DE69013458T2 - Plasmide und Wirtszellen zur Expression von INA Protein (Ice nucleating protein). - Google Patents

Plasmide und Wirtszellen zur Expression von INA Protein (Ice nucleating protein).

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Nukleierung von Eis zum Gefrieren von Nahrungsmitteln und ähnlichen biologischen Materialien und Zusätze zur Förderung einer derartigen Nukleierung.
  • Beim Gefrieren von Nahrungsmitteln und ähnlichen biologischen Materialien ist es wichtig, die Bildung van großen Eiskristallen zu minimieren, weil dies im allgemeinen eine schädliche Wirkung auf die Struktur oder den Zustand des Materials nach dem Auftauen hat. Es wurde gefunden, daß, wenn das Gefrieren in der Gegenwart einer großen Anzahl die Eisbildung fördernder Keime erfolgt, das gesamte vorhandene Wasser in Form von kleinen Kristallen gefroren werden kann. Es gibt jedoch starke Beschränkungen bezüglich der Substanzen, die der Nahrung zugesetzt werden können, so daß Nukleierungszusätze bisher nicht in einem beträchtlichen Ausmaß verwendet wurden.
  • Kürzlich wurde vorgeschlagen, den Nahrungsmitteln Zellen von Pseudomonas syringiae zuzusetzen, die ein natives Protein tragen, das in der rage ist, Eis zu nukleieren. Dieser Organismus ist weit verbreitet und ist in vielen Fällen für das vorzeitige Gefrieren von Zuchtpflanzen wie Weinreben, Erdbeeren, Kartoffeln, Tomatenpflanzen und dgl. verantwortlich. Es wurde gefunden, daß die Zellen von P. syringiae die Eisnukleierung und die Bildung von kleinen Eiskristallen fördern können, wenn sie während des Gefrierens in den Nahrungsmitteln vorhanden sind. Außerdem beschreibt das US-Patent 4 200 228 ein Verfahren, bei dem derartige Organismen zur Schneeherstellung verwendet werden, während die internationale Patentanmeldung WO 83/03831 die Transformation von bestimmten Wirts-Mikroorganismen, konkret E. coli, mit das eisnukleierende Protein kodierender DNA beschreibt, um mikrobielle Mittel zur Hemmung der Unterkühlung herzustellen.
  • Bei P. syringiae handelt es sich um ein Mitglied der Gattung Pseudomonas. Bestimmte Arten der Gattung sind Pathogene, beispielsweise das menschliche Pathogen P. aeruginosa. Einige Stämme von P. syringiae sind bekanntermaßen auch Pathogene für bestimmte Pflanzen. Gleichermaßen sind bestimmte Stämme von E. coli wohlbekannte menschliche Pathogene. Folglich wären sie nicht zur Verwendung als Nahrungsmittelzusätze geeignet. Selbst wenn sie in Form von abgetöteten Zellen verwendet werden, besteht immer die Gefahr, daß die Abtötung nicht vollständig ist und daß die überlebenden Organismen anschließend bei der Lagerung und beim Auftauen des Nahrungsmittels wuchern, und derartige Mikroorganismen sind nicht in der Liste von Organismen enthalten, die im U. S. Code of Federal Regulations, Bd. 21, Teile 170 bis 199, April 1986, veröffentlicht vom U. S. Government Printing Office, mit GRAS (Generally Regarded as Safe) bezeichnet werden.
  • Kürzlich wurde in der internationalen Patentanmeldung WO 89/06498 ein Verfahren zum Gefrieren von festen Nahrungsmitteln und anderen biologischen Produkten mit einem nichttoxischen Mikroorganismus mit einem eisnukleierenden Phänotyp vorgeschlagen, der durch Transformation mit einem Plasmid, das ein ein Eisnukleierungs-Protein kodierendes Gen aufweist, erhalten wurde. Es wird jedoch kein Plasmid konkret erwähnt, das praktisch verwendet werden könnte, um einen nichttoxischen Mikroorganismus zu transformieren.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Isolierung des Gens, das für die Expression eines eisnukleierenden Proteins in P. syringiae und anderen Organismen verantwortlich ist, und auf dessen Verwendung in einem geeigneten Vektor zur Transformation von Organismen, die sowohl in lebender als auch in abgetöteter Form bezüglich Nahrungsmitteln als GRAS aufgelistet sind, und zwar als Zusätze zu Nahrungsmitteln oder anderen aufnehmbaren biologischen Materialien.
  • Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein pDP143 genanntes Plasmid bereitgestellt, das zur Expression eines INA- Proteins in Hefe-GRAS-Mikroorganismen verwendet werden kann.
  • Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein weiteres pDP148 genanntes Plamid bereitgestellt, das zur Expression des gleichen INA-Proteins in Laktokokken-GRAS-Mikroorganismen verwendet werden kann.
  • Die hier verwendete Bezeichnung GRAS hat die in den obigen U.S. Federal Regulations angegebene Bedeutung. Derartige Mikroorganismen umfassen Hefe, z.B. Saccaromyces cerevisiae oder carlsbergensis, Milchsäure-Bakterien, z.B. Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus etc., Essigbakterien und bestimmte filamentöse Pilze, z.B. Aspergillus-Arten.
  • Die transformierten Mikroorganismen können in Form von ganzen Zellen oder in Form von Fraktionen davon verwendet werden. Es gibt Hinweise dafür, daß ganze Zellen wirksam sind, und zwar selbst wenn das eisnukleierende Protein innerhalb der Zelle verbleibt. In einigen Fällen jedoch kann es vorteilhaft sein, die Zellen zu fragmentieren und nur Fraktionen zu verwenden, die das aktive Protein tragen, beispielsweise Zellwand-Fragmente.
  • Die Mikroorganismen werden mit einem Vektor transformiert, der für diesen Zweck geeignet ist. Im allgemeinen werden Plasmide verwendet, wenn prokaryotische Wirte wie Bakterien transformiert werden. Hefen können mit Plasmiden transformiert werden, die jedoch so konstruiert werden können, daß sie das aktive Gen in die chromosomale DNA integrieren.
  • Die das eisnukleierende Protein kodierende DNA kann aus natürlich vorkommenden Organismen wie P. syringiae, P. fluorescens, P. coronafasciens, Xanthomonas translucens oder Erwinia herbicola erhalten werden. Alternativ kann die DNA auf der Grundlage von Genen synthetisiert werden, die bereits sequenziert wurden, z.B. INAW (R. L. Green und G. J. Warren, Nature, Bd. 317, 1985, S. 645 - 648) und INAZ (G. J. Warren et al., Nucleic Acids Research, Bd. 14, Nr. 20, 1986, S. 8047 - 8060) oder die hier beschriebenen Gen- Sequenzen.
  • Das isolierte Gen kann mit geeigneten terminalen Restriktionsstellen versehen werden, die es ermöglichen, es in einen Vektor zu insertieren, der für den ins Auge gefaßten Wirt geeignet ist.
