생산능력이 제거됨과 동시에 돌연변이 프로테아제 생산능력이 도입된다.

변형되었거나 소위 단백질 조작화된 단백질을 코드화하는 돌연변이된 유전자의 발현을 위한 숙주세포로서 유전자가 높은 수준으로 구조적 발현되는 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또다른 면에 있어서, 놀랍게도 프로테아제 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해서는 무포자성(asporogenous)바실루스를 사용할 수 있다는 것을 알게 되었다.

본 발명은 또한 바실루스 섭틸리스에서 바실루스 PB92로부터 유래된 고알칼리성 프로테아제의 생산을 높이기 위해서는 바실루스 섭틸리스에서 활성인 프로모터를 유전자의 앞에 삽입하는 것이 바람직하다는 것을 보여준다. 만일 다른 바실루스로부터 유래된 효소가 바실루스 섭틸리스에서 생산되면, 바실루스 섭틸리스에서 활성인 프로모터 삽입체 또는 다른 발현 시그널이 필요할 수 있으며 여기에는 별도의 단계가 필요하다.

고알칼리성 프로테아제를 생산하는 바실루스는 분류학적으로 잘 분류되어있지 않으며 일반적으로 친알칼리성 바실루스 균주로 언급되어 있다. 본 발명을 위해 본발명자는 친알칼리성 바실루스는 pH 9-11의 알칼리성 조건하에서 성장하는 바실루스 균주로 정의한다(Horikoshi, k. 및 T. Akiba, 1982, Alkalophilic microorganisms, Spring Verlag, New York). 이러한 바실루스에 의해서 생산되는 알칼리성 프로테아제도 또한 고알칼리성 프로테아제로 불리운다. 알칼리성 pH에서 성장할 수 있는 바실루스 균주의 실례로는 예를 들어 미국특허 제3,723,250호, 특허 Re. 30,602호 및 제4,480,037호가 있다. 친알칼리성 바실루스 숙주 균주의 실레는 그중에서도 미국특허 Re. 30,602 호에 개시되어 있는 바실루스 노보 종 PB92이다. 프로테아제 생산에 최적화된 이 친알칼리성 바실루스 균주의 유도체는 공업상 규모에서 이 프로테아제를 제조하기 위해 사용되었다(EP-A-0284126 호 참조).

생산물은 몇가지 예를들어 세탁세제에의 첨가물로서와 같은 공업적 용도로 사용된다. 이러한 제품의 실례로는 Maxacal^R(기스트-브로카데스/IBIS), Savinase^R(NOVO), Esperase^R(NOVO)가 있다. 이러한 생산물의 돌연변이체들은 WO 89/06279호에 개시되어 있고 여기에서는 바실루스 렌투스 균주으로부터 유래한다고 되어 있으며, 미공개 유럽특허출원 EP-A-0328229호에도 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, EP-A-0328229 및 WO 89/06279호에 개시된 돌연변이체를 공업용 규모로 생산하는 형질전환된 바실루스 균주가 제공된다.

본 발명에 따르면, 바실루스 균주, 특히 친알칼리성 바실루스, 바람직하게는 바실루스 노보 종 PB92가 적절하게 사용된다. 바실루스 균주의 또다른 바람직한 군은 무포자성 돌연변이체이며 이중에서도 PBT 110과 이것의 유도체가 가장 바람직하다. 친알칼리성 바실루스 균주의 형질전환에는 상기 균주로부터의 원형질체의 사용이 포함되는 것이 바람직하다. 그러나, Chang, S 및 S.M.Cohen에 의해 기술된 통상의 원형질체 형질전환 프로토콜(Molec. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115)에는 친알칼리성 바실루스 균주에 관한 언급이 없다. 이 균주에 필요한 프로토콜은 EP-A-0283075호에 개시되어 있다.

동종성의 숙주에서 돌연변이 프로테아제 유전자의 발현은 야생형 유전자의 치환 및/ 또는 비활성화를 필요로 한다. 몇가지 방법이 사용될 수 있다.

a) 한 방법은 유전자나 이것의 일부를 클론하고 위치-지정 돌연변이 유발에 의해 변형시키고 유전자(부분적인)를 플라스미드에 실어 세포내로 재도입하는 것이다. 유전자는 상동 재조합에 의해 염색체에 도입될 수 있다. 야생형 및 돌연변이체 유전자는 일렬로 위치하게 되는 상황이 된다. 제2의 재조합후, 염색체 유전자에 상기와 같이 돌연변이가 효과적으로 도입된 염색체에는 변형된 서열이 남게 된다(제14도에 설명되었음).

b) 다른 방법에 있어서, 염색체 유전자 복사체는 결실에 의해 비활성화 된다. 만일 전략적으로 유전자의 결실이 선택되면, 결실되는 염색체 유전자 단편은 바람직하게는 완전한 코딩영역이다. 비활성후에는 비활성화된 유전자의 돌연변이 복사체를 클로닝 벡터에 실어 세포에 운반한다.

c) 또다른 방법에 있어서, 염색체 유전자 복사체가 돌연변이원화 된다. 원칙저긍로 돌연변이 원인 올리고 뉴클레오티드로 박테리아를 형질전환시킨 후에 생체네에서(특이적) 돌연변이를 얻을 수 있다. Moerschell 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(1988) 524-528)에 의해 기술된 바와같이 이러한 방법은 효모에 있어서 성공적으로 이용되어 왔다. 만일 이러한 방법에 동종성, 바람직하게는 동종성 친알칼리성 바실루스 균주에서 수행되면 이것은 본 발명의 구체예이다.

