DE19654841A1 - Zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren - Google Patents
Zweifach positiv selektive KlonierungsvektorenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einfach und zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren zur positiven Selektion von
gentechnischen Klonierungen in Rezipientenstämmen von
Bakterien nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.
Gentechnische Klonierungen betreffen meist nicht selektive
und auch phänotypisch nicht unmittelbar nachweisbare Gene, so
daß die Isolierung von Klonierungen bzw. dadurch erzeugter
rekombinanter Plasmide einen hohen experimentellen Aufwand
erfordern kann. Ein Beitrag zur Lösung dieses Problems wurde
durch die Entwicklung von positiv selektiven
Klonierungsvektoren geleistet (Literaturreferenzen s.
Sambrook et al., 1989; Bernard et al., 1994), die eine
direkte Selektion von gentechnischen Klonierungen gestatten.
Solche Klonierungsvektoren wurden fast ausschließlich für
Rezipientenstämme von Escherichia coli (E. coli) entwickelt,
und ihre Anwendbarkeit zur positiven Selektion beruht auf der
Inaktivierung von Genen oder DNA-Strukturen in
Plasmidvektoren, die eine letale Wirkung auf ihren
Rezipientenstamm ausüben. Die Inaktivierung erfolgt durch
Klonierung in eine interne Restriktaseschnittstelle des
letalen Plasmid-Gens bzw. der letalen Plasmidstruktur, so daß
die Inaktivierung durch Insertion erzielt wird. Auf diese
Weise können gentechnische Klonierungen allein auf Grund der
Replikationsfähigkeit der rekombinanten Plasmide selektiert
werden. Von den bisher erprobten positiv selektiven
Klonierungsvektoren sind bei E. coli zwei Vektortypen
allgemein anwendbar und zeichnen sich durch eine hohe
Selektivität aus. Bei einem Vektortyp wird die
Insertionsinaktivierung des induzierbar letalen Gens ccdB
(control of cell death) zur positiven Selektion genutzt
(Bernard et al., 1994). Ein zweiter Vektortyp basiert auf der
replikationshemmenden Wirkung eines langen DNA-Palindroms in
Plasmiden und der konditionalen Replikationsfähigkeit der
palindromhaltigen Plasmide bei Unterbrechung des
DNA-Palindroms durch Insertion einer unikalen DNA-Sequenz (US) im
Zentrum des DNA-Palindroms. Unter Selektionsdruck, z. B. durch
ein Antibiotikum, wirkt die Replikationshemmung eines
palindromhaltigen Plasmids, das ein Gen für Resistenz gegen
dieses Antibiotikum als Selektionsmarker enthält, letal auf
seinen Rezipientenstamm, der selbst gegen das Antibiotikum
sensibel ist. Als invertiert repetitive DNA-Sequenzen (IR's)
des DNA-Palindroms können beliebige DNA-Fragmente mit einer
Mindestlänge von ca. 60 Basenpaaren (bps) verwendet werden.
Zur Insertionsinaktivierung des DNA-Palindroms ist eine
Mindestlänge der US von ca. 50 bps erforderlich, und als US
des Klonierungsvektors wird bevorzugt ein Gen genutzt, das
einen selektiven Phänotyp kodiert. Die US ist innerhalb eines
symmetrischen Polylinkers inseriert, der an einem Ende des
DNA-Palindroms, in Verlängerung der beiden IR's des
DNA-Palindroms, lokalisiert ist und als positiv selektive,
multiple Klonierungsstelle (PSMCS) wirksam ist. Am
gegenüberliegenden Ende der IR's grenzt das DNA-Palindrom an
ein unikales Plasmidreplikon mit essentiellen
Plasmidfunktionen (Replikation, Selektionsmarker für die
Plasmidtransformation) des Klonierungsvektors. Zur positiven
Selektion von gentechnischen Klonierungen wird die US in
einer Restriktaseschnittstelle (d. h. in je einer gleichen
Restriktaseschnittstelle der beiden Polylinker) der PSMCS
exzidiert und durch klonierte DNA-Fragmente ersetzt. Unter
optimalen Bedingungen (vollständige Exzision der US,
optimales Verhältnis von Donor- zu Vektor-DNA) wird eine hohe
Selektivität für gentechnische Klonierungen erreicht, so daß
nach Klonierung isolierte Plasmidtransformanten fast
ausschließlich rekombinante Plasmide enthalten.
Nichtrekombinante Plasmide gehen aber nicht nur auf nicht
exzidierte US, sondern auch auf spontane Deletionen innerhalb
des DNA-Palindroms zurück, die durch Rekombination verursacht
werden. Als Rezipientenstämme für Plasmidtransformationen
sind zur homologen Rekombination fähige Stämme erforderlich,
da die Replikationshemmung durch DNA-Palindrome in Plasmiden
nur in solchen Stämmen wirksam ist.
Neben dieser erfolgreichen Entwicklung von positiv selektiven
Klonierungsvektoren bei E. coli als bedeutendstem Vertreter
der gramnegativen Bakterien erfolgte eine vergleichbare
Vektorentwicklung (Prats et al., 1985) bei dem grampositiven
Bakterium Streptococcus pneumoniae, während für andere,
besonders für industriell bedeutende grampositive Bakterien,
wie Bacillus subtilis (B. subtilis) und andere Bacillus-Spezies,
bisher keine Ergebnisse publiziert wurden. Bei
Bacillus könnte die Ursache dafür in der noch
weitverbreiteten Nutzung von ssDNA (single strand DNA =
einzelsträngige DNA)-Plasmidvektoren liegen, deren
strukturelle Instabilität (Harwood and Cutting, 1990) ihre
Nutzung als Ausgangsplasmide für positiv selektive
Klonierungsvektoren erschwert oder unmöglich macht. Ihre
strukturelle Plasmidinstabilität ist durch den "rolling-circle"-
oder Sigma-Typ der Plasmidreplikation bedingt, bei
der einzelsträngige DNA als Intermediärprodukt gebildet wird,
die durch ihre erhöhte Rekombinationsfähigkeit
destabilisierend wirkt. Strukturelle Instabilität würde zu
einem erhöhten Anteil von nichtrekombinanten Plasmiden führen
und so die Selektivität bei positiv selektiven
Klonierungsvektoren für gentechnische Klonierungen
reduzieren.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die angegebenen
Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und solche
Klonierungsvektoren zu entwickeln, die die Vorteile der
positiven Selektion von gentechnischen Klonierungen auch bei
anderen, besonders bei industriell bedeutenden grampositiven
Bakterien, wie B. subtilis und anderen Bacillus-Spezies, in
effektiver Weise nutzen lassen. Dazu soll die Fähigkeit zur
positiven Selektion optimiert und mit weiteren vorteilhaften
Vektoreigenschaften, wie struktureller und segregativer
Plasmidstabilität, hoher Klonierungs-Effektivität und
-Kapazität, Variabilität der Kopienzahl und biologischer
Sicherheit, verbunden werden, so daß die positiv selektiven
Klonierungsvektoren nicht nur für Klonierungsexperimente im
Labormaßstab, sondern auch für Vorhaben in großem Maßstab,
wie industrielle Fermentationen und Freisetzungen,
unmittelbar anwendbar sind. Dafür soll ein solch hoher Grad
der segregativen Plasmidstabilität erreicht werden, daß auf
selektiven Druck zur Plasmidstabilisierung verzichtet werden
kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß positiv
selektive Klonierungsvektoren auf der eingangs näher
beschriebenen, an sich bekannten Grundlage der
replikationshemmenden Wirkung eines langen DNA-Palindroms in
Plasmiden konstruiert werden. Abweichend von der üblichen
Verfahrensweise werden aber zwei gleiche oder annähernd
gleiche Plasmidreplikons als IR's des DNA-Palindroms genutzt,
wodurch nicht nur an sich bekannte, einfach positiv selektive
Klonierungsvektoren mit nur einer PSMCS, sondern auch
neuartige, zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren
erzeugt werden können. Diese enthalten zwei unterschiedliche
oder zumindest partiell unterschiedliche PSMCS's, welche
unabhängig voneinander und mit erhöhter Variabilität
anwendbar sind. Die Nutzung von zwei Plasmidreplikons als
IR's des DNA-Palindroms schließt aber nicht aus, daß beide
oder eines von beiden verkürzt wird und dadurch positiv
selektive Klonierungsvektoren mit reduzierter Größe und
veränderten Vektoreigenschaften abgeleitet werden. Für die
Vektorkonstruktion ist es besonders vorteilhaft, wenn ein
Streptococcen-Plasmid pDB101 (Behnke et al., 1979) oder ein
vergleichbares Plasmid der Inkompatibilitätsgruppe inc18 als
Ausgangsplasmid verwendet wird, das bereits ein DNA-Palindrom
natürlichen Ursprungs enthält. Weitere Vorteile bieten
Plasmide der Inkompatibilitätsgruppe inc18 auf Grund ihrer
Theta-Typ-Replikation, Partition- und Resolvase-Gen-
Funktionen (Ceglowski et al., 1993a), ihres weiten
Wirtsbereiches sowie ihrer hohen Klonierungs-Effektivität und
-Kapazität (Rabinovich et al., 1985; Janniere et al., 1990),
so daß auch von diesen abgeleitete positiv selektive
Klonierungsvektoren eine hohe strukturelle und segregative
Plasmidstabilität, hohe Klonierungshäufigkeiten, eine stabile
Klonierung auch von großen DNA-Fragmenten und die Nutzung von
Rezipientenstämmen verschiedener grampositiver Bakterien
ermöglichen könnten. Plasmide mit Theta-Typ-Replikation, auch
als "non-ssDNA"-Plasmide bezeichnet, sind im Unterschied zu
ssDNA-Plasmiden strukturell stabil, da bei ihnen während der
Replikation keine einzelsträngige, sondern doppelsträngige
und deshalb stabile DNA als Intermediärprodukte gebildet
werden. Zur Gewährleistung von biologischer Sicherheit bietet
das Ausgangsplasmid pDB101 schließlich den Vorteil eines
hohen Grades seiner strukturellen und funktionellen
Charakterisierung (Ceglowski et al., 1993a, b; Ceglowski und
Alonso, 1994), so daß ein Risiko mit hoher Wahrscheinlichkeit
ausgeschlossen werden kann.
Als Rezipientenstamm für Plasmidtransformationen wird, wenn
nicht anders vermerkt, ein rekombinationsfähiger Stamm B.
subtilis GSB26 aus der Stammfamilie B. subtilis 168 genutzt,
der sich schon wiederholt für eine stabile Etablierung
rekombinanter Derivate von pDB101 bewährt hat (Steinborn und
Hofemeister, 1984; Steinborn, 1988).
Die Konstruktion von einfach und zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektoren ist unabhängig voneinander möglich, doch
können zweifach positiv selektive weniger aufwendig von
einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren abgeleitet
werden. Bei Nutzung des Ausgangsplasmids pDB101 werden
zunächst einfach positiv selektive Klonierungsvektoren
(schematische Darstellung s. Abb. 1a) erzeugt, indem seine
US1 deletiert und sein DNA-Palindrom in solcher Weise
verlängert wird, daß es aus zwei gleichen, funktionsfähigen
Plasmidreplikons besteht. Dabei werden sein Replikations-Gen
repS in Verlängerung der beiden IR's (IR, IR') des DNA-Palin
droms dupliziert (reps, reps') und ein Reporter-Gen als US1
innerhalb eines symmetrischen Polylinkers inseriert. Wie im
Ausgangsplasmid pDB101 enthalten auch hier noch beide IR's
des DNA-Palindroms je eine Kopie der Gene für Resolvase
(resS, resS') und Partition (parS, parS'), die multimere
Plasmidformen monomerisieren bzw. bei der Zellteilung eine
aktive Verteilung der Plasmidkopien von der Mutterzelle auf
die Tochterzellen bewirken und dadurch eine hohe segregative
Plasmidstabilität ermöglichen. Der symmetrische Polylinker
wirkt am Ende des DNA-Palindroms positiv selektiv und wird
als PSMCS genutzt, die in dieser Position, stromaufwärts zur
Transkriptionsrichtung der beiden Replikations-Gene und
flankierend zur US1, als "PSMCS1" bezeichnet wird. Als
Selektionsmarker für Plasmidtransformationen dient
vorzugsweise ein mlsS-Gen für Resistenz gegen
MLS-Antibiotika, das natürlicherweise in der US2 des
Ausgangsplasmids pDB101 lokalisiert ist und unverändert in
einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren Anwendung
findet. Die US2 befindet sich gegenüber der US1, stromabwärts
zur Transkriptionsrichtung der beiden Replikations-Gene, und
grenzt im Unterschied zur US1 unmittelbar (ohne
Klonierungsstelle) an das gegenüberliegende Ende des
DNA-Palindroms. Statt des mlsS-Gens können auch andere
Selektionsmarker verwendet werden, sofern dadurch nicht die
Anwendbarkeit der Klonierungsvektoren beeinträchtigt wird.
