ES2064077T5 - Integracion estable de adn en genomas bacterianos. - Google Patents

Abstract

INTEGRACION ESTABLE DE ADN EN GENOMAS BACTERIANOS UNA CELULA BACTERIANA EN QUE EN SU GENOMA LLEVA UNA FORMACION DE ADN SIN REPETICION INTEGRADA QUE CONSTA DE (1) UNA SECUENCIA DE ADN DE INTERES, (2) UNA SECUENCIA DE ADN HOMOLOGA A LA REGION DEL GENOMA DE LA CELULA Y (3) UN ORIGEN DE REPRODUCCION, FALTANDOLE A DICHA FORMACION DE ADN UN GEN FUNCIONAL QUE CODIFIQUE EL FACTOR REQUERIDO PARA INICIAR LA REPETICION DE DICHO ORIGEN DE REPRODUCCION.

Description

Integración estable de ADN en genomas bacterianos.

Campo del invento

El presente invento se refiere a una célula bacteriana que comprende una construcción de ADN integrada en su genoma, a un vector plasmídico que comprende la construcción de ADN, y a métodos para integrar la construcción de ADN en genomas bacterianos.

Fundamento del invento

Cuando, con el fin de producir un polipéptido deseado mediante procedimientos de ADN recombinante, se transforman células bacterianas con un vector plasmídico recombinante que lleva información genética insertada que codifica dicho polipéptido, se ha observado frecuentemente que dichos plásmidos se vuelven inestables aun cuando, en sí mismos, pueden ser establemente heredados en la célula. Esta inestabilidad puede tomar la forma de un mantenimiento inestable del plásmido en las células de modo que el plásmido se pierda finalmente de una población celular, o de modo que el ADN que codifica la proteína en cuestión pueda ser suprimido del plásmido. Una manera tradicional de resolver el primer problema ha sido hacer crecer las células transformadas bajo una presión de selección, es decir, típicamente en presencia de un antibiótico al cual las células en cuestión se han hecho resistentes a causa de la presencia de un gen que codifica un producto que media en la resistencia a ese antibiótico, en el plásmido transformado a las células. Sin embargo, este procedimiento no es económicamente viable en una producción a gran escala a causa del elevado coste de los antibióticos en cuestión, ni es deseable por razones ambientales. Además, el uso de antibióticos en medios de cultivo hace más difícil obtener la aprobación del producto por las autoridades sanitarias y similares.

Se ha sugerido previamente la estabilización de plásmidos insertando en ellos una secuencia de ADN que codifique una función de reparto que asegure, tras la división celular, la distribución uniforme de plásmidos en las células de la progenie. Un método alternativo para alcanzar la herencia estable de secuencias clonadas de ADN es proporcionar la integración de dichas secuencias de ADN en el genoma de la bacteria hospedante. La integración de las secuencias de ADN presentes en los vectores plasmídicos puede tener lugar mediante el llamado procedimiento de "sobrecruzamiento" como, por ejemplo, el descrito por A. Campbell, Advances Genet. 11, 1.962, páginas 101-145. De acuerdo con este procedimiento, el vector plasmídico es provisto de una secuencia de ADN que es homóloga con respecto a una región del genoma bacteriano, o, alternativamente, de dos secuencias homólogas situadas en cada lado de la secuencia heteróloga de ADN que se va a integrar. En un proceso de recombinación subsiguiente, la secuencia homóloga y las secuencias adyacentes del vector son integradas en el genoma hospedante, en la región de homología. Como un ejemplo, Kallio et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1.987), volumen 27, páginas 64-71, describen la integración de un gen de \alpha-amilasa en el genoma de Bacillus subtilis mediante el uso de esta técnica.

Sin embargo, en algunos casos, se ha hallado que las secuencias de ADN integradas son suprimidas de las células en ausencia de una presión de selección, por ejemplo, mediante un tipo de proceso de recombinación homóloga similar al responsable de la integración del ADN. En particular, se ha observado previamente que la recombinación entre secuencias de ADN homólogas es estimulada en la proximidad de un ADN replicativo presente en, o cerca de, el ADN integrado en el genoma de la célula hospedante; véanse Ph. Noirot et al., J. Mol. Biol. 196, 1.987, páginas 39-48, y M. Young y S. D. Ehrlich, J. Bacteriol. 171(5), mayo de 1.989, páginas 2.653-2.656.

Por lo tanto, un objeto del presente invento es proporcionar la integración estable de secuencias de ADN en ADN genómico, por ejemplo: el cromosoma, de células bacterianas hospedante.

Sumario del invento

El presente invento se basa en el hallazgo de que la integración estable de secuencias de ADN en el genoma de bacterias hospedante puede ser obtenida evitando la presencia de un sistema funcional de replicación plasmídica en el ADN integrado.

En consecuencia, en un aspecto, el presente invento se refiere a una célula bacteriana perteneciente al género Bacillus y que no puede ser transformada para hacerla competente, y que lleva en su genoma una construcción de ADN no replicativa e integrada que comprende (1) una secuencia de ADN de interés, (2) una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, y (3) un origen de replicación, construcción de ADN en la que se ha suprimido un gen que codifica un factor requerido para iniciar la replicación a partir de dicho origen de replicación o en la que el gen que codifica el factor de replicación ha sido modificado con objeto de que codifique un factor de replicación inactivo.

En el contexto presente, con la expresión "construcción de ADN no replicativa" se pretende significar una secuencia de ADN que es incapaz de replicarse autónomamente y que, por lo tanto, se replica junto con el genoma de la célula hospedante. El genoma comprende el cromosoma y elementos extracromosómicos establemente heredados. La expresión "secuencia de ADN de interés" es utilizada para indicar una secuencia que puede codificar un producto de ARN o de proteína deseado (heterólogo o nativo con respecto a la célula hospedante), o que, en sí misma, puede proporcionar una propiedad deseada a la célula hospedante; por ejemplo, un fenotipo mutante como el descrito más adelante.

La secuencia de ADN homóloga puede ser típicamente una que proceda del genoma de la célula hospedante, y puede ser homóloga con una región del genoma que no es esencial para la supervivencia o el funcionamiento apropiado de la célula hospedante. Por otra parte, la secuencia de ADN homóloga puede ser también seleccionada para que la integración de la construcción de ADN mediante recombinación homóloga conduzca a una célula que exprese un fenotipo mutante (el cual puede servir luego como un marcador para la selección de las células en las que se ha integrado la construcción de ADN); por ejemplo, si la construcción de ADN es integrada en una unidad de transcripción alterando ésta para que, en consecuencia, no se expresen uno o más genes contenidos en la unidad de transcripción. La secuencia de ADN homóloga puede ser alternativamente una que no sea nativa con respecto al genoma hospedante pero que haya sido clonada de otro organismo o que haya sido sintetizada y posteriormente introducida en el genoma hospedante mediante cualquier procedimiento conveniente, por ejemplo: sobrecruzamiento, antes de la integración de la construcción de ADN. La secuencia de ADN homóloga puede ser una que esencialmente comprenda, o consista en, la secuencia de ADN de interés, ya sea nativa o extraña con respecto a la célula hospedante en cuestión (por ejemplo, nativa con respecto a la célula en los casos en que se desea multiplicar el número de copias de la secuencia de ADN de interés en la célula; véase más adelante). Debe advertirse que, en el presente contexto, el término "homólogo" puede ser definido como una identidad de secuencia de al menos 9 pares de bases consecutivos.

Aunque, de acuerdo con el invento, la integración estable de ADN en genomas bacterianos ha sido demostrada para plásmidos con un tipo particular de sistema de replicación (la llamada replicación de círculo rodante; véase más adelante), actualmente se espera que cualesquier plásmidos que se repliquen mediante un mecanismo en el que se requieran uno o más factores de acción trans (es decir, factores de ARN o de proteína) para iniciar la replicación a partir de secuencias de acción cis en el plásmido (tales secuencias de ADN de acción cis son colectivamente denominadas el origen de replicación) sean útiles para el fin presente. Los factores que son necesarios para la replicación plasmídica serán denominados a continuación factores de replicación. Cuando la construcción de ADN carece de un gen funcional que codifique un factor de replicación requerido por el origen de replicación contenido en dicha construcción de ADN, no se produce ningún factor de replicación activo y, en consecuencia, no se inicia ninguna replicación desde el origen.