본 발명은 효과적인 프로테아제 생산자로서 공지된 바실루스 균주에 관한 것이다. 바람직한 방법중의 한가지에 있어서는 완전한 고알칼리성성 프로테아제 코딩 영역을 염색체로부터 결실시킨다. 이 구체예에 있어서는 5' 및 3' 영역이 포함된 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하는 벡터가 사용된다. 5' 및 3' 플랭킹 서열을 남기고, 시험관에서 벡터로부터 프로테아제 유전자를 결실시켰다. 이 벡터를 친알칼리성 바실루스 균주내에 운반하였다. 이 벡터는 플랭킹 영역에서의 상동 재조합을 거쳐 염색체에 통합된다. 탈재조합(outrecombination)과 분해(resolntion)는 결실된 프로테아제 유전자를 가지는 바실루스 균주에 이르게 한다. 사용된 벡터는 플라스미드가 바람직하다. 선택을 가능하게 하기 위해서 바람직하게는 예를 들어 네오마이신 내성과 같은 내항생성 선택가능 마커를 플라스미드에 도입한다. 바람직하게는, 벡터를 염색체내로 선택적으로 통합할 수 있으며 이는 pE194로부터의 것과 같이 온도에 민감한 기원과 같은 복제 유도성 기원을 도입함으로써 이루어질수 있다. 상기 플라스미드는 종동성 숙주세포내로 도입된다. 고온 조건하에서 플라스미드는 복제될수 없으므로 염색체의 통합체들은 선별될 수 있다. 통합체들은 고온에서 관련 항생물질(예를 들어 네오마이신)의 존재하에 선택된다. 숙주 염색체로부터 플라스미드가 분해되면 코딩 영역을 제거하면서도 염색체에 플랭킹 영역을 잔류시킬 수 있다. 마지막으로, 선별된 결과 돌연변이체는 선택가능 마커 유전자를 상실하였고(네오마이신 감수성임) 프로테아제 음성이다. 최후의 염색체 구성은 제한분석법과 서던 블로팅에 의해 결정된다. WO 88/06623 호에는 가능한 통합기작이 광범위하게 개시되어 있다. 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 변형된 프로테아제 유전자는 적절한 발현벡터에 실려 프로테아제 음성세포에 도입되었다. 플라스미드의 불안정성을 피하기 위해, 염색체에 상동성인 짧은 서열을 플라스미드가 운반하거나 바람직하게는 상동성인 서열을 전혀 운반하지 않는다는 점에 주의를 하여야 한다.

벡터로부터 돌연변이된 프로테아제 유전자를 발현시키는 대신에, 돌연변이된 프로테아제 유전자를 프로테아제 음성 균주에 염색체안에 통합시킬 수 있다. 이는 돌연변이된 프로테아제 유전자에 접하는 프로테아제 유전자의 플랭킹 영역을 플라스미드에 잔류시킴으로써 이루어질수 있다. 이러한 플라스미드의 도입은 플랭킹 영역내에서의 상동 재조합을 일으킴으로써 프로테아제 음성 균주의 염색체내에 돌연변이된 프로테아제 유전자를 도입할 수 있다. 만일 플라스미드가 불안정하면 특히 유리하다. 본 발명은 또한 만일 유전자의 복사체 1개가 게놈에 통합되어 플라스미드에 의해 코드화된 유전자 복사체가 여러개 존재한다면, 얻어지는 재조합 돌연변이체 또는 야생형 프로테아제의 양이 비슷하거나 더 많다는 것을 나타낸다.

또 다른 구체예에 있어서, 염색체의 고알칼리성성 프로테아제 유전자는 프로테아제 음성균주를 미리 단리하지 않고서도 상동 재조합에 의한 돌연변이체 유전자에 의해 치환될수 있다.

단백질이 분비된다면 프로테아제가 발현되어 세포로부터, 또는 배지로부터 단리될 수 있다. 프로테아제를 회수한 후, 이것은 정제되어 세제 조성물로 조합될 수 있다. 상기 생산에 있어서는 야생형 유전자가 완전히 결실되어 있기 때문에, 돌연변이 프로테아제 제조는 야생형 프로테아제로부터 완전하게 유리될 수 있다.

EP-A-0284126호에 개시된 바와같이 구성된 플라스미드 pM 58에는 고알칼리성 프로테아제 유전자가 함유되어 있다. 비활성화 플라스미드를 얻기위해 프로테아제 유전자의 코딩영역을 Ball/Hpal 이중 소화에 의해 결실시킨다. 연이어 pE194 neo-1으로부터 온도-민감성 복제 기원을 도입한다. pEM58 △ 구성체를 바실루스 균주 PBT 110에 도입한다.

프로테아제 유전자의 5' 플랭킹 영역에서는 소위 캠벌(Campbell)-형 기작에 의해 통합이 일어나서, 프로테아제 좌의 염색체에 플라스미드 벡터 전체를 운반하는 프로테아제 양성 균주가 형성된다(제3도에 도시되었다).

이 균주의 프로테아제 음성 유도체에 대한 연이은 선별에서는 두 균주 PBT 125와 PBT 126이 밝혀졌으며 여기에서는 프로테아제 유전자와 네오마이신 마커가 상실되었다. 또한 그 다음의 분석에서는 이 제2단계에서 변칙적인 재조합이 일어난다는 것이 밝혀졌다.

얻어진 바실루스 균주는 검출가능한 프로테아제 활성을 나타내지 않기 때문에 변화된 프로테아제 유전자의 발현에 사용될수 있다. PBT 125와 PBT 126이 유일한 실례임은 명백하다. 변칙적인 재조합은 상이한 결과를 산출하기 때문에 완전한 유전자가 결실되었는가의 여부를 측정하는 것이 필수적이다. 더욱 특이한 균주를 얻기 위해서는 상동 재조합이 이루어질수 있었어야 한다.