Für Vorhaben in großem Maßstab sind z. B. nutritive Gene oder
andere biologisch unbedenkliche Gene als Selektionsmarker
vorteilhaft, deren Nutzung einer weiteren Verbreitung von
Genen für Resistenz gegen Antibiotika, insbesondere gegen
therapeutisch genutzte Antibiotika, vorbeugt. Als Reporter-Gene
der US1 werden solche eingesetzt, die einen selektiven
oder leicht nachweisbaren Phänotyp kodieren, so daß ihre
Insertion und Exzision bei der Konstruktion von positiv
selektiven Klonierungsvektoren bzw. bei Ihrer Nutzung für
gentechnische Klonierungen selektierbar bzw. wenig aufwendig
nachweisbar sind. Vorzugsweise werden die hochexprimierten
Gene amyA (Steinborn und Hofemeister, 1984) und nprA
(Steinborn, 1988) für extrazelluläre alpha-Amylase bzw.
neutrale Protease von Bacillus amyloliquefaciens (B.
amyloliquefaciens) als Reporter-Gene verwendet, da diese
verbreitet für industrielle Fermentationen genutzt werden und
damit die positiv selektiven Klonierungsvektoren auch
anwendungsnah unter dem Streß der hohen Expression eines
industriell genutzten Produkt-Gens testen lassen.
So werden beispielhaft bei Anwendung des amyA-Gens und eines
cmlR-Gens für Resistenz gegen Chloramphenicol als Reporter-Gene
die einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren pPS1
(Abb. 2) bzw. pPS2 erzeugt (Ausführungsbeispiel 1), die
hinsichtlich ihrer Selektivität und Plasmidstabilität zwei
wesentliche Anforderungen an positiv selektive
Klonierungsvektoren erfüllen. Ihre Selektivität für
gentechnische Klonierungen wird wenig aufwendig unter Nutzung
eines Reporter-Gens ermittelt, indem z. B. das cmlR-Reporter-Gen
aus pPS2 innerhalb der PSMCS1 exzidiert und die positive
Selektion anhand der Klonierungshäufigkeit des aus pPS1
exzidierten amyA-Reporter-Gens in die PSMCS1 von pPS2
bestimmt wird. Unter geeigneten experimentellen
Voraussetzungen (möglichst vollständige Exzision des
cmlR-Reporter-Gens, äquimolares Verhältnis von Donor zu Vektor-
DNA-Fragmenten) wird ein hoher Grad der Selektivität (bis zu
98% der Plasmidtransformanten enthalten rekombinante
Plasmide) erreicht, der mit dem bei einfach positiv
selektiven Klonierungsvektoren in E. coli vergleichbar ist.
Hinsichtlich einer geringen segregativen Plasmidinstabilität
(bis 1% plasmidfreie Segreganten nach 80 Generationen ohne
Selektionsdruck) erreichen pPS1 und pPS2 nicht den extrem
hohen Stabilitätsgrad von nicht positiv selektiven
rekombinanten Derivaten von pDB101, die ebenfalls ein
kloniertes amyA-Gen enthalten (Steinborn und Hofemeister,
1984). Diese geringe Plasmidinstabilität läßt zwar keinen
Einfluß auf die positive Selektion erkennen, könnte sich aber
bei einer unmittelbaren Nutzung der Klonierungsvektoren für
Vorhaben in großem Maßstab negativ auswirken.
Es ist noch unbekannt, worauf die geringe segregative
Plasmidinstabilität bei pPS1 und pPS2 zurückzuführen ist.
Eine permanente Inaktivierung ihrer beiden Partitions-Gene
als eine mögliche Ursache ist auszuschließen, da sich von
pPS1 extrem stabile nicht palindrome Plasmide ableiten lassen
und durch Deletion der parS-Gene erzeugte Derivate von pPS1
im Vergleich zu pPS1 eine 100-fach erhöhte
Plasmidinstabilität aufweisen.
Während pPS1 und pPS2 durch ihre hohe Selektivität und
Plasmidstabilität schon zwei wesentliche Anforderungen an
positiv selektive Klonierungsvektoren erfüllen, weisen sie
hinsichtlich ihrer überdurchschnittlichen Größe (19-20 Kb)
und einer geringen Kopienzahl (5-10/Zelle) noch
Vektoreigenschaften auf, die unter Umständen für ihre
experimentelle und wirtschaftliche Nutzung nachteilig sein
können. Größere Plasmide lassen sich mit zunehmender Größe
(besonders nach der PEG-Protoplasten-Methode) weniger
effektiv transformieren und enthalten auch meist nicht
essentielle Gene, die den Rezipientenstamm erheblich belasten
können. Zur Überwindung dieser möglichen Nachteile wird
deshalb, ausgehend von pPS1, zunächst seine Plasmidgröße
reduziert (Ausführungsbeispiel 2), indem sein DNA-Palindrom
innerhalb einer nicht essentiellen Region (d. h. außerhalb
der Gene für Replikation, Resolvase und Partition) verkürzt
wird. Die Verkürzung des DNA-Palindroms erfolgt durch
Isolierung eines nicht palindromen Plasmids pSB468 als
Derivat von einem palindromen Plasmid pPS1 (pPS2 oder
pDB101), Deletion mittels Restriktasespaltung in pSB468 und
Nutzung des so erhaltenen verkürzten (nicht palindromen)
Plasmidderivats pSB472 zur Rekonstruktion eines (palindromen)
einfach positiv selektiven Klonierungsvektors pPS3 (Abb. 3).
In pPS3 sind im Vergleich zu pPS1 pro IR je 2231 bps und
damit je zwei nicht essentielle Gene deletiert, wobei die
Plasmidgröße um ¼ reduziert ist. Neben der hier ausgeführten
Methode wäre auch jede andere anwendbar, die eine gezielte
Verkürzung bei weitgehender Wahrung der DNA-Homologie des
DNA-Palindroms gewährleistet. Größere Deletionen oder
Insertionen in nur einer IR des DNA-Palindroms sind dabei zu
vermeiden, da solche Störungen der DNA-Homologie zu einer
Destabilisierung der Plasmide führen können (Steinborn und
Hofemeister, 1984).
Eine bedeutende, 5- bis 10-fache Erhöhung der Kopienzahl
(Ausführungsbeispiel 3) wird zufällig, aber in vorteilhafter
Form, durch die Isolierung eines spontanen Plasmidderivats
pPS4 (Abb. 4) von pPS3 erreicht. Restriktions- und Funktions
analysen führen zu dem unerwarteten Ergebnis, daß seine
erhöhte Kopienzahl auf die Inaktivierung eines Replikations-Gens
zurückgeht, so daß in pPS4 je ein aktives und inaktives
Replikations-Gen repS' bzw. repS497 vorliegt. Als Ursache der
Inaktivität von repS497 wird durch DNA-Sequenzanalyse eine
kurze (52bps-)Deletion in seinem Promotor PII nachgewiesen,
die die Gen-Transkription unterbindet. Für eine gleiche
Erhöhung der Kopienzahl könnten auch andere Methoden der
Inaktivierung von einem der beiden Replikations-Gene gewählt
werden, doch weist die Deletion in reps497 einige
vorteilhafte Merkmale auf: a) irreversibel und dadurch
stabil, b) geringe Länge und dadurch ohne Einfluß auf die
Stabilität des DNA-Palindroms (vgl. Ausführungsbeispiel 2),
c) geeignete Position und dadurch keine Beeinträchtigung der
positiven Selektion und Erhalt von geeigneten
Restriktaseschnittstellen (besonders für Pvu II und Bcl I)
für die Vektorkonstruktion. Hinsichtlich einer unmittelbaren
Anwendung der einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren
wird anschließend untersucht, ob und in welchem Grade die
erhöhte Kopienzahl einen erhöhten Gen-Dosis-Effekt und damit
eine Steigerung der plasmidkodierten Produktbildung bewirkt.
Anwendungsnah wird dazu die plasmidkodierte Bildung von
α-Amylase in einem industriell genutzten Medium bestimmt, wobei
für pPS4 (mit 5- bis 10-facher Kopienzahl) eine
beträchtliche, 3-fache Steigerung der Produktbildung
nachgewiesen wird. Damit wird keine linear proportionale
Erhöhung des Gen-Dosis-Effektes erreicht, was offenbar auf
das hohe Niveau der Amylasebildung (auf Grund des
hochexprimierten amyA-Gens) und die dadurch bedingte starke
Belastung der zellulären Syntheseleistung des
Rezipientenstammes zurückzuführen ist. Ein überraschendes und
für die Anwendung der einfach positiv selektiven
Klonierungsvektoren vorteilhaftes Ergebnis ergibt sich aus
einem Vergleich der plasmidkodierten Amylasebildung zu
üblichen, nicht palindromen rekombinanten Plasmiden. Bei
vergleichbarer Kopienzahl kodiert pPS4 auch im Vergleich zu
nicht palindromen rekombinanten Plasmiden mit kloniertem
amyA-Gen eine 2,5- bis 3-fache Amylasebildung, womit letztere
nur das gleiche Niveau wie die einfach positiv selektive
Klonierungsvektoren pPS1 oder pPS3 mit geringer Kopienzahl
erreichen. Diese in Relation zur ermittelten Kopienzahl
deutlich erhöhte Produktbildung bei einfach positiv
selektiven Klonierungsvektoren kann auf ihre strukturellen
und funktionellen Besonderheiten oder (unwahrscheinlicher)
auf eine experimentelle Unterbestimmung ihrer Kopienzahl
zurückgehen.
Wegen seiner verbesserten Vektoreigenschaften (reduzierte
Größe, erhöhte Kopienzahl) wird vorzugsweise pPS4 als
Ausgangsplasmid für die Konstruktion von weiteren einfach
positiv selektiven Klonierungsvektoren verwendet. Zur
Variierung des Reporter-Gens werden zunächst die Derivate
pPS5 und pPS6 von pPS4 abgeleitet, indem sein amyA-Reporter-Gen
gegen das cmlR- bzw. nprA-Gen ausgetauscht wird.
Auch pPS3 bis pPS6 werden auf den Grad ihrer Selektivität und
Plasmidstabilität getestet und erweisen sich darin
vergleichbar mit pPS1 und pPS2.
Von einem einfach positiv selektiven Klonierungsvektor können
zweifach positiv selektive (schematische Darstellung
s. Abb. 1b) abgeleitet werden (Ausführungsbeispiel 4), indem
seine US2 deletiert, sein mlsS-Selektionsmarker in
Verlängerung der beiden IR's (IR, IR') dupliziert (mlsS,
mlsS') und ein Reporter-Gen als US2 innerhalb eines
symmetrischen Polylinkers am Ende des so verlängerten
DNA-Palindroms inseriert wird. Wie die PSMCS1 wirkt auch dieser
symmetrische Polylinker am gegenüberliegenden Ende des
DNA-Palindroms positiv selektiv und wird als positiv selektive,
multiple Klonierungsstelle genutzt, die in dieser Position,
stromabwärts zur Transkriptionsrichtung der beiden
Replikations-Gene und flankierend zur US2, als "positiv
selektive, multiple Klonierungsstelle 2" (PSMCS2) bezeichnet
wird. Die PSMCS2 enthält im Vergleich zur PSMCS1
unterschiedliche oder zumindest partiell unterschiedliche
Restriktaseschnittstellen, so daß beide nacheinander und
unabhängig voneinander für gentechnische Klonierungen nutzbar
sind. Als Ausgangsplasmid für diese Vektorkonstruktion wird
vorzugsweise ein einfach positiv selektiver Klonierungsvektor
ausgewählt, der in seiner US1 ein selektives Reporter-Gen
enthält und unter Selektionsdruck gegen das Reporter-Gen die
Isolierung von spontanen Deletionen im Bereich der US1 als
unerwünschte Derivate bei der Vektorkonstruktion weitgehend
ausschließen läßt. So wird bei Anwendung von pPS5 und des
amyA-Gens als Ausgangsplasmid bzw. Reporter-Gen der US2 ein
zweifach positiv selektiver Klonierungsvektor pPS8 (Abb. 5)
erzeugt, bei dem durch Restriktionsanalyse nur die
ausgeführten Klonierungen und keine unerwünschten
Strukturänderungen, insbesondere keine Änderungen der beiden
Resolvase- und Partition-Gene, feststellbar sind. Unerwartet
weist pPS8 jedoch eine stark erhöhte strukturelle und segrega
tive Plasmidinstabilität (5-10% Deletionsderivate bzw. 10
bis 60% plasmidfreie Segreganten nach 40 Generationen bei
Passagen ohne Selektionsdruck) auf, die zudem mit mehrfach
reduzierter Kopienzahl und deutlich reduziertem
Kolonienwachstum der Plasmidtransformanten korreliert ist und
dadurch die Nutzbarkeit von pPS8 als Klonierungsvektor
beeinträchtigt.