Con objeto de obtener una célula bacteriana del invento que comprenda una construcción de ADN que carezca de un gen funcional que codifique un factor de replicación requerido, se puede suprimir el gen entero o modificarlo de tal modo que codifique un factor de replicación inactivo. Dicha modificación del gen puede ser llevada a cabo de un modo per se conocido mediante deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN del gen, o mediante modificaciones similares de las señales de inicio o parada de transcripción o traducción.

El sistema de replicación anteriormente esbozado puede ser utilizado en un método para construir una célula bacteriana del invento. En una realización del método, se construye inicialmente un vector plasmídico para el fin presente, denominado vector paterno. El vector paterno comprende un primer origen de replicación y un segundo origen de replicación con la misma orientación que el primer origen de replicación, orígenes de replicación primero y segundo que son suficientemente similares para ser funcionales con el(los) mismo(s) factor(es) de replicación, dividiendo los orígenes de replicación primero y segundo al vector en dos partes: (i) una primera parte que comprende el primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) de replicación requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dichos orígenes de replicación primero y segundo, y (ii) una segunda parte que comprende el segundo origen de replicación, una secuencia de ADN de interés, y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de una célula destinada a la introducción del vector. Debe advertirse que, en el presente contexto, el término "plásmido" quiere también indicar un bacteriófago u otra molécula de ADN capaz de actuar como un elemento extracromosómico de replicación autónoma.

De acuerdo con el método del invento, este vector paterno puede luego transformarse en células bacterianas, y las células transformadas son cultivadas bajo condiciones selectivas, dando lugar la replicación del vector plasmídico paterno a la formación de un primer vector de progenie que comprende el primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) de replicación requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dichos orígenes de replicación primero y segundo, y a un segundo vector de progenie que comprende el segundo origen de replicación pero que carece de un gen funcional que codifica un factor de replicación, comprendiendo también una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, dando lugar el cultivo continuado de las células transformadas, bajo condiciones selectivas, a la integración de dicho segundo vector de progenie en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga y a la pérdida del primer vector de progenie así como del vector paterno de las células.

La formación de dos moléculas de vector de progenie a partir del vector paterno puede tener lugar mediante mecanismos diferentes, ya sea como resultado del modo de replicación del plásmido, por ejemplo, replicación de círculo rodante de plásmidos de ADN de una sola cadena (véase más adelante), o ya sea como resultado de la recombinación homóloga entre las regiones de ADN que incluyen, y/o son adyacentes a, los dos orígenes de replicación presentes en el vector plasmídico.

Cuando el segundo origen está situado en el plásmido paterno con la misma orientación que el primer origen, las diversas secuencias de ADN que se quieren integrar en el genoma bacteriano y situar cadena abajo del segundo origen pero cadena arriba del primer origen (es decir, la secuencia de ADN de interés y la secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula) estarán presentes en el segundo vector de progenie después de la replicación plasmídica. El cultivo continuado de las células transformadas puede dar espontáneamente lugar a la integración de dicho segundo vector de progenie en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga y a la pérdida del primer vector de progenie de las células con una cierta frecuencia.

Con objeto de facilitar la selección de las células en las que el segundo vector de progenie se ha integrado en el genoma, este vector es preferiblemente provisto de un marcador seleccionable. En este caso, las células pueden ser cultivadas bajo condiciones selectivas, lo cual quiere decir que sólo sobrevivirán las células en las que se mantenga el marcador seleccionable. El marcador seleccionable puede ser un gen que codifique un producto que confiera resistencia antibiótica a la célula o que confiera prototrofía a una cepa auxotrófica (por ejemplo, genes dal introducidos en una cepa dal^{-}; véase B. Diderichsen en Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A. T. Ganesan y J. A. Hoch redactores, Academic Press, 1.986, páginas 35-46). Las células que sobrevivan bajo estas condiciones serán células que contengan el vector plasmídico paterno o que contengan ambos vectores de progenie formados tras la replicación del vector paterno en la célula, o células en las que se haya integrado el segundo vector de progenie que comprende la construcción de ADN. Se ha hallado sorprendentemente que finalmente se pierden el vector paterno y el primer vector de progenie mientras el segundo vector de progenie que comprende la construcción de ADN se integra espontáneamente en el genoma hospedante con una frecuencia elevada.

Si se desea mejorar la eficacia con la que tiene lugar la integración de la construcción de ADN, se puede utilizar, como vector paterno, un plásmido que sea capaz de replicarse bajo ciertas condiciones (permisivas) e incapaz de replicarse bajo otras condiciones (no permisivas). Por ejemplo, el plásmido puede ser uno que, en cuanto a la replicación, sea sensible a la temperatura. De este modo, en una realización del método del invento, el vector paterno es uno que es incapaz de replicarse a temperaturas aumentadas, las cuales permiten sin embargo el crecimiento de la célula hospedante. Las células bacterianas son inicialmente cultivadas a una temperatura que permite la replicación plasmídica y la formación de los dos vectores de progenie y, posteriormente, después de la integración del segundo vector de progenie en el genoma bacteriano, son cultivadas a una temperatura que no permite la replicación plasmídica, de modo que se pierden de las células el primer vector de progenie así como el vector paterno. El cultivo a la temperatura no permisiva es llevado a cabo bajo condiciones selectivas para asegurar que sólo sobreviven las células que contienen la construcción de ADN integrada, incluyendo un apropiado marcador seleccionable. Otro modo de aumentar la eficacia de la integración y la subsiguiente pérdida del primer vector de progenie de las células puede ser tratar las células transformadas con el vector paterno, después de cultivar las células hospedante bajo condiciones selectivas como las anteriormente descritas, con un agente de curación plasmídica, por ejemplo; novobiocina (Gadó, I. et al., 1.987, Zbl. Bakt. Hyg. A. 265, 136-145).

Puede ser posible emplear orígenes de replicación de dos plásmidos diferentes en el mismo vector paterno con tal que estos sean suficientemente similares entre sí para ser funcionales con el(los) mismo(s) factor(es) de replicación, los cuales deben ser capaces de iniciar la replicación desde ambos orígenes de replicación, el primero y el segundo. Alternativamente, el vector plasmídico debe contener regiones homólogas con objeto de ser capaz de experimentar una recombinación homóloga como se describió anteriormente. Sin embargo, se prefiere que el primer origen de replicación (y el gen que codifica el factor de replicación asociado con él) proceda del mismo plásmido que el segundo origen de replicación con objeto de asegurar que el mecanismo de replicación en que se basa el presente invento funciona óptimamente.

Al margen de consideraciones prácticas, puede preferirse hacer la construcción inicial del vector plasmídico en un organismo en el que no pueda iniciarse la replicación a partir de los orígenes primero y segundo de replicación o en el que la velocidad de replicación a partir de estos orígenes sea muy pequeña. Por lo tanto, el vector plasmídico puede ser un vector lanzadera provisto de un origen adicional de replicación que haga que el vector sea capaz de replicarse en dos organismos diferentes. El origen adicional de replicación puede ser, por ejemplo, uno que sea funcional en Escherichia coli, estando este organismo bien descrito y siendo convencionalmente utilizado para experimentación con ADN recombinante y, por lo tanto, adecuado para construir plásmidos mediante técnicas de ADN recombinante. El vector lanzadera puede comprender además un marcador seleccionable adicional, por ejemplo, un gen de resistencia antibiótica, para la selección del vector en E. coli. El origen adicional de replicación y el marcador seleccionable deben seguir preferiblemente al primer origen y/o al(a los) factor(es) de replicación, pero preceder al segundo origen para que, tras la replicación del vector a partir de los orígenes primero y segundo, estas secuencias adicionales sean llevadas por el primer vector de progenie, el cual se pierde finalmente de la célula bacteriana transformada con el vector paterno.

En un método alternativo para producir la célula bacteriana del invento, células bacterianas son transformadas con (i) un primer vector de ADN que comprende un primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dicho primer origen de replicación, y con (ii) un segundo vector de ADN que comprende un segundo origen de replicación pero que carece de un gen funcional que codifique un factor requerido para la replicación plasmídica a partir del segundo origen de replicación, comprendiendo además una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, siendo dichos orígenes de replicación primero y segundo lo suficientemente similares para ser funcionales con el(los) mismo(s) factor(es) de replicación de modo que la replicación del segundo vector de ADN a partir del segundo origen de replicación sea iniciada por el(los) factor(es) de replicación codificado(s) por el(los) gen(es) presente(s) en el primer vector de ADN, y las células resultantes son cultivadas bajo condiciones selectivas, como se describió anteriormente, lo que conduce a la integración de dicho segundo vector de ADN en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga y a la pérdida del primer vector de ADN.

