DE69333534T2

DE69333534T2 - Thermosensitive plasmide

Info

Publication number: DE69333534T2
Application number: DE69333534T
Authority: DE
Inventors: Alexandra Gruss; Emmanuelle Maguin
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1993-03-12
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2013-03-13
Also published as: PT631626E; ATE267869T1; DK0631626T3; JPH07504567A; CA2131984A1; JP2004166712A; EP0631626A1; DE69333534D1; AU3756493A; US5919678A; JP3573347B2; FR2688515B1; CA2131984C; EP0631626B1; US6025190A; WO1993018164A1; FR2688515A1; ES2220907T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Plasmid, welches für die genetische Modifikation von Bakterien mit positiver Gram-Färbung, insbesondere Milchsäurebakterien, welche einen industriellen oder medizinischen Nutzen aufweisen, eingesetzt werden kann.
Sie betrifft gleichfalls Bakterien, die ein solches Plasmid enthalten. Sie betrifft schließlich genetische Modifizierungsverfahren, welche ein solches Plasmid einsetzen, entweder um ein normalerweise in dem Bakterienchromosom vorhandenes Gen zu inaktivieren oder um ein Gen von Interesse einzuführen und zu exprimieren.
Zahlreiche Gram-Bakterien mit positiver Gram-Färbung sind Forschungsgegenstände als biologisches Modell (beispielsweise die Bakterien der Gattung Bacillus), als Fermentationstamm von industriellem Nutzen (Milchsäurebakterien) oder als Pathogen (beispielsweise Clostridien, Listerien, Staphylococcus, Streptococcus). Viele dieser Stämme sind aus einem physiologischen Gesichtspunkt charakterisiert, es wurden aber nur wenige genetisch untersucht oder modifiziert. Die Untersuchung oder die Modifizierung der Stämme kann durch die Verwendung von Vektoren, welche gesteuerte oder nicht-spezifische Insertionen in das Bakterienchromosom erlauben, vereinfacht werden. Abgabesysteme, welche auf nicht-replikativen Vektoren basieren, sind auf die Bakterien beschränkt, die mit einer hohen Frequenz transformiert werden können, und jene, die allein unter bestimmten Bedingungen aktive Replikons verwenden, sind oftmals auf ihr Wirtsspektrum begrenzt. Auch erfordert die Konstruktion von rekombinanten Stämmen einen bedeutenden Aufwand und kann wirkungsvoll lediglich bei bestimmten speziellen Mikroorganismen angewendet werden.
Das Hinzufügen, der Verlust oder die Modifizierung von Genen kann die Rolle eines Organismus in einem industriellen Prozess, wie der Fermentation, umwandeln.
Die Biotechnologie strebt an, die industrielle Verwendung von Mikroorganismen zu vereinfachen. Beispielsweise werden die Milchsäurebakterien in der Agrarwirtschaft, hauptsächlich für die Herstellung von vergorenen Milchprodukten, aber auch außerhalb des Milch-Kontexts für die Herstellung von Wein, Apfelwein, Fleisch- und Wurstwaren und Silage eingesetzt.
Es ist folglich besonders wünschenswert, über wirksame Mittel zur Einführung oder zur spezifischen und definitiven Modifizierung von bestimmten Genen in diese(n) Organismen zu verfügen.
Aktuell erfolgt die Modifizierung des Chromosoms bei den Milchsäurebakterien durch das Zwischenglied eines Systems durch Transformation mittels eines nicht-replikativen Plasmids. Es ist notwendig, dass in einem einzigen Schritt zwei Ereignisse von geringer Häufigkeit, die Transformation durch ein Plasmid und eine Rekombination in das Chromosom, stattfinden. Die Wahrscheinlichkeit, diese beiden Ereignisse in einem einzigen Schritt zu erhalten, ist das Produkt der Wahrscheinlichkeiten von jedem; folglich besteht eine sehr geringe Chance, die Modifizierung zu erzielen.
Das Plasmid pWV01 ist ein kryptisches Plasmid, welches erstmals bei Lactococcus lactis Subsp. cremoris isoliert worden ist; es handelt sich um ein Plasmid mit breiter Wirtsspezifität, welches sich zugleich in grampositiven und gramnegativen Bakterien, insbesondere in E. coli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Streptococcus und Lactobacillus, repliziert. Es wurde charakterisiert und seine Nukleotidsequenz wurde von Leenhouts et al. (1991) veröffentlicht.
In der Anmeldung WO 85/03495 werden große Fragmente dieses Plasmids eingesetzt, um ein rekombinantes Plasmid pGK12, welches durch das Erythromycin-Resistenzgen und/oder das Chloramphenicol-Resistenzgen (die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)) markiert ist, zu konstruieren. Dieses Plasmid pGK12 kann nicht eingesetzt werden, um Integrationen in das Bakterienchromosom vorzunehmen.
Die bis heute verwendeten nicht-replikativen Plasmide erlauben es, dieses Problem zu beheben, aber dieses System erfordert hohe Transformationsgrade, um den Nachweis von Ereignissen von geringer Häufigkeit, wie der Transposition oder der Rekombination in das Chromosom, zu erlauben; außerdem ist der größte Teil der Milchsäurebakterien nur schlecht transformierbar.
Die Gesamtheit dieser Schwierigkeiten könnte dank der Gewinnung eines wärmesensitiven Replikons, welches als Abgabevektor in Bakterien, Milchsäurebakterien oder anderen, einsetzbar ist, überwunden werden.
Die Plasmide pE194 und PSH71 wurden als oberhalb einer Temperatur von 51°C natürlich wärmesensitiv beschrieben (J. Bacteriol., 1990, 172, 4543–4548).
Aus diesem Grunde hat die Erfindung einen bakteriellen Plasmidvektor des Typs, welcher einen in grampositiven Bakterien wirksamen Replikationsstartpunkt aufweist, zum Gegenstand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er wenigstens umfasst:

– ein Markergen, welches in einem bakteriellen Wirtsstamm exprimiert wird,
– ein wirksames Replikationssystem, welches ab einer Temperatur, welche mit der Lebensfähigkeit des Wirtsstamms verträglich ist, wärmesensitiv (Ts) ist,

Die Tatsache, dass das erfindungsgemäße Plasmid bei 37°C nicht replikativ ist, macht dieses besonders geeignet in dem Falle, wo die Bakterien eine relativ niedrige Vermehrungstemperatur aufweisen oder wenn ein bedeutender Wärmeschock nicht wünschenswert ist. Das erfindungsgemäße Plasmid kann allein verwendet werden, es muss nicht mit einem anderen Plasmid kombiniert werden. Da die Hemmung der Replikation oder Replikationsinhibition durch Temperaturen über ungefähr 37°C erfolgt, handelt es sich nicht um einen abhängigen Stamm. Es weist ein breites Wirtsspektrum auf und kann insbesondere in den klassischen Stämmen etabliert werden, welche zu der Gruppe gehören, umfassend: Bacillus, Ente rococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Listeria, Pediococcus, Staphylococcus, Clostridia, Leuconostoc, E. coli. Unter jenen kann man als Beispiel die folgenden Spezies aufführen: B. subtilis, E. faecalis, L. fermentum, L. helveticus, L. bulgaricus, L. lactis, S. pyogenes, S. thermophilus, S. sanguis, L. monocytogenes.
Das erfindungsgemäße Plasmid trägt wenigstens ein Gen, welches einen Selektionsmarker kodiert, wie auch die für dessen Expression erforderlichen Elemente, wie Promotor, Ribosomen-Bindungsstelle, Terminationssequenzen u.s.w. Selektionsgene sind beispielsweise Resistenzgene gegen Antibiotika (Erythromycin, Chloramphenicol) oder solche, die die Vermehrung auf einem Medium, welchem bestimmte Elemente fehlen, erlauben.
Das Markergen wird im Falle einer Rekombination in das Chromosom integriert.
Unter Replikationssystem versteht man ein System, welches einen Replikationsstartpunkt wie auch das Protein, welches sein Funktionieren induziert, umfasst; dieses Protein wird oberhalb einer Temperatur, welche das Replikationssystem hemmt, inaktiviert.
Ein solches Plasmid repliziert sich bei 28°C in einer großen Anzahl von Bakterien normal. Bei einer Temperatur über ungefähr 35°C ist die Replikation dieses Plasmids gehemmt; diese die Replikation des Plasmids hemmende Temperatur ist relativ niedrig und erlaubt die normale Multiplikation und Vermehrung des größten Teils der Bakterien, insbesondere der Milchsäurebakterien. Die für die wirksame Inaktivierung dieses Plasmids empfohlene Temperatur beträgt 37°C.
Gemäß einem ihrer Aspekte hat die Erfindung einen Plasmidvektor zum Gegenstand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er das größte ClaI-Fragment des Plasmids pWV01, welches wenigstens eine Mutation in der Thal-Rsal-Region aufweist, enthält.
Insbesondere weist ein Plasmidvektor mit wärmesensitiver Replikation gemäß der Erfindung wenigstens eine Mutation in der Regi on, welche RepA des Plasmids pWV01 entspricht, auf. Das Protein RepA wird durch eines der 4 offenen Leseraster (ORF), welche auf pWV01 identifiziert worden sind, ORFA, kodiert und ist für die Replikation erforderlich.
Bevorzugte Mutationen dieses Plasmids finden sich an den Positionen 972, 977, 980 und 987 der Nukleotidsequenz von pWV01.
Das durch das erfindungsgemäße Plasmid kodierte RepA-Protein weist bezogen auf den Wildtyp die in der 3 angegebenen Modifikationen auf, nämlich den Ersatz von:

– Ser durch Asn,
– Asp durch Asn,
– Val durch Ile,
– Arg durch Gln.

Ein solches Plasmid bilden einen Suizidvektor mit breiter Wirtsspezifität eines bis heute auf dem Gebiet der Milchsäurebakterien einzigartigen Typs.
Tatsächlich erlaubt es, die Integration in das Chromosom in zwei Schritte zu zerlegen. In dem ersten Transformationsschritt wird das Plasmid in der Zelle etabliert. In dem zweiten Schritt wird das Ereignis der Integration in das Chromosom durch Erhöhung der Temperatur selektioniert. Man kann so Bakterien, die dafür bekannt sind, schlecht transformierbar zu sein, genetisch modifizieren.
Erfindungsgemäße Plasmide umfassen insbesondere eine der Sequenzen, die in einer der 9, 10 oder 11 angegeben sind, oder eine Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie zu diesen Sequenzen aufweist.
Die so entwickelten genetischen Werkzeuge (Tools) erlauben es, Gene in das Bakterienchromosom einzuführen und darin zu stabilisieren.
Man trifft beispielsweise die Wahl, ein Verfahren durch homologe Rekombination anzuwenden.
Dafür setzt man ein wärmesensitives Replikon gemäß der Erfindung ein, welches außerdem wenigstens ein DNA-Fragment umfasst, welches zu der chromosomalen DNA des Bakteriums, welches man zu modifizieren wünscht, homolog ist.
Gemäß einem ihrer Aspekte hat die Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung eines Gens, welches in dem Chromosom eines Bakteriums vorhanden ist, zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass:

a) man in das Bakterium durch Transformation das erfindungsgemäße Plasmid einführt,
b) man das Bakterium auf selektivem Medium bei einer Temperatur unter der Hemmungstemperatur des Replikationsstartpunkts kultiviert,
c) man die Kultivierungstemperatur auf eine Temperatur über der Hemmungstemperatur erhöht,
d) man die nach mehreren Vermehrungszyklen bei der Hemmungstemperatur der Plasmidreplikation überlebenden Bakterien gewinnt.

Der Schritt d) erlaubt es, die Bakterien zu selektieren, welche den Plasmidmarker tragen.
Das in das Plasmid klonierte chromosomale Fragment kann einem präzisen Gen entsprechen, welches durch die Integration des Plasmids auf der Ebene der chromosomalen Kopie des Gens inaktiviert wird. In der Bakterienpopulation wird allein diese Integrationsstelle gefunden.
Bei einer anderen Ausführungsweise könnte die in dem Plasmid vorhandene bakterielle DNA in einer Bank von chromosomalen Fragmenten für die Klonierung ausgewählt werden und es wird eine zufällige Integration stattfinden; die Integrationsstelle des Plasmids unterscheidet sich von einem Bakterium zum anderen und man führt so die Mutagenese aus.
Das Verfahren kann gleichfalls auf ein wärmesensitives Replikon, welches ein Transposon trägt, angewendet werden. Man verfügt ü ber verschiedene Transposons, um das Chromosom zu mutagenisieren.
Das Ts-Plasmid wird als Träger für eines dieser Transposons, welches gegebenenfalls modifiziert ist, so dass es in L. lactis aktiv ist, eingesetzt. Jedes Transposon trägt ein Markergen (z.B.: Resistenzgen). Indem man das zuvor beschriebene Protokoll (a bis c) anwendet, erhält man Zellen, welche das Transposon in ihre Chromosomen integriert haben. Man selektiert diese Zellen mittels des Markers des Transposons. In dem Falle der Transposition wird das Plasmid nicht in das Chromosom integriert.
Bei einer Variante umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor gleichfalls einen Mobilisierungs-Genort, welcher eine Konjugation erlaubt. Dieser Mobilisierungs-Genort ist vorzugsweise der Genort ori T, welcher aus einem Plasmid von grampositiven Bakterien extrahiert wird, der vorzugsweise aus einem Plasmid von Streptococcus extrahiert werden kann. Der Plasmidvektor, der diesen Genort trägt, kann mobilisiert und durch Konjugation in nicht-transformierbare Bakterienspezies transferiert werden.
Das Verfahren zur Inaktivierung eines Gens in einem Bakterium lässt dann die folgenden Schritte stattfinden:

a) man führt in das Bakterium durch Konjugation ein erfindungsgemäßes Plasmid ein, welches einen Mobilisierungs-Genort und ein zu dem Chromosom homologes Fragment und/oder ein Transposon trägt,
b) man kultiviert das Bakterium auf selektivem Medium bei einer Temperatur unterhalb der Hemmungstemperatur des Replikationsstartpunkts,
c) man erhöht die Kultivierungstemperatur auf eine Temperatur oberhalb der Hemmungstemperatur,
d) man gewinnt die nach mehreren Vermehrungszyklen bei der Hemmungstemperatur der Plasmidreplikation überlebenden Bakterien.

Die am Ende von Schritt d) erhaltenen Bakterien haben ein Rekombinations- oder Transpositionsereignis durchlaufen und tragen den Marker des Transposons oder des Plasmids.
Bei einer Variante umfasst der erfindungsgemäße Plasmidvektor gleichfalls ein in E. coli aktives Replikon. Der diesen Genort tragende Plasmidvektor und dessen Derivate können in E. coli vermehrt werden. Die in E. coli hergestellten und bei 37°C (dank des zweiten Replikons) vermehrten Konstrukte können dann in die Milchsäurebakterien, in denen nur das Ts-Replikon aktiv sein wird, transferiert werden.
In den oben beschriebenen Verfahren lässt man nach der Einführung des Plasmidvektors in das Bakterium durch Transformation oder Konjugation in Schritt a) das Plasmid sich in der Bakterienpopulation durch Replikation bei 28–30°C etablieren.
Der Selektionscharakter wird in der Gesamtheit der Bakterien exprimiert. Wenn die Temperatur über 35°C ansteigt, wird das Plasmid in freier Form unfähig, sich zu replizieren, und geht folglich während der Zellteilungen verloren. Nur die Bakterien, bei denen dieses Plasmid sich durch Rekombination in das Chromoson integriert hat oder bei denen das Transposon sich in das Chromosom integriert hat, bewahren und übertragen die genetische Information, die das Plasmid oder das Transposon trägt und die es diesen erlaubt, sich auf selektivem Medium zu vermehren. Man selektiert so auf die Integrationsereignisse von geringer Häufigkeit, indem die Bakterien, die sich bei 35–37°C auf selektivem Medium vermehren, gewinnt.
Wenn das Plasmid in das Chromosom integriert ist, weist es eine hervorragende Stabilität auf, die nach 75 Fortpflanzungen bei 37,5°C in der Größenordnung von 99% liegen kann.
Das für die Integration des Plasmids durch homologe Rekombination verfolgte Schema wird in der 6 veranschaulicht.
Der Stamm L. lactis VE 6002, welcher das erfindungsgemäße Plasmid pVE6002 enthält, wurde bei der nationalen Sammlung des Institut Pasteur, 25–28 rue du Docteur Roux, Paris, unter der Nummer I-1179 hinterlegt.
Gemäß einem anderen ihrer Aspekte hat die Erfindung ein Verfahren, welches die Einführung eines heterologen Gens in ein Bakterium erlaubt, zum Gegenstand. Für dessen Ausführung setzt man einen wärmesensitiven Plasmidvektor ein, wie er zuvor definiert worden sein kann und welcher außerdem ein Gen, welches ein Protein von Interesse kodiert, unter der Kontrolle der für dessen Expression erforderlichen Elemente, und welche den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, umfasst. Dieses Gen könnte sich gegebenenfalls auf dem Transposon befinden. Man folgt dann den nachfolgend angegebenen Schritten.

a) man führt in das Bakterium durch Transformation oder Konjugation ein erfindungsgemäßes Plasmid ein,
b) man kultiviert das Bakterium auf selektivem Medium bei einer Temperatur unter der Hemmungstemperatur des Replikationsstartpunkts,
c) man erhöht die Kultivierungstemperatur auf eine Temperatur oberhalb der Hemmungstemperatur,
d) man gewinnt die nach mehreren Vermehrungszyklen bei der Hemmungstemperatur der Plasmidreplikation überlebenden Bakterien.

