DE69013520T2

DE69013520T2 - Stabile integration von dna in bakterielle genome.

Info

Publication number: DE69013520T2
Application number: DE69013520T
Authority: DE
Inventors: Borge Diderichsen; Per Jorgensen; Steen Jorgensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1989-12-18
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2010-12-19
Also published as: EP0506780B1; FI922812A0; WO1991009129A1; EP0506780B2; DE69013520T3; JP3162707B2; FI922812A; DK639689D0; CA2070676A1; JPH05502162A; DK0506780T3; ATE113077T1; AU643741B2; AU7031291A; DK0506780T4; NO922381D0; ES2064077T5; ES2064077T3; NO922381L; DE69013520D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine bakterielle Zelle, die ein DNA-Konstrukt integriert in ihr Genom umfaßt, einen Plasmidvektor, der das DNA-Konstrukt umfaßt, und Verfahren zur Integration des DNA-Konstrukts in bakterielle Genome.

Hintergrund der Erfindung

Wenn zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids durch rekombinante DNA-Verfahren bakterielle Zellen mit einem rekombinanten Plasmidvektor transformiert werden, der inserierte genetische Information trägt, die für das Polypeptid codiert, dann ist oftmals beobachtet worden, daß derartige Plasmide instabil werden, obwohl sie möglicherweise als solche stabil in der Zelle vererbt werden. Diese Instabilität kann entweder die Form einer instabilen Aufrechterhaltung des Plasmids in den Zellen, so daß das Plasmid schließlich aus der Zellpopulation verlorengeht, oder eine Form, bei der die für das fragliche Protein codierende DNA aus dem Plasmid deletiert wird, annehmen. Ein herkömmlicher Weg, um das erstgenannte Problem zu lösen, bestand darin, die transformierten Zellen unter Selektionsdruck zu züchten, d. h. typischerweise in Gegenwart eines Antibiotikums, gegenüber dem die fraglichen Zellen aufgrund des Vorhandenseins eines Gens, das für ein Produkt codiert, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum verleiht, auf dem durch Transformation in die Zellen eingeführten Plasmid resistent gemacht worden sind. Dieser Ansatz ist jedoch weder wirtschaftlich durchführbar bei einer Produktion im großen Maßstab aufgrund der hohen Kosten für die fraglichen Antibiotika, noch ist er aus Umweltschutzgründen wünschenswert. Die Verwendung von Antibiotika in Kulturmedium macht es auch schwieriger, eine Zulassung von den Gesundheitsbehörden oder dergl. für das Produkt zu erhalten.
Es ist bereits vorgeschlagen worden, Plasmide durch Insertion einer DNA-Sequenz, die für eine Verteilungsfunktion codiert, die eine gleichmäßige Verteilung der Plasmide an die Nachkommenzellen bei der Zellteilung sicherstellt, zu stabilisierer. Ein alternatives Verfahren, um eine stabile Vererbung der clonierten DNA-Sequenzen zu erzielen, besteht darin, für eine Integration derartiger DNA-Sequenzen in das Genom des Wirtsbakteriums zu sorgen. Die Integration von DNA-Sequenzen, die auf Plasmidvektoren vorhanden sind, kann durch ein sog. "Crossing-over" erfolgen, wie es z. B. von A. Campbell, Advances Genet., Bd. 11 (1962), S. 101-145 beschrieben wird. Gemäß diesem Verfahren wird der Plasmidvektor mit einer DNA-Sequenz versehen, die homolog zu einer Region des bakteriellen Genoms ist, oder alternativ mit zwei homologen Sequenzen, die auf beiden Seiten der heterologen DNA-Sequenz die integriert werden soll, angeordnet sind. In einem nachfolgenden Rekombinationsereignis werden die homologe Sequenz und die benachbarten Sequenzen auf dem Vektor in das Wirtsgenom im Bereich der Homologie integriert. Als ein Beispiel beschreiben Kallio et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 27 (l987), S. 64-71 die Integration eines α-Amylasegens in das Genom von Bacillus subtilis unter Anwendung dieser Technik.
In einigen Fällen wurde jedoch festgestellt, daß die integrierten DNA-Sequenzen bei Fehlen eires Selektionsdrucks aus den Zellen deletiert werden, z. B. durch ein homologes Rekombinationsereignis ähnlicher Art wie das, das für die Integration der DNA verantwortlich war. Insbesondere ist bisher beobachtet worden, daß die Rekombination zwischen homologen DNA-Sequenzen durch die Nähe replikativer DNA, die in oder nahe der in das Wirtszellgenom integrierten DNA vorhanden ist, stimuliert wird; vgl. Ph. Noirot et al., J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 39-48; und M. Young und S.D. Ehrlich, J. Bacteriol., Bd. 171/5 (Mai 1989), S. 2653-2656.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, für eine stabile Integration von DNA-Sequenzen in genomische DNA, z. B. das Chromosom, von bakteriellen Wirtszellen zu sorgen.

