DE68919068T2 - Genetisch modifizierte Milchsäurebakterien und ihre Verwendung bei der Herstellung von Käse und rekombinanten Plasmiden. - Google Patents
Genetisch modifizierte Milchsäurebakterien und ihre Verwendung bei der Herstellung von Käse und rekombinanten Plasmiden.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft genetisch modifizierte Milchsäurebakterien, insbesondere der Spezies Lactococcus lactis, sowie die Verwendung dieser Bakterien bei der Herstellung von Käse und rekombinante Plasmide, die für die genetische Modifikation verwendet werden können.
- Die vorliegende Erfindung liegt daher auf dem Gebiet der genetischen Modifikation unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie sowie auf dem Gebiet der Molkereitechnologie, insbesondere der Herstellung von Käse.
- Ein Problem, das bei der Herstellung von Käse, z.B. bei der Herstellung von Gouda und Edamer, entstehen kann, ist das Auftreten einer sog. Buttersäurefermentation d.h. das Auftreten von Aromamängeln als Folge des Wachstums von Clostridia-Spezies, insbesondere Clostridium tyrobutyricum, wobei Sporen davon in der Käsemilch enthalten sein können. Insbesondere Wintermilch ist oftmals mit nennenswerten Mengen an Sporen dieser Buttersäurebakterien kontaminiert.
- Da die relevanten Sporen ohne weiteres Pasteurisierungsbehandlungen überleben, sind spezielle Maßnahmen erforderlich, um die Buttersäurefermentation im Käse zu hemmen. Eine herkömmliche und wirksame Maßnahme besteht in der Zugabe von Nitrat zur Käsemilch. Vom Standpunkt der Gesundheit sind jedoch Einwände gegen das Vorhandensein von relativ großen Mengen an Nitrat in Nahrungsmitteln, wie Käse, erhoben worden. Durch die Bildung von Nitrit kann Nitrat zur Bildung von Nitrosaminen führen, von denen bekannt ist, daß es sich um karzinogene Substanzen handelt. Aus diesem Grund ist es in einigen Ländern verboten, Käse mit einem Gehalt von mehr als 10 mg Nitrat pro Kilogramm Käse zu importieren.
- Seit 1966 ist es bekannt, daß die Buttersäurefermentation auch durch Zugabe von Lysozym, das aus Hühnereiweiß gewonnen wird, gehemmt werden kann (Pulay, XVII Int. Dairy Congr. D641 (1966)). Im Hinblick auf einige neuere Untersuchungen wird auf Wasserfall und Teuber, Appl. Environ, Microbiol., Bd. 38 1979), S. 197-199 und Stadhouders et al., NIZO-Nieuws, Nr. 10 (1987), S. 17-20 Bezug genommen.
- Es ist ferner aus Biochem. Biophys. Acta, Bd. 615 (1980), S. 489- 496 und aus Mol. Gen. Genet., Bd. 182 (1981), S. 326-331 bekannt, daß das R-Gen-Produkt des Bakteriophagen lambda eine Transglycosylase mit einer wesentlich höheren bakteriolytischen Aktivität als Hühnereiweißlysozym ist.
- Für Hühnereiweißlysozym sind inzwischen auch Versuche unternommen worden, das Enzym durch ein mikrobiologisches Verfahren herzustellen. Miki et al., Protein Engineering, Bd. 1 (1987), S. 327-332 und Imoto et al., Protein Engineering, Bd. 1 (1987), S. 333-338 beschreiben die Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, die ein Gen enthalten, das für Hühnereiweißlysozym kodiert, und die Expression dieses Gens in Escherichia coli-Bakterien. Es stellt sich heraus, daß Lysozym in diesem Mikroorganismus in Form eines inaktiven Niederschlags angereichert wird, was einer fehlerhaften Faltung des Enzyms zugeschrieben wird.
- Bei der Herstellung von Käse spielen Milchsäurebakterien eine wichtige Rolle. Das Aroma und die Struktureigenschaften des Käses werden in einem großen Maße durch die eingesetzten Spezies und Stämme von Milchsäurebakterien bestimmt.
- Im Hinblick auf die genetische Modifikation von Milchsäurebakterien, wie verschiedenen Spezies von Streptococci, Lactococci und Lactobacilli, hat die rekombinante DNA-Technologie inzwischen erhebliche Fortschritte erzielt. So sind bereits Transformationssysteme für Milchsäurebakterien entwickelt worden, die erfolgreich für die Klonierung und Charakterisierung verschiedener homologer Gene verwendet wurden. Kok et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 48 (1984), S. 726-731 beschreiben geeignete Vektoren, die aufgrund eines speziellen Replikationsursprungs aus dem Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-Plasmid pWV01 zur Replikation sowohl in Milchsäurebakterien als auch in Escherichia coli und Bacillus subtilis imstande sind. Kok et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 54 (1988), S. 231-238 haben die Nukleotidsequenz des Zellwandproteinase-Gens des Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-Stamms und der damit verbundenen Expressionssignale, nämlich einer Promotor- und einer Terminatorsequenz, bestimmt. Ferner haben Van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 50 (1985), S. 540-542 und Bd. 53 (1987), S. 2452-2457 Signale für die Genexpression chromosomaler DNA des vorstehenden Wg2- Stamms isoliert und charakterisiert. Durch diese in der Literatur beschriebenen Hilfsmittel scheint es nun möglich, auch heterologe Gene in Milchsäurebakterien zu exprimieren. Für sich genommen ist dies eine interessante Tatsache, da Milchsäurebakterien zur Kategorie der GRAS-Organismen ("generally regarded as safe", im allgemeinen als sicher angesehen) gerechnet werden und daher als sehr geeignet für die sichere Herstellung großtechnisch wichtiger Proteine erscheinen.
- Bis jetzt ist jedoch nur eine sehr kleine Anzahl an heterologen Genen in Milchsäurebakterien exprimiert worden, und zwar betrifft dies insbesondere Antibiotika-Resistenz-Gene für die Verwendung als Selektionsgene in verschiedenen Klonierungsvektoren (De Vos, FEMS Microbiol. Rev., Bd. 46 (1987), S. 281-295). Was eukaryontische DNA-Sequenzen betrifft, so ist bisher nur die Expression des (verkürzten) Rinder-Prochymosin-Gens in Lactococcus lactis subsp. lactis beschrieben worden (Simons und De Vos, Proc. 4th European Congress on Biotechnology 1987, S. 458 und Klessen et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 212 (1988), S. 295-300).
- Die vorliegende Erfindung stellt Milchsäurebakterien, insbesondere der Spezies Lactococcus lactis, bereit, die infolge einer genetischen Modifikation die Fähigkeit erworben haben, Lysozym zu produzieren.
- Insbesondere stellt die Erfindung solche Milchsäurebakterien bereit, die infolge einer genetischen Modifikation die Fähigkeit erworben haben, ein aus Hühnereiweißlysozym und dem R-Gen-Produkt des Bakteriophagen lambda ausgewähltes Enzym zu produzieren.