Zur Überwindung der Plasmidinstabilität bei zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektoren werden Varianten erprobt, die
ihre Konstruktionsweise, Struktur- und Selektionsmarker
betreffen (Ausführungsbeispiel 5). Ein mit pPS8 strukturell
vergleichbarer Klonierungsfaktor pPS9 wird unter Nutzung
eines nicht palindromen Ausgangsplasmids pSB587 (Abb. 6)
erzeugt, indem es in zwei unterschiedlichen Restriktase
schnittstellen (z. B. Bam HI und Pst I) seiner multiplen
Klonierungsstelle linearisiert wird und je zwei
Plasmidreplikons als IR und IR' mit den Reporter-Genen cmlR
und amyA (in Bam HI- bzw. Pst I-DNA-Fragmenten) als US1 bzw.
US2 innerhalb einer PSMCS1 bzw. PSMCS2 ligiert werden. Durch
diese alternative Konstruktionsweise wird bezweckt, daß mit
hoher Wahrscheinlichkeit zwei identische, in allen
Genfunktionen (Replikation, Resolvase, Partition,
Selektionsmarker) aktive Plasmidreplikons als IR und IR' an
der Bildung des DNA-Palindroms des zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektors pPS9 beteiligt sind und durch
Restriktionsanalyse nicht nachweisbare, kleine Änderungen des
Ausgangsplasmids (wie eventuell in pPS5) als Ursache für
Plasmidinstabilität ausgeschlossen werden können. Eine zweite
Konstruktionsvariante auf der Grundlage eines nicht palin
dromen Ausgangsplasmids geht von einem zu pSB587
unterschiedlichen Ausgangsplasmid pSB576 aus, und es wird ein
zweifach positiv selektiver Klonierungsvektor pPS10 erzeugt,
der sich von pPS8 und pPS9 in drei Merkmalen unterscheidet:
a) dupliziertes cmlR- (statt mlsS-) Gen als Selektionsmarker, b) Selektionsmarker in veränderter Position (benachbart zu den Replikations-Genen statt zu den Partitions-Genen), c) zwei aktive Replikations-Gene (reps und reps', statt je eines aktiven und inaktiven Replikations-Gens reps' bzw. reps497) und dadurch bedingte reduzierte Kopienzahl (wie in pPS1 bis pPS3). Wie für pPS8, werden auch für pPS9 und ppS10 mehrere (wenigstens 10) unabhängig voneinander isolierte Plasmide charakterisiert und alle als vergleichbar hoch instabil befunden. Soweit getestet, verhalten sich die zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren auch in zwei anderen Rezipientenstämmen instabil, die, ebenso wie der bisher verwendete Rezipientenstamm GSB26, der Stammfamilie B. subtilis 168 angehören. Da andererseits alle einfach positiven Klonierungsvektoren und die nicht palindromen Ausgangsplasmide der zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren sowie auch von diesen abgeleitete nicht palindrome, rekombinante Plasmide in den gleichen Rezipientenstämmen eine hohe bis extrem hohe Plasmidstabilität aufweisen, ist die hohe Plasmidinstabilität bei zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren offensichtlich auf ihre plasmidspezifischen Besonderheiten (bes. Duplikation ihres Selektionsmarkers) zurückzuführen.
a) dupliziertes cmlR- (statt mlsS-) Gen als Selektionsmarker, b) Selektionsmarker in veränderter Position (benachbart zu den Replikations-Genen statt zu den Partitions-Genen), c) zwei aktive Replikations-Gene (reps und reps', statt je eines aktiven und inaktiven Replikations-Gens reps' bzw. reps497) und dadurch bedingte reduzierte Kopienzahl (wie in pPS1 bis pPS3). Wie für pPS8, werden auch für pPS9 und ppS10 mehrere (wenigstens 10) unabhängig voneinander isolierte Plasmide charakterisiert und alle als vergleichbar hoch instabil befunden. Soweit getestet, verhalten sich die zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren auch in zwei anderen Rezipientenstämmen instabil, die, ebenso wie der bisher verwendete Rezipientenstamm GSB26, der Stammfamilie B. subtilis 168 angehören. Da andererseits alle einfach positiven Klonierungsvektoren und die nicht palindromen Ausgangsplasmide der zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren sowie auch von diesen abgeleitete nicht palindrome, rekombinante Plasmide in den gleichen Rezipientenstämmen eine hohe bis extrem hohe Plasmidstabilität aufweisen, ist die hohe Plasmidinstabilität bei zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren offensichtlich auf ihre plasmidspezifischen Besonderheiten (bes. Duplikation ihres Selektionsmarkers) zurückzuführen.
Während sich die bisher erfolglosen Versuche zur
Stabilisierung der zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektoren auf die Plasmide selbst beschränkt haben,
wird im folgenden der Rezipientenstamm mit in die
Stabilisierungsversuche einbezogen (Ausführungsbeispiel 6).
Es wird davon ausgegangen, daß die Plasmidstabilität nicht
nur durch Gen-Funktionen der Plasmide, sondern auch durch
noch unbekannte chromosomale Gen-Funktionen des
Rezipientenstammes bewirkt werden könnte, so daß eine
Plasmidstabilisierung sowohl durch Änderungen von
Gen-Funktionen des Plasmids als auch des Rezipientenstammes
möglich sein sollte. Entsprechend dem geringen Kenntnisstand
zur Genetik und zum molekularen Mechanismus der
Plasmidstabilität, insbesondere der segregativen
Plasmidstabilität (Williams and Thomas, 1992), wird eine
empirische Verfahrensweise angewendet, die von der
beobachteten Korrelation von Plasmidinstabilität zu einer
deutlich reduzierten Koloniegröße der Plasmidtransformanten
mit zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren ausgeht
und entsprechend voraussetzt, daß eine Plasmidstabilisierung
auch mit einer Normalisierung der Koloniegröße korreliert
sein könnte. Unerwartet erfolgreich verläuft die
Stabilisierung unter Nutzung des Ausgangsstammes GSB26 (pPS8)
bei Isolierung größerer Kolonien nach Wachstum unter
Selektionsdruck durch Erythromycin, von denen sich bis zu
20% als stabilisiert erweisen. Zwei unabhängig voneinander
isolierte, stabilisierte Derivate werden charakterisiert, und
als besonders bemerkenswerte und vorteilhafte Eigenschaft
wird bei beiden eine extrem hohe strukturelle und segregative
Plasmidstabilität ermittelt, die die der einfach positiv
selektiven Klonierungsvektoren im Rezipientenstamm B.
subtilis GSB26 noch weit übertrifft. So lassen sich unter
nicht selektiven Bedingungen erst nach mehr als 150
Generationen einzelne plasmidfreie Segreganten isolieren,
welche zunächst zur Lokalisierung der spontanen genetischen
Änderung genutzt werden, die zur Stabilisierung geführt hat.
Durch kreuzweise Plasmidtransformation (pPS8 in die
Segreganten, Plasmide aus den stabilisierten Derivaten in
GSB26) und Restriktionsanalysen wird nachgewiesen, daß die
stabilisierende Änderung ausschließlich im bakteriellen
Chromosom des Rezipientenstammes erfolgt ist und demnach auf
eine spontane chromosomale Mutation zurückzuführen ist.
Entsprechend erhalten die beiden stabilisierten Derivate die
Stammbezeichnung "B. subtilis GSB285 (pPS8)" und "B. subtilis
G5B287 (pPS8)", während die plasmidfreien Segreganten mit "B.
subtilis GSB285" bzw. "B. subtilis G5B287" bezeichnet werden.
Soweit überprüft, hat GSB285 auch einen vergleichbar extrem
hohen Stabilisierungseffekt auf den einfach positiv
selektiven Klonierungsvektor pPS4, so daß diese
Plasmidstabilisierung offenbar allgemeiner anwendbar ist. Ein
Stabilisierungseffekt ist dagegen nicht auf positiv selektive
Klonierungsvektoren und nicht palindrome Plasmide
feststellbar, die kein aktives Partition-Gen (parS)
enthalten, so daß die chromosomal kodierte
Plasmidstabilisierung in GSB285 (und G5B287) parS-Gen-
abhängig wirksam ist und demnach nur die segregative
Plasmidstabilität betrifft. Der geringe Aufwand zur
Stabilisierung und ihre Wiederholbarkeit sowie der hohe
Stabilisierungseffekt bieten gute Voraussetzungen zur
Anwendung des gleichen empirischen Verfahrens bei
Rezipientenstämmen anderer grampositiver Bakterien. Denkbar
wäre dadurch aber auch eine Klärung der molekularen Ursachen
der Stabilisierung und damit ein Beitrag zum molekularen
Mechanismus der segregativen Plasmidstabilität, so daß die
erfindungsgemäße empirische Methode durch ein theoretisch
begründetes Verfahren ersetzt werden könnte.
Wegen ihres hohen Stabilisierungseffektes ist es zweckmäßig,
im folgenden bevorzugt GSB285 oder G5B287 als
Rezipientenstämme für alle positiv selektiven
Klonierungsvektoren zu nutzen und vor allem für
anspruchsvolle Klonierungsvorhaben einzusetzen, die den
Rezipientenstamm stark belasten können. Als ein solches
Klonierungsvorhaben wird zunächst die Isolierung einer
genomischen Gen-Bank (Ausführungsbeispiel 7) von B.
amyloliquefaciens ausgeführt, wozu chromosomale Eco RI-Fragmente
in den einfach positiv selektiven Klonierungsvektor
pPS4 kloniert werden und GSB285 als Rezipientenstamm für
Plasmidtransformationen dient. Aus diesem Shotgun-Experiment
werden 100 Plasmidtransformanten charakterisiert, und als
besonders positives Ergebnis ist zu bewerten, daß alle
Plasmidtransformanten ausschließlich rekombinante Plasmide
und keine Deletionsderivate des Klonierungsvektors enthalten.
Dieses Ergebnis bestätigt die hohe Selektivität und
Plasmidstabilität des Wirts-Vektor-Systems GSB285 (pPS4). Zur
Länge der klonierten DNA-Fragmente wird ein Verteilungsmuster
ermittelt, das den gewählten experimentellen Bedingungen (Eco
RI-Spaltung der Donor-DNA, PEG-Protoplasten-Methode zur
Plasmidtransformation) zugunsten mittellanger DNA-Fragmente
entspricht. Als längste werden zwei gleiche ca. 20 kb-DNA-Fragmente
bestimmt und für erste Untersuchungen zur
Klonierungskapazität des Wirts-Vektor-Systems genutzt. Als
Auswirkung des langen DNA-Fragments in einem rekombinanten
Derivat GSB285 (pSB616) wird (wie häufig anzutreffen) eine
deutliche Reduzierung der Kopienzahl beobachtet, jedoch keine
Änderung hinsichtlich der extrem hohen Plamidstabilität.
Auf Grund der positiven Ergebnisse zur Isolierung einer Gen-Bank
für mittelgroße DNA-Fragmente (2 bis 6 kb) ist es
naheliegend, den stabilisierenden Rezipientenstamm GSB285
auch zur Isolierung einer Gen-Bank für große DNA-Fragmente
anzuwenden (Ausführungsbeispiel 8). Statt einer vollständigen
Restriktase-Spaltung, wie vorausgehend mittels Eco RI für
mittelgroße DNA-Fragmente, kann zur Erzeugung der großen
Donor-DNA-Fragmente eine partielle Restriktase-Spaltung
erfolgen, oder aber es wird vorzugsweise eine Restriktase zur
Erzeugung großer DNA-Fragmente, wie Not I oder Swa I,
genutzt, so daß die DNA-Fragmente in ihrer natürlichen
Struktur kloniert und anschließend die klonierten DNA-Fragmente
wieder als ganze aus den rekombinanten Plasmiden
isoliert werden können. Dadurch können auch große Operons
vollständig isoliert und weniger aufwendig einer
Charakterisierung und Nutzung zugänglich werden. Bei Nutzung
von - Not I kommt ein einfach positiv selektiver
Klonierungsvektor pPS7 zur Anwendung, der in beiden
Polylinkern seiner PSMCS1 je eine Not I-Schnittstelle
enthält. pPS7 wird von pPS4 abgeleitet, indem die Not
I-Schnittstellen mittels eines Eco RI-Not I-Sac I-Linkers und
des cmlR-Gens in die PSMCS1 von pPS4 inseriert werden. Bei
Not I-Klonierung und unter ansonsten gleichen experimentellen
Bedingungen wie zur vorausgegangenen Eco RI-Klonierung
erweist sich pPS7 als positiv selektiv, doch wird nur eine
geringe Transformantenhäufigkeit und keine deutliche
Größenzunahme der klonierten Not I-DNA-Fragmente im Vergleich
zu den Eco RI-DNA-Fragmenten erzielt. Es ist darum
zweckmäßig, die experimentellen Bedingungen zugunsten der
Klonierung von großen DNA-Fragmenten zu modifizieren.