  • Wenn es sich daher bei dem ins Auge gefaßten Wirt um eine Hefe, z.B. YP42, handelt, handelt es sich bei einem geeigneten Plasmid-Vektor um pDP34 (europäisches Patent 89 810 297.5), der geeignet modifiziert wurde, z.B. das Plasmid, das den E. coli-Vektor pUC19, das komplette Hefe- 2-Mikron-Plasmid und 2 Hefe-selektierbare auxotrophe Marker aufweist, z.B. das URA3-Gen zur leichten Transformation und zur Selektion des Plasmids mit niedriger Kopienzahl in Hefe und das dLEU2-Allel des LEU2-Gens für die induzierte hohe Kopienzahl.
  • Es sei darauf hingewiesen, daß sichergestellt werden sollte, daß es sich bei dem Initiator-Codon um das erste ATG des Gens handelt, weil Hefen immer das erste gefundene ATG verwenden, um die Translation zu initiieren, und das erforderlichenfalls alle ATGs 5' vor dem "richtigen" ATG ausgeschnitten werden müssen.
  • Die Plasmide können dann verwendet werden, um einen geeigneten Hefestamm zu transformieren und auf die Gegenwart der auxotrophen Marker zu selektieren.
  • Es wurde gefunden, daß Hefestämme, die wie oben beschrieben transformiert wurden, nicht immer das eisnukleierende Protein in zugänglicher Form produzieren und daß eine Hefe- Signalsequenz eingeschlossen sollte, um das Protein zur Zell-Oberfläche zu leiten. Bei einer derartigen Sequenz kann es sich beispielsweise um die PHO5-Signal-Sequenz (B. Wajeeh et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12, Nr. 20, 1984, S. 7721-7739) oder um die alpha-Faktor-pre-pro- Leader-Sequenz (J. Kurjan und I. Herskowitz, Cell 30, 1982, S. 993 - 943) handeln. Außerdem wurde gefunden, daß bei der Verwendung der alpha-Faktor-Leader-Sequenz vorzugsweise eine Linker-Sequenz zwischen der pre-pro-Peptid-Sequenz und dem interessierenden Gen vorhanden ist, z.B. der 8-Aminosäure-Linker im nativen alpha-Faktor.
  • Es ist auch möglich, daß Eisnukleierungs-Protein zu einer spezifischen Organelle in der Zelle zu leiten, z.B. zur Vacuole. Zu diesem Zweck kann die pre-pro-Sequenz von Carboxypeptidase Y (GPY) eingeführt werden, weil dieses Protein bekanntermaßen zur Vacuole geleitet wird.
  • Bei Lactococcus lactis handelt es sich um einen besonders sicheren und für Nahrungsmittel geeigneten Mikroorganismus, z.B. der Stamm LM0230. Ein geeignetes Plasmid zur Transformation dieses Organismus ist pSC12vN, das aus dem E. coli-Vektor pUC18, dem nicht induzierbaren Erythromycin- Resistenz-Gen des Plasmids pVA838 (vgl. die folgende Literaturstelle 1) und einem L. lactis-Plasmid-Replikationsstartpunkt besteht. Dies macht Iedoch zusätzlich zu dem interessierenden Gen die Einverleibung eines Promotors erforderlich und es wurde gefunden, daß der modifizierte tacII-Promotor besonders geeignet ist. Ein direkteres Konzept zur Expression in L. lactis ist die Verwendung des Promotors eines L. lactis-Gens wie beispielsweise des Phospho-β-galactosidase-Gens des Stamms Z268 (Literaturstelle 2).
  • 1. (B. Brigitte et al., Gene 62, 1988, 249 - 261)
  • 2. (F. L. Macrina et al., Gene 19, 1982, 345 - 353)
  • Die folgenden Mikroorganismen wurden bei der National Culture of Industrial and Marine Organisms, Aberdeen, Schottland am 24. Oktober 1989 unter den unten angegebenen Zugangs-Nrn. hinterlegt. S. cerevisiae L. lactis E. coli
  • Der obige E. coli NCIMB 40217 wurde mit dem Plasmid pUC21ENA3 transformiert, auf das im folgenden Bezug genommen wird.
  • Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung:
    • Beispiel 1 Isolation von eisnukleierenden Pseudomonaden
  • In den Wäldern in der Nähe des Nestlé-Forschungszentrums Vers-chez-les-Blanc wurde von den Pflanzen eine Probe von etwa 15 g Blättern und Blüten entnommen und in einen sterilen 500 ml Schüttelkolben gegeben. Dann wurden 100 ml steriler Pepton (0,1 %)/Phosphat (50 mM, pH 7)-Puffer zugegeben und dann wurde der Kolben mit 300 UpM bei 30ºC 1 h geschüttelt. Die Flüssigkeit wurden entnommen und die Zelltrümmer und die Bakterien wurden durch Zentrifugation, 10 000 UpM, 5 min, pelletiert. Der überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 10 ml Pepton/Phosphat-Puffer resuspendiert. Davon wurden 5 Aliquots zu 0,04 ml auf Kings-Agar-Platten, die mit 40 ug/ml Cycloheximid und 0,1 % Cetrimid ergänzt waren, ausplattiert und bei Raumtemperatur 48 h inkubiert. Die Platten sind wichtig und völlig spezifisch für Pseudomonas (das Cycloheximid zerstört Pilze oder ihre keimenden Sporen und bei dem Cetrimid handelt es sich um ein biologisches Detergenz, das mit Ausnahme von Pseudomonas die meisten Bakterien abtötet).
  • Die Platten enthielten zwei Grundtypen von Kolonien. Die einen waren schmal und bildeten einen Hintergrund von individuellen Kolonien, während die anderen größeren Kolonien sich darüber schichteten (so war es unmöglich zu sagen, daß eine große Kolonie nicht mit einer kleinen kontaminiert war).
  • Zwei der Platten wurden auf die allgemeine Gegenwart der eisnukleierenden Aktivität (INA) untersucht, und zwar indem die Zellen mit 5 ml Pepton/Phosphat-Puffer von den Platten abgewaschen und mit dem Tropfen-Gefrier-Assay untersucht wurden. Dazu ist eine mit Paraffin beschichtete Aluminiumschale erforderlich (diese ist erhältlich, indem eine 1 %ige Lösung von Paraffinwachs (fest) in Xylol auf die Oberfläche des Aluminiums gewaschen und das Xylol abdampfen gelassen wird). 10 ul-Tropfen der Platten-Waschungen wurden zusammen mit Kontrollen bei -9ºC auf der Aluminiumschale angeordnet und das Gefrieren wurde beurteilt. Beide Platten-Waschungen gefroren unter diesen Bedingungen innerhalb 30 s reproduzierbar, während die Kontrollen lediglich gelegentlich gefroren, wenn überhaupt. Diese Untersuchung wurde bei der kritischeren Temperatur von -5ºC wiederholt, wobei die Platten-Waschungen wiederum rasch und reproduzierbar gefroren, während die Kontrollen bei dieser Temperatur überhaupt nicht gefroren. Dies bestätigt die Gegenwart von INA-Bakterien in diesen Isolaten.