- In den bisher erfindungsgemäß erhaltenen Stämmen von Milchsäurebakterien, die durch genetische Modifikation die Fähigkeit zur Bildung von Lysozym erworben haben, ist diese Fähigkeit plasmidkodiert. Diese Stämme von Milchsäurebakterien enthalten stets mindestens ein Plasmid, das für die Fähigkeit zur Produktion von Lysozym verantwortlich ist, wobei das Plasmid mindestens den Replikationsursprung des Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-Plasmids pWV01 und ein Gen, das für Lysozym kodiert, unter der Kontrolle von in Milchsäurebakterien wirksamen Expressionssignalen enthält. Einige der erhaltenen Stämme haben außerdem die Fähigkeit zur Absonderung des produzierten Lysozyms erworben. Die tatsächlich erhaltenen Stämme sind Lactococcus lactis subsp. lactis-Bakterien, die das Plasmid pMG37, pMG38, pMG41 oder pMG42 enthalten. Diese Plasmide und ihre Konstruktion werden im experimentellen Teil beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Verwendung derartiger Milchsäurebakterien, die durch genetische Modifikation erhalten wurden, bei der Herstellung von Käse und auf den erhaltenen Käse.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante DNA in Form von Plasmiden, die zu der vorstehenden genetischen Modifikation von Milchsäurebakterien verwendet werden können, und insbesondere ein rekombinantes Plasmid, das einen Replikationsursprung, der in Milchsäurebakterien aktiv ist, und ein Gen, das für Lysozym kodiert, unter der Kontrolle von Expressionssignalen, die in Milchsäurebakterien aktiv sind, enthält. Das für Lysozym kodierende Gen ist vorzugsweise ein Gen, das für Hühnereiweißlysozym kodiert, oder das R-Gen des Bakteriophagen lambda.
- Wie vorstehend bemerkt wurde, wird einem rekombinanten Plasmid der Vorzug gegeben, das den Replikationsursprung des Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-Plasmids pWV01 enthält.
- Es wird ferner bevorzugt, daß das rekombinante Plasmid die Terminatorsequenz des Proteinase-Gens von Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 enthält.
- Einige Ausführungsformen der Erfindung betreffen ein rekombinantes Plasmid, das den Promotor und die Signalsequenz des Protease-Gens von Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 enthält. Milchsäurebakterien, die ein derartiges Plasmid enthalten, sind zur Absonderung des gebildeten Lysozyms imstande. Weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen ein rekombinantes Plasmid, das den Promotor P32 aus chromosomaler DNA von Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 enthält. Genetisch modifizierten Milchsäurebakterien, die ein derartiges Plasmid enthalten, fehlt die Fähigkeit zur Absonderung des gebildeten Enzyms.
- Es ist bevorzugt, daß ein erfindungsgemäßes rekombinantes Plasmid auch ein oder mehrere Selektionsgene enthält. Geeignet dafür sind z.B. Antibiotika-Resistenz-Gene, wie ein Kanamycin-Resistenz-Gen oder ein Erythromycin-Resistenz-Gen.
- Erfindungsgemäße rekombinante Plasmide, die inzwischen tatsächlich konstruiert worden sind, sind pMG36HEL, pMG36eHEL, pMG33eHEL, pMG36lambdaR und pMG33lambdaR sowie die Plasmide pMG37, pMG38, pMG41 und pMG42, die aufgrund der ihnen innewohnenden Eigenschaften besonders bevorzugt sind.
- Schließlich stellt auch ein rekombinanter Vektor, aus dem eines der vorstehend beschriebenen rekombinanten erfindungsgemäßen Plasmide durch Insertion des für ein Lysozym kodierenden Gens, wie eines Gens, das für Hühnereiweißlysozym kodiert, oder des R-Gens des Bakteriophagen lambda, abgeleitet wird, eine Ausführungsform der Erfindung dar. Rekombinante Vektoren, aus denen die vorstehend genannten Plasmide abgeleitet werden, sind pMG33, pMG33e, pMG36 und pMG36e.
- Fig. 1 ist eine Karte des Expressionsvektors pMG36. Dieser Vektor weist eine Größe von 3,7 kb (Kilobasen) auf und ist zum Teil vom Ausgangsplasmid pGK11 (angezeigt durch einen offenen Balken, in dem der Replikationsursprung des Plasmids pWV01, kurz als ori pWV01 bezeichnet, vorhanden ist), zu einem anderen Teil vom Ausgangsplasmid pPJ1 (angezeigt durch einen breiten ausgefüllten Balken, in dem ein Kanamycin-Resistenz- Gen, kurz als Kmr bezeichnet, vorhanden ist), zu einem anderen Teil vom Proteinase-Gen von L. lactis subsp. cremoris Wg2 (angezeigt durch einen schmalen ausgefüllten Balken, in dem ein Transkriptions-Terminator, kurz als T bezeichnet, vorhanden ist) und zum Teil vom Ausgangsplasmid pGKV32 (angezeigt durch eine gestrichelte Linie, wobei ein Promotor P, eine Ribosom-Bindungsstelle und der Beginn eines offenen Leserahmens vorhanden sind) abgeleitet. Der Beginn des offenen Leserahmens (durch einen Pfeil angezeigt) und die mehrfache Klonierungsstelle (MCS) sind in vergrößerter Form gezeigt.
- Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz eines EcoRI-HindIII-Fragments, das die cDNA für das reife Hühnereiweißlysozym enthält (die kodierende Sequenz ist unterstrichen). Das EcoRI-HindIII-Fragment 243-647 (Numerierung, wie sie in Fig. 2 verwendet wird) stammt aus dem Plasmid pKLZ61 (Imoto et al., Protein Engineering, Bd. 1 (1987), S. 333-338). Das Fragment 1-242 stammt aus pGKV432.
- Die Erfindung stellt Milchsäurebakterien mit einer Eigenschaft, die ihnen natürlicherweise fehlt, nämlich der Fähigkeit zur Bildung eines aktiven Lysozyms, bereit, was es ihnen während der Verwendung bei der Herstellung von Käse ermöglicht, das Auftreten einer Buttersäurefermentation zu hemmen. Aus praktischen und wirtschaftlichen Gründen ist es attraktiv, über Stämme von Milchsäurebakterien zu verfügen, die inhärent imstande sind, Infektionen durch Clostridium tyrobutyricum während der Käsereifung zu kontrollieren, so daß die getrennte Zugabe von Lysozym überflüssig ist und die Zugabe von Nitrat verringert oder sogar vollständig weggelassen werden kann.
- Die erfindungsgemäße genetische Modifikation ist im Prinzip nicht auf eine spezielle Spezies von Milchsäurebakterien beschränkt. Die im experimentellen Teil beschriebenen rekombinanten Vektoren und Plasmide eignen sich für Milchsäurebakterien verschiedener Spezies, wie Streptococci, Lactococci und Lactobacilli, und daher nicht nur für die Spezies Lactococcus lactis subsp. lactis (Stamm IL1403), die im experimentellen Teil verwendet wird. Gegebenenfalls werden angepaßte Vektoren für die genetische Modifikation anderer Arten von Milchsäurebakterien verwendet, wobei man annimmt, daß der Fachmann dazu auf der Basis seiner normalen Fachkenntnisse und der hier vorgelegten Informationen imstande ist.
- Obwohl im Prinzip auch eine genetische Modifikation möglich ist, bei der die für die Fähigkeit zur Produktion eines Lysozyms erforderliche Information in das Genom (die Chromosomen) der Milchsäurebakterien eingeschlossen wird, wird die im experimentellen Teil erläuterte Bildung von genetisch modifizierten Milchsäurebakterien, die eine plasmidkodierte Fähigkeit zur Produktion eines Lysozyms aufweisen, bevorzugt, da die Eigenschaft dann in einfacherer Weise auf andere Stämme übertragen werden kann.