El segundo vector de ADN es además preferiblemente provisto de un marcador seleccionable.

Como en el método anteriormente descrito que emplea inicialmente un solo vector plasmídico, el primer vector de ADN puede ser uno cuya replicación dependa de condiciones permisivas y no permisivas para cultivar células transformadas con el vector. De este modo, en el método del invento, el primer vector de ADN puede ser uno que sea incapaz de replicarse a temperaturas aumentadas, las cuales permiten no obstante el crecimiento de las células hospedante, y las células bacterianas son inicialmente cultivadas a una temperatura que permite la replicación plasmídica, y posteriormente, después de la integración del segundo vector de ADN en el genoma bacteriano, son cultivadas a una temperatura que no permite la replicación plasmídica, de modo que el primer vector de ADN se pierde de las células, y bajo condiciones selectivas, de modo que sólo son capaces de sobrevivir las células en las que está integrado el segundo vector de ADN. Similarmente, las células transformadas pueden ser tratadas con un agente de curación plasmídica como se describió anteriormente.

Un producto intermedio formado en ambos métodos para construir una célula que contenga la construcción de ADN no replicativa e integrada anteriormente discutida, es una célula bacteriana que comprende un primer vector de ADN que comprende un primer origen de replicación asociado con uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dicho primer origen de replicación, y un segundo vector de ADN que comprende un segundo origen de replicación, así como una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, careciendo dicho segundo vector de un gen funcional que codifique un factor de replicación requerido para la replicación a partir del origen de replicación que lleva dicho segundo vector.

Con objeto de obtener un origen de replicación en el segundo vector de ADN, el cual carece de un gen funcional que codifique un factor de replicación requerido para la replicación a partir de dicho origen, es posible suprimir este gen del vector o modificarlo de las formas anteriormente indicadas. En particular, cuando se utilizan dos orígenes de replicación diferentes, el primer vector de ADN puede ser provisto además de un gen que codifique un factor de replicación requerido para iniciar la replicación a partir del segundo origen de replicación. De este modo, la replicación del segundo vector de ADN depende del segundo factor de replicación producido a partir del primer vector de ADN, y el segundo vector se vuelve no replicativo cuando el primer vector se pierde de la célula. Sin embargo, los orígenes primero y segundo de replicación pueden también proceder del mismo plásmido, en cuyo caso sólo se requiere en el primer vector un gen que codifique un factor de replicación intacto.

Aunque, para el fin del presente invento, la célula bacteriana en la que se transforman el vector plasmídico o el primer y segundo vector de ADN puede ser tanto Gram-negativa como Gram-positiva, es preferiblemente una célula de una bacteria Gram-positiva ya que es generalmente más fácil obtener una expresión extracelular de polipéptidos a partir de organismos Gram-positivos que a partir de Gram-negativos. Por consiguiente, la bacteria puede ser de una cepa que pertenezca al género Bacillus o Streptomyces, en particular una cepa de Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis o Streptomyces lividans.

Se cree actualmente que el presente invento es el único método eficaz de proporcionar una integración homóloga estable de secuencias de ADN de interés en genomas de bacterias que no pueden ser transformadas haciéndolas competentes (o, al menos, en las que aún han de demostrarse mecanismos de competencia naturales), pero que pueden ser transformadas mediantes técnicas que incluyen, por ejemplo, formación de protoplastos o electroporación; por ejemplo, ciertas cepas de Bacillus licheniformis o Bacillus lentus. Por lo tanto, el presente método es de particular interés con respecto a dichos organismos en los que la frecuencia de transformación es baja, típicamente 10-50 productos de transformación por \mug de ADN (contrariamente a, por ejemplo, la transformación de células competentes de E. coli o B. subtilis, en las que el número de productos de transformación es típicamente del orden de 10^{6}-10^{8} por \mug de ADN), lo que hace particularmente importante la satisfactoria transformación e integración estable de ADN en estos organismos.

En la célula bacteriana del invento, la secuencia de ADN de interés es ventajosamente una que codifica un polipéptido de interés, y, en consecuencia, el presente invento se refiere además a un procedimiento para producir un polipéptido de interés, procedimiento que comprende cultivar una célula bacteriana, de acuerdo con el invento, que contiene una secuencia de ADN integrada que codifica dicho polipéptido bajo condiciones conducentes a la producción del polipéptido, y recuperar del cultivo el polipéptido resultante. El polipéptido producido mediante el procedimiento presente puede ser cualquier polipéptido ventajosamente producido en bacterias, tal como un enzima; por ejemplo, una proteasa, amilasa o lipasa.

Una gran familia de plásmidos procedentes de bacterias Gram-positivas se replican mediante el llamado mecanismo de "replicación de círculo rodante", por el cual se genera ADN de una sola cadena como un producto intermedio de replicación. La replicación es iniciada cuando una proteína codificada por plásmido, Rep, reconoce un origen de secuencia de replicación (el origen positivo) y produce una muesca en una de las cadenas de ADN (la cadena positiva). La cadena positiva es luego desplazada, y una nueva cadena positiva se polimeriza a partir de la muesca por extensión de 3'-OH. Cuando la proteína Rep reconoce posteriormente una secuencia de terminación (que se superpone al origen positivo), produce una segunda muesca en la misma posición que la primera para generar una cadena totalmente replicada y un monómero de ADN, de una sola cadena, de la cadena desplazada, los extremos del cual se ligan para formar una molécula circular. Factores del hospedante aseguran luego la conversión de la molécula de ADN de una sola cadena en ADN de doble cadena (para una descripción más detallada de este tipo de plásmido, véase A. Gruss y S. D. Ehrlich, Microbiological Reviews 53(2), junio de 1.989, páginas 231-241). Para el fin presente, los plásmidos con este sistema de replicación son denominados plásmidos de ADN de una sola cadena.

Se ha hallado sorprendentemente que el mecanismo de replicación de círculo rodante puede ser utilizado de acuerdo con el invento para producir una célula bacteriana, de acuerdo con el invento, que contenga una construcción de ADN que comprenda, aparte de una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con respecto a una región del genoma de la célula, un origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, careciendo la construcción de ADN de un gen funcional rep afín al origen positivo de replicación.

Esta célula bacteriana puede ser construida mediante el método del invento utilizando un vector plasmídico paterno que comprenda un primer origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, y un segundo origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena con la misma orientación que el primer origen positivo, dividiendo los orígenes positivos de replicación primero y segundo al vector en dos partes: una primera parte que comprende el primer origen positivo de replicación y un gen funcional rep que codifica un factor requerido para la replicación a partir de los orígenes positivos de replicación primero y segundo, y una segunda parte que comprende el segundo origen positivo de replicación, una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de una célula destinada a la introducción del vector plasmídico.

Tras la replicación del vector paterno, se forman los vectores de ADN de progenie primero y segundo, presumiblemente mediante el mecanismo siguiente:

La proteína Rep inicia la replicación produciendo una muesca en el primer origen positivo, y pasa a hacer una muesca en el segundo origen positivo. La cadena desplazada se vuelve a ligar para formar un primer vector de progenie que comprende un primer origen positivo de replicación, procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, y un gen funcional rep afín al primer origen positivo. Similarmente, la proteína Rep pasa del segundo origen positivo a hacer una muesca en el primer origen positivo, formando de este modo, tras nueva ligación de la cadena desplazada y conversión del ADN de una sola cadena en ADN de doble cadena, un segundo vector de progenie que comprende un segundo origen positivo de replicación procedente de una plásmido de ADN, de una sola cadena, que carece de un gen funcional rep afín al segundo origen positivo de replicación, así como una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de dicha célula. Ya que el segundo vector de progenie no comprende un gen funcional rep, la replicación de esta molécula depende enteramente de la proteína Rep proporcionada in trans a partir del primer vector de progenie o a partir del vector paterno.

Alternativamente, los dos vectores de progenie podrían formarse también como resultado de la recombinación entre las regiones de ADN homólogas que incluyen, y/o son adyacentes a, los dos origenes presentes en el vector paterno.