  • Von den verbliebenen Platten wurden 300 individuelle Kolonien mit sterilen Zahnstochern auf Mikrotiter-Platten übertragen und bei Raumtemperatur 3 Tage lang gezüchtet. Dann wurden 10 ul-Tröpfchen mit einer Mehrkanal-Pipette auf eine mit Paraffin beschichtete Aluminiumschale übertragen und bei -5ºC aufbewahrt. Damit wurden 10 INA-Bakterien identifiziert, wobei ein Typ schwache Aktivität besaß. Von diesen wurden zwei, nämlich INA5 und INA7, zu reinen Kulturen gereinigt, was durch Ausplattieren der Zellen zu Einzelkolonien und durch Entnahme von 50 zufälligen Klonen und durch Untersuchung auf eisnukleierende Aktivität bei -5ºC ermittelt wurde.
    • Qualitativer Standard-Tropfen-Gefrier-Assay
  • 50 Tröpfchen mit einem Volumen von 10 ul wurden auf einer mit Paraffin beschichteten Aluminiumschale angeordnet und auf die Oberfläche eines Alkoholbads mit einer vorgewählten Temperatur gestellt. Dort befand sich die Schale 1 min lang, dann wurde die Anzahl der gefrorenen Tröpfchen bestimmt. Diese wird in Form des Prozentsatzes gefrorener Tröpfchen bei dieser Temperatur ausgedrückt. Ein Vergleich mit den mit Wasser (A), M17-Medium (B), M17-Medium plus DM0230 mit dem Plasmid pSC12vN (C) und M17-Medium plus DM0230 mit dem Plasmid pDP135 (D) erhaltenen Ergebnissen ist in Fig. 1 dargestellt, wobei der Prozentsatz der gefrorenen Tröpfchen als Ordinate gegen die Temperatur (-ºC) als Abszisse aufgetragen ist.
    • Quantitativer Standard-Tropfen-Gefrier-Assay
  • Dieser beruht auf den Berechnungen von G. Vali (J. Atmos. Sci. 28, 1971, 402 - 409) zur Quantifizierung von eisnukleierenden Substanzen. Bei einem Standard-Assay wurde 1 ml Kultur entnommen und die Zellen wurden durch 2minütige Zentrifugation pelletiert. Das Kultur-Medium wurde verworfen und die Zellen wurden in 1 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,0) resuspendiert. Von dieser Suspension wurden Verdünnungsreihen auf 10&supmin;&sup7; in TE hergestellt. 10 Tröpfchen jeder Verdünnung wurden auf eine mit Paraffin beschichtete Aluminiumschale pipettiert und dann wurde die Schale auf ein Alkohol/Wasserbad bei einer vorgewählten Temperatur unter Null gestellt. Nach 3 min wurde die Anzahl der gefrorenen Tröpfchen und ihre Stellung in der Verdünnungsreihe aufgezeichnet. Die Anzahl der Eiskeime bei dieser Temperatur wird gemäß Vali's Gleichung berechnet:
  • N(t) = ln 1/(1-f) x 10D/V
  • wobei N(t) für die Anzahl der Eiskeime bei der gegeben Temperatur steht, f für den Anteil gefrorener Tröpfchen steht, D für die Anzahl der Verdünnungen in der Reihe steht und V für das Volumen des Tröpfchens in ml steht. Dies wird dann bezüglich der Zellen-Konzentration normalisiert und schließlich in Form des Log dieser Zahl ausgedrückt. Dies ist eine quantitative Berechnung für eine eisnukleierende Substanz und basiert auf dem geordneten Gefrieren in der Verdünnungsreihe, d.h. wenn die Temperatur abfällt, gefrieren zuerst die unverdünnten Tröpfchen, gefolgt von der 10&supmin;¹ Verdünnung usw. Dies kann nicht ohne weiteres zur Quantifizierung des Gefrierens von reinem Wasser verwendet werden, bei dem es sich im wesentlichen um einen Zufallsprozeß handelt. Daher die Verwendung des qualitativen Assays für diese nicht-eisnukleierenden Lösungen.
    • Isolation von chromosomaler DNA
  • 100 ml Kings-Medium wurden mit INA5 und INA7 inokuliert und bei 30ºC über Nacht gezüchtet. Die Zellen wurden mit 10 000 UpM 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in 5 ml 50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert und dann wurden 0,5 ml einer frischen 10 mg/ml Lösung von Lysozym in 250 mM Tris, pH 8,0 zugegeben und dann wurde auf Eis 45 min inkubiert. Zu diesem wurde dann 1 ml STEP (0,5 % SDS, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,4 M EDTA und 1 mg/ml Proteinase K) gegeben und es wurde 3 h bei 60ºC inkubiert. Dieses wurde zweimal mit 7 ml 1:1 Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert und die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt. Dann wurden 15 ml Ethanol zugegeben, um die DNA auszufällen, und die Flüssigkeit wurde vorsichtig abgegossen. Die DNA wurde in 5 ml 10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml RNase durch 2 bis 3stündige Inkubation bei 60ºC gelöst (dabei handelt es sich um eine kombinierte Solubilisierung und RNase-Behandlung). Die DNA wurde erneut mit 10 ml Ethanol ausgefällt und dann wurde die DNA durch Aufspulen entfernt (die DNA-Masse wurde entfernt, indem sie gegen die Seite des Teströhrchens um einen Zahnstocher gewickelt wurde). Diese DNA wurde dann in 5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EDTA gelöst, wodurch sich eine Lösung von etwa 1 mg/ml ergab.
    • Klonierung des INA-Gens
  • Bei Oligo 17 handelt es sich um ein gemischtes Oligonukleotid, das auf einem 8-Aminosäuren-Motiv der wiederholten Sequenz beruht, die sowohl in INAZ als auch in INAW konserviert ist [aus P. syringiae (R. L. Green & G. J. Warren, Nature, Bd. 317, 1985, S. 645 - 648) bzw. P. fluorescens (G. J. Warren et al., Nucleic Acids Research, Bd. 14, Nr. 20, 1986, S. 8047 - 8060)] und nahezu 30mal in jedem Fall wiederholt ist (unten).
  • Sowohl an der INA5- als auch an der INA7-DNA wurden analytische Restriktionsverdauungen vorgenommen und die Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Diese wurden dann auf Zetaprobe-Nylon-Membran überführt und mit radioaktiv kinasiertem Oligo 17 (T. Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982) hybridisiert. Nach dem Waschen wurde der Filter bei -70ºC mit einer Verstärkerfolie 6 h autoradiographiert. Das Autoradiogramm zeigte etwas Hintergrund, nämlich nichtspezifische Hybridisierung, aber auch gute Signale. Zuerst waren sowohl INA5 als auch INA7 identisch. Die Fragmente hatten die folgenden Größen (INAZ in Klammern): SacI 7 kb (?), SacI + BglII 6 kb (3,4 kb), BglII 16 - 19 kb (sehr groß), BglII + EcoRI 5 kb (5 kb), EcoRI 9 kb (23 kb), EcoRI + Pvu 7 kb (3,75 kb), PvuI 8 kb (?), und SalI 1 kb (1 kb). Daher waren, obwohl die EcoRI + BglII- und die SalI-Fragmente die gleichen waren, die meisten der anderen Restriktionsverdauungen unterschiedlich.