- Im Hinblick auf das zu exprimierende Lysozym ist die Erfindung im Prinzip ebenfalls nicht beschränkt. Beliebige Lysozyme oder lysozymartige Enzyme, die zur Hemmung des Wachstums von Buttersäurebakterien imstande sind, können verwendet werden. Die Beispiele für geeignete Lysozyme, die im experimentellen Teil angegeben werden, sind jedoch bevorzugt, da die für diese Enzyme kodierende DNA kloniert und gut charakterisiert ist. Bei diesen Enzymen handelt es sich um Hühnereiweißlysozym und das R-Gen-Produkt des Bakteriophagen lambda. Weitere Informationen über diese Enzyme und die genetische Information, die dafür kodiert, finden sich in der Literatur unter Einschluß der Literatur, die im Abschnitt "Hintergrund der Erfindung" angegeben ist. Der Wirkungsmechanismus des lambda-R-Gen-Produkts zeigt starke Ahnlichkeiten mit dem von Hühnereiweißlysozym, obwohl klare strukturelle Unterschiede zwischen beiden Enzymen bestehen. Wie aus dem experimentellen Teil ersichtlich ist, ist die genetische Information, die für diese Enzyme kodiert, über bekannte Plasmide zugänglich.
- Durch rekombinante DNA-Techniken kann die genetische Information, die für ein Lysozym kodiert, geeigneten Expressionsvektoren, insbesondere Plasmiden, die zur Replikation in Milchsäurebakterien imstande sind und eine Anzahl von Merkmalen aufweisen, die es ermöglichen, sie als Vektoren zu verwenden, einverleibt werden. Verschiedene Klonierungsvektoren, die sich für Milchsäurebakterien eignen, sind bekannt. Vorzugsweise wird jedoch ein Vektor verwendet, der, wie das Plasmid pGK11, den Replikationsursprung des Plasmids pWV01 enthält. Entscheidend ist, daß der Replikationsursprung die attraktive Eigenschaft aufweist, daß er nicht nur in Milchsäurebakterien seine Funktion erfüllt (pWV01 ist ein Plasmid des Milchsäurebakteriums Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2), sondern auch in Escherichia coli und Bacillus subtilis. Der pWV01-Ursprung ist öffentlich durch das natürliche Plasmid pWV01 selbst oder durch das Konstrukt pGK11, die beide von Kok et al. in Appl. Environ. Microbiol., Bd. 48 (1984), S. 726-731 beschrieben werden, zugänglich.
- Um seine Funktion als Expressionsvektor erfüllen zu können, muß das Plasmid nicht nur einen geeigneten Replikationsursprung aufweisen, sondern auch Expressionssignale, die in Milchsäurebakterien aktiv sind. Geeignete Expressionssignale sind bereits veröffentlicht worden, wie die von Kok et al. in Appl. Environ. Microbiol., Bd. 54 (1988), S. 231-238 beschriebenen Expressionssignale (Promotor und Signalsequenz, Terminatorsequenz) des Proteinase-Gens, das sich auf dem Plasmid pWV05 des vorstehend genannten Wg2-Stamms befindet. Diese Nukleotidsequenzen sind öffentlich über das natürliche Plasmid pWV05 selbst oder über bekannte Konstrukte, wie das Plasmid pGKV512, das von Kok et al. in Appl. Environ. Microbiol., Bd. 54 (1988), S. 239-244 beschrieben wird, zugänglich. Anstelle des pWV05-Proteinase-Gen-Promotors kann der von Van der Vossen et al. in Appl. Environ. Microbiol., Bd. 53 (1987), S. 2452-2457 beschriebene Promotor, der aus chromosomaler DNA des Wg2-Stamms stammt, ebenfalls verwendet werden. Zusammen mit einer ribosomalen Bindungsstelle und dem Beginn eines offenen Leserahmens ist dieser Promotor über das Plasmid pGKV232 zugänglich. Da keine Signalsequenz vorhanden ist, führt die Verwendung dieses Promotors dazu, daß unter der Kontrolle dieses Promotors exprimiertes Lysozym durch die Milchsäurebakterien nicht abgesondert wird. Weitere Promotoren und Terminatorsequenzen eignen sich im Prinzip jedoch auch, solange sie ihre Funktion in Milchesäurebakterien erfüllen. Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Expressionssignale beschränkt, die im experimentellen Teil verwendet werden.
- Wie für den Fachmann klar ist, werden Expressionsvektoren, die eine mehrfache Klonierungsstelle (MCS) enthalten, bevorzugt. Durch das Vorhandensein einer MCS wird die Konstruktion der erfindungsgemäßen Plasmide erleichtert, und insbesondere kann der korrekte Leserahmen leicht sichergestellt werden. Geeignete MCS-Seouenzen sind als solche bekannt und zugänglich, z.B. über die öffentlich zugänglichen pUC-Plasmide, wie pUC18. Die MCS von pUC18 enthält u.a. SalI-, AccI- und HindII-Stellen, die es ermöglichen, ein ausgewähltes Gen im korrekten Leserahmen zu inserieren. Nachdem diese Stellen mittels des Klenow-Enzyms zu stumpfen Enden aufgefüllt wurden, können die Fragmente mit den stumpfen Enden in 3 Leserahmen inseriert werden, die an Stellen in gegenseitigen Abständen von 1 Basenpaar angeordnet sind.
- Entsprechend ist klar, daß geeignete Vektoren üblicherweise mindestens ein selektierbares Merkmal enthalten, um es zu ermöglichen, erfolgreiche Konstruktionen oder erfolgreiche Transformationen (Transformanten) von nicht erfolgreichen Konstruktionen und Transformationen zu unterscheiden. Es ist üblich, für diesen Zweck Antibiotika-Resistenz-Gene zu verwenden. Inzwischen ist eine Anzahl derartiger Gene bekannt. Als Beispiele für geeignete Antibiotika-Resistenz-Gene wurden das Kanamycin-Resistenz-Gen des Streptococcus faecalis-Plasmids pJH1 (beschrieben von Trieu-Cuot und Courvalin in Gene, Bd. 23 (1983), S. 331-341) und das Erythromycin-Resistenz-Gen des Streptococcus aureus-Plasmids pE194 (beschrieben von Weisblum et al., J. Bacteriol., Bd. 137 (1979), S. 635- 643) im experimentellen Teil ausgewählt. Beide sind öffentlich zugänglich und werden entsprechend dem experimentellen Teil aus den Plasmiden pPJ1 (ein pUC7-Plasmid, das das Kmr-Gen von pJH1 enthält) und pUC7e (ein pUC7- Plasmid, das das Emr-Gen von pE194 enthält) isoliert. Das Kanamycin-Resistenz-Gen (Kmr-Gen) weist den Vorteil einer einfachen Selektion in E. coli und in B. subtilis auf, die Selektion in L. lactis erweist sich jedoch aufgrund des Auftretens eines hohen Hintergrundes an nicht-transformierten Zellen als schwieriger, auch wenn anstelle von Kanamycin Neomycin als selektives Antibiotikum verwendet wird. Da die Selektion auf Erythromycin-Resistenz in L. lactis wesentlich wirksamer ist, wird die Verwendung von Expressionsvektoren, die das Erythromycin-Resistenz-Gen (Emr) enthalten, bevorzugt.
- Zusätzlich zu Antibiotika-Resistenz-Genen gibt es noch weitere selektierbare Merkmale. Im vorliegenden Fall, in dem es um genetisch modifizierte Milchsäurebakterien für die Verwendung bei der Herstellung von Käse geht, ist ein selektierbares Merkmal, das aus Milchsäurebakterien stammt, gegenüber Selektionsmerkmalen, die nicht aus Milchsäurebakterien stammen, bevorzugt.