Der Schritt d) erlaubt es, die Bakterien zu selektieren, welche den Marker des Plasmids oder des Transposons tragen.
Die Erfindung hat gleichfalls Bakterien, die ein erfindungsgemäßes Plasmid in freier Form oder integriert in das Chromosom enthalten, zum Gegenstand.
Solche Bakterien werden insbesondere Anwendungen auf dem Gebiet der Agrarwirtschaft, insbesondere der Milchwirtschaft oder der Käserei finden.
Bei bestimmten der zuvor beschriebenen Fälle wünscht man, die Gesamtheit oder einen Teil des in das Bakterienchromosom durch das erfindungsgemäße Verfahren eingeführten genetischen Materials entfernen zu können.
Das homologe Rekombinationsverfahren erlaubt zwei Schritte: der erste besteht darin, auf das Integrationsereignis des Plasmids zu selektieren, der zweite Schritt – der fakultativ ist – be steht darin, das Replikon und die Marker, die nicht den Nahrungsmittelnormen entsprechen, aus dem Chromosom herauszuschneiden.
Exzision/Herausschneiden des Replikons: die Integration durch homologe Rekombination erzeugt Verdopplungen von jeder Seite des Ts-Plasmids (7a). Es ist gezeigt worden, dass ein replikatives "rolling circle"-Plasmid, welches in das Chromosom integriert ist, die homologe Rekombination zwischen den angrenzenden Sequenzen stark stimuliert. Wenn das chromosomale Fragment, welches das Ts-Plasmid trägt, einen Marker enthält, erlauben die durch die Integration erzeugten Verdopplungen, das Replikon herauszuschneiden, wobei ein inaktives chromosomales Gen zurückgelassen wird (7a). Experimentell handelt es sich darum, den Stamm, welcher das integrierte Plasmid enthält (welcher zuvor bei 37°C selektiert worden ist), bei 28°C zu kultivieren. Bei permissiver Temperatur startet die Replikation erneut und stimuliert die Rekombination zwischen den wiederholten Sequenzen, was zur Deletion des Replikons führt (7a).
Die Erfindung hat gleichfalls einen Plasmidvektor mit wärmesensitiver Replikation, welcher eine oder mehrere der bereits dargelegten Charakteristika aufweist und bei dem eine interne Region verdoppelt ist, zum Gegenstand. Die beiden identischen Sequenzen sind derart angeordnet, dass sie die Region, welche man zu entfernen wünscht, einrahmen. Ein solches Plasmid wird dann in einem Verfahren zur Inaktivierung eines Gens oder zur Einführung eines heterologen Gens durch Rekombination in das Bakterienchromosom, wie oben beschrieben, eingesetzt.
Am Ende von Schritt d) werden die überlebenden Bakterien erneut bei einer Temperatur unter der Hemmungstemperatur, beispielsweise bei 28–30°C, auf nicht-selektivem Medium in Kultur genommen. Tatsächlich stimuliert ein replikatives Plasmid die homologe Rekombination zwischen den angrenzenden Sequenzen stark. Der zuvor bei 35–37°C selektierte Stamm, welcher das integriert Plasmid enthält, wird bei permissiver Temperatur kultiviert: die Plasmidreplikation startet erneut, wodurch die Rekombination zwischen den wiederholten Sequenzen stimuliert wird. Das Replikon und die Marker, welche beispielsweise mit einer agrarwirtschaftlichen Verwendung dieses Systems nicht verträglich sind, werden herausgeschnitten, wobei das modifizierte Gen gegebenenfalls zurückgelassen wird. Die Selektion der Bakterien, bei denen die unerwünschten Marker herausgeschnitten sind, erfolgt nach Ausplattieren bei nicht-permissiver Temperatur. Dieser Mechanismus ist in der 7b veranschaulicht.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne in irgendeiner Weise deren Umfang zu beschränken.
Es wird Bezug genommen auf die folgenden Figuren:
1: Kinetik des Verlusts und Analyse der Anzahl von Kopien von pVE6002 gemäß der Erfindung und von nicht-Ts-pVE6001. L. lactis Subsp. lactis IL 1403, welche das Plasmid pGK12, pVE6001 oder pVE6002 tragen, werden bei 28°C oder 37,5°C kultiviert. Nach verschiedenen Kulturzeiten werden Proben entnommen, um bei 28°C auf selektiven und nicht-selektiven Medien kultiviert zu werden. 100 Kolonien werden ausgehend von dem nicht-selektiven Medium auf das selektive Medium (Em 5 μg/ml) umpikiert, um den Anteil von Zellen, welche ein Plasmid enthalten, in der Population auszuwerten. Die Extraktionen von Gesamt-DNA erfolgen bei Kulturen bei 28°C oder 37,5°C ohne Selektion während 5 h 30.
2: Hybrides Plasmid von pGK12 und pVE6002. pVE6043 wird aus dem SacI-ThaI-Fragment von 994 Basenpaaren von pKG12, welches mit dem ThaI-SacI-Fragment von 3384 Basenpaaren von pVE6002 verknüpft ist, gebildet. pVE6044 enthält das umgekehrte Paar, das SacI-ThaI-Fragment von 994 Basenpaaren von pVE6002, welches mit dem ThaI-SacI-Fragment von 3384 Basenpaaren von pGK12 verknüpft ist. Die dünnen Linien entsprechen der pGK12-DNA, die dicken gestrichelten Linien der pVE6002-DNA.
3: Lage der Ts-Mutation in dem RepA-Gen von pVE6002. Das ThaI-RsaI-Fragment von pVE6002, welches das RepA-Gen enthält, wurde auf beiden Strängen sequenziert. Die Sequenz zeigt vier Mutationen an den Positionen 972, 977, 980, 987, wohingegen der Rest der Sequenz sich von der für das Ausgangsreplikon pWV01 veröffentlichten Sequenz nicht unterscheidet.
4: Beschreibung der wärmesensitiven Derivate. pVE6006 wird durch Insertion des PvuII-Fragments von 445 Basenpaaren von pBluescript SK+ in die ClaI-Stelle von pVE6002 konstruiert. pVE6007 geht aus einer SacI-Deletion von pVE6006 hervor, welche zu dem Verlust des Erythromycin-Resistenzgens führt. pVE6004 wird durch Insertion des PvuII-Fragments von 445 Basenpaaren von pBluescript SK+ in das ClaI-HpaII-Fragment von pVE6002, welchem das Chloramphenicol-Resistenzgen fehlt, konstruiert.
5: Vergleich der zu Rep analogen Proteine von PE.194.
6: Schema des Verfahrens zur Inaktivierung eines Gens.
7a: Schema eines Beispiels einer Exzision des Ts-Replikons in zwei Schritten.
7b: Schema der Exzision des Replikons mittels Plasmidverdopplungen.
8: Konstruktion der Plasmide pG⁺host5 und pG⁺host6 ausgehend von dem Plasmid pG⁺host4 (oder pVE6004): das Plasmid pG⁺host5 wird durch Insertion des AvaI-AlwN1-Fragments von pBR322 (welches den Replikationsstartpunkt von pBR322 enthält) in das durch NsiI linearisierte pG⁺host4 konstruiert.
pG⁺host6 wird durch Insertion des AvaI-EcoRI-Fragments von pBR322 (welches den Replikationsstartpunkt von pBR322 und das Ampicillin-Resistenzgen enthält) in das durch NsiI linearisierte pG⁺host4 konstruiert.
9: Nukleotidsequenz von pG⁺host4.
10: Nukleotidsequenz von pG⁺host5.
11: Nukleotidsequenz von pG⁺host6.
Beispiel 1: Herstellung und Charakterisierung eines wärmesensitiven Plasmidvektors
MATERIALIEN UND METHODEN
Die Arbeiten wurden am Laboratoire de Génétique Microbienne, Institut de Biotechnologie, INRA, 78352 Jouy-en-Josas cedex, Frankreich, ausgeführt.
Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen.
Die eingesetzten Plasmide und Bakterienstämme sind in der Tabelle 1 angegeben. Die Konstruktionen von pVE6043 und pVE6044 sind in der 2 beschrieben; die Plasmide pVE6004, pVE6006 und pVE6007 sind in der 4 gezeigt. pVE6004 (oder pG⁺host4) wird durch Insertion eines PvuII-DNA-Fragments von 445 Basenpaaren in das ClaI-HpaII-Fragment von 3340 Basenpaaren mit stumpfem Ende des ursprünglichen Ts-Isolats, welchem das Cm-Resistenzgen fehlt, konstruiert. Das PvuII-Fragment von 445 Basenpaaren enthält eine Mehrfachklonierungsstelle, die Promotoren T7 und T3 und die Stellen für M13–20, T7, T3 und inverse Primer, die die direkte Sequenzierung ausgehend von dem Vektor erlauben. Dieses Plasmid ist in allen untersuchten Wirten, einschließlich E. coli, wärmesensitiv und muss bei 28°C gehalten werden.