Erfolgversprechend ist die Anwendung einer InGel-Methode zur
schonenden Isolierung und Ligation großer DNA-Fragmente, von
kompetenten Zellen oder der Elektroporationsmethode zur
ungehinderten Transformation von großen Plasmidderivaten und
eines Restriktions-Modifikationsdefekten (r⁻⁻m⁻)
Rezipientenstammes zur Vermeidung der Restriktion von
heterologen DNA-Fragmenten.
Auch zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren eignen
sich zur Isolierung von Gen-Banken, wobei die Klonierung von
nicht vorselektierten DNA-Fragmenten in beide oder
vorzugsweise in nur eine von beiden PSMCS's erfolgt. Bei
Klonierung von nicht vorselektierten DNA-Fragmenten in nur
eine PSMCS ist es denkbar, daß die zweite PSMCS ein bekanntes
Struktur- oder Regulations-Gen enthält, dessen Wechselwirkung
mit Genen der klonierten DNA-Fragmente ermittelt werden soll.
Weitere Möglichkeiten zur Anwendung von zweifach positiv
selektierten Klonierungsvektoren bestehen in der Klonierung
und stabilen Etablierung von je einem gleichen oder
unterschiedlichen Gen (oder Gen-Gruppen) in beiden PSMCS's,
die sich in ihren Gen-Funktionen vorteilhaft ergänzen oder
beeinflussen. Beispiele dazu werden im folgenden
(Ausführungsbeispiel 9) unter Anwendung des
Rezipientenstammes GSB285 sowie der Gene amyA und nprA
ausgeführt, die hier weniger als Reporter-Gene (wie oben),
sondern mehr als hochexprimierte, industriell genutzte
Produkt-Gene von Interesse sind. Ein Beispiel für je ein
gleiches hochexprimiertes Produkt-Gen in beiden PSMCS's wird
durch Klonierung des amyA-Gens in die PSMCS1 von pPS8
ausgeführt, wobei ein Plasmid ppS11 erzeugt wird. Durch eine
solche Gen-Duplikation des amyA-Gens wird bei gleicher
Kopienzahl die Gen-Dosis verdoppelt und unter geeigneten
Voraussetzungen (geringe Gen-Expression und Kopienzahl) kann
auch ein entsprechender Gen-Dosis-Effekt für die
Produktbildung erreicht werden. Wie zu erwarten (vgl.
Ausführungsbeispiel 3), wird im ausgeführten Beispiel durch
die Duplikation des amyA-Gens keine Steigerung der
Amylasebildung bewirkt, da diese Duplikation ein
hochexprimiertes Gen betrifft und bei hoher und im Vergleich
zum Ausgangsplasmid pPS8 unveränderter Kopienzahl erfolgt.
Ein überraschendes und für die Anwendung der zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektoren vorteilhaftes Ergebnis wird
aber insofern erzielt, als auch diese Plasmidderivate trotz
der zusätzlichen DNA-Homologie (bei anderen positiv
selektiven Klonierungsvektoren nur zwischen IR und IR', bei
pPS11 zusätzlich zwischen US1 und US2) eine unverändert
extrem hohe Plasmidstabilität (keine Plasmidinstabilität
nachweisbar nach 180 Generationen ohne Selektionsdruck)
aufweisen.
Ein Beispiel für je ein unterschiedliches, hochexprimiertes
Produkt-Gen in beiden PSMCS's eines zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektors wird durch Klonierung des
nprA-Gens in die PSMCS1 von pPS8 ausgeführt, wobei ein Plasmid
pPS12 (Abb. 7) erhalten wird. Bei vergleichbarer Kopienzahl
ist bei GSB285 (pPS12) im Unterschied zu GSB285 (ppS11) eine
geringe Plasmidinstabilität (0,4% Amy⁻ und 0,2% Npr⁻-Derivate
nach 140 Generationen ohne Selektionsdruck)
feststellbar, die offenbar auf eine höhere Streßwirkung durch
die Expression des nprA-Gens im Vergleich zum amyA-Gen und
dadurch bedingte Anreicherung von Deletionsderivaten und
Segreganten zurückgeht. Das Ergebnis läßt hingegen nicht
darauf schließen, daß GSB285 keine stabilisierende Wirkung
auf pPS12 ausübt: Eine bedeutende Plasmidstabilisierung durch
GSB285 im Vergleich zu dem nicht stabilisierenden
Ausgangsstamm GSB26 ist daran meßbar, daß bei GSB26 (pPS12)
schon nach 80 Generationen 80% Amy⁻-Derivate beobachtet
werden und G5B285 (pPS12) unter gleichen Bedingungen noch
keine Plasmidinstabilität erkennen läßt.
Für die Klonierung in zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren (wie in pPS8) ist es bemerkenswert, daß
eine vergleichbar hohe Selektivität wie bei einfach positiv
selektiven Klonierungsvektoren (vgl. Ausführungsbeispiel 1)
erzielt wird, unabhängig davon, ob in die PSMCS1 (wie zur
Erzeugung von pPS11 und pPS12) oder PSMCS2 kloniert wird. Bei
Klonierungen in beide PSMCS's ist es jedoch vorteilhaft,
diese aufeinanderfolgend auszuführen, so daß nur ein
Vektorfragment an der Ligation beteiligt ist. Anderenfalls
wird eine höhere Anzahl verschiedener Vektor- und Donor-DNA-Fragmente
miteinander ligiert, und es kommt dadurch zu einer
erhöhten Häufigkeit von unerwünschten Ligationsprodukten.
In der vorausgegangenen Beschreibung sind nur einige
Beispiele für Varianten von positiv selektiven
Klonierungsvektoren und Klonierungen ausgeführt, auf die sich
die Erfindung aber nicht beschränken soll. Weitere Varianten
sind u. a. durch Neukombination zwischen den schon
beschriebenen Klonierungsvektoren möglich, wofür in
vorteilhafter Weise interne Restriktaseschnittstellen des
DNA-Palindroms nutzbar sind. Diese gestatten nicht nur den
Austausch von Reporter-Genen (wie mittels der
Restriktaseschnittstellen der PSMCS's; s. Ausführungsbeispiel
1) und klonierten DNA-Fragmenten, sondern zusätzlich zu
diesen die sie flankierenden Teile des DNA-Palindroms, die
durch die Restriktaseschnittstellen begrenzt werden.
Besonders vorteilhaft sind dafür unikale
Restriktaseschnittstellen anwendbar, und bei Nutzung der Bcl
I- oder Spe I-Schnittstellen (s. Abb. 5) lassen sich z. B.
die duplizierten mlsS- oder cmlR-Gene aus pPS8 bzw. pPS10 als
Selektionsmarker zur Erzeugung von zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektoren oder auch die 52bps-Deletion
aus pPS4 (s. Ausführungsbeispiel 3) zur Steigerung der
Kopienzahl bei einfach und zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektoren übertragen. Denkbar wäre bei Nutzung der
Bcl I- und Spe I-Schnittstellen auch ein Austausch des
verkürzten DNA-Palindroms (s. Ausführungsbeispiel 2) gegen
das ursprünglich längere DNA-Palindrom, falls sich z. B. die
Verkürzung doch noch als nachteilig erweisen sollte.
Auch die bislang ausschließliche Nutzung von Plasmiden der
Inkompatibilitätsgruppe inc 18 und Rezipientenstämmen der
Stammlinie B. subtilis 168 soll nicht besagen, daß sich die
Erfindung auf solche Plasmide und B. subtilis oder die Gruppe
der grampositiven Bakterien beschränkt. Die beschriebene
Konstruktion von zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektoren geht zwar vorzugsweise von Plasmiden der
inc 18-Gruppe aus, die zudem auch schon ein DNA-Palindrom
enthalten, doch sind auch alle anderen Plasmide als
Ausgangsplasmide denkbar, die eine hinreichende
Plasmidstabilität, vor allem strukturelle Plasmidstabilität,
ermöglichen. Wie an den ausgeführten Beispielen pPS9 und
pPS10 gezeigt, können auch nicht palindrome Ausgangsplasmide
für die Konstruktion von zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektoren verwendet werden, und es wäre deshalb
denkbar, daß u. a. auch E. coli-Stämme und pBR322 und seine
Derivate als Rezipientenstämme bzw. Ausgangsplasmide dienen
könnten, die auf Grund ihrer Theta-Typ-Replikation eine
wesentliche Voraussetzung für strukturelle Plasmidstabilität
erfüllen.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der folgenden
Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Die Abbildungen zeigen in
Abb. 1 schematische Restriktionskarten für einfach (Abb.
1a) im Vergleich zu zweifach (Abb. 1b) positiv
selektiven Klonierungsvektoren
Abb. 2 die Restriktionskarte eines einfach positiv
selektiven Klonierungsvektors pPS1 mit einem amyA-
Reporter-Gen als US1 in der PSMCS1
Abb. 3 die Restriktionskarte eines verkleinerten, einfach
positiv selektiven Klonierungsvektors pPS3 mit
verkürztem DNA-Palindrom
Abb. 4 die Restriktionskarte eines einfach positiv
selektiven Klonierungsvektors pPS4 mit 10-fach
erhöhter Kopienzahl auf Grund einer 52bps-Deletion
in repS497
Abb. 5 die Restriktionskarte eines zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektors pPS8 mit einem cmlR-
und amyA-Reporter-Gen als US1 bzw. US2 in der
PSMCS1 bzw. PSMCS2
Abb. 6 die Restriktionskarte eines nicht palindromen
Plasmids pSB587 als Ausgangsplasmid zur Erzeugung
eines zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektors pPS9
Abb. 7 die Restriktionskarte eines zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektors pPS12 als Beispiel
für die Klonierung von je einem unterschiedlichen,
hochexprimierten Produkt-Gen in der PSMCS1 und
PSMCS2.
In den Abbildungen werden für die Genetik und Gentechnik
übliche Abkürzungen und Symbole verwendet. Für die Erfindung
häufige und spezifische Abkürzungen und Symbole sind im
Anhang 1 alphabetisch aufgeführt. Die IR's des DNA-Palindroms
sind durch eine breitere Kreislinie markiert. In positiv
selektiven Klonierungsvektoren als multiple
Klonierungsstellen (MCS) enthaltene Polylinker sind
symmetrisch angeordnet, und je eine gleiche MCS1 und MCS1'
sowie MCS2 und MCS2' an den beiden Enden des langen DNA-
Palindroms werden als positiv selektive, multiple
Klonierungsstelle 1 (PSMCS1) bzw. 2 (PSMCS2) genutzt. In den
Restriktionskarten sind nur solche Gene und
Restriktaseschnittstellen berücksichtigt, die für die
Erfindung wesentlich sind. Zusätzlich sind pro IR eines
verkürzten DNA-Palindroms (z. B. in pPS8) von den
gebräuchlichen Restriktasen für mittelgroße und große
DNA-Fragmente mehrere Restriktaseschnittstellen (1 × Avi II, 2 ×
Bbr PI, 1 × Bsi WI, 1 × Bsm I, 1 × Bst 1107 I, 5 × Cla I, 3 ×
Hind III, 3 × Mun I, 1 × Nhe I, 2 × Rca I, 3 × Sna BI, 6 ×
Ssp I, 1 × Swa I) enthalten, die bei Nutzung der PSMCS's zu
berücksichtigen sind.
Übliche Materialien und Methoden werden im folgenden nicht
detailliert beschrieben. Kenntnisse zur Kultivierung von
Bakterien, Stammselektion, Isolierung von chromosomaler DNA,
Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten, Restriktasespaltung von DNA,
Ligation von DNA-Fragmenten, Plasmidtransformation,
Elektrophorese und DNA-Sequenzanalyse werden vorausgesetzt
und sind durch Publikationen (Sambrook et al., 1989; Harwood
und Cutting, 1990; Nicholl, 1994) allgemein zugänglich.
Folgende spezielle Materialien und Methoden werden häufiger
verwendet:
Bakterienstamm B. subtilis GSB26 als Rezipientenstamm für
Plasmidtransformationen; abgeleitet (Steinborn und
Hofemeister, 1984) als spontane Streptomycin-resistente
Mutante von dem Amylase-defekten Stamm QB1133 sacA321 aroI906
metB5 amyE (Steinmetz et al., 1976) aus der Stammlinie B.
subtilis 168.
Plasmid pDB101 (19,2 kb; MLSr) als Ausgangsplasmid für die
Konstruktion von einfach und zweifach positiv selektiven
Klonierungsvektoren; Deletionsderivate (Behnke et al., 1969)
von dem Streptococcen-Plasmid pSM19035 der Inkompati
bilitätsgruppe inc18.
Plasmidvektor pSB355 (8,4 kb; Cmr MLSr) als nicht palindromer
Plasmidvektor mit multipler Klonierungsstelle zur
Reklonierung der Reporter-Gene amyA, cmlR und nprA;
abgeleitet (Steinborn, 1992) von dem Streptococcen-Plasmid
pGB354 (Behnke and Gilmore, 1981) der Inkompatibilitätsgruppe
inc18.