Puede formarse un segundo vector de progenie sin un origen de replicación funcional si el primer origen positivo del plásmido paterno anteriormente descrito es sustituido por un pequeño fragmento de ADN, procedente de la región de origen, que es suficiente para asegurar la terminación de la replicación plasmídica pero demasiado pequeño para constituir un origen funcional. Dichos fragmentos han sido identificados en pUB110 (Boe et al., 1.989, J. Bacteriol., 171, 3.366-3.372) y en pC194 (Gros et al., 1.987, EMBO J., 6, 3.863-3.869).

La célula bacteriana puede ser alternativamente construida mediante un método del invento que comprende transformar la célula hospedante con un primer vector de ADN que comprende un primer origen positivo de replicación, procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, y un gen funcional rep y, posterior o simultáneamente, mediante cotransformación, transformar la célula hospedante con un segundo vector de ADN que comprende un segundo origen positivo de replicación, procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, pero que carece de un gen funcional rep afín al segundo origen positivo de replicación, comprendiendo asimismo una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de dicha célula. El segundo vector de ADN se mantiene en la célula debido a la presencia de la proteína Rep proporcionada a partir del primer vector de ADN.

Cuando el vector paterno o el segundo vector de ADN comprende un gen rep modificado, el segundo origen positivo puede preceder a, o estar situado en, el gen rep modificado. Como se describió anteriormente, el segundo origen positivo puede proceder del mismo o diferente plásmido que el primer origen positivo. En los casos en que los orígenes positivos primero y segundo proceden de diferentes plásmidos de modo que la replicación no se inicia desde ambos orígenes por medio de la misma proteína Rep, el primer vector de ADN puede contener además un gen rep que codifique una proteína Rep activa capaz de iniciar la replicación a partir del segundo origen positivo. El vector paterno o el segundo vector de ADN puede comprender también un marcador seleccionable, como se describió anteriormente.

En una realización favorita para activar el proceso de integración, puede emplearse un vector cuya replicación dependa de condiciones permisivas, incluyendo la temperatura a la que se cultivan las células hospedante. De este modo, cuando una bacteria hospedante que contiene los vectores de ADN primero y segundo es cultivada a la temperatura permisiva para replicación plasmídica, la proteína Rep producida a partir del primer vector de ADN sirve para mantener el segundo vector de ADN en la célula. Sin embargo, a temperaturas no permisivas a las que el primer vector de ADN es incapaz de replicarse, se perderán de la célula el primer vector y, en consecuencia, la proteína Rep producida a partir de él, de modo que el segundo vector de ADN tampoco será ya capaz de replicarse. Mediante cultivo continuado bajo presión selectiva, por ejemplo, en presencia de un antibiótico, sólo sobrevivirán las células que contengan en su genoma la insertada construcción de ADN del invento, que incluye un gen que codifica un marcador seleccionable.

Debe advertirse que una vez que la construcción de ADN se ha integrado en el genoma de la célula hospedante, ésta puede ser cultivada en ausencia de presión de selección sin la consiguiente pérdida de la construcción de ADN ni de partes de la misma de la célula. Se cree que esto es atribuible al hecho de que el ADN integrado es incapaz de replicación autónoma, sino que se replica junto con el genoma del hospedante. La falta de replicación autónoma del ADN integrado implica que no hay formación alguna del producto intermedio de ADN de una sola cadena, del que se cree que es responsable del proceso de recombinación, por lo que el ADN integrado es escindido del genoma del hospedante (véanse Ph. Noiret et al., J. Mol. Biol. 196, 1.987, páginas 39-48, y M. Youngy S. D. Ehrlich, J. Bacteriol. 171(5), mayo de 1.989, paginas 2.653-2.656.

Se ha hallado posible multiplicar la construcción integrada de ADN cultivando células transformadas bajo una presión de selección aumentada; por ejemplo, en concentraciones aumentadas de un antibiótico. Se ha hallado previamente (véase) que en ausencia de una presión de selección dichas copias multiplicadas se pierden frecuentemente de las células. Contrariamente a esto, el presente invento proporciona una célula bacteriana en la que las copias multiplicadas de las secuencias integradas de ADN pueden mantenerse establemente en las células hospedante debido a que, como se explicó anteriormente, el ADN integrado es no replicativo. Aunque anteriormente el presente invento ha sido descrito fundamentalmente como adecuado para la integración de secuencias heterólogas de ADN, debe advertirse que el método presente es también adecuado para obtener un número multiplicado de copias de un gen que es homólogo con respecto a la célula hospedante con objeto de aumentar su producción de un producto génico específico.

Breve descripción de los dibujos

El invento es adicionalmente ilustrado con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un mapa de restricción del plásmido pDN3000,

la Figura 2 muestra un mapa de restricción del plásmido pE194,

la Figura 3 muestra un mapa de restricción del plásmido pPL1975,

la Figura 4 muestra un mapa de restricción del plásmido pSX120,

la Figura 5 muestra un mapa de restricción del plásmido pPL2002,

la Figura 6 muestra un mapa de restricción del plásmido pDN3060,

la Figura 7 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1085,

la Figura 8 muestra un mapa de restricción del plásmido pUC19,

la Figura 9 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1103,

la Figura 10 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1130,

la Figura 11 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1136,

la Figura 12 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1137,

la Figura 13 muestra un mapa de restricción del plásmido pPL1484,

la Figura 14 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1155,

la Figura 15 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1157,

la Figura 16 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1259,

la Figura 17 muestra un mapa de restricción del plásmido pDN2904,

la Figura 18 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1139,

la Figura 19 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1139a,

la Figura 20 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1139b,

la Figura 21 muestra un mapa de restricción del plásmido pDN3020,

la Figura 22 muestra un mapa de restricción del plásmido pPL1878,

la Figura 23 muestra un mapa de restricción del plásmido pPL1896,

la Figura 24 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ993,

la Figura 25 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1163,

la Figura 26 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1163a,

la Figura 27 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1163b,

la Figura 28 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1259a,

la Figura 29 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1555,

la Figura 30 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1155a, y

la Figura 31 muestra un mapa de restricción del plásmido pSJ1555b.

En todas las figuras, las flechas señalan la dirección de transcripción.

Para mejorar la legibilidad, los orígenes de replicación (+ ori pUB110, + ori pE194, ori pUC19) son indicados por el punto real de inicio para la replicación, aun cuando un origen funcional consista en una región de ADN más grande.

El invento es adicionalmente descrito en los ejemplos siguientes, con los cuales no se pretende limitar en modo alguno el alcance ni el espíritu del invento como es reivindicado.

Materiales y métodos Plásmidos

1

Cepas

2

Medios

TY:

Tripticasa	20 g/l
Extracto de levadura	5 g/l
FeCl_{2}\cdot4H_{2}O	6 mg/l
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O	1 mg/l
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	15 mg/l
pH	7,3

TY9: Como el medio TY, pero el pH fue ajustado a 8,5 mediante la adición de NaHCO_{3} (0,1 M).

Agar TY9:

Tripticasa	20 g/l
Extracto de levadura	5 g/l
FeCl_{2}\cdot4H_{2}O	6 mg/l
MnSO_{4}\cdot4H_{2}O	1 mg/l
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	15 mg/l
Agar Bacto	5 g/l
Ajustado a pH 8,5 con NaOHCO_{3} (0,1 M)

BPX:

Almidón de patata	100 g/l
Harina de cebada	50 g/l
BAN 5000 SKB	0,1 g/l
Caseinato de sodio	10 g/l
Harina de soja	20 g/l
Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O	9 g/L
Pluronic	0,1 g/l

Agar LB (Caldo de Luria)

Triptona Bacto	10 g/l
Extracto de levadura	5 g/l
NaCl	10 g/l
Agar Bacto	15 g/l
Ajustado a pH 7,5 con NaOH

Métodos generales

Las técnicas experimentales utilizadas para construir los plásmidos fueron técnicas estándares dentro del campo de la tecnología del ADN recombinante; véase T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1.982.

Las endonucleasas de restricción fueron obtenidas de New England Biolabs y Boehringer Manheim y fueron utilizadas del modo recomendado por los fabricantes. La ADN-ligasa de T4 fue obtenida de New England Biolabs y fue utilizada del modo recomendado por el fabricante.

La preparación del ADN plasmídico de todas las cepas fue llevada a cabo mediante el método descrito por Kieser, 1.984.