- Wie im experimentellen Teil gezeigt wird, können Plasmide konstruiert werden, die zur Herstellung eines Fusionsproteins, d.h. eines Proteins, das überschüssige Sequenzen zusätzlich zur Aminosäuresequenz des Lysozyms enthält, führen. Diese zusätzlichen Sequenzen können eine nachteilige Wirkung auf die Aktivität des Enzyms vom Lysozymtyp aufweisen. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, daß redundante Nukleotidsequenzen, die für diese überschüssigen und möglicherweise störenden Aminosäuren kodieren, entfernt werden. Diese Entfernung überschüssiger Nukleotidsequenzen kann mittels bekannter gerichteter Mutationsverfahren (gerichtete Mutagenese) erfolgen, wie der "gapped duplex DNA" -Methode, die von Kramer et al. in Nucl. Acids Res., Bd. 12 (1984), S. 9441-9456 beschrieben wird, und zwar unter Verwendung der speziell dafür entworfenen Phasmide (d.h. Plasmid/Phage-Hybride) pMa5-8 und pMc5-8, die von Stanssens et al. in dem Manual mit dem Titel "Oligonucleotide-directed construction of mutations by the gapped duplex DNA method using pMa/c phasmid vectors", November 1986, gemeinsam herausgegeben von Plant Genetic Systems, Gand, Belgium, und Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Bundesrepublik Deutschland, beschrieben werden. pMas-8 enthält ein Ampicillin-Resistenz- Gen und ein Chloramphenicol-Resistenz-Gen, das aufgrund einer Amber-Mutation inaktiv ist. pMc5-8 ist nahezu identisch zu pMas-8, enthält jedoch ein aktives Chloramphenicol-Resistenz-Gen und ein Ampicillin-Resistenz- Gen, das aufgrund einer Amber-Mutation inaktiv ist. Wie im experimentellen Teil gezeigt wird, wurde dieses Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pMG37 und pMG38 angewandt, die das für Hühnereiweißlysozym kodierende Gen enthalten, und bei der Konstruktion der Plasmide pMG41 und pMG42, die das lambda-R-Gen enthalten. Im Fall der Konstruktion des Plasmids pMG37 bestand der bei der gerichteten Mutagenese verwendeten Primer aus einzelsträngiger DNA mit der Seouenz (in 5'-3'-Richtung):
- GCTCACATCGTCCAAAGACTTTCATTTCAAAATTCCTCCGAATA.
- Dieses aus 44 Nukleotiden bestehende synthetische Oligonukleotid ist komplementär zu den Nukleotiden (entsprechend der Numerierung von Fig. 2) 159-180 [die aus dem Promotor P32 stammen] und 253-274 [die aus dem EcoRI-HindIII-Fragment des Plasmids pKLZ61 (beschrieben von Imoto et al. in Protein Engineering, Bd. 1 (1987), S. 333-338) stammen, auf dem sich die für Hühnereiweißlysozym kodierende Sequenz befindet]. Die Verwendung dieses Primers führte zur Entfernung der redundanten Nukleotide 181-252. Bei der Konstruktion des Plasmids pMG38 handelte es sich bei dem verwendeten Primer um eine einzelsträngige DNA mit der Sequenz (in 5'-3'- Richtung):
- GCTCACATCGTCCAAAGACTTTCGCCTTTGCTTGGATTTCGCC.
- Im Fall der Plasmide mit dem Bakteriophage lambda-R-Gen ist eine derartige gerichtete Mutation ebenfalls erforderlich, da im pAP19-Fragment, das als Quelle für das R-Gen verwendet wird (ein Konstrukt, das durch Insertion des HinfI-Fragments erhalten wurde, das das lambda-R-Gen (Nukleotide 45439-45976) in der EcoRV-Stelle des Plasmids pIC19H enthält, beschrieben von Marsh et al. in Gene, Bd. 32 (1984), S. 481-485), vor dem R-Gen ein Stopcodon im gleichen Leserahmen wie das R-Gen auftritt.
- Bei der Konstruktion des Plasmids pMG41 handelte es sich bei dem verwendeten Primer um eine einzelsträngige DNA mit der Seouenz (in 5'-3'- Richtung):
- CGTTGATTATTGATTTCTACCATTTCAAAATTCCTCCGAAT.
- Bei der Konstruktion des Plasmids pMG42 handelte es sich bei dem verwendeten Primer um eine einzelsträngige DNA mit der Sequenz (in 5'-3'- Richtung):
- TACGTTGATTATTGATTTCTACCGCCTTTGCTTGGATTTCG.
- Die vorliegende Erfindung ist nicht auf genetisch modifizierte Milchsäurebakterien, wie sie vorstehend definiert und beschrieben wurden, und auf rekombinante Plasmide, die für die relevanten genetischen Modifikationen verwendet werden können, beschränkt, sondern erstreckt sich auf rekombinante Vektoren, aus denen die vorstehenden Plasmide durch Insertion des Gens, das für ein Lysozym kodiert, abgeleitet wurden. Diese Vektoren eignen sich in der Tat auch sehr gut für die Expression von Proteinen, die von Lysozymen verschieden sind, in Milchsäurebakterien. Daher können sie in Fällen der Verbesserung eines Stamms (der Bildung von Milchsäurebakterien mit verbesserten oder sogar vollständig neuen Eigenschaften) und bei der Verwendung von Milchsäurebakterien als Hersteller heterologer Proteine verwendet werden.
- Die Erfindung wird ausführlicher mittels des nachstehenden experimentellen Teils erläutert, der jedoch nicht beschränkend sein soll.
- - BHB2600 (Hohn, Methods Enzymol., Bd. 68 (1979), S. 299-309)
- - C600 (Appleyard, Genetics, Bd. 39 (1954), S. 440-452)
- - JM103 (Messing et al., Nucl. Ac. Res. , Bd. 9 (1981), S. 309-321)
- - MC1000 (Casadaban und Cohen, J. Mol. Biol., Bd. 138 (1980), S. 179-207)
- - WK6mutS (Manual von Stanssens et al., 1986)
- - PSL1 (Ostroff und Pene, J. Bacteriol., Bd. 156 (1983), S. 934- 936)
- - IL1403 (Chopin et al., Plasmid, Bd. 11 (1984), S. 260-263)
- - pWV01 (Kok et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 48 (1984) S. 726-731; ein Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-plasmid, dessen Ursprung seine Funktion auch in E. coli und B. subtilis erfüllt)
- - pGK11 (Kok et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 48 (1984), S. 726-731; Cmr; enthält den Ursprung von pWV01 auf einem Sau3A-Fragment)
- - pWV05 (Kok et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 54 (1988), S. 231-244; ein Plasmid, das das vollständige Wg2-Protease-Gen unter Einschluß des Terminators enthält)