  • Es wurde entschieden, daß 5 kb BglII + EcuRI-Fragment in einen pUC-Vektor zu klonieren und mit Oligo 17 zu durchmustern. 60 ug der INA5-DNA wurden mit dem Restriktions- Enzymen BglII und EcoRI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 0,7 %igen Agarose-Gel aufgetrennt. Die Gel- Fläche, welche Fragmentgrößen von 4,4 - 5,5 kb enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Dieses Gemisch wurde in das Plasmid pUC21 kloniert [ein auf pUC19 (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, 1985, S. 103 - 119) basierendes Plasmid mit einer alternativen Klonieranordnung, das mit synthetischen Oligonukleotiden erzeugt wurde, welche in mit BamHI - SacI verdautes pUC19 kloniert wurden], und zwar wie folgt (die reife Aminosäure-Sequenz des LacZ-Gens ist in der oberen Zeile angegeben, die DNA- Sequenz und ihr Komplement sind in den mittleren beiden Zeilen angegeben, die Restriktions-Enzym-Erkennungsstellen sind in der unteren Zeile angegeben, die synthetischen Oligonukleotide sind in Großbuchstaben angegeben):
    • Beispiel-Ligation
  • 0,4 pmol (1 ul) BglII - EcoRI-verdautes pUG21,
  • 1,5 pmol (3 ul) gereinigtes BglII - EcoRI-INA5-Fragment,
  • 13 ul TE-Puffer
  • wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen gut gemischt und dann 2 min bei 56ºC erhitzt.
  • Dann wurden 2 ul 10 x T4-DNA-Ligase-Puffer [660 mM Tris, pH 7,5, 50 mM MgCl, 50 mM Dithiothreitol (DTT), 10 mM
  • Adenosin-5'-triphosphat ATP), 200 ug/ml Rinderserum-Albumin (BSA)] zugegeben.
  • Dann wurde 1 ul = 1 Einheit T4-DNA-Ligase zugegeben
  • und dann wurde gut gemischt und 3 - 4 h bei 4ºC inkubiert.
    • Beispiel für kompetente E. coli-Zellen:
  • 100 ml YT-Medium (8 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefe- Extrakt, 5 g/l NaCl) wurden mit 1 ml frischer Übernachtkultur BZ234-Zellen inokuliert.
  • Dann wurde die Kultur bei 37ºC bis OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,4 inkubiert.
  • Dann wurden die Zellen in einer Zentrifuge 5 min mit 10 000 UpM pelletiert.
  • Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde bei 4ºC in einem gleichen Volumen sterilem 50 mM CaCl resuspendiert.
  • Dann wurde auf Eis 20 min inkubiert.
  • Die Zellen wurden bei 10 000 UpM 5 min pelletiert.
  • Der Überstand wurde verworfen und es wurde in 1/10-tel des ursprünglichen Volumen 50 mM CaCl, 20 % Glycerol resuspendiert.
  • Diese E. coli-Zellen sind nun kompetent und können unmittelbar verwendet werden oder sie können bei -70ºC zur zukünftigen Verwendung eingefroren werden.
    • Transformation:
  • Ein 100 ul Aliquot kompetenter Zellen wurde in ein vorgekühltes steriles Glas-Teströhrchen gegeben.
  • Die obige Ligations-Reaktion wurde dazugegeben und dann wurde gut gemischt.
  • Anschließend wurde auf Eis 20 min inkubiert.
  • Dann wurde 2 min bei 42ºC erhitzt.
  • Diese Zellen können nun direkt auf den selektiven Platten (wie im Fall der Ainpicillin-Selektion) ausplattiert werden oder es wurden 500 ul YT-Medium hinzugegeben und es wurde bei 37ºC 2 h inkubiert (wie im Fall der Kanamycin- und Erythromycin-Selektion).
  • Von diesen selektiven Transformations-Platten wurden 8 Mikrotiter-Platten an Kolonien (768) entnommen. Diese wurden auf Zetaprobe-Nylon-Filter repliziert, auf eine mit Ampicillin ergänzte YT-Agarplatte gelegt und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Die Kolonien wurden direkt auf den Filtern lysiert und mit radioaktiv kinasiertem Oligo 17 hybridisiert. Nach dem Waschen wurden die Filter 45 min lang unter Identifizierung von 10 hybridisierenden Klonen autoradiographiert. ENA = E.-coli eisnukleierende Aktivität Platte Position ENA
  • Es zeigte sich, daß alle diese Kolonien bei -5ºC gefroren, und zwar gewöhnlich innerhalb von 20 - 30 s, wohingegen die Kontrollen nach 10 min nicht gefroren. Von allen 10 Klonen wurden DNA-Präparationen im kleinen Maßstab hergestellt und die DNA wurde mit EcoRI und BlgII verdaut (den Enzymen, die zur Klonierung des Gens verwendet wurden, und die ein einzelnes 4,5 kb-Insert und den 2,7 kb-Plasmid-Vektor freisetzen sollten). ENA 4 und 10 zeigten die Gegenwart von zwei Insert-Banden und wurden daher beiseite gelassen. Die analytischen Verdauungen zeigten, daß ENA 1 und 6 Gemische von Plasmiden enthielten. Wegen dieser Ergebnisse wurde ENA3 zur weiteren Analyse ausgewählt. Das Plasmid pUC21/ENA3 ist in Fig. 2A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt; Fig. 2B zeigt eine Restriktionskarte des ENA3-Gens.
  • Als Ausgangspunkt wurde eine eingehende Restriktionskarte des Plasmids ENA3 konstruiert. Diese zeigte eine beträchtliche, wenn auch nicht perfekte Homologie zwischen dem ENA3-Insert und dem publizierten INAZ-Gen aus Pseudomonas syringiae. Die Restriktionskarte wurde für die umfassende Subklonierung des ENA3-Insertes und zur anschließende DNA- Sequenz-Analyse dieser Subklone verwendet.
  • Das vollständige BglII - EcoRI-Fragment wurde sequenziert und es enthielt 4446 bp, nämlich 12 Basenpaare weniger als das publizierte INAZ-Gen. Es gibt zwei Nebeninsertionen/Deletionen von 1 Nukleotid, und zwar beide außerhalb der Protein-kodierenden Sequenz. Dabei handelt es sich um die Insertion eines G beim bp 594 im ENA3-Gen und die Deletion eines Nukleotids bei bp 4396. Eine wichtigere Deletion tritt ungefähr bei den bp 1168 - 1179 auf, und zwar handelt es sich um die Deletion von 12 Basenpaaren, die den Protein-Leserahmen erhalten (eine Deletion von 4 Aminosäuren). Dies tritt bei einem 4x wiederholten Sequenzmotiv von "AACGCC" auf. Höchstwahrscheinlich sind diese Wiederholungen für die Deletion verantwortlich.
  • Die beiden P. syringiae-Sequenzen zeigen eine Gesamthomologie von etwa 93 % (bestimmt mit dem Bestfit-Programm von UWGCG) auf der DNA-Ebene, wobei es sich hauptsächlich um die üblichen T T C- und G T A-Änderungen handelt. Auf der Proteinebene steigt die Homologie auf etwa 98 %. Bei den Änderungen handelt es sich um die Deletion von 4 Aminosäuren und um 37 Aminosäure-Substitutionen, von denen lediglich 13 "konservativ" sind.
