CN115885045A - 质粒拷贝数调节和整合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及优选在原核宿主中的质粒拷贝数调节领域，并提供用于用户控制的质粒拷贝数调节的材料和方法。本发明还提供利用本发明提供的拷贝数调节手段的宿主培养方法。本发明尤其允许以高整合效率将靶核酸区段整合入另一核酸。
Description
技术领域
本发明涉及优选原核宿主中的质粒拷贝数调节领域，并提供用于用户控制的质粒拷贝数调节的材料和方法。本发明还提供利用本发明提供的拷贝数调节手段的宿主培养方法。本发明尤其允许以高整合效率将靶核酸区段整合入另一核酸。
发明背景
质粒是染色体外基因组，可以自主和受控地复制。它们通常是环状核酸，其携带自己的复制起点以允许它们独立于宿主微生物染色体的复制而被复制。因此，质粒经常用作载体，将后续核酸片段穿梭到宿主中。质粒通常以其特定的质粒拷贝数为特征。质粒所依赖的复制机制可确保每个宿主细胞中质粒的拷贝数不会高于或低于质粒的特征拷贝数。例如，众所周知的质粒pBR322的拷贝数约为20。该拷贝数在宿主细胞的所有生命阶段或多或少地保持不变。
当质粒含有要在宿主中表达的靶基因时，质粒拷贝数与靶基因的基因剂量密切相关。在发酵过程中，通常希望实现一种或多种靶基因的强表达。实现这种强表达的一种方法是将一个或多个靶基因置于强启动子的控制之下。然而，对于某些宿主微生物，发现可用的启动子不够强。另一种增加靶基因表达的方法是提供更多拷贝的启动子-基因表达盒，从而增加基因剂量。由此，靶基因从几个位置同时转录，这增加了靶基因的表达。然而，增加质粒上表达盒的拷贝数是费力的，并且会导致同源重组，这反过来又会导致靶基因表达盒的不受控制的丢失。
因此已尝试操纵质粒本身的拷贝数。相同质粒之间的同源重组，特别是当仅包含一个靶基因表达盒拷贝时，不太可能导致靶基因丢失。已经提出了几种增加质粒拷贝数的策略。例如，WO2009076196和WO2002029067提供了特定的高拷贝数质粒。WO2007035323提供了其中复制起点可以交换的质粒；这允许在选定的质粒载体中插入已知可提供所需质粒拷贝数的复制起点。
高质粒拷贝数是有代价的。与整个质粒大小相比，靶基因表达盒的大小通常较小。此外，质粒通常需要存在选择标记，通常是抗生素抗性基因，以确保在培养过程中质粒在宿主中的维持。因此，质粒拷贝数的增加导致宿主的高代谢负担，宿主必须转移资源用于质粒主链的复制。这种代谢负担可能成为限制宿主在具有挑战性的条件下生存能力的决定性因素。例如，在靶基因表达已经造成代谢负担的情况下，维持高质粒拷贝数可能会损害宿主在发酵过程中的活力，导致发酵过早停止或目标基因产物产量不足。此外，当宿主被置于新的培养基中时，例如接种发酵罐开始分批发酵时，以及低温保存的培养物解冻后，宿主会经历强烈的代谢压力以适应新环境。在这种情况下，由质粒的自主复制机制决定的、维持高质粒拷贝数的需要，对于宿主细胞来说，可能是过度的，从而导致显著的生长延迟和降低的发酵时空产量。
因此，已经尝试，通过使用温度敏感的复制起点，来限制高拷贝数质粒的质粒复制在一段确定的时间长度上。Olson等人，Journal of Biological Engineering 2012,6:5和WO9318164中给出了此类质粒复制暂时限制的一个例子。后一文献提供了质粒pWV01的温度敏感性质粒变体，用于革兰氏阳性菌，特别是乳酸菌，其中质粒在大约37℃以上不能复制。然而，在这样的系统中，由于该普遍存在的温度，质粒复制要么被完全允许，要么被完全阻止。因此，必须非常小心地防止在需要维持低质粒拷贝数(而不是每个宿主细胞零质粒)的生长阶段意外丢失质粒。
质粒的另一个用途是操纵宿主的非质粒遗传物质，也称为宿主染色体。通过同源重组，质粒能够整合到宿主的染色体中。它们还可以从它们的整合位点被切除，同样例如通过WO9318164的图6、7A和7B及其所附描述中描述的同源重组进行切除。通过这种整合和任选的部分切除，质粒可用于例如失活宿主染色体中的期望核酸序列。失活可由存在完整的插入质粒、或在部分质粒切除后存在质粒的剩余部分而引起。此外，整个质粒的整合和/或在部分质粒切除后留下一段质粒核酸，将允许在特定的宿主染色体位置引入所需的核酸片段，优选包含靶基因表达盒的核酸片段，或引入任何其他所需的核酸元件。
质粒整合作为此类过程的第一步，依赖于质粒与宿主染色体重组而不是继续自主复制的倾向。因此，首先需要确立质粒在宿主细胞中存在。这反过来又依赖于质粒自主复制的能力。然而，当试图将质粒整合到宿主的染色体中时，质粒自主复制的能力会严重降低整合的可能性。因此，已经尝试在此类整合测定试验中使用具有依赖于温度的复制活性丧失的质粒。然而，虽然通过与宿主的最佳温度相比大幅降低或升高培养温度可能可以干扰质粒的复制能力，但这种温度变化会使宿主细胞处于严重的代谢压力之下。例如，在低温下，宿主细胞可能或多或少地处于代谢活跃状态，而在高温下，宿主细胞蛋白质可能会变性。在这两种情况下，质粒整合的可能性都降低了。因此，迄今为止，已发现质粒整合测定试验是不可靠的，需要大量工作来检查通过此类测定试验获得的推定克隆是否确实不含质粒，同时在确切的所需位置整合了仅一个质粒。
因此，本发明的目的是解决现有技术的上述缺陷。特别地，本发明提供了一种简单可靠的质粒拷贝数控制方法。本发明还提供了用于质粒整合的可靠方法。本发明提供了可用于此类方法的质粒和宿主。
发明概述
因此，本发明提供了一种质粒拷贝数控制方法，包括：
i)提供包含质粒的原核宿主，其中质粒具有可被质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，和
ii)调节Rep蛋白的表达，从而将质粒拷贝数调整到所需值。
本发明还提供了一种受控复制质粒，包括
-可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，
-编码Rep蛋白的rep基因，
其中
a)rep基因可操作地连接到异源启动子，和/或
b)质粒包含可操作地连接到异源启动子的阻遏基因，该阻遏基因编码Rep表达的阻遏物。
并且本发明提供了一种复制辅助依赖性质粒，包括
-可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，
-任选地，可操作地连接至编码Rep表达阻遏物的阻遏基因的启动子，
其中质粒不包含编码Rep蛋白的功能性rep基因。
本发明还提供了质粒复制控制宿主，其包含如本文所述的受控复制质粒。还提供了一种质粒复制辅助宿主，包括
i)如本文所述的复制辅助依赖性质粒，和
ii)用于表达rep基因的表达盒，所述表达盒位于宿主染色体中和/或宿主的辅助质粒上。
还提供了一种培养方法，包括
i)提供包含根据本发明的质粒的宿主的起子培养物，
ii)培养所述宿主以实现宿主细胞数量的增加，以及
iii)在步骤ii)期间或之后调整培养的宿主细胞中的质粒拷贝数。
本发明还提供了一种整合方法，包括
i)在原核质粒受体宿主中提供包含选择标记的根据本发明的质粒，
ii)阻止质粒复制，同时保持对选择标记的选择。
尤其是，本发明提供了一种整合方法，包括
i)提供质粒供体宿主和质粒受体宿主，其中
-质粒供体宿主包含根据本发明的受控复制质粒或复制辅助依赖性质粒，该质粒包含选择标记，并且其中
-质粒受体宿主不包含rep基因，
ii)将质粒从质粒供体宿主转移到质粒受体宿主，以及
iii)与步骤ii)同时或在步骤(ii)之后，阻止质粒在质粒受体宿主中复制，同时使质粒受体宿主接受选择压力以迫使选择标记存在于质粒受体宿主中。
附图简述
图1：pE194复制起点的示意图，包括调节基因和特征。非编码序列用浅灰色框表示，ORF用黑色箭头表示。启动子用转角箭头表示。产生的蛋白质在其低聚状态下以深灰色描绘。SSO：单链起点；DSO：双链起点；cop基因：编码“拷贝数控制蛋白”。Cop形成二聚体，并使阻遏物与自身的启动子结合。自Pcop启动子的转录导致涵盖cop和repF基因的mRNA。repF基因：编码RepF蛋白，它与DSO结合并在DSO区域内形成缺口作为质粒复制的起始物，ctRNA：从与repF ORF的5'UTR重叠的负链转录的反向转录RNA，抑制RepF翻译起始。
图2：A)携带所示质粒pKS100(pE194复制起点，cop-repF)和质粒pKS101(pE194(ts)复制起点；标记为cop-repF*)或整合到amyE基因座中的质粒pKS102(无pE194复制起点)(Bs#073)的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168菌株的示意图。LuxABCDE：萤光素酶基因；amy：淀粉酶amyE同源区。B)枯草芽孢杆菌菌株在所示温度下在补充有红霉素(50μg/ml)的LB培养基中振荡培养。生长8小时后取出样品，并通过定量实时PCR确定每个细胞的平均质粒拷贝数。相对PCN：所示质粒相对于染色体末端的相对质粒拷贝数(每个细胞)。Bs#073是整合对照，具有每染色体末端一个质粒主链(虚线)。
图3：A)携带所示质粒pKS100(pE194复制起点，cop-repF)的枯草芽孢杆菌168菌株和带有基因组整合的PxylA-cop表达盒和质粒KS100的枯草芽孢杆菌菌株GXC1的示意图。LuxABCDE：萤光素酶基因；amy：淀粉酶amyE同源区。B)所示菌株的培养物在含有红霉素(50μg/ml)且不含木糖(0％)、含0.125％木糖或含0.5％木糖的LB培养基中于37℃孵育。8小时后取出样品并进行定量实时PCR以确定每个细胞的平均质粒拷贝数。虚线标记每染色体末端一个质粒的拷贝数——整合质粒DNA的比率。相对PCN：所示质粒相对于染色体末端的相对质粒拷贝数(每个细胞)。PxylA：巨大芽孢杆菌(B.megaterium)xylA基因的启动子。
图4：A)带有基因组整合的PxylA-cop表达盒并携带所示质粒pKS100(pE194复制起点，cop-repF)和质粒pKS101(pE194(ts)复制起点；标记为cop-repF*)的枯草芽孢杆菌GCX1菌株的示意图。LuxABCDE：荧光素酶基因；amy：淀粉酶amyE同源区。B)在补充红霉素(50μg/ml)的LB培养基中于30℃下培养8小时后，测量具有质粒pKS100和质粒pKS101的枯草芽孢杆菌GCX1培养物的发光信号和细胞密度(600nm处的OD)。如图所示，相对发光信号(RLU)针对诱导物分子木糖的不同浓度作图。虚线表示参考对照菌株Bs#073的RLU，该菌株具有整合到基因组中的lux操纵子。
图5：A)具有质粒pKS111并携带所示质粒pKS100(pE194复制起点，cop-repF)和质粒pKS101(pE194(ts)复制起点；标记为cop-repF*)的枯草芽孢杆菌PCX1菌株和具有质粒pKS100的枯草芽孢杆菌168菌株的示意图。LuxABCDE：萤光素酶基因；amy：淀粉酶amyE同源区。B)携带质粒pKS111和质粒pKS100或pKS101的枯草芽孢杆菌PCX1培养物在补充有红霉素(50μg/ml)和卡那霉素(20μg/ml)的LB培养基中30℃培养8小时后，测量发光信号和细胞密度(600nm处的OD)。如图所示，相对发光信号(RLU)针对诱导物分子木糖的不同浓度作图。以具有质粒pKS100的参考菌株枯草芽孢杆菌168菌株作为对照，在没有卡那霉素的情况下进行培养。
图6：A)枯草芽孢杆菌168菌株的示意图，所述菌株具有携带以下遗传元件的质粒pBAio-lu-miBs：pE194复制起点(显示为cop-repF)，在PxylA启动子控制下的额外拷贝的cop基因，LuxABCDE操纵子(组成型启动子Pveg下的萤光素酶基因)和淀粉酶amyE同源区(amy)。B)携带质粒pBAio-lumiBs的枯草芽孢杆菌168培养物在补充红霉素(50μg/ml)的LB培养基中30℃培养8小时后的发光信号和细胞密度(600nm处的OD)。如图所示，相对发光信号(RLU)针对诱导物分子木糖的不同浓度作图。依赖于诱导物分子木糖的浓度，具有较低RLU信号。
图7：A)具有携带以下遗传元件的质粒pBAio-lumiBl的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)P308菌株的示意图：pE194复制起点(显示为cop-repF)，PxylA启动子控制下的额外cop基因拷贝、LuxABCDE操纵子(组成型启动子Pveg下的萤光素酶基因)和淀粉酶amyB同源区(amy)。携带pBAio lumiBl的地衣芽孢杆菌P308在补充卡那霉素(20μg/ml)和所示木糖浓度的LB培养基中37℃培养8小时。B)质粒pBAio-lumiBl的相对发光输出RLU针对所示木糖浓度作图。质粒pBAio-lu-miBI的RLU在诱导cop表达时较低。C)在使用所示木糖浓度表达cop时，地衣芽孢杆菌P308中pBAio lu-miBl的平均质粒拷贝数。培养8小时后取出样品，并通过定量实时PCR确定每个细胞的平均质粒拷贝数。相对PCN：质粒相对于染色体末端的相对质粒拷贝数(每个细胞)。虚线表示单拷贝染色体整合水平。
图8：cop过表达和温度变化相结合的100％ Campbell重组效率。A)携带具有luxA同源区的pKS137质粒的发光地衣芽孢杆菌LBL细胞的两种状态的示意图。质粒自主复制，基因组编码的lux-ABCDE序列完好无损，所有细胞都显示发光。当质粒复制被废除时，pKS137通过与同源区(luxA')同源重组，整合到基因组luxA序列中，从而破坏编码萤光素酶亚基的该基因。具有这种基因型的细胞不再能够产生功能性萤光素酶并且不发光。B)地衣芽孢杆菌中基于发光的质粒整合率评估。具有质粒pKS137的地衣芽孢杆菌菌株LBL在LB琼脂平板上铺板后的第二天在液体培养物中培养，两者都补充了20μg/ml卡那霉素。“+”表示补充0.5％诱导物分子木糖，培养温度为37℃或45℃。显示以下条件的结果：日培养物中无木糖，琼脂平板中无木糖(白色条)；日培养物中无木糖，琼脂平板中有0.5％木糖(右斜阴影)；日培养物中有0.5％木糖并且在琼脂平板中没有木糖(黑色)；或者在日培养物中有0.5％木糖，在琼脂平板中有0.5％木糖(交叉线)。
发明详述
本发明的教导在此使用语言手段表达，特别是通过使用科学和技术术语进行表达。然而，本领域技术人员理解，语言手段，尽管它们可能是详细和精确的，但只能近似给出技术教导的全部内容，即使仅仅是因为有多种表达教导的方式，由于每种表达都必然总有结束，每一种都必然无法完全表达所有概念上的联系。考虑到这一点，本领域技术人员理解，本发明的主题是本文所表示或表达的各个技术概念的总和，受书面描述的固有约束，这些概念不得不以部分代替全局的方式进行表达。特别地，本领域技术人员将理解，在本文中，各个技术概念的含义是以缩写表示方式来完成的，其可以在技术上合理的范围内阐明每个可能的概念组合，因此，例如三个概念或实施方案A、B和C的公开，是概念A+B、A+C、B+C、A+B+C的缩写表示方式。特别地，特征的后备在本文中通过汇聚可选方案或实例的列表来描述。除非另有说明，本文描述的发明包括此类可选方案的任何组合。从这样的列表中选择或多或少优选的元素是本发明的一部分，并且这样的选择可以因技术人员对最小程度实现各个特征所传达的一个或多个优点的偏好所致。这样的多个组合实例是本发明的充分优选的形式。
如本文所用，单数和单数形式的术语如“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非内容另有明确规定。因此，例如，术语“一个核酸”的使用任选地包括，实际上，该核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。同样如本文所用，词语“包含”或诸如“包括”或“含有”的变体将被理解为指，包括了规定的元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组。
如本文所用，术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能组合，以及当以备选(“或”)解释时不组合。术语“包含”还涵盖术语“由……组成”。
术语“约”，在用于可测量值，例如质量、剂量、时间、温度、序列同一性等量时，是指±0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、或甚至20％的规定值变化以及所述规定值。因此，如果给定的组合物被描述为包含“约50％的X”，则应理解，在一些实施方案中，该组合物包含50％X，而在其他实施方案中，可以包含40％至60％X之间的任何值(即50％±10％)。
如本文所用，术语“基因”是指生物化学信息，当其在核酸中具体化时，可以转录成基因产物，即另一种核酸，优选RNA，并且优选地还可以翻译成肽或多肽。因此，该术语也用于表示类似于所述信息的核酸部分和此类核酸的序列(本文也称为“基因序列”)。
同样如本文所用，术语“等位基因”是指基因的变异，其特征在于所述基因序列与野生型基因序列相比具有一个或多个特定的差异，而不管是否存在其他序列差异。本发明的等位基因或核苷酸序列变体，与野生型基因的核苷酸序列，至少具有，按递增的优选顺序，30％、40％、50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％-84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸“序列同一性”。相应地，当“等位基因”是指表达肽或多肽的生化信息时，该等位基因的相应核酸序列，与相应的野生型肽或多肽，至少具有，按递增的优选顺序，30％、40％、50％、60％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％-84％,85％,86％,87％,88具有％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸“序列同一性”。
“靶基因”是指具有期望特性的基因或等位基因。根据本发明，靶基因优选地编码酶，更优选地，该酶选自淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶，葡糖苷酶、半纤维素酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、核酸酶、氧化酶、果胶酶、磷酸酶、植酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶和木聚糖酶，更优选蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶，最优选蛋白酶。
氨基酸或核酸序列的突变或改变可以是取代、缺失或插入中的任何一种；术语“突变”或“改变”也包括这些的任何组合。
当与亲本蛋白质或核酸相比时，蛋白质或核酸变体可以通过它们的序列同一性来定义。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”的形式提供。为了在第一步中确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，在这两个序列之间生成成对序列比对，其中两个序列在其全长上比对(即，成对全局比对)。使用执行Needleman和Wunsch算法的程序生成比对(J.Mol.Biol.(1979)48，p.443-453)，优选使用程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))与程序默认参数(gapo-pen＝10.0,gapextend＝0.5和matrix＝EBLOSUM62)。用于本发明目的的优选比对是可以确定最高序列同一性的比对。
以下示例旨在举例说明两个核苷酸序列，但相同的计算适用于蛋白质序列：
Seq A:AAGATACTG长度:9个碱基
Seq B:GATCTGA长度:7个碱基
因此，较短的序列是序列B。
产生显示两个序列完整长度的成对全局比对，其导致
比对中的“I”符号表示残基(这意味着DNA的碱基或蛋白质的氨基酸)相同。相同残基数为6。
比对中的“-”符号表示空位。序列B中由比对引入的空位数为1。序列B边界处由比对引入的空位数为2，序列A边界处由比对引入的空位数为1。
显示比对序列在其完整长度上的比对长度为10。
根据本发明，产生显示较短序列在其完整长度上的成对比对，结果导致：
根据本发明，产生显示序列A在其完整长度上的成对比对，结果导致：
根据本发明产生显示序列B在其完整长度上的成对比对，结果导致：
显示较短序列在其完整长度上的比对长度为8(存在一个空位，这是较短序列的比对长度中的一个因素)。
因此，显示序列A在其全长上的比对长度将为9(意味着序列A是本发明的序列)，显示序列B在其全长上的比对长度将为8(意味着序列B是本发明的序列))。
比对两个序列后，在第二步中，应根据比对确定同一性值。因此，根据本说明书，适用以下同一性百分比计算方式：
％-同一性＝(相同的残基/比对区域的长度，其显示本发明相应序列的全长)*100。因此，根据本发明，与两个氨基酸序列的比较相关的序列同一性，通过将相同残基的数目除以比对区域的长度来计算，该比对区域显示本发明的相应序列的完整长度。该值乘以100得到“％-同一性”。根据上面提供的例子，％同一性是：对于序列A是本发明的序列，(6/9)*100＝66.7％；对于序列B是本发明的序列，(6/8)*100＝75％。
如本文所定义的，术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生，即两种互补核酸都在溶液中。杂交过程也可以通过互补核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖珠或任何其他树脂上来进行。杂交过程还可以通过如下方式发生：其中一种互补核酸固定到固体支持物如硝化纤维素或尼龙膜上，或通过例如光刻术固定化到例如硅质玻璃载体(后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)上。为了允许发生杂交，通常将核酸分子热变性或化学变性，以将双链熔解成两条单链和/或从单链核酸去除发夹或其他二级结构。
术语“严格性”是指进行杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，低严格条件选择为比具体序列在规定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约30℃。中等严格条件是温度比Tm低20℃，高严格条件是温度比Tm低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，由于遗传密码的简并性，核酸可能在序列上发生偏离但仍编码基本相同的多肽。因此，有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定此类核酸分子。
“Tm”是在规定的离子强度和pH值下的温度，在该温度下，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成和长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。杂交的最大速率在低于Tm约16℃至32℃时获得。杂交溶液中单价阳离子的存在减少了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交形成；对于高达0.4M的钠浓度，这种效果是可见的(对于更高的浓度，这种效果可忽略)。甲酰胺将DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6至0.7℃(每百分比甲酰胺)，添加50％甲酰胺允许杂交在30至45℃下进行，尽管杂交速率将被降低。碱基对错配会降低双链体的杂交速率和热稳定性。平均而言，对于大探针，每％碱基错配，Tm降低约1℃。取决于杂交体的类型，Tm可使用以下公式计算：
·DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984):
Tm＝81.5℃+16.6xlog([Na+]{a})+0.41x％[G/C{b}]–500x[L{c}]-1–0.61x％甲酰胺
·DNA-RNA或RNA-RNA杂交体:
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]{a})+0.58(％G/C{b})+11.8(％G/C{b})2-820/L{c}
·oligo-DNA或oligo-RNA杂交体:
对于<20个核苷酸:Tm＝2({ln})
对于20–35个核苷酸:Tm＝22+1.46({ln})
其中：
{a}或对于其他单价阳离子，但仅在0.01–0.4M范围内准确
{b}仅对30％到75％范围内的％GC准确
{c}L＝双链体的碱基对长度
{d}Oligo，寡核苷酸
{ln}引物有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)
可以使用许多已知技术中的任何一种来控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于不相关的探针，可以通过改变以下之一项进行一系列杂交：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃到42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。本领域技术人员知道在杂交过程中可以改变并且将维持或改变严格条件的各种参数。