Transformación de E. coli

Células de E. coli fueron hechas competentes y transformadas del modo descrito por Mandel e Higa, 1.970, o fueron transformadas mediante electroporación del modo descrito en el manual del aparato de electroporación Gene Pulser de BIO-RAD.

Transformación de B. subtilis

Células competentes fueron preparadas y transformadas del modo descrito por Yasbin et al., 1.975.

Transformación de B. licheniformis

Se introdujeron plásmidos en B. licheniformis mediante transformación protoplástica mediada por polietilenglicol, del modo descrito pos Akamatzu, 1.984.

Transformación de B. lentus

Se introdujeron plásmidos en B. lentus mediante transformación protoplástica de acuerdo con un procedimiento ligeramente modificado de Akamatzu (1.984). Las modificaciones fueron un mayor pH en el medio de regeneración; por ejemplo, el medio HCP 1,5 fue tamponado a pH 8,5 añadiendo NaHCO_{3} 0,1 M al medio.

Ejemplo 1 Integración estable de una molécula de ADN no replicativa en el cromosoma de Bacillus lentus Clonación del gen subtilisina 309

El gen que codifica la proteasa denominada subtilisina 309 fue clonado a partir de un producto de aislamiento de la cepa NCIB 10309 de B. lentus, como se describe en WO 89/06279. Una subclonación adicional dio lugar al plásmido pSX120, el cual contiene el origen de replicación del pUB110, el gen (cat) de resistencia al cloranfenicol del pC194, dos activadores P_{AmyM} y P_{AmyQ}, y el gen que codifica la proteasa subtilisina 309 (véase la Figura 4 y la Solicitud nº PCT/DK90/00164 de Patente Internacional).

Construcción del plásmido pPL2002 de integración

El plásmido pDN3000 fue construido por restricción del pUC19 (Yanisch-Perron et al.) con EcoRI e insertando la siguiente secuencia de oligonucleótidos (preparada mediante el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1.981, páginas 1.859-1.869, en un sintetizador automático de ADN).

AATTGATCAAGCTTTAAATGCATGCTAGCAACGCGGCCGCCAACCTCGAGATCTCATG

CTAGTTCGAAATTTACGTACGATCGTTGCGCCGGCGGTTGGAGCTCTAGAGTACTTAA

en el pUC19 linealizado, seguido de ligación. La mezcla de ligación fue utilizada luego para transformar células competentes de E. coli SJ6, y los productos de transformación fueron seleccionados en placas de LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. La orientación en el pDN3000 del engarzador insertado es como se indica por la orientación de los puntos de restricción en la Figura 1.

El plásmido pPL1975 fue construido por restricción del pDN3000 con BglII, seguida de ligación de este plásmido linealizado al fragmento de MboI que contiene el ADN, de la posición 1 a la 1.585, que resulta de la restricción del pE194 (Figura 2, Horinouchi y Weisblum) con MboI. La mezcla de ligación fue utilizada luego para transformar células competentes de E. coli SJ6, y los productos de transformación fueron seleccionados en placas de LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. La orientación de la conexión de estos dos fragmentos es como se indica en la Figura 3. De este modo, el pPL1975 contiene un origen funcional de replicación de E. coli y un fragmento de ADN del pE194 que comprende un origen positivo intacto (+ ori pE194) y un gen repF truncado (repF') (Villafane

\hbox{ et
al ., 1.987).}

El plásmido pPL2002 (Figura 5) fue construido por restricción del pPL1975 (Figura 3) mediante EcoRI y BamHI y ligando el plásmido linealizado al fragmento de EcoRI (parcial), BglII de 3,3 kb del pSX120 (Figura 4), que contiene el gen de subtilisina 309 y el gen cat de resistencia. La mezcla de ligación fue utilizada luego para transformar células competentes de E. coli SJ6, y los productos de transformación fueron seleccionados en placas de LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina.

Integración estable del plásmido pPL2002 en el cromosoma de B. lentus

Un producto de aislamiento de la cepa NCIB 10309 de B. lentus fue transformada mediante transformación protoplástica con el plásmido pE194 (véase la Figura 1) sensible a la temperatura, seleccionando para resistencia a eritromicina (5 \mug/ml) a 30ºC (temperatura permisiva). La cepa resultante fue denominada PL2156.

La cepa PL2156 fue luego sometida a transformación protoplástica con el plásmido pPL2002, seleccionando para resistencia a cloranfenicol (8 \mug/ml) y resistencia a eritromicina (5 \mug/ml) a 30ºC, teniendo como resultado la cepa PL2157 que contiene los dos plásmidos pE194 y pPL2002. En estas células, la replicación del plásmido pPL2002 depende completamente de la presencia del plásmido pE194, el cual codifica la proteína repF de replicación, indispensable para la replicación del pPL2002.

Se hizo crecer la cepa PL2157 durante la noche en medio TY9 y se sembraron diluciones en placas de TY9 a 45ºC (temperatura no permisiva), seleccionando para resistencia al cloranfenicol (10 \mug/ml). Una de estas colonias resistentes al cloranfenicol fue denominada PL2158.

La hibridación Southern mostró que, en la cepa PL2158, el plásmido pPL2002 se integró en el cromosoma mediante recombinación homóloga entre los genes que lleva el plásmido y los genes cromosómicos de subtilisina 309 y luego se multiplicó hasta aproximadamente 4 copias. No se detectó ninguna evidencia de secuencias completas del plásmido pE194.

La estabilidad de las copias cromosómicamente integradas del pPL2002 en la cepa PL2158 fue probada en fermentaciones a gran escala (1.500 l) sin antibiótico alguno.

Después de la fermentación, unas muestras fueron diluidas y sembradas en placas de TY9, y 100 colonias fueron sometidas a replicación en placas de TY9 que contenían 10 \mug/ml de cloranfenicol. 98 de las colonias probadas eran aún resistentes al cloranfenicol, lo que indicaba que el plásmido pPL2002 estaba aún integrado en el cromosoma. 20 de estas colonias fueron luego probadas mediante hibridación Southern, la cual mostró que el plásmido pPL2002 estaba aún integrado, aparentemente con el mismo número de copias (aproximadamente 4 copias) en todas las colonias probadas.

Ejemplo 2 Construcción de vectores plasmídicos que contienen dos orígenes de replicación del pUB110

El plásmido pSJ1085 (Figura 7) fue construido por restricción del pDN3060 [que contiene un origen de replicación (+ ori pUB110) y el gen rep del pUB110, y un gen (cat) de resistencia al cloranfenicol del pC194] con BamHI y EcoRI e insertando la siguiente secuencia de oligonucleótidos (preparada mediante el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1.981, páginas 1.859-1.869, en un sintetizador automático de ADN).

AATTCTGCAGATATCAAGATAAGAAAGAACAAGTTCCG

GACGTCTATAGTTCTATTCTTTCTTGTTCAAGGCCTAG

en el pDN3060 linealizado, seguido de ligación y transformación de Bacillus subtilis DN1885.

El plásmido pSJ1103 (Figura 9) fue construido por restricción del pSJ1085 (Figura 7) con EcoRI e insertando el plásmido linealizado entero en el plásmido pUC19 similarmente restringido (Figura 8), seguido de ligación y transformación de E. coli SJ6. El plásmido pSJ1103 resultante contiene el origen positivo y el gen rep del pUB110, el gen cat del pC194, el origen de replicación del pUC19 (ori pUC19) y el gen (bla) de \beta-lactamasa (resistencia a ampicilina).

El plásmido pSJ1130 (Figura 10) fue obtenido del pSJ1103 (Figura 9) por deleción de un fragmento de NsiI-PstI de 1,6 kb, teniendo esencialmente como resultado un plásmido pUC19 que contenía un origen positivo de pUB110 y un gen rep truncado (rep'). El plásmido fue transformado en E. coli SJ6.

Un fragmento de HindIII de 1,4 kb del pDN3060 (Figura 6), que contenía el origen positivo seguido del gen rep intacto, fue luego insertado en el punto único de HindIII del pSJ1130 (Figura 10), y el plásmido ligado fue transformado en E. coli SJ6, teniendo como resultado el pSJ1136 (Figura 11). En este experimento, sucedió que el fragmento se insertó en el pSJ1136 en dos copias en tándem. Una de estas copias fue posteriormente suprimida por digestión del pSJ1136 con NsiI, nueva ligación del fragmento de 5,1 kb y transformación de E. coli SJ6, lo que dio como resultado el pSJ1137 (Figura 12), el cual contiene un origen de pUB110 junto a un gen rep truncado, y un origen de pUB110 junto a un gen rep intacto.