- - pJH1 (Trieu-Cuot und Courvalin, Gene, Bd. 23 (1983), S. 331-341; Emr, Kmr, Strr, Tcr; ein Streptococcus faecalis-Plasmid, das u.a. ein Kanamycin-Resistenz-Gen enthält)
- - pGKV512 (Kok et al., Appl. Environ. Micdrobiol., Bd. S4 (1988), S. 239-244)
- - pGKV232 (Van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 53 (1987), S. 2452-2457; Cmr, Emr; ein Plasmid, das einen aus der chromosomalen DNA von Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 stammenden Promotor P32 mit einer ribosomalen Bindungsstelle und dem Beginn eines offenen Leserahmens enthält)
- - pE194 (Horinouchi und Weisblum, J. Bacteriol., Bd. 150 (1982), S. 804-814; Weisblum et al., J. Bacteriol., Bd. 137 (1979), S. 635-643; Emr)
- - pUC7 (Vieira und Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259-268)
- - pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119; Apr)
- - M13mp18/19 (Yanisch-Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103- 119)
- - pPJ1 (Apr, Kmr; pUC7 mit dem Kanamycin-Resistenz-Gen von pJH1 auf einem HindII-Fragment)
- - pUC18e (enthält eine mehrfache Klonierungsstelle MCS mit einem Erythromycin-Resistenz-Gen in der BamHI-Stelle)
- - M13prot93 (Phage M13mp18/19 mit dem pWV05-Protease-Gen-Terminator in einem 5 kb umfassenden PstI-Fragment)
- - pGKV514 (ein Plasmid, das durch Schneiden von pGKV512 mit AatII und Religation erhalten wird, wobei das Plasmid den Promotor des Protease-Gens des Wg2-Stamms in einem 500 bp umfassenden NruI-HaeIII-Fragment enthält)
- - pGKV432 (Cmr, Emr; ein Plasmid, das durch Schneiden von pGKV232 mit BamHI, Behandlung mit Klenow-Enzym und Religation abgeleitet wird, wobei das Plasmid einen aus der chromosomalen DNA von Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 stammenden Promotor P32 mit einer ribosomalen Bindungsstelle und dem Beginn eines offenen Leserahmens in einem EcoRI-SalI- Fragment enthält)
- - pUC7e (Apr, Emr; pUC7 mit dem Erythromycin-Resistenz-Gen von pE194 in einem AccI-Fragment)
- - pMG6 (enthält ein PstI-HindIII-Fragment mit einer Lysozym-lacZ- Fusionssequenz, wobei das Fragment aus 3 Teilfragmenten besteht, die nach der Bildung stumpfer Enden miteinander ligiert wurden; diese Teilfragmente sind der Reihe nach: (1) ein PstI-SacI-Fragment (5'-Teil der Lysozym-Sequenz) aus pLS1023; (2) ein EcoRI-DraI-Fragment (lacZ-Fragment) aus pMLB1034, aus dem die BamHI-Stelle zuvor mittels Mungobohnen-Nuklease entfernt wurde; und (3) ein ClaI-HindIII-Fragment aus pBR322)
- - pMG18 (enthält ein PstI-HindIII-Fragment mit einer Lysozym-cDNA- Sequenz, wobei das Fragment aus 2 Teilfragmenten besteht, die miteinander nach der Bildung stumpfer Enden ligiert wurden; diese Teilfragmente sind der Reihe nach: (1) ein PstI-DraI-Fragment (Lysozym-Fragment) aus pLS1023; und (2) ein EcoRI-HindIII-Fragment aus pBR322)
- - pLS1023 (Land et al., Methods Enzymol., Bd. 100 (1983), S. 285- 292)
- - pMLB1034 (Silhavy et al., "Experiments with gene fusions", 1984, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York)
- - pBR322 (Bolivar et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95-113)
- - pKLZ61 (Imoto et al., Protein Engineering, Bd. 1 (1987), S. 333- 338; Apr; enthält Hühnereiweißlysozym-cDNA)
- - pICI9H (Marsh et al., Gene, Bd. 32 (1984), S. 481-485)
- - pAP19 (pICI9H mit einem HinfI-Fragment in der EcoRV-Stelle,
- das aus dem Phagen lambda stammt (Nukleotide 45439-45976) und das lamoda-R-Gen enthält)
- - pMa6-8 (Apr, Cms) und pMc5-8 (Aps, Cmr), Stanssens et al., Manual 1986)
- pMG20; pMG21; pMG23; pMG25; pMG27; pMG29; pMG30; pMG32, pMG32delta; pMG33a; pMG33; pMG36 (ca. 3,7 kb); pMG36e (ca. 3,7 kb); pMG36HEL; pMG36eHEL; pMG37; pMG33e; pMG33eHEL; pMG38, pMG36lambdaR; pMG33lambdaR; pMG41; und pMG42.
- E. Coli und B. subtilis wurden in TY-Brühe (Rottlander und Trautner, J. Mol. Biol., Bd. 108 (1970), S. 47-60) oder auf mit 1,5 % Agar verfestigtem TY gezüchtet. Zur Transformation von B. subtilis-Protoplasten handelte es sich bei dem Platiermedium um DM3 (Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet., Bd. 168 (1989), S. 111-115). Zum Züchten von L. lactis wurde Glucose-M17-Brühe (Terzaghi und Sandine, Appl. Microbiol., Bd. 29 (1975), S. 807-813) oder mit 1,5 % Agar verfestigtes Glucose-M17-Medium verwendet. Um die der Elektroporation unterworfenen Zellen osmotisch zu stabilisieren, wurde diesen Medien 0,3 m Saccharose zugesetzt.
- Kanamycin wurde in Konzentrationen von 50 und 20 ug/ml für E. coli bzw. B. subtilis verwendet, wobei ein 100 ug/ml für die DM3-Platten verwendet wurden. Erythromycin wurde in Konzentrationen von 100 und 5 ug/ml für E. coli bzw. L. lactis verwendet.
- Plasmid-DNA wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res., Bd. 7 (1979), S. 1513-1523) isoliert. Restriktionsenzyme, Klenow-Enzym und T4-DNA-Ligase wurden von Boehringer Mannheim GmbH bezogen und verwendet, wie es veröffentlicht ist. Für die Transformation von E. coli wurde das Verfahren von Mandel und Higa (J. Mol. Biol., Bd. 53 (1970), S. 159-162) angewandt. Protoplasten von B. subtilis wurden nach dem Verfahren von Chang und Cohen (Mol. Gen. Genet., Bd. 168 (1979), S. 111-115) hergestellt und transformiert. Plasmide wurden durch Elektroporation in L. lactis gebracht (Van der Lelie et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 54 (1988), S. 865-871).
- Die verschiedenen Stufen der durchgeführten Konstruktionen sind nachstehend beschrieben. Relevante Informationen über die Plasmide sind in Klammern angegeben. Der Ausdruck "Klenow" bedeutet, daß eine Behandlung mit Klenow-DNA-Polymerase durchgeführt wurde, um stumpfe Enden zu erzeugen.