E. coli und Bacillus subtilis wurden in LB-Medium kultiviert. L. lactis Subsp. lactis (L. lactis) wird auf M17-Medium, in welchem man Lactose durch Glucose ersetzt hat, kultiviert. Es wurde Chloramphenicol (Cm) in einer Konzentration von 5 μg/ml für L. lactis und B. subtilis bzw. Erythromycin (Em) in einer Konzentration von 5 μg/ml bzw. 0,5 μg/ml eingesetzt. Cm, Azaerythromycin und Erythromycin wurden für E. coli in jeweiligen Endkonzentrationen von 15 μg/ml, 100 μg/ml und 150 μg/ml eingesetzt.
Molekulare Klonierung, Kompetenz und Transformationsverfahren.
Enzyme des Handels wurden eingesetzt, wie von den Lieferfirmen angegeben. Mini-Lysate von ganzen Zellen und Plasmid-DNA wurden hergestellt, wie in der Literatur beschrieben. Die Induktion von Kompetenz und die Transformation von E. coli und von B. subtilis erfolgten durch Standardprozeduren (Hanahan, 1985, oder Niaudet et al., 1979). Die Stämme von L. lactis wurden elektrotransformiert, wie von Langella und Chopin, 1989a, beschrieben und gemäß der Prozedur von Holo und Nes, 1989, modifiziert.
Mutagenese der Plasmide
Die Mutagenese durch Hydroxylamin erfolgte an der DNA des Plasmids pGK12 unter den von Thomas, 1987, beschriebenen Bedingungen. Nach 110 und 120 min Behandlung bei 70°C wird das Hydroxylamin durch Präzipitation der DNA mit Isopropanol entfernt.
Sequenzierung der DNA
Für die Sequenzierung der DNA wurde das ThaI (756 bp)-RsaI (1620bp)-Fragment von pVE6002 in das Plasmid pBluescript kloniert. Man erzeugt eine Reihe von überlappenden Klonen durch Verwendung von Exonuklease III und Mungbohnen-Nuklease (Stratagene). Das ThaI (756 bp)-NdeI (1140 bp)-Fragment der Präparation des Plasmids pGK12, welches für die Mutagenese eingesetzt wurde, wird gleichfalls durch die gleiche Prozedur sequenziert.
Man führt die Sequenzierung der DNA durch die Didesoxykettenabbruchmethode an DNA-Doppelsträngen mit dem Sequenzierungskit Taq Dye Primer Cycle (Applied Biosystems) durch, indem man einen PCR-Apparat von Perkin Elmer verwendet. Die Sequenzierungsreaktionen werden mit fluoreszierenden Oligonukleotiden (Applied Biosystems) initiiert und mittels eines automatischen Sequenzierapparats (Sequenzierungsapparat 370 A DNA, Applied Biosystems) analysiert. Die erhaltenen Sequenzen wurden auf beiden Strängen bestimmt.
ERGEBNISSE
Isolierung der Mutante.
Das in diesen Experimenten eingesetzte Plasmid, pGK12, ist ein Derivat von pWV01, welches zwei Antibiotika-Resistenzmarker enthält (Kok et al., 1984). 10 μg Plasmid-DNA werden in vitro durch Hydroxylamin mutagenisiert und durch Elektroporation in den Lactococcus-Stamm IL1403 nach Entfernung des mutagenen Mittels eingeführt. Die Wirksamkeit der Mutagenese wird durch die Verringerung der Lebensfähigkeit des Plasmids und durch das Auftreten von gegenüber Erythromycin oder gegenüber Chloramphenicol empfindlichen Mutanten ausgewertet. Nach 110 bis 120 min Behandlung fällt die Lebensfähigkeit des Plasmids auf weniger als 0,1% ab und ungefähr 10% der Transformanten enthalten Plasmide, welche gegenüber einem der Antibiotika empfindlich sind. Diese Mutage nesebedingungen werden ausgewählt, um nach wärmesensitiven Plasmiden zu suchen, welche durch Replikaplattierung der bei 28°C erhaltenen Transformanten auf ein Medium, welches Erythromycin enthält, unter Inkubation bei 37,5°C identifiziert werden. Zwei wärmesensitive Kandidaten, welche als pVE6001 und pVE6002 bezeichnet werden, werden durch Screening von ungefähr 5000 Klonen erhalten. Die Anzahlen von Plasmidkopien bei diesen werden verglichen und es wird der Verlust bei 37,5°C bestimmt.
Charakterisierung der Mutante: pVE6001 ist eine nicht-Ts-Mutante.
Das Plasmid pVE6001 ist bei 28°C instabiler als pGK12 und dieser Mangel wird bei 37,5°C noch ausgeprägter. Indessen enthalten 7% der Bakterien das Plasmid noch nach 8 h nicht-selektiver Vermehrung bei 37,5°C, was nahelegt, dass eine Replikation unter den restriktiven Bedingungen stattfindet (1A, links).
Bezogen auf pGK12 erscheint die Anzahl von Kopien von pVE6001 bei 28°C und 37,5°C mit oder ohne Selektion verringert (1A), was dessen geringere Stabilität erklären könnte. Es ist möglich, dass der Verlust des Plasmids bei hohen Temperaturen auf physiologische Veränderungen beim Wirt bei höheren Temperaturen und nicht auf die Wärmesensitivität des Plasmids zurückzuführen ist.
Charakterisierung der Mutante: pVE6002 ist oberhalb von 35°C eine wärmesensitive Mutante.
Die Messungen der Stabilität des Plasmids während der Vermehrung ohne Antibiotikum enthüllen, dass pVE6002 bei 28°C ebenso stabil ist wie pGK12, aber bei 37,5°C auf drastische Weise verloren geht (1B). Der schnelle Verlust von pVE6002 bei 37,5°C legt nahe, dass die Replikation unverzüglich nach der Temperaturänderung blockiert wird. Nach 8 h Vermehrung bleiben lediglich ungefähr 0,1% gegen Erythromycin resistente Zellen übrig. Die Anzahlen von Kopien von pGK12 und von pVE6002 sind bei 28°C mit und ohne Selektion ähnlich; indessen kann nach 5 h bei 37,5°C pVE6002 nicht mehr nachgewiesen werden, wohingegen die Anzahl von Kopien von pGK12 ungefähr die gleiche ist (1B). Man kann aus diesen Experimenten schließen, dass die Mutation auf pVE6002 wirklich eine wärmesensitive Replikationsdefizienz darstellt.
Es wurde die minimale Temperatur, welche den Verlust von pVE6002 ermöglicht, bestimmt. Der Stamm IL1403, welcher pVE6002 enthält, wurde hinsichtlich des Plasmidverlusts während 8 h nichtselektiver Vermehrung bei 28°C, 30°C, 33°C, 35°C und 37,5°C getestet (Tabelle 2).
TABELLE 2: Prozentsatz von Em^r-Zellen in der Population
Eine Übernachtkultur in M17 mit Em von IL1403, welches pVE6002 trägt, wird in neuem selektivem Medium verdünnt und man lässt sie bei 28°C 3 h sich vermehren. Die Kultur wird dann 10000-fach in einem nicht-selektiven Medium verdünnt und bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. In unterschiedlichen Zeitabständen werden Proben entnommen und bei 28°C auf M17 gegeben. Für jeden Temperatur- und Zeitpunkt wird der Verlust des Plasmids ausgewertet, indem ungefähr Hundert Kolonien auf Schalen mit selektivem (Em) Medium bei 28°C erneut pikiert werden.
Es wurde festgestellt, dass der Plasmidverlust bei 37,5°C und 35°C äquivalent ist. Ein partieller Verlust des Plasmids wird bereits bei 33°C beobachtet, wohingegen das Plasmid bei 28°C und 30°C stabil war. So können die Zellen, die pVE6002 enthalten, dieses Plasmid durch Erhöhung der Temperatur auf 35°C oder mehr verlieren.
pVE6002 wurde auch in einen anderen Stamm von Lactococcus, MG1363 (Gasson, 1983), der sich von IL1403 durch Vergleich der Pulsfeld-Elektrophoreseprofile unterscheidet, eingeführt. Die Analyse der Sequenzen zeigt, dass MG1363 wahrscheinlich ein L. lactis Subsp. cremoris-Stamm (Godon et al., 1992) ist. pVE6002 zeigt in dieser Umgebung die gleiche Wärmesensitivität, was zeigt, dass der Phänotyp der Plasmid-Mutante nicht mit dem Stamm verbunden ist.
Breite Wirtsspezifität und Ts-Phänotyp von pVE6002.
Ein Ts-Plasmid kann ein Klonierungsvehikel, welches in anderen Organismen nützlich ist, sein. So wurde das wärmesensitive Verhalten von pVE6002 bei B. subtilis und E. coli untersucht. Diese Stämme wurden als repräsentativ für das breite Wirtsspektrum des ursprünglichen Replikons pWV01 ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde in die beiden Spezies durch Transformation und Selektion bei 28°C eingeführt. Angesichts der Tatsache, dass B. subtilis und E. coli maximale Vermehrungstemperaturen aufweisen, die höher sind als jene von L. lactis-Subsp., wurde die Replikation von pVE6002 bei 28°C, 37°C und 42°C getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass pVE6002 in den beiden Wirten wärmesensitiv ist. Es ist wahrscheinlich, dass pvE6002 seine Wärmesensitivitäts-Eigenschaften bei dem breiten Wirtsspektrum, in dem es etabliert werden kann, bewahrt.