El gen (kan) que codifica resistencia a la kanamicina fue escindido del plásmido pPL1484 (Figura 13) en un fragmento de SphI de 1,4 kb e insertado, en cada una de las dos posibles orientaciones, en el punto de SphI del pSJ1137 (Figura 12), seguido de transformación de E. coli SJ6, lo que dio como resultado el pSJ1155 (Figura 14) y el pSJ1157 (Figura 15), respectivamente. El pSJ1157 contenía el gen kan en dos copias en tándem. Una copia fue escindida con BamHI, y el fragmento de 6,5 kb fue vuelto a ligar y transformado en E. coli SJ6 para formar el pSJ1259 (Figura 16).

El plásmido pSJ1139 (Figura 18) fue construido del modo siguiente: el plásmido pDN2904 de Bacillus (Figura 17), que contenía un gen (cat) de resistencia al cloranfenicol, un gen (kan) de resistencia a la kanamicina y el origen positivo del pUB110 con el correspondiente gen rep, fue digerido con SphI y ligado al pSJ1130 (Figura 10), el cual también había sido digerido con SphI. El plásmido pSJ1139 resultante contiene un origen de pUB110 asociado con un gen rep truncado, y un origen de pUB110 asociado con un gen rep intacto.

Ejemplo 3 Formación de vectores de ADN de progenie a partir de plásmidos que contienen dos orígenes de replicación del pUB110, en Bacillus subtilis

Se transformó el plásmido pSJ1139 (Figura 18; preparado a partir de E. coli SJ1139 de un modo per se conocido) en B. subtilis DN1885 seleccionando para resistencia a la kanamicina (10 \mug/ml), y se preparó ADN plasmídico a partir de diversos productos de transformación. La electroforesis de estos plásmidos en gel de agarosa, ya fueran no digeridos o digeridos con una diversidad de enzimas de restricción, mostró la presencia de dos moléculas de ADN menores, de 5,1 kb y 2,4 kb, respectivamente, así como una pequeña cantidad del plásmido pSJ1139 de longitud completa, de 7,5 kb. Los patrones de restricción obtenidos fueron los esperados para la formación de los dos vectores de progenie, pSJ1139a (Figura 19) y pSJ1139b (Figura 20), ya fuera por sobrecruzamiento homólogo entre las dos secuencias rep en pSJ1139 o ya fuera por la acción de la proteína Rep, la cual produce una muesca en el origen positivo del pUB110, en la cadena positiva de ADN que es luego desplazada y recircularizada del modo descrito por A. Gruss y S. D. Ehrlich, opere citato (ambos mecanismos podrían conducir a los dos mismos vectores de progenie).

Estos vectores fueron adicionalmente analizados mediante nueva transformación en la cepa DN1885 de B. subtilis, y siembra en placas de LB que contenían 10 \mug/ml de kanamicina o 6 \mug/ml de cloranfenicol, seguido de siembra por réplica de cada placa en una nueva placa que contenía el otro antibiótico. Luego se aislaron vectores de cada tipo de producto de transformación y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, con los resultados siguientes:

Los productos de transformación resistentes tanto al cloranfenicol como a la kanamicina contienen las tres especies vector (pSJ1139 de 7,5 kb, pSJ1139a de 2,4 kb y pSJ1139b de 5,1 kb). Los productos de transformación resistentes al cloranfenicol y sensibles a la kanamicina sólo contienen el pSJ1139b. No se obtuvieron productos de transformación resistentes a la kanamicina pero sensibles al cloranfenicol. Por consiguiente, el pequeño vector de progenie pSJ1139a, de 2,4 kb, no es capaz de replicarse autónomamente en B. subtilis.

Ejemplo 4 Integración estable de una molécula de ADN no replicativa en el cromosoma de B. subtilis Construcción de una cepa de B. subtilis que contiene una copia cromosómica de un gen de ciclodextrina-glicosil-transferasa (CGTasa)

El gen (CGT) de CGTasa fue escindido del plásmido pPL1878 (Figura 22) sobre un fragmento de BamHI-SphI de 2,5 kb, y ligado al plásmido pDN3020 digerido con BamHI-SphI (Figura 21) para formar el plásmido pPL1896 (Figura 23). El pDN3020 es un derivado del pDN1313 (Diderichsen, 1.986), construido insertando un engarzador oligonucleotídico sintético (preparado del modo descrito en el Ejemplo 1 anterior), que contiene SphI, en el punto EcoRI del plásmido pDN1380 (Diderichsen y Christiansen, 1.988), lo que tiene como resultado el plásmido pDN1620. La región activadora de una amilasa maltógena de B. stearothermophilus (PamyM), presente en el pDN1620 (B. Diderichsen y L. Christiansen, opere citato), fue luego transferida al pUC19 digerido con SphI-BamHI, sobre un fragmento de BamHI-SphI de aproximadamente 200 pares de bases, lo que dio como resultado el plásmido pDN2977. La región activadora fue escindida del pDN2977 sobre un fragmento de BglII-SacI de aproximadamente 200 pares de bases, el cual fue insertado en la región poliengarzadora del pDN1313, generándose de este modo el plásmido pDN3020. El gen de CGTasa del pPL1896 está flanqueado por dos fragmentos de ADN cromosómico de B. subtilis, indicados como dal y dfs en la Figura 23. dal es el gen que codifica la D,L-alanina-racemasa de B. subtilis (Diderichsen, 1.986).

El plásmido pPL1896 fue transformado en la cepa DN1686 de B. subtilis. Cuando se seleccionó únicamente para productos de transformación Dal^{+}, se obtuvieron diversas cepas que eran sensibles al cloranfenicol, CGTasa^{+}. Fueron formadas mediante un doble sobrecruzamiento homólogo entre el pPL1896 y el cromosoma de DN1686, como describe Diderichsen, 1.986. Una de tales cepas es PL1897, que contiene una copia cromosómicamente integrada del gen de CGTasa.

Construcción de un vector de integración que contiene el gen de CGTasa

El gen de CGTasa fue escindido del pPL1878 (Figura 22) sobre un fragmento de BamHI-NotI de 2,5 kb. Se construyó un vector de expresión insertando un fragmento de SphI-PstI, de 0,6 kb, que contenía la región activadora del gen de alfa-amilasa clonado de un derivado de B. licheniformis ATCC 9789 superproductor de amilasa, obtenido por procedimientos convencionales de mutagénesis, en un vector procedente de pUB110 que contenía el origen de pUB110 y el gen que codifica la resistencia a la kanamicina. El gen (cgt) de CGTasa fue insertado cadena abajo de este activador, entre los puntos BamHI y NotI, lo que dio como resultado el pSJ993 (Figura 24).

Se insertó un fragmento de BglII de 4 kb del pSJ993 en el punto BglII del pSJ1155 (descrito en el Ejemplo 1 anterior, Figura 14), se transformó el plásmido resultante en la cepa SJ6 de E. coli, y se aislaron productos de transformación de E. coli SJ6, resistentes a la ampicilina y productores de CGTasa, sembrando productos de transformación en placas de LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y almidón soluble al 0,5%, explorando la formación de un halo claro alrededor de las colonias después de teñir las placas con vapor de yodo. Para experimentos posteriores se guardó un producto de transformación que contenía el plásmido pSJ1163 (Figura 25) en el que se había regenerado el gen de resistencia a la kanamicina.

Formación de vectores de progenie del pSJ1163 en las cepas DN1885 y PL1897 de B.subtilis

El pSJ1163 (Figura 25) fue transformado en DN1885, y el ADN vector fue preparado a partir de productos de transformación resistentes a la kanamicina y fue analizado mediante electroforesis en gel de agarosa. Este análisis mostró cantidades mínimas de una molécula plasmídica de 10,5 kb, que correspondía al pSJ1163, y dos moléculas vector de progenie, pSJ1163b de 4,1 kb (Figura 27) y pSJ1163a de 6,4 kb (Figura 26) en cantidades aproximadamente igual y mucho mayor, respectivamente, que correspondían a vectores de progenie procedentes bien de recombinación homóloga entre las dos secuencias rep del pSJ1163 o bien de la acción de la proteína Rep en cada origen positivo, en replicación de círculo rodante como se describió anteriormente. La formación de vectores de progenie como los anteriormente descritos fue también observada cuando el pSJ1163 fue transformado en PL1897, y dichos dos productos de transformación fueron guardados para ulteriores experimentos como cepas SJ1168 y SJ1170.