본원에서 주어진 실시예는 주로 본발명의 2가지 특이적 구체예를 기술하는 것이다. 그중 하나는 프로테아제 음성 균주로부터의 플라스미드 코드화 돌연변이 프로테아제의 제조이다. 나머지 하나는 돌연변이 프로테아제를 제조함으로써, 유전자 교환에 의해 돌연변이된 유전자를 게놈에 도입하는 것이다. 당해 기술분야에 숙련된 자에게는 다른 구체예들, 예를들어 프로테아제 음성 균주에 염색체를 통합시키는 것, 플라스미드상의 그리고 염색체에 통합된 돌연변이된 유전자 복사체, 염색체에서 일련로 위치된 또는 상이한 위치에 위치된 돌연변이된 유전자의 하나 이상의 복사체 등이 가능하다는 것이 명백해질 것이다. 다음의 실시예는 설명을 위해 제공되는 것이며 조금이라도 제한하려는 의도가 아니다.

[실험 섹션]

[실시예 1]

[비활성화 플라스미드 pEM 58 △의 구성]

플라스미드 pM 58(EP-A-0284126 호 참조)을 제한효소 Ball 및 Hpal으로 소화시켰다. 프로테아제 유전자의 플랭킹 서열부분이 함유된 큰 단편을 정제(Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982)하고 연결시켰다. 연결 혼합물을 바실루스 섭틸리스 DB 104(Kawamura 및 Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444)로 형질전환(Spizizen 등, J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746)시키고 카세인 0.4%와 네오마이신 20μg/㎖가 들어있는 최소 플레이트에서 네오마이신 내성 및 프로테아제 음성 형질 전환체를 선별하였다.

플라스미드 pM 58△을 단리하고 제한효소 분석에 의해 특성을 확인하였다. 제1도에 나타낸 바와같이, 플라스미드 pM 58△에는 고알칼리성 프로테아제 유전자의 플랭킹 서열, 네오마이신 내성체 코딩 유전자 및 바실루스 복제 기원이 함유되어 있다.

온도-민감성 복제 기원을 함유하는 통합 플라스미드를 구성하기 위해 pM 58△을 제한효소 Xbal 및 BglII로 소화시켰다. 고알칼리성 프로테아제 플랭킹 서열을 함유하는 단편을 정제하고, 이 단편을 전술한 바와같이 정제시킨 후 pE194(Jordanescu 등, 플라스미드 1(1978) 468-479)로부터 유래된 온도-민감성 복제 기원을 함유하는 pE 194neo-1의 (정제된) Xba I/ Bal II 단편(EP-A-0284126 호)에 연결시켰다. 연결 혼합물을 바실루스 섭틸리스 DB104로 형질전환시키고 네오마이신 내성체를 선별하였다(상기 참조). 플라스미드 pEM58△을 단리하여 특성을 확인하였다(제2도). 여기에는 네오마이신 내성체 유전자, pE 194로부터의 온도-민감성 복제 기원 및 알칼리 프로테아제 유전자의 플랭킹 서열이 함유되어 있다.

이 플라스미드 pEM58△을 사용하여 바실루스 균주 PBT 110을 형질전환하였다.

[실시예 2]

[프로테아제 네거티브 친알칼리성 바실루스 균주의 구성]

a. 플라스미드 pEM 58△에 대한 바실루스 PBT 110의 원형질체 형질 전환

바실루스 균주 PBT110은 바실루스 노보 종 PB92의 무포자성 돌연변이체(미합중국 특허 재출원 제30,602호) 이고 종래의 (UV)돌연변이 방법에 의해 얻어진다. 이 균주는 EP-A-0284126호에 개시된 것과 유사한 방법으로 플라스미드 pEM58△을 사용하여 형질전환시켰다. 통합실험에 앞서, 이것이 형질전환체가 관련 플라스미드를 함유하는가의 여부를 제한효소분석에 의해 검사하였다.

b. 바실루스 PBT110 염색체에 pEM58△의 통합

EP-A-0284126호에 개시된 바와같이 바실루스 균주 PBT 110의 염색체에 pEM58△의 통합을 수행하였다. 네오마이신 1μg/㎖ 농도에서 통합체의 선별이 이루어졌다. 제한효소 분석후에 서던 블로팅과 혼성화분석을 함으로써 통합체의 유전적 구성을 결정하였고, 이것을 제3도에 나타내었다. 알칼리성 프로테아제 유전자의 5' 플랭킹 영역에서의 상동 재조합에 의해 소위 캠벌-형 기작을 통하여 pEM58△의 통합이 일어나 바실루스 균주 PBT110-INT5가 형성되는 것으로 보인다.

c. 프로테아제 음성 균주의 선별

네오마이신이 1μg/㎖ 들어있는 트립신 콩 브로스(TSB)에 바실루스 균주 PBT-INT5를 접종하고 50℃에서 24시간동안 인큐베이션하였다.

24시간후, 얻어진 배양물 0.1㎖를 다음과 같은 PBT 최소배지가 100㎖ 들어잇는 500㎖ 진동 플라스크에 접종하였다: K₂HPO₄, 17.42g/ℓ; 글루타메이트, 13.36g/ℓ; 시트르산나트륨·H₂O 2g/ℓ; FeSO₄·7H₂O, 0.05g/ℓ; ZnSO₄·7H₂O 1㎎/ℓ; CuSO₄·5H₂O, 1㎎/ℓ; CaCl₂·2H₂O, 10㎎/ℓ; MgSO₄·7H₂O, 0.2g/ℓ; CuSO₄·5H₂O, 0.5㎎/ℓ; H₃BO₃, 0.5㎎/ℓ; Na₂MoO₄·2H₂O, 0.5㎎/ℓ; CoCl₂·6H₂O, 0.5㎎/ℓ; 비오틴, 0.5㎎/ℓ; 삭카로오스, 20g/ℓ; (pH 8.0, 120℃에서 20분동안 살균됨). 살균후에 티아민 1㎎/ℓ를 첨가하였다.