Zusammenfassende Darstellung der Erfinduug

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Befund, daß eine stabile Integration von DNA-Sequenzen in das Genom von Wirtsbakterien erzielt werden kann, indem das Vorhandensein eines funktionellen Plasmidreplikationssystems in der integrierten DNA vermieden wird.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt eine bakterielle Zelle, die in ihrem Genom ein integriertes nicht-replikatives DNA-Konstrukt trägt, das (1) eine DNA-Sequenz von Interesse, (2) eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, und (3) einen Replikationsursprung umfaßt, wobei aus dem DNA-Konstrukt ein Gen deletiert worden ist, das für einen Faktor codiert, der erforderlich ist, um die Replikation von dem Replikationsursprung zu initiieren, oder wobei das Gen, das für den Replikationsfaktor codiert, modifiziert worden ist, so daß es für einen inaktiven Replikationsfaktor codiert.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "nicht-replikatives DNA-Konstrukt" eine DNA-Sequenz bedeuten, die zur autonomen Replikation nicht imstande ist und die daher zusammen mit dem Wirtszellgenom repliziert wird. Das Genom umfaßt das Chromosom und stabil vererbte extrachromosomale Elemente. Der Ausdruck "DNA-Sequenz von Interesse" wird verwendet, um eine Sequenz zu bezeichnen, die für ein gewünschtes RNA- oder Proteinprodukt (heterolog oder nativ für die Wirtszelle) codiert oder die als solche der Wirtszelle eine gewünschte Eigenschaft verleiht, z. B. einen mutierten Phänotyp, wie es nachstehend beschrieben ist.
Bei der homologen DNA-Sequenz kann es sich typischerweise um eine Sequenz handeln, die aus dem Genom der Wirtszelle abgeleitet ist, und sie kann homolog zu einer Region des Genoms sein, die nicht essentiell für das Überleben oder die richtige Funktion der Wirtszelle ist. Andererseits kann die homologe DNA-Sequenz auch so gewählt sein, daß die Integration des DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination zu einer Zelle führt, die einen mutierten Phänotyp exprimiert (der dann als Marker für die Selektion von Zellen, in die das DNA-Konstrukt integriert worden ist), z. B. wenn das DNA-Konstrukt innerhalb einer Transkriptionseinheit integriert wird und diese unterbricht, so daß ein oder mehrere Gene, die in der Transkriptionseinheit enthalten sind, dann nicht mehr exprimiert werden. Bei der homologen DNA-Sequen kann es sich alternativ um eine Sequenz handeln, die nicht nativ für das Wirtsgenom ist, sondern die aus einem anderen Organismus cloniert oder die synthetisiert worden ist und anschließend in das Wirtsgenom nach einem beliebigen geeigneten Verfahren, z.B. durch Crossing-over, vom der Integration des DNA-Konstrukts eingeführt worden ist. Bei der homologen DNA-Sequenz kann es sich um eine Sequenz handeln, die die DNA-Sequenz von Interesse umfaßt oder im wesentlichen daraus besteht, ob es sich nun um eine native oder fremde DNA-Sequenz für die fragliche Wirtszelle handelt (nativ für die Zelle z. B. in Zellen, in denen es gewünscht ist, die Kopienzahl der DNA-Sequenz von Interesse in der Zelle zu erhöhen, siehe nachstehend). Es ist darauf hinzuweisen, daß im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck "homolog" als eine Sequenzidentität von mindestens 9 aufeinanderfolgenden Basenpaaren definiert werden kann.
Obwohl erfindungsgemäß eine stabile Integration von DNA in bakterielle Genome für Plasmide mit einer besonderen Art von Replikationssystem (die sog. "rolling circle"-Replikation, siehe nachstehend) gezeigt worden ist, wird gegenwärtig erwarte, daß beliebige Plasmide, bei denen die Replikation nach einem Mechanismus erfolgt, bei dem ein oder mehrere in trans wirkende Faktoren (d. h. RNA- oder Proteinfaktoren) erforderlich sind, um die Replikation von in cis wirkenden Sequenzen auf dem Plasmid zu initiieren (derartige in cis wirkende DNA-Sequenzen werden zusammenfassend als Replikationsursprung bezeichnet), sich für den vorliegenden Zweck eignen. Faktoren, die für die Plasmidreplikation erforderlich sind, werden nachstehend als Replikationsfaktoren bezeichnet. Wenn dem DNA-Konstrukt ein funktionelles Gen fehlt, das für einen Replikationsfaktor codiert, der für den Replikationsursprung, der in dem DNA-Konstrukt enthalten ist, erforderlich ist, dann wird kein aktiver Replikationsfaktor gebildet, und dementsprechend wird keine Replikation von dem Ursprung initiiert.
Um eine erfindungsgemäße bakterielle Zelle zu erhalten, die ein DNA- Konstrukt umfaßt, dem ein funktionelles Gen fehlt, das für einen erforderlichen Replikationsfaktor codiert, kann man entweder das gesamte Gen deletieren oder es in einer solchen Weise modifizieren, daß es für einen inaktiven Replikationsfaktor codiert. Eine derartige Modifikation des Gens kann auf eine als solche bekannte Weise durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide der DNA-Sequenz des Gens oder durch ähnliche Modifikationen der transkriptionalen oder translationalen Start- oder Stoppsignale erfolgen.
Das vorstehend dargelegte Replikationssystem kann bei einem Verfahren zur Konstruktion einer erfindungsgemäßen bakteriellen Zelle genutzt werden. Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird ein Plasmidvektor, der für die vorliegenden Zwecke als Elternvektor bezeichnet wird, zunächst konstruiert. Der Elternvektor umfaßt einen ersten Replikationsursprung und einen zweiten Replikationsursprung in der gleichen Orientierung wie der erste Replikationsursprung, wobei der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind, um ihre Funktion mit dem/den gleichen Replikationsfaktoren(en) zu erfüllen, wobei der erste und der zweite Replikationsursprung den Vektor in zwei Teile teilen, und zwar (i) einen ersten Teil, der den ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten und dem zweiten Replikationsursprung erforderlichen Replikationsfaktor(en) codieren, umfaßt, und (ii) einen zweiten Teil, der den zweiten Replikationsursprung, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des Vektors vorgesehenen Zelle ist, umfaßt. Es ist darauf hinzuweisen, daß im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck "Plasmid" auch einen Bakteriophagen oder ein anderes DNA-Molekül bezeichnen soll, das imstande ist, als ein autonom replizierendes extrachromosomales Element zu funktionieren.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann dieser Elternvektor dann in bakterielle Zellen transformiert werden, und die transformierten Zellen werden unter selektiven Bedingungen kultiviert, wobei die Replikation des Elternplasmidvektors zur Bildung eines ersten Nachkommenvektors, der den ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten und dem zweiten Replikationsursprung erforderlichen Replikationsfaktor(en) codieren, umfaßt, und eines zweiten Nachkommenvektors führt, der den zweiten Replikationsursprung umfaßt, dem jedoch ein funktionelles Gen, das für einen Replikationsfaktor codiert, fehlt, und der außerdem eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt, wobei ein fortgesetztes Kultivieren der transformierten Zellen unter selektiven Bedingungen zur Integration des zweiten Nachkommenvektors in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination und zum Verlust des ersten Nachkommenvektors sowie des Elternvektors aus den Zellen führt.
Die Bildung von zwei Nachkommenvektormolekülen aus dem Elternvektor kann nach verschiedenen Mechanismen stattfinden; entweder als Ergebnis der Art der Replikation des Plasmids, z. B. der "rolling circle"-Replikation von einzelsträngigen DNA-Plasmiden (siehe nachstehend), oder als ein Ergebnis einer homologen Rekombination zwischen den DNA-Regionen, die die beiden Replikationsursprünge die auf dem Plasmidvektor vorhanden sind, einschließen und/oder zu ihnen benachbart sind.
Wenn der zweite Ursprung sich in der gleichen Orientierung auf dem Elternplasmid wie der erste Ursprung befindet, dann sind die verschiedenen DNA-Sequenzen, die in das bakterielle Genom integriert werden sollen und die sich stromabwärts von dem zweiten Ursprung, jedoch stromaufwärts von dem ersten Ursprung befinden (d. h. die DNA-Sequenz von Interesse und die DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist), auf dem zweiten Nachkommenvektor nach der Plasmidreplikation vorhanden. Ein fortgesetztes Kultivieren der transformierten Zellen kann spontan zu einer Integration des zweiten Nachkommenvektors in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination und Verlust des ersten Nachkommenvektors aus den Zellen mit einer bestimmten Häufigkeit führen.
Um die Selektion von Zellen, bei denen der zweite Nachkommenvektor in das Genom integriert worden ist, zu erleichtern, wird dieser Vektor vorzugsweise mit einem selektierbaren Marker versehen. In diesem Fall können die Zellen unter selektiven Bedingungen kultiviert werden, d. h., daß nur Zellen, in denen der selektierbare Marker erhalten wird, überleben. Bei dem selektierbaren Marker kann es sich um ein Gen handeln, das für ein Produkt codiert, das den Zellen eine Antibiotikaresistenz verleiht, oder das einem auxotrophen Stamm eine Prototrophie verleiht (z. B. dal-Gene, die in einen dal&supmin;-Stamm eingeführt werden; vgl. B. Diderichsen in Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A.T. Ganesan und J.A. Hoch (Hrsg.), Academic Press, 1986, S. 35-46). Unter diesen Bedingungen überlebende Zellen sind entweder Zellen, die den Elternplasmidvektor enthalten, oder Zellen, die beide bei der Replikation des Elternvektor gebildeten Nachkommenvektoren in einer Zelle enthalten, oder Zellen, bei denen der zweite Nachkommenvektor, der das DNA-Konstrukt umfaßt, integriert worden ist. Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß der Elternvektor und der erste Nachkommenvektor schließlich verlorengehen, während der zweite Nachkommenvektor, der das DNA-Konstrukt umfaßt, spontan in das Wirtsgenom mit großer Häufigkeit integriert wird.
Wenn es erwünscht ist, den Wirkungsgrad, mit dem die Integration des DNA-Konstrukts stattfindet, zu erhöhen, dann kann man als Elternvektor ein Plasmid verwenden, das zur Replikation unter bestimmten (permissiven) Bedingungen imstande ist und das zur Replikation unter anderen (nicht- permissiven) Bedingungen nicht imstande ist. Bei dem Plasmid kann es sich z. B. um ein Plasmid handeln, das im Hinblick auf die Replikation temperaturempfindlich ist. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Elternvektor also um einen Vektor, der zur Replikation bei erhöhten Temperaturen, die ein Wachstum der Wirtszellen erlauben, nicht imstande ist. Die bakteriellen Zellen werden zunächst bei einer Temperatur kultiviert, die eine Plasmidreplikation und die Bildung der beiden Nachkommenvektoren erlaubt, und anschließend, nach der Integration des zweiten Nachkommenvektors in das bakterielle Genom, werden sie bei einer Temperatur kultiviert, die eine Plasmidreplikation nicht erlaubt, so daß der erste Nachkommenvektor sowie der Elternvektor aus den Zellen verlorengehen. Die Kultivierung bei der nicht-permissiven Temperatur wird unter selektiven Bedingungen durchgeführt, um sicherzustellen, daß nur Zellen, die das integrierte DNA-Konstrukt enthalten, das einen geeigneten selektiven Marker umfaßt, überleben. Ein anderer Weg, um den Wirkungsgrad bei der Integration und dem anschließenden Verlust des ersten Nachkommenvektors aus den Zellen zu erhöhen, besteht in einer Behandlung der mit dem Elternvektor transformierten Zellen mit einem Plasmidhärtungsmittel ("plasmid-curing agent"), z. B. Novobiocin (I. Gadó et al., Zbl. Bakt. Hyg. A., Bd. 265 (1987), S. 136-145) nach Kultivieren der Wirtszellen unter selektiven Bedingungen, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Es ist möglich, Replikationsursprünge von zwei verschiedenen Plasmiden auf dem gleichen Elternvektor einzusetzen, sofern diese ausreichend ähnlich zueinander sind, so daß sie ihre Funktion mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) erfüllen, der/die imstande sein sollte(n), die Replikation sowohl vom ersten als auch vom zweiten Replikationsursprung zu initiieren. Alternativ sollte der Plasmidvektor homologe Regionen enthalten, um zu einer homologen Rekombination imstande zu sein, wie es vorstehend beschrieben wurde. Es ist jedoch bevorzugt, daß der erste Replikationsursprung (und das Gen, das für den damit verbundenen Replikationsfaktor codiert) vom gleichen Plasmid wie der zweite Replikationsursprung abgeleitet ist, um sicherzustellen, daß der Replikationsmechanismus, auf dem die vorliegende Erfindung basiert, optimal funktioniert.
Aus praktischen Überlegungen mag es bevorzugt sein, die anfängliche Konstruktion des Plasmidvektors in einem Organismus durchzuführen, in dem eine Replikation vom ersten und zweiten Replikationsursprung nicht initiiert werden kann oder in dem die Rate der Replikation von diesen Ursprüngen sehr gering ist. Bei dem Plasmidvektor kann es sich daher um einen Shuttle-Vektor handeln, der mit einem zusätzlichen Replikationsursprung versehen ist, so daß der Vektor zur Replikation in zwei verschiedenen Organismen imstande ist. Der zusätzliche Replikationsursprung kann z. B. ein Replikationsursprung sein, der funktionell in Escherichia coli ist, wobei dieser Organismus gut beschrieben und herkömmlicherweise für rekombinante DNA-Versuche verwendet wird und daher für die Konstruktion von Plasmiden durch rekombinante DNA-Techniken geeignet ist. Der Shuttle-Vektor kann auch einen zusätzlichen selektierbaren Marker für die Selektion des Vektors in E. coli umfassen, z. B. ein Antibiotika-Resistenzgen. Der zusätzliche Replikationsursprung und der selektierbare Marker sollten dem ersten Ursprung und/oder dem/den Replikationsfaktor(en) folgen, jedoch dem zweiten Ursprung vorausgehen, so daß bei Replikation des Vektors vom ersten und zweiten Ursprung der erste Nachkommenvektor diese zusätzlichen Sequenzen trägt, der schließlich aus der bakteriellen Zelle, die mit dem Elternvektor transformiert wurde, verlorengeht.
Bei einem alternativen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen bakteriellen Zelle werden bakterielle Zellen mit (i) einem ersten DNA-Vektor, der einen ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten Replikationsursprung erforderlichen Faktor(en) codieren, umfaßt, und mit (ii) einem zweiten DNA-Vektor, der einen zweiten Replikationsursprung umfaßt, dem jedoch ein funktionelles Gen, das für einen Faktor codiert, der für die Plasmidreplikation von dem zweiten Replikationsursprung erforderlich ist, fehlt, und der außerdem eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt, transformiert, wobei der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind, um mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) ihre Funktion zu erfüllen, so daß die Replikation des zweiten DNA-Vektors vom zweiten Replikationsursprung durch den/die Replikationsfaktor(en) initiiert wird, der/die von dem/den auf dem ersten DNA-Vektor vorhandenen Gen(en) codiert wird/werden, und die erhaltenen Zellen werden unter selektiven Bedingungen kultiviert, wie es vorstehend beschrieben wurde, was zur Integration des zweiten DNA-Vektors in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination und Verlust des ersten DNA-Vektors führt.
Auch der zweite DNA-Vektor ist vorzugsweise mit einem selektierbaren Marker versehen.
Wie bei dem vorstehenden beschriebenen Verfahren, bei dem zunächst ein einzelner Plasmidvektor eingesetzt wird, kann es sich bei dem ersten DNA-Vektor um einen Vektor handeln, bei dem die Replikation von permissiven und nicht-permissiven Bedingungen für das Kultivieren der mit dem Vektor transformierten Zellen abhängt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann es sich also bei dem ersten DNA-Vektor um einen Vektor handeln, der nicht zur Replikation bei erhöhten Temperaturen imstande ist, die jedoch ein Wachstum der Wirtszellen erlauben, wobei die bakteriellen Zellen zunächst bei einer Temperatur, die eine Plasmidreplikation erlaubt, und anschließend, nach der Integration des zweiten DNA-Vektors in das bakterielle Genom, bei einer Temperatur, die eine Plasmidreplikation nicht erlaubt, so daß der erste DNA-Vektor aus den Zellen verlorengeht, unter selektiven Bedingungen kultiviert werden, so daß nur Zellen, bei denen der zweite DNA-Vektor integriert ist, imstande sind, zu überleben. Entsprechend können die transformierten Zellen mit einem Plasmidhärtungsmittel behandelt werden, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Ein Zwischenprodukt, das bei beiden vorstehend erörterten Verfahren zur Konstruktion einer Zelle, die das integrierte nicht-replikative DNA- Konstrukt enthält, gebildet wird, ist eine bakterielle Zelle, die einen ersten DNA-Vektor, der einen ersten Replikationsursprung, der mit einem oder mehreren funktionellen Gen(en), das/die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten Replikationsursprung erforderlichen Faktor(en) codiert/codieren, verbunden ist, umfaßt und einen zweiten DNA-Vektor, der einen zweiten Replikationsursprung sowie eine DNA-Sequenz von Interesse umfaßt, und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt, wobei dem zweiten Vektor ein funktionelles Gen, das für einen Replikationsfaktor codiert, der für die Replikation von dem Replikationsursprung, den der zweite Vektor trägt, erforderlich ist, fehlt.