Kartierung der Ts-Mutation.
Die DNA-Sequenz von pWV01 zeigt das Vorhandensein eines "origin-plus" und von vier ORF. Leenhouts leitet aus dessen Ähnlichkeit zu besser charakterisierten Plasmid-DNAs ab, dass ORF A das Replikationsprotein (RepA) kodiert, welches für das Schneiden eines DNA-Strangs an der "origin-plus"-Stelle verantwortlich ist. Zusätzliche Homologien legen nahe, dass ORF C die Expression von RepA regulieren könnte. ORF B und ORF D wurden noch keine Funktionen klar zugewiesen, obgleich man weiß, dass dieses letztere für die Replikation nicht erforderlich ist.
Um die Mutation zu lokalisieren, die pVE6002 die Wärmesensitivität verleiht, wurden hybride Plasmide konstruiert, die Abschnitte des wärmesensitiven Replikons und nicht-mutierte Abschnitte kombinieren. pVE6043 wird aus einem Fragment von pGK12, welches die "origin-plus"-Stelle, ORF B und ORF C enthält, und einem pVE6002 (Ts)-Fragment, welches den ORF A (RepA), dem sein Promotor fehlt, ORF D und den Em- und Cm-Resistenz-Marker enthält (man verwendet die Sac1- und Tha1-Restriktionsstellen, 2), gebildet. Dieses Hybrid geht bei 37,5°C verloren in dem gleichen Maße wie pVE6002, wohingegen das umgekehrte Hybrid (pVE6044) mit der gleichen Stabilität wie pGK12 beibehalten wird (2). So befindet sich die Mutation, die pVE6002 Wärmesensitivität verleiht, in dem DNA-Fragment, welches RepA, ORF D und die Antibiotika-Marker kodiert. Angesichts der Tatsache, dass ORF D nicht unverzichtbar ist und dass die Antibiotika-Marker keine Kandidaten darstellen, kann man schließen, dass die wärmesensitive Funktion das RepA-Protein ist.
Sequenzierungsdaten
Um die Ts-Mutation zu lokalisieren, wurde das Fragment von 864 Basenpaaren, welches das RepA-Protein von pVE6002 kodiert, sequenziert. Es wurden vier Mutationen an den Positionen 972, 977, 980 und 987 identifiziert (3). Es wurde bestätigt, dass die entsprechende Region des Ausgangs-Plasmids pGK12, das für die Mutagenese eingesetzt worden war, mit der für pWV01 veröffentlichten Sequenz (Leenhouts et al., 1991) identisch ist. Die vier Mutationen sind Transitionen von G zu A, was der bekannten mutagenen Wirkung von Hydroxylamin entspricht. Jede Basenveränderung hat eine Veränderung einer Aminosäure zum Ergebnis (3), von denen eine, Val zu Ile, konservativ ist. Der Beitrag von einer oder mehreren dieser Veränderungen kann an dem Ts-Phänotyp beteiligt sein.
Derivate des Ts-Plasmids
Mit dem Ziel einer Klonierung wurden Derivate des anfänglichen Ts-Plasmids pVE6002 entwickelt (4). Diese Derivate sind modifiziert, so dass sie entweder die beiden Antibiotika-Resistenzen (Em und Cm) oder nur eine (Em oder Cm) enthalten, und alle haben eine von dem Plasmid pBluescript SK+ abgeleitete Multistellen ("multisite")-Sequenz
Excision des Replikons
Ausgehend von einem von pVE6002, welches eine Region mit Homologie zu dem Bakterienchromosom unterbrochen durch ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum (Ab^r) trägt, abgeleiteten Plasmid konnten Ereignisse eines doppelten reziproken Austauschs erhalten werden, wie in der 7a veranschaulicht. Nach Einführung des Plasmids in das Bakterium bei 28°C besteht ein erster Schritt darin, diejenigen Zellen, bei denen eine Integration in das Chromosom stattgefunden hat, durch Kultur bei 37°C auf Medium, welches das Antibiotikum enthält, zu selektieren. Die Region mit Homologie ist infolge der Integration verdoppelt (7a). Während eines zweiten Schritts erhält man die Exzision des Replikons durch Inkubation bei 28°C, um zu ermöglichen, dass die Plasmidreplikation erneut startet, und um ein zweites Rekombinationsereignis zu stimulieren. Auf die Exzisionsereignisse wird durch Kultivierung bei 37°C selektiert; das chromosomale Gen wird durch das Ab^r-Gen inaktiviert.
Beispiel 2: Integration des wärmesensitiven Plasmids in das Chromosom von L. lactis
Die in dieser Untersuchung eingesetzten Bakterienstämme und Plasmide sind in der Tabelle 3 aufgeführt. Die Stämme von Escherichia coli werden in LB-Brühe kultiviert. L. lactis wird in einer M17-Glucose-Brühe oder in einem Minimalmedium, wenn es auf den ilv-Phänotyp getestet wird, kultiviert und ausplattiert. Erythromycin (Em) wird zu einer Konzentration von 5 Mikrogramm/ml für L. lactis Subsp. lactis und 150 Mikrogramm/ml für E. coli zugesetzt, Tetracyclin wird in einer Konzentration von 12,5 Mikrogramm/ml für L. lactis eingesetzt. Die Elektroporation von L. lactis Subsp. lactis (Appl. Env. Microbiol. 55, 3119–3123, 1989) liefert zwischen 10⁵ und 10⁶ Transformanten pro Mikrogramm Plasmid-DNA für IL1403 und ungefähr 10² Transformanten pro Mikrogramm Plasmid-DNA mit NCDO2118, dem ilv⁺-Stamm, welcher für die Genersatzexperimente eingesetzt wurde. E. coli wird durch die von Hanahan (1985, DNA cloning: A practical approach, Band 1: 109–135, IRL Press, Hrsg. Glover) beschriebene Methode transformiert.
Tabelle 3
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Konstruktion der Plasmide für die Integration
a) Konstruktion des Vektors
Das Plasmid pG⁺host4 (oder pVE6004) ist ein Ts-Derivat von pWV01, welches gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist. Um die Klonierung in E. coli zu vereinfachen, wird das 1,4 kb-Fragment, welches den Startpunkt von pBR322 enthält, in pG⁺host4 inseriert. Das Plasmid pG⁺host5 wird durch Insertion des AvaI-AlwN1-Fragments von pBR322 (welches den Replikationsstartpunkt von pBR322 enthält) in den durch NsiI geschnittenen linearisierten pG⁺host4 konstruiert. Dessen Struktur ist in der 8 aufgeführt. Das erhaltene Plasmid, welches als pG⁺host5 bezeichnet wird (Appligene, Illkirch, Frankreich), wird für alle Klonierungen verwendet. Die Aktivität des Startpunkts von pBR322 erlaubt seine Aufrechterhaltung bei 37°C in E. coli und der Ts-Startpunkt hält pG⁺host5 bei 28°C in den grampositiven Bakterien aufrecht.
b) Klonierung von zufälligen chromosomalen Fragmenten in pG⁺host5
Die chromosomale DNA des Stamms IL1403 wird durch EcoRV und HindIII verdaut. Chromosomale Fragmente mit einer Größe zwischen 0,9 kb und 1,4 kb einschließlich werden ausgehend von Agarosegelen gereinigt und mit durch SmaI-HindIII behandeltem pG⁺host5 verknüpft. Die rekombinanten Plasmide werden in E. coli etabliert, dann lässt man sie durch Elektroporation in L. lactis eindringen. Dieses Letzere wird eingesetzt, um die Strukturen der Plasmide und die Größen der Inserts zu verifizieren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt. Man setzt die Restriktionsenzyme HpaI (einmalig vorkommende Stelle in dem Abschnitt des Vektors) und HindIII (einmalig vorkommende Stelle zwischen dem Insert und dem Vektor) für die Analyse der Klone, bei denen eine Integration stattgefunden hat, ein.
Tabelle 4: Ipc an unterschiedlichen Positionen auf dem Chromosom von L. lactis
c) Klonierung und Deletion eines Fragments des ilv-Operons
Ein EcoRI-Fragment von 3949 by des ilv-Operons von IL1403 (J. Bacteriol. 174, 6580–6589 (1992) wird in der einen oder der anderen Orientierung in die EcoRI-Stelle von pG⁺host5 kloniert (wodurch pVE7009 und pVE7009R erhalten werden).
Integration durch einfaches Crossing-over (sco) in das Chromosom von L. lactis