이 배양물을 37℃에서 4일간 인큐베이션하였다. 4일후, 배양물 1㎖를 동일 배지 100㎖에 희석시켜서 4일간 인큐베이션하였다. 4일후, 0.4% 카세인과 15g/ℓ 아가가 추가로 함유된 PBT 최소 배지 플레이트에 배양물을 플레이팅하였다. 검출가능한 프로테아제 무리(halo)가 결여된 콜로니는 프로테아 음성으로 간주하고, PBT 110 알칼리성 프로테아제를 코드화하는 유전자가 결여되었는가를 검사하였다.

d. 프로테아제 네거티브 균주의 특성확인

전술한 섹션으로 기술된 카세인 플레이트에서 검출가능한 무리를 나타내지 않는 균주를 네오마이신 감수성 및 무포자성 표현형의 존재에 대하여 일차적으로 시험하였다. 프로테아제 음성 및 무포자성 표현형이 함유된 2개 균주, 바실루스 PBT 125 및 PBT 126을 미합중국 특허출원 Re. 제30, 602호에 기술된 바와같이 프로테아제 생산배지가 100㎖ 함유된 500㎖전동 플라스크내에서 시험하였다. 어느 균주도 프로테아제를 검출가능한 양 만큼 제조하지 않았다.

제한효소분석과 염색체 블로팅에 의해 2개 균주의 유전적 구성을 결정하고 이것을 제4도에 나타내었다. 상동이 아니라 변칙적인 재조합이 일어났으며 프로테아제 및 네오마이신 내성 유전자가 완전히 결실된 2개의 균주가 결과적으로 생성되었다. 그러나 작은 플라스미드 단편은 프로테아제 유전자의 결실 이후에 염색체에 잔류하는 것으로 나타났다. 이러한 단편의 서열을 다음과 같이 측정하였다. 플라스미드/염색체 접합부를 함유하는 균주 PBT 125 및 126의 염색체 Hind III 단편을 파아지 벡터 M13 mp 18에 연결(Messing 등, NuCl. Acids Res. 9 (1981) 303-321) 시키고, Cohen 등 (Proc. Natl. Acid. Sci. USA 69 (1972) 2110-2114)에 의해 개시된 방법에 따라 대장균 JM 101로 형질전환시켰다. 대장균 JM 101에서 파아지를 증식시킨후, ssDNA를 단리하였다(Heidecker 등, Gene 10 (1980) 69-73).

Sanger 등에 의해 개시된 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 6463)을 사용하여 삽입체를 서열화하였다. 결과를 제5a및 5b도에 각각 나타내었다.

[실시예 3]

[프로테아제 생산 및 돌연변이 벡터의 제조]

a. 파아지 M13 mp 18에로의 PB92 프로테아제의 유전자의 서브클로닝

플라스미드 pM58 을 Hpa I 및 Bal I으로 소화시켰다. 프로테아제 유전자를 함유하는 DNA단편을 정제(Maniatis, 1982)한후 이 단편을 SmaI으로 소화된 파아지 M 13 mp 18에 연결하였다. 연결혼합물을 대장균 JM101에 형질전환(Cohen 등, 상기 참조)시켰다. 대장균 JM101에서 파아지를 증식시킨후, Birnboim과 Doly에 의해 개시된 방법(Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 1513-1523)에 따라 ds DNA를 단리하였다. 삽입체와 이것의 배향을 제한효소분석에 의해 검사하였다. 서브클로닝 실험을 더 하기 위해 mp18MXL 벡터를 사용하였고 제6도에 나타낸다.

b. 플라스미드 pBHA1에 있어서 PB92 프로테아제 유전자의 서브클로닝

제7도는 플라스미드 pBHA1의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 이 플라스미드는 Stanssens등에 의해 개시된 쌍성(twin)벡터체계 pMa/c5-8에서 유래되는데, 여기에는 추가 프로모터가 삽입되어 있다. 플라스미드 BHA1는 다음의 단편들로 구성된다:

pos 11-105 : 박테리오파아지 FD, 터미네이터;

pos 121-215 : 박테리오파아지 FD, 터미네이터;

pos 221-307 : pBR 322 플라스미드의 일부 (즉, 2069-2153 위치);

pos 313-768 : 박테리오 파아지 F1, 복제 기원 (즉, 5482-5943);

pos 772-2571 : 플라스미드 pBR 322의 일부, 즉 복제 기원 및 β-락타마제 유전자;

pos 2572-2685 : 트랜스포손 TN 903, 완전한 게놈;

pos 2719-2772 : 트립토판 터미네이터 (2중);

pos 2773-3729 : 트랜스포손 Tn9, 클로람페니콜-아세틸-전이효소(=cat)유전자. 3005(a), 3038(c), 3302(a) 및 3409(a) 위치의 뉴클레오티드는 야생형cat 코드서열과 다르다. 돌연변이가 도입되어 Nco I, Bal I, CcoRI 및 Pvu 11부위가 제거된다.

pos 3730-3804 : 다중클론 부위;

pos 3807-7264 : 플라스미드 pUB110의 일부(즉, 복제기능 및 가나마이신 내성유전자, EcoRI-Pvull단편)(Mckenzis등, Plasmid 15 (1986) 93-103 및 Plasmid17 (1987) 83-85);

pos 7267-7331 : 다중클론 부위.

단편들은 공지의 클로닝 기술, 예를 들어 접착말단을 클레노우(Klenow), 어댑터 클로닝등으로 채우는 기술을 사용하여 결합시켰다. 모든 데이터는 미합중국 Genbank^RNational Nucleic Acid Sequence Data Bank' NIH로부터 유래되었다. 플라스미드 pMc 5-8은 DSM 4566으로 기탁되었다.