Um einen Replikationsursprung auf dem zweiten DNA-Vektor, dem ein funktionelles Gen, das für einen Replikationsfaktor codiert, der für die Replikation von dem Ursprung erforderlich ist, fehlt, zu erhalten, ist es möglich, dieses Gen aus dem Vektor zu deletieren oder es auf die vorstehend beschriebene Weise zu modifizieren. Insbesondere bei Verwendung von zwei verschiedenen Replikationsursprüngen kann der erste DNA-Vektor auch mit einem Gen versehen werden, das für einen Replikationsfaktor codiert, der erforderlich ist, um die Replikation von dem zweiten Replikationsursprung zu initiieren. Auf diese Weise hängt die Replikation des zweiten DNA-Vektors von dem zweiten Replikationsfaktor ab, der vom ersten DNA- Vektor gebildet wird, und der zweite Vektor wird nicht replikativ, wenn der erste Vektor aus der Zelle verlorengeht. Der erste und der zweite Replikationsursprung können jedoch auch vom gleichen Plasmid stammen, wobei in diesem Fall nur ein Gen, das für einen intakten Replikationsfaktor codiert, auf dem ersten Vektoi erforderlich ist.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann die bakterielle Zelle, in die der Plasmidvektor oder der erste und der zweite DNA-Vektor transformiert werden, zwar sowohl gramnegativ als auch grampositiv sein, es handelt sich jedoch bevorzugt um eine Zelle eines grampositiven Bakteriums, da es im allgemeinen enfacher ist, eine extrazelluläre Expression von Polypeptiden aus grampositiven Organismen als aus gramnegativen Organismen zu erzielen. Bei dem Bakterium kann es sich also um einen Stamm handeln, der zur Gattung Bacillus oder Streptomyces gehört, insbesondere einen Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis oder Streptomyces lividans.
Es wird gegenwärtig angenommen, daß die vorliegende Erfindung das einzig wirksame Verfahren ist, um für die stabile homologe Integration von DNA-Sequenzen von Interesse in Genome von Bakterien zu sorgen, die nicht transformiert werden können, indem sie kompetent gemacht werden (oder bei denen zumindest natürliche Kompetenzmechanismen noch aufgezeigt werden müssen), die jedoch nach Techniken unter Einschluß z. B. der Protoplastenbildung oder der Elektroporation transformiert werden können, z. B. bestimmte Stämme von Bacillus licheniformis oder Bacillus lentus. Das vorliegende Verfahren ist daher von besonderem Interesse im Hinblick auf solche Organismen, bei denen die Transformationshäufigkeit gering ist, und zwar typischerweise 10 bis 50 Transformanten pro 1 ug DNA (im Gegensatz z. B. zur Transformation von kompetenten E. coli- oder B. subtilis- Zellen, wo die Anzahl der Transformanten typischerweise in der Größenordnung von 10&sup6; bis 10&sup8; pro 1 ug DNA liegt), was eine erfolgreiche Transformation und eine stabile Integration der DNA in diese Organismen besonders wichtig macht.
In der erfindungsgemäßen bakteriellen Zelle handelt es sich bei der DNA-Sequenz von Interesse mit Vorteil um eine Sequenz, die für ein Polypeptid von Interesse codiert, und die vorliegende Erfindung betrifft dementsprechend ferner ein verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse, das das Kultivieren einer erfindungsgemäßen bakteriellen Zelle, die eine integrierte DNA-Sequenz enthält, die für das Polypeptid codiert, unter Bedingungen, die die Bildung des Polypeptids fördern, und die Gewinnung des erhaltenen Polypeptids aus der Kultur umfaßt. Bei dem nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Polypeptid kann es sich um ein beliebiges Polypeptid handeln, das mit Vorteil in Bakterien hergestellt wird, wie ein Enzym, z. B. eine Protease, Amylase oder Lipase.
Bei einer großen Gruppe von Plasmiden aus grampositiven Bakterien erfolgt die Replikation nach dem sog. "rolling circle"-Replikationsmechanismus unter Bildung von einzelsträngiger DNA als Replikationszwischenprodukt. Die Replikation wird initiiert, wenn ein Plasmid-codiertes Protein, nämlich Rep, eine Replikationsursprungssequenz erkennt (den Plus- Ursprung) und einen Einzelstrangbruch in einem der DNA-Stränge (dem Plus- Strang) erzeugt. Der Plus-Strang wird dann verdrängt, und ein neuer Plus- Strang wird ausgehend von dem Einzelstrangbruch durch eine 3'-OH-Erweiterung polymerisiert. Wenn das Rep-Protein anschließend eine Terminationssequenz (die mit dem Plus-Ursprung überlappt) erkennt, dann erzeugt es einen zweiten Einzelstrangbruch an der gleichen Position wie der erste, um einen vollständig replizierten Strang und ein einzelsträngiges DNA-Monomeres des verdrängten Strangs, dessen Enden unter Bildung eines kreisförmigen Moleküls ligiert werden, zu erzeugen. Wirtsfaktoren stellen dann die Umwandlung des einzelsträngigen DNA-Moleküls in doppelsträngige DNA sicher (für eine ausführlichere Beschreibung dieser Art von Plasmid vgl. A. Gruss und S.D. Ehrlich, Microbiological Reviews, Bd. 53/2 (Juni 1989), S. 231-241). Für die vorliegenden Zwecke werden Plasmide mit diesem Replikationssystem als einzelsträngige DNA-Plasmide bezeichnet.
Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß der "rolling circle"-Replikationsmechanismus erfindungsgemäß genutzt werden kann, um eine erfindungsgemäße bakterielle Zelle herzustellen, die ein DNA-Konstrukt enthält, das, abgesehen von einer DNA-Sequenz von Interesse und einer DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, einen Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid enthält, wobei dem DNA-Konstrukt ein funktionelles rep-Gen, das zum Plus- Replikationsursprung gehört, fehlt.
Diese bakterielle Zelle kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines Elternplasmidvektors konstruiert werden, der einen ersten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid und einen zweiten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid in der gleichen Orientierung wie der erste Plus-Ursprung enthält, wobei der erste und der zweite Plus-Replikationsursprung den Vektor in zwei Teile teilen, und zwar einen ersten Teil, der den ersten Plus-Replikationsursprung und ein funktionelles rep-Gen, das für einen Faktor codiert, der für die Replikation vom ersten und zweiten Plus-Replikationsursprung erforderlich ist, umfaßt, und einen zweiten Teil, der den zweiten Plus-Replikationsursprung, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des Plasmidvektors vorgesehenen Zelle ist, umfaßt.
Bei Replikation des Elternvektors werden der erste und der zweite DNA-Nachkommenvektor vermutlich nach folgendem Mechanismus gebildet:
Das Rep-Protein initiiert die Replikation durch Bildung eines Einzelstrangbruchs am ersten Plus-Ursprung und schreitet fort, um einen Einzelstrangbruch am zweiten Plus-Ursprung zu erzeugen. Der verdrängte Strang wird unter Bildung eines ersten Nachkommenvektors religiert, der einen ersten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid und ein funktionelles rep-Gen, das zu dem ersten Plus-Ursprung gehört, enthält. Entsprechend schreitet das Rep-Protein vom zweiten Plus-Ursprung fort, um einen Einzelstrangbruch am ersten Plus-Ursprung zu erzeugen, wobei auf diese Weise bei Religation des verdrängten Strangs und Umwandlung der einzelsträngigen DNA in doppelsträngige DNA ein zweiter Nachkommenvektor gebildet wird, der einen zweiten Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA-Plasmid, dem ein funktionelles rep-Gen, das zu dem zweiten Plus-Replikationsursprung gehört, fehlt, sowie eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt. Da der zweite Nachkommenvektor kein funktionelles rep-Gen umfaßt, hängt die Replikation dieses Moleküls vollständig vom Rep-Protein ab, das in trans entweder vom ersten Nachkommenvektor oder vom Elternvektor zur Verfügung gestellt wird.
Alternativ dazu könnten die beiden Nachkommenvektor auch als Ergebnis der Rekombination zwischen den homologen DNA-Regionen, die die beiden auf dem Elternvektor vorhandenen Ursprünge einschließen und/oder dazu benachbart sind, gebildet werden.
Ein zweiter Nachkommenvektor ohne einen funktionellen Replikationsursprung kann gebildet werden, wenn der erste Plus-Ursprung im Elternplasmid, das vorstehend beschrieben wurde, durch ein kleines DNA-Fragment ersetzt wird, das aus der Ursprungsregion stammt und ausreicht, um eine Termination der Plasmidreplikation sicherzustellen, jedoch zu klein ist, um einen funktionellen Ursprung darzustellen. Derartige Fragmente sind in pUB110 (Boe et al., J. Bacteriol., Bd. 171 (1989), S. 3366-3372) und in pC194 (Gros et al., EMBO J. Bd. 6 (1987), S. 3863-3869) identifiziert worden.
Die bakterielle Zelle kann alternativ nach einem erfindungsgemäßen Verfahren konstruiert werden, das die Transformation der Wirtszelle mit einem ersten DNA-Vektor, der einen ersten Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA-Plasmid und ein funktionelles rep-Gen umfaßt, und die anschließende oder gleichzeitige (durch Cotransformation) Transformation der Wirtszelle mit einem zweiten DNA-Vektor umfaßt, der einen zweiten Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA-Plasmid umfaßt, dem jedoch ein funktionelles rep-Gen, das zu dem zweiten Plus-Replikationsursprung gehört, fehlt, und der außerdem eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, enthält. Der zweite DNA-Vektor kann in der Zelle aufgrund des Vorhandenseins des Rep-Proteins, das vom ersten DNA-Vektor zur Verfügung gestellt wird, bewahrt werden.
Wenn der Elternvektor oder der zweite DNA-Vektor ein modifiziertes rep-Gen umfassen, dann kann (der zweite Plus-Ursprung dem modifizierten rep-Gen vorausgehen oder sich im modifizierten rep-Gen befinden. Wie vorstehend beschrieben wurde, kann der zweite Plus-Ursprung vom gleichen Plasmid oder von einem anderen Plasmid als der erste Plus-Ursprung abgeleitet sein. In den Fällen, in denen der erste und der zweite Plus-Ursprung von verschiedenen Plasmiden abgeleitet sind, so daß die Replikation nicht von beiden Ursprüngen mittels des gleichen Rep-Proteins initiiert wird, kann der erste DNA-Vektor zusätzlich ein rep-Gen enthalten, das für ein aktives Rep-Protein codiert, das zur Initiation der Replikation von dem zweiten Plus-Ursprung imstande ist. Der Elternvektor oder der zweite DNA-Vektor können auch einen selektierbaren Marker umfassen, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Gemäß einer günstigen Ausführungsform zur Förderung des Integrationsprozesses kann ein Vektor eingesetzt werden, dessen Replikation von permissiven Bedingungen unter Einschluß der Temperatur, bei der die Wirtszellen kultiviert werden, abhängt. Wenn also ein Wirtsbakterium, das den ersten und den zweiten DNA-Vektor enthält, bei der permissiven Temperatur für die Plasmidreplikation kultiviert wird, dann dient das Rep-Protein, das vom ersten DNA-Vektor gebildet wird, dazu, den zweiten DNA-Vektor in der Zelle zu bewahren. Bei nicht-permissiven Temperaturen, bei denen der erste DNA-Vektor nicht repliziert werden kann, gehen der erste Vektor und dementsprechend auch das Rep-Protein, das von ihm gebildet wird, aus der Zelle verloren, so daß der zweite DNA-Vektor ebenfalls nicht länger zur Replikation imstande ist. Durch fortgesetztes Kultivieren unter Selektionsdruck, z. B. in Gegenwart eines Antibiotikums, überleben nur diejenigen Zellen, die in ihrem Genom das erfindungsgemäße inserierte DNA-Konstrukt unter Einschluß eines Gens, das für einen selektierbaren Marker codiert, enthalten.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die Wirtszelle, sobald das DNA-Konstrukt in ihr Genom integriert worden ist, in Abwesenheit eines Selektionsdrucks ohne daraus folgenden Verlust des DNA-Konstrukts oder von Teilen davon aus der Zelle kultiviert werden kann. Man nimmt an, daß dies der Tatsache zuzuschreiben ist, daß die integrierte DNA nicht zur autonomen Replikation imstande ist, sondern zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert wird. Das Fehlen einer autonomen Replikation der integrierten DNA impliziert, daß keine Bildung des einzelsträngigen DNA-Zwischenprodukts stattfindet, von der man annimmt, daß sie für den Rekombinationsprozeß verantwortlich ist, durch den integrierte DNA aus dem Wirtsgenom ausgeschnitten wird (vgl. Ph. Noiret et al., J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 39-48; und H. Young und S.D. Ehrlich, J. Bacteriol., Bd. 171/5 (Mai 1989), S. 2653-2656).
Es ist festgestellt worden, daß es möglich ist, das integrierte DNA- Konstrukt durch Kultivieren von transformierten Zellen unter erhöhtem Selektionsdruck, d. h. bei erhöhten Konzentrationen von Antibiotika, zu amplifizieren. Es ist früher festgestellt worden, daß bei Fehlen eines Selektionsdrucks derartige amplifizierte Kopien häufig aus den Zellen verlorengehen. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende Erfindung eine bakterielle Zelle bereit, in der amplifizierte Kopien von integrierten DNA- Sequenzen stabil in den Wirtszellen gehalten werden, da, wie vorstehend erklärt wurde, die integrierte DNA nicht replikativ ist. Die vorliegende Erfindung ist zwar vorsteherd hauptsächlich als geeignet für die Integration von heterologen DNA-Sequenzen beschrieben worden, es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß das vorliegende Verfahren sich auch eignet, um eine amplifizierte Kopienzahl eines Gens zu erhalten, das homolog in bezug auf die Wirtszelle ist, um die Produktion eines speziellen Genprodukts zu erhöhen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die vorliegende Erfindung wird weiter mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung erläutert, in der
Fig. 1 eine Restriktionskarte des Plasmids pDN3000 zeigt;
Fig. 2 eine Restriktionskarte des Plasmids pE194 zeigt;
Fig. 3 eine Restriktionskarte des Plasmids pPL1975 zeigt;
Fig. 4 eine Restriktionskarte des Plasmids pSX120 zeigt;
Fig. 5 eine Restriktionskarte des Plasmids pPL2002 zeigt
Fig. 6 eine Restriktionskarte des Plasmids pDN3060 zeigt;
Fig. 7 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1085 zeigt;
Fig. 8 eine Restriktionskarte des Plasmids pUC19 zeigt;
Fig. 9 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1103 zeigt;
Fig. 10 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1130 zeigt;
Fig. 11 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1136 zeigt;
Fig. 12 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1137 zeigt;
Fig. 13 eine Restriktionskarte des Plasmids pPL1484 zeigt;
Fig. 14 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1155 zeigt;
Fig. 15 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1157 zeigt;
Fig. 16 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1259 zeigt;
Fig. 17 eine Restriktionskarte des Plasmids pDN29D4 zeigt;
Fig. 18 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1139 zeigt;
Fig. 19 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1139a zeigt;
Fig. 20 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1139b zeigt;
Fig. 21 eine Restriktionskarte des Plasmids pDN3020 zeigt;
Fig. 22 eine Restriktionskarte des Plasmids pPL1878 zeigt;
Fig. 23 eine Restriktionskarte des Plasmids pPL1896 zeigt;
Fig. 24 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ993 zeigt;
Fig. 25 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1163 zeigt;
Fig. 26 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1136a zeigt;
Fig. 27 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1163b zeigt;
Fig. 28 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1259a zeigt;
Fig. 29 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1555 zeigt;
Fig. 30 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1555a zeigt; und
Fig. 31 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1555b zeigt.
In allen Figuren bezeichnen Pfeile die Richtung der Transkription.
Um die Lesbarkeit zu verbessern, sind die Replikationsursprünge (+ ori pUB110, + ori pE194, ori pUC19) durch die tatsächliche Startstelle der Replikation bezeichnet, obwohl ein funktioneller Ursprung aus einer größeren DNA-Region besteht.
Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen weiter erläutert, die jedoch den Umfang und den Geist der Erfindung, wie sie beansprucht wird, nicht beschränken sollen.