    • Beispiel 2 Expression von ENA3 in Hefe
  • Ein wichtiger erster Schritt zur Expression des eisnukleierenden ENA3-Gens in Hefe ist die Entfernung der beiden "ATG"s, die unmittelbar (14 bp und 8 bp) 5' vor dem richtigen "ATG" liegen. Dies ist erforderlich, weil Hefe immer das erste "ATG" nimmt, das sie nach der mRNA-Initiation findet, was in diesem Fall zu einem Peptid mit einer Länge von 4 Aminosäuren führen würde, was nur sehr wenig des eisnukleierenden Proteins ist. Eine zweite Erwägung ist die Hinzufügung einer nützlichen Restriktionsstelle, um die Hinzufügung von Hefe-Promotoren und/oder -Signalsequenzen zu erleichtern.
    • Konstruktion von ENA3-term
  • Das Plasmid ENA3 wurde mit dem Restriktions-Enzym EcoRI verdaut und der 5'-Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde anschließend mit BglII und PvuI verdaut und dann wurden die DNA-Fragmente auf einem
  • Agarpse-Gel aufgetrennt. Das 4,5 kb-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Bei dem Plasmid pUC21/LYS2- term2 (R. D. Pridmore, unveröffentlichte Ergebnisse) handelt es sich um den E. coli-Vektor pUC21, der den bidirektionalen Hefe-LYS2-Terminator (U. N. Fleig et al., Gene 46, 1986, S. 237 - 245) enthält. Dieses Plasmid wurde mit NheI verdaut und der 5'-Überhang wurde Klenow-repariert (Maniatis et al.). Dieses wurde anschließend mit PstI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 2 %igen Agarose-Gel aufgetrennt. Das 190 bp Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Diese beiden Fragmente wurden mit PstI- und BamHI-verdautem pK19 (R. D. Pridmore, Gene 56, 1987, S. 309 - 312) -Vektor gemischt und ligiert. Die Transformanten wurden zunächst auf die eisnukleierende Aktivität untersucht. Einer von diesen wurde dann durch Restriktions- Enzym-Analyse weiter charakterisiert, um das Plasmid pK19/ENA3-term zu bestätigen, das in Fig. 3A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt ist. Fig. 3B zeigt eine Restriktionskarte von ENA3-term, in der LYS2 T den bi-direktionalen Hefe-LYS2-Terminator darstellt.
  • Dieses Plasmid wurde dann mit den Restriktions-Enzymen AatII und SacI verdaut und das 5 kb-Fragment wurde Gelgereinigt und dephosphoryliert (Maniatis et. al.). Dieses Fragment wurde zur Aufnahme zukünftiger Promotor-ENA3-5'- Konstruktionen präpariert.
    • Konstruktion von pDP105:
  • Die Konstruktion von pDP105 war mit der Isolation eines DNA-Fragments verbunden, und zwar ausgehend von der TagI- Restriktionsstelle, etwa +8 bp vom "ATG" des ENA3-Gens entfernt, bis zur SphI-Restriktionsstelle, etwa +185 bp. Die DNA-Sequenz des "ATG" und des ENA3-Gens bis zur TaqI- Restriktionsstelle wurde durch synthetische Oligonukleotide ersetzt, die auch die neuen Restriktions-Enzym-Stellen EcoRI und NdeI 5' vom "ATG" hinzufügten.
  • Bei dem Plasmid EC1 handelt es sich um einen ENA3-Subklon, der ein 750 bp Sphl-Fragment enthält, das den Promotor und das "ATG" überspannt. EC1 wurde mit den Restriktions- Enzymen SphI und TaqI verdaut, die Fragmente wurden auf einem 2 %igen Agarose-Gel aufgetrennt und das 180 bp Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Dieses Fragment wurden mit den synthetischen Oligonukleotiden 124 und 125 gemischt und in den mit SphI und EcoRI verdauten pUC19- Klonier-Vektor ligiert. Die Plasmide, die das richtige Insert trugen, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert und schließlich durch DNA-Sequenz-Analyse bestätigt. Dies führt zur EcoRI- und NdeI-Restriktion 5' bzw. das "ATG" überlappend.
  • DNA-Sequenz um das "ATG" des ENA3-Gens, welche die TaqI- Restriktionsstelle zeigt:
  • DNA-Sequenz der als Linker verwendeten Oligonukleotide:
    • Hinzufügung des GAPDH-Promotors
  • Zwei GAPDH-Promotor-Konstruktionen wurden hergestellt und untersucht. Das 2 kb-HindIII-Fragment, welches das vollständige GAPDH-Gen enthielt, (J. P. Holland & M. J. Holland, The Journal of Biological Chemistry, Bd. 258, Nr. 19, 1979, S. 9839 - 9845) wurde von Ciba Geigy bezogen. Das Gen wurde mit HindIII ausgeschnitten und in den E. coli- Vektor pK19 übertragen. Zur Verkürzung des Promotors wurden zwei Deletionen konstruiert, indem das Plasmid mit SmaI (das innerhalb der pK19-Linker-Anordnung schneidet) und entweder SnaBI (bp 424) oder SspI (bp 646) verdaut wurde, wobei alle Enzyme verträgliche stumpfe Enden ergaben, und zwar alle selbst-religiert. Dadurch ergaben sich für die Plasmide pK19/GAPDH-dSna und pK19/GAPDH-dSsp GAPDH-Promotorlängen von 600 bp bzw. 400 bp.
  • Die dSna- und dSsp-Promotoren wurden wie folgt isoliert. Die Plasmide wurden mit dem Restriktion-Enzym AsuII verdaut und der 5'-Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit SacI verdaut und die Produkte wurden auf einem 1 %igen Agarose-Gel aufgetrennt. DNA-Banden mit der richtigen Größe wurden ausgeschnitten und die DNA wurde aus dem Gel-Fragment elektroeluiert.
  • Das pDP105-Plasmid wurde mit dem Restriktion-Enzym EcoRI verdaut und der 5'-Überhang wurde mit Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit SphI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 2 %igen Agarose-Gel aufgetrennt. Das richtige 200 bp-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert.
  • Das pDP105-ENA3-5'-DNA-Fragment wurde parallel in die beiden Promotoren des E. coli-Vektors puC19 ligiert, der mit SacI und SphI verdaut worden war. Dies ergab die Plasmide pDP106 (dSsp) und pD107 (dSna).
  • Die Plasmide pDP106 und pDP107 wurden mit den Restriktions- Enzymen SphI und SacI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Die 550 bp- und 750 bp- Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid ENA3 wurde mit den Restriktions- Enzymen AatII und SphI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 1,3 kb-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Dieses ENA3- 5'-1,3 kb-AatII-SphI-Fragment wurde mit den isolierten pDP106- und -107-Fragmenten separat gemischt und mit dem zuvor präparierten pK19/ENA3-term-AatII-SacI-5 kb-Fragment und ligiert. Daraus wurden die Plasmide pDP108 bzw. pDP109 identifiziert.