- 1. Konstruktion von pMG20 (Kmr, ori pWV01)
- 1a. pGK11 (ori pWV01) + Sau3A, Klenow
- 1b. pPJ1 (Km) + HindII
- 1c. Ligation, Transformation von E. coli MC1000, Selektion Km&sub2;&sub0;R, Cm&sub5;S, Ap&sub1;&sub0;&sub0; S
- 2. Konstruktion von pMG21 (Entfernung der 2 HindIII-Stellen im pPJ1-Teil)
- 2a. pMG20 + HindIII, Klenow
- 2b. Ligation, Transformation von B subtilis PSL1-Protoplasten, Selektion Km&sub1;&sub0;&sub0;R (DM3-Medium)
- 3. Konstruktion von pMG23 (Kmr, ori pWV01, Emr in MCS)
- 3a. pMG21 + ClaI, Klenow
- 3b. pUCl8e + EcoRI, HindIII, Klenow
- 3c. Ligation, Transformation von E. coli C600, Selektion Km&sub5;&sub0;Em&sub5;&sub0;R, Ap&sub5;&sub0;S
- 4. Konstruktion von pMG25 (Entfernung des Emr-Gens aus der MCS)
- 4a. pMG23 + BamHI
- 4b. Ligation, Transformation von E. coli C600, Selektion Km&sub5;&sub0;R, Km&sub5;&sub0;Em&sub5;&sub0;S
- 5. Konstruktion von pMG27 (Kmr, ori pWV01, Terminator in MCS)
- 5a. pMG25 + SphI, T4-DNA-Polymerase + dNTPs, PstI, Isolierung Vektorteil
- 5b. M13prot93 + PstI, AccI, Isolierung 1021 bp umfassendes Fragment, FnuDII, HaeII
- 5c. Ligation, Transformation von E. coli C600, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 6. Konstruktion von pMG29
- 6a. pMG27 + PstI, HindIII, Isolierung Vektorteil
- 6b. pMG6 + PstI, HindIII, Isolierung Lysozym-lacZ-Fusionsfragment
- 6c. Ligation, Transformation von E. coli BHB2600, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 7. Konstruktion von pMG30 (Kmr, ori pWV01, Protease-Gen-Promotor und -Terminator in MCS)
- 7a. pMG29 + BamHI, SalI, Klenow
- 7b. pGKV514 + NruI, HaeIII, Isolierung 500 bp umfassendes Promotorfragment
- 7c. Ligation, Transformation von E. coli MC1000, Selektion Km&sub5;&sub0;R, Xgal&sub4;&sub0; blau
- 8. Konstruktion von pMG32
- 8a. pMG30 + PstI, HindIII
- 8b. pMG18 + PstI, HindIII
- 8c. Ligation, Transformation von E. coli MC1000, Selektion Km&sub5;&sub0;R, Xgal&sub4;&sub0; weiß, Tc12,5S
- 9. Konstruktion von pMG32delta (Entfernung der SmaI- und BamHI- Stellen)
- 9a. pMG32 + SmaI, BamHI, Klenow
- 9b. Ligation, Transformation von E. coli MC1000, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 10. Konstruktion von pMG33a (Einführung von MCS und Emr hinter dem Protease-Gen- Promotor)
- 10a. pMG32delta + HindII, HindIII
- 10b. puCl8e + EcoRI, Klenow, HindIII
- 10c. Ligation, Transformation von E. coli C600, Selektion Km&sub5;&sub0;Em&sub5;&sub0;R
- 11. Konstruktion von pMG33 (Entfernung des Emr-Gens)
- 11a. pMG33a + BamHI
- 11b. Ligation, Transformation von E coli MC1000, Selektion Km&sub5;&sub0;R, Em&sub5;&sub0;S
- 12. Konstruktion von pMG36 (Kmr, Wg2-Promotor P32, MCS, Terminator, ori pWV01; der Expressionsvektor pMG36 ist in Fig. 1 gezeigt)
- 12a. pMG33 + EcoRI, SalI
- 12b. pGKV432 + EcoRI, SalI
- 12c. Ligation, BamHI, Transformation von E. coli BHB2600, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 13. Konstruktion von pMG36e (Emr, Wg2-Promotor P32, MCS, Terminator, ori pWV01)
- 13a. pMG36 + EcoRV
- 13b. pUC7e + AccI, Klenow
- 13c. Ligation, Transformation von E. coli C600, Selektion Em&sub1;&sub0;&sub0; R, Km&sub5;&sub0;S
- 14. Konstruktion von pMG36HEL (pMG36 + Hühnereiweißlysozym-Gen)
- 14a. pMG36 + AccI, Klenow, HindIII
- 14b. pKLZ61 + EcoRI, Klenow, HindIII (Die Sequenz des EcoRI- HindIII-Fragments von pKLZ61 ist in Fig. 2 von Nummer 243 an gezeigt.)
- 14c. Ligation, Transformation von E. coli, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 15. Konstruktion von pMG36eHEL (pMG36e + Hühnereiweißlysozym-Gen)
- 15a. pMG36HEL + EcoRV, Isolierung Vektorteil
- 15b. pUC7e + AccI, Klenow, Isolierung 1 kb umfassendes Fragment
- 15c. Ligation, Transformation von E. coli BHB2600, Selektion Em&sub1;&sub0;&sub0;R
- 16. Konstruktion von pMG37 (Entfernung der überschüssigen Sequenzen aus pMG36HEL)
- 16a. pMG36HEL + EcoRV, HindIII, Isolierung des den Promotor und das Lysozym-Gen enthaltenden Fragments
- 16b. pMa5-8 + SmaI, HindIII
- 16c. Ligation etc., gefolgt von Isolierung einzelsträngiger DNA
- 16d. pMc5-8 + EcoRI, HindIII
- 16e. "gapped duplex"-Bildung
- 16f. Addition des einzelsträngigen Oligonukleotids (5' nach 3')
- GCTCACATCGTCCAAAGACTTTCATTTCAAAATTCCTCCGAATA
- 16g. in vitro Auffüllen und Ligation
- 16h. Transformation von E. coli WK6MutS, Selektion CmR
- 16i. Plasmid-DNA-Isolierung, SmaI, Transformation von E. coli WK6
- 16j. Plasmid-DNA-Isolierung, Restriktionsenzymanalyse, Sequenzanalyse
- 16k. Isolierung des EcoRI-HindIII-Fragments und Einführen in pMG36e/EcoRI, HindIII
- 17. Konstruktion von pMG33e (Emr, Protease-Gen-Promotor, MCS, Terminator, ori pWV01)
- 17a. pMG33 + EcoRV
- 17b. pUC7e + AccI, Klenow
- 17c. Ligation, Transformation von E. coli C600, Selektion Em&sub1;&sub0;&sub0;R, Km&sub5;&sub0;S
- 18. Konstruktion von pMG33eHEL (pMG33e + Hühnereiweißlysozym-Gen)
- 18a. pMG33e + XbaI, HindIII
- 18h. pMG36HEL + XbaI, HindIII
- 18c. Ligation, Transformation von E. coli BHB2600, Selektion Em&sub1;&sub0;&sub0;R
- 19. Konstruktion von pMG38 (Entfernung Überschüssiger Sequenzen aus pMG33eHEL)
- 19a. pMG33eHEL + SspI, HindIII, Isolierung des Fragments, das die Signalsequenz und die für Lysozym kodierende Sequenz enthält
- 19b. pMa5-8 + SmaI, HindIII
- 19c. Ligation etc., gefolgt von Isolierung einzelsträngiger DNA
- 19d. pMc5-8 + EcoRI, HindIII
- 19e. "gapped duplex"-Bildung
- 19f. Addition des einzelsträngigen Oligonukleotids (5' nach 3')
- GCTCACATCGTCCAAAGACTTTCGCCTTTGCTTGGATTTCGCC
- 19g. in vitro Auffüllen und Ligation
- 19h. Transformation von E. coli WK6MutS, Selektion CmR
- 19i. Plasmid-DNA-Isolierung, SmaI, Transformation von E. coli WK6
- 19j. Plasmid-DNA-Isolierung, Restriktionsenzymanalyse, Sequenzanalyse
- 19k. Isolierung des EcoRI-HindIII-Fragments und Einführung in pMG33e/EcoRI, HindIII
- 20. Konstruktion von pMG36lambdaR (pMG36 + lambda-R-Gen)
- 20a. pMG36 + SacI, SalI
- 20b. pAP19 + SacI, SalI
- 20c. Ligation, Transformation von E. coli MC1000, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 21. Konstruktion von pMG33lambdaR (pMG33 + lambda-R-Gen)
- 21a. pMG33 + BamHI, SalI
- 21b. pAP19 + BglII, SalI
- 21c. Ligation, Transformation von E. coli MC1000, Selektion Km&sub5;&sub0;R
- 22. Konstruktion von pMG41 (Entfernung überschüssiger Sequenzen aus pMG36lambdaR)
- Eine gerichtete Mutagenese wurde analog zu dem unter Punkt 16 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei sie jedoch auf das Plasmid pMG36lambdaR angewandt wurde und der folgende Primer verwendet wurde:
- CGTTGATTATTGATTTCTACCATTTCAAAATTCCTCCGAAT
- 23. Konstruktion von pMG42 (Entfernung überschüssiger Sequenzen aus pMG33lambdaR)
- Eine gerichtete Mutagenese wurde analog zu dem unter Punkt 16 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei sie jedoch auf das Plasmid pMG33lambdaR angewandt wurde und der folgende Primer verwendet wurde:
- TACGTTGATTATTGATTTCTACCGCCTTTGCTTGGATTTCG
- Transkription und Translation wurden in vitro mittels des Translationsreagenzsatzes für prokaryontische DNA von Amersham International plc, Amersham, England, durchgeführt.