Materialien und Methoden

Plasmide

pBD64: Beschrieben von Gryczan et al., 1980.
pDN3060: Ein Clonierungsvektor, der von dem Bacillus-Plasmid pDN1050 (B. Diderichsen, 1986) durch Insertion von synthetischen Oligonucleotiden, die eine Anzahl nützlicher Restriktionsstellen enthalten, abgeleitet ist. Die Restriktionskarte ist in Fig. 6 gezeigt.
pDN2904: Ein Derivat des Bacillus-Plasmids pUB110 (Gryczan et al., 1978), das sowohl ein Chloramphenicol-Resistenzgen als auch Kanamycin-Resistenzgen enthält. Die Restriktionskarte ist in Fig. 17 gezeigt.
pPL1484: Ein pUC19-Derivat (Yanisch-Perron et al., 1985), das eine modifizierte Polylinkerregion enthält, in die ein 1,4 kb umfassendes BamHI-Fragment von pDN2904, das das Kanamycin-Resistenzgen enthält, inseriert ist. Die Restriktionskarte ist in Fig. 13 gezeigt.
pPL1878: pDN1380 (beschrieben in Diderichsen und Christiansen, 1988), das ein 2,4 kb umfassendes HaeII-SphI-Fragment enthält, das für eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase (CGTase) codiert, die aus Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 stammt. Das Gen wurde ursprünglich in das E. coli- Plasmid pBR322 auf einem 12,8 kb umfassenden EcoRI-Fragment cloniert (Starnes et al., 1989). Die Restriktionskarte ist in Fig. 22 gezeigt.

Stämme:

E. coli SJ 6: Ein restriktionsdefizientes Derivat von MC1000 (Diderichsen et al., 1990)
Bacillus subtilis DN1885: Ein amyE, amyR2, spo&spplus;, Pro&spplus;-Derivat von Bacillus subtilis 168. (Diderichsen et al., 1990).
Bacillus subtilis DN1686: Ein spo&supmin; Derivat von DN1280, das eine chromosomale Deletion im dal-Gen enthält (Diderichsen, 1986).
Bacillus licheniformis ATCC 9789
Bacillus lentus NCIB 10309

Medien:

TY: Trypticase 20 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
FeCl&sub2; 4H&sub2;O 6 mg/l
MnCl&sub2; 4H&sub2;O 1 mg/l
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 15 mg/l
pH-Wert: 7,3
TY9: Wie TY-Medium, der pH-Wert wurde jedoch durch Zugabe von NaHCO&sub3; (0,1 m) auf 8,5 eingestellt.
TY9-Agar: Trypticase 20 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
FeCl&sub2; 4H&sub2;O 6 mg/l
MnSO&sub4; 4H&sub2;O 1 mg/l
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 15 mg/l
Bacto-Agar 5 g/l
Mit NaHCO&sub3; (0,1 m) auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt.
BPX: Kartoffelstärke 100 g/l
Gerstenmehl 50 g/l
BAN 5000 SKB 0,1 g/l
Natriumcaseinat 10 g/l
Sojabohnenmehl 20 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 9 g/l
Pluronic 0,1 g/l
LB-Agar: Bacto-trypton 10 g/l
Bacto-Hefeextrakt 5 g/l
NaCl 10 g/l
Bacto-Agar 15 g/l
Mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.