Lactococcus-Stämme, welche die getesteten Plasmide enthalten, werden eine Nacht bei 28°C in Gegenwart von Erythromycin kultiviert, dann 100-fach in dem gleichen Medium verdünnt und bei 28°C 2 h bis 2 ½ h kultiviert (exponentielle Phase). Die Kulturen werden 3 h bei 37,5°C plaziert, um die Anzahl von Kopien von Plasmiden pro Zelle zu verringern. Die Proben werden dann verdünnt und bei 37°C auf M17-Em-Medium ausplattiert, um die Integrationsereignisse zu detektieren, und bei 28°C auf nicht-selektivem Medium, um die Anzahl von lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Die Integrationshäufigkeit pro Zelle (ipc) wird als das Verhältnis der Em^r-Zellen bei 37°C zu der Anzahl von bei 28°C lebensfähigen Zellen abgeschätzt. Die Zellen, bei denen eine Integration stattgefunden hat, welche bei 37°C isoliert wurden, werden in einem M17-Medium, welches Ein enthält, bei 37,5°C für eine spätere Verwendung gehalten.
Integration durch doppeltes Crossing-over (dco) in das Chromosom von L. lactis
Die Plasmide pIL1263 und pIL1202 werden aus dem Vektor Ts (pG⁺host4, Em^r) und aus den chromosomalen Regionen von 2,3 kb bzw. 3,6 kb, unterbrochen durch das Tet-Gen von Tn1545 (Nucl. Acids Res., 14, 7047–7058, 1986) gebildet. Ein Stamm, welcher pIL1202 oder pIL1263 trägt, wird eine Nacht bei 37,5°C in M17 mit Tet oder Ein kultiviert, um eine Population von Zellen, bei welchen eine Integration stattgefunden hat, zu erhalten. Die Kultur wird dann auf 1/10⁵ in M17-Medium ohne Antibiotikum verdünnt und auf 28°C erwärmt, um die Rekombination durch Plasmidreplikation zu stimulieren. Eine Kultur von 12 h oder mehr bei 28°C liefert maximale Genersatz-Frequenzen. Eine Übernachtkultur bei 28°C wird in unterschiedlichen Zellkonzentrationen bei 37°C mit oder ohne Selektion durch Tet ausplattiert. Die Kolonien, bei denen der Ersatz des Gens erfolgt war, haben einen Tet^r- und Em-empfindlichen (Em^s) Phänotyp. Die chromosomale DNA wird gemäß bekannten Methoden präpariert (Grüss et al., 1988).
Die gereinigte DNA wird durch Restriktionsenzyme behandelt, durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt und durch Southern-Hybridisierung mit DNA-Sonden analysiert, um die homologen Rekombinationen nachzuweisen (Sambrook et al., 1989).
Ergebnisse
1) Integration durch einfaches Crossing-over
Die Klonierung der chromosomalen Fragmente von L. lactis in pG⁺host5 in E. coli erlaubt es, 14 unterschiedliche Plasmide, welche jeweils eine unterschiedliche chromosomale Insertion von 0,9 kb bis 1,4 kb enthalten, zu isolieren. Diese in IL1403 bei 28°C etablierten Plasmide dienen dazu, die Integrationshäufigkeiten in das Chromosom von L. lactis zu messen. Die Integrationshäufigkeit pro Zelle liegt zwischen 10^–2 und 10^–7. Die ipc eines Vektors pG⁺host5 ohne chromosomales Insert liegt zwischen 10^–6 und 10^–7. Die Plasmide, die die chromosomalen Inserts tragen, können in zwei Gruppen abhängig von ihrer Integrationshäufigkeit eingeteilt werden. In der Gruppe I variiert die ipc zwischen
3.10^–2 und 4.10^–4. Diese Variationen müssen auf die Lage oder auf die Natur des Inserts, vielmehr auf seine Größe zurückzuführen sein. In der Gruppe II liegt die ipc des Plasmids zwischen 10^–5 und 3.10^–7. Dies ist wahrscheinlich auf die Unterbrechung eines essentiellen chromosomalen Gens, die es lediglich erlaubt, die nicht-homologen Integrationen zu beobachten, zurückzuführen. Nur zwei von diesen Plasmiden (pVE7028 und pVE7034) produzieren Moleküle mit hohen Molekulargewichten (HMW). Die Analyse der ausgehend von den bei 37°C gehaltenen Stämmen, bei welchen eine Integration stattgefunden hat, erhaltenen chromosomalen DNA durch enzymatische Restriktion und Southern-Hybridisierung unter Einsatz des Plasmids pG⁺host5 als Sonde zeigt eine einfache Integration und Multi-Tandems in dem Falle von acht Plasmiden und eine Integration durch eine Mehrzahl von Kopien im Falle von zwei Plasmiden. Der Verdau der DNA der Zellen, bei denen eine Integration stattgefunden hat, durch HindIII bestätigt, dass die Integration durch einfaches Crossing-over erfolgt. Jedes Plasmid enthält eine einzige HindIII-Stelle an der Vektor-Insert-Verbindungsstelle und der Verdau muss eine einzige DNA-Bande von Plasmidgröße freisetzen. Die Southern-Hybridisierung der nicht- verdauten Gesamt-DNA enthüllt bei keinem der Plasmide der Gruppe I freies Plasmid, was anzeigt, dass die Kopie des Plasmids integriert ist. Eine ähnliche Analyse der Plasmide pVE7028 und pVE7034 bestätigt, dass diese Plasmide gleichfalls durch einfaches Crossing-over integriert sind. Die Verwendung von HpaI, welches eine einmalig vorkommende Stelle im Inneren des Vektors erkennt, erlaubt es, zu bestimmen, dass jedes Plasmid an einer unterschiedlichen Position integriert ist.
Die vier Plasmide der Gruppe II (niedrige Integrationshäufigkeit) scheinen zufällig integriert worden zu sein, denn der Verdau durch HindIII setzt keine monomere Plasmid-Bande frei und der Verdau durch HpaI von drei Klonen, bei denen eine Integration des gleichen Plasmids stattgefunden hat, liefert auf dem Gel nicht das gleiche Profil. Die Restriktionskarte des Chromosoms von L. lactis, welche für SmaI und ApaI entwickelt wurde, erlaubt es die Integrationsstellen der Plasmide durch einfaches Crossing-over auf der Chromosomenkarte zu lokalisieren. Jede Integration befindet sich auf einem unterschiedlichen Abschnitt. Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, dass die chromosomalen Insertionen auf zufällige Weise auf dem Chromosom positioniert sind, was so eine jegliche Verfälschung in dem Verfahren ausschließt.
Die Integrationshäufigkeit hängt von der Länge der Homologie ab.
Ein Abschnitt von 3,9 kb des sequenzierten ilv-Operons von IL1493 wird in pG⁺host5 kloniert und es wird auf demselben Vektor eine Gesamtheit von Deletionen des Fragments erzeugt. Während Plasmide, die das vollständige Insert von 3,9 kb in einer der beiden Orientierungen tragen (pVE7009 und pVE7009R), eine gewisse strukturelle Instabilität in L. lactis zeigen, sind die acht Derivate durch Deletion von pVE7009R stabil. Diese Klone werden eingesetzt, um das Verhältnis zwischen der Länge der Homologie und der Integrationshäufigkeit zu bestimmen. Es existiert eine logarithmische Beziehung zwischen der Integrationshäufigkeit und der Länge der Homologie für Längen zwischen 0,35 und 2,5 kb. Bei Fragmenten von mehr als 2,5 kb scheinen die Rekombinationshäufigkeiten ein Plateau zu erreichen, denn die ipc der homologen Segmente von 2,5, 3,3 und 3,9 kb sind nicht signifikant unterschiedlich. Die anderen Faktoren als die Länge scheinen ebenfalls wichtig zu sein. Die Analyse durch Restriktionsenzyme, die eine einmalig vorkommende Stelle entweder in dem Vektor oder in dem Insert oder in der Vektor-Insert-Verbindungsstelle erkennen, bestätigt, dass die Integration durch homologe Rekombination durch einfaches Crossing-over erfolgt. Für jedes eingesetzte Plasmid erfolgen Multicopy-Integrationen des Plasmids. Diese Ergebnisse zeigen, dass pG⁺host ein wirksames Integrationsmittel durch einfaches Crossing-over liefert, wenn es homologe Abschnitte, welche auch so klein wie 330 Basenpaare sein können, trägt.
2) Integration durch doppeltes Crossing-over
Bei dem oben beschriebenen System durch einfaches Crossing-over (sco) wird das integrierte Plasmid durch wiederholte Sequenzen flankiert. Wenn die bei 37°C erzeugten Klone, bei denen eine Integration stattgefunden hat, bei 28°C gehalten werden, stimuliert die Replikation des Plasmids auch stark ein zweites Rekombinationsereignis. Dieses Ereignis hat eine hohe Häufigkeit einer Exzision des Replikons, welche entweder zu der Ausgangsstruktur oder zu der chromosomalen Struktur dco (doppeltes Crossing-over) führt, zur Folge.