- Lysate von L. lactis für Western Blot-Analysen wurden nach folgender Anleitung hergestellt; die Stämme wurden über Nacht in Glucose-M17- Brühe, die mit 40 millimolar DL-Threonin angereichert war, gezüchtet. Von dieser Kultur wurden Proben von 10 ml zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 10 ml STE (100 millimolar NaCl; 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7; 1 millimolar EDTA) gewaschen, in 1 ml STE resuspendiert und in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen. Nach erneutem Zentrifugieren der Zellen wurde das Pellet in 50 ul einer Lösung mit 10 millimolar Tris-HCl, 1 millimolar EDTA (pH-Wert: 7), die 150 Einheiten/ml Mutanolysin und 1 millimolar MgCl&sub2; enthielt, resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde ein Volumen, das dem zweifachen des eingefüllten Puffers für die Polyacrylamidgel-Elektrophorese entsprach, zugegeben, gefolgt von 10- minütigem Erwärmen der Proben auf 100ºC. Zellrückstände wurden durch Zentrifugation entfernt, und Anteile von höchstens 1/10 des Überstandes wurden für die weitere Analyse verwendet. Produkte der in vitro erfolgten Transkription-Translation und Zell-Lysate wurden auf 15 %-ige SDS-Polyacrylamidgele (Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680-685) aufgebracht und einer Elektrophorese unterworfen. Produkte der in vitro erfolgten Transkription-Translation wurden anschließend durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die elektrophoretisch von den Zell-Lysaten getrennten Proteine wurden auf Nitrozellulose durch Elektroblotting übertragen, gefolgt vom Nachweis von Hühnereiweißlysozym-Sequenzen mit einem Kaninchen- Antiserum gegen Hühnereiweißlysozym und einem Peroxidase-konjugierten Schweineantiserum gegen Kaninchen-Immunglobuline (Dakopatts a/s, Glostrup, Dänemark).
- Um festzustellen, ob das in L. lactis gebildete Enzym in aktiver Form vorliegt, wurden Zell-Lysate durch Beschallung bei 0ºC (6 Zyklen von 20 Sekunden mit Intervallen von 20 Sekunden, Amplitude: 4 um, in einer Vorrichtung Soniprep 150 von MSE Ltd., Sussex, England) hergestellt. Nach der Entfernung von Zellrückständen durch Zentrifugation wurden Anteile des Überstandes zu einer Suspension von lyophilisiertem Micrococcus lysodeikticus-Zellen (Sigma, St. Louis, USA) gegeben, und Δ A450, was die Lysozym-Aktivität darstellt, wurde gemessen, wie es vorgeschrieben ist.
- Wie vorstehend unter (f) angegeben wurde, wurden verschiedene neue Plasmide konstruiert. Zuerst wurden geeignete Expressionsvektoren, nämlich pMG33, pMG33e, pMG36 und pMG36e, konstruiert. pMG36 ist in Fig. 1 gezeigt. Dieser Expressionsvektor basiert u.a. auf dem L. lactis subsp. cremoris Wg2-Plasmid pWV01, das auch in E. coli und B. subtilis repliziert wird. Der Teil des Vektors, der den pWV01-Replikationsursprung enthält, wurde aus pGK11 durch Ausschneiden mit Sau3A und Auffüllen der klebrigen Enden mittels des Klenow-Enzyms isoliert. Der Kanamycin-Resistenz-Marker, der aus dem S. faecalis-Plasmid pJH1 stammte, wurde aus dem Plasmid pPJ1 als ein HindII-Fragment isoliert. Diese beiden Fragmente wurden ligiert, und das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli MC1000 verwendet, wobei eine Selektion auf Kanamycin-Resistenz erfolgte. Sodann wurden 2 HindIII-Stellen, die sich in der Terminatorregion des Kanamycin-Resistenz-Gens befanden, durch Ausschneiden mit HindIII, Auffüllen der klebrigen Enden mittels Klenow-Enzym, Religation und Transformation von Protoplasten von B. subtilis entfernt. Das erhaltene Plasmid (pMG21) enthielt eine einzige ClaI-Stelle, die zur Einführung der MCS von pUC18 und der Transkriptions-Terminator-Sequenz des Proteinase-Gens des Wg2-Stamms verwendet wurde. In der Tat wurden 2 Fragmente des Proteinase-Gens und der benachbarten Sequenzen kloniert: ein HindIII-HaeII- Fragment (Nukleotide 6532-6651) und ein HaeII-FnuDII-Fragment (Nukleotide 6970-7141), die die Terminatorsequenz enthielten. Diese und die folgenden Stufen bei der Vektorkonstruktion wurden mit E. coli als Wirt zum Klonieren durchgeführt. Schließlich wurde ein Teil der MCS durch ein EcoRI- SalI-Fragment aus pGKV432 ersetzt, das einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und den Beginn eines offenen Leserahmens enthielt und aus der chromosomalen DNA des Wg2-Stamms stammte. Es ist darauf hinzuweisen, daß die HindIII-Stelle in der MCS von pMG36 einzigartig ist, und zwar aufgrund der Entfernung der HindIII-Stellen in der Terminatorregion des Kanamycin-Resistenz-Gens.
- Der Expressionsvektor pMG36 wurde als Ausgangspunkt für die Konstruktion u.a. der rekombinanten Plasmide pMG36HEL, pMG37, pMG36lambdaR und pMG41 verwendet. Aus dem Plasmid pKLZ61 wurde ein EcoRI-HindIII-Fragment von 400 bp isoliert, das die für das reife Hühnereiweißlysozym kodierende Sequenz enthielt. Dieses Fragment, dessen Sequenz bekannt ist, wurde in pMG36 gebracht. Stromaufwärts vom Hühnereiweißlysozym-Gen wurde ein klebriges EcoRI-Ende in geeigneter Weise mittels des Klenow-Enzyms aufgefüllt und in die AccI-Stelle von pMG36 ligiert, die ebenfalls zuerst mittels des Klenow-Enzyms stumpf gemacht wurde. Das klebrige HindIII-Ende unmittelbar stromabwärts vom Stopcodon des Lysozymgens wurde in die einzige HindIII-Stelle von pMG36 ligiert. Das erneute Auftreten einer EcoRI- Stelle am Ort der AccI-EcoRI-Fusion ermöglichte es, zu überprüfen, ob die Konstruktion in korrekter Weise abgelaufen war. Das erhaltene Plasmid wurde als pMG36HEL bezeichnet. Dieses Plasmid pMG36HEL wurde einer Transkription und einer Translation in vitro in einem E. coli-System unterworfen, gefolgt von einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Dies führte zur Bindung einer Proteinbande von ungefähr 17 kDa, die in einer Kontrollspur auf der Basis von pMG36 fehlte (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Größe des Proteins entspricht gut der Größe des erwarteten Fusionsproteins (das erwartete Molekulargewicht des Fusionsproteins betrug 17,0 kDa; Hühnereiweißlysozym weist zum Vergleich ein Molekulargewicht von 14,3 kDa auf).
- Da festgestellt wurde, daß in L. lactis die Selektion auf Erythromycin-Resistenz wirksamer ist als die Selektion auf Kanamycin- oder Neomycin-Resistenz, wurde der größere Teil des Kanamycin-Resistenz-Gens aus pMG36HEL durch Behandlung mit EcoRV entfernt und durch ein 1 kb umfassendes Fragment aus pUC7e ersetzt, das das Erythromycin-Resistenz-Gen des S. aureus-Plasmids pE194 enthielt. Das erhaltene Plasmid pMG36eHEL wurde durch Elektroporation in den L. lactis subsp. lactis-Stamm IL1403 übertragen, wobei eine Selektion auf Erythromycin-Resistenz erfolgte. In der gleichen Weise wurde das Kanamycin-Resistenz-Gen von pMG36 durch das Erythromycin-Resistenz-Gen ersetzt, wobei man pMG36e erhielt. Dieses Plasmid wurde ebenfalls in den L. lactis subsp. lactis-Stamm IL1403 übertragen.