돌연변이 과정에 앞서서, 쌍성 벡터 체계 pBHA/c-1을 변형시켜 다음과 같은 쌍성 벡터 체계 pBHARB-MXL/ pBHCRB-MXL을 얻었다.

1. 벡터 mp18MXL을 Kpnl 및 Hin C II로 소화시켰다. 프로테아제 유전자가 함유된 DNA 단편을 정제하고, EcoRV 과 Kpn I 으로 소화된 pBHA1에 연결하였다. 연결혼합물을 대장균 JM101에 형질전환(Maniatis, 1982)시키고, 트립톤 10g/ℓ, 효모추출물(Difco) 5g/ℓ, NaCl 8g/ℓ, 티민 25㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 1g/ℓ, 앰피실린 100 μg/㎖, 네오마이신 20μg/㎖가 함유된 pH7.0의 LC⁺플레이트에 플레이팅하였다. 형질전환체의 플라스미드 DNA를 단리(Birnboim)하고 제한효소 분석에 의해 특성을 확인하였다. 이 방법으로 pBHA1 MXL을 단리하였다(제8도 참조).

2. 유용한 올리고 뉴클레오티드 세트를 사용하여 프로테아제 유전자에 서열 돌연변이를 도입하기위해서는 프로테아제 유전자에 비해 F1 기원의 배향을 역전시키는 것이 필요하다. 이것은 다음과 같은 방법으로 수행된다: 플라스미드 pBHA1-MXL을 Bam HI으로 소화시키고 재연결시켰다. 연결혼합물을 대장균 WK6 (Maniatis, 상기 참조)에 형질전환시키고, 트립톤 10g/ℓ, 효모추출물(Difco) 5g/ℓ, NaCl 8g/ℓ, 티민 25㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 1g/ℓ, 앰피실린 100μg/㎖ 및 네오마이신 20μg/㎖가 함유된 LC⁺플레이트에서 네오마이신이나 앰피실린 내성체를 선별하였다. 형질전환체의 플라스미드 DNA를 단리(Birnboim, 상기 참조)하고 제한효소 분석에 의해 특성을 확인하였다. 이 방법으로 pBHAR-MXL을 단리하였으며, 이 것을 대장균 서열의 배향이 역전되었다는 점에서 pBHA-MXL과는 다르다(제9도 참조).

3. 플라스미드 pBHAR-MXL에 있어서 추가 플랭킹 서열을 도입하기 위해서는 다음과 같이 소화가 이루어졌다. 플라스미드 pM58을 Sph I과 Hind III로 소화시켰다. 플라스미드 pBHAR-MXL을 Sph I과 Hind III로 소화시켰다. 플라스미드 pBHAR-MXL(제10도)을 SphI과 Hind III로 소화시켰다. 큰 단편을 정제시켰다. 양자의 소화물을 연결하여 바실루스 섭틸리스 DB 104에 형질전환시키고, 네오마이신 10μg/㎖와 카세인 0.4%가 함유된 최소 플레이트에서 네오마이신 내성과 프로테아제 활성을 선별하였다. 제한효소분석에 의해 형질전환체를 특성을 확인하였다. 이들중의 한가지 pBHARB-MXL(제10도)을 추가의 실험을 위해 사용하였다.

c. 플라스미드 pBHARB-MXL에서 pB92 유전자의 돌연변이유발

쌍성 벡터 체계 pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL을 사용하여 돌연변이 유발을 수행하였다(Stanssens, 상기 참조). 틈이 생긴 이중체(gapped-duplex) 접근방법(Kramer 등, NuCl. Acids. Res. 12 (1984)9441)에 근거한 방법과 플라스미드(파아지/플라스미드 혼성체)를 사용하였다. 기본적으로 이 방법은, 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자에 앰버(amber) 돌연변이를 운반하는 주형 스트랜드(+스트랜드)와, 야생형 항생물질 내성마커가 함유된 틈이 생긴(gapped) 스트랜드(-스트랜드)로 구성되는 틈이 있는 이중체 DNA 중간체에 의존한다. 어니일링한후, 돌연변이원 올리고뉴클레오티드는 시험관에서 틈-충전(filling) 및 밀봉반응 동안에 틈이 있는 스트랜드에 혼입된다. 형성된 분자는 의도된 돌연변이와 항생물질 내성마커와의 사이의 연결이 유지되는 미스매치수복 결함(Mut S) 숙주를 형질전환하기 위해 사용된다. 그다음에 이 균주로부터 단리된 혼합된 플라스미드 집합체는 억제 유전자 음성 숙주 균주에서 분리될수 있도록 한다. 형질전환체를 항생물질 함유 배지에 플레이팅함으로써, 틈이 있는 스트랜드로부터 유래된 자세포를 선별한다.

pMa형 벡터에 있어서, 뉴클레오티드 3409는 G에서 A로 변화되었고, 반면에 pMc형 벡터에 있어서 뉴클레오티드 2238은 G에서 C로 변화되어 클로람페니콜-아세틸 전이효소 유전자와 β-락타마제 유전자 각각에 있어서 앰버 정지코돈을 생성시켜서 상기 유전자를 비활성시킨다.

돌연변이를 유발시키기 위해, 표적 DNA 단편을 pMa5-8 또는 이것의 유도체의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. 그다음에는 표적 DNA와 pMc 5-8을 함유하는 pMa5-8 사이의 틈이 있는 이중체를 구성하였다.