Aislamiento de productos de integración que contienen moléculas de ADN no replicativas

Las cepas SJ1168 y SJ1170 fueron inoculadas en 10 ml de medio TY que contenía 5 \mug/ml de kanamicina y fueron incubadas durante la noche a 37ºC. Luego se inocularon 100 \mul de cada cultivo en medio TY fresco y se repitió la incubación. Después de cuatro de dichos ciclos de incubación durante la noche, se preparó ADN plasmídico a partir de los dos cultivos y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. No se observó ninguna molécula plasmídica. Cuando la preparación plasmídica fue utilizada para transformar E. coli seleccionando para resistencia a la ampicilina, no se obtuvo ningún producto de transformación, lo que indica que no estuvieron presentes el pSJ1163 original de 10,5 kb ni la molécula vector de progenie pSJ1163b, de 4,1 kb. Las cepas resistentes a la kanamicina, exentas de plásmidos, fueron guardadas para ulteriores experimentos como SJ1223 y SJ1237.

Multiplicación del ADN integrado

Seleccionando para crecimiento em medio TY que contenía concentraciones gradualmente crecientes de kanamicina, se aislaron cepas que eran capaces de crecer en 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1.000, 1.200 y 1.400 \mug/ml de kanamicina. En ADN cromosómico de cepas resistentes a más de aproximadamente 400 \mug/ml de kanamicina, las digestiones con NheI o NotI revelaron una banda de ADN del tamaño esperado de la digestión del vector de progenie pSJ1163a, de 6,4 kb, con estos enzimas. Esta banda no aparecía en los productos de digestión del ADN preparado a partir de cepas con un grado menor de resistencia a la kanamicina. Un cálculo moderado sería que al menos 5-10 copias del ADN integrado estaban presentes cuando apareció esta banda.

Estabilidad del ADN integrado

Se hicieron crecer cepas resistentes a 400 \mug/ml de kanamicina durante una semana, a 37ºC, en matraces sacudidos que contenían medio BPX sin nada de kanamicina añadida. Fueron sembradas en placas de LB y luego sometidas a siembra por réplica en placas que contenían 10 \mug/ml de kanamicina. De aproximadamente 100 colonias, todas eran resistentes a la kanamicina, lo que indica la herencia estable del gen de resistencia a la kanamicina, presente en el ADN integrado en ausencia de presión de selección.

Estabilidad de un gen de CGTasa que lleva el plásmido, en B. subtilis

El plásmido pPL1892 es esencialmente idéntico al pSJ993 (Figura 24), siendo la única diferencia que una región poliengarzadora diferente está presente cadena abajo del gen de CGTasa. Este plásmido fue introducido en DN1885 y la cepa resultante SJ984 fue hecha crecer durante una semana a 37ºC en matraces sacudidos que contenían medio BPX sin nada de kanamicina añadida.

La siembra en placas que contenían kanamicina (10 \mug/ml) proporcionó un recuento celular 10 veces menor que aquél en placas sin kanamicina, lo que indicaba que el 90% de las células habían perdido su plásmido. Esto se reflejaba también en el hallazgo de que menos del 10% de las colonias en placas sin kanamicina producían CGTasa.

Ejemplo 5 Formación de vectores de progenie del pSJ1156 en B. licheniformis ATCC 9789

El plásmido pSJ1156 es idéntico al pSJ1157 mostrado en la Figura 15. El pSJ1156 fue introducido en B. licheniformis ATCC 9789 mediante transformación protoplástica, seleccionando para resistencia a la kanamicina, lo que dio como resultado la cepa SJ1199. El análisis del contenido plasmídico de la SJ1199 por digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa reveló la presencia de dos moléculas plasmídicas. Una era idéntica al pSJ1259 (Figura 16) y muy probablemente se formó por deleción de una copia del gen kan mediante recombinación homóloga. La otra correspondía al pSJ1259a (Figura 28), una de las dos moléculas de progenie que podrían formarse bien por recombinación homóloga entre las dos secuencias rep del pSJ1259 o bien por la acción de la proteína Rep en cada origen positivo, en replicación de círculo rodante como se describió anteriormente.

Ejemplo 6 Integración estable de una molécula de ADN no replicativa en el cromosoma de B.licheniformis ATCC 9789 Construcción del vector de integración

El plásmido pSJ1260 es idéntico al pSJ1259 mostrado en la Figura 16. Se digirió ADN cromosómico de B. licheniformis ATCC 9789 con PstI + BamHI y se aislaron fragmentos de entre 2 y 4 kb de un gel de agarosa. Estos fragmentos fueron ligados al pSJ1260 digerido con PstI + BamHI, y transformados en E. coli SJ6 seleccionando resistencia a ampicilina. Un producto de transformación obtenido contenía una inserción de 2,1 kb, y el plásmido fue denominado pSJ1555 (Figura 29). E. coli SJ6 que contenía el pSJ1555 fue depositada en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Escocia, Gran Bretaña, el 12 de diciembre de 1.990, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con el fin de procedimiento de patente, con el número de acceso NCIMB 40346. Este plásmido tiene la capacidad de formar las dos moléculas de progenie pSJ1555a (Figura 30) y pSJ1555b (Figura 31).

Aislamiento de un producto de integración de B. licheniformis que contiene una molécula de ADN no replicativa

Se introdujo el pSJ1555 en B. licheniformis ATCC 9789 mediante transformación protoplástica, seleccionando para resistencia a la kanamicina. Un producto de transformación regenerado (SJ1613), resistente a la kanamicina, estaba exento de plásmidos, como se vió por electroforesis en gel de una preparación plasmídica procedente de ese producto de transformación, y la preparación plasmídica fue incapaz de transformar al B. subtilis en cuanto a resistencia a la kanamicina. Este resultado indica que la molécula de progenie no replicativa pSJ1555a se había formado y se había integrado en el cromosoma de ATCC 9789.

Multiplicación y estabilidad del ADN integrado

Se hizo crecer la cepa SJ1613 en cultivos sucesivos de TY, de 10 ml, que contenían 10, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000 y 5.000 \mug/ml de kanamicina, y las cepas que crecieron en cada una de estas diferentes concentraciones fueron guardadas para un estudio posterior. Se analizaron adicionalmente las cepas resistentes a 20, 200 y 1.500 \mug/ml de kanamicina. El ADN cromosómico de las dos últimas cepas reveló, tras digestión con BamHI, una banda marcada de 4,5 kb, ausente del ADN de la primera cepa, como se esperaba para las cepas que contienen copias múltiples del pSJ1555a integradas en el cromosoma.

Todas las cepas fueron hechas crecer en matraces sacudidos con BPX, a 37ºC, durante 7 días y sin kanamicina, y luego fueron sembradas como rayas en placas de LB. La siembra por réplica de placas de LB a placas de kanamicina (10 \mug/ml) no reveló ninguna colonia sensible a la kanamicina. Se obtuvieron los recuentos de colonias en las placas con y sin kanamicina (10 \mug/ml) para las tres cepas resistentes a 20, 200 y 1.500 \mug/ml de kanamicina y, en todos los casos, fueron 10^{10} ml^{-1}, lo que indica la estabilidad del gen kan integrado.