Allgemeine Methoden

Die experimentellen Techniken, die zur Konstruktion der Plasmide angewandt wurden, waren Standardtechniken auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie; vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Restriktionsendonucleasen wurden von New England Biolabs und Boehringer Mannheim bezogen und verwendet, wie es von den Herstellern empfohlen wird T4-DNA-Ligase wurde van New England Biolabs bezogen und verwendet, wie es vom Hersteller empfohlen wird.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus allen Stämmen wurde nach dem von Kieser, 1984, beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Transformation von E. coli:
Zellen von E. coli wurden kompetent gemacht und transformiert, wie es von Mandel und Higa, 1970, beschrieben wurde, oder sie wurden durch Elektroporation transformiert, wie es im Manual für die BIO-RAD-Gene-Pulser- Elektroporationsvorrichtung beschrieben wird.
Transformation von B. subtilis:
Kompetente Zellen wurden hergestellt und transformiert, wie es von Yasbin et al., 1975, beschrieben wird.
Transformation von B. licheniformis:
Plasmide wurden in B. lichenformis durch Polyethylenglykol-vermittelte Protoplastentransformation eingeführt, wie es von Akamatzu, 1984, beschrieben wird.
Transformation von B. lentus:
Plasmide wurden in B. lentus durch Protoplastentransformation gemäß einem geringfügig modifizierten Verfahren nach Akamatzu (1984) eingeführt. Die Modifikationen waren ein höherer pH-Wert im Regenerationsmedium, z. B. wurde das HCP 1,5-Medium auf einen pH-Wert von 8,5 durch Zugabe von 0,1 m NaHCO&sub3; zu dem Medium gepuffert.

Beispiel 1

Stabile Integration eines nicht-replikativen DNA-Moleküls in das Bacillus lentus-Chromosom

Clonierung des Subtilisin-309-Gens

Das für die als Subtilisin 309 bezeichnete Protease codierende Gen wurde aus einer Isolierung des B. lentus-Stamms NCIB 10309, der in WO 89/06279 beschrieben wird, cloniert. Weiteres Subclonieren führte zu dem Plasmid pSX120, das den Replikationsursprung von pUB110, das Chloramphenicol-Resistenzgen (cat) aus pC194, die beiden Promotoren PAmyM und PAmyQ und das für die Subtilisin 309-Protease codierende Gen enthielt (vgl. Fig. 4 und die internationale Patentanmeldung PCT/DK90/00164).

Konstruktion des Integrationsplasmids pPL2002

Das Plasmid pDN3000 wurde durch Restriktionsverdau von pUC19 (Yanisch-Perron et al.) mit EcoRI und Insertion der folgenden Oligonucleotidsequenz (die nach der Phosphoamiditmethode, die von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859-1869 beschrieben wird, in einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt wurde):
in das linearisierte pUC19, gefolgt von einer Ligation, konstruiert. Das Ligationsgemisch wurde dann verwendet, um kompetente E. coli SJ6-Zellen zu transformieren, und die Transformanten wurde auf LB-Platten mit einem Gehalt an 100 ug/ml Ampicillin selektiert Die Orientierung des inserierten Linkers in pDN3000 ist durch Orientierung der Restriktionsstellen in Fig. 1 angegeben.
Das Plasmid pPL1975 wurde durch Restriktionsverdau von pDN3000 mit BglII, gefolgt von einer Ligation dieses linearisierten Plasmids an das MboI-Fragment, das die DNA aus Position 1 bis 1585, die durch Restriktionsverdau von pE194 (Fig. 2, Horinouchi und Weisblum) mit MboI erhalten wurde, enthielt, konstruiert. Das Ligationsgemisch wurde anschließend verwendet, um kompetente E. coli SJ6-Zellen zu transformieren, und die Transformanten wurden auf LB-PLatten mit einem Gehalt an 100 ug/ml Ampicillin selektiert. Die Orientierung der Verbindung dieser beiden Fragmente ist so, wie sie in Fig. 3 angegeben ist. pPL1975 enthält also einen funktionellen E. coli-Replikationsursprung und ein pE194-DNA-Fragment, das einen intakten Plus-Ursprung (+ ori pE194) und ein verkürztes repF- Gen (repF') (Villafane et al., 1987) umfaßt.
Das Plasmid pPL2002 (Fig 5) wurde durch Restriktionsverdau von pPL1975 (Fig. 3) mit EcoRI und BamHI und Ligation des linearisierten Plasmids an das 3,3 kb umfassende EcoRI (partiell)-BglII-Fragment von pSX120 (Fig. 4) konstruiert, das das subtilisin 309-Gen und das cat-Resistenzgen enthielt. Das Ligationsgemisch wurde dann verwendet, um kompetente E. coli SJ6-Zellen zu transformieren, und die Transformanten wurden auf LB-Platten mit einem Gehalt an 100 ug/ml Ampicillin selektiert.

Stabile Integration des pPL2002-Plasmids in das Chromosom von B. lentus

Eine Isolierung des B. lentus-Stamms NCIB 10309 wurde durch Protoplastentransformation mit dem temperaturempfindlichen Plasmid pE194 (vgl. Fig. 1) transformiert; die Selektion auf Erythromycin-Resistenz (5 ug/ml) erfolgte bei 30ºC (permissive Temperatur). Der erhaltene Stamm wurde als PL2156 bezeichnet.
PL2156 wurde anschließend einer Protoplastentransformation mit dem Plasmid pPL2002 unterzogen; die Selektion auf Chloramphenicol-Resistenz (8 ug/ml) und auf Erythromycin-Resistenz (5 ug/ml) bei 30ºC führte zum Stamm PL2157, der die beiden Plasmide pE194 und pPt2002 enthielt. In diesen Zellen hängt die Replikation des Plasmids pPL2002 vollständig vom Vorhandensein des Plasmids pE194 ab, das für das für die pPL2002-Replikation unabdingbare Replikationsprotein repF codiert.
Der Stamm PL2157 wurde über Nacht in TY9-Medium gezüchtet, und Verdünnungen wurden auf TY9-Platten bei 45ºC (nicht-permissive Temperatur) plattiert, wobei auf Chloramphenicol-Resistenz (10 ug/ml) selektiert wurde.
Eine dieser Chloramphenicol-resistenten Kolonien wurde als PL2158 bezeichnet.
Die Southern-Hybridisierung zeigte, daß in dem Stamm PL2158 das Plasmid pPL2002 in das Chromosom durch homologe Rekombination zwischen dem vom Plasmid getragenen und dem chromosomalen Subtilisin 309-Gen integriert und anschließend auf etwa 4 Kopien amplifiziert worden war. Es wurden keine Hinweise auf vollständige pE194-Plasmidsequenzen gefunden.
Die Stabilität der chromosomal integrierten Kopien von pPL2002 im Stamm PL2158 wurde bei Fermentationen im großen Maßstab (1500 l) ohne Antibiotika getestet.
Nach der Fermentation wurden Proben verdünnt und auf TY9-Platten plattiert; 100 Kolonien wurden auf TY9-Platten mit einem Gehalt an 10 ug/ml Chloramphenicol replikaplattiert. 98 der getesteten Kolonien war noch resistent gegenüber Chloramphenicol, was zeigt, daß das Plasmid pPL2002 noch in das Chromosom integriert war. 20 dieser Kolonien wurden anschließend durch Southern-Bybridisierung untersucht, die zeigte, daß das Plasmid pPL2002 noch integriert war, und zwar offensichtlich mit der gleichen Kopienzahl (etwa 4 Kopien) in allen getesteten Kolonien.

Beispiel 2

Konstruktion von Plasmidvektoren, die zwei pUB110-Replikationsursprünge enthalten

Das Plasmid pSJ1085 (Fig. 7) wurde durch Restriktionsverdau von pDN3060 (das einen Replikationsursprung (+ ori pUB110) und das rep-Gen (rep) aus pUB110 und ein Chloramphenicol-Resistenzgen (cat) aus pC194 enthielt) mit BamHI und EcoRI und Insertion der folgenden Oligonucleotidsequenz (die nach der Phosphoamiditmethode, die von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859-1869 beschrieben wird, in einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt wurde):
in das linearisierte pDN3060, gefolgt von Ligation und Transformation von B. subtilis DN1885, konstruiert.
Das Plasmid pSJ1103 (Fig. 9) wurde durch Restriktionsverdau von pSJ1085 (Fig. 7) mit EcoRI sind Insertion des gesamten linearisierten Plasmids in das einem entsprechenden Restriktionsverdau unterworfene Plasmid pUC19 (Fig. 8), gefolgt von Ligation und Transformation von E. coli SJ6, konstruiert. Das erhaltene Plasmid pSJ1103 enthält den Plus-Ursprung und das rep-Gen aus pUB110, das cat-Gen aus pC194, den pUC19-Replikationsursprung (ori pUC19) und das β-Lactamase-Gen (Ampicillin-Resistenz) (bla).
Das Plasmid pSJ1130 (Fig. 10) wurde von pSJ1103 (Fig. 9) durch Deletion eines 1,6 kb umfassendpn NsiI-PstI-Fragments abgeleitet, was im wesentlichen zu einem pUC19-Plasmid führte, das einen pUB110-Plus-Ursprung und ein verkürztes rep-Gen (rep') enthielt. Dieses Plasmid wurde in E. coli SJ6 transformiert.
Ein 1,4 kb umfassendes HindIII-Fragment aus pDN3060 (Fig. 6), das den Plus-Ursprung gefolgt vom intakten rep-Gen enthielt, wurde anschließend in die einzige HindIII-Stelle von pSJ1130 (Fig. 10) inseriert, und das ligierte Plasmid wurde in E. coli als SJ6 transformiert, was zu pSJ1136 (Fig. 11) führte. Bei diesem Experiment wurde das Fragment in pSJ1136 in zwei Tandemkopien inseriert. Eine dieser Kopien wurde anschließend durch Verdau von pSJ1136 mit NsiI, Religation des 5,1 kb umfassenden Fragments und Transformation von E. coli SJ6 deletiert, was zu pSJ1137 (Fig. 12) führte, das einen pUB110-Ursprung benachbart zum verkürzten rep-Gen und einen pUB110-Ursprung benachoart zu einem intakten rep-Gen enthält. Das für Kanamycin-Resistenz codierende Gen (kan) wurde aus dem Plasmid pPL1484 (Fig. 13) auf einem 1,4 kb umfassenden SphI-Fragment ausgeschnitten und in jeder der beiden möglichen Orientierungen in die SphI- Stelle von pSJ1137 (Fig. 12) inseriert, gefolgt von einer Transformation von E. coli SJ6, wobei man pSJ1155 (Fig. 14) und pSJ1157 (Fig. 15) erhielt. pSJ1157 enthielt das kan-Gen in zwei Tandemkopien. Eine Kopie wurde mit BamHI ausgeschnitten, und das 6,5 kb umfassende Fragment wurde religiert und in E. coli SJ6 transformiert, wobei man pSJ1259 (Fig. 16) erhielt.
Das Plasmid pSJ1139 (Fig 18) wurde auf folgende Weise konstruiert: Das Bacillus-Plasmid pDN2904 (Fig. 17), das ein Chloramphenicol-Resistenzgen (cat), ein Kanamycin-Resistenzgen (kan) und den pUB110-Plus- Ursprung mit dem entsprechenden rep-Gen enthielt, wurde mit SphI verdaut und an pSJ1130 (Fig. 10) ligiert, das ebenfalls mit SphI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid pSJ1139 enthält einen pUB110-Ursprung, der mit einem verkürzten rep-Gen verbunden ist, und einen pUB110-Ursprung, der mit einem intakten rep-Gen verbunden ist.