除了杂交条件，杂交的特异性通常还取决于杂交后洗涤的函数。为了去除非特异性杂交产生的背景，用稀盐溶液洗涤样品。这种洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低和洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性时进行。阳性杂交给出的信号至少是背景信号的两倍。通常，用于核酸杂交测定或基因扩增检测程序的合适的严格条件如上所述。也可以选择更严格或较不严格的条件。熟练的技术人员知道在洗涤过程中可以改变并且将维持或改变严格条件的各种参数。
例如，对于长度超过50个核苷酸的DNA杂交体，典型的高严格杂交条件包括在65℃下在1xSSC中杂交，或在42℃下在1x SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃下在0.3x SSC中洗涤。对于长于50个核苷酸的DNA杂交体，中等严格杂交条件的例子包括在50℃下在4x SSC中杂交，或在40℃下在6x SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃下在2x SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过如本文所述比对序列和鉴定保守区来确定杂交体长度。1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可额外包含5x Denhardt试剂、0.5-1.0％ SDS、100μg/ml变性、片段化的鲑鱼精子DNA、0.5％焦磷酸钠。高严格条件的另一个例子是在65℃下在包含0.1SDS和可选的5x Denhardt试剂、100μg/ml变性、片段化的鲑鱼精子DNA、0.5％焦磷酸钠的0.1x SSC中杂交，然后在65℃下在0.3x SSC中洗涤。
为了定义严格程度的目的，可以参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:alaboratory manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,NewYork or to Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989年和每年更新)。
如本文所用，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离或被修饰以包含天然不存在的核酸片段或是合成的。
当核酸构建体含有表达多核苷酸所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。
术语“控制序列”在本文中定义为包括影响多核苷酸表达，包括但不限于编码多肽的多核苷酸的表达，的所有序列。每个控制序列对于多核苷酸可以是天然的或外来的，或者彼此是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于启动子序列、5'-UTR(也称为前导序列)、核糖体结合位点(RBS，shine dalgarno序列)、3'-UTR以及转录起始和终止位点。
关于调节元件的术语“功能性连接”或“可操作地连接”应理解为是指，调节元件(包括但不限于启动子)与待表达的核酸序列和如果合适的话，其他调节元件(包括但不限于终止子)的顺序排列，由此每个调节元件均能够实现其预期功能，以允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。例如，将控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列置于适当位置，使得控制序列指导多肽编码序列的表达。
“启动子”或“启动子序列”是位于基因上游的核苷酸序列，与基因在相同链上，使该基因能够转录。启动子之后是基因的转录起始位点。启动子被RNA聚合酶(连同任何所需的转录因子)识别，从而启动转录。启动子的功能片段或功能变体是可被RNA聚合酶识别并能够启动转录的核苷酸序列。
“活性启动子片段”、“活性启动子变体”、“功能启动子片段”或“功能启动子变体”描述启动子的核苷酸序列的片段或变体，其仍然具有启动子活性。
“诱导物依赖性启动子”在本文中应理解为，在将“诱导物分子”添加到发酵培养基时其活性增加从而使得能够转录与该启动子可操作地连接的基因的启动子。因此，对于诱导物依赖性启动子，诱导物分子的存在通过信号转导触发与启动子可操作连接的基因表达的增加。在由存在诱导物分子而被激活之前，基因表达无需是缺失的，而是也可以以低水平的基础基因表达存在，在加入诱导物分子后增加。“诱导物分子”是存在于发酵培养基中能够通过增加与基因可操作连接的诱导物依赖性启动子的活性来实现基因表达增加的分子。优选地，诱导物分子是碳水化合物或其类似物。在一个实施方案中，诱导物分子是芽孢杆菌细胞的次级碳源。在存在碳水化合物的混合物的情况下，细胞会选择性地吸收为它们提供最大能量和生长优势的碳源(一级碳源)。同时，它们抑制参与较不优选的碳源(次级碳源)的分解代谢和吸收的各种功能。通常，芽孢杆菌的一级碳源是葡萄糖，各种其他糖和糖衍生物被芽孢杆菌用作次要碳源。次级碳源包括例如甘露糖或乳糖但不限于这些。与之相反，不依赖于诱导物分子存在的启动子(本文称为“诱导物非依赖性启动子”)的活性，可以是组成型活性的，或者可以被增加，而不管是否存在添加到发酵培养基的诱导物分子。
术语“表达”或“基因表达”是指，一个或多个特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别是指一个或多个基因或遗传构建体转录成结构RNA(例如，rRNA、tRNA)或mRNA，随后将或不将后者翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
术语“载体”在本文中被定义为线性或环状DNA分子，其包含可操作地连接至用于多核苷酸表达的一个或多个控制序列的多核苷酸。
如本文所用，术语“分离的DNA分子”是指，该DNA分子至少部分地与在其天然或自然状态正常与其相关的其他分子分离。术语“分离的”优选地指，DNA分子至少部分地与正常在其天然或自然状态下位于其侧翼的一些核酸分离。因此，融合到它们正常不结合的调节序列或编码序列的DNA分子，例如作为重组技术的结果，在本文中被认为是分离的。当整合到宿主细胞的染色体中或与其他DNA分子一起存在于核酸溶液中时，此类分子被认为是分离的，因为它们不处于其天然状态。
可以使用本领域技术人员熟知的许多方法来分离和操作本文公开的多核苷酸或其片段。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于扩增特定的起始多核苷酸分子和/或产生原始分子的变体。多核苷酸分子或其片段也可以通过其他技术获得，例如通过化学方法直接合成片段，如通常通过使用自动寡核苷酸合成仪实践的那样。多核苷酸可以是单链的(ss)或双链的(ds)。“双链”是指通常在生理学相关条件下，在充分互补、反平行的核酸链之间发生碱基配对以形成双链核酸结构。该方法的实施方案包括其中多核苷酸是选自有义单链DNA(ssDNA)、有义单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、双链DNA/RNA杂交体，反义ssDNA，或反义ssRNA中的至少一种；可以使用任何这些类型的多核苷酸的混合物。
术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然的)多肽在本文中被定义为，非宿主细胞天然的多肽；已通过重组DNA技术进行了结构修饰的宿主细胞天然多肽(其中所述结构修饰为，例如缺失、取代和/或插入，由此改变天然多肽)；或通过重组DNA技术操作宿主细胞DNA而使其表达在数量上发生了改变或者从与天然宿主细胞不同的基因组位置使其表达的宿主细胞天然多肽(例如更强的启动子)。类似地，术语“异源的”(或外源的或外来的或重组的或非天然的)多核苷酸是指，非宿主细胞天然的多核苷酸；已通过重组DNA技术进行了结构修饰的宿主细胞天然多核苷酸(其中所述结构修饰为，例如缺失、取代和/或插入，由此改变该天然多核苷酸)，或通过重组DNA技术操作多核苷酸的调节元件(例如更强的启动子)而使其表达在数量上发生了改变的宿主细胞天然多核苷酸；或作为重组DNA技术遗传操作的结果而整合在非其天然遗传环境中的宿主天然多核苷酸。对于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列，术语“异源的”用于表征这两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列天然并不以该特定的彼此组合方式存在。特别地，当提及启动子-基因组合时，术语“异源”是指在自然界中未发现该启动子和基因的该特定组合。特别是在以下情况下，启动子与基因异源，反之亦然：(a)在野生型细胞中与基因A可操作连接的启动子现在与另一个基因B可操作连接，或(b)自然界中未发现的该启动子与该基因可操作连接，或(c)启动子与具有自然界中未发现的序列的基因可操作连接。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括对核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导、缀合等敏感的任何细胞类型。因此，术语“宿主细胞”包括，能够作为宿主或表达运载体用于新引入的DNA序列(特别是用于表达包含在所述新引入的DNA序列中的靶基因)的细胞。根据本发明的宿主细胞应理解为是原核的并且优选属于革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物，更优选选自:醋杆菌属(Acetobacter)、酸性硫杆菌属(Acidithiobacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮杆菌属(Azotobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、色杆菌属(Chromobacterium),柠檬酸杆菌属(Citrobacter),梭菌属(Clostridium),毛单胞菌属(Comamonas),棒状杆菌属(Corynebacterium),肠球菌属(Enterococcus),大肠杆菌属(Escherichia),黄杆菌属(Flavobacterium),梭杆菌属(Fusobacterium),地芽孢杆菌属(Geobacillus),地杆菌属(Geobacter),葡糖杆菌属(Gluconobacter),螺杆菌属(Helicobacter),泥杆菌属(Ilyobacter),乳杆菌属(Lactobacillus),乳球菌属(Lactococcus),Microlunatus,分枝杆菌属(Mycobacterium),奈瑟菌属(Neisseria),海洋杆菌属(Oceanobacillus),类芽孢杆菌属(Paenibacillus),泛趾菌属(Pantoea),假单胞菌属(Pseudo-monas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、糖多胞菌属(Saccharopolyspora)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Ser-ratia)、中华根瘤菌属(Sinorhizo-bium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、Synechocystis、栖热菌属(Thermus)、脲原体属(Ureaplasma)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)和Zymonas。在革兰氏阴性宿主中，优选变形杆菌(Proteobacteria)，更优选γ变形杆菌(Gammaproteobacteria)，其中特别是弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和黄单胞菌属(Xanthomonas)的宿主，最优选假单胞菌(Pseudomonas)或大肠杆菌(Escherichia coli)。然而，更优选的是革兰氏阳性宿主，尤其是厚壁菌门(Phylum Firmicutes)的宿主，更优选芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)中的任何一种，甚至更优选乳杆菌目(Lactobacillales)或芽孢杆菌目(Bacillales)，甚至更优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)或乳杆菌科(Lactobacillaceae)，甚至更优选乳杆菌属(Lactobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、维尔吉芽孢杆菌属(Virgibacillus)或芽孢杆菌属(Bacillus)，最优选解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefa-ciens)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，最优选属于地衣芽孢杆菌种。本发明的一个优点是，宿主可以或多或少是本发明的质粒能够在其中扩增的任何原核生物，只要存在功能性rep基因即可。因此，本发明的质粒和宿主可有利地用于多种发酵过程。
如本文所用，当提及核酸或多肽时，“重组”表示此类物质已因人类应用重组技术而改变，例如通过多核苷酸限制和连接、通过多核苷酸重叠-延伸，或通过基因组插入或转化。在以下情况下，基因序列开发阅读框是重组的：如果(a)该核苷酸序列存在于其天然序列以外的环境中，例如通过(i)克隆到任何类型的人工核酸载体中或(ii)移动或复制到原始基因组的另一个位置，或者如果(b)该核苷酸序列被诱变而使其与野生型序列不同。术语重组还可以指具有重组物质的生物体，例如，包含重组核酸的植物是重组植物。
术语“转基因”是指包含异源多核苷酸的生物体，优选植物或其部分，或核酸。优选地，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得多核苷酸可以传递给后续的世代。异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的一部分整合到基因组中。“转基因”在本文中用于指其基因型因异源核酸的存在而发生改变的任何细胞或细胞系，包括那些最初发生如此改变的转基因生物或细胞，以及通过杂交或无性繁殖从最初的转基因生物或细胞产生的转基因生物或细胞。“重组”生物体优选是“转基因”生物体。
如本文所用，“诱变”是指与相应野生型生物体或核酸的遗传物质的序列相比，在其天然遗传物质的生物分子序列中具有了改变的生物体或其核酸，其中所述遗传物质的改变是由人类行为引起和/或选择的。诱导突变的方法可以在遗传物质的随机位置诱导突变，或者可以在遗传物质的特定位置诱导突变(即，可以是定向诱变技术)，例如通过使用基因成形术(genoplasty)技术。除了非特异性突变之外，根据本发明，还可以通过使用对特定位点具有偏好性或甚至特异性的诱变手段诱变核酸，从而产生根据本发明的人工诱导的可遗传等位基因。此类手段，例如位点特异性核酸酶，包括例如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶(meganuclease)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)(Malzahn等人，Cell Biosci，2017年，7:21)和规律成簇间隔短回文重复/CRISPR-相关核酸酶(CRISPR/Cas)与工程化的crRNA/tracr RNA(例如，作为单向导RNA，或作为修饰的crRNA和tracrRNA分子以形成双分子向导)，以及使用这种核酸酶靶向已知基因组位置的方法，在本领域中是众所周知的(参见Bortesi和Fischer的综述，2015，Biotechnology Advances 33：41-52；以及Chen和Gao，2014，Plant Cell Rep 33：575-583，以及其中的参考文献)。
如本文所用，“遗传修饰的生物体”(GMO)是这样一种生物体或其后代生物，其中所述生物的遗传特征包含了由人类行为产生的改变，所述人类行为导致转染，由此用来自另一个或“来源”生物的遗传物质或用合成或修饰的天然遗传物质转化了目标生物体，其中所述后代生物保留该插入的遗传物质。来源生物体可以是不同类型的生物体(例如，GMO植物可以含有细菌遗传物质)或来自相同类型的生物体(例如，GMO植物可以含有来自另一种植物的遗传物质)。
术语“天然”(或野生型或内源性)细胞或生物体和“天然”(或野生型或内源性)多核苷酸或多肽是指在自然界中发现的细胞或生物体以及在细胞中发现的处于自然形式和遗传环境中的所讨论的多核苷酸或多肽(即没有任何人为干预)。
如本文所用，“野生型”或“相应的野生型植物”是指生物体或其遗传物质的典型形式，其通常存在的形式，区别于例如诱变和/或重组形式。类似地，“对照细胞”或“野生型宿主细胞”意指，缺乏本文公开的本发明特定多核苷酸的细胞。因此，术语“野生型”的使用并不意在暗示宿主细胞在其基因组中缺乏重组DNA。
如本文所述，本发明提供了质粒拷贝数控制的方法。术语“对照”表示每个宿主细胞质粒的平均拷贝数可以由用户随意调整。因此，本发明允许进行宿主菌株的培养并在培养过程中改变质粒拷贝数。在质粒拷贝数仅由质粒的野生型复制机制自我调节的情况下，这是不可能的。
根据本发明，提供了包含质粒的原核宿主。所述质粒具有可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点。这样的Rep蛋白通常是技术人员已知的。在功能意义上，Rep蛋白及其相应的质粒拷贝数控制野生型机制可分为两组：在第一组和首选组中，Rep蛋白影响质粒复制，通常在任何生理上可接受的Rep蛋白浓度下，通过与复制起点结合来产生该影响。此类质粒、复制起点、Rep蛋白和拷贝数控制产物(Cop和/或反义RNA，也在本文中进一步描述)在Khan,Micro-biology and Molecular Bi-ology reviews,1997,442-455中有详细描述；该文献的内容全部纳入此处。熟知的质粒是属于pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184家族的质粒，允许在大肠杆菌中复制，以及pUB110、pE194、pTA1060和rhoAMbetaII，允许在芽孢杆菌中复制。属于Khan描述的第一组的典型质粒属于pLS1或pUB110家族。在第二组中，Rep蛋白在高浓度表达时充当自身的阻遏物。这种Rep蛋白及其质粒拷贝数自动调节机制在Ishiai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,1994,3839-3843,and Giraldo etal.,NatureStructural Biology 2003,565-571中描述。除非本文特别指出或只要在技术上合理，根据本发明的质粒拷贝数控制可以通过第一组或第二组拷贝数调节机制来实现。但是，优先考虑第一组。
根据本发明，Rep蛋白的表达被调节以将质粒拷贝数调整到期望值。因此，通过干扰宿主细胞，可以随意增加或减少平均质粒拷贝数。特别是，通过直接和特异性干扰Rep蛋白的表达，本发明因此允许修改质粒拷贝数，而不必使宿主经受生理挑战条件如极端温度变化。本发明的一个特别优点是质粒拷贝数可以由用户基本上在任何时候调整，而不是通过加入选定的复制起点(如WO2007035323中所述)、特殊的rep基因表达启动子等来最终确定。
Rep蛋白的表达优选受以下一种或多种调节
a)编码Rep蛋白的rep基因的增加表达，
b)编码Rep蛋白的rep基因的降低表达，
c)编码Rep表达阻遏物的阻遏基因的降低表达，
d)编码Rep表达阻遏物的阻遏基因的增加表达。
Rep蛋白的表达可以通过改变编码Rep蛋白的基因(rep)的转录速率和/或通过改变编码Rep蛋白的mRNA的翻译速率来调节。因此，可以通过增加rep基因及其相应mRNA的转录和/或翻译速率来增加Rep蛋白的表达。相应地，可以通过降低rep基因及其相应mRNA的转录和/或翻译速率来实现Rep蛋白表达的降低。
根据本发明通过增加转录效率来增加基因表达，优选地通过将相应基因置于异源诱导型启动子的控制之下来实现。此类启动子对于任何宿主微生物，特别是本文所述的那些，是技术人员已知的。通常，此类启动子的转录速率受一种或多种响应外部刺激(优选地，向宿主培养基中添加的物质)的转录因子调节。本发明的一个优点是，质粒拷贝数控制方法可以通过使用这种经过良好测试和可靠的启动子和诱导物来进行。技术人员熟知的合适诱导物和相应启动子有IPTG、乳糖、木糖、四环素及其衍生物，例如多西环素(doxocycline)。
诱导型启动子，也称为诱导物依赖性启动子，在本文中应理解为指这样的启动子，在将“诱导物”添加到培养物或发酵培养基中后该启动子活性增加，从而使得与该启动子可操作连接的基因能够转录。因此，对于诱导物依赖性启动子，诱导物分子的存在通过信号转导触发与启动子可操作连接的基因表达的增加。由诱导物分子存在而激活之前，基因表达不需要不存在，而是也可以以低水平的基础基因表达存在，而在加入诱导物分子后增加。“诱导物分子”是存在于发酵培养基中能够通过增加与基因可操作连接的诱导物依赖性启动子的活性来实现基因表达增加的分子。优选地，诱导物分子是碳水化合物或其类似物。在一个实施方案中，诱导物分子是芽孢杆菌细胞的次级碳源。在存在碳水化合物的混合物的情况下，细胞会选择性地吸收为它们提供最大能量和生长优势的碳源(一级碳源)。同时，它们抑制参与较不优化碳源(次级碳源)的分解代谢和吸收的各种功能。通常，芽孢杆菌的一级碳源是葡萄糖，各种其他糖和糖衍生物被芽孢杆菌用作次级碳源。次级碳源包括例如甘露糖或乳糖，但不限于这些。
众所周知的诱导型启动子的例子是来自大肠杆菌的PBAD启动子，其受araC调节，添加阿拉伯糖后araC改变其构象并作为二聚体结合到操纵子位点I1和I2；以及来自芽孢杆菌的甘露糖诱导型启动子系统PmanP，其由激活剂manR调节。诱导型启动子，如用于在大肠杆菌中表达的lacUV5启动子、T7噬菌体启动子，和用于芽孢杆菌中的Pspac-I和Ppac-I启动子，在不存在诱导物分子时受到lac阻遏物(由lacI基因编码)结合的负调控，lac阻遏物结合启动子序列内的特定lac操纵子位点，例如在-35和-10sigA识别位点之间，或附近，即启动子序列的3'或5'，以阻止转录。另一个例子是广泛用于芽孢杆菌表达系统的巨大芽孢杆菌的PxylA诱导型启动子系统。PxylA启动子受xylR阻遏蛋白结合的负调控，该蛋白结合转录起始位点3'的xylR操纵子位点。已经开发出，适用于范围广泛的不同细菌物种的、具有茶碱核糖开关(theophylline riboswitch)的合成诱导表达系统(Topp S,Reynoso CM,Seeliger JC,et al.Synthetic riboswitches that induce gene expression indiverse bacterial species；Appl Environ Microbiol.2010；76(23):7881-7884)。
诱导物依赖性启动子的例子在下表中通过提及相应的操纵子而给出：
相应地，根据本发明通过降低转录效率来降低基因表达，优选通过将相应基因置于异源可沉默启动子的控制下来实现。此类启动子对于任何宿主微生物，特别是本文所述的那些，是技术人员已知的。通常，此类启动子的转录速率受一种或多种响应外部刺激(优选地，向宿主培养基中添加的物质)的转录因子调节。本发明的一个优点是，质粒拷贝数控制方法可以通过使用这种经过良好测试和可靠的启动子和沉默物(silencer substance)来进行。技术人员熟知的合适沉默物和相应的启动子有，应用四环素及其衍生物例如多西环素的tet-off启动子系统；核糖开关启动子系统，不限于辅酶B12核糖开关、赖氨酸核糖开关、TPP核糖开关(Winkler WC,Breaker RR.Regulation of bacterial gene expressionby riboswitches.Annu Rev Microbiol.2005；59:487-517)。