DNA-Isolierungen aus Stämmen von Bacillus:
- - chromosomale DNA und Plasmid-DNA in großem Maßstab nach den Methoden von Saito und Miura (1963) bzw. Gryczan et al. (1978)
- - Plasmid-DNA in kleinem Maßstab nach einer alkalischen Methode (Sambrook et al., 1989).
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen mittels QIAEX-Kit (QIAGEN-GmbH).
Bestimmung und Vergleich der Kopienzahl von Plasmiden in
Rezipientenstämmen von B. subtilis nach einer
Verdünnungsmethode (Brantl and Behnke, 1992). Als Referenz
dient das Plasmid pDB101 (5 Kopien pro Zelle).
PEG-Protoplasten-Methode (Chang und Cohen, 1979) zur
Plasmidtransformation in B. subtilis mit Modifikation der
Medien (Steinborn, 1988).
Kultivierung bei 37°C in flüssigem TBY-Vollmedium (1%
bactotryptone, Difco-0,5% yeast extract, Difco-0,5% NaCl;
pH 7,0) oder auf TBY-Agar (1,8% Agar-Agar). Zusatz von
essentiellen Aminosäuren zu 50 µg/ml.
Selektion auf plasmidkodierte Antibiotikaresistenz durch
Zusatz von 10 µg/ml Chloramphenicol (Cm) oder 5 µg/ml
Erythromycin (Em).
Nachweis der Bildung von plasmidkodierter, extrazellulärer
alpha-Amylase und neutraler Protease an Hand von Abbauhöfen
auf Agar-Platten mit Zusatz von 1% unlöslicher Maisstärke
bzw. 0,5 bis 1% Magermilchpulver. Bei verminderter
Agar-Schichtdicke und frühzeitiger Auswertung der Platten können
300 bis 400 Kolonien pro Platte ausgewertet werden.
Quantitative Bestimmung der Plasmidinstabilität nach 3 bis 14
Passagen (40 bis 180 Generationen, pro Passage 10-4 umgesetzt
und 12 h kultiviert) ohne Selektionsdruck durch Antibiotika
an Hand der Abwesenheit von Abbauhöfen auf nicht selektiven,
stärke- oder milchhaltigen Agar-Platten auf Grund des
Verlustes von plasmid-kodierter extrazellulärer alpha-Amylase
(Amy⁻) bzw. neutraler Protease (Npr⁻). Segregative und
strukturelle Plasmidinstabilität werden nach den Anteilen von
plasmidfreien Segreganten bzw. strukturell veränderten
Plasmidderivaten unterschieden. Strukturell veränderte
Plasmidderivate werden unter Amy⁻ und Npr⁻-Derivaten an Hand
von plasmidkodierter Antibiotikaresistenz (Cmr oder Emr)
selektiert.
Quantitative Bestimmung der alpha-Amylase-Aktivität in
Kulturüberständen mittels Spofa-alpha-Amylase-Testtabletten
(Slovakofarma, Hlohovec).
Ein einfach postitiv selektiver Klonierungsvektor pPS1 (Abb.
1) wird von einem palindromen Plasmid ppB101 abgeleitet,
indem das Ausgangsplasmid durch Bcl I und Kpn I gespalten
wird und das so erhaltene Bcl I-Fragment und eines der beiden
Bcl I-Kpn I-Fragmente, das einen Teil des Replikations-Gens
reps enthält, mit zwei komplementären Kpn I-Teilfragmenten
eines als Reporter-Gen genutzten amyA-Gens innerhalb eines
Ligationsgemisches ligiert werden. Das lange Bcl I-Fragment
enthält IR's eines langen DNA-Palindroms, und pPS1 wird nur
dann erzeugt, wenn a) je ein Bcl I-Kpn I-Fragment in
Verlängerung der beiden IR's ligiert und dadurch das
Replikations-Gen dupliziert (repS, repS') wird sowie b) beide
komplementäre Kpn I-Teilfragmente an einem ihrer beiden Enden
über die Gen-interne Kpn I-Schnittstelle zu einem aktiven
amyA-Gen und über gleiche Polylinker, die das zweite Ende der
komplementären Kpn I-Teilfragmente flankieren, mit den beiden
Replikations-Genen am Ende des DNA-Palindroms ligiert werden.
In dem Ausgangsplasmid pDB101 ist je ein aktives (reps) und
ein am 3'-Ende defektes Replikations-Gen enthalten. Bei der
Vektorkonstruktion geht die Duplikation des repS-Gens darauf
zurück, daß bei der Ligation je ein Teilfragment des aktiven
repS-Gens am Ende des Bcl I-Fragments mit je einem
komplementären Bcl I-Kpn I-Teilfragment in der Gen-internen
Bcl I-Schnittstelle zu je einem aktiven Replikations-Gen
ligiert werden. Auch die flankierenden Polylinker der beiden
komplementären Kpn I-Fragmente werden invertiert repetitiv
zueinander ligiert, so daß ein symmetrischer Polylinker
erzeugt wird, der in dieser Position, am Ende eines langen
DNA-Palindroms und stromaufwärts zur Transkriptionsrichtung
der Replikations-Gene positiv selektiv wirksam ist und als
"positiv selektive, multiple Klonierungsstelle 1" (PSMCS1)
bezeichnet wird. Die beiden komplementären Kpn I-Teilfragmente
des amyA-Reporter-Gens mit flankierenden
Polylinkern werden aus einem nicht palindromen Plasmid
pSB441/1 und pSB441/3 isoliert, in denen das amyA-Gen in
unterschiedlicher Transkriptionsrichtung innerhalb eines
langen Polylinkers inseriert ist. Mittels Kpn I werden das
amyA-Gen und der Polylinker Gen-intern bzw. endständig
gespalten und je ein komplementäres Teilfragment mit gleichem
Polylinker aus beiden Donorplasmiden zur Ligation verwendet.
Die Plasmide pSB441/1 und pSB441/3 werden durch Reklonierung
des amyA-Gens mittels Bcl I-Bam HI-Zweifachspaltung aus einem
rekombinanten Plasmid pSB6 (Steinborn und Hofemeister, 1984)
in die mittelständige Bgl II-Schnittstelle des Polylinkers
eines nicht palindromen Plasmidvektors pSB355 (Steinborn,
1992) erzeugt. Bei solcher Position des Reporter-Gens in
einer mittelständigen Restriktaseschnittstelle (wie für Bgl
II) im Polylinker der Donorplasmide können aus den gleichen
Donorplasmiden Reporter-Gene mit zwei unterschiedlichen
symmetrischen Polylinkern isoliert werden, wenn alternativ
der eine oder andere Teil des Polylinkers der Donorplasmide
als flankierender Polylinker der Teilfragmente genutzt wird.
Die Klonierung wird experimentell ausgeführt, indem das Bcl
I-Kpn I-Fragment und die beiden komplementären Kpn I-Fragmente
im Vergleich zum Bcl I-Fragment in 2-facher
Konzentration zur Ligation eingesetzt werden und das
Ligationsgemisch in den Rezipientenstamm B. subtilis GSB26
transformiert wird. Plasmidtransformationen werden an Hand
plasmidkodierter Erythromycinresistenz (Emr) und
Amylasebildung (Amy⁺) selektiert und bei diesen mittels
Restriktionskartierung solche Plasmidderivate als pPS1
ermittelt, die der Restriktionskarte in Abb. 2 entsprechen.
Bei zwei unabhängigen Versuchen werden im Vergleich zu
anderen Klonierungen eine deutlich geringere (1/30)
Transformantenhäufigkeit erzielt und unter den EmrAmy⁺-
Transformanten nur ein geringer Anteil (1/3) GSB26(pPS1)-Transformanten
ermittelt. Das Ergebnis ist dadurch zu
erklären, daß mehrere unterschiedliche DNA-Fragmente zugleich
an der Ligation beteiligt sind und dadurch ein hoher Anteil
unerwünschter und auch replikationsunfähiger
Ligationsprodukte erzeugt wird. Die Erzeugung und Isolierung
von pPS1 wird in Anbetracht der komplexen Ligation offenbar
nur dadurch ermöglicht, daß das Bcl I-Kpn I-Fragment
gerichtet ligiert wird, die Ligationen zu den aktiven
Replikations-Genen und zum aktiven amyA-Gen essentiell bzw.
phänotypisch an Hand von Verdauungshöfen nachweisbar sind und
die Klonierung in mehreren Restriktaseschnittstellen (in
beiden Bc I- und in zwei Kpn I-Schnittstellen) positiv
selektiert wird.
Ein einfach positiv selektiver Klonierungsvektor pPS2 wird
als Derivat von pPS1 abgeleitet, indem sein amyA-Reporter-Gen
gegen ein cmlR-Gen für Chloramphenicolresistenz (Cmr) aus
einem Plasmid pGB354 ausgetauscht wird. Dazu werden zwei
komplementäre Teilfragmente des cmlR-Gens in die PSMCS1
kloniert, die jeweils an einem Fragmentende eine Gen-interne
Bst E II-Schnittstelle enthalten und am anderen Fragmentende
durch einen gleichen Polylinker flankiert werden. Bei
Selektion auf Cmr und Emr werden GSB26(pPS2)-Transformanten
mit hoher Häufigkeit isoliert, und ihre Identität wird durch
ihr Restriktionsmuster bestätigt. Die komplementären
Teilfragmente des cmlR-Gens werden durch Bst EII-Xba
I-Zweifachspaltung aus nicht palindromen Plasmiden pSB521 und
pSB522 isoliert, in denen das cmlR-Gen in unterschiedlicher
Transkriptionsrichtung innerhalb eines langen Polylinkers
inseriert ist.
Als wesentliche Merkmale werden bei pPS1 und pPS2 ihre
Selektivität, d. h. ihre Effektivität zur positiven Selektion
von gentechnischen Klonierungen, und ihre Plasmidstabilität
charakterisiert. Die Selektivität wird ermittelt, indem pPS1
und pPS2 durch Xba I (oder eine andere Restriktase für eine
Schnittstelle der PSMCS1) möglichst vollständig gespalten,
das amyA-Gen-Fragment aus pPS1 und das Vektorfragment aus
pPS2 isoliert und beide Fragmente ligiert werden. Nach
Transformation des Ligationsgemisches in GSB26 wird auf Emr
selektiert und die Selektivität am Verhältnis von Amy⁺ zu
Amy⁻-Transformanten gemessen. Bei äquimolarem Verhältnis von
Donor- zu Vektorfragment (1,5 mg in 30 µl-Ligationsgemisch)
werden 98% Amy⁺-Transformanten und damit eine auch für die
routinemäßige Anwendung hinreichend hohe Selektivität
erreicht. Plasmide aus Amy⁺-Transformanten sind mit pPS1
vergleichbar, während solche aus Amy⁻-Transformanten als
verkleinerte Deletionsderivate oder als pPS2 identifiziert
werden, wobei die Reisolierung von pPS2 auf eine
unvollständige Exzision des cmlR-Gens bei der
Fragmentisolierung zurückgeht. Unter den gewählten
experimentellen Bedingungen (10 ml-Rezipientenstamm-Kultur,
E470 = 2,5; transformierte Protoplasten plattiert auf 10
DM3-Regenerationsplatten) werden ca. 100 Transformanten pro
Platte erzielt.
Die Plasmidstabilität wird bei Passagen in Flüssigkulturen
ohne Selektionsdruck durch Antibiotika und vorzugsweise für
GSB26(pPS1)-Plasmidtransformanten ermittelt, bei denen eine
Plasmidinstabilität wenig aufwendig an Hand von Kolonien ohne
Amylaseverdauungshof auf nicht selektiven, stärkehaltigen
Agar-Platten nachgewiesen werden kann. Erst nach 6 Passagen
(80 Generationen) werden 0,1 bis 1% Amy⁻-Derivate ermittelt,
die auch als Erythromycin-sensibel (Ems) und plasmidfrei
identifiziert werden und deshalb auf eine geringe segregative
Plasmid-instabilität zurückzuführen sind.