표적 DNA로 구성되는 단일 스트랜드 틈을 뉴클레오티드 화학적 또는 효소적으로 잘못 혼입하여 잘못 혼입된 뉴클레오티드의 수준이 낮은 긴 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여, 돌연변이원 올리고 뉴클레오티드와 함께 돌연변이를 유발시켰다. 상세한 기재는 Ausubel등 (1987, Current protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons Inc. New York); 또는 B. Perbal(1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd ed. John Wiley Sons Inc; New York)을 참고하라.

d. 프로테아제의 공업적 생산을 위한 벡터 구성

원하는 돌연변이를 플라스미드 pBHARB-MXL에 도입한후, 플라스미드로부터 원하지 않는 대장균 서열을 다음과 같이 결실시켰다: 관련 돌연변이를 포함하는 플라스미드 pBHARB-MXL을 Bam HI으로 소화시키고 희석된 조건하에서 재연결시켰다. 연결 혼합물을 바실루스 DB104로 형질전환시키고, 네오마이신 20μg/㎖와 카세인 0.4%가 함유된 최소플레이트에서 네오마이신 내성과 프로테아제 활성에 대하여 선별하였다. 형질전환체의 DNA를 단리하고 제한효소 분석에 의해 특성확인하였다. 이러한 방법으로 대장균의 DNA가 결여되고 단백질의 상업적 생산에 알맞은 벡터가 단리되었다.

전술한 방법은 제11도에 설명되었으며, 여기에서는 예로써 M216Q 돌연변이가 주어지며 플라스미드 pBHB-MXL M216Q가 결과적으로 생산된다. M216Q, 그리고 이하 언급되는 M216S, S160D 및 N212D는 EP-A-0328229호에 개시된 바실루스 PB92 돌연변이 프로테아제이다.

[실시예 4]

[플라스미드 pBHB-MXL 유도체에 의한 바실루스 PBT 125의 원형질체 형질전환]

바실루스 균주 PBT 125를 플라스미드 pBHB-MXL, 또는 돌연변이 프로테아제 유전자가 함유된 이것의 유도체를 사용하여 EP-A-0284124호에 개시된 형질전환 방법에 따라 형질전환하였다. 생산물을 조사하기에 앞서, 제한효소 분석에 의해 형질전환체에 관련 플라스미드가 함유되어 있는가를 검사하였다.

[실시예 5]

[프로테아제 통합 벡터의 구성]

a. 통합 벡터 pEN₃Q

플라스미드 pE1 94neo-1(EP-A-0284126)을 SalI으로 소화시켜 다시 연결하였다. 연결혼합물을 바실루스 서브틸리스 DB104에 형질전환시키고 20μg/㎖ 네오마이신 함유 최소 플레이트상에서 네오마이신 내성체에 대하여 선별하였다. 플라스미드 pE194neo-3을 분리하여 역 배향(제12도 참조)의 네오마이신 내성 유전자의 존재에 대하여 조사하였다. 플라스미드 pE194 neo-3을 Hpal 과 Bgl II로 소화하였다. 온도에 민감한 복제 기원을 함유하고 있는 단편을 정제하였다(Maniatis, 상기 동일).

플라스미드 pBHB-MXL M216Q(실시예3 및 제11도 참조)를 BglII와 BalI으로 소화하였다. 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 단편을 정제하였다. 양자의 단편을 연결하여 그 연결 혼합물을 바실루스 서브틸리스 DB104에 형질전환시키고 상술한 바와같이 프로테아제 활성 및 네오마이신 내성에 대하여 선별하였다. 형질전환체를 제한효소 소화에 의해 특성확인하였다. 형질전환체중 플라스미드 pEN₃Q를 함유하고 있는 하나를 선별하였다(제13도). 이 플라스미드는 네오마이신 내성유전자, 플라스미드 pE194neo-3으로 부터의 온도민감 복제기원 및 PB92 프로테아제 유전자의 M216Q 돌연변이를 함유하였다.

b. 통합벡터 pEN₃S

통합벡터 pEN₃Q에 대해 상술된 것과 동일한 방식으로, 출발 벡터로서 pBHARB-MXL M216S를 사용하여 pEN₃S를 구성하였다.

[실시예 6]

[바실루스 균주 PEP111 및 PEP112의 구성]

a. 플라스미드 pEN₃Q에 의한 바실루스 PBT110의 원형질체 형질전환

바실루스 균주 PBT110을 EP-A-0284126에 기재된 바와같이 플라스미드 pEN₃Q 로 형질전환 시켰다. 통합 실험에 앞서 제한효소 분석에 의하여 형질전환체가 관련 플라스미드를 함유하였는지의 여부를 조사하였다.

b. 바실루스 PBT110 염색체로의 pEN₃Q의 통합

바실루스 균주 PBT110 염색체에서 플라스미드 pEN₃Q을 이용한 통합 실험을 EP-A-0284126에 기재되어 있는 바와같이 수행하였다. 통합체에 대한 선택은 플라스미드 복제에 대한 비-허용 온도(50℃)에서 네오마이신 농도가 1μg/㎖일때 수행하였다. 염색체중에 pEN₃Q의 통합을 조사하기 위하여 잠재적인 통합체의 염색체 DNA를 분리하여 Hind III 또는 ClaI으로 소화시켜 0.8% DNA아가로스 겔상에서 전개시키고 니트로셀룰로스에 블롯팅한후(Southern, J. Mol. Biol. 98(1975) 503-517)³²p표지 니크(nick)-번역된 pEN₃Q DNA와 혼성화하였다(Maniatis, 1982).

pEN₃Q의 통합은 염색체상에 나란히 위치해있는 2개의 프로테아제 유전자(하나는 야생형이고 다른 하나는 돌연변이 M216Q)를 가지고 있는 균주(PBT110M/Q)를 유발하는 상동 재조합에 의하여 일어났음을 알 수 있다. 그러므로, pEN₃Q의 통합을 제14도에 도시된 바와같은(또한 EP-A-0284126 참조) 소위 캠벌형 메카니즘에 의해 일어났다.

c. 네오마이신 민감 재조합체의 선별

염색체중에 야생형 또는 돌연변이 프로테아제 유전자중 하나를 함유하고 있는 네오마이신 민감 재조합체(이하 탈재조합체(outrecombinant)라 칭함)을 선택하였다. 선택과정은 실시예 2℃에서 전술한 과정과 동일하다.