    • GAPDH/CAT-Promotoren
  • Es wurde eine zweite Linie von Promotoren konstruiert, die auch einen E. coli-Promotor zwischen dem Hefe-GAPDH-Promotor und dem ENA3-Gen trugen. Dies wurde vorgenommen, um die Durchmusterung der Konstruktionen auf Aktivität vor deren Transformation in Hefe zu erleichtern. Bei dem gewählten E. coli-Promotor handelte es sich um den des Chloramphenicol- Resistenzgens Tn9 (N. K. Alton & D. Vapnek, Nature 282, 1979, S. 864 - 869). Um die Einverleibung unerwunschter E. coli-Sequenzen in die Konstruktion zu vermeiden, wurde der Promotor synthetisiert und als Linker zwischen dem GAPDH- Promotor und dem ENA3-Gen verwendet, nämlich wie folgt:
  • Die Großbuchstaben bezeichnen das, was synthetisiert wurde, wobei es sich bei dem oberen Strang um Oligo 141 und bei dem unteren um Oligo 142 handelt. Diese Oligonukleotide wurden wie üblich gereinigt und dann getrocknet und zu einer Konzentration von 300 pmol/ul wieder aufgelöst. 300 pmol jedes Oligonukleotids wurden in ein Volumen von 10 ul Hybridisierungs-Puffer (150 mM NaCl, 100 mM Tris, pH 8,0 und 1 mM EDTA) gemischt. Dieses wurde dann 5 min auf 95ºC erhitzt und dann über Nacht bei 55ºC inkubiert, um die beiden komplementären Oligonukleotide zu hybridisieren.
  • Die folgenden DNA-Fragmente wurden auch isoliert. Die Plasmide pK19/GAPDH-dSsp und -dSna wurden mit den Restriktions-Enzymen AsuII und SacI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Die 400 bp- und 600 bp-Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid pDP108 wurde mit den Restriktions-Enzymen EcoRI und AatII verdaut und das 1,5 kb-DNA-Fragment wurde aus dem Gel isoliert. Dieses 1,5 kb-pDP108-Fragment wurde individuell mit den beiden AsuII - SacI-GAPDH-Fragmenten, dem gereinigten pK19/ENA3- term-5 kb-SacI-AatII-Fragment und dem Asull-EcoRI-Linker (CAT-Promotor) gemischt und ligiert. Die Transformanten wurden sowohl durch Restriktionsanalyse von DNA-Präparationen im kleinen Maßstab als auch durch die Eisnukleierungs-Aktivität und durch DNA-Sequenzierung überprüft. Diese korrespondierten genau und es ergaben sich die Plasmide pDP110 (dSsp) und pDPIII (dSna).
    • Übertragung in das Hefe-Expressionsplasmid
  • Das Hefe-Expressionsplasmid, das zum Untersuchen dieser Konstruktionen verwendet wurde, wurde von der Biotechnologie-Abteilung der Ciba-Geigy zur Verfügung gestellt. Dabei handelte es sich um das Plasmid pDP34-Xho (pDP34, vgl. europäische Patentanmeldung 89 810 297.5. Bei der Xho- Modifikation handelt es sich um mit SacI und BamHI verdautes pDP34, wobei die zur Herstellung von pUC21 verwendeten Oligonukleotide zugegeben werden, vgl. Seite 9), das aus dem E. coli-Vektor puC19, dem kompletten Hefe-2-Micron- Plasmid und zwei Hefe-selektierbaren auxotrophen Markern besteht. Bei dem ersten handelt es sich um das URA3-Gen zur leichten Transformation und zur Selektion des Plasmids in Hefe mit niedriger Kopienzahl und bei dem zweiten handelt es sich um das dLEU2-Allel des LEU2-Gens für die induzierte hohe Kopienzahl.
  • Das Plasmid pDP34-Xho wurde mit den Restriktions-Enzymen SacI und MluI verdaut. Die Plasmide pDP108, 109, 110 und 111 wurden ebenfalls mit den Restriktions-Enzymen SacI und MluI verdaut. Das pDP34-Plasmid wurde individuell mit den vier Plasmid-Verdauungen ligiert und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden auf Ampicillin-Platten zur Selektion des pDP34-Plasmids selektiert. Durch Restriktionsanalyse wurden die Plasmide pDP112 (das die ENA3- Konstruktion von pDP108 enthält), pDP113 (109), pDP114 (110) und pDP115 (111) identifiziert. Die Plasmide pDP114, pDP115 und pDP34Xho sind in den Fig. 4A, 5A bzw. 6 der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt. Die Restriktionskarten von ENA-110 (aus pDP110) und ENA-111 (aus pDP111) sind in den Fig. 4B und 5B dargestellt, wobei P den Promotor darstellt und T den Terminator darstellt.
    • Hefe-Transformation
  • Hefe-Zellen wurden aus einer Übernachtkultur in YPD-Medium (1 % Bacto-Hefe-Extrakt, 2 % Bacto-Pepton, 2 % Dextrose) inokuliert und über Nacht bei 30ºC gezüchtet.
  • Die Kultur wurde bei etwa OD&sub6;&sub0;&sub0; = 2,0 entnommen.
  • 50 ml Zellen-Suspension wurden 5 min bei 3000 UpM pelletiert.
  • Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 50 ml TE-Puffer gewaschen.
  • Die Zellen wurden in 20 ml 1 M Lithiumacetat (in TE) resuspendiert.
  • Dann wurde bei 30ºC 90 min lang unter mildern Schütteln inkubiert.
  • Anschließend wurden die Zellen 5 min mit 3000 UpM pelletiert.
  • Der Überstand wurde verworfen und dann wurde in 1 ml 1 M LiOAc resuspendiert.
  • 200 ul-Aliquots kompetenter Zellen plus 1 ug DNA wurden bei 30ºC 10 min inkubiert.
  • Dann wurde 1 ml 50 %ige PEG-Lösung (in TE) zugegeben.
  • Dann wurde gemischt und 60 min bei 30ºC inkubiert.
  • Dann wurde ein Hitzeschock, 5 min, 42ºC, angewendet.
  • Anschließend wurden die Zellen in der Mikrozentrifuge 5 s lang pelletiert.
  • Der Überstand wurde verworfen.
  • Die Zellen wurden in 300 ul 800 mM Sorbitol resuspendiert und auf selektiven Platten ausplattiert.
    • Expression des ENA3-Gens in Hefe
  • Die Plasmide pDP112, pDP113, pDP114 und pDP115 wurden wie oben beschrieben in den Hefe-Stamm YP42 (Genotyp: α, ura3-52, his4-580, leu2) transformiert. Die Transformanten wurden auf SD (0,67 % Bacto-Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 2 % Dextrose)-Minimal-Agar-Platten, die mit Histidin (20 mg/l) und Leucin (30 mg/l) ergänzt worden waren, bei 30ºC selektiert. Die transformierten Kolonien wurden auf den gleichen selektiven Platten zweimal zu einzelnen Kolonien ausgestrichen, um die Transformanten zu reinigen. Kolonien von jeder Plasmid-Konstruktion wurden verwendet, um Kulturen in YPD-Medium zu inokulieren, die unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet wurden. Diese wurden bis zur frühen log-Phase, OD&sub6;&sub0;&sub0; ungefähr 1,0, gezüchtet, und die Zellen wurden pelletiert etc. Die Eisnukleierungs-Spektren von YP42 plus die Plasmide pDP114 und pDP115 sind in den Fig. 7 und 8 der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt. Diese Fig. zeigen log (Eiskeime/Zelle) als Ordinate gegen die Unterkühlung (-ºC) als Abszisse für YPD- Medium (º) graphisch dargestellt.