Von pPS1 wird ein verkleinerter, einfach positiv selektiver
Klonierungsvektor pPS3 (Abb. 3) mit verkürztem DNA-Palindrom
abgeleitet, der sich von pPS1 durch die Deletion von je einem
2231 bps-Cla I-Fragment in einer nicht essentiellen Region
beider IR's (von Cla I,2872 bis 5103 und Cla I,11087 bis
13318; s. Abb. 2) unterscheidet. pPS3 wird über Deletion
eines nicht palindromen Plasmids pSB468 konstruiert, und
pSB468 wird von pPS1 abgeleitet, indem pPS1 mittels Hpa I
gespalten wird, die Hpa I-Fragmente selbstligiert werden und
Plasmid-transformanten auf EMr selektiert werden. pSB468 wird
als ein 9,08 kb-Plasmid isoliert und entspricht dem Hpa
I-Fragment von Hpa I,13389 über Pvu II,1 bis Hpa I,8589 aus
pPS1 (vgl. Abb. 2). Ein durch Deletion von Cla I,2872 bis Cla
I,5103 (s. Abb. 1) verkürztes Plasmidderivat pSB472 wird von
pSB468 abgeleitet, indem pSB468 mittels Cla I partiell
gespalten wird, im Vergleich zum linearisierten Plasmid
pSB468 wenig (d. h. um ca. 2 kb) verkürzte Cla I-Fragmente
isoliert und selbstligiert werden sowie Plasmidtransformanten
wieder auf Emr selektiert werden. Auf Grund mehrerer (6)
Cla I-Restriktaseschnittstellen in pSB468 werden entsprechend
verschiedene Deletionsderivate isoliert, unter denen pSB472
an Hand typischer Restriktionsmuster identifiziert wird. pPS3
wird schließlich auf der Grundlage des verkürzten, nicht
palindromen Plasmids pSB472 rekonstruiert, indem aus pSB472
das 4,89 kb-Hpa-Fragment isoliert, mit dem das amyA-Reporter-Gen
enthaltenden Hpa I-Fragment (US1) und dem das mlsS-Gen
enthaltenden Spe I-Fragment (US2) aus pPS1 ligiert und
Plasmidtransformanten auf EmrAmy⁺ selektiert werden. Auch
pPS3 wird aus mehreren, unabhängig voneinander isolierten
Transformanten isoliert und an Hand von Restriktionsmustern
entsprechend Abb. 3 identifiziert.
Auf Grund eines größeren Amylase-Verdauungshofes und
reduzierter Koloniegröße wird ein einfach positiv selektiver
Klonierungsvektor pPS4 als spontanes Derivat von pPS3
isoliert, das im Vergleich zu pPS3 bei unveränderter
Plasmidgröße eine 5- bis 10-fache Kopienzahl (50/Zelle)
aufweist. Bei Retransformation von pPS4 in den
Rezipientenstamm GSB26 werden ausschließlich
Plasmidtransformanten mit gleich stark erhöhter Kopienzahl
erhalten, so daß die erhöhte Kopienzahl auf eine Mutation im
Plasmid und nicht im bakteriellen Chromosom des
Rezipientenstammes zurückzuführen ist. Da durch
Restriktionsanalysen bei pPS4 keine strukturellen Änderungen
nachweisbar sind, werden Funktionsanalysen ausgeführt, wozu
ein kreuzweiser Austausch von Bcl I- und Spe I-Fragmenten
zwischen pPS3 und pPS4 erfolgt. Dabei läßt sich das Merkmal
der erhöhten Kopienzahl mit dem kleinen Bcl I-Fragment aus
pPS4 transferieren, wodurch die Position der ursächlichen
Mutation auf dieses Fragment eingegrenzt werden kann. Zur
genaueren Lokalisierung der Mutation wird ein zusätzlicher
Polylinker in nur einen von beiden Polylinkern der PSMCS1 von
pPS4 inseriert, so daß ein partiell asymmetrischer Polylinker
erzeugt wird. Dadurch können die Teilfragmente der beiden
Replikations-Gene repS und repS' von den beiden Bcl
I-Schnittstellen bis zu den Polylinkern der modifizierten
PSMCS1 getrennt als Bcl I-Pst I- bzw. Sac I-Fragment isoliert
und charakterisiert werden. Bei Komplementationstesten
(Austausch eines entsprechenden Fragments in einem nicht
palindromen Plasmid pSB587, Abb. 6, gegen das Bcl I-Pst
I-oder Bcl I-Sac I-Fragment aus pPS4 und Test auf
Replikationsfähigkeit) wird für das Bcl I-Sac I-Fragment eine
unveränderte Funktionsfähigkeit, für das Bcl I-Pst-Fragment
dagegen Inaktivität nachgewiesen. Das Ergebnis läßt darauf
schließen, daß in pPS4 je ein aktives Replikations-Gen repS'
und ein mutiertes, inaktives Replikations-Gen repS,
bezeichnet mit repS497, vorliegt und die erhöhte Kopienzahl
bei pPS4 auf die Inaktivierung eines der beiden Replikations-Gene
zurückzuführen ist. Zur molekularen Charakterisierung
der inaktivierenden Mutation werden die Bcl I-Sac I- und Bcl
I-Pst I-Fragmente in üblicher Weise in einem Plasmidvektor
pUC18 und Rezipientenstamm E. coli XL1 Blue kloniert und die
so erhaltenen rekombinanten Plasmide pSBS71 und pSBS72 zur
Sequenzierung der Fragmente verwendet. Im Unterschied zum Bcl
I-Sac I-Fragment wird für das Bcl I-Pst I-Fragment eine
52bps-Deletion (bps - 339 bis - 391, bezogen auf Pvu II, 1;
Abb. 3) im Promotor P II des Replikations-Gens repS497
ermittelt, so daß seine Gen-Inaktivität auf den Ausfall
seiner Transkription zurückgeht.
Bei Langzeitkultivierung (bis 72 h) in einem industriell
genutzten HKM-Medium [2,5% Maisstärke - 0,75%
Weizenfeinschrot - 2,1% Sojaschrot - 0,5% yeast extract,
Difco - 0,8% (NH4)2 HPO4 - 0,1% KCl - 0,05% MgSO4.7 H2O;
pH7] wird bei GSB26 (pPS4) im Vergleich zu anderen
rekombinanten Stämmen untersucht, ob und in welchem Grade die
erhöhte Kopienzahl von pPS4 einen Gen-Dosis-Effekt des hoch
exprimierten amyA-Gens auf die plasmidkodierte Amylasebildung
hat. Unter gleichen experimentellen Bedingungen (37°C, 10 ml-
Kulturen in 50 ml Steilbrustflaschen, 10-2 aus TBY-Kulturen
in der frühen stationären Phase umgesetzt) wird für GSB26
(pPS4) im Vergleich zu GSB26 (pPS3) eine bis (nach 72 h
Kultivierung) 3-fach erhöhte Amylaseaktivität gemessen, wobei
diese Gen-Dosis-bedingte Steigerung der Produktbildung auf
hohem Expressionsniveau erfolgt. Eine gleich hohe Steigerung
der Amylasebildung wird auch gegenüber nicht palindromen
rekombinanten Plasmiden beobachtet, für die eine mit pPS4
vergleichbare Kopienzahl ermittelt wurde.
Durch Variierung des Reporter-Gens in der PSMCS1 werden von
pPS4 weitere (verkleinerte) einfach positiv selektive
Klonierungsvektoren pPS5 und pPS6 mit erhöhter Kopienzahl
abgeleitet, indem sein amyA-Reporter-Gen gegen das cmlR-Gen
bzw. ein hochexprimiertes nprA-Gen für extrazelluläre
neutrale Protease von B. amyloliquefaciens ausgetauscht wird.
Dazu werden das cmlR-Gen mittels Xba I (oder einer anderen
Restriktase für eine Restriktaseschnittstelle der PSMCS1) aus
pPS2 rekloniert und das nprA-Gen (wie die amyA- und cmlR-Reporter-Gene
zur Konstruktion von pPS1 bzw. pPS2) aus zwei
komplementären Teilfragmenten mit einer endständigen
Gen-internen Restriktaseschnittstelle und flankierenden Poly
linkern am anderen Fragmentende rekonstruiert. Die EcoRV-Xba
I-Teilfragmente des nprA-Gens werden aus einem nicht
palindromen Plasmid pSB429/2 und pSB429/5 isoliert, in denen
das nprA-Gen in unterschiedlicher Transkriptionsrichtung
innerhalb eines langen Polylinkers inseriert ist. pSB429/2
und pSB429/5 werden durch Reklonierung des nprA-Gens mittels
Bcl I aus einem rekombinanten Plasmid pSB92 (Steinborn, 1988)
in die mittelständige Bgl II-Schnittstelle des Polylinkers im
Plasmidvektor pSB355 erhalten.
Auch pPS3, pPS4, pPS5 und pPS6 werden auf Selektivität und
Plasmidstabilität im Rezipientenstamm GSB26 getestet und
erweisen sich darin vergleichbar mit pPS1 (s.
Ausführungsbeispiel 1).
Ein zweifach positiv selektiver Klonierungsvektor pPS8 (Abb.
5) wird von dem einfach positiv selektiven Klonierungsvektor
pPS5 abgeleitet, indem pPS5 mittels Spe I und Hpa I zweifach
gespalten wird und das so erhaltene große Spe I-Fragment
(11,03 kb) und eines der beiden Spe I-Hpa I-Fragmente (1,97
kb), das einen Teil des parS-Gens und den mlsS-Selektionsmarker
enthält, mit einem Sma I-Fragment (2,44 kb)
ligiert werden, das mit dem amyA-Reporter-Gen in einem
symmetrischen Polylinker inseriert ist. Analog zu pPS1
(Ausführungsbeispiel 1) wird pPS8 erzeugt, wenn a) je ein Spe
I-Hpa I-Fragment in Verlängerung der beiden IR's ligiert und
dadurch das parS-Gen (wie schon im Ausgangsplasmid) und der
mlsS-Selektionsmarker dupliziert (parS, parS' bzw. mlsS,
mlsS') werden sowie b) das amyA-Reporter-Gen am Ende des
DNA-Palindroms als US2 kloniert wird. Die Selektion erfolgt auf
CmrEmrAmy⁺, und auf Grund der komplexen Ligation (wie schon
für pPS1) und der Beteiligung von Fragmenten mit Hpa I- und
Sma I-"blunt"-Enden an der Ligation werden GSB26
(pPS8)-Transformanten mit geringer Häufigkeit isoliert. Der die US2
flankierende symmetrische Polylinker wirkt positiv selektiv
und wird in dieser Position als "PSMCS2" bezeichnet. In pPS8
unterscheiden sich die PSMCS1 und PSMCS2 nur partiell in
einigen Restriktaseschnittstellen, die für schrittweise und
unabhängige Klonierungen in beide PSMCS's nutzbar sind.
Mittels Pst I wird das nprA-Reporter-Gen aus der PSMCS1 von
pPS6 in die PSMCS2 von pPS8 kloniert und dabei für diese
PSMCS2 ein gleich hoher Grad der Selektivität wie für die
PSMCS1 der einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren (s.
Ausführungsbeispiel 1) gefunden.
Im Unterschied zu den einfach positiv selektiven
Klonierungsvektoren werden bei GSB26 (pPS8) eine deutlich
erhöhte Plasmidinstabilität (5-10% Deletionsderivate und
10-60% plasmidfreie Segreganten nach 40 Generationen ohne
Selektionsdruck) und zugleich eine drei- bis fünffache
Reduzierung der Kopienzahl und Koloniegröße nachgewiesen, die
die Nutzung von pPS8 als Klonierungsvektor beeinträchtigen.
pPS8 wird auch in die Rezipientenstämme B. subtilis PG594
(Steinmetz et al., 1976) und QB99 (Dedonder et al., 1977)
transformiert und verhält sich in diesen vergleichbar
instabil.
Alternativ zur Konstruktionsweise von pPS8 werden zur
Erzeugung der zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren
pPS9 und pPS10 nicht palindrome Plasmide als Ausgangsplasmide
verwendet. Ein mit pPS8 strukturell vergleichbarer
Klonierungsvektor pPS9 wird auf der Grundlage eines nicht
palindromen Plasmids pSB587 (Abb. 6) konstruiert, das durch
Insertion eines Polylinkers als multiple Klonierungsstelle in
das Plasmid pSB472 (s. Ausführungsbeispiel 2) erhalten wird
und alle essentiellen (reps, mlsS) und für die
Plasmidstabilität (resS, parS) notwendigen Plasmid-Gene
enthält. pSBS87 wird in den Bam HI- und Pst I-Schnittstellen
seiner multiplen Klonierungsstelle zweifach gespalten, so daß
linearisierte, vollständige Plasmidreplikons mit
unterschiedlichen, endständigen Restriktaseschnittstellen
(Bam HI, Pst I) erhalten werden. Diese werden mit den
Reporter-Genen cmlR und amyA ligiert, die als Bam HI- bzw.
Pst I-Fragmente mit flankierenden, symmetrischen Polylinkern
aus pPS8 oder anderen positiv selektiven Klonierungsvektoren
isoliert werden. GSB26(pPS9)-Transformanten werden auf
CmrEmrAmy⁺ selektiert und pPS9 nach Maßgabe der
Restriktionskarte in Abb. 5 identifiziert.
pPS10 wird unter Nutzung eines nicht palindromen
Ausgangsplasmids pSB576 erzeugt, das von pSB472 durch
Austausch des mlsS-Gens gegen das cmlR-Gen als
Selektionsmarker und Insertion eines Polylinkers abgeleitet
wird. Restriktasespaltungen und Ligation erfolgen wie zur
Konstruktion von pPS9, außer der Nutzung des nprA-Gens statt
des cmlR-Gens als Reporter-Gen, wozu das nprA-Gen als Bam HI-Fragment
mit symmetrischem Polylinker aus pPS6 isoliert wird.