균주 PBT 110 M/Q를 출발 균주로 사용하였다. 균주 PBT110 M/Q를 PBT 최소 배지에서 인큐베이션한후, 그 배양액을 0.4% 카제인과 15g/ℓ의 아가를 함유하고 있는 PBT 최소배지 플레이트위에 플레이트하였다. 이들 플레이트를 48시간동안 37℃에서 인큐베이션하고 그 레플리카(replica)를 각각 1μg/㎖ 네오마이신을 함유하고 있는 하트 인퓨전(HI)플레이트와 네오마이신을 함유하지 않은 HI 플레이트에 놓았다. 네오마이신 민감 콜로니를 탈재조합체로서 간주하였다.

d. 네오마이신 민감 재조합체의 특성확인

잠재적인 탈재조합체의 염색체 DNA를 ClaI 또는 HindIII로 소화하여 0.5% 아가로스 겔상에서 전개한 후 니트로셀룰로스에 블롯팅시킨 다음(Southern, 1975)³²p-표지 니크 번역된 pEN₃Q와 혼성화시켰다(Maniatis, 1982). 돌연변이 M216Q가 ClaI부위의 제거를 초래하기 때문에, 야생형 프로테아제 또는 돌연변이 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 균주와, 중간체 균주 PBT110 M/Q는 쉽게 구별될수 있다(제14도 참조).

pB92의 M216Q 돌연변이 프로테아제 유전자를 함유하는 탈재조합체를 분리하였다. PB92 돌연변이 프로테아제에 대하여 PB92 야생형 프로테아제의 유전자 치환이 일어났음을 보여진 후, 균주의 생성물을 EP-A-0328229에 기재된 바와같이, 그의 생화학적 변수(Kcat, Km), 내산성, 특이적 활성 및 세척능력으로 특성을 확인하였다. 모든 결과는 대조표준 프로테아제 M216Q와 동일하였고, 이것은 형질전환된 균주의 생성물이 실제로 돌연변이 M216Q를 함유하는 PB92 프로테아제였음을 의미한다. 이 형질전환된 균주를 바실루스 PEP111이라 칭한다.

유사한 실험을 벡터 pEN₃S를 사용하여 수행하여 돌연변이 M216S를 가지는 pB92 프로테아제 함유하는 바실루스 균주 PEP112를 구성하였다.

[실시예 7]

[바실루스 균주 PEP211과 PEP212의 구성]

바실루스 균주 PEP111을 EP-A-0284126에 기재된 과정을 따라 플라스미드 pEN₃Q로 형질전환시켰다. 통합과정전에 제한효소분석에 의하여 형질전환체가 관련 플라스미드를 함유하였는지를 조사하였다. 통합 과정과 통합체에 대한 선별(플라스미드 복제를 허용하지 않는 온도(50℃)에서 20μg/㎖의 네오마이신 농도에서)은 EP-A-0284126에 기재된 바와같이 수행하였다.

염색체에서 플라스미드 pEN₃Q의 통합을 조사하기 위하여 잠재적 통합체의 염색체DNA를 분리하여 Hind III로 소화시킨 후, 0.8% 아가로스 겔상에서 전개한 다음, 니트로셀룰로스에 블롯팅시키고(Southern et al., 1979)³²P 표지 니크-번역된 pEN₃Q와 혼성화시켰다. 균주가 별도로 염색체상에 위치하고 있는 2개의 돌연변이(M216Q) PB92 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 것으로 나타났고, 이 균주를 분리하였다. 이 균주를 PEP211이라 칭한다. 이것의 염색체 구성은 제15도에 도시되어 있다.

돌연변이 M216S를 가지고 있는 2개의 프로테아제 유전자 함유하는 유사 균주를 얻기 위하여, 야생형 유전자의 유전자 치환후에 돌연변이 유전자(M216S)를 함유하고 있는 균주 PEP112를 플라스미드 pEN₃S로 형질전환시켰다. 상술된 바와 같은 과정이 뒤따랐다. 이들 실험은 염색체상에 별도로 위치해 있는 2개의 PB92 돌연변이 M216S 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 균주 PEP212를 초래하였다.

[실시예 8]

[돌연변이 프로테아제의 생산]

돌연변이된 프로테아제 코드화하는 유전자가 플라스미드상에 또는 염색체상에 위치한 그러한 형질전환된 바실루스 균주를 사용하여 프로테아제 돌연변이체의 생산을 수행하였다.

플라스미드 코드화된 제조를 위해서는 2종류의 균주, 본원 기재의 호알칼리성 균주 바실루스 PBT 125와, 바실루스 서브틸리스 DB104(Kawamura et al., J. Bacteriol. (1984) 160, 442-444)로부터 유도된 무포자성 균주인 바실루스 서브틸리스 균주 DS12367을 사용하였다. 이들 균주를 pBHB-MXL 유래된 플라스미드로 형질전환시켰다. 프로테아제 코드화하는 플라스미드를 갖지 않는 바실루스 PBT125와 바실루스 서브틸리스 DS12367을 대조 균주로서 사용하였다.

염색체상으로 통합된 프로테아제 돌연변이 유전자를 함유하는 균주를 이용한 제조를 위해서는 본원 기재의 바실루스 PEP 균주를 사용하였다. 야생형 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 바실루스 PBT 균주 108과 110을 대조 균주로서 사용하였다. PBT108은 염색체상에 별도로 위치한 2개의 야생형 유전자를 함유하고 있는 균주이고(EP-A-0284126 참조), PBP110에 대해서는 실시예 2a에 언급되어 있다.