  • YP42 plus die Plasmide pDP114 und pDP115 wurde auch in SD2- Medium (0,67 % Bacto-Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 0,5 % Casaminosäuren, 2 % Dextrose und 50 mM Natriumcitrat, pH 6,0) bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Die entsprechenden Gefrierspektren für SD2-Medium sind in den Fig. 7 und 8 der beigefügten Zeichnungen angegeben ( )
    • Konstruktion von DDP140
  • Das Plasmid pDP133 wird später beschrieben. Dieses Plasmid wurde mit den Restriktions-Enzymen MluI und SacI verdaut, mit MluI- und SacI-verdautem pDP34Xho gemischt und ligiert. Dieses wurde in kompetente E. coli-Zellen transformiert und die Transformanten wurden auf YT-Platten selektiert, die mit Ampicillin ergänzt worden war. Die Kolonien wurden durch Gefrieren und durch Restriktions-Enzym-Analyse unter Erhalt des Plasmids pDP140 durchmustert, das in Fig. 9A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt ist. Fig. 9B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-133 (aus pDP133), wobei P den Promotor darstellt und T den Terminator darstellt.
  • pDP140 wurde wie oben beschrieben in YP42 transformiert. Die Kolonien wurden in SD2-Medium bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. Das Gefrierspektrum von YP42 plus dem Plasmid pDP140 ist in Fig. 10 der beigefügten Zeichnungen gezeigt, in der log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • UBI4-Promotor-Präparation und Hinzufügung
  • Bei dem Ausgangsmaterial handelte es sich um Ciba Geigy's P1amid KS+/UB14, das aus dem genomischen 6 kb-SacI-Fragment des Hefe-Wildtyp-Stamms S288C, welches das UB14-Gen (E. Ozkaynak et al., The EMBO Journal, Bd. 6, Nr. 5, 1987, 1429-1439) enthält, in die SacI-Stelle des Bluescript- Plasmids KS+ (Stratagene Cloning Systems, USA) kloniert, bestand. Das Plasmid KS+/UB14 wurde mit den Restriktions- Enzymen HindIII und BglII verdaut, die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und die 1 kb-Bande wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid Bluescript SK+ (Stratagene Cloning Systems, USA) wurde mit den Restriktions-Enzymen HindIII und BglII verdaut. Die beiden DNA-Fragmente wurden zusammengemischt, ligiert und in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Die Transformanten wurden auf YT-Platten, die mit Ampicillin ergänzt worden waren, selektiert, durch Restriktions-Enzym-Verdauungen analysiert und das Plasmid BA1 wurde identifiziert. Der das Plasmid BA1 enthaltende E. coli-Stamm wurde dann mit dem Helferphagen M13/K07 gemäß den Stratagene-Anweisungen infiziert und die einzelsträngige Form von BA1 wurde aus dem Überstand gewonnen. Dieser wurde zur weiteren Verwendung gereinigt.
  • Der UB14-Promotor wurde durch Oligonukleotid-dirigierte ortsspezifische Mutagenese modifiziert, um eine EcoRV- Restriktionsstelle direkt vor dem "ATG" des UB14-Gens einzuführen, nämlich wie folgt:
  • wobei es sich bei der oberen Sequenz um das genomische UB14-Gen um das "ATG" herum (mit Großbuchstaben bezeichnet) handelt und bei der unteren Sequenz (in Großbuchstaben) um das zur Mutagenese verwendete Oligo 166 (wobei die neue EcoRV-Restriktionsstelle darunter angegeben ist). Die Mutagenese wurde mit dem "Oligonukleotid-dirigierten in vitro Mutagenese-System, Version 2" (Amersham, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Transformanten wurden auf YT-Platten, die mit Ampicillin ergänzt worden waren, selektiert, mit dem Restriktions-Enzym EcoRV analysiert und das Plasmid SK+/UB14-EcoRV wurde identifiziert.
  • Das Plasmid pDP108 wurde mit dem Restriktions-Enzym NdeI verdaut und der Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit dem Restriktions-Enzym AatII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 1,5 kb-DNA-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Der Plasmid-Vektor pGEM7 (Promega, USA) wurden mit den Restriktions-Enzymen HindIII und AatII verdaut. Der pGEM7-Vektor, der UBI4-Promotor und das pDP108-5'-ENA3-DNA-Fragment wurden gemischt und ligiert. Diese Ligation wurden in kompetente E. coli-Zellen transformiert und auf YT-Platten, die mit Ampicillin ergänzt worden waren, ausplattiert. Die Transformanten wurden analysiert und das Plasmid BF1 wurde identifiziert.
  • Das Plasmid BF1 wurde mit den Restriktions-Enzymen SacI und AatII verdaut, die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und das 2 kb-Fragment wurde elektroeluiert. Dieses wurde mit dem oben beschriebenen gereinigten und dephosphorylierten 5 kb-SacI-AatII-pK19/ENA3-term-Fragment gemischt, ligiert und in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Die Transformanten wurden auf YT-Platten das mit Kanamycin ergänzt worden war, selektiert und durch Restriktions-Enzym-Verdauungen, Gefrieren und DNA-Sequenzierung unter Erhalt von Plasmid pDP118 analysiert. Das ENA3-Insert von pDP118 wurde dann in den Hefe-Expressions-Vektor pDP34 unter Erhalt des Plasmids pDP120 übertragen. Das Plasmid pDP120 ist in Fig. 11A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt. Fig. 11B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-118 (aus pDP118), wobei P bzw. T den Promotor und den Terminator darstellen. pDP120 wurde wie oben beschrieben in YP42 transformiert. Die Kolonien wurden in SD2-Medium bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. Das Gefrierspektrum von YP42 plus pDP120 ist in Fig. 12 der beigefügten Zeichnungen gezeigt, in der log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • Zielorientierung des ENA3-Gens in Hefe
  • Um die Zielorientierung des eisnukleierenden Proteins und möglicherweise seine phänotypische Expression zu verbessern, wurden Konstruktionen hergestellt, bei denen native Hefe-Signal-Sequenzen an den Amino-Terminus des ENA3-Proteins fusioniert waren. Zwei wurden ausgewählt, namlich die PHO5-Signal-Sequenz (B. Wajeeh et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12, Nr. 20, 1984, S. 7721 - 7739) und die alpha-Faktor-pre-pro-Leader-Sequenz (J. Kurjan & I. Herskowitz, Cell 30, 1982, S. 933 - 943).