因此，根据本发明的rep基因可以可操作地连接至表达盒中的异源诱导型启动子。在诱导型启动子控制下的rep基因可以存在于质粒和/或宿主染色体中。在这两种情况下，当向宿主菌株提供相应的诱导物时，rep基因的转录速率和相应的Rep蛋白的表达是最大的；在没有这种诱导物的情况下，转录速率和由此Rep蛋白的表达减少。因此，Rep蛋白的表达可以通过在有限的时间内添加诱导物而暂时增加，例如在发酵过程中。这是本发明的一个特别的优点。例如，允许在没有诱导物的情况下从低温保存中复苏宿主菌株培养物，并生长仅包含低质粒拷贝数的起子培养物。如上所述，当微生物经历培养基或其他环境条件的变化时，它们会受到新陈代谢的挑战。通过不强迫宿主在这种条件下维持高质粒拷贝数，本发明允许增加宿主适应生长条件变化的速度，从而允许更快地开始指数生长。本发明的另一个优点是，即使在代谢胁迫条件下，仍然可以维持选择压力，从而防止质粒从宿主培养物中丢失。
在Rep蛋白属于第一和优选的Rep蛋白组的情况下，增加Rep蛋白的表达，导致质粒拷贝数增加。在第二组中，增加Rep蛋白的表达，只在Rep蛋白特定浓度范围导致质粒拷贝数的增加。对于这样的质粒拷贝数调节系统，Rep蛋白的缺失导致质粒从宿主中丢失，这是由于质粒复制起始物的缺失所致。高浓度的Rep蛋白导致Rep自身失活，通常是通过Rep蛋白的二聚化。因此，对于第二组，本发明仍然允许通过将Rep表达从零增加到最佳Rep浓度来暂时增加质粒拷贝数，但也允许通过将Rep浓度增加到超过最佳浓度，从而迫使Rep进入自动抑制，来暂时减少质粒拷贝数Rep浓度。
rep基因也可以可操作地连接至表达盒中的异源可沉默启动子。同样，在可沉默启动子控制下的rep基因可以存在于质粒和/或宿主染色体中。在这两种情况下，添加沉默物都会降低rep基因的转录速率。相应地，Rep蛋白的表达在没有沉默物的情况下最大，而在沉默物存在的情况下减少。对于第一组的Rep蛋白，当在宿主培养的大多数阶段期望高质粒拷贝数而仅在特定阶段需要低拷贝数时，这种配置是有利的，所述特定阶段例如在更换培养基时，在低温保存后复苏期间或在发酵罐接种的最早阶段。只需要在低期望质粒拷贝数的这种例外阶段添加沉默物，本发明允许在较高的质粒拷贝数时对宿主进行所有其他处理而无需添加沉默物。对于第二组的Rep蛋白，这种配置有利于暂时将Rep浓度从自身抑制水平降低到质粒复制允许水平。
除了与诱导型或可沉默启动子偶联之外，另外地或备选地，Rep蛋白的表达还可以通过在异源启动子控制下表达rep基因表达的阻遏物来修饰。这种阻遏物可以是核酸或蛋白质。例如，在pLS1家族的质粒中，两种类型的阻遏物都天然用于调节质粒拷贝数，即与Rep编码mRNA杂交的copA反义RNA和rep基因表达的CopB阻遏蛋白。使用rep基因表达的天然阻遏物具有额外的优势，即rep基因的至少一个拷贝可以保持在Rep表达的天然启动子的控制之下。
优选至少一个rep基因可操作地连接到天然rep基因启动子并且阻遏物是天然rep基因启动子的阻遏物。因此，例如可以在宿主中提供未修饰的高拷贝数质粒，所述宿主在其染色体中或辅助质粒上包含表达盒，该表达盒包含在异源诱导型或沉默型启动子控制下的阻遏基因拷贝。这种质粒-宿主系统的一个优点是，宿主菌株只需通过引入阻遏物表达盒进行一次基因改造；然后，由此产生的宿主可用于控制具有相容rep基因启动子的任何质粒的拷贝数，通过在每个时间点以所需浓度表达阻遏物，以获得所需的Rep表达水平，进而获得所需的质粒拷贝数。
作为可诱导或可沉默启动子的补充或替代，本发明还提供了异源组成型启动子的使用。这导致的阻遏物的数量，将导致该细胞中的恒定拷贝数。组成型启动子的表达速率可以根据所需的表达水平进行调整，例如Guiziou等人，(2016)：Nucleic Acids Res.44(15)，7495-7508或WO2013148321中所述的抗西格玛因子。
阻遏基因可以在异源诱导型启动子的控制下。在这种情况下，将诱导物添加到宿主会导致阻遏基因表达增加，从而导致Rep蛋白表达减少，如上所述。当阻遏基因受异源沉默型启动子控制时，向宿主添加沉默物会导致阻遏基因表达降低，从而导致Rep蛋白表达增加，如上所述。
优选地，rep基因表达在阻遏物核酸和阻遏物蛋白(本文中也称为“Cop蛋白”)两者的控制下。在这样的系统中，编码第一阻遏物的第一基因优选位于质粒上，而编码第二阻遏物的另一基因的表达盒优选位于任何地方，优选整合到宿主的染色体中。因此，第一阻遏物作为质粒拷贝数的自动调节剂起作用：当质粒拷贝数增加时，第一阻遏物的基因剂量也相应地增加。这反过来又导致第一阻遏物浓度增加，从而抑制rep基因表达，从而限制最大质粒拷贝数，而无需用户干预。当质粒拷贝数减少时，第一阻遏物的基因剂量也相应减少。这反过来又导致第一阻遏物浓度降低，从而导致rep基因表达增加，从而再次无需用户采取行动，即可阻止质粒丢失或质粒拷贝数降至最低阈值以下。当rep基因表达在阻遏物核酸和阻遏物蛋白两者的控制下时，优选第一阻遏物是阻遏物核酸，最优选反义RNA，并且表达盒包含启动子，并且与其可操作地连接地，第一阻遏基因优选位于拷贝数待控制的质粒上。这种配置特别有利，因为通过这种方式，自动调节不依赖于代谢成本高昂的阻遏蛋白生产；相反，第一阻遏基因的转录物足以以所需强度抑制Rep表达。另一个优点是核酸阻遏物比蛋白质阻遏物产生更快，并且通常具有更短的半衰期，因此它们可以用于控制Rep表达，只有很短的延迟。反义核酸形式的核酸阻遏物独立于驱动rep基因表达的启动子序列。因此，即使rep基因处于异源启动子的控制下，核酸阻遏物也可以通过阻止或减少rep mRNA转录物的翻译来抑制Rep表达。
相应地，本发明还提供了适用于质粒拷贝数控制的质粒。特别地，本发明提供了一种受控复制质粒，其包含可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点和编码Rep蛋白的rep基因，其中rep基因可操作地连接至异源启动子，并且其中该启动子优选是可诱导的或可沉默的。如上所述，此类质粒允许通过添加诱导物或沉默物来增加或减少Rep蛋白表达。当rep基因能够被至少一种阻遏物阻遏时，该阻遏物优选不是由质粒提供，而是由宿主提供，优选由整合到宿主染色体中的阻遏物表达盒和/或位于辅助质粒上的阻遏物表达盒提供。如上所述，本发明还提供了一种质粒，其包含在异源启动子、优选可诱导或可沉默启动子控制下的rep基因，并且还包含编码Rep表达的核酸阻遏物的基因。这种反义核酸阻遏物独立于驱动rep基因表达的启动子。
本发明还提供了一种受控复制质粒，其包含可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点和编码Rep蛋白的rep基因，其中质粒包含可操作地连接到异源启动子的、编码Rep表达阻遏物的阻遏基因。同样，异源启动子优选是可诱导的或可沉默的。当阻遏物是阻遏物蛋白时，则rep基因处于可被阻遏物蛋白阻遏的启动子的控制之下。在这种情况下，rep基因优选可操作地连接至天然rep基因启动子或衍生自天然rep基因启动子的启动子，其中衍生启动子仍然允许阻遏蛋白结合。
质粒包含可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点、编码Rep蛋白的rep基因，以及在异源诱导型或沉默型启动子控制下的编码Rep表达阻遏物的阻遏基因，这存在一个特别的优点，即，这种质粒的拷贝数可以通过应用相应诱导物或沉默物来控制，而无需对宿主的遗传物质进行任何修饰。因此，这种一体化质粒特别通用。此类质粒的特别优选用途在本文中描述，特别是在附图和实施例中描述。
类似地，本发明提供了一种受控复制质粒，其包含可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点和编码Rep蛋白的rep基因，其中rep基因可操作地连接至异源启动子，并且进一步包含可操作地连接到异源启动子的、编码Rep表达阻遏物的阻遏基因。优选至少可操作地连接到阻遏基因的异源启动子是可诱导的或可沉默的。一种这样的质粒已在上面描述，即包含在异源启动子控制下的核酸阻遏物以阻遏rep基因的质粒。
此外，本发明提供了一种复制辅助依赖性质粒，其包含
-可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，以及
-任选地，可操作地连接至编码Rep表达阻遏物的阻遏基因的启动子，
其中质粒不包含编码Rep蛋白的功能性rep基因。
如本文所述，复制辅助依赖性质粒仍然需要Rep蛋白的活性。然而，Rep蛋白不由位于质粒上的相应表达盒顺式提供。相反，Rep蛋白由位于宿主染色体和/或辅助质粒上的相应表达盒反式提供。此类辅助质粒优选不依赖于Rep蛋白的活性用于复制，因此独立于复制辅助依赖性质粒进行复制。反式提供rep基因的优点是，相应的rep基因表达盒仅需要在宿主中建立一次，优选在其染色体中，由此可用于引入宿主的任何复制辅助依赖性质粒或任何其他受控复制质粒。复制辅助依赖性质粒具有特别的优势。首先，它只在有能力的宿主中复制。因此，复制辅助依赖性质粒是一种特别安全的载体，它本身可以防止不表达Rep蛋白的宿主发生意外转化。此外，复制辅助依赖性质粒特别有利于本文所述的质粒整合方法。
复制辅助依赖性质粒不包含功能性rep基因。功能性rep基因的缺失可以通过从包含rep基因的野生型质粒中切除rep基因来实现。此外，可以使rep基因失活，例如通过引入一个或多个过早终止密码子或通过其他氨基酸改变以编码非功能性蛋白质。此外，优选编码非功能性蛋白质的基因可以没有功能性启动子。最优选地，复制辅助依赖性质粒不包含与以下rep基因具有至少95％、更优选至少90％、甚至更优选至少80％序列同一性的核酸序列，所述rep基因编码根据表1由其Uniprot标识符标识的任何氨基酸序列。
复制辅助依赖性质粒优选还包含编码阻遏物的基因，当在包含用于表达Rep蛋白的表达盒的宿主中表达时，抑制Rep蛋白的表达。如上所述，这样的宿主反式提供rep基因。通过阻遏物控制宿主提供的rep基因的表达，本发明允许控制质粒拷贝数。在这种情况下，在编码Rep蛋白表达的核酸阻遏物的复制辅助依赖性质粒上具有rep基因是特别有利的。如上所述，核酸阻遏物特别有用，例如可以建立反馈机制以限制最大质粒拷贝数而不需要用户干预。
适用于受控复制和复制辅助依赖性质粒的特别优选特征如下所述：
如上所述，可操作地连接到阻遏物和/或rep基因的异源启动子，响应于外部调节物浓度或代谢物浓度的变化。响应于外部调节物浓度的异源启动子在本文中被描述为可诱导或可沉默的启动子。响应于代谢物浓度变化的异源启动子允许在预定的代谢条件下自动诱导或沉默可操作地连接到启动子的基因。特别有利的是，在本发明的质粒、宿主染色体和/或辅助质粒上提供受启动子控制的阻遏基因，使得阻遏基因在发酵后期在宿主细胞停止呈指数增长时沉默。在这种接近分批发酵结束的阶段，宿主的生存能力不再是问题。相反，最大化位于质粒上的靶基因的“最后一分钟”表达可能是更为期望的。这种“最后一分钟”的表达诱导可以通过去除对质粒拷贝数控制的抑制来实现，从而增加质粒拷贝数并因此增加靶基因剂量。响应于此发酵结束条件的合适启动子是例如，在严格限制下沉默的启动子、或在孢子形成开始时沉默的启动子。这种启动子的一个例子是枯草芽孢杆菌的abrB。
根据本发明的质粒优选是如上所述的滚环复制型质粒。因为Rep蛋白不充当自阻遏物，这样的质粒允许特别容易和可靠地控制复制。因此，改变宿主细胞中Rep蛋白的浓度不必像第二Rep组质粒那样进行微调。
此外，质粒优选包含以下的一种或多种：
-可选择标记，
-靶基因，
-包含可操作地连接至靶基因的启动子的表达盒，
-重组位点。
选择标记允许确保质粒在宿主细胞中的存在。如上所述，选择标记还允许确保本发明的质粒通过同源重组高效整合到前面的核酸中，优选整合到宿主的染色体中。
靶基因优选编码酶，更优选地，酶选自淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半纤维素酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、核酸酶、氧化酶、果胶酶、磷酸酶、植酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶和木聚糖酶，更优选蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶，最优选蛋白酶。本发明的一个特别优点是本发明的质粒可用于表达工业发酵过程中常见的多种靶基因。
本发明还提供了质粒复制控制宿主，其包含如本文所述的受控复制质粒。这种宿主特别适合根据用户定义的需要来改变质粒拷贝数。特别地，此类宿主允许在制备低温保存培养物或复苏低温保存的培养物样品时暂时减少质粒拷贝数。
质粒复制控制宿主优选反式提供编码Rep表达阻遏物的阻遏基因，该阻遏基因可操作地连接到异源诱导型或沉默型启动子。这允许通过诱导宿主提供的rep基因的表达，暂时减少质粒拷贝数；或通过减少宿主提供的rep基因的表达，暂时增加质粒拷贝数。优选地，质粒复制控制宿主反式提供编码如本文所述的Rep表达阻遏蛋白的基因。
本发明还提供了一种质粒复制辅助宿主，包括
i)根据本发明的复制辅助依赖性质粒，和
ii)位于宿主染色体和/或宿主辅助质粒上的用于表达rep基因的表达盒。
如上所述，此类质粒复制辅助宿主反式提供Rep蛋白，因此特别适合维持复制辅助依赖性质粒。因此，质粒复制辅助宿主是安全框架的一部分，可以防止复制辅助依赖性质粒意外传输到不反式提供Rep蛋白的另一个菌株。
鉴于上述优点，本发明还提供一种培养方法，包括
i)提供包含根据本发明的质粒的宿主起子培养物，
ii)培养所述宿主以实现宿主细胞数量的增加，以及
iii)在步骤ii)期间或之后调整培养的宿主细胞中的质粒拷贝数。
如本文所述，质粒可以是受控复制质粒或复制辅助依赖性质粒。在后一种情况下，宿主应该是质粒复制辅助宿主。
在根据本发明的上述培养方法中，提供了起子培养物。这种起子培养物优选是在与培养方法的步骤ii)中所经历的代谢条件显著不同的代谢条件下维持的培养物。优选地，起子培养物是待从冷冻保存中复苏的培养物样品。还优选地，起子培养物是用于接种发酵罐的培养物样品并且因此经历培养体积的变化，从不超过100ml的起子培养体积转变到至少1立方米的发酵体积。
在步骤ii)中培养起子培养物以增加宿主细胞数量。通常这会导致培养基的光密度增加。本发明不限于实现宿主细胞数量增加的特定培养基或特定方法。相反，本发明的培养方法有利地广泛应用于工业发酵过程。
在步骤ii)期间或不太优选地之后，调节培养的宿主细胞中的质粒拷贝数。调节优选是暂时减少质粒拷贝数、增加质粒拷贝数、或减少然后增加拷贝数。
如上所述，本文提供的培养方法，即使在具有挑战性的代谢条件下，例如在更换培养基时或在冷冻保存后复苏时，通过在此类条件下保持低拷贝数并且仅在稍后(当预期宿主能够维持高质粒拷贝数而不影响生长时)增加质粒，从而允许宿主增殖。
质粒拷贝数的调节可以延迟在步骤ii)开始后。通常将起子培养物置于新培养基中或新培养基上以启动宿主细胞增殖。质粒拷贝数的减少优选在步骤ii)开始时进行。这样，宿主细胞培养物就可以从维持高质粒拷贝数的代谢负担中解脱出来。优选在宿主细胞数增加至少25％、更优选至少33％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少75％，甚至更优选至少90％时，开始质粒拷贝数的增加。在这些条件下，成功适应新培养条件的宿主细胞的比例足够高，足以承担增加质粒复制的额外代谢负担。
本发明相应地还提供起子培养物制备方法，其中调节、优选减少宿主培养物中的质粒拷贝数，同时允许培养的宿主细胞增殖。这样，本发明提供特别有利的方法来补充上述起子培养物培养方法。通过在低温保存、培养基改变、接种大体积新培养基或其他显著的代谢应激事件之前减少宿主细胞培养物中的质粒拷贝数，缓解了由质粒扩增对宿主细胞造成的一些胁迫。通过使用这种起子培养物制备方法，本发明有利地提供质粒拷贝数已经减少的起子培养物。因此，即使在没有任何用户交互的情况下，这种起子培养物也可以免除，在这些起子培养物的培养开始后，例如在这种低温保存的起子培养物复苏后，立即保持高质粒拷贝数的初始代谢负担。该起子培养物制备方法因此有利地提供起子培养物，其中在上述培养方法的步骤ii)中，不需要额外减少质粒拷贝数。
此外，本发明提供在起子培养基中包含根据本发明的质粒复制控制宿主或质粒复制辅助宿主的起子培养物，其中宿主的质粒拷贝数在将宿主转移到LB培养基(即10g胰蛋白胨、10g NaCl、5g酵母提取物和950g水的培养基)中之后增加。因此，即使不需要额外的用户干预，本发明的这种起子培养物也有利地达到了质粒拷贝数的自然增加。应当理解，起子培养物可以添加到符合宿主代谢需求而选择的任何合适的培养基中，并且不限于在LB培养基中生长。
根据本发明，低质粒拷贝数优选为最大质粒拷贝数的至多一半、更优选至多35％、更优选最多30％、更优选至多25％、更优选至多20％、更优选至多10％，其中最大质粒拷贝数确定为以下(a)和(b)中的最大值：
a)相应野生型质粒在相应宿主中的平衡质粒拷贝数，和
b)通过应用诱导物或沉默物增加Rep表达(如适用)而达到的本发明的质粒在相应宿主中的最大质粒拷贝数。
优选地，低质粒拷贝数是1-15，高质粒拷贝数为20-100。更优选地，低质粒拷贝数是1-10，高质粒拷贝数为30-60。例如，对于pE194复制子(pLS1家族)的质粒，优选的高质粒拷贝数目为每个宿主细胞30-40个质粒，优选的低质粒拷贝数为每个宿主细胞1-10个质粒。
本文还提供整合方法。如上所述，根据本发明的整合可以是整合入宿主染色体，但也可以是整合入另一质粒。然而，根据本发明，优选用于整合方法的宿主不包含除本发明的质粒以外的质粒。这样，该整合方法就不容易受存在于宿主中的两种不同质粒的复制不兼容性的影响。
在步骤i)中，提供包含本发明质粒的原核质粒受体宿主。该质粒优选为受控复制质粒，因此包含用于rep基因表达的表达盒。该质粒也可以是复制辅助依赖性质粒。用于根据本发明的整合方法的质粒包含选择标记。选择标记允许确定至少该选择标记核酸区段在受体宿主中的存在。
在步骤ii)中，质粒复制被阻止，同时保持对选择标记的选择。持续的选择压力迫使受体宿主中至少保持选择标记核酸区段。然而，由于质粒在步骤ii)中不能复制，在没有选择压力的情况下，质粒将从受体宿主中丢失。因此，质粒的持续存在对于受体宿主的生存至关重要。在这种情况下，受体宿主被迫将质粒整合到宿主染色体中，因为宿主只有在整合质粒后才能承受持续的选择压力。
根据本发明阻止质粒复制，可以通过以下一种或多种方法实现：
-在rep基因与诱导型异源启动子有效连接时，去除所需的诱导物，
-在rep基因与可沉默异源启动子有效连接时，添加沉默物，
-在阻遏基因与异源启动子有效连接时，通过添加诱导物来产生Rep表达的阻遏物，
-在阻遏基因与可沉默启动子有效连接时，通过去除沉默物来产生Rep表达的阻遏物。
优选地，该阻遏物是蛋白质阻遏物，并且该rep基因处于可被该蛋白质阻遏物抑制的启动子的控制下。一个特别的优势是，本发明的整合方法可以应用于广泛使用的质粒，而不修饰质粒的复制操纵子。在这种情况下，受体宿主反式提供处于诱导型或可沉默启动子控制下的阻遏基因。然而，在宿主不必反式提供阻遏基因的情况下，整合方法也适用。在这种情况下，质粒提供处于诱导型或可沉默启动子控制下的阻遏基因。当然，质粒和宿主都可以提供处于诱导型或可沉默启动子控制下的阻遏基因，从而在整合方法的步骤ii)期间有利地增加宿主中的阻遏物浓度。
如实施例中所示，本发明以高可靠性达到了质粒完全整合到宿主染色体中，这是一个特别的优势。
在根据本发明的一个具体整合方法中，将质粒从质粒供体宿主转移到质粒受体宿主。此方法有利地允许例如以高质粒拷贝数在质粒供体宿主中培养质粒，然后将质粒转移到其不能在其中复制的受体宿主。质粒的转移可以通过任何合适的方式实现，例如通过电穿孔或通过接合。接合是特别优选的转移方法，因为它对受体宿主非常温和。这具有特别重要的意义，因为对受体宿主施加了选择压力。在这种选择压力下，受体宿主处于立即开始表达质粒的选择标记的严重压力下。在宿主还必须从电穿孔的影响恢复时，受体宿主在此类条件下的生存显著受损。本发明人观察到，电穿孔后受体宿主细胞刚刚死亡，从而降低了添加到受体宿主细胞培养物中的抗生素的有效性。这进而导致选择压力的降低，从而减少了受体宿主整合质粒核酸的需要。此外，许多在工业发酵过程中具有有意义特性的宿主不能可靠地进行电穿孔。
因此，本发明提供整合方法，其包括以下步骤：
i)提供质粒供体宿主和质粒受体宿主，其中
-该质粒供体宿主包含根据本发明的受控复制质粒或复制辅助依赖性质粒，该质粒包含选择标记，且
-该质粒受体宿主不包含rep基因，
ii)将质粒从质粒供体宿主转移到质粒受体宿主，以及
iii)与步骤ii)同时或在步骤ii)之后，阻止质粒在质粒受体宿主中复制，同时使质粒受体宿主经受选择压力，以迫使选择标记存在于质粒受体宿主中。
如上所述，质粒的转移优选通过接合实现。上述三步整合方法是特别有利的，因为在受体宿主中不存在任何Rep基因会对宿主施加非常高的压力以使质粒整合到染色体中，因为这是保持选择标记核酸序列存在的唯一方式。如果没有整合，选择标记核酸序列将在子细胞中丢失，而子细胞将无法生长。
质粒优选包含重组位点以便于与复制受体宿主的核酸的相容位点的重组。通过在质粒上提供重组位点，质粒与宿主核酸(优选宿主染色体)之间的一个同源重组事件足以达到质粒的完全整合。这是一个特别的优势，因为它保证了所有或基本上所有存活的受体宿主细胞都将整合完整的质粒。因此，本发明的整合方法不仅在产生重组受体宿主方面是有效的，而且是可靠的。
以下通过实施例和附图进一步解释本发明。提供这些实施例和附图作为进一步说明本发明上下文中的选定方面的手段，而并非意在限制对本发明的理解或权利要求的范围。
实施例
除非另有说明，以下实验是通过应用基因工程中使用的标准设备、方法、化学药品和生物化学药品以及通过培养微生物发酵产生的化学化合物来进行。还参见Sambrook等(Sambrook,J.和Russell,D.W.Molecular cloning.A laboratory manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001)和Chmiel等(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik,Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1991)。分子生物学中的标准方法，不限于大肠杆菌微生物的培养、DNA的电穿孔、基因组和质粒DNA的分离、PCR反应、克隆技术，基本上按Sambrook和Rusell.(Sambrook,J.和Russell,D.W.Molecular cloning.A laboratory manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001.)所述进行。
表1：质粒及相应rep和阻遏基因的NCBI来源(登录日期2020年6月2日)
电穿孔感受态地衣芽孢杆菌细胞和电穿孔
通过电穿孔将DNA转化到地衣芽孢杆菌菌株DSM 641和ATCC 53926中。电穿孔感受态地衣芽孢杆菌细胞的制备和DNA的转化基本上按Brigidi等(Brigidi,P.,Mateuzzi,D.(1991).Biotechnol.Techniques 5,5)所述进行，进行以下修改：DNA转化后，将细胞回收到1ml LBSPG缓冲液中，并在37℃下孵育60分钟(
J.,1989,FEMS Microbio.Lett.,61:165-170)，然后接种在选择性LB琼脂平板上。
为了克服地衣芽孢杆菌菌株DSM 641和ATCC 53926的地衣芽孢杆菌特异性限制修饰系统，如下文所述从Ec#098细胞中分离质粒DNA。为了在地衣芽孢杆菌限制酶敲除菌株中转移，从大肠杆菌INV110细胞分离质粒DNA(Life technologies)。
电穿孔感受态短小芽孢杆菌细胞和电穿孔
通过电穿孔将DNA转化到短小芽孢杆菌DSM14395中。电穿孔感受态短小芽孢杆菌DSM14395细胞的制备和DNA的转化按照针对地衣芽孢杆菌细胞所述进行。
为了克服短小芽孢杆菌特异性限制性修饰系统，从大肠杆菌DH10B细胞分离质粒DNA，并按照专利DE4005025中针对地衣芽孢杆菌所述的方法，用来自短小芽孢杆菌DSM14395的全细胞提取物体外甲基化质粒DNA。
质粒分离
通过(Sambrook,J.和Russell,D.W.Molecular cloning.A laboratory manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001)中所述的标准分子生物学方法或碱裂解法(Birnboim,H.C.,Doly,J.(1979).Nucleic Acids Res 7(6):1513-1523)，从芽孢杆菌和大肠杆菌细胞分离质粒DNA。在细胞裂解之前，与大肠杆菌相比，用10mg/ml溶菌酶在37℃下处理芽孢杆菌细胞30分钟。
寡核苷酸退火形成寡核苷酸双链体
将寡核苷酸在水中调整至浓度为100μM。将5μl正向寡核苷酸和5μl相应的反向寡核苷酸添加到90μl 30mM Hepes缓冲液(pH 7.8)中。将反应混合物加热至95℃5分钟，然后按0.1℃/秒从95℃降温至4℃进行退火(Cobb,R.E.,Wang,Y.,&Zhao,H.(2015).High-Efficiency Multiplex Genome Editing of Streptomyces Species Using anEngineered CRISPR/Cas System.ACS Synthetic Biology,4(6),723–728))。
菌株
大肠杆菌菌株Ec#098