Beispiel 3

Bildung von DNA-Nachkommenvektoren aus Plasmiden, die zwei pUB110- Replikationsursprünge enthalten, in Bacillus subtilis

Das Plasmid pSJ1139 (Fig. 18) (hergestellt aus E. coli SJ1139 in einer als solches bekannten Weise) wurde in B. subtilis DN1885 transformiert, wobei die Selektion auf Kanamycin-Resistenz (10 ug/ml) erfolgte, und Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten hergestellt. Eine Agarosegel-Elektrophorese dieser Plasmide zeigte, ob sie unverdaut oder mit einer Reihe von Restriktionsenzymen verdaut waren, das Vorhandensein von zwei kleineren DNA-Molekülen von 5,1 kb bzw. 2,4 kb sowie eine kleine Menge des Vollängenplasmids pSJ1139 von 7,5 kb. Die erhaltenen Restriktionsmuster entsprachen den erwarteten Mustern für die Bildung von zwei Nachkommenvektoren pSJ1139a (Fig. 19) und pSJ1139b (Fig. 20), und zwar durch homologes Crossing-over zwischen den beiden rep-Sequenzen auf pSJ1139 oder durch Einwirkung des Rep-Proteins, das einen Einzelstrangbruch am pUB110-Plus-Ursprung im Plus-DNA-Strang erzeugt, der dann verdrängt und erneut zum Kreis geschlossen wird, wie es in A. Gruss und S.D. Ehrlich, a.a.O., beschrieber wird (beide Mechanismen können zu den beiden gleichen Nachkommenvektoren führen).
Diese Vektoren wurden weiter durch erneute Transformation in den B. subtilis-Stamm DN1885 und Plattieren auf LB-Platten mit einem Gehalt an entweder 10 ug/ml Kanamycin oder 6 ug/ml Chloramphenicol, gefolgt von Replikaplattieren jeder Platte auf eine neue Platte mit einem Gehalt an dem anderen Antibiotikum, analysiert. Vektoren wurden anschließend aus jedem Typ von Transformant isoliert und durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt:
Transformanten, die sowonl gegenüber Chloramphenicol als auch gegenüber Kanamycin resistent sind, enthalten alle drei Vektorspezies (pSJ1139 mit 7,5 kb, pSJ1139a mit 2,4 kb und pSJ1139b mit 5,1 kb). Transformanten, die gegenüber Chloramphenicol resistent und gegenüber Kanamycin empfindlich sind, enthalten nur pSJ1139b. Transformanten, die gegenüber Kanamycin resistent, jedoch gegenüber Chloramphenicol empfindlich sind, wurden nicht erhalten. Der kleine Nachkommenvektor pSJ1139a mit 2,4 kb ist also zur autonomen Replikation in B. subtilis nicht imstande.

Beispiel 4

Stabile Integration eines nicht-replikativen DNA-Moleküls in das B. subtilis-Chromosom

Konstruktion eines B. subtilis-Stamms, der eine chromosomale Kopie eines Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Gens (CGTaSe-Gens) enthält

Das CGTase-Gen (CGT) wurde aus dem Plasmid pPL1878 (Fig. 22) auf einem 2,5 kb umfassenden BamHI-SphI-Fragment ausgeschnitten und an das BamHI-SphI-verdaute Plasmid pDN3020 (Fig. 21) unter Bildung des Plasmids pPL1896 (Fig. 23) ligiert. pDN3020 ist ein Derivat von pDN1313 (Diderichsen, 1986), das durch Insertion eines synthetischen, SphI-enthaltenden Oligonucleotidlinker (hergestellt, wie es im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben wurde) in die EcoRI-Stelle des Plasmids pDN1380 (Diderichsen und Christiansen, 1988) erhalten wurde, was zum Plasmid pDN1620 führte. Die Promotorregion von einer maltogenen Amylase aus B. stearothermophilus (PamyM), die auf pDN1620 (B. Diderichsen und L. Christiansen, a.a.O.) vorhanden ist, wurde anschließend auf SphI-BamHI-verdautes pUC19 auf einem ungefähr 200 bp umfassenden BamHI-SphI-Fragment übertragen, was zum Plasmid pDN2977 führte. Die Promotorregion wurde aus pDN2977 auf einem ungefähr 200 bp umfassenden BglII-SacI-Fragment ausgeschnitten, das in die Polylinkerregion von pDN1313 inseriert wurde, wobei das Plasmid pDN3020 erzeugt wurde. Das CGTase-Gen auf pPL1896 ist von zwei Fragmenten von chromosomaler B. subtilis-DNA flankiert, die in Fig. 23 als dal und dfs bezeichnet werden. dal ist das für D,L-Alaninracemase von B. subtilis codierende Gen (Diderichsen, 1986).
Das Plasmid pPL1896 wurde in den B. subtilis-Stamm DN1686 transformiert. Bei Selektion allein auf Dal&spplus;-Transformanten wurden mehrere Stämme erhalten, die Chloramphenicol-empfindlich, CGTase&spplus; waren. Sie wurden durch ein doppeltes homologes Crossing-over zwischen pPL1896 und dem DN1686-Chromosom gebildet, wie es von Diderichsen, 1986, beschrieben wurde. Ein derartiger Stamm ist PL1897, der eine chromosomal integrierte Kopie des CGTase-Gens enthält.

Konstruktion eines Integrationsvektors, der das CGTase-Gen enthält

Das CGTase-Gen wurde aus pPL1878 (Fig. 22) auf einem 2,5 kb umfassenden BamHI-NotI-Fragment ausgeschnitten. Ein Expressionsvektor wurde durch Insertion eines 0,6 kb umfassenden SphI-PstI-Fragments, das die Promotorregion des α-Amylasegens enthielt, das aus einem α-Amylase überproduzierenden Derivat von B. lichenformis ATCC 9789 cloniert wurde, das durch herkömmliche Mutageneseverfahren erhalten wurde, in einen von pUB110 abgeleiteten Vektor, der den pUB110-Ursprung und das für Kanamycin-Resistenz codierende Gen enthielt, konstruiert. Das CGTase-Gen (cgt) wurde stromabwärts von diesem Promotor zwischen der BamHI-Stelle und der NotI- Stelle inseriert, was zu pSJ993 (Fig. 24) führte.
Ein 4 kb umfassendes BglII-Fragment von pSJ993 wurde in die BglIIStelle von pSJ1155 (beschrieben im vorstehenden Beispiel 1, Fig. 14) inseriert, wobei das erhaltene Plasmid in den E. coli-Stamm SJ6 transformiert wurde. Ampicillin-resistente, CGTase bildende Transformanten von E. coli SJ6 wurden durch Plattieren von Transformanten auf LB-Platten, die 100 ug/ml Ampicillin und 0,5 % lösliche Stärke enthielten, und Absuchen auf die Bildung von klaren Höfen um die Kolonien, nachdem die Platten mit Ioddampf angefärbt worden waren, isoliert. Ein Transformant, der das Plasmid pSJ1163 (Fig. 25) enthielt, in dem das Kanamycin-Resistenzgen wiederhergestellt worden war, wurde für weitere Experimente aufbewahrt.

Bildung von Nachkommenvektoren aus pSJ1163 in den B. subtilis-Stämmen DN1885 und PL1897

pSJ1163 (Fig. 25) wurde in DN1885 transformiert, und Vektor-DNA wurde aus Kanamycin-resistenten Transformanten isoliert und durch Agarosegel- Elektrophorese analysiert. Dabei zeigten sich Spuren eines 10,5 kb umfassenden Plasmidmoleküls, das pSJ1163 entsprach, und von zwei Nachkommenvektormolekülen pSJ1163b mit 4,1 kb (Fig. 27) und pSJ1163a mit 6,4 kb (Fig. 26) in ungefähr gleicher Menge bzw. in weitaus größerer Menge, die Nachkommenvektoren entsprachen, die durch homologe Rekombination zwischen den beiden rep-Sequenzen von pSJ1163 oder durch Einwirkung des Rep-Proteins auf jeden Plus-Ursprung bei einer "rolling circle"-Replikation entstanden waren, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Bildung der Nachkommenvektoren, wie sie vorstehend beschrieben wurde, wurde auch beobachtet, wenn pSJ1163 in PL1897 transformiert wurde, und zwei derartige Transformanten wurden für weitere Experimente als Stämme SJ1168 und SJ1170 aufbewahrt.

Isolierung von Integranden, die nicht-replikative DNA-Moleküle enthalten

Die Stämme SJ1168 und SJ1170 wurden in 10 ml TY-Medium mit einem Gehalt an 5 ug/ml Kanamycin überimpft und über Nacht bei 37ºC inkubiert. 100 ul jeder Kultur wurde anschließend in frisches TY-Medium überimpft, und die Inkubation wurde wiederholt. Nach vier derartigen Zyklen von Inkubationen über Nacht wurde Plasmid-DNA aus beiden Kulturen hergestellt und durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Es wurden keine Plasmidmoleküle beobachtet. Wenn die Plasmidzubereitung verwendet wurde, um E. coli bei Selektion auf Ampicillin-Resistenz zu transformieren, dann wurden keine Transformanten erhalten, was zeigt, daß weder das ursprüngliche, 10,5 kb umfassende pSJ1163 noch das 4,1 kb umfassende Nachkommenvektormolekül pSJ1163b vorhanden waren. Die Kanamycin-resistenten, plasmidfreien Stämme wurden für weitere Experimente als pSJ1223 und pSJ1237 aufbewahrt.