Es wird ein schlecht transformierbarer Stamm von L. lactis, NCDO2118, der für die verzweigten Aminosäuren (Ilv, Leu, Val) prototroph ist und in dem bis heute keinerlei genetische Modifikation realisierbar war, eingesetzt. Es werden zwei Derivate von pG⁺host4, die ein entweder angrenzendes oder nicht-angrenzendes chromosomales Segment tragen, eingesetzt. pIL1263 enthält ein chromosomales Fragment von 2,3 kb stromaufwärts des ilv-Operons unterbrochen durch ein DNA-Segment von 4 kb, welches einen Tetracyclinresistenz-Marker (Tet^r) enthält. Die Substitution des Gens muss zu der Insertion des Tet^r-Markers in das Chromosoms führen und das ilv⁺-Operon intakt lassen. Das Plasmid pIL1202 enthält nicht-angrenzende Segmente von 1,1 kb und 2,5 kb, welche den Enden einer Region von 18,5 kb, welche das ilv-Operon einschließt, verbunden durch den Tet^r-Marker von 4 kb entsprechen. Der Ersatz des Gens muss zu einer Deletion des Chromosoms von 14,9 kb, welche das ilv-Operon mit einschließt, und unter Erzeugung eines ilv^–-Phänotyps führen.
Selektion auf das Ersatzgen:
Ein Stamm, welcher entweder pIL1202 oder pIL1263 enthält, wird unter oben angegebenen Bedingungen unter Verwendung von Tet als Selektionsmarker kultiviert. Bei unabhängigen Experimenten mit pIL1263 waren 69% und 98% der Tet^r-Kolonien Em^s; bei pIL1202 sind 50% und 91% der Tet^r-Kolonien Em^s. In den während des gleichen Zeitraums bei 37°C gehaltenen Kontrollkulturen sind alle Tet^r-Kolonien gleichfalls Em^r. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Replikation bei den rc ("rolling circle" oder rollender Kreis) -Plasmiden die Exzision aus dem Chromosom stimuliert. Fünf Em^s-Kolonien, die durch Integration von pIL11202 erhalten worden waren, werden auf Minimalmedium, welchem verzweigte Aminosäuren fehlen, kultiviert und sind ilv^–, was bestätigt, dass die Rekombination stattgefunden hat. Die Struktur der entsprechenden chromosomalen Region der fünf Tet^r-Em^s-Isolate wird durch Southern-Hybridisierung untersucht, welche den Ersatz des Gens in allen Fällen bestätigt.
Keine Selektion:
Es wurde ein identisches Protokoll ohne Selektion durch Tet eingesetzt, um sich in den Fall zu versetzen, wo das chromosomale Fragment, das das Plasmid trägt, keinen Selektionsmarker aufweist. In drei Experimenten unter Verwendung von pIL1263 (Geninsertion) sind 10% bis 40% der bei 37°C ohne Selektion erhaltenen Kolonien Tet^r Em^s, was anzeigt, dass ein Genersatzereignis stattgefunden hat. Für pIL1202 (Deletion des Chromosoms) sind 1% bis 7% der Kolonien Tet^r Em^s, was einen Ersatz des Gens anzeigt; von den untersuchten vier Tet^r Em^s-Kolonien sind alle ilv^–. Die Analyse der chromosomalen Struktur der vier Klone von jedem Typ, bei welchen eine Integration durch dco stattgefunden hat, bestätigt, dass der Ersatz erfolgt, ohne Selektion eines neuen inserierten Fragments. Diese Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit des Genersatzes, ohne einen Antibiotikumsmarker in dem Chromosom zurückzulassen. Dieses Protokoll ist folglich für die chromosomale Modifizierung ohne Verwendung von Selektionsmarkern geeignet.
Verwendung von pG⁺host in anderen grampositiven Bakterien
Die Wirksamkeit der intermolekularen Rekombination an zwölf unterschiedlichen Positionen des Chromosoms von B. subtilis wurde bestimmt, indem kompetente Zellen durch ein nicht-replikatives Plasmid transformiert wurden (J. Bacteriol. 174, 5593–5587, 1992). In diesen Experimenten ist das homologe Segment unveränderlich (Insertion eines Fragments von pBR322). Die Wirksamkeiten variieren um das ungefähr dreifache abhängig von der Position der Integration. Unter Verwendung des Systems pG⁺host sco wie auch des nicht-replikativen Vektors können identische Rekombinationsexperimente bei den beiden Stämmen von B. subtilis mit den Unterschieden einer Größenordnung von drei bei den Integrationshäufigkeiten ausgeführt werden. pG⁺host5, welches das 1,4 kb-Fragment von pBR322 trägt, wird in die Stämme von B. subtilis von Interesse eingeführt. Unter Einsatz der oben beschriebenen sco-Prozedur variiert die Integrationshäufigkeit zwischen 1,8 ± 0,6.10^–3 und 6,1 ± 0,9.10^–4. Die gleichen Variationen um das 3-fache werden zwischen den beiden unterschiedlichen Positionen wie bei jenen, die mit dem nicht-replikativen System erhalten werden, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt die Wirksamkeit des Systems.
Beispiel 3: Genetische Modifikation von nicht-transformierbaren Organismen
Organismen von industriellem Nutzen, wie bestimmte Lactobazillen, sind gegenwärtig nicht transformierbar; es ist indessen möglich, dahinein Plasmide durch Konjugation einzuführen. Der Mobilisierungs-Genort oriT des Plasmids pIP501 ist charakterisiert worden. pIP501 ist in bestimmte dieser Lactobazillen autotransferierbar.
Dieses oriT-Fragment wurde in das Plasmid Ts kloniert (Plasmid Ts:oriT); es wurde seine Fähigkeit getestet, in Gegenwart eines "helper"-Plasmids (abgeleitet von pIP501), welches die Transfer-Proteine in trans liefert, mobilisiert zu werden. Es wurden verschiedene Intra- oder Inter-Spezies-Kreuzungen mit Erfolg ausgeführt (Tabelle 5); mit den Exkonjuganten, die lediglich das Plasmid Ts:oriT enthalten, ist das zukünftige Verfahren einer Integration durch Rekombination anwendbar. Man kann folglich ge netische Informationen in das Chromosom von nicht-transformierbaren Lactobacillus bulgaricus-Spezies, welche durch die Milchindustrie mehr und mehr eingesetzt werden, einführen.
Die Zweckbestimmung des Verfahrens einer Integration durch Rekombination ist die Modifizierung der genetischen Charaktere von Bakterienstämmen. Dies legt nahe, dass die zu modifizierenden Eigenschaften auf molekularer Ebene charakterisiert sind. Die Entwicklung eines funtkionsfähigen Transpositionssystems (Kombination des Ts-Plasmids mit einem Transposon) würde einen bedeutenden Beitrag als genetisches Werkzeug (Tool) für die Analyse von L. lactis bilden.
Tabelle 5: KONJUGATIONSHÄUFIGKEIT MIT DEM PLASMID TS:oriT
Beispiel 4: Verwendung eines wärmesensitiven Plasmids als Vektor eines Transposons
Es wird eine Tn10-Transpositionskassette, welche in ein Derivat von pVE6004 kloniert ist, für einen Transpositionstest eingesetzt. Bei 37°C sind ungefähr 1% der Zellen Em^r, was anzeigt, dass das Transposon oder das Plasmid in das Chromosom integriert ist. Die nicht-spezifische Integration des Plasmids ohne die Transpositionskassette erfolgt mit Häufigkeiten unter 10^–7. Die Transposition wird durch Analyse der durch HindIII verdauten DNA aus acht Kolonien abgeschätzt. HindIII hat zwei Restriktionsstellen in dem Plasmid, aber keine in der transponierbaren Einheit. Die chromosomale DNA wird aus acht wärmeresistenten Em^r-Klonen extrahiert und mit HindIII verdaut; die behandelte DNA wird dann durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt und mit einem DNA-Fragment, welches das Em^r-Transposon enthält, als Sonde hybridisiert. Unter diesen Bedingungen würde die Integration des vollständigen Vektors (d.h. ohne Transposition) zu einer Hybridisierungsbande von 1,3 kb führen, die hier nicht beobachtet wird. Jede Chromosomenprobe liefert ein einzigartiges Profil, wenn das DNA-Fragment, welches das Transposon enthält, als Sonde verwendet wird. Keine der hybridisierten Banden hat eine Größe von 1,3 kb, die erwartet würde, wenn das vollständige Plasmid in eine Stelle des Vektors integriert worden wäre. Außerdem beobachtet man keine Hybridisierung, wenn der Plasmidvektor Ts als Sonde eingesetzt wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transposition an unterschiedlichen Stellen stattfindet und dass die Plasmid-DNA sich nicht mit dem Transposon in das Chromosom integriert. Das wärmesensitive Plasmid kann folglich als Abgabevektor eingesetzt werden.
REFERENZEN