大肠杆菌菌株Ec#098是携带DNA甲基转移酶编码表达质粒pMDS003(WO2019016051)的大肠杆菌INV110菌株(Life technologies)。
地衣芽孢杆菌基因敲除菌株的产生
对于地衣芽孢杆菌菌株DSM641和ATCC 53926(US5352604)及其衍生物中的基因缺失，将缺失质粒转化到按照Chung(Chung,C.T.,Niemela,S.L.,and Miller,R.H.(1989).One-step preparation of competent Escherichia coli:transformation andstorage of bacterial cells in the same solution.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86,2172-2175)的方法制备的感受态大肠杆菌菌株Ec#098中，在37℃下在含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上进行选择。从单克隆分离质粒DNA，并用于随后转移到地衣芽孢杆菌菌株中。分离的质粒DNA分别携带地衣芽孢杆菌菌株DSM641和ATCC53926的DNA甲基化模式，在转移到地衣芽孢杆菌中时受到保护而不会降解。
地衣芽孢杆菌P304：缺失限制性内切酶
按上文所述制备电穿孔感受态地衣芽孢杆菌DSM641细胞(US5352604)，并用1μg从大肠杆菌Ec#098分离的pDel006限制酶基因缺失质粒转化，然后在30℃下接种在含有5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上。
基因缺失流程按下述进行：
携带质粒的地衣芽孢杆菌细胞在45℃下在含5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上培养，驱动缺失质粒通过Campbell重组整合到染色体中，pDel006的一个同源区与该限制酶基因5’或3’的序列同源。挑取克隆，并在无选择压力的LB培养基中45℃培养6小时，然后在30℃下接种在含5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上。挑取单克隆，用寡核苷酸SEQ ID NO.14和SEQID NO.15，通过菌落-PCR分析，针对限制酶基因的成功基因组缺失进行筛选。挑取推定为缺失阳性的单克隆，并在45℃下在不含抗生素的LB培养基中连续培养两个过夜以固定质粒，并接种在LB琼脂平板上进行37℃过夜培养。通过菌落PCR，针对限制酶基因的成功基因组缺失，分析单克隆。分离出具有正确缺失的限制酶基因的红霉素敏感单克隆，并将其命名为地衣芽孢杆菌P304。
地衣芽孢杆菌P308：缺失聚γ-谷氨酸合成基因
按上文所述制备电穿孔感受态地衣芽孢杆菌P304细胞，并用1μg从大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)分离的pDel007 pga基因缺失质粒转化，然后在30℃下接种在含有5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上。
基因缺失流程按照针对限制酶基因的缺失所述进行。
用寡核苷酸SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18通过PCR分析pga基因的缺失。将得到的pga合成基因缺失的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P308。
地衣芽孢杆菌LBL菌株：lux基因整合到amyB基因座中
按上文所述制备电穿孔感受态地衣芽孢杆菌P308，并用1μg从大肠杆菌INV100分离的质粒pKS068转化，然后在30℃下接种在含有50μg/ml红霉素的LB琼脂平板上。
基因缺失流程按照针对限制酶基因的缺失所述进行。
用寡核苷酸SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，通过PCR分析amyB基因的缺失和lux表达盒的整合，并在用Lugol溶液进行碘染色后分析含有1％淀粉的LB琼脂平板上的透明区。将所得到的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌LBL。
地衣芽孢杆菌Bli#002：缺失aprE基因
按上文所述制备电穿孔感受态地衣芽孢杆菌ATCC53926细胞，并用1μg从大肠杆菌Ec#098分离的pDel003 aprE基因缺失质粒转化，然后在30℃下接种在含有5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上。
基因缺失流程按照针对限制酶基因的缺失所述进行。用寡核苷酸SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21通过PCR分析aprE基因的缺失。将所得到的缺失aprE基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为Bli#002。
地衣芽孢杆菌Bli#005：缺失聚γ-谷氨酸合成基因
按针对在地衣芽孢杆菌P304中缺失pga基因所述，在地衣芽孢杆菌Bli#002中缺失聚γ-谷氨酸合成基因，不同之处在于pDel007质粒分离自大肠杆菌Ec#098细胞。将所得到的菌株命名为Bli#005。
枯草芽孢杆菌菌株GCX1
枯草芽孢杆菌168野生型按照Spizizen(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81,741-746.)的方法制备为感受态，并用以限制性内切酶ApaI线性化的质粒pKS099转化，以将xylR-PxylA-cop盒连同腐草霉素(phleomycin)抗性基因一起整合到sacA基因座中。将细胞涂布在含有5μg/ml腐草霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。挑取长出的克隆，并通过PCR验证表达构建体正确整合入sacA基因座。所得到的枯草芽孢杆菌菌株具有基因型枯草芽孢杆菌168sacA::xylR-PxylA-cop-phleor，命名为GCX1。
枯草芽孢杆菌菌株PCX1
枯草芽孢杆菌168野生型按照Spizizen(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81,741-746.)的方法制备为感受态，并用质粒pKS111转化。将细胞涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。将所得到的枯草芽孢杆菌菌株命名为PCX1，其携带复制型pKS111质粒。
枯草芽孢杆菌菌株KDS
按照Spizizen(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.1961.J.Bacteriol.81,741-746.)的方法，将携带pLS20cat的枯草芽孢杆菌168(Itaya M.等,2006,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,70(3),740-742)制备为感受态，并用线性化(用ScaI切割)的质粒pBS4S(Addgene#55170或BGSCID＝ECE259)转化，从而用壮观霉素抗性盒替换thrC基因座。将细胞涂布在含有100μg/ml壮观霉素和5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。挑取长出的克隆，并测试苏氨酸营养缺陷型。所得到的枯草芽孢杆菌菌株为苏氨酸营养缺陷型，并携带复制型pLS20cat质粒。将它命名为枯草芽孢杆菌KDS。
枯草芽孢杆菌菌株Bs#056
按照Spizizen(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81,741-746.)的方法，将原养型枯草芽孢杆菌菌株KO-7S(BGSCID:1S145；Zeigler D.R)制备为感受态，并按WO2019016051中针对枯草芽孢杆菌Bs#053的产生所述，用线性化DNA甲基转移酶表达质粒pMIS012转化，以将DNA甲基转移酶整合到amyE基因中。将细胞涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板37℃过夜培养。挑取长出的克隆，划线在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板以及含有10μg/ml氯霉素和0.5％可溶性淀粉(Sigma)的LB琼脂平板上，然后37℃过夜培养。淀粉平板用含碘Lugols溶液覆盖，并鉴定出具有阴性淀粉酶活性的阳性整合克隆。在37℃下用溶菌酶(10mg/ml)处理30分钟后，通过标准苯酚/氯仿提取方法分离阳性克隆的基因组DNA，然后通过PCR分析MTase表达盒的正确整合。将所得到的枯草芽孢杆菌菌株命名为Bs#056。
枯草芽孢杆菌菌株Bs#073
按照Spizizen(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81,741-746.)的方法将枯草芽孢杆菌168野生型制备为感受态，并用质粒pKS102转化。该质粒不携带芽孢杆菌中的功能性复制起点，只有通过提供的与amyE基因座同源的区域整合到枯草芽孢杆菌168基因组中时才能稳定地遗传。将细胞涂布在含有50μg/ml红霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。挑取长出的克隆，并通过PCR进行验证。所得到的枯草芽孢杆菌菌株将完整质粒pKS102整合到amyE基因座中，将其命名为Bs#073。
质粒
pEC194RS-芽孢杆菌温度敏感型质粒。
用具有侧翼PvuII位点的寡核苷酸SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，PCR扩增质粒pE194，用限制性内切酶PvuII消化，并连接到用限制酶SmaI消化的载体pCE1中。pCE1是一种pUC18衍生载体，其中氨苄青霉素抗性基因内的BsaI位点已通过沉默突变去除。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将所得到的质粒命名为pEC194S。
用包含用于限制位点BamHI的附加核苷酸的寡核苷酸SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，从质粒pBSd141R(检索号：KY995200)(Radeck,J.,Meyer,D.,Lautenschlager,N.和Mascher,T.2017.Bacillus SEVA siblings:A Golden Gate-based toolbox to createpersonalized integrative vectors for Bacillus subtilis.Sci.Rep.7:14134)，PCR扩增II型装配mRFP盒。用限制酶BamHI限制消化PCR片段和pEC194S，然后连接，并转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化分析其正确性。所得到的质粒pEC194RS携带mRFP盒，其可读框与红霉素抗性基因的可读框相反。
pEC194RS(ts)–芽孢杆菌严格温度敏感型质粒
使用QuikChangeTM试剂盒(Agilent)以及寡核苷酸SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.65，将两个单核苷酸交换引入pEC194RS的pE194复制起点。这些突变对应于Villafane等(Villafane,R.等1987.Replication control genes of plasmid pE194.Journal ofbacteriology,169(10),4822-4829.)描述的温度敏感性突变。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的经序列验证的质粒命名为pEC194RS(ts)。
pEC194RSdelta(cop-repF)–非复制型pEC194RS衍生质粒
pEC194RSdelta(cop-repF)用作整合对照，并且由于cop-repF操纵子的缺失而在芽孢杆菌中为非复制型。用侧翼为NcoI限制位点的寡核苷酸SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29扩增pEC194RS的骨架。用NcoI切割骨架片段，并通过自连重新环化。随后将反应混合物转化入大肠杆菌DH10β细胞(Life tech nologies)。将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将得到的经序列验证的质粒命名为pEC194RSdelta(cop-repF)。
pDel003-aprE基因缺失质粒
用质粒pEC194RS和基因合成构建体SEQ ID NO.19构建地衣芽孢杆菌aprE基因的基因缺失质粒，其中该合成构建体包含aprE基因5’和3’的基因组区，侧翼为与pEC194RS相容的BsaI位点。按(Radeck,J.,Meyer,D.,Lautenschlager,N.和Mascher,T.2017.BacillusSEVA siblings:A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrativevectors for Bacillus subtilis.Sci.Rep.7:14134)所述，用限制性内切酶BsaI进行II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10β细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化分析其正确性。将所得到的aprE缺失质粒命名为pDel003。
pDel006-限制酶基因缺失质粒
用质粒pEC194RS和基因合成构建体SEQ ID NO.13构建地衣芽孢杆菌DSM641(SEQID NO.11)的限制性修饰系统的限制酶基因(SEQ ID NO.12)的基因缺失质粒，其中该合成构建体包含限制酶基因5’和3’的基因组区，侧翼为与pEC194RS相容的BsaI位点。如上文所述用限制性内切酶BsaI进行II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10β细胞(Lifetechnologies)中。将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化分析其正确性。将所得到的限制酶缺失质粒命名为pDel006。
pDel007-聚γ-谷氨酸合成基因缺失质粒
按针对pDel006所述构建用于缺失涉及地衣芽孢杆菌的聚γ-谷氨酸(pga)产生的基因，即ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)，的缺失质粒，但是，使用基因合成构建体SEQ ID NO.16，其包含ywsC、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)基因5’和3’侧翼的基因组区，侧翼为与pEC194RS相容的BsaI位点。将所得到的pga缺失质粒命名为pDel007。
质粒p#0074–xylR-PxylA启动子片段
巨大芽孢杆菌DSM319的xylA基因启动子PxylA和以相反方向位于PxylA 5’的木糖阻遏基因xylR，作为基因合成构建体订购，该构建体针对低含量的限制性内切酶位点进行了优化，侧翼为II型限制性内切核酸酶BpiI位点(SEQ ID NO.22)。
质粒pBW424-低拷贝芽孢杆菌T2A-大肠杆菌穿梭载体
质粒pBW424是基于pBS72复制起点的低拷贝芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体(Titok,M.A.等2003,Plasmid,49(1),53-62.)，具有pUB110的卡那霉素抗性基因、用于大肠杆菌的ColE1复制起点和用于随后克隆表达构建体的II型组装盒。用针对低数量的限制性内切酶位点优化且侧翼为限制性内切核酸酶BsaI位点的基因合成构建体，按下文所述，构建质粒。
SEQ ID NO.68包含pBS72(检索号：AY102630)的复制起点，与公开序列相比针对低数量的限制性内切酶位点进行了优化。SEQ ID NO.69包含来自质粒pBSd141R(检索号：KY995200；Radeck等,2017；Sci.Rep.7:14134)的经修饰的mRFP盒，具有侧翼BpiI的II型限制酶位点、来自地衣芽孢杆菌aprE基因的终止区。
SEQ ID NO.70包含经修饰的pUB110的卡那霉素抗性基因和经修饰的ColE1复制起点。质粒pBW424使用BsaI通过Radeck等2017描述的II型限制性克隆进行组装。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，通过限制消化后进行测序来分析其正确性。将所得到的质粒命名为pBW424。
质粒p#692–具有强终止子的低拷贝芽孢杆菌T2A–大肠杆菌穿梭载体
将t1t2t0终止子(源自pMUTIN)引入pBW424的II型组装盒5’，以防止自卡那霉素选择标记的潜在通读。
通过Gibson组装(
HiFi DNA组装克隆试剂盒，New England Biolabs)将终止子序列t1t2t0整合到pBW424中。为此，使用pMutin2(检索号AF072806)作为模板，用寡核苷酸SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72通过PCR扩增终止子片段(0.44kb)。用寡核苷酸SEQID NO.73和SEQ ID NO.74扩增pBW424的相应载体骨架。使用PCR产物纯化试剂盒(Roche)纯化pBW424扩增子。随后用DpnI(New England Biolabs)消化pBW424 PCR产物后，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)对两个PCR片段进行凝胶纯化，并在50℃下以1:2的比例退火1小时。用组装反应物转化大肠杆菌DH10B菌株，然后接种在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化和测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为p#692。
质粒p#0268–用于II型组装的货物载体
质粒p#0268包含基因合成构建体(SEQ ID NO.23)，并且是pSEVA243(Radeck等,2017；Sci.Rep.7(1):14134)的货物载体衍生物的衍生物，其包含lacZ基因，侧翼带有限制性内切酶BpiI位点和终止区5’和3’，以保护克隆的表达盒免受潜在的转录活性。根据Radeck等2017年的II型组装概念，该改良的lacZ盒侧翼同样有II型限制位点BsaI、BsmBI、AarI RE位点。
质粒p#0268ter–包括上游终止子的用于II型组装的货物载体
质粒p#0268ter用作货物载体，并在插入片段上游包含终止子。用BpiI切割质粒p#0268，用寡核苷酸SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78从p#0692PCR扩增终止子-mRFP片段，随后用限制性内切酶BsaI切割。将两个部分连接，并将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从红色单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为p#268ter。
质粒p#0268cat–带有3’氯霉素抗性基因的货物载体
质粒p#0268cat用作货物载体，并在插入片段下游包含氯霉素抗性盒。用限制性内切酶SmaI在独特的SmaI位点处切割p#0268，并与PCR片段连接，该PCR片段包含氯霉素抗性盒，是用寡核苷酸SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52从pBS3Clux(Radeck等,J BiolEng.2013Dec 2；7(1):29)PCR扩增的。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Lifetechnologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为p#268cat。
质粒p#0268ter-cat–带有5’终止子和3’氯霉素抗性基因的货物载体
质粒p#0268ter-cat用作货物载体，在插入片段上游包含终止子并在插入片段下游包含氯霉素抗性盒。用BpiI切割质粒p#0268cat，用寡核苷酸SEQ ID NO.77和SEQ IDNO.78从p#692PCR扩增终止子-mRFP片段，随后用限制性内切酶BsaI切割。将两个部分连接，并将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从红色单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为p#268ter-cat。
质粒p#0268phleo–带有3’腐草霉素抗性基因的货物载体
质粒p#0268phleo用作货物载体，并在插入片段下游包含腐草霉素抗性盒。在独特的SmaI位点处切割p#0268，并与腐草霉素抗性盒连接，该腐草霉素抗性盒是用寡核苷酸SEQID NO.49和SEQ ID NO.50从pBSc243B(Radeck等,2017；Sci.Rep.7(1):14134)PCR扩增的。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并在限制消化后进行测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为p#268phleo。
质粒p#0268ter-phleo–带有5’终止子和3’腐草霉素抗性基因的货物载体
质粒p#0268ter-phleo用作货物载体，在插入片段上游包含终止子并在插入片段下游包含腐草霉素抗性盒。用限制性内切酶BpiI切割质粒p#0268phleo，并且用限制性内切酶BsaI切割用寡核苷酸SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78从质粒p#0692PCR扩增的终止子mRFP-片段。将两部分连接在一起，将连接混合物转化到大肠杆菌DH10？细胞(Lifetechnologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从红色单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为p#268ter-phleo。
质粒pKS099–用于将xylR-PxylA-cop表达盒整合到枯草芽孢杆菌sacA基因座中的质粒
基因组整合质粒pKS099用于将xylR-PxylAcop插入枯草芽孢杆菌的sacA基因中，并在两步的过程中构建。首先，使用BpiI限制性内切酶，通过II型组装反应，将质粒p#0074(SEQ ID NO.22)的xylR-PxylA片段，与使用寡核苷酸SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60PCR扩增的pE194RS的cop编码区组装到货物载体p#0268ter-phleo中。将反应混合物转化到大肠杆菌DH10？细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒与侧翼均为BsaI位点的sacA基因5’和3’基因组区(使用寡核苷酸SEQ ID NO.53和SEQ IDNO.54以及SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56从枯草芽孢杆菌基因组扩增)以及pBSd191R(Radeck等,2017；Sci.Rep.7:14134；BGSC ID:ECE702)骨架载体组装。按所述用限制性内切酶BsaI进行第二次II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10？细胞中。将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为pKS099。
质粒pKS111：用于cop表达的高拷贝大肠杆菌-低拷贝芽孢杆菌载体