- Lysate von L. lactis (pMG36e) und L. lactis (pMG36eHEL) wurden in der gleichen Weise hergestellt, wie es unter (g) beschrieben ist. Der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese folgte eine Western Blot-Analyse mittels eines Kaninchen-Antiserums gegen Hühnereiweißlysozym. Die Ergebnisse (hier nicht gezeigt) zeigen das Vorhandensein eines Proteins von 17 kDa in L. lactis (pMG36eHEL), das in dem Stamm, der pMG36e enthielt, nicht auftrat. Dies ist ein starker Hinweis darauf, daß das Hühnereiweißlysozym-Fusionsgen in L. lactis subsp. lactis IL1403 exprimiert wurde.
- Lysate der beiden plasmidhaltigen L. lactis-Stämme wurden auch mit einer Suspension von Micrococcus lysodeikticus inkubiert, gefolgt von einer Abnahme von A450. Bei dieser Untersuchung wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Stämmen (der Stamm mit pMG36eHEL und der Kontrollstamm mit pMG36e) beobachtet, woraus zu schließen ist, daß das Fusionsprotein entweder inaktiv war oder in zu geringen Mengen gebildet wurde, um in diesem Experiment nachgewiesen zu werden.
- Das Fusionsgen (462 bp umfaßt eine Sequenz von 387 bp, die für reifes Lysozym kodiert, wobei ihr der 5'-Teil eines unbekannten chromosomalen Gens von L. lactis subsp. cremoris Wg2 und ein kleiner Teil der MCS vorausgehen. Um die Wahrscheinlichkeit eines Erfolges, daß die Bildung eines Milchsäurebakteriums, das ein aktives Enzym vom Lysozymtyp nutzt und das Wachstum von Buttersäurebakterium hemmt, ohne sich selbst zu töten, zu maximieren, wurden zwei Alternativen untersucht, bei denen verschiedene neue Konstrukte verwirklicht wurden. Für diese beiden Alternativen wurde jeweils ein Plasmid, das zur Absonderung des gebildeten Genprodukts aus der Zelle führt, und ein Plasmid, das nicht zu einer derartigen Absonderung führt, konstruiert.
- Ein erster Typ von Alternativen bestand in der Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, die nicht mehr zu einem Fusionsprotein führen, sondern zum reifen Hühnereiweißlysozym selbst. Aus dem Plasmid pMG36eHEL wurde das Plasmid pMG37 mittels gerichteter Mutagenese konstruiert (durch die gerichtete Mutagenese wurden die Nukleotide 181-252 in dem in Fig. 2 gezeigten Fragment entfernt). In L. lactis subsp. lactis IL1403 führte dieses Plasmid zur Bildung der reifen Form von Hühnereiweißlysozym. Dieses Protein wird intrazellulär gebildet, und es zeigt sich, daß es aktiv das Wachstum von Clostridium tyrobutyricum hemmt.
- Aus dem Plasmid pMG33 wurde das Plasmid pMG38 über pMG33e und pMG33eHEL konstruiert. Das Plasmid pMG33eHEL enthält die Lysozym-cDNA-Sequenz, der der Promotor und die Signalsequenz des Protease-Gens des Wg2- Stamms vorausgehen. Die überschüssigen Sequenzen zwischen der Signalsequenz und der für Lysozym kodierenden Sequenz wurden durch gerichtete Mutagenese analog wie bei der Konstruktion von pMG37 entfernt. In L. lactis subsp. lactis IL1403 führt das Plasmid pMG38 zur Absonderung von Lysozym, das aktiv gegen Buttersäurebakterien ist.
- Ein zweiter Typ von Alternativen bestand im Ersetzen der genetischen Information, die für Hühnereiweißlysozym kodiert, durch das R-Gen des Bakteriophagen lambda, was zur Bildung eines Proteins führt, dessen Wirkungsmechanismus im wesentlichen dem von Hühnereiweißlysozym entspricht, das jedoch eine klar unterschiedliche Struktur aufweist und wahrscheinlich eine höhere Aktivität zeigt. Das Plasmid pMG41, das aus pMG36 über pMG36lambdaR konstruiert wurde, führt zur intrazellulären Bildung eines aktiven lambda-R-Gen-Produkts. Das Plasmid pMG33, das aus pMG33 über pMG33lambdaR konstruiert wurde, führt zur Absonderung eines aktiven lambda-R-Gen-Produkts.
Claims (14)
1. Milchsäurebakterien, inbesondere der Spezies Lactococcus
lactis, die infolge einer genetischen Modifikation die
Fähigkeit erworben haben, Lysozym zu produzieren.
2. Milchsäurebakterien nach Anspruch 1, die infolge einer
genetischen Modifikation die Fähigkeit erworben haben, ein aus
Hühnereiweißlysozym und dem R-Genprodukt des Bakteriophagen
Lambda gewähltes Enzym zu produzieren.
3. Milchsäurebakterien nach Anspruch 1 oder 2, deren
Fähigkeit, Lysozym zu produzieren, plasmidkodiert ist.
4. Milchsäurebakterien nach Anspruch 3, in denen mindestens
ein Plasmid enthalten ist, das für die Fähigkeit, Lysozym zu
produzieren, verantwortlich ist, wobei dieses Plasmid
mindestens den Replikationsursprung des Lactococcus lactis
subsp.cremoris Wg2-Plasmids pMV01 und ein für ein Lysozym
kodierendes Gen unter Kontrolle von in Milchsäurebakterien
wirksamen Expressionssignalen enthält.
5. Verwendung von Milchsäurebakterien nach einem der
Ansprüche 1-4 in der Käseherstellung.
6. Rekombinantes Plasmid, enthaltend einen in
Milchsäurebakterien wirksamen Replikationsursprung und ein für
ein Lysozym kodierendes Gen unter Kontrolle von in
Milchsäurebakterien wirksamen Expressionssignalen.
7. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, enthaltend einen
in Milchsäurebakterien wirksamen Replikationsursprung und
entweder ein für Hühnereiweißlysozym kodierendes Gen oder das
R-Gen des Bakteriophagen Lambda unter Kontrolle von in
Milchsäurebakterien wirksamen Expressionssignalen.
8. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6 oder 7, das den
Replikationsursprung des Lactococcus lactis subsp.cremoris Wg2-
Plasmids pWV01 enthält.
9. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 6-8, das
die Teminatorsequenz des Proteinasegens Von Lactococcus lactis
subsp.cremoris Wg2 enthält.
10. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 6-9, das
den Promoter und die Terminatorsequenz des Proteinasegens von
Lactococcus lactis subsp.cremoris Wg2 enthält.
11. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 6-9, das
den aus chromosomaler DNS von Lactococcus lactis subsp.cremoris
Wg2 stammenden Promoter P32 enthält.
12. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 6-11, das
auch ein oder mehrere Selektionsgene enthält.
13. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 12, das ein
Kanamycinresistenzgen oder ein Erythromycinresistenzgen
enthält.
14. Rekombinanter Vektor, von dem ein rekombinantes Plasmid
nach einem der Ansprüche 6-13 abgeleitet ist durch Insertion
des für ein Lysozym kodierenden Gens, wie das für
Hühnereiweißlysozym kodierende Gen oder das R-Gen des
Bakteriophagen Lambda.
Applications Claiming Priority (1)
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| NL8803004A NL8803004A (nl) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | Genetisch gemanipuleerde melkzuurbacterien en hun gebruik in de bereiding van kaas, alsmede recombinante plasmiden. |
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