GSB26(pPS10)-Transformanten werden auf CmrAmy⁺Npr⁺ selektiert
und nach dem zu erwartenden Restriktionsmuster identifiziert.
pPS9 und pPS10 erweisen sich ebenso positiv selektiv wie
andere positiv selektive Klonierungsvektoren, sind jedoch
auch ebenso instabil, korreliert mit reduzierter Kopienzahl
und Koloniegröße, wie pPS8 im Rezipientenstamm GSB26 und
dadurch in ihrer Nutzbarkeit als Klonierungsvektoren
beeinträchtigt.
Zur Überwindung der deutlich erhöhten Plasmidinstabilität bei
zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren wird eine
empirische Verfahrensweise genutzt, die von der beobachteten
Korrelation (s. Ausführungsbeispiele 4 und 5) der Plasmid
instabilität zu einer deutlich reduzierten Koloniegröße bei
Plasmidtransformanten von GSB26 mit zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektoren ausgeht. Unter der Annahme,
daß umgekehrt eine Plasmidstabilisierung auch mit einer
Normalisierung der Koloniegröße korreliert sein könnte,
werden von GSB26(pPS8) größere EmrAmy⁺-Kolonien isoliert und
auf Plasmidstabilität getestet. Solche Isolierungen erfolgen
unter unterschiedlichen Bedingungen (von selektiven, Em-
haltigen oder nicht selektiven Agar-Platten; ohne Passagen
oder nach Passagen mit oder ohne Em-Selektionsdruck). Als
erfolgreich erweist sich die Isolierung von selektiven
Platten, und nach 8 Passagen unter Em-Selektionsdruck können
bis zu 20% stabilisierte Derivate isoliert werden. Zwei
unabhängig voneinander isolierte stabilisierte Derivate
werden eingehender charakterisiert, und als eine besonders
bemerkenswerte Eigenschaft wird bei beiden eine extrem hohe
Plasmidstabilität ermittelt, die die der einfach positiv
selektiven Klonierungsvektoren im Rezipientenstamm GSB26
deutlich übertrifft. Unter nicht selektiven Bedingungen
lassen sich erst nach mehr als 150 Generationen einzelne
plasmidfreie Segreganten mit einer Häufigkeit von 0,05%
nachweisen. Je eine Segregante der stabilisierten Derivate
wird zur Lokalisierung der spontanen genetischen Änderung als
Ursache der Stabilisierung genutzt, die sowohl im Plasmid als
auch im bakteriellen Chromosom des Rezipientenstammes erfolgt
sein kann. Kreuzweise werden dazu pPS8 in die Segreganten und
Plasmide aus den stabilisierten Derivaten im GSB26
transformiert und die erhaltenen Plasmidtransformanten auf
Plasmidstabilität getestet. Dabei wird festgestellt, daß
allein von den Segreganten, nicht aber von den Plasmiden, die
stabilisierende Wirkung ausgeht und diese Stabilisierung
deshalb auf eine chromosomale Mutation des Rezipientenstammes
zurückgeht. Entsprechend werden die stabilisierten Derivate
mit "GSB28S(pPS8)" und "GSB287(pPS8)" und die Segreganten mit
"GSB285" bzw. "GSB287" bezeichnet. Soweit getestet, hat
GSB285 auch einen vergleichbar hohen Stabilisierungseffekt
auf den einfach positiv selektiven Klonierungsvektor pPS4,
nicht jedoch auf positiv selektive Klonierungsvektoren und
nicht palindrome Plasmide, die kein parS-Gen enthalten.
Zur Isolierung einer genomischen Gen-Bank für mittelgroße
DNA-Fragmente in dem stabilen Wirts-Vektor-System,
GSB285(pPS4) (s. Ausführungsbeispiel 6) werden Plasmid-DNA
von pPS4 und chromosomale DNA von B. amyloliquefaciens
ATCC23844 mittels hochkonzentrierter Eco RI (40 U/µl)
möglichst vollständig gespalten und das isolierte
Vektorfragment (ohne amyA-Reporter-Gen) von pPS4 mit
gespaltener chromosomaler Gesamt-DNA ligiert. In einem 40 µl-Gemisch
kommen 1,1 µg Vektorfragmente und 0,8 µg
chromosomale Fragmente zur Ligation, das Ligationsgemisch
wird in Protoplasten (0,5 ml Protoplasten von 10 ml-Kultur,
E470 = 2,5) von GSB285 transformiert, Transformanten werden
auf Emr selektiert (24 DM3-Regenerationsplatten).
Plasmidtransformanten werden mit hoher Häufigkeit (400 bis
500 Transformanten pro Platte) isoliert und von diesen 100
charakterisiert. Bei allen Plasmidtransformanten, bezeichnet
mit GSB285(pSB615)1 bis 100, werden ausschließlich
rekombinante Plasmide und keine Deletionsderivate des
Klonierungsvektors pPS4 nachgewiesen. Nach Eco RI-Spaltung
der rekombinanten Plasmide wird für die klonierten Fragmente
das folgende Verteilungsmuster ihrer Größen ermittelt: < 2
kb, 23%, 2 bis 6 kb, 58%, < 6 kb, 18%. Als größte der
klonierten DNA-Fragmente enthalten zwei
Plasmidtransformanten, GSB285(psB615)62 und GSB285(psB615)73,
je ein gleiches 20 kb-Fragment, dessen Einfluß auf die
Plasmidstabilität getestet wird. Dazu wird das amyA-Gen in
das 20 kb-Fragment inseriert, so daß Plasmidinstabilität
wieder wenig aufwendig an Hand der Abwesenheit von
Amylaseverdauungshöfen nachgewiesen werden kann. So erhaltene
Derivate GSB285(pSB616)2, 12 und 18 (je zwei
Parallelkulturen) lassen bei Passagen ohne Selektionsdruck
nach 120 Generationen noch keine Plasmid-instabilität (gesamt
4,8 × 104 getestete Kolonien, Plasmidinstabilität ≦ 0,002%)
erkennen. Die Kopienzahl ist in GSB285(pSB615) und
GSB285(psB616) auf 1/3 reduziert.
Ein endständiges "s" wird im Text zur Kennzeichnung des Plurals
verwendet
(z. B. bps, PSMCS's, IR's).
amyA Gen für extrazelluläre alpha-Amylase (von Bacillus amyl ol iquefaciens ATCC23844)
Amy⁺ Bildung von extrazellulärer alpha-Amylase
bp Basenpaar
Cm Chloramphenicol
Cmr Resistenz gegen Chloramphenicol
cmlR Gen für Resistenz gegen Chloramphenicol (von einem Plasmid pGB354)
Em Erythromycin (ein Macrolid-Antibiotikum)
Emr Resistenz gegen Erythromycin
IR invertiert repetitive DNA-Sequenz
Kb Kilobase
MCS multiple Klonierungsstelle
MLS Macrolid-Lincosamid- und Streptogramin-B-Typ- Antibiotika
MLSr Resistenz gegen MLS-Antibiotika
mlsS Gen für Resistenz gegen MLS-Antibiotika
nprA Gen für extrazelluläre neutrale Protease (von B. amyloliquefaciens ATCC23844)
Npr⁺ Bildung von extrazellulärer neutraler Protease
parS Partition-Gen (von einem Plasmid pDB101)
PSMCS positiv selektive, multiple Klonierungsstelle
resS Resolvase-Gen (von einem Plasmid pDB101)
US unikale DNA-Sequenz
amyA Gen für extrazelluläre alpha-Amylase (von Bacillus amyl ol iquefaciens ATCC23844)
Amy⁺ Bildung von extrazellulärer alpha-Amylase
bp Basenpaar
Cm Chloramphenicol
Cmr Resistenz gegen Chloramphenicol
cmlR Gen für Resistenz gegen Chloramphenicol (von einem Plasmid pGB354)
Em Erythromycin (ein Macrolid-Antibiotikum)
Emr Resistenz gegen Erythromycin
IR invertiert repetitive DNA-Sequenz
Kb Kilobase
MCS multiple Klonierungsstelle
MLS Macrolid-Lincosamid- und Streptogramin-B-Typ- Antibiotika
MLSr Resistenz gegen MLS-Antibiotika
mlsS Gen für Resistenz gegen MLS-Antibiotika
nprA Gen für extrazelluläre neutrale Protease (von B. amyloliquefaciens ATCC23844)
Npr⁺ Bildung von extrazellulärer neutraler Protease
parS Partition-Gen (von einem Plasmid pDB101)
PSMCS positiv selektive, multiple Klonierungsstelle
resS Resolvase-Gen (von einem Plasmid pDB101)
US unikale DNA-Sequenz
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Claims (37)
1. Einfach und zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren auf der Grundlage der
replikationshemmenden Wirkung eines langen DNA-Palindroms in
Plasmiden sowie der Replikationsfähigkeit von
palindromhaltigen Plasmiden bei Unterbrechung des
DNA-Palindroms durch unikale DNA-Sequenzen und Nutzung dieser
konditionalen Replikationsfähigkeit in Plasmidvektoren zur
positiven Selektion und Steigerung der Effektivität von
gentechnischen Klonierungen in Rezipientenstämmen von
Bakterien,
dadurch gekennzeichnet, daß
- - zwei gleiche Plasmidreplikons als invertiert repetitive DNA-Sequenzen des DNA-Palindroms genutzt werden und dieses an seinen beiden Enden durch je eine unikale DNA-Sequenz unterbrochen wird
- - die beiden invertiert repetitiven DNA-Sequenzen an einem Ende oder beiden Enden mit symmetrischen Polylinkern abschließen und diese als positiv selektive, multiple Klonierungsstellen in entsprechend einfach bzw. zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren Anwendung finden
- - bei einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren der Selektionsmarker zur Selektion auf Plasmidtransformation in einer von beiden unikalen DNA-Sequenzen enthalten ist, so daß nur das andere Ende des DNA-Palindroms zur positiven Selektion nutzbar ist
- - bei zweifach positiv selektiven Klonierungsvektoren der gleiche Selektionsmarker in beiden invertiert repetitiven DNA-Sequenzen des DNA-Palindroms enthalten ist und dadurch beide Enden des DNA-Palindroms zur positiven Selektion nutzbar sind
- - in zweifach positiv selektiven Plasmidvektoren die beiden positiv selektiven, multiplen Klonierungsstellen zueinander unterschiedlich sind und aufeinanderfolgend für die positive Selektion von gentechnischen Klonierungen genutzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein
stabiles oder zumindest strukturell stabiles Plasmid als
Ausgangsplasmid für die Konstruktion von positiv selektiven
Klonierungsvektoren verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß vorzugsweise ein Plasmid pDB101 oder ein vergleichbares
Plasmid als Ausgangsplasmid verwendet wird, das
natürlicherweise ein langes DNA-Palindrom enthält und auf
Grund seiner Theta-Typ-Replikation sowie Resolvase- und
Partition-Gen-Funktionen eine hohe strukturelle und
segregative Plasmidstabilität ermöglicht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß stabile, einfach positiv selektive Klonierungsvektoren
von pDB101 abgeleitet werden, indem seine unikale DNA-Sequenz
1 mit Teilen des DNA-Palindroms deletiert, sein Replikations-Gen
repS in Verlängerung der invertiert repetitiven
DNA-Sequenzen des DNA-Palindroms dupliziert und zwischen den
Enden der invertiert repetitiven DNA-Sequenzen, stromaufwärts
zur Transkriptionsrichtung der beiden, durch Duplikation
erhaltenen Replikations-Gene repS und repS', ein Reporter-Gen
als unikale Sequenz 1 innerhalb eines symmetrischen
Polylinkers inseriert wird, so daß der symmetrische
Polylinker am Ende des DNA-Palindroms als positiv selektive,
multiple Klonierungsstelle wirksam ist und diese entsprechend
ihrer flankierenden Position zur unikalen Sequenz 1 als
"positiv selektive, multiple Klonierungsstelle 1" bezeichnet
wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet,
daß bei der Konstruktion von einfach positiv selektiven
Klonierungsvektoren ein mlsS-Selektionsmarker für Resistenz
gegen MLS-Antibiotika, der in der unikalen DNA-Sequenz 2 von
pDB101 und nicht als Insert innerhalb einer positiv
selektiven, multiplen Klonierungsstelle enthalten ist, zur
Selektion auf Plasmidtransformation genutzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet,
daß ein hoch exprimiertes amyA-Gen für extrazelluläre
alpha-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens als Reporter-Gen der
unikalen Sequenz 1 genutzt und so ein einfach positiv
selektiver Klonierungsvektor pPS1 erhalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet,
daß ein cmlR-Gen für Antibiotikaresistenz gegen
Chloramphenicol aus einem Plasmid pGB354 als Reporter-Gen der
unikalen Sequenz 1 genutzt und so ein einfach positiv
selektiver Klonierungsvektor pPS2 erhalten wird.