质粒pKS111在芽孢杆菌中用作低拷贝表达载体，用于在来自巨大芽孢杆菌的木糖诱导型启动子PxylA的控制下表达pE194的cop基因。用限制性内切酶BpiI通过T2A组装构建pKS111，具有以下组分：质粒p#0692作为目的载体，质粒p#0074(SEQ ID NO.22)的xylR-PxylA片段，以及用寡核苷酸SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60从pEC194RS扩增的cop片段。将反应混合物转化到大肠杆菌DH10？细胞中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为pKS111。
质粒pBS3KcatluxGG
质粒pBS3KcatluxGG作为PCR扩增II型组装兼容的luxABCDE操纵子的模板。通过使用QuikChangeTM试剂盒(Agilent)以及寡核苷酸SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48引入沉默突变，去除载体pBS3Kcatlux(Popp,P.F.等2017.7(1),1-13.)的luxABCDE操纵子内的所有BsaI、BsmBI和AarI限制酶识别位点。将所得到的具有功能性萤光素酶活性的载体命名为pBS3KcatluxGG。
质粒p#0268ter-Pveglux–Pveg-luxABCDE
质粒p#0268ter-Pveglux将萤光素酶报告基因与来自枯草芽孢杆菌的侧翼为T2A限制性内切酶位点的组成型Pveg启动子结合。使用具有BpiI位点突出端的寡核苷酸SEQ IDNO 062和SEQ ID NO063从TMB3090(Popp,P.F.等2017.The Bacillus BioBrick Box 2.0:expanding the genetic toolbox for the standardized work with Bacillussubtilis.Scientific reports,7(1),1-13.)PCR扩增Pveg片段。用寡核苷酸SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58从pBS3KcatluxGG PCR扩增报告基因luxABCDE。质粒p#0268ter用作货物载体。按(Radeck等,2017；Sci.Rep.7(1):14134)所述，通过限制性内切酶BpiI，通过II型组装反应，构建此中间启动子-报告基因货物载体，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的经序列验证质粒命名为p#0268ter-Pveglux。
质粒pKS100–用于枯草芽孢杆菌的基于pEC194RS的发光质粒
质粒pKS100基于质粒pEC194RS，该质粒另外携带与枯草芽孢杆菌淀粉酶amyE基因同源的600bp片段和处于来自质粒p#0268ter-Pveglux的Pveg启动子控制下的萤光素酶基因。用寡核苷酸SEQ ID NO 066和SEQ ID NO 067PCR扩增淀粉酶基因片段。使5’磷酸化的寡核苷酸SEQ ID NO.79和080退火形成寡核苷酸双链体。如上文所述使用BsaI限制性内切酶通过II型组装构建质粒pKS100，具有以下组分：pEC194RS、PCR片段amyE、寡核苷酸双链体和p#0268ter-Pveglux。将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中，随后将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化和测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为pKS100。
质粒pKS101–用于枯草芽孢杆菌的基于pEC194RS(ts)的发光质粒
按照针对质粒pKS100所述构建pKS101，但使用质粒pEC194RS(ts)。
质粒pKS102–枯草芽孢杆菌中的发光整合质粒
按照针对质粒pKS100所述构建pKS102，但使用质粒pEC194RS？(cop-repF)。
质粒pKS200–用于地衣芽孢杆菌的基于pEC194RS的发光质粒
按照针对质粒pKS100所述构建pKS200，但使用寡核苷酸SEQ ID NO.75和SEQ IDNO.76从地衣芽孢杆菌P308基因组PCR扩增与地衣芽孢杆菌amyB基因的600bp同源的片段，而不是枯草芽孢杆菌amy E片段。
质粒p#0268-PsrfAAlux–PsrfAAluxABCDE货物
按针对质粒p#0028ter-Pveglux所述构建质粒p#0268-PsrfAAlux，具有以下差异。用携带BpiI限制位点的寡核苷酸SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31从枯草芽孢杆菌基因组DNAPCR扩增来自枯草芽孢杆菌的srfAA基因启动子，而不是Pveg启动子。用寡核苷酸SEQ IDNO.57和SEQ ID NO.61从pBS3KcatluxGG PCR扩增报告基因操纵子luxABCDE。
质粒pKS068–luxABCDE整合amyB质粒
质粒pKS068用于将luxABCDE表达盒整合到地衣芽孢杆菌的淀粉酶amyB基因座中。分别用包含侧翼BsaI核酸内切酶限制位点的寡核苷酸SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7、SEQ IDNO.8从地衣芽孢杆菌基因组DNA PCR扩增地衣芽孢杆菌amyB基因的5’和3’区。用质粒pEC194RS、5’amyB同源区、质粒PsrfAAluxABCDE和3’amyB同源区，如上文所述通过II型组装构建质粒pKS068。将反应混合物转化到大肠杆菌DH10β细胞(Life technologies)中，随后将转化体涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化和测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为pKS068。
质粒pBAio–芽孢杆菌一体化载体
pBAio质粒是大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体，具有质粒pEC194RS的温度敏感性复制起点、在大肠杆菌和芽孢杆菌中具有功能的卡那霉素抗性盒以及处于巨大芽孢杆菌PxylA启动子控制下的cop基因的额外拷贝。质粒pBAio由以下遗传元件组成：
i)使用寡核苷酸SEQ ID NO.34(NcoI)和SEQ ID NO.35(PstI)从p#0692PCR扩增的卡那霉素抗性基因和ColE1复制起点，
ii)使用SEQ ID NO.38(SpeI)和SEQ ID NO.39(BamHI)从pKS111扩增的终止子片段，
iii)使用SEQ ID NO.44(NsiI)和SEQ ID NO.45(SpeI)从pKS111 PCR扩增的xylR-PxylA-cop片段，
iv)使用SEQ ID NO.36(BamHI)和SEQ ID NO.37(NcoI)从pEC194RS PCR扩增的II型组装盒，
v)使用SEQ ID NO.42(NcoI)和SEQ ID NO.43(XbaI)从pLS20(Itaya M.等,2006,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,70(3),740–742)PCR扩增的oriT片段，以及
vi)使用SEQ ID NO.40(SpeI)和SEQ ID NO.41(NcoI)从pEC194RS PCR扩增的pE194复制起点。
将片段KanR+ColE1(i)、xylR-PxylA-cop(ii)、终止子(iii)和II型组装盒(iv)在指定的限制位点处切割并连接形成中间构建体(pBAioint)。将反应混合物转化到大肠杆菌DH10β细胞中，随后将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化和测序分析其正确性。在独特的NcoI位点处切割此中间质粒(pBAioint)，用磷酸酶(NEB的rSAP)处理，并通过SLG DNA净化试剂盒(SLG)纯化，随后与片段oriT(v)和pE194复制起点(vi)连接。将反应混合物转化到大肠杆菌DH10β细胞中，随后将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过限制消化和测序分析其正确性。将所得到的质粒命名为pBAio。
pBAio lumiBs–用于枯草芽孢杆菌的基于pBAio的发光质粒
按照针对pKS100所述构建质粒pBAio-lumBs，但使用质粒pBAio替代质粒pEC194RS。
pBAio lumiBl–用于地衣芽孢杆菌的基于pBAio的发光质粒
按照针对pKS200所述构建质粒pBAio lumiBl，但使用质粒pBAio替代质粒pEC194RS。
质粒pKS137–基于pBAio的luxA整合质粒
质粒pKS137用于基于Campbell的重组/整合到luxABCDE操纵子的luxA基因中进行功能失活。用质粒pBAio和侧翼为与pBAio相容的BsaI位点的与luxA同源的500bp区域(使用SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33从pBS3KcatluxGG PCR扩增)构建质粒pKS137。如上文所述使用限制性内切酶BsaI进行II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞中。随后将转化体涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上37℃过夜培养。从单克隆分离质粒DNA，并通过测序分析其正确性。将所得到的luxA基因整合质粒命名为pKS137。
实施例
实施例1：pEC194RS和pEC194RS(ts)衍生物的温度依赖性质粒拷贝数
通过实时定量PCR测定衍生自pE194和pE194(ts)的质粒的温度依赖性拷贝数。
将携带质粒pKS100(基于pEC194RS)、pKS101(基于pEC194RS(ts))的枯草芽孢杆菌168菌株以及携带整合到基因组中的pKS102序列(缺乏cop-repF操纵子)的枯草芽孢杆菌参考菌株Bs#073在含有50μg/ml红霉素的2ml LB-Lennox培养基中30℃搅拌培养16小时。第二天，将培养物在补充有红霉素(50μg/ml)的LB-Lennox培养基中稀释至OD600为0.1，并分入三个摇瓶中，每个摇瓶10ml，然后分别在30℃、37℃和42℃培养。培养8小时后，在细胞达到转换期(transition phase)时，取出样品并通过离心回收细胞。
从各样品分离总DNA，并通过实时定量PCR(qTower3,AnalytikJena，使用
Universal qPCR Master Mix，NEB)测定质粒拷贝数。用编码pEC194RS和pEC194RS(ts)衍生物上的氨苄青霉素抗性基因的bla基因内的寡核苷酸SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27以及染色体末端附近的枯草芽孢杆菌rtp基因座(基因座标签BSU_18490)内的寡核苷酸SEQ IDNO.24和SEQ ID NO 25进行RT-qPCR扩增。纯化的质粒DNA和纯化的染色体DNA作为绝对定量的量度用于计算PCR效率，其分别为99％和98％。
每个细胞的质粒平均数量是相对于染色体末端的数量计算的，后者代表具有一条染色体的单个细胞。
结果如图2所示。具有整合的非复制型质粒骨架的枯草芽孢杆菌菌株Bs#073在所有温度条件下用作单拷贝对照。
质粒pKS100在30℃和37℃下的平均拷贝数分别为38.5和34.1，在非允许温度42℃下，平均拷贝数强烈降低，为4.1。具有更严格的温度敏感性复制起点的质粒pKS101在30℃时的平均拷贝数为25个质粒，在37℃时每个细胞的平均拷贝数为2.9个。在42℃时，平均质粒拷贝数低于1，这表明质粒丢失。没有质粒的细胞在抗生素选择压力下不能存活，但是如通过qPCR分析检测的，它们贡献其基因组DNA。
实施例2：质粒拷贝数减少——cop基因的额外染色体拷贝的表达
枯草芽孢杆菌菌株GCX1携带整合在sacA基因座中的cop基因表达盒。染色体定位的cop基因的转录处于来自巨大芽孢杆菌的木糖诱导型启动子PxylA的控制下，因此cop表达以木糖依赖的方式受到控制。用质粒pKS100转化枯草芽孢杆菌GCX1，并在37℃下在含有红霉素的LB琼脂平板上培养过夜后回收单克隆。用携带pKS100的枯草芽孢杆菌菌株168(参见实施例1)和携带质粒pKS100的枯草芽孢杆菌株GCX1的单克隆来接种2ml含有50μg/ml红霉素的LB-Lennox培养基，然后在37℃下搅拌培养16小时。第二天，将培养物在补充有50μg/ml红霉素的LB Lennox培养基中稀释至OD600为0.1。将10ml携带pKS100的枯草芽孢杆菌菌株168的培养物转移到新的100ml摇瓶中，并在37℃下搅拌培养。将带有质粒pKS100的枯草芽孢杆菌菌株GCX1的培养物分入三个100ml摇瓶，每个摇瓶10ml，补充0％、0.125％或0.5％木糖，并在37℃下搅拌培养。8小时后取出样品，通过离心回收细胞。从各样品分离总DNA，并按照实施例1所述测定每个细胞的平均质粒拷贝数。结果如图3所示。
在枯草芽孢杆菌168菌株中，质粒pKS100的平均质粒拷贝数为34。相比之下，即使在缺乏诱导物分子木糖的情况下，在具有定位在基因组中的额外cop基因拷贝的枯草芽孢杆菌GCX1菌株中，质粒pKS100的平均拷贝数较低，每个细胞的拷贝数为15.4。枯草芽孢杆菌菌株GCX1中pKS100的较低平均拷贝数表明，在缺乏诱导物分子木糖的情况下，来自PxylA启动子的cop基因的低水平、泄露表达。在培养基中存在0.125％或0.5％木糖的情况下，升高的诱导cop表达水平足以阻断质粒复制，如平均拷贝数分别为1或低于1所示。
实施例3：减少质粒拷贝数——cop基因的额外染色体拷贝的表达
质粒pKS100和pKS101携带与枯草芽孢杆菌淀粉酶amyE基因同源的600bp区域，并携带luxABCDE基因作为允许通过发光测量进行定量的报告系统。由于luxABCDE基因的表达处于枯草芽孢杆菌组成型Pveg启动子的控制下，发光信号的减少/增加直接反映了质粒拷贝数的变化。
用携带质粒pKS100(pE194复制起点)和质粒pKS101(pE194(ts)复制起点)的枯草芽孢杆菌菌株GCX1以及具有(通过pKS102)单拷贝整合luxABCDE基因的参考枯草芽孢杆菌Bs#073，接种2ml含50μg/ml红霉素的LB-Lennox培养基，然后在30℃下搅拌培养16小时。第二天，在补充红霉素(50μg/ml)的LB-Lennox培养基中将培养物稀释至OD600为0.1。将各200μl培养物转移到黑色96孔微量滴定板(Sarstedt)中，并补充木糖至终浓度为0％、0.0625％、0.125％、0.25％或0.5％木糖。将细胞在Synergy Neo2 HTS Multi-ModeMicroplate Reader(BioTek)上30℃中度搅拌孵育。培养8小时后测量OD600和发光。在8小时时间点测定相对发光单位(RLU)作为每OD600的发光信号，并对所示木糖浓度作图(图4)。具有整合的lux基因的单拷贝对照菌株Bs#073的RLU用虚线表示。
随着诱导物分子木糖的加入，cop基因的表达从基因组整合的cop基因激活，所得到的质粒pKS100和pKS101的RLU信号的较低水平反映了较低的质粒拷贝数。0.25％和0.50％木糖诱导物分子的浓度使RLU信号降低至低于Bs#073整合对照(图4中的虚线)，这反映了细胞群体内的质粒丢失。相对于缺乏诱导物分子木糖，基因组整合的cop基因的较低cop表达(0.063％，0.125％木糖诱导物分子)显示质粒pKS100和pKS101的稳定较低质粒拷贝数。
这表明质粒拷贝数的减少取决于木糖诱导物分子浓度是可调节的。
实施例4：减少质粒拷贝数——来自第二质粒的cop基因表达
与实施例3类似，将附加的cop基因置于诱导型PxylA启动子的控制之下，然而，该附加的cop表达盒编码在共同驻留的低拷贝质粒pKS111上。
分别用质粒pKS100和pKS101转化枯草芽孢杆菌菌株PCX1(携带pKS111)，并在30℃下在含有50μg/ml红霉素和20μg/ml卡那霉素的LB-Lennox琼脂平板上培养。使用带有质粒pKS100的枯草芽孢杆菌168菌株作为对照。挑取单克隆，并在30℃搅拌下在2ml LB-Lennox培养基中培养16小时。对于枯草芽孢杆菌168菌株背景，向培养基中添加50μg/ml红霉素，对于枯草芽孢杆菌PCX1菌株背景，向培养基中添加50μg/ml红霉素和20μg/ml卡那霉素。第二天，在补充了相应抗生素的LB-Lennox培养基中将培养物稀释至OD600为0.1。将各200μl培养物转移到黑色96孔微量滴定板(Sarstedt)中，并补充木糖至最终浓度为0％、0.0625％、0.125％、0.25％或0.5％木糖。将细胞在Synergy Neo2 HTS Multi-Mode MicroplateReader(BioTek)上30℃中度搅拌孵育。培养8小时后测量OD600和发光。
在8小时时间点测定相对发光单位(RLU)作为每OD600的发光信号，并对所示木糖浓度作图(图5)。
具有质粒pKS100的参考菌株枯草芽孢杆菌168，无论在缺乏或添加浓度递增的诱导物分子木糖的情况下，都显示可比的RLU信号。与来自参考菌株的信号相比，没有诱导物分子时具有质粒pKS100的枯草芽孢杆菌菌株PCX1的RLU信号较低。这表明cop基因的泄露表达。其导致指示较低质粒拷贝数的较低RLU信号(约20％)。通过添加递增量的诱导物分子木糖来增加cop表达，以木糖浓度依赖的方式降低RLU信号。针对具有质粒pKS101的枯草芽孢杆菌PCX1菌株观察到了相同的依赖性，尽管起始水平较低。这与pKS101相比pKS100(实施例1，图2)具有较低质粒拷贝数相符。
与使用具有基因组整合的cop表达盒的枯草芽孢杆菌菌株GCX1的实施例3相比，可以观察到cop表达盒的基于质粒的附加拷贝的效应。具有pBS72复制起点的质粒pKS111每个细胞具有大约6个拷贝(Titok,M.A.等,2003.Plasmid,49(1),53-62.)。这种质粒拷贝效应导致在给定的木糖浓度下cop表达高约6倍以及因此对较低RLU信号的影响，因此可以观察到质粒pKS100和pKS101的较低质粒拷贝数。
实施例5：在枯草芽孢杆菌中从同一质粒pBAio表达附加的cop基因来减少质粒拷贝数
质粒pBAio-lumiBs在功能上与pKS100相似，但如实施例2、3和4所述，还携带处于PxylA启动子控制下的附加cop基因。用pBAio-lumiBs转化枯草芽孢杆菌168菌株，并在30℃下在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上培养。挑取单克隆，并在30℃搅拌下在2ml含有20μg/ml卡那霉素的LB-Lennox培养基中培养16小时。第二天，将培养物在补充有20μg/ml卡那霉素的LB-Lennox培养基中稀释至OD600为0.1。将各200μl培养物转移到黑色96孔微量滴定板(Sarstedt)中，并补充木糖至终浓度为0％、0.0313％、0.0625％、0.125％、0.25％或0.5％木糖。将细胞在Synergy Neo2HTS Multi-Mode Microplate Reader(BioTek)上30℃中度搅拌孵育。培养8小时后测量OD600和发光。在8小时时间点测定相对发光单位(RLU)作为每OD600的发光信号，并对所示木糖浓度作图(图6)。质粒拷贝数的变化反映在质粒pAio-lumiBs上编码的Pveg-lux的发光输出的变化。随着诱导物分子木糖浓度的增加，质粒pBAio-lumiBs上的附加cop基因的表达增加，RLU信号降低，因此质粒pBAio-lumiBs的质粒拷贝数降低。添加0.0313％的木糖导致质粒pBAio-lumiBs的RLU信号降低7倍(非诱导对照的15％)。
实施例6：在地衣芽孢杆菌中从同一质粒pBAio表达附加的cop基因来减少质粒拷贝数
质粒pBAio-lumiB1与pBAio-lumiBs功能相同，在pBAio-lumiBl上存在附加的cop基因，但携带与地衣芽孢杆菌淀粉酶amyB基因座同源的600bp片段。
用pBAio-lumiBl转化枯草芽孢杆菌KDS，并在37℃下在含有20μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养。挑取单克隆，并在37℃搅拌下在2ml含有20μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的LB-Lennox培养基中培养16小时。平行地，在37℃搅拌下在2ml LB-Lennox培养基中培养地衣芽孢杆菌P308 16小时。第二天，按(Itaya M,2006.,BiosciBiotechnol Biochem；70(3):740–742.)所述将pBAio lumiBl接合到地衣芽孢杆菌P308中，将混合细胞涂布在补充了2％葡萄糖、0.2％谷氨酸钾和20μg/ml卡那霉素的微量盐琼脂平板上，并在37℃下培养3天。具有色氨酸和苏氨酸营养缺陷的枯草芽孢杆菌供体菌株KDS不能再在这些琼脂平板上生长。挑取携带pBAio-lumiBl的地衣芽孢杆菌单克隆，并在37℃搅拌下在2ml含有20μg/ml卡那霉素的LB-Lennox培养基中培养16小时。第二天，将培养物在补充有20μg/ml卡那霉素的LB-Lennox培养基中稀释至OD600为0.1。将各200μl培养物转移到黑色96孔微量滴定板(Sarstedt)中，并补充木糖至终浓度为0％、0.0313％、0.0625％、0.125％、0.25％或0.5％木糖。将细胞在Synergy Neo2 HTS Multi-Mode MicroplateReader(BioTek)上37℃中度搅拌孵育。培养8小时后测量OD600和发光。在8小时时间点测定相对发光单位(RLU)作为每OD600的发光信号，并对所示木糖浓度作图(图7B)。质粒拷贝数的变化反映在质粒pAio-lumiBl上编码的Pveg-lux的发光输出的变化。通过添加0.031％木糖诱导物分子诱导cop表达，导致RLU信号降低2.5倍(非诱导对照的40％)。通过增加木糖浓度而增强的cop表达导致更低的恒定RLU信号水平，其对应于质粒pBAio-lumiBl单拷贝整合进入amyB基因座。
与发光实验平行，在8小时时间点从0.0％、0.0313％和0.5％木糖培养物取出样品，并通过离心回收。从各样品分离总DNA，并按实施例1中所述测定每个细胞的平均质粒拷贝数，但是用质粒pBAio-lumiBli的luxB基因内的寡核苷酸SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82以及染色体末端附近的基因BLi02076(基因座标签DSM13)内的寡核苷酸SEQ ID NO.83和SEQ ID NO 84进行RT-qPCR扩增。结果如图7C所示。在没有木糖诱导物分子时地衣芽孢杆菌中pBAio lumiBl的平均质粒拷贝数计算为每个细胞19.3个拷贝。与质粒pKS100(相同的pE194复制起点，每个细胞平均38.5个拷贝；实施例1)相比，该较低的平均拷贝数反映了来自启动子PxylA的泄漏cop表达，因此抑制质粒复制。添加0.313％的木糖导致更低的平均质粒拷贝数，每个细胞11.6个拷贝，这与上述发光数据一致(图7B)。通过添加0.5％木糖的强cop表达导致计算的平均质粒拷贝数为0.8——略低于1.0，这表明质粒丢失。没有质粒的细胞在抗生素选择压力下不能存活，但是如通过qPCR分析检测的，它们贡献其基因组DNA。
实施例7：地衣芽孢杆菌中过量表达cop与转移到非允许温度相组合获得100％Campbell重组效率
基于同源重组的基因缺失或基因整合方法，使用具有温度敏感性复制起点的质粒，例如pE194，通过在选择压力(例如抗生素)下将培养条件转移到非允许温度，迫使质粒首先Campbell重组到具有质粒上存在的同源区的基因组。这一过程并不完全，导致大量细胞可能具有非常低拷贝数的非复制型质粒，最终导致大规模筛选来鉴定正确的克隆。
为了显示基于pBAio的质粒在与宿主基因组同源重组效率方面的更高效率，构建了一个“光开关”。用质粒pKS068将处于来自枯草芽孢杆菌的强PsrfAA启动子控制下的萤光素酶编码基因(luxABCDE报告操纵子)整合到地衣芽孢杆菌P308的淀粉酶amyB基因座中，产生如菌株章节所述的地衣芽孢杆菌菌株LBL。地衣芽孢杆菌LBL的每个细胞都显示发光信号。通过按实施例6(见上文)中所述在地衣芽孢杆菌LBL中接合来转化质粒pKS137(携带与luxA的500bp同源的区域的pBAio质粒衍生物)。挑取一个菌落，并接种在10ml补充有20μg/ml卡那霉素和0.5％木糖的LB-Lennox中，并在37℃下搅拌培养3小时(预培养)。制备一系列稀释液，并将各100μl接种在含有20μg/ml卡那霉素和1％木糖的LB琼脂平板上。琼脂平板在45℃下过夜培养。作为对照，在预培养物和/或琼脂平板中不用木糖处理细胞，在37℃或其组合下培养。第二天，检查菌落是否发光来分析质粒整合状态。用AlphaImagerTM(AlphaInnotech)在默认设置下暴露3分钟，分析琼脂板的发光。第二张照片在高分辨率设置下用反射光拍摄8毫秒。这两张照片使用Fiji(Schindelin等,2012,Nature methods 9(7):676-682)进行叠加。质粒整合率通过非发光菌落的数量除以菌落总数来确定。每个条件平均分析1000个菌落，实验一式三份进行。