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LEGENDE DER FIGUREN
FIGUR 4: Einmalig vorkommende Stellen:
FIGUR 6: Symbole:
FIGUR 7A:
FIGUR 7B: Symbole:

Claims

Bakterieller Plasmidvektor mit einem in E. coli und in grampositiven Bakterien, ausgewählt in der Gruppe, umfassend: Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Listeria, Pediococcus, Staphylococcus, Clostridia, Leuconostoc, wirksamen Replikationsstartpunkt, welcher wenigstens umfasst: – ein Markergen, welches in einem bakteriellen Wirtsstamm exprimiert wird, – ein wirksames Replikationssystem, welches ab einer Temperatur, welche mit der Lebensfähigkeit des Wirtsstamms verträglich ist, wärmesensitiv ist, dessen Replikationsinhibitionstemperatur unter oder bei ungefähr 37°C liegt und dessen rollender Kreis-Replikationssystem jenes ist, welches sich auf dem größten Cla1-Fragment des Plasmids pWV01 befindet, welches wenigstens eine Mutation in der Thal-Rsal-Region aufweist.
Plasmidvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem wenigstens eine DNA-Sequenz umfasst, die zu einer chromosomalen DNA-Sequenz homolog ist, um eine Rekombination zu ermöglichen.
Plasmidvektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markergen derart gelegen ist, dass es im Falle einer Rekombination in das Chromosom integriert wird.
Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Markergen eine Resistenz gegen eine chemische Verbindung sicherstellt oder ein Gen ist, welches die Komplementation oder Ergänzung einer Auxotrophie ermöglicht.
Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das wärmesensitive Replikationssystem oberhalb von 35°C inhibiert wird.
Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid einen Mobilisierungslocus, welcher die Konjugation ermöglicht, umfasst.
Plasmidvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er zwei identische wiederholte Sequenzen umfasst, welche eine Sequenz des Plasmids einrahmen.
Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Mutation in der Region, welche Rep A des Plasmids pWV01 entspricht, aufweist.
Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es bezogen auf die Sequenz von pWV01 wenigstens eine Mutation in einer der folgenden Positionen aufweist: 972, 977, 980, 987.
Plasmid nach einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass das dem Replikationssystem entsprechende Fragment ein Protein kodiert, welches die in der 3 angegebenen Mutationen aufweist.
Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es eine der in 9, 10 oder 11 angegebenen Sequenzen oder eine Sequenz, welche wenigstens 80% Homologie zu diesen Sequenzen aufweist, umfasst.
Plasmid nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es bei 28°C replikativ ist und bei einer Temperatur über ungefähr 35°C nicht-replikativ ist.
Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Mobilisierungslocus der ori T- Locus, welcher aus einem Plasmid eines grampositiven Bakteriums extrahiert worden ist, ist.
Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem ein in E. coli aktives Replikon umfasst, das tatsächlich ein gramnegativ/grampositiv-Shuttle-Plasmid ist.
Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Transposon trägt.
Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem ein Gen, welches ein Protein von Interesse kodiert, unter der Kontrolle der für dessen Expression erforderlichen Elemente umfasst.
Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in freier oder in sein Chromosom integrierter Form enthält.
Verfahren zur Inaktivierung eines in dem Chromosom eines Bakteriums vorhandenen Gens, dadurch gekennzeichnet, dass: a) man in das Bakterium durch Transformation das Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 bis 12, 14, 15 oder 16 einführt, b) man das Bakterium auf selektivem Medium bei einer Temperatur unter der Inhibitionstemperatur des Replikationsstartpunkts kultiviert, c) man die Kultivierungstemperatur auf eine Temperatur über der Inhibitionstemperatur erhöht, d) man die nach mehreren Vermehrungszyklen überlebenden Bakterien gewinnt.
Verfahren zur Inaktivierung eines Gens in einem Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass: a) man in das Bakterium durch Konjugation ein Plasmid nach einem der Ansprüche 6 bis 16 einführt, b) man das Bakterium auf selektivem Medium bei einer Temperatur unter der Inhibitionstemperatur des Replikationsstartpunkts kultiviert, c) man die Kultivierungstemperatur auf eine Temperatur über der Inhibitionstemperatur erhöht, d) man die nach mehreren Vermehrungszyklen überlebenden Bakterien gewinnt.
Verfahren zur Einführung eines heterologen Gens in ein Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass: a) man in das Bakterium durch Transformation oder Konjugation ein Plasmid nach Anspruch 16 einführt, b) man das Bakterium auf selektivem Medium bei einer Temperatur unter der Inhibitionstemperatur des Replikationsstartpunkts kultiviert, c) man die Kultivierungstemperatur auf eine Temperatur über der Inhibitionstemperatur erhöht, d) man die nach mehreren Vermehrungszyklen überlebenden Bakterien gewinnt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die am Ende von Schritt d) erhaltenen überlebenden Bakterien erneut bei einer Temperatur unter der Inhibitionstemperatur des Replikationsstartpunkts auf nicht-selektivem Medium kultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt b) bei einer Temperatur von ungefähr 28°C ausgeführt wird.