8. Verfahren nach Anspruch 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Größe von positiv selektiven Klonierungsvektoren
reduziert wird, indem ihr DNA-Palindrom innerhalb einer
nichtessentiellen Region verkürzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet,
daß ein einfach positiv selektiver Klonierungsvektor pPS3 mit
verkürztem DNA-Palindrom von pPS1 abgeleitet wird, indem
durch Hpa I-Spaltung ein palindromfreies Plasmid pSB468
isoliert und von diesem durch partielle Cla I-Spaltung ein
Deletionsderivat pSB472 abgeleitet wird, dessen verkürztes
Spe I-Bcl I-Fragment als invertiert repetitive DNA-Sequenz
zur Rekonstruktion des verkürzten DNA-Polindroms von pPS3
dient.
10. Verfahren nach Anspruch 6, 7 und 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Kopienzahl bei positiv selektiven
Klonierungsvektoren erhöht wird, indem eines ihrer beiden
Replikations-Gene, repS oder repS', inaktiviert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 und 10, dadurch
gekennzeichnet, daß ein einfach positiv selektiver
Klonierungsvektor pPS4 mit 10-fach erhöhter Kopienzahl als
spontanes Derivat von pPS3 isoliert wird, in dem das repS-Gen
zu einem inaktiven Gen repS497 mutiert ist, so daß in pPS4
nur noch das repS'-Gen aktiv ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die Inaktivität des Gens repS497 in pPS4
auf eine S2bps-Deletion in der Region seines Promoters pII
zurückgeht.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
Varianten von einfach positiv selektiven Klonierungsvektoren
mit verkürztem DNA-Palindrom und erhöhter Kopienzahl von pPS4
abgeleitet werden, indem sein amyA-Reporter-Gen der unikalen
Sequenz 1 durch ein anderes Reporter-Gen ersetzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
das cmlR-Gen oder ein hoch exprimiertes nprA-Gen für
extrazelluläre neutrale Protease von Bacillus
amyloliquefaciens als Reporter-Gen der unikalen Sequenz 1
verwendet und dadurch ein Klonierungsvektor pPS5 bzw. pPS6
von pPS4 abgeleitet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
das cmlR-Gen als Reporter-Gen und ein Eco RI-Not I-Sac I-Linker
genutzt werden und dadurch ein Klonierungsvektor pPS7
von pPS4 abgeleitet wird, der in seiner positiv selektiven,
multiplen Klonierungsstelle 1 Not I-Schnittstellen zur
Klonierung von großen DNA-Fragmenten enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren konstruiert werden, indem sie von einfach
positiv selektiven Klonierungsvektoren abgeleitet oder in
alternativer Weise aus nichtpalindromen Plasmiden
rekonstruiert werden.
17. Verfahren nach Anspruch 14 und 16, dadurch
gekennzeichnet, daß ein zweifach positiv selektiver
Klonierungsvektor pPS8 von dem einfach positiv selektiven
Klonierungsvektor pPS5 abgeleitet wird, indem seine unikale
Sequenz 2 mit Teilen des DNA-Palindroms deletiert, sein
Selektionsmarker mlsS in Verlängerung der invertiert
repetitiven DNA-Sequenz des DNA-Palindroms dupliziert und
zwischen den Enden der invertiert repetitiven DNA-Sequenz,
stromaufwärts zur Transkriptionsrichtung der beiden, durch
Duplikation erhaltenen Selektionsmarker mlsS und mlsS', ein
amyA-Reporter-Gen als unikale Sequenz 2 innerhalb einer
positiv selektiven, multiplen Klonierungsstelle 2 inseriert
wird, die sich in der Spezifität ihrer Restriktase-
Schnittstellen von der positiv selektiven, multiplen
Klonierungsstelle 1 unterscheidet.
18. Verfahren nach Anspruch 16 und 17, dadurch
gekennzeichnet, daß in alternativer Weise ein zweifach
positiv selektiver Klonierungsvektor pPS9, der ebenfalls je
einen mlsS-Selektionsmarker pro invertiert repetitiver
DNA-Sequenz des DNA-Palindroms enthält, durch Rekonstruktion aus
einem nicht palindromen Plasmid pSB587 erhalten wird, indem
das Plasmid in zwei unterschiedlichen
Restriktaseschnittstellen, z. B. Bam HI und Pst I, seines als
multiple Klonierungsstelle genutzten Polylinkers linearisiert
wird und zwei linearisierte Plasmidreplikons als invertiert
repetitive DNA-Sequenzen mit den Reporter-Genen cmlR und amyA
innerhalb einer positiv selektiven, multiplen
Klonierungsstelle 1 bzw. 2 als unikale Sequenz 1 bzw. 2
ligiert werden.
19. Verfahren nach Anspruch 16 und 18, dadurch
gekennzeichnet, daß ein zweifach positiv selektiver
Klonierungsvektor pPS10, der je ein cmlR-Gen als
Selektionsmarker pro invertiert repetitive DNA-Sequenz des
Palindroms enthält, in analoger Weise aus dem
nichtpalindromen Plasmid pSB576 rekonstruiert wird und dabei
das nprA- und amyA-Gen als Reporter-Gene der unikalen Sequenz
1 bzw. 2 genutzt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 18 und 19, dadurch
gekennzeichnet, daß die nichtpalindromen Plasmide pSB576 und
pSB587 von pSB472 abgeleitet werden.
21. Verfahren nach Anspruch 1, 5 und 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in positiv selektiven Klonierungsvektoren
anstelle der Selektionsmarker mlsS und cmlR andere
Selektionsmarker Anwendung finden und wegen ihrer
Unbedenklichkeit auch nutritive Selektionsmarker genutzt
werden.
22. Verfahren nach Anspruch 1, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18
und 19, dadurch gekennzeichnet, daß gentechnische
Klonierungen mittels der positiv selektiven
Klonierungsvektoren ausgeführt werden, indem ein als unikale
DNA-Sequenz genutztes Reporter-Gen mittels einer Restriktase
innerhalb einer positiv selektiven, multiplen
Klonierungsstelle exzidiert und durch klonierte DNA-Fragmente
ersetzt wird, wobei die Exzision der unikalen DNA-Sequenz
durch den Verlust des Reporter-Gens angezeigt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 1 und 22, dadurch
gekennzeichnet, daß gentechnische Klonierungen in positiv
selektive Klonierungsvektoren allein auf Grund der
Replikationsfähigkeit der rekombinanten Plasmide selektiert
werden und bis zu 98% Plasmidtransformanten mit
rekombinanten Plasmiden isoliert werden.
24. Verfahren nach Anspruch 1, 17, 18 und 19, dadurch
gekennzeichnet, daß bei Nutzung von zweifach positiv
selektiven Klonierungsvektoren gentechnische Klonierungen in
beide positiv selektive, multiple Klonierungsstellen
vorteilhafterweise aufeinanderfolgend und unabhängig
voneinander ausgeführt werden.
25. Verfahren nach Anspruch 1 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, daß rekombinationsfähige Stämme von
grampositiven Bakterien, vorzugsweise ein Stamm B. subtilis
GSB26 aus der Stammlinie Bacillus subtilis 168, als
Rezipientenstämme für Plasmidtransformationen eingesetzt und
Plasmidtransformanten mittels des Selektionsmarkers der
Klonierungsvektoren selektiert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 1 und 25, dadurch
gekennzeichnet, daß einfach und zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren in dem Rezipientenstamm B. subtilis GSB26
eine geringe bzw. erhöhte Plasmidinstabilität aufweisen und
deshalb stabilisierende Rezipientenstämme isoliert und
eingesetzt werden.
27. Verfahren nach Anspruch 1 und 26, dadurch
gekennzeichnet, daß von B. subtilis GSB26 spontane,
stabilisierende Derivate B. subtilis GSB285 und GSB287
isoliert und eingesetzt werden, die bei einfach und zweifach
positiv selektiven Klonierungsvektoren eine sehr hohe
Plasmidstabilität bewirken.
28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 27, dadurch
gekennzeichnet, daß positiv selektive Klonierungsvektoren
vorzugsweise für die Isolierung von Gen-Banken genutzt
werden.
29. Verfahren nach Anspruch 11, 27 und 28, dadurch
gekennzeichnet, daß unter Nutzung von pPS4, der Restriktase
EcoR I und des Rezipientenstammes Bacillus subtilis GSB285
eine genomische Gen-Bank von Bacillus amyloliquefaciens
isoliert wird, die überwiegend mittelgroße DNA-Fragmente
enthält.
30. Verfahren nach Anspruch 1 und 27 bis 29, dadurch
gekennzeichnet, daß in einem rekombinanten Derivat GSB285
(pSB615) ein 20 kb-Fragment als größtes Fragment der EcoR I-Gen-Bank
ermittelt wird, das jedoch trotz seiner
überdurchschnittlichen Größe auch nach Langzeitkultivierung
(< 150 Generationen) keine Plasmidinstabilität verursacht.
31. Verfahren nach Anspruch 11 und 27 bis 29, dadurch
gekennzeichnet, daß unter Nutzung von pPS4 und bei partieller
Spaltung mittels einer Restriktase für kleine oder
mittelgroße DNA-Fragmente, wie EcoR I, oder vorzugsweise
unter Nutzung von pPS7 und einer Restriktase für große
DNA-Fragmente, wie Not I, sowie eines stabilisierenden
Rezipientenstammes eine Gen-Bank isoliert wird, die
vorwiegend große DNA-Fragmente enthält.
32. Verfahren nach Anspruch 1, 6, 7, 9, 11, 14 und 21,
dadurch gekennzeichnet, daß einfach positiv selektive
Klonierungsvektoren, vorzugsweise solche mit erhöhter
Kopienzahl, auch zu einer Erhöhung und Modifikation der
Produktbildung genutzt werden.
33. Verfahren nach Anspruch 11, 25 und 32, dadurch
gekennzeichnet, daß pPS4 in dem Rezipientenstamm Bacillus
subtilis GSB26 zur erhöhten Produktbildung von
extrazellulärer α-Amylase genutzt wird und auf Grund der
erhöhten Kopienzahl von pPS4 in einem industriell genutzten
Medium HKM auf hohem Expressionsniveau eine dreifach erhöhte
Amylasebildung erzielt wird, die bei vergleichbarer
Kopienzahl auch die durch nicht palindrome Plasmide kodierte
Amylasebildung mehrfach übertrifft.
34. Verfahren nach Anspruch 1, 17, 18, 19, 27 und 32,
dadurch gekennzeichnet, daß zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren in dem Rezipientenstamm GSB285 zur
Klonierung eines gleichen Produkt-Gens innerhalb beider
positiv selektiver, multipler Klonierungsstellen genutzt
werden, so daß seine Gen-Dosis verdoppelt und dadurch eine
zusätzliche Erhöhung der Produktbildung ermöglicht wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß
innerhalb der positiv selektiven, multiplen Klonierungsstelle
1 von pPS8 das cmlR-Reporter-Gen gegen das amyA-Gen
ausgetauscht und so ein Plasmid pPS11 mit je einem hoch
exprimierten amyA-Gen innerhalb beider positiv selektiven,
multiplen Klonierungsstellen erhalten und dadurch die
Gen-Dosis des amyA-Gens verdoppelt wird.
36. Verfahren nach Anspruch 1, 17, 18, 19, 27 und 32,
dadurch gekennzeichnet, daß zweifach positiv selektive
Klonierungsvektoren in dem Rezipientenstamm GSB285 zur
Klonierung von je einem unterschiedlichen Gen innerhalb
beider positiv selektiven, multiplen Klonierungsstellen
genutzt werden, so daß sich beide Gene in ihrer
Produktbildung oder anderen Funktionen vorteilhaft ergänzen
oder beeinflussen.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß
innerhalb der positiv selektiven, multiplen Klonierungsstelle
1 von pPS8 das cmlR-Reporter-Gen gegen das nprA-Gen
ausgetauscht und so ein Plasmid pPS12 erhalten wird, das in
beiden Klonierungsstellen je ein unterschiedliches, hoch
exprimiertes Produkt-Gen enthält.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996154841 DE19654841A1 (de) | 1996-12-31 | 1996-12-31 | Zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996154841 DE19654841A1 (de) | 1996-12-31 | 1996-12-31 | Zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19654841A1 true DE19654841A1 (de) | 1998-07-02 |
Family
ID=7816470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1996154841 Ceased DE19654841A1 (de) | 1996-12-31 | 1996-12-31 | Zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19654841A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000003009A2 (de) * | 1998-07-10 | 2000-01-20 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendung |
-
1996
- 1996-12-31 DE DE1996154841 patent/DE19654841A1/de not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000003009A2 (de) * | 1998-07-10 | 2000-01-20 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendung |
| WO2000003009A3 (de) * | 1998-07-10 | 2000-05-04 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendung |
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