具有整合质粒的克隆不显示发光，因为质粒pKS137与luxA基因的同源重组导致质粒整合到基因组中，从而破坏luxABCDE操纵子。示意图如图8A所示，结果如图8B所示。
37℃时，通过接种在含有1％木糖的LB琼脂平板上可达到至多87％的质粒整合率，从而诱导cop表达。通过添加0.5％木糖“预处理”，在液体培养物中诱导cop基因表达，对整体整合效率影响较小。在45℃(非允许温度)时，平均整合率在85％到90％之间，这表明第一步确实效率低下。pE194复制起点在非允许温度(45℃)下的生长与cop表达的诱导组合显示，整合率可以提高到100％(分析的1000多个菌落中没有发光菌落)。
实施例8：自杀载体和方法
应用温度敏感性复制起点的基因缺失(类似基因整合)流程(本文中还针对具有诱导型启动子PxylA控制下的附加cop基因的pBAio质粒进行了描述)用于基因组编辑，其中直接转移包含选择标记(在其每一侧翼具有与受体细胞同源的DNA序列)的线性DNA片段或自杀质粒(不能在宿主细胞中复制)是不成功的，如通过已摄取该DNA并正确整合入基因组的转化体所测定。前者已针对地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和其他物种进行大量描述，后者已针对具有所谓天然感受态的枯草芽孢杆菌实验室菌株(例如枯草芽孢杆菌168菌株)进行描述，其中该细胞主动吸收线性DNA，并伴有高频率的重组。同样，“诱导型感受态”系统已被描述为，基于质粒或基于基因组整合的感受态基因comS和/或comK的过量表达，以增强DNA摄取。还已知的是，地衣芽孢杆菌中mecA基因的附加敲除可以使得该宿主细胞成为线性DNA转化能力提高的受体宿主。显然，该受体宿主在使用前需要进行遗传操作。此外，可能会对宿主的生产能力(如化学物质、聚合物、蛋白质、酶等)产生不利影响。因此，希望应用有效的DNA转移和基因缺失/基因整合流程，而不需要对受体细胞进行修饰。
DNA转移和基因缺失流程包括：
具有营养缺陷(例如丙氨酸消旋酶基因–alr/dal基因的缺失)和接合质粒pLS20(WO0200907)的枯草芽孢杆菌供体宿主。接合质粒pLS20另外携带选择标记(例如氯霉素抗性标记，Itaya等,2006)和反选择标记(例如codBA基因,Kostner等,2013)。枯草芽孢杆菌宿主是枯草芽孢杆菌宿主Bs#056的衍生物，其中氯霉素抗性基因已替换为卡那霉素抗性盒，该卡那霉素抗性盒侧翼为lox位点，随后通过转移质粒pDR244(芽孢杆菌遗传储备中心BGSC：ECE274)上的cre重组酶而去除。用质粒衍生物pBS4S(Radeck等,2013)将质粒pE194的复制盒(nt 920–nt1910；包含处于Pcop启动子控制下的cop和repF基因以及反义ctRNA)整合到苏氨酸(thrC)基因座中，其中壮观霉素抗性盒已替换为卡那霉素抗性盒，该卡那霉素抗性盒侧翼为lox位点，以允许cre介导的标记回收。优选地，将cop基因的附加拷贝置于整合到sacA基因座中的诱导型PxylA基因启动子下，以允许调整pE194衍生物的低拷贝数，如针对枯草芽孢杆菌GCX1所述。
缺失质粒由以下元件组成：
A)抗生素抗性基因(例如质粒pUB110的卡那霉素抗性基因)和ColE1复制；B)pLS20的oriT(Itaya M.等,2006,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,70(3),740–742)；C)包含SSO和DSO的pE194序列(nt 630–nt 920)；D)反选择标记(例如codBA基因Kostner等2013)；E)侧翼为lox位点以及与受体宿主的区域同源的5’和3’500bp区域的壮观霉素抗性盒。
基因整合质粒由以下元件组成：
A)抗生素抗性基因(例如质粒pUB110的卡那霉素抗性基因)和ColE1复制；B)pLS20的oriT(Itaya M.等,2006,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,70(3),740–742)；C)包含SSO和DSO的pE194序列(nt 630–nt 920)；D)反选择标记(例如codBA基因Kostner等2013)；E)异源基因表达盒(启动子-基因-终止子)，其位于侧翼为lox位点的壮观霉素抗性盒的5’。基因表达和壮观霉素抗性盒的侧翼同样是与受体宿主的区域同源的5’和3’500bp区域。
细胞内的质粒复制依赖于染色体或质粒上反式编码的repF蛋白。
D-丙氨酸消旋酶活性原养型的地衣芽孢杆菌受体宿主对5’氟胞嘧啶不敏感，对卡那霉素和壮观霉素抗生素敏感。
通过II型组装，组装基因缺失质粒，转化到枯草芽孢杆菌供体菌株中，然后在补充有20μg/ml卡那霉素、5μg/ml氯霉素、10μg/ml苏氨酸和100μg/ml D-丙氨酸的LB琼脂平板上选择。用菌落PCR鉴定携带正确组装的基因缺失质粒的枯草芽孢杆菌克隆，然后进行质粒分离以及限制酶消化分析和测序。如上文所述，由于repF从染色体上表达，该质粒作为复制型质粒是稳定的。
接下来，基本上按照WO0200907的实施例中针对基于复制型pE194的基因缺失/基因整合质粒所述，通过接合将缺失质粒从枯草芽孢杆菌供体菌株转移到地衣芽孢杆菌受体菌株。根据Itaya等2006对接合进行了修改，其中接合在液体培养物中而不是在固体培养基琼脂平板上进行。
携带缺失质粒的枯草芽孢杆菌供体菌株在补充有20μg/ml卡那霉素、5μg/ml氯霉素、10μg/ml苏氨酸和100μg/ml D-丙氨酸的LB Lennox培养基中培养15-17小时，而地衣芽孢杆菌受体菌株在37℃在LB Lenox培养基中培养。第二天，将培养物在新鲜预热培养基中稀释至光密度OD(600nm)为0.1，并在不含抗生素的培养基中继续培养，直到供体和受体细胞培养物的OD(600)均达到0.8至1.0。取出每种培养物0.5ml，混合并在37℃下孵育15分钟，无需摇动，以允许接合质粒转移。细胞混合物用预热的转化培养基(TM)洗涤一次，然后接种在补充有200μg/ml壮观霉素的TM琼脂平板上，并在37℃下培养24-48小时。
转化培养基TM由含有1.0％葡萄糖、0.2％谷氨酸钾和0.1％酪蛋白氨基酸的Spizizen基本培养基(Anagnostopoulos,C.和Spizizen,J.(1961).J.Bacteriol.81,741-746.)组成。
只有接受了线性单链缺失质粒并以两个同源DNA区的双同源重组成功整合了壮观霉素抗性盒的地衣芽孢杆菌转接合子细胞才能在这些条件下生长。由于地衣芽孢杆菌中不存在repF基因，因此供体质粒的质粒复制不再可能，从而产生接合的“自杀”质粒。
枯草芽孢杆菌供体细胞在缺乏D-丙氨酸的情况下不能生长。然后将地衣芽孢杆菌转接合子接种在含有200μg/ml壮观霉素和20μg/ml氟胞嘧啶的TM琼脂平板上，在37℃下培养24小时。第二步对可自我转移的pLS20CAT接合质粒以及缺失质粒(如果发生通过Campbell重组的整合)的存在，进行反向选择。
所得到的地衣芽孢杆菌菌株的靶基因缺失，对壮观霉素耐药，对5-氟胞嘧啶不敏感，对卡那霉素敏感。
在下一步中，可以通过解离酶(cre-解离酶)介导的标记回收来去除壮观霉素抗性标记。
与其他物理DNA转移方法(如电穿孔或原生质体转化)不同，接合DNA转移使受体细胞易于进行DNA摄取和DNA重组，允许通过这种自杀方法实现特定基因缺失/基因整合。
此外，此方法允许构建强启动子控制下的基因表达盒，其中枯草芽孢杆菌供体菌株中非常低的拷贝数对于稳定维持是绝对必要的。如所述，质粒拷贝数通过repF在细胞中的表达水平被反式控制。在接合转移时，在受体细胞中产生自杀质粒，并且强基因表达盒直接整合到基因组中，而无需多拷贝质粒中间体(这将导致选择在基因表达盒内具有突变的细胞)。
序列表
<110> 巴斯夫欧洲公司(BASF)
<120> 质粒拷贝数调节和整合
<130> PF 191586
<160> 84
<170> 根据 Wipo Std 25
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增pE194
<400> 1
tatatacagc tggattcaca aaaaataggc ac 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增pE194
<400> 2
tatatacagc tggattatgt cttttgcgca gtc 33
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增功能性 mRFP 盒
<400> 3
tatatggatc cgtaatcagg gtatcgaggc 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增功能性mRFP 盒
<400> 4
tatatggatc cctcattagg cgggctacta a 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增amyB 基因组区域
<400> 5
tataggtctc aacccataat gccgtcgcac tgg 33
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增amyB 基因组区域
<400> 6
ccttggtctc gtcgctagaa gagcagagag gacgg 35
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增amyB 基因组区域
<400> 7
ttgagaggtc tcagagacat tttccctata ttttcttcc 39
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增amyB 基因组区域
<400> 8
gtgaggtctc atgagaccat ccgttattga caagg 35
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增amyB 基因组区域
<400> 9
ttgcccgaat acaacgacag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增amyB 基因组区域
<400> 10
caacaacagg ctgtctgacg g 21
<210> 11
<211> 2143
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniforms)
<220>
<223> P300 DSM641 RMS: RMS区和侧翼区
<400> 11
aacttctata aatgtaacga tacgatttat tgtttcatta aagtcttcct ttatttcatg 60
ttcccatatt cttttaatgt tccaatcctt ttcctcgtaa tatttattaa cttccttatc 120
tcttttttta tttctttcga gttttttctc ccaatattcc gtattacttt ttggtatatt 180
cccgtgtttt tcacacgcat gccagaaaca agaatcaatg aatatgacta ttttatattt 240
ctgtattact atatctggac taccgtataa tttcttaaca ttttttcgga atcttattcc 300
acggtgccat agttctttag taaccttatc ttctaatttt gaacgagatt tgattgcctg 360
catgtttttt cttctttgtt cttttgaaac cgtgtcagtc atagaagagt cctccaaagc 420
cacaataatt gtattctata aacgaggaag caagccctca agcttacccc ctcttagttc 480
cttttttgcc tacttattta tttgttttca ttttcaaatt catcataaga acccatttca 540
caaaaatcaa tggagtaatg ttgttcgctg tgtttataaa caattactga gtcaatattt 600
agtctttcca gcatttcata ggttagaagt tctttttcct ctaagttcat aacttgtctt 660
agtagccatt ctccaagagc actatttgga ttagacataa gtgctttact attgtcttgg 720
cataccttgg ctgataaaag cgatttgtct ggcaagcgta actgaaaagg tttatcacga 780
gctgggaaaa atgttgggaa tacattatga atccattttg gaattggtat ataaatctcg 840
ttagggtttc gtggtcgacc taaagcattc cattggttta gaccgctttt ttctggtaca 900
tgacgctttg agccacggtc tgaaaagagt ggaagaataa cgtgctcaag gttttcaaaa 960
ggattgacag ttggtgctgg aatttttgga atttcaaagc caaatagttt agccaattca 1020
tgataaggat tttctaagat ttcaacatta atttcttcaa taggtttatc agtgataaaa 1080
cgcttataaa gggtgctctt agtgacatta aagctgtatt cgtgtagacc gtcttcaaag 1140
gtgattgtat ttctgttgtt acttactttc acatttgtaa ttgaggagat ttcaaccaag 1200
tccattggct cttcaaaaat aagaattttc cctggctttc ttgttacaca gtggtatatc 1260
attgaatcaa taccatatgt tcttttagta aattcaattc tctcgttacg gagagaagca 1320
accgtgttta ttagctcttt tggagatttc ccacgataca agtctgagtc tttattgaat 1380
tcagctactt tttgaagagt atgaccatta ccatgaagaa aagtcttaat accaattccg 1440
acacgattta atgaagcgtc agcagaacag tctgacctcc ccaagttttc agctccaaat 1500
gcttcacaaa aagcattttc cacattcctt gagaccaaat aaggcgagtc actttcagag 1560
aacaaattgg atagcgaacc agttgagcgg agcatttgtt tgtatgtagt gcagttgatg 1620
gctggttgat tagtatagaa cattattttt cctcctcttt tatgcttgtc atttcttctt 1680
tcagacccaa aaggtagtca gctgatacgt tcaatgtttc agctattctt ttgaaagtgt 1740
ccaatgatgg agttctattt tcactttcat atagtgacca agtgcttcta gtgaccccga 1800
ctttttcagc gatttggctg ggtaataacc tacgagcttc tcttgcattt tgaatacgat 1860
ttccaaggaa aggtatcatt tttgcacctc caagatttgt tgttttcaga gtatcaccag 1920
aacccccgaa aatagtccaa agttagctaa cagcaaacaa ataaaaataa ataagttgtt 1980
tactcttagc aaacttgtta ctaaaatttg ataaagttat tcatttaatc cagctcttat 2040
gctaaaattg cattagcgga caagcttaat gtttgcaagg aggtataatt ttgacttatc 2100
gagtaggtag tatgtttgct gggataggtg gaacttgttt agg 2143
<210> 12
<211> 1146
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniforms)
<220>
<223> CDS: 限制酶 P300 DSM641
<400> 12
ttatttgttt tcattttcaa attcatcata agaacccatt tcacaaaaat caatggagta 60
atgttgttcg ctgtgtttat aaacaattac tgagtcaata tttagtcttt ccagcatttc 120
ataggttaga agttcttttt cctctaagtt cataacttgt cttagtagcc attctccaag 180
agcactattt ggattagaca taagtgcttt actattgtct tggcatacct tggctgataa 240
aagcgatttg tctggcaagc gtaactgaaa aggtttatca cgagctggga aaaatgttgg 300
gaatacatta tgaatccatt ttggaattgg tatataaatc tcgttagggt ttcgtggtcg 360
acctaaagca ttccattggt ttagaccgct tttttctggt acatgacgct ttgagccacg 420
gtctgaaaag agtggaagaa taacgtgctc aaggttttca aaaggattga cagttggtgc 480
tggaattttt ggaatttcaa agccaaatag tttagccaat tcatgataag gattttctaa 540
gatttcaaca ttaatttctt caataggttt atcagtgata aaacgcttat aaagggtgct 600
cttagtgaca ttaaagctgt attcgtgtag accgtcttca aaggtgattg tatttctgtt 660
gttacttact ttcacatttg taattgagga gatttcaacc aagtccattg gctcttcaaa 720
aataagaatt ttccctggct ttcttgttac acagtggtat atcattgaat caataccata 780
tgttctttta gtaaattcaa ttctctcgtt acggagagaa gcaaccgtgt ttattagctc 840
ttttggagat ttcccacgat acaagtctga gtctttattg aattcagcta ctttttgaag 900
agtatgacca ttaccatgaa gaaaagtctt aataccaatt ccgacacgat ttaatgaagc 960
gtcagcagaa cagtctgacc tccccaagtt ttcagctcca aatgcttcac aaaaagcatt 1020
ttccacattc cttgagacca aataaggcga gtcactttca gagaacaaat tggatagcga 1080
accagttgag cggagcattt gtttgtatgt agtgcagttg atggctggtt gattagtata 1140
gaacat 1146
<210> 13
<211> 1022
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 同源区域: 融合限制酶基因的5-引物和3-引物区，具有侧翼BsaI位点
<400> 13
ggtctcgacc caacttctat aaatgtaacg atacgattta ttgtttcatt aaagtcttcc 60
tttatttcat gttcccatat tcttttaatg ttccaatcct tttcctcgta atatttatta 120
acttccttat ctcttttttt atttctttcg agttttttct cccaatattc cgtattactt 180
tttggtatat tcccgtgttt ttcacacgca tgccagaaac aagaatcaat gaatatgact 240
attttatatt tctgtattac tatatctgga ctaccgtata atttcttaac attttttcgg 300
aatcttattc cacggtgcca tagttcttta gtaaccttat cttctaattt tgaacgagat 360
ttgattgcct gcatgttttt tcttctttgt tcttttgaaa ccgtgtcagt catagaagag 420
tcctccaaag ccacaataat tgtattctat aaacgaggaa gcaagccctc aagcttaccc 480
cctcttagtt ccttttttgc ctacttattt atatttttcc tcctctttta tgcttgtcat 540
ttcttctttc agacccaaaa ggtagtcagc tgatacgttc aatgtttcag ctattctttt 600
gaaagtgtcc aatgatggag ttctattttc actttcatat agtgaccaag tgcttctagt 660
gaccccgact ttttcagcga tttggctggg taataaccta cgagcttctc ttgcattttg 720
aatacgattt ccaaggaaag gtatcatttt tgcacctcca agatttgttg ttttcagagt 780
atcaccagaa cccccgaaaa tagtccaaag ttagctaaca gcaaacaaat aaaaataaat 840
aagttgttta ctcttagcaa acttgttact aaaatttgat aaagttattc atttaatcca 900
gctcttatgc taaaattgca ttagcggaca agcttaatgt ttgcaaggag gtataatttt 960
gacttatcga gtaggtagta tgtttgctgg gataggtgga acttgtttag gctcaggaga 1020
cc 1022
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增限制酶基因组区域
<400> 14
gacaatcccc ttttactgac c 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增限制酶基因组区域
<400> 15
ctatttcatt tgcccagaca atcc 24
<210> 16
<211> 1363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 同源区域: 融合pga基因的5-引物和3-引物区域，具有侧翼BsaI位点
<400> 16
ggtctcgacc cgaacactga aattttagac cgggctggga tatcgagaca tatatagggg 60
cgtttaatgg cgaatacagt aacaatgaga atagtaagaa aaattaaaaa tgttaaagtt 120
tgatgaatta tcattgaaaa aaattaatgg ctttttaaat cctaggattt taacctaaaa 180
tctgaagaaa taaggtggat cgaacgactc acaaaatatt tggatttgtc aatgaatccc 240
gctttatgct aaaagagatt ttcatttttt gatagatggt ctgattgtca taggacggat 300
ttgttttgaa gagggaacat tggtgacttt ttaacctgtt cgaaaagagc gaaaatacta 360
aaagaaaaga gacatcccgg ctgacagccc atttaaaggg gattgcggcc gggggaaaaa 420