Amplifikation von integrierter DNA

Durch Selektion auf Wachstum in TY-Medium mit einem Gehalt an allmählich steigenden Konzentrationen an Kanamycin wurden Stämme isoliert, die zum Wachstum bei 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200 und 1400 pg/ml Kanamycin imstande waren. Bei chromosomaler DNA aus Stämmen, die resistent gegenüber mehr als etwa 400 ug/ml Kanamycin waren, zeigte der Verdau mit NheI oder NotI eine DNA-Bande der Größe, die für den Verdau des 6,4 kb umfassenden Nachkommenvektor pSJ1163a mit diesen Enzymen zu erwarten war. Diese Bande trat nicht beim Verdau von DNA auf, die aus Stämmen mit einem geringeren Grad an Kanamycin-Resistenz hergestellt wurde. Eine konservative Abschätzung ist, daß mindestens 5 bis 10 Kopien an integrierter DNA vorhanden waren, wenn diese Bande auftrat.

Stabilität der integrierten DNA

Stämme, die resistent gegenüber 400 ug/ml Kanamycin waren, wurden 1 Woche bei 37ºC in Schüttelkolben mit einem Gehalt an BPX-Medium ohne zugegebenes Kanamycin gezüchtet. Sie wurden anschließend auf LB-Platten plattiert und sodann auf Platten mit einem Gehalt an 10 ug/ml Kanamycin replikaplattiert. Von etwa 130 Kolonien waren alle Kanamycin-resistent, was die stabile Vererbung des Kanamycin-Resistenzgens, das in der integrierten DNA vorhanden ist, in Abwesenheit eines Selektionsdrucks zeigt.

Stabilität eines plasmidgetragenen CGTase-Gens in B. subtilis

Das Plasmid pPL1892 ist m wesentlichen Identisch zu pSJ993 (Fig. 24), wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß eine andere Polylinkerregion stromabwärts vom CGTase-Gen vorhanden ist. Dieses Plasmid wurde in DN1885 eingeführt, und der erhaltene Stamm SJ984 wurde 1 Woche bei 37ºC in Schüttelkolben mit einem Gehalt an BPX-Medium ohne zugegebenes Kanamycin gezüchtet.
Das Plattieren auf Platten mit einem Gehalt an Kanamycin (10 ug/ml) ergab eine 10-fach geringere Zellenzahl als auf Platten ohne Kanamycin, was zeigt, daß 90 % der Zellen ihr Plasmid verloren hatten. Dies wird auch durch den Befund widergespiegelt, daß weniger als 10 % der Kolonien auf Platten ohne Kanamycin CGTase bildeten.

Beispiel 5

Bildung von Nachkommenvektoren aus pSJ1156 in B. licheniformis ATCC 9789

Das Plasmid pSJ1156 ist identisch zu pSJ1157, das in Fig. 15 gezeigt ist. pSJ1156 wurde in licheniformis ATCC 9789 durch Protoplastentransformation bei Selektion auf Kanamycin-Resistenz eingeführt, wobei man den Stamm pSJ1199 erhielt. Die Analyse des Plasmidgehalts von pSJ1199 durch Restriktionsenzymverdau und Agarosegel-Elektrophorese zeigte das Vorhandensein von zwei Plasmidmolekülen. Eines war identisch zu pSJ1259 (Fig. 16) und wurde mit größter Wahrscheinlichkeit durch Deletion einer Kopie des kan-Gens durch homologe Rekombination gebildet. Das andere entsprach pSJ1259a (Fig. 28), also einem der beiden Nachkommenmoleküle, die entweder durch homologe Rekombination zwischen den beiden rep-Sequenzen von pSJ1259 oder durch Einwirkung des Rep-Proteins an jedem Plus-Ursprung bei einer "rolling circle"-Replikation, wie sie vorstehend beschrieben wurde, gebildet werden.

Beispiel 6

Stabile Integration eines nicht-replikativen DNA-Moleküls in das B. licheniformis ATCC 9789-Chrootosom

Konstruktion eines Integrationsvektors

Das Plasmid pSJ1260 ist identisch zu pSJ1259, das in Fig. 16 gezeigt ist. Chromosomale DNA aus B. licheniformis ATCC 9789 wurde mit PstI + BamHI verdaut, und Fragmente zwischen 2 und 4 kb wurden aus einem Agarosegel isoliert. Diese Fragmente wurden in pSJ1260, das mit PstI + BamHI verdaut worden war, ligiert, und in E. coli SJ6 bei Selektion auf Ampicillin-Resistenz transformiert. Ein erhaltener Transformant enthielt ein Insert von 2,1 kb, und das Plasmid wurde als pSJ1555 (Fig. 29) bezeichnet. E. coll SJ6 mit einem Gehalt an pSJ1555 wurde bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Schottland, Vereinigtes Königreich, am 12. Dezember 1990 gemäß den Bestimmungen bes Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40346 hinterlegt. Dieses Plasmid besitzt die Fähigkeit zur Bildung von zwei Nachkommenmolekülen pSJ1555a (Fig. 30) und pSJ1555b (Fig. 31).

Isolierung eines B. licheniformis-Integranden, der ein nicht-replikatives DNA-Molekül enthält

pSJ1555 wurde in B. licheniformis ATCC 9789 durch Protoplastentransformation bei Selektion auf Kanamycin-Resistenz eingeführt. Ein erzeugter Kanamycin-resistenter Transformant (SJ1613) war plasmidfrei, wie durch Gelelektrophorese einer Plasmidzubereitung aus diesem Transformanten gezeigt wurde, und die Plasmidzubereitung war nicht imstande, B. subtilis zu einer Kanamycin-Resistenz zu transformieren. Dieses Ergebnis zeigt, daß sich das nicht-replikative Nachkommenmolekül pSJ1555a gebildet hatte und in das ATCC 9789-Chromosom integriert worden war.

Amplifikation und Stabilität von integrierter DNA

Der Stamm SJ1613 wurde nacheinander in 10 ml umfassenden TY-Kulturen mit einem Gehalt an Kanamycin von 10, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 und 5000 ug/ml gezüchtet, und Stämme, die bei jeder dieser verschiedenen Konzentrationen wuchsen, wurden für die weitere Untersuchung aufbewahrt. Stämme, die resistent gegenüber 20, 200 und 1500 ug/ml Kanamycin waren, wurden weiter analysiert. Chromosomale DNA aus den beiden letztgenannten Stämmen zeigte bei Verdau mit BamHI eine ausgeprägte Bande von 4,5 kb, die bei DNA aus dem ersten Stamm fehlte, wie für Stämme zu erwarten ist, die mehrfache Kopien von pSJ1555a integriert in das Chromosom aufweisen.
Alle Stämme wurden in BPX-Schüttelkolben bei 37ºC für 7 Tage ohne Kanamycin gezüchtet und anschließend auf LB-Platten ausgestrichen. Replikaplattierungen von LB-Platten auf Kanamycin-Platten (10 ug/ml) zeigten keine Kanamycin-empfindlichen Kolonien. Koloniezählungen auf den Platten mit und ohne Kanamycin (10 ug/ml) wurden für die drei Stämme, die gegenüber 20, 200 und 1500 ug/ml Kanamycin resistent waren, erhalten, und in allen Fällen betrugen sie 10¹&sup0; ml&supmin;¹, was die Stabilität des integrierten kan-Gens zeigt.

Literaturverzeichnis

T. Akamatzu, J. Sekiguchi: An improved method of protoplast regeneration für Bacillus species and its application to protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem., Bd. 48 (1984), S. 651-655.
C. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing: Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119.
B. Diderichsen: A genetic system for stabilization of cloned genes in Bacillus subtilis. In: Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications. A.T. Ganesan und J.A. Hoch, Hrsg., Academic Press (1986),
B. Diderichsen, L. Christiansen: Cloning of a maltogenic alphaamylase from a Bacillus stearothermophilus. FEMS Microbiology Letters, Bd. 56 (1988), S. 53-60.
B. Diderichsen, U. Wedsted, L. Hedegaard, B. R. Jensen, C. Sjoholm: Cloning of aldB, which encodes α-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., Bd. 172 (1990), S. 4315-4321.
Gryczan et al., J. Bacteriol., Bd. 141 (1980), S. 246-253. Gryczan et al., Characterization of staphylococcus aureus plasmids introduced by transformation into Bacillus subtilis. J. Bacteriol., Bd. 134 (1978), S. 318-329.
A. Mandel, A. Higa, J. Mol. Biol., Bd. 53 (1970), S. 159-162.
R.L. Starnes, P.C. Trackman, D.M. Katkocin: Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase, its production and use. Internationale Patentanmeldung WO 89/03421 (1989).
R.E. Yasbin, G.A. Williams, F.E. Young, J. Bacteriol., Bd. 121 (1975), S. 296-304.
R. Villafane, D.B. Beckhofer, C.S. Narayanan und D. Dubnau: Replication control genes of plasmid pE194. J. Bact., Bd. 169 (1987), S. 4822- 4829.
S. Horinouchi und B. Weisblum: Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide lincosamide and Streptogramin type B antibiotics. J. Bact., (1982), S. 804-814.
T. Kieser: Factors affecting the Isolation of CCC DNA from Streptomyces lividans and Escherichia coli. Plasmid, Bd. 12, (1984), S. 19-36.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Zelle, die in ihrem Genom ein integriertes nicht-replikatives DNA- Konstrukt trägt, das (1) eine DNA-Sequenz Von Interesse, (2) eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, und (3) einen Replikationsursprung umfaßt, wobei dem DNA-Konstrukt ein funktionelles Gen fehlt, das für einen Faktor codiert, der erforderlich ist, um die Replikation vom Replikationsursprung zu initiieren,

wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Transformation von bakteriellen Zellen mit einem Elternplasmidvektor, der einen ersten Replikationsursprung und einen zweiten Replikationsursprung in der gleichen Orientierung wie der erste Replikationsursprung umfaßt, wobei der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind, um ihre Funktion mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) zu erfüllen,

wobei der erste und der zweite Replikationsursprung den Vektor in zwei Teile teilen, und zwar (i) einen ersten Teil, der den ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten und dem zweiten Replikationsursprung erforderlichen Replikationsfaktor(en) codieren, umfaßt, und (ii) einen zweiten Teil, der den zweiten Replikationsursprung, eine DNA- Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des Vektors vorgesehenen Zelle ist, umfaßt, und