Referencias

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Claims (40)

1. Un método para producir una célula bacteriana que lleve en su genoma una construcción de ADN no replicativa e integrada que comprende (1) una secuencia de ADN de interés, (2) una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, y (3) un origen de replicación, construcción de ADN que carece de un gen funcional que codifica un factor requerido para iniciar la replicación a partir de dicho origen de replicación, método que comprende

(a) transformar células bacterianas con un vector plasmídico paterno que comprende un primer origen de replicación y un segundo origen de replicación con la misma orientación que el primer origen de replicación, orígenes de replicación primero y segundo que son suficientemente similares para ser funcionales con el(los) mismo(s) factor(es) de replicación, dividiendo los orígenes de replicación primero y segundo al vector en dos partes: (i) una primera parte que comprende el primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) de replicación requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dichos orígenes de replicación primero y segundo, y (ii) una segunda parte que comprende el segundo origen de replicación, una secuencia de ADN de interés, y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de una célula destinada a la introducción del
vector, y

(b) cultivar bajo condiciones selectivas las células transformadas, dando lugar la replicación del vector plasmídico paterno a la formación de un primer vector de progenie que comprende el primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) de replicación requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dichos orígenes de replicación primero y segundo, y a un segundo vector de progenie que comprende el segundo origen de replicación pero que carece de un gen funcional que codifica un factor de replicación, comprendiendo también una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, dando lugar el cultivo continuado de las células transformadas, bajo condiciones selectivas, a la integración de dicho segundo vector de progenie en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga y a la pérdida del primer vector de progenie así como del vector paterno de las células.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo origen de replicación procede del mismo plásmido que el primer origen de replicación.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se ha suprimido un gen que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se ha modificado un gen que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el gen ha sido modificado por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN del gen, o por deleción de señales de inicio o parada de transcripción o traducción.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vector plásmidico paterno es uno que es incapaz de replicarse a temperaturas aumentadas, las cuales permiten no obstante el crecimiento de la célula hospedante, y en el que las células bacterianas son inicialmente cultivadas a una temperatura que permite la replicación plasmídica, y posteriormente, después de la integración del segundo vector de progenie en el genoma bacteriano, son cultivadas a una temperatura que no permite la replicación plasmídica de modo que el primer vector de progenie así como el vector paterno se pierden de las células.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el vector paterno comprende un primer origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, y un segundo origen positivo de replicación, procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, con la misma orientación que el primer origen positivo, dividiendo los orígenes positivos de replicación primero y segundo al vector en dos partes: (i) una primera parte que comprende el primer origen positivo de replicación y un gen funcional rep que codifica un factor requerido para la replicación a partir de los orígenes positivos de replicación primero y segundo, y (ii) una segunda parte que comprende el segundo origen de replicación, una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de una célula destinada a la introducción del vector plasmídico.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el segundo origen positivo de replicación procede del mismo plásmido de ADN de una sola cadena que el primer origen positivo de replicación.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la célula bacteriana es una célula de una bacteria Gram-positiva.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la bacteria Gram-positiva es una cepa que pertenece al género Bacillus o Streptomyces.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la bacteria es una cepa de Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis o Streptomyces lividans.

12. Un método para producir una célula bacteriana que lleve en su genoma una construcción de ADN no replicativa e integrada que comprenda (1) una secuencia de ADN de interés, (2) una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, y (3) un origen de replicación, construcción de ADN que carece de un gen funcional que codifique un factor requerido para iniciar la replicación a partir de dicho origen de replicación, método que comprende

(a) transformar células bacterianas con un (i) un primer vector de ADN que comprende un primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dicho primer origen de replicación, y con (ii) un segundo vector de ADN que comprende un segundo origen de replicación pero que carece de un gen funcional que codifique un factor requerido para la replicación plasmídica a partir del segundo origen de replicación, comprendiendo también una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, orígenes de replicación primero y segundo que son suficientemente similares para ser funcionales con el(los) mismo(s) factor(es) de replicación de modo que la replicación del segundo vector de ADN a partir del segundo origen de replicación sea iniciada por el(los) factor(es) de replicación codificado(s) por el(los) gen(es) presente(s) en el primer vector de ADN, y

(b) cultivar las células resultantes bajo condiciones selectivas que conduzcan a la integración de dicho segundo vector de ADN en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga y a la pérdida del primer vector de
ADN.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el segundo origen de replicación procede del mismo plásmido que el primer origen de replicación.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación ha sido suprimido del segundo vector de ADN.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación ha sido modificado.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el gen ha sido modificado por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN del gen, o por deleción de señales de inicio o parada de transcripción o traducción.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer vector de ADN comprende además un gen funcional que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el segundo vector de ADN comprende además un marcador seleccionable.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en el que el primer vector de ADN comprende un primer origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, y un gen funcional rep, y en el que el segundo vector de ADN comprende un segundo origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena pero carece de un gen funcional rep afín al segundo origen positivo de replicación, comprendiendo asimismo una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de dicha célula.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el segundo origen positivo de replicación procede del mismo plásmido de ADN de una sola cadena que el primer origen positivo de replicación.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer vector de ADN es uno que es incapaz de replicarse a temperaturas aumentadas, las cuales permiten no obstante el crecimiento de la célula hospedante, y en el que las células bacterianas son inicialmente cultivadas a una temperatura que permite la replicación plasmídica, y posteriormente, después de la integración del segundo vector de ADN en el genoma bacteriano, son cultivadas a una temperatura que no permite la replicación plasmídica de modo que el primer vector de ADN se pierde de las células.

22. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-21, que es una célula de una bacteria Gram-positiva.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la bacteria Gram-positiva es una cepa que pertenece al género Bacillus o Streptomyces.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la bacteria es una cepa de Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis o Streptomyces lividans.

25. Un vector plasmídico paterno que comprende un primer origen de replicación y un segundo origen de replicación con la misma orientación que el primer origen de replicación, orígenes de replicación primero y segundo que son suficientemente similares para ser funcionales con el(los) mismo(s) factor(es) de replicación, dividiendo los orígenes de replicación primero y segundo al vector en dos partes: (i) una primera parte que comprende el primer origen de replicación y uno o más genes funcionales que codifican el(los) factor(es) de replicación requerido(s) para la replicación plasmídica a partir de dichos orígenes de replicación primero y segundo, y (ii) una segunda parte que comprende el segundo origen de replicación, una secuencia de ADN de interés, y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de una célula destinada a la introducción del vector.

26. Un vector plasmídico de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el segundo origen de replicación procede del mismo plásmido que el primer origen de replicación.

27. Un vector plasmídico de acuerdo con la reivindicación 25, del que se ha suprimido el gen que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación.

28. Un vector plasmídico de acuerdo con la reivindicación 25, en el que se ha modificado un gen que codifica el factor de replicación asociado con el segundo origen de replicación.

29. Un vector plasmídico de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el gen ha sido modificado por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN del gen, o por deleción de señales de inicio o parada de transcripción o traducción.

30. Un vector plasmídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25-29, que comprende un primer origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, y un segundo origen positivo de replicación, procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, con la misma orientación que el primer origen positivo, dividiendo los orígenes positivos de replicación primero y segundo al vector en dos partes: una primera parte que comprende el primer origen positivo de replicación y un gen funcional rep que codifica un factor requerido para la replicación a partir de los orígenes positivos de replicación primero y segundo, y una segunda parte que comprende el segundo origen positivo de replicación, una secuencia de ADN de interés y una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de una célula destinada a la introducción del vector plasmídico.

31. Un vector plasmídico de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el segundo origen positivo de replicación procede del mismo plásmido de ADN de una sola cadena que el primer origen positivo de replicación.

32. Un vector plasmídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25-31, que comprende además un marcador seleccionable.

33. Una célula bacteriana perteneciente al género Bacillus y que no puede ser transformada para hacerla competente, y que lleva en su genoma una construcción de ADN no replicativa e integrada que comprende (1) una secuencia de ADN de interés, (2) una secuencia de ADN que es homóloga con una región del genoma de la célula, y (3) un origen de replicación, construcción de ADN en la que se ha suprimido un gen que codifica un factor requerido para iniciar la replicación a partir de dicho origen de replicación o en la que el gen que codifica el factor de replicación ha sido modificado con objeto de que codifique un factor de replicación inactivo.

34. Una célula de acuerdo con la reivindicación 33, en la dicho gen ha sido modificado por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN del gen, o por deleción de señales de inicio o parada de transcripción o traducción.

35. Una célula de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, en la que la construcción de ADN comprende una secuencia de ADN de interés, una secuencia de ADN que es homóloga con respecto a una región del genoma de la célula, y un origen positivo de replicación procedente de un plásmido de ADN de una sola cadena, construcción de ADN que carece de un gen funcional rep afín al origen positivo de replicación.

36. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en la que la construcción de ADN comprende además un marcador seleccionable.

37. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-36, en la que la bacteria es una cepa de Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans o Bacillus subtilis.

38. Un procedimiento para producir un polipéptido de interés, que comprende cultivar una célula bacteriana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-37, que contiene una secuencia de ADN integrada que codifica dicho polipéptido bajo condiciones conducentes a la producción del polipéptido, y recuperar del cultivo el polipéptido resultante.

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39. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el polipéptido es un enzima.

40. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39, en el que el enzima es una proteasa, amilasa o lipasa.