agagatcctg aatccatcct tcaacctttc atctgaaata gggagaaaag tacaaaaatc 480
ataatgtcga attttgaaag cgcatactta aaacgctgac aaaaatctga taggaattaa 540
gaactttcga tttccaaaaa tatcaataaa aagataggca ttaatgactc gggcgaggtg 600
atctttgtca cggaaaattt cgtcgtcttc tgttacataa tgccgattgt gatttcatag 660
tgaaccctga tcccggttat aaaagacctg tgaaaagcgg ccggtttgaa agggaaacac 720
gacaattttc ttaaccggtc agtgtataaa gttttataga aaatcaggag gatatataca 780
tggttttggg gttcatgttt attgtattct tttgaaggga ataaaaactg acaaatttcg 840
actgaagcaa aatttgaaaa tgcatcacct taccaattcg ggatgggaac cgcacctcat 900
gttcatgacc tctttagaat atttcccttc atctttttaa tccgcgctta ggtgaaaaag 960
ctgatcatgc tgtgctgagc gtttcttctc gctatgacgc tgctgtacat gcaaaaaaag 1020
tcctttaaat atcccagttg aatgacgatg aaagaggaaa gaagaggagg aacagatcaa 1080
ttgataaaaa aagcggcaaa caaaaagttg gttttgtttt gtggaattgc ggtgctttgg 1140
atgtctttat ttttaacgaa tcataatgat gtacgcgccg atacgatcgg cgagaaaata 1200
gcggaaactg ccagacagct tgagggtgcg aaatacagct acggcggaga gaagccgaaa 1260
acggggtttg actcgtcagg ctttgtgcaa tatgtgtttc aatcgctcga tattacgctt 1320
ccgagaacgg taaaggaaca atcgactctt ggctcaggag acc 1363
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增pga 基因组区域
<400> 17
aaagccttct cctctctatt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增pga 基因组区域
<400> 18
ttcttgaaaa agacaaggtc 20
<210> 19
<211> 1027
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 同源区域: 融合aprE基因的5-引物和3-引物区域，具有侧翼BsaI位点
<400> 19
ggtctcgacc cgaagttctt ttttaacata taggtaaaac aatacgaaaa aaggcgccaa 60
gtattgaaga attgcagcag ccgcggcatt tcccttttcg attgaagcaa aaaacgtata 120
ttgaacagta agcattccaa aaatggaaaa tactaaaatc gaacaaatat ctgttttttt 180
cttccatatc tgacacacat gttgaaaacc gtttttcatt gaaacatata acaagagaat 240
gactcccgat gccagaagcc tgacagagac aagcgagccg gcttcaaccg ctcccctttc 300
aaatatgtac tgtgcagcgc ttcccgataa tccccacaat gaagcccctg caagcaccat 360
caatacgcct ttcacatgag ctgatttcat atctttcacc cgtttctgta tgcgatatat 420
tgcatatttt aatagatgat cgacaaggcc gcaacctcct tcggcaaaaa atgatctcat 480
aaaataaatg aatagtattt tcataaaatg agctcaataa catattctaa caaatagcat 540
atagaaaaag ctagtgtttt tagcactagc tttttcttca ttctgatgaa ggttgttcaa 600
tattttgaat ccgttccatg atcgtcggat ggccgtattt aaaaatcttg acgagaaacg 660
gcgggtttgc ctcgctcagc ccggcttttg agagctcttg aaacgtcgaa accgctgcat 720
cgctgttttg cgtcagttca atcgcatact ggtcagcagc tttttcctga tgcctcgaaa 780
ctgcgttcgt aaatggagac gacgcgaaag agatgacccc catcagcatc agaagaagcg 840
gaagtgcggc tagatcggat tttcctgcaa tatgaaggct tcttccatag cggccgatga 900
tccgcttgta cagcttgtcg atcacataaa agacagcaag ggataaaagc agatacccgc 960
caagtcctat gtaaacatgc ttcatcacat agtgccccat ttcgtgcgcc atgatgctca 1020
ggagacc 1027
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增aprE 基因组区域
<400> 20
ccggttgtca ttgatccttt a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR扩增aprE 基因组区域
<400> 21
atcctcctgc aaaaaccgta t 21
<210> 22
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性片段: PxylA 启动子和xylR阻遏物，巨大芽孢杆菌，侧翼为
BpiI位点
<400> 22
gaagaccttc gagttataga aaatcaatta attgaaagta gctccttcat tcttaagatc 60
aacgtgatat aggtttgcta acctttgcgt tcacttaact aacttatagg ggtaacactt 120
aaaaaagaat caataacgat agaaaccgct cctaaagcag gtgcattttt tcctaacgaa 180
gaaggcaata gttcacattt attgtctaaa tgagaatgga ctctagaaga aacttcgttt 240
ttaatcgtat ttaaaacaat gggatgagat tcaattatat gatttctcaa gataacagct 300
tctatatcaa atgtattaag gatattggtt aatccaattc cgatataaaa gccaaagttt 360
tgaagtgcat ttaacatttc tacatcattt ttatttgcgc gttccacaat ctcttttcga 420
gaaatattct tttcttcttt agagagcgaa gccagtaacg ctttttcaga agcatataat 480
tcccaacagc ctcgatttcc acagctgcat ttgggtccat taaaatctat cgtcatatga 540
cccatttccc cagaaaaacc ctgaacacct ttatacaatt cgttgttaat aacaagtcca 600
gttccaattc cgatattaat actgatgtaa acgatgtttt catagttttt tgtcatacca 660
aatacttttt caccgtatgc tcctgcatta gcttcatttt caacaaaaac cggaacatta 720
aactcactct caattaaaaa ctgcaaatct ttgatattcc aatttaagtt aggcatgaaa 780
ataatttgct gatgacgatc tacaaggcct ggaacacaaa ttcctattcc gactagacca 840
taaggggact caggcatatg ggttacaaaa ccatgaataa gtgcaaataa aatctctttt 900
acttcactag cggaagaact agacaagtca gaagttttct cgagaataat atttccttct 960
aagtcggtta gaattccgtt aagatagtcg actcctatat caataccaat cgagtagcct 1020
gcattcttat taaaaacaag cattacaggc ctcctgccgc ctctagattg ccctgcccca 1080
atttcaaaaa taaaatcttt ttcaagcagt gtatttactt gagaggagac agtagacttg 1140
tttaatcctg taatctcaga gagagttgcc ctggagacag gggagttctt caaaatttca 1200
tctaatatta atttttgatt catttttttt actaaagctt gatctgcaat ttgaataata 1260
accactcctt tgtttatcca ccgaactaag ttggtgtttt ttgaagcttg aattagatat 1320
ttaaaagtat catatctaat attataacta aattttctaa aaaaaacatt gaaataaaca 1380
tttattttgt atatgatgag ataaagttag tttattggat aaacaaacta actcaattaa 1440
gatagttgat ggataaactt gttcacttaa atcaaagggg gaaatgtaat ataagtcttc 1500
<210> 23
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能性片段: 用于II型组装的货物载体
<400> 23
ttcacctgcg atggcgagaa cttgcgaggt ctcagcgatc gtctcagcga cccgggtcag 60
ctgggtgctt tttttattcc ttcatcagaa tgaagaaaaa gctagtgcta aaaacactag 120
ctttttctat atgctatttg tggcgcgccg gctagggtct tcttaattaa ctcgaggtcg 180
acaagcttac tatgctacat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccaga tgcggtgtga 240
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcaga cgccattcgc cattcaggct 300
acgcaactgt tgggaagggc gatctgtgcg ggcctcttcg ctattacgcc aactggcgaa 360
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 420
ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta atacgactca ctggaactcc agcttttgtt 480
ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 540
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 600
cctggggtgc ctaatgagta agctaactca cattaattgc gttgcgctga tatcgaattc 660
caccgcggtg agctctgtgg catcaaataa aacgaaaagc tcagtcgaaa gactgggcct 720
ttcgttttat ctgttgttgg atccaactag tgaagaccct cgacaatttg agatgagacc 780
ttgcaggtga gatgagacgg tccttaacat cgc 813
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR终止子Bsub fwd
<400> 24
caagaagctc atgcaaagac c 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR终止子 Bsub rev
<400> 25
cgatgacaga gcaagagaga c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR 质粒 AmpR fwd
<400> 26
atcagcaata aaccagccag 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR 质粒 AmpR rev
<400> 27
agccatacca aacgacgag 19
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: delta cop+repF fwd
<400> 28
atcgccatgg gacaatggac acctaggg 28
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: delta repF rev
<400> 29
atcgccatgg ctcggcgtat gttattcaag 30
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PsrfAA(trunc) fwd
<400> 30
gcattctaga gaagacaaat atttttatct ttctaccgtt cag 43
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PsrfAA(trunc) rev
<400> 31
gcatgaattc gaagacgctc gattagtgga aatgattgcg g 41
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Hom(luxA) fwd
<400> 32
cagtgaattc ggtctctacc cgaggtaatg aaacgtttgg 40
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Hom(luxA) rev
<400> 33
agcttctaga ggtctcttga gcccatattc ttgagccac 39
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: KanR - ColE1 fwd NcoI
<400> 34
tcagccatgg gttcaacaaa cgggccat 28
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: KanR - ColE1 rev PstI
<400> 35
tgacctgcag agtacttgag ttttcgttcc actgag 36
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: T2A盒 fwd BamHI
<400> 36
tacgagatct gtcgacggat ccgatatccc accctgagac ccac 44
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: T2A 盒 rev NcoI
<400> 37
gtacccatgg gatatcttaa attgagtgag acgagcagg 39
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: 终止子 fwd SpeI
<400> 38
tagcactagt ctaaaaagga gcgatgag 28
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: 终止子 rev BamHI
<400> 39
gatcggatcc gtaatctaga gcaacgttc 29
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: pE194 ori fwd SpeI
<400> 40
gatcactagt gacgatttag agatgtagag g 31
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: pE194 ori rev NcoI
<400> 41
gcatccatgg gctggtgcga aaaaagag 28
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: oriT fwd NcoI
<400> 42
atgcccatgg gactaaattt ctgtatgg 28
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: oriT rev XbaI
<400> 43
gacttctaga ccccttgtta acgctc 26
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Pxyl_cop fwd NsiI
<400> 44
gatcatgcat catatgtcga gttatagaaa atc 33
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Pxyl_cop rev SpeI
<400> 45
tgacactagt ctttttttat tccttcatca g 31
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Quickchange lux001
<400> 46
gaagatagta ataaagctaa acaagagaca cgtgcattta ttagtg 46
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Quickchange lux002
<400> 47
gatctcatga cggaatgagg ccgttgcaac gattag 36
<210> 48
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Quickchange lux003
<400> 48
gatgattatt gagtcaaatg cagatgtgga atttaatcaa ccac 44
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 49
gttatgcata tgcaaaaaaa c 21
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 50
cgcgtacgat gacctcta 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 51
accttcttca actaacgg 18
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 52
gaagaaagca gacaagtaag 20
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: sacA 5-引物 hom 区域 fwd
<400> 53
cagtgaattc ggtctctacc cgccgggctt atgaagaag 39
<210> 54
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: sacA 5-引物 hom 区域 rev
<400> 54
taggcttcta gaggtctctt cgcatcgggc caagaaatct c 41
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: sacA 3-引物 hom 区域 fwd
<400> 55
agctgaattc ggtctctgag actggattca ctgcatgac 39
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: sacA 3-引物 hom 区域 rev
<400> 56
agcttctaga ggtctcttga gcactggctg ttacttcat 39
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: rev lux
<400> 57
gcattctaga gaagacgcgc tagcactggt aatggtagcg ac 42
<210> 58
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: fwd lux
<400> 58
gcatgaattc gaagacgcat atgaaatttg gaaacttttt gcttac 46
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Cop fwd
<400> 59
gcatgaattc gaagacgcat atggttgtag atagaaaag 39
<210> 60
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Cop rev
<400> 60
gcattctaga gaagacgcgc tattaaaatg caccgtattc 40
<210> 61
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: fwd lux
<400> 61
gcatgaattc gaagacgcat atgcttttat aagtcgacag g 41
<210> 62
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Pveg T2A fwd
<400> 62
cgaggaagac cttcgagagt tctgagaatt ggtatgcc 38
<210> 63
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: Pveg T2A rev
<400> 63
attcgaagac ttatatagag tcctcctgtc gaccttac 38
<210> 64
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: repF的引物r G 至 A 5-引物
<400> 64
ctatgactaa attttgttaa atgtattagc accgttatta tatc 44
<210> 65
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: repF中引物r G 至A
<400> 65
gggatactga tacagaagat aggatgaaaa aagagc 36
<210> 66
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: 淀粉酶基因 amyE fwd
<400> 66
gagaggtctc gacccaaatg tgtgcagccg ctgaaga 37