바실루스 서브틸리스에서 PB92 프로테아제 유전자의 원래의 프로모터의 활성을 체크하기 위하여, Hpa II 프로모터(Zyprian et al., DNA 5 (1986) 219-225)에 대해 프로테아제 유전자의 배향이 역으로 되어 있어서, 프로테아제 유전자의 발현이 단지 그의 원래의 프로모터에 의해서만 지시되는 구성물, pBHB-MXLR을 만들었다.

생산은 100㎖의 프로테아제 생산 배지를 포함하고 있는 500㎖ 진동 플라스크에서 수행하였다.

호알칼리성 바실루스 균주를 사용한 경우 배양액을 접종한 후에 미국 특허 No. Re.g 30,602 에 기재된 바와같이 40시간동안 37℃ 하에서 제조배지에서 배양하였다. 플라스미드 함유 균주의 경우 네오마이신(20μg/㎖)을 첨가하였다.

바실루스 서브틸리스 DS12367 균주를 사용한 경우, 비교할만한 배지 즉, 12.5g/ℓ의 효모 추출물(Difco), 0.97g/ℓ의 CaCl₂·6H₂O, 2.25g/ℓ의 MgCl₂·6H₂O, 20g/ℓ의 MnSO₄·4H₂O, 1㎎/ℓ의 CoCl₂·6H₂O, 0.5g/ℓ의 시트르산염, 0.5㎖의 안티포옴 5693, 6% w/w의 말토오스, 0.2M 인산염 완충액 pH6.8을 함유하는 배지를 사용하였다. 플라스미드 함유 균주의 경우 네오마이신(20μg/㎖)을 첨가하였다.

바실루스 서브틸리스 균주를 함유하는 배양액을 65시간동안 37℃에서 배양하였다. 모든 경우에 진동-플라스크를 24시간동안 37℃에서 배양해놓은 관련 균주를 함유하고 20μg/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 트립틱 소야 브로스 배양액 0.1㎖로 접종하였다.

프로테아제 활성은 린등에 의해 기재된 바와같이 (Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793)기질로서 디메틸카제인을 사용하여 측정하였다. 프로테아제 돌연변이체의 특이적 활성(EP-A-0328229)을 ㎎기준으로의 생산을 측정하기 위하여 사용하였다.

발효 실험의 결과를 다음 표1에 요약한다.

본 명세서에서 언급한 모든 공보(특허출원 포함)는 본발명의 속하는 기술분야에서 숙련된 사람들의 숙련 정도를 나타낸다. 모든 공보는 각각의 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참고로서 삽입되는 것임을 나타내는 것과 동인한 정도로 본원에 참고로 삽입된다.

전술하는 발명을 이해를 분명히 할 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 어느정도 상세히 기재하였지만, 많은 수정 및 변형이 첨부된 특허청구의 범위의 범주 또는 사상을 벗어남이 없이 본 발명에 대해 이루어질수 있음이 당해 기술분야에 통상적인 지식을 가지고 있는 사람들에게 명백할 것이다.

Claims

야생형 프로테아제와 적어도 하나의 아미노산이 다른 프로테아제의 제조방법으로서, 상기 방법은 발현 숙주로서 동종성의 친알칼리성 바실루스 균주를 사용하는 것을 포함하고, 상기 균주는, 돌연변이 고알칼리성 프로테아제 유전자의 적어도 하나의 복사체로 야생형 고알칼리성 프로테아제 유전자를 치환함에 의해 상기 바실루스 균주로부터 야생형 고알칼리성 프로테아제 유전자가 결실되게 하거나, 또는 염색체에 남겨진 서열이 너무 짧아서 프로테아제 유전자를 코드화하는 플라스미드와 상동 재조합을 할 수 없는 방식으로 상기 바실루스 균주로부터 야생형 고알칼리성 프로테아제 유전자가 결실되게 함에 의하여, 야생형 프로테아제를 생산할 수 없고, 돌연변이 고알칼리성 프로테아제 유전자의 적어도 하나의 복사체가 게놈으로 삽입되거나 또는 플라스미드에 코드화되어 있는 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 발현숙주로서 프로테아제 음성 친알칼리성 바실루스 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 발현숙주로서 바실루스 노보 종 PB92의 프로테아제 음성 유도체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법이 있다.
제1항에 있어서, 발현숙주로서 무포자성 친알칼리성 바실루스 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 발현숙주로서 상동 또는 변칙적인 재조합에 의해 야생형 프로테아제 유전자가 결실된 무포자성 바실루스를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 야생형 고알칼리성 프로테아제가 필수적으로 바실루스 노보 종 PB92 프로테아제의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
야생형 프로테아제와 적어도 하나의 아미노산이 다른 프로테아제를 생산할 수 있는 친알칼리성 바실루스 균주를 얻는 방법으로서, 돌안변이 고알칼리성 프로테아제 유전자의 적어도 하나의 복사체로 야생형 고알칼리성 프로테아제 유전자를 치환함에 의해 상기 바실러스 균주로부터 야생형 고알카리성 프로테아제 유전자가 결실되게 하거나, 또는 염색체에 남겨진 서열이 너무 짧아서 프로테아제 유전자를 코드화하는 플라스미드와 상동 재조합을 할 수 없는 방식으로 상기 바실루스 균주로부터 야생형 고알칼리 프로테아제 유전자가 결실되게 함에 의하여, 돌연변이 고알칼리성 프로테아제 유전자의 적어도 하나의 복사체가 게놈으로 삽입되거나 또는 플라스미드에 코드화되어 있는 상기 균주를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 친알칼리성 바실루스 균주가 바실루스 노보 종 PB92 이거나 이것의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.