(b) Kultivieren der transformierten Zellen unter selektiven Bedingungen, wobei die Replikation des Elternplasmidvektors zur Bildung eines ersten Nachkommenvektors, der den ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten und dem zweiten Replikationsursprung erforderlichen Replikationsfaktor(en) codieren, umfaßt, und eines zweiten Nachkommenvektors führt, der den zweiten Replikationsursprung umfaßt, dem jedoch ein funktionelles Gen, das für einen Replikationsfaktor codiert, fehlt, und der außerdem eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt, sowie fortgesetztes Kultivieren der transformierten Zellen unter selektiven Bedingungen, die zur Integration des zweiten Nachkommenvektors in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination und zum Verlust des ersten Nachkommenvektors sowie des Elternvektors aus den Zellen führen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Replikationsursprung vom gleizhen Plasmid wie der erste Replikationsursprung stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein für den Replikationsfaktor, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist, codierendes Gen deletiert worden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein für den Replikationsfaktor, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist, codierendes Gen modifiziert worden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Gen durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide der DNA-Sequenz des Gens oder durch Deletion des transkriptionalen oder translationalen Start- oder Stoppsignals modifiziert worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Elternplasmidvektor um einen Vektor handelt, der nicht zur Replikation bei erhöhten Temperaturen imstande ist, der jedoch ein Wachstum der Wirtszelle erlaubt, wobei die bakteriellen Zellen zunächst bei einer Temperatur kultiviert werden, die eine Replikation des Plasmids erlaubt, und anschließend, nach der Integration des zweiten Nachkommenvektors in das bakterielle Genom, bei einer Temperatur kultiviert werden, die die Replikation des Plasmids nicht erlaubt, so daß der erste Nachkommenvektor sowie der Elternvektor aus den Zellen verloren gehen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Elternvektor einen ersten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid und einen zweiten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid in der gleichen Orientierung wie der erste Plus-Ursprung enthält, wobei der erste und der zweite Plus-Replikationsursprung den Vektor in zwei Teile teilen, und zwar (i) einen ersten Teil, der den ersten Plus-Replikationsursprung und ein funktionelles rep-Gen, das für einen Faktor codiert, der für die Replikation vom ersten und zweiten Plus-Replikationsursprung erforderlich ist, umfaßt, und (ii) einen zweiten Teil, der den zweiten Replikationsursprung, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des Plasmidvektors vorgesehenen Zelle ist, umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der zweite Plus-Replikationsursprung vom gleichen einzelsträngigen DNA-Plasmid wie der erste Plus-Replikationsursprung stammt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei der bakteriellen Zelle um die Zelle eines grampositiven Bakteriums handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem grampositiven Bakterium um einen Stamm handelt, der zur Gattung Bacillus oder Streptomyces gehört.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Bakterium um einen Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis oder Streptomyces lividans handelt.

12. Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Zelle, die in ihrem Genom ein integriertes nicht-replikatives DNA- Konstrukt trägt, das (1) eine DNA-Sequenz von Interesse, (2) eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, und (3) einen Replikationsursprung umfaßt, wobei dem DNA-Konstrukt ein funktionelles Gen fehlt, das für einen Faktor codiert, der zur Initiation der Replikation von dem Replikationsursprung erforderlich ist,

wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Transformation bakterieller Zellen mit (i) einem ersten DNA-Vektor, der einen ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten Replikationsursprung erforderlichen Faktor(en) codieren, umfaßt, und mit (ii) einem zweiten DNA-Vektor, der einen zweiten Replikationsursprung umfaßt, dem jedoch ein funktionelles Gen, das für einen Faktor codiert, der für die Plasmidreplikation von dem zweiten Replikationsursprung erforderlich ist, fehlt, und der außerdem eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt,

wobei der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind, um mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) ihre Funktion zu erfüllen, so daß die Replikation des zweiten DNA-Vektors vom zweiten Replikationsursprung durch den/die Replikationsfaktor(en) initiiert wird, der/die von dem/den auf dem ersten DNA-Vektor vorhandenen Gen(en) codiert wird/werden, und

(b) Kultivieren der erhaltenen Zellen unter selektiven Bedingungen, die zur Integration des zweiten DNA-Vektors in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination und Verlust des ersten DNA-Faktors führen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der zweite Replikationsursprung vom gleichen Plasmid wie der erste Replikationsursprung stammt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei aus dem zweiten DNA-Vektor das Gen deletiert worden ist, das für den Replikationsfaktor codiert, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist

15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Gen, das für den Replikationsfaktor codiert, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist, modifiziert worden ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Gen durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide der DNA-Sequenz des Gens oder durch Deletion des transkriptionalen oder translationalen Start- oder Stoppsignals modifiziert worden ist.

17. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der erste DNA-Vektor ferner ein funktionelles Gen umfaßt, das für den Replikationsfaktor codiert, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist.

18. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der zweite DNA- Vektor ferner einen selektierbaren Marker umfaßt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei der erste DNA-Vektor einen ersten Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA-plasmid und ein funktionelles rep-Gen umfaßt, und wobei der zweite DNA-Vektor einen zweiten Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA- Plasmid umfaßt, ihm jedoch ein funktionelles rep-Gen, das zum zweiten Plus-Replikationsursprung gehört, fehlt, und er außerdem eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der zweite Plus- Replikationsursprung aus dem gleichen einzelsträngigen DNA- Plasmid wie der erste Plus-Replikationsursprung stammt.

21. Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem ersten DNA-Vektor um einen Vektor handelt, der nicht zur Replikation bei erhöhten Temperaturen imstande ist, der jedoch ein Wachstum der Wirtszellen erlaubt, wobei die bakteriellen Zellen zunächst bei einer Temperatur kultiviert werden, die eine Plasmidreplikation erlaubt, und anschließend, nach der Integration des zweiten DNA-Vektors in das bakterielle Genom, bei einer Temperatur kultiviert werden, die eine Plasmidreplikation nicht erlaubt, so daß der erste DNA-Vektor aus den Zellen verloren geht.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei sich bei der Zelle um ein grampositives Bakterium handelt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem grampositiven Bakterium um einen Stamm handelt, der zur Gattung Bacillus oder Streptomyces gehört.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei dem Bakterium um einen Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearotherinophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis oder Streptomyces lividans handelt.

25. Elternplasmidvektor, der einen ersten Replikationsursprung und einen zweiten Replikationsursprung in der gleichen Orientierung wie der erste Replikationsursprung umfaßt, wobei der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind, um mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) ihre Funktion zu erfüllen,

wobei der erste und der zweite Replikationsursprung den Vektor in zwei Teile teilen, und zwar (i) einen ersten Teil, der den ersten Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von dem ersten und dem zweiten Replikationsursprung erforderlichen Replikationsfaktor(en) codieren, umfaßt, und (ii) einen zweiten Teil, der den zweiten Replikationsursprung, eine DNA- Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des Vektors vorgesehenen Zelle ist, umfaßt.

26. Plasmidvektor nach Anspruch 25, wobei der zweite Replikationsursprung vom gleichen plasmid wie der erste Replikationsursprung stammt.

27. Plasmidvektor nach Anspruch 25, bei dem das Gen, das für den Replikationsfaktor, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist, codiert, deletiert worden ist.

28. Plasmidvektor nach Anspruch 25, wobei ein Gen, das für den Replikationsfaktor codiert, der mit dem zweiten Replikationsursprung assoziiert ist, modifiziert worden ist.

29. Plasmidvektor nach Anspruch 28, wobei das Gen durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide der DNA-Sequenz des Gens oder durch Deletion des transkriptionalen oder translationalen Start- oder Stoppsignals modifiziert worden ist.

30. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 25 bis 29, der einen ersten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid und einen zweiten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid in der gleichen Orientierung wie der erste Plus-Ursprung umfaßt, wobei der erste und der zweite Plus-Replikationsursprung den Vektor in zwei Teile teilen, und zwar einen ersten Teil, der den ersten Plus-Replikationsursprung und ein funktionelles rep-Gen, das für einen Faktor codiert, der für die Replikation von dem ersten und dem zweiten Plus-Replikationsursprung erforderlich ist, umfaßt, und einen zweiten Teil, der den zweiten Plus-Replikationsursprung, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des Plasmidvektors vorgesehenen Zelle ist, umfaßt.

31. Plasmidvektor nach Anspruch 30, wobei der zweite Plus-Replikationsursprung vom gleichen einzelsträngigen DNA- Plasmid wie der erste Plus-Replikationsursprung stammt.

32. Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 25 bis 31, der ferner einen selektierbaren Marker umfaßt.

33. Bakterielle Zelle, die in ihrem Genom ein integriertes nicht-replikatives DNA-Konstrukt trägt, das (1) eine DNA- Sequenz von Interesse, (2) eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, und (3) einen Replikationsursprung umfaßt, wobei aus dem DNA-Konstrukt ein Gen, das für einen Faktor codiert, der zur Initiation der Replikation von dem Replikationsursprung erforderlich ist, deletiert worden ist, oder wobei das Gen, das für den Replikationsfaktor codiert, modifiziert worden ist, so daß es für einen inaktiven Replikationsfaktor codiert.

34. Zelle nach Anspruch 33, wobei das Gen durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide der DNA-Sequenz des Gens oder durch Deletion des transkriptionalen oder translationalen Start- oder Stoppsignals modifiziert worden ist.

35. Zelle nach einem der Ansprüche 33 oder 34, wobei das DNA-Konstrukt eine DNA-Sequenz von Interesse, eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, und einen Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid umfaßt, wobei dem DNA-Konstrukt ein funktionelles rep-Gen fehlt, das zu dem Plus-Replikationsursprung gehört.

36. Zelle nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei das DNA-Konstrukt zusätzlich einen selektierbaren Marker umfaßt.

37. Zelle nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei es sich bei der Zelle um ein grampositives Bakterium handelt.

38. Zelle nach Anspruch 37, wobei es sich bei dem grampositiven Bakterium um einen Stamm handelt, der zur Gattung Bacillus oder Streptomyces gehört.

39. Zelle nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Bakterium um einen Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis oder streptomyces lividans handelt.

40. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse, umfassend das Kultivieren einer bakteriellen Zelle nach einem der Ansprüche 33 bis 39, die eine integrierte DNA- Sequenz enthält, die für das Polypeptid codiert, unter Bedingungen, die günstig für die Bildung des Polypeptids sind, und die Gewinnung des erhaltenen Polypeptids aus der Kultur.

41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein Enzym handelt.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem Enzym um eine Protease, eine Amylase oder eine Lipase handelt.