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: 淀粉酶基因 amyE rev
<400> 67
gagagagacc gtcgccgact ctacccatgt cactag 36
<210> 68
<211> 3123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复制起点: 功能片段复制起点pBS72 修饰的
<400> 68
ggttgcggtc tcaccacgcg ctagtttgtc tgcaactgaa aagtttatac cttacctgga 60
acaaatggtt gaaacatacg aggctaatat cggcttatta ggaatagtcc ctgtactaat 120
aaaatcaggt ggatcagttg atcagtatat tttggacgaa gctcggaaag aatttggaga 180
tgacttgctt aattccacaa ttaaattaag ggaaagaata aagcgatttg atgttcaagg 240
aatcacggaa gaagatactc atgataaaga agctctaaaa ctattcaata accttacaat 300
ggaattgatc gaaagggtgg aaggttaatg gtacgaaaat taggggatct acctagaaag 360
ccacaaggcg ataggtcaag cttaaagaac ccttacatgg atcttacaga ttctgaaagt 420
aaagaaacaa cagaggttaa acaaacagaa ccaaaaagaa aaaaagcatt gttgaaaaca 480
atgaaagttg atgtttcaat ccataataag attaaatcgc tgcacgaaat tctggcagca 540
tccgaaggga attcatatta cttagaggat actattgaga gagctattga taagatggtt 600
gagacattac ctgagagcca aaaaactttt tatgaatatg aattaaaaaa aagaaccaac 660
aaaggctgag acagactcca aacgagtctg tttttttaaa aaaaatatta ggagcattga 720
atatatatta gagaattaag aaagacatgg gaataaaaat attttaaatc cagtaaaaat 780
atgataagat tatttcagaa tatgaagaac tctgtttgtt tttgatgaaa aaacaaacaa 840
aaaaaatcca cctaacggaa tctcaattta actaacagcg gccaaactga gaagttaaat 900
ttgagaaggg gaaaaggcgg atttatactt gtatttaact atctccattt taacatttta 960
ttaaacccca tacaagtgaa aatcctcttt tacactgttc ctttaggtga tcgcggaggg 1020
acattatgag tgaagtaaac ctaaaaggaa atacagatga attagtgtat tatcgacagc 1080
aaaccactgg aaataaaatc gccaggaaga gaatcaaaaa agggaaagaa gaagtttatt 1140
atgttgctga aacggaagag aagatatgga cagaagagca aataaaaaac ttttctttag 1200
acaaatttgg tacgcatata ccttacatag aaggtcatta tacaatctta aataattact 1260
tctttgattt ttggggctat tttttaggtg ctgaaggaat tgcgctctat gctcacctaa 1320
ctcgttatgc atacggcagc aaagactttt gctttcctag tctacaaaca atcgctaaaa 1380
aaatggacaa gactcctgtt acagttagag gctacttgaa actgcttgaa aggtacggtt 1440
ttatttggaa ggtaaacgtc cgtaataaaa ccaaggataa cacagaggaa tccccgattt 1500
ttaagattag acgtaaggtt cctttgcttt cagaagaact tttaaatgga aaccctaata 1560
ttgaaattcc agatgacgag gaagcgcatg taaagaaggc tttaaaaaag gaaaaagagg 1620
gacttccaaa ggttttgaaa aaagagcacg atgaatttgt taaaaaaatg atggatgagt 1680
cagaaacaat taatattcca gaggctttac aatatgacac aatgtatgaa gatatactca 1740
gtaaaggaga aattcgaaaa gaaatcaaaa aacaaatacc taatcctaca acatcttttg 1800
agagtatatc aatgacaact gaagaggaaa aagtggacag tactttaaaa agcgaaatgc 1860
aaaatcgtgt ctctaagcct tcttttgata cctggtttaa aaacactaag atcaaaattg 1920
aaaataaaaa ttgtttatta cttgtaccga gtgaatttgc atttgaatgg attaagaaaa 1980
gatatttaga aacaattaaa acagtccttg aagaagctgg atatgttttc gaaaaaatcg 2040
aactaagaaa agtgcaataa actgctgaag tatttcagca gtttttttta tttagaaata 2100
gtgaaaaaaa tataatcagg gaggtatcaa tatttaatga gtactgattt aaatttattt 2160
agactggaat taataattaa cacgtagact aattaaaatt taatgaggga taaagaggat 2220
acaaaaatat taatttcaat ccctattaaa ttttaacaag ggggggatta aaatttaatt 2280
agaggtttat ccacaagaaa agaccctaat aaaattttta ctagggttat aacactgatt 2340
aatttcttaa tgggggaggg attaaaattt aatgacaaag aaaacaatct tttaagaaaa 2400
gcttttaaaa gataataata aaaagagctt tgcgattaag caaaactctt tactttttca 2460
ttgacattat caaattcatc gatttcaaat tgttgttgta tcataaagtt aattctgttt 2520
tgcacaacct tttcaggaat ataaaacaca tctgaggctt gttttataaa ctcagggtcg 2580
ctaaagtcaa tgtaacgtag catatgatat ggtatagctt ccacccaagt tagcctttct 2640
gcttcttctg aatgtttttc atatacttcc atgggtatct ctaaatgatt ttcctcatgt 2700
agcaaggtat gagcaaaaag tttatggaat tgatagttcc tctctttttc ttcaactttt 2760
ttatctaaaa caaacacttt aacatctgag tcaatgtaag cataagatgt ttttccagtc 2820
ataatttcaa tcccaaatct tttagacaga aattctggac gtaaatcttt tggtgaaaga 2880
atttttttat gtagcaatat atccgataca gcaccttcta aaagcgttgg tgaatagggc 2940
attttaccta tctcctctca ttttgtggaa taaaaatagt catattcgtc catctaccta 3000
tcctattatc gaacagttga actttttaat caaggatcag tccttttttt cattattctt 3060
aaactgtgct cttaacttta acaactcgat ttgtttttcc agatcccgct cagagacccg 3120
ttg 3123
<210> 69
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能片段: II型 mRFP 盒
<400> 69
ggttgcggtc tcaaccttta tggttttggt cggcactgcc gacagcctcg cagagcacac 60
actttatgaa tataaagtat agtgtgttat actttacttg gaagtggttg ccggaaagag 120
cgaaaatgcc tcacatttgt gccacctaaa aaggagcgat ttacatatgt cgagggtctt 180
cggtaccttg tcggataaag ctgtgttata ttatgtcttg gtgttaaata cacacgctta 240
acgatttatg cagagggtgc tgcaggcggc agttctgtac aaaaatgacc taagcggagg 300
aaaaaaacca ttatattagg aggaaataac atggcctctt cagaggatgt tattaaagaa 360
tttatgcggt ttaaggtgag gatggaaggc tcggtgaacg gacatgagtt cgaaattgag 420
ggagaaggtg aaggccgccc ttatgaaggt actcagacag cgaaattgaa agtcacgaaa 480
ggcggaccgc tgccgtttgc ttgggacatt ctctcacctc aatttcaata tggctcaaaa 540
gcctacgtaa aacacccggc tgacatccct gattacttaa agctatcctt cccggagggc 600
tttaaatggg aacgagttat gaattttgag gacggcggcg tcgttactgt cacacaggat 660
tcttcccttc aggatggcga atttatttac aaagtaaaac ttcgtggaac taacttccca 720
agcgatggtc ccgtgatgca aaaaaaaaca atgggatggg aagcatctac ggaacgtatg 780
tatccggagg atggagcctt aaagggtgaa atcaaaatgc gcctgaaact taaagatggc 840
ggacactatg acgcggaagt taaaacaaca tatatggcta aaaaaccagt ccaactgccg 900
ggagcatata agacggatat aaagttggac attaccagcc ataatgaaga ttacacgatt 960
gtggaacagt atgagagagc agagggcaga catagcacag gcgcgtaaga attaatgaaa 1020
aataagcggc agcctgcttt tccatgcggg ctgccgctta tcgggttatt gcggccgcgt 1080
ttataatgaa gaccctagcc atattctaac aaatagcata tagaaaaagc tagtgttttt 1140
agcactagct ttttcttcat tctgatgaag gaataaaaaa agcacctgaa aaggtgtctt 1200
tttttccaca gagacccgtt g 1221
<210> 70
<211> 1817
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 功能片段: 修饰的卡那霉素抗性基因和ColE1复制起点
<400> 70
ggttgcggtc tcagctctag ttcaacaaac gggccatatt gttgtataag tgatgaaata 60
ctgaatttaa aacttagttt atatgtggta aaatgtttta atcaagttta ggaggaatta 120
attatgaagt gtaataatgg accaataata atgactagag aagaaagaat gaagattgtt 180
catgaaatta aggaacgaat attggataaa tatggggatg atgttaaggc tattggtgtt 240
tatggctctc ttggtcgtca gactgatggg ccctattcgg atattgagat gatgtgtgtc 300
atgtcaacag aggaagcaga gttcagccat gaatggacaa ccggtgagtg gaaggtggaa 360
gtgaattttg atagcgaaga gattctacta gattatgcat ctcaggtgga atcagattgg 420
ccgcttacac atggtcaatt tttctctatt ttgccgattt atgattcagg tggatactta 480
gagaaagtgt atcaaactgc taaatcggta gaagcccaaa cgttccacga tgcgatttgt 540
gcccttatcg tagaagagct gtttgaatat gcaggcaaat ggcgtaatat tcgtgtgcaa 600
ggaccgacaa catttctacc atccttgact gtacaggtag caatggcagg tgccatgttg 660
attggtctgc atcatcgcat ctgttatacg acgagcgctt cggtcttaac tgaagcagtt 720
aagcaatcag atcttccttc aggttatgac catctgtgcc agttcgtaat gtctggtcaa 780
ctttccgact ctgagaaact tctggaatcg ctagagaatt tctggaatgg gattcaggag 840
tggacagaac gacacggata tatagtggat gtgtcaaaac gcataccatt ttgaatcgtt 900
aagggatcaa ctttgggaga gagttcaaaa ttgatccttt ttttataaca ggaattctga 960
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaagcgcg cgttgctggc gtttttccat 1020
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 1080
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 1140
gttccgaccc tcgccgttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 1200
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 1260
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gacccgtgcg ccttatccgg taactatcgt 1320
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cacgagccac tggtaacagg 1380
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 1440
ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 1500
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 1560
gtttgcaacg agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 1620
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 1680
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 1740
taaagtatat atgagtacaa ttcaaatctt tttgttccat taaagggcgc gattgctgaa 1800
tacctagaga cccgttg 1817
<210> 71
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR-扩增终止子pMutin
<400> 71
cacatttgtg ccacctaaaa aggagcgatg agtcgctttt gtaaatttgg a 51
<210> 72
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR-扩增终止子pMutin
<400> 72
caaggtaccg aagaccctcg acatatgtaa tctagagcaa cgttcttgcc a 51
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR-扩增 pBW424
<400> 73
ttacatatgt cgagggtctt cg 22
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: PCR-扩增 pBW424
<400> 74
atcgctcctt tttaggtggc 20
<210> 75
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: fwd amyB
<400> 75
tcgcgaagac aatcgcgatc cgcgacatta acgtttac 38
<210> 76
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: rev amyB
<400> 76
acccgaagac ttacccgatt gataatgaag cggcacg 37
<210> 77
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: 正向引物, T2A 盒，来自质粒 p#0692 ，具有ter
<400> 77
gcatggtctc atcgaccgga aagagcgaaa atg 33
<210> 78
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: 反向引物; T2A 盒，来自质粒 p#0692 具有 ter
<400> 78
cgatggtctc tgctacgcgt ggaaaaaaag acac 34
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 79
gagattccgg tcgacaattt gaga 24
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工寡核苷酸
<400> 80
tgagtctcaa attgtcgacc ggaa 24
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR luxB fwd
<400> 81
atgtaacagc aaccagtcat c 21
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR luxB rev
<400> 82
atccgcaacg gctttatatc 20
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR ter Bli fwd
<400> 83
gtctaagaca tggttccatt cg 22
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸: qPCR ter Bli rev
<400> 84
caaactttgc acattgcatc c 21
Claims (16)
1.质粒拷贝数控制方法，其包括：
i)提供包含质粒的原核宿主，其中该质粒具有可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，以及
ii)调节Rep蛋白的表达以将质粒拷贝数调整到期望值。
2.权利要求1的方法，其中该Rep蛋白的表达通过以下一种或多种调节：
a)提高编码Rep蛋白的rep基因的表达，
b)降低编码Rep蛋白的rep基因的表达，
c)降低编码Rep表达阻遏物的阻遏基因的表达，
d)提高编码Rep表达阻遏物的阻遏基因的表达。
3.权利要求2的方法，其中
a)该rep基因与异源启动子有效连接和/或
b)该质粒包含与异源启动子有效连接的编码Rep表达阻遏物的阻遏基因。
4.受控复制质粒，其包含
-可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，
-编码Rep蛋白的rep基因，
其中
a)该rep基因与异源启动子有效连接和/或
b)该质粒包含与异源启动子有效连接的编码Rep表达阻遏物的阻遏基因。
5.权利要求4的受控复制质粒，其包含
-有效连接到编码Rep蛋白的rep基因的启动子，以及
-编码Rep表达阻遏物的阻遏基因，其中该阻遏基因处于异源启动子的控制下。
6.复制辅助依赖性质粒，其包含
-可由质粒复制起始蛋白(Rep)激活的复制起点，
-可选地与编码Rep表达阻遏物的阻遏基因有效连接的启动子，
其中该质粒不包含编码Rep蛋白的功能性Rep基因。
7.权利要求6的复制辅助依赖性质粒，其进一步包含
-编码阻遏物的基因，该阻遏物在包含表达Rep蛋白的表达盒的宿主中表达时抑制Rep蛋白表达。
8.权利要求4至7中任一项的质粒，其中
-至少一个，优选每个，异源启动子对外部调节物浓度或代谢浓度的变化作出反应，和/或
-该质粒是滚环复制型质粒，和/或
-该质粒包含以下一种或多种
-选择标记，
-靶基因，
-包含有效连接到靶基因的启动子的表达盒，
-重组位点。
9.质粒复制控制宿主，其包含权利要求4、5或8中任一项的受控复制质粒。
10.质粒复制辅助宿主，其包含
i)权利要求6至8中任一项的复制辅助依赖性质粒，以及
ii)位于宿主染色体中和/或宿主中的辅助质粒上的用于表达rep基因的表达盒。
11.培养方法，其包括
i)提供包含权利要求4至8中任一项的质粒的宿主的起子培养物，
ii)培养所述宿主以达到宿主细胞数量的增加，以及
iii)在步骤ii)期间或之后，调节培养的宿主细胞中的质粒拷贝数。
12.整合方法，其包括
i)在原核质粒受体宿主中提供根据权利要求4至8中任一项的包含选择标记的质粒，
ii)防止质粒复制，同时保持对选择标记的选择。
13.权利要求12的整合方法，其中防止质粒受体宿主中的质粒复制通过以下一种或多种进行：
a)不在质粒上提供rep基因，
b)抑制rep基因的表达，以及
c)撤消表达rep基因所需的诱导物。
14.整合方法，其包括
i)提供质粒供体宿主和质粒受体宿主，其中
-该质粒供体宿主包含权利要求4至8中任一项的受控复制质粒或复制辅助依赖性质粒，该质粒包含选择标记，以及
-该质粒受体宿主不包含rep基因，
ii)将质粒从质粒供体宿主转移到质粒受体宿主，以及
iii)与步骤ii)同时或在步骤ii)之后，防止质粒在质粒受体宿主中复制，同时使质粒受体宿主经受选择压力，以迫使选择标记存在于质粒受体宿主中。
15.权利要求12至14中任一项的整合方法，其中该质粒包含重组位点以便于与该复制受体宿主的核酸的相容位点的重组。
16.权利要求12至15中任一项的整合方法，其中将该质粒整合到质粒受体宿主的基因组中或整合到其复制不依赖于rep基因的另一质粒中。
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