    • PHO5-Signal-Sequenz
  • Die PHO5-Signal-Sequenz wurde erhalten, indem zwei komplementäre Oligonukleotide synthetisiert wurden, die als Linker wirken, während sie die benötigen Aminosäure-Sequenzen wie folgt enthalten (die synthetischen Oligonukleotide sind in Großbuchstaben angegeben):
  • Bei dem oberen Oligonukleotid handelt es sich um Oligo 174 (59 mer) und bei dem unteren um Oligo 175 (57 mer). Diese beiden Oligonukleotide wurden in ungefähr äquimolaren Mengen zusammengemischt und in einer Hochsalz-Lösung hybridisiert. Diese hybridisierten Oligonukleotide wurden mit den folgenden gereinigten Fragmenten gemischt, nämlich dem oben beschriebenen mit SacI und AatII verdauten, Gel-gereinigten und dephosphorylierten 5 kb-pK19/ENA3-term-Fragment, dem mit SacI und EcoRI verdauten und Gel-gereinigten 700 bp-Fragment von pDP111 und dem mit NdeI und AatII verdauten und Gel-gereinigten 1,45 kb-Fragment von pDP111. Dieses wurde ligiert und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden zuerst durch ihre Aktivität in E. coli und zweitens durch Restriktions-Enzym-Analyse unter Erhalt der Plasmide pDP117 und in pDP34 Plasmid pDP120 selektiert. Die DNA-Sequenz-Analyse zeigte, daß ein Teil der PHO5-Signal- Sequenz verdoppelt war. Die 8 mit * markierten Aminosäuren (vgl. oben) sind verdoppelt und ergeben die folgende Signal-Sequenz: Signal-Spaltungsstelle
  • Das Plasmid pDP121 ist in Fig. 13A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt. Fig. 13B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-117 (aus pDP117), wobei P, SS bzw. T den Promotor, die Signal-Sequenz und den Terminator darstellen.
  • Das Plasmid pDP121 wurde in den Hefe-Stamm YP42 transformiert und die Kolonien wurden auf SD + HIS + LEU-Platten selektiert. Kulturen der Transformanten wurden in SD2- Medium gezüchtet und auf eisnukleierende Aktivität untersucht. Das Gefrierspektrum von YP42 plus pDP121 ist in Fig. 14 der beigefügten Zeichnung dargestellt, wobei log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • Alpha-Faktor-Leader
  • Bei dem Ausgangsmaterial für den pre-pro-alpha-Faktor- Leader handelte es sich um Ciba Geigy's pUC/PHO5-alpha- Faktor-Leader-Plasmid. Dieses wurde so modifiziert, daß es eine EcoRI-Restriktionsstelle und 8 bp des PHO5-Promotors, gefolgt von dem "ATG" und dem alpha-Faktor-Leader enthält.
  • Die pre-pro-Spalt-Region wurden ebenfalls modifiziert, und zwar durch den Einschluß einer BglII-Restriktionsstelle an der KEX2-Spaltstelle und einer PvuII-Restriktionsstelle 6 bp davor (eine Chiron Corp. Modifikation).
  • Das Plasmid pUC/PHO5-alpha-Faktor-Leader wurde mit den Restriktions-Enzymen EcoRI und HindIII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 300 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid pDP111 wurde mit den Restriktions-Enzymen EcoRI und SacI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 650 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Diese beiden Bestandteile des alpha-Faktor-Leaders bzw. des GAPDH-dSna-CAT-Promotors wurden mit pUC19 zusammengemischt, mit den Restriktions- Enzymen SacI und HindIII verdaut, ligiert und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden analysiert und das Plasmid pUC/GAPDH-dSna-CAT-alpha-Faktor-Leader wurde identifiziert
  • Das Plasmid pUC/GAPDH-dSna-CAT-alpha-Faktor-Leader wurde mit dem Restriktions-Enzym BglII verdaut und der 5'-Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit dem Restriktions-Enzym SacI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 940 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid pDP111 wurde mit dem Restriktions-Enzym NdeI verdaut und der 5'-Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit dem Restriktions-Enzym AatII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose- Gel aufgetrennt. Das 1400 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Diese beiden gereinigten Fragmente wurden mit dem mit SacI und AatII verdauten, Gel-gereinigten und dephosphorylierten 5 kb-pK19/ENA3-term-Fragment gemischt, ligiert und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden zuerst auf eisnukleierende Aktivität durchmustert und dann durch Restriktions-Enzym-Analyse und schließlich durch DNA-Sequenz-Analyse, und zwar unter Identifizierung des Plasmids pDP126. Das Insert wurde dann zur Untersuchung in Hefe in pDP34 überführt, wodurch sich das Plasmid pDP129 ergab, das in Fig. 15A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt ist. Fig. 15 B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-126 (aus pDP126), wobei P, T und L den Promotor, Terminator bzw. Leader darstellen. Das Plasmid pDP129 wurde wie oben beschrieben in den Hefe-Stamm YP42 transformiert. Die Transformanten wurden verwendet, um Kulturen von SD2-Medium zu inokulieren, und diese wurden bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Das Gefrierspektrum von YP42 plus Plasmid pDP129 ist in Fig. 16 der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt, wobei log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • Alpha-Faktor-Leader plus Linker
  • Neuere Informationen bezüglich der Verwendung des alpha- Faktor-Leaders zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in Hefe besagen, daß ein zusätzliches Erfordernis notwendig ist. Im nativen alpha-Faktor folgt auf das pre-pro-Peptid ein Linker mit 8 Aminosäuren und dann das alpha-Faktor- Peptid. Die Linker-alpha-Faktor-Anordnung wird in dem Gen 5fach wiederholt und die Linker werden während der Prozessierung des alpha-Faktors entfernt. Die Informationen besagen, daß der Linker nach dem pre-pro-Leader und vor dem interessierenden Gen zugegebenen werden sollte. Dieses wurde mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden als Linkern zur Insertion der benötigten Aminosäuren vorgenommen.
  • Das Plasmid pUC/GAPDH-dSna-CAT-alpha-Faktor-Leader wurde mit den Restriktions-Enzymen SacI und BglII verdaut und die Fragmente wurde auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 940 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid pDP111 wurde mit den Restriktions-Enzymen NdeI und AatII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 1400 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Die beiden gereinigten Fragmente wurden mit den beiden hybridisierten Oligonukleotiden 208 und 209 und dem oben beschriebenen pK19/ENA3-term-SacI - AatII-Fragment gemischt, ligiert und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden durch Restriktions-Enzym- Verdauungen und DNA-Sequenz-Analyse unter Identifizierung von Plasmid pDP127, das ebenfalls eisnukleierende Aktivität zeigte, durchmustert. Das Insert wurde in das Hefe-Expressionsplasmid pDP34 übertragen, und zwar unter Erhalt von Plasmid pDP130, das in Fig. 17A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt ist. Fig. 17B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-127 (aus pDP127), wobei P, T bzw. L den Promotor, Terminator und Leader + Linker darstellen. Das Plasmid pDP130 wurde wie oben beschrieben in YP42 transformiert. Die Transformanten wurden zum Inokulieren von Kulturen von SD2-Medium verwendet und bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Das Gefrierspektrum von YP42 plus Plamid pDP130 ist in Fig. 18 der beigefügten Zeichnungen dargestellt, wobei log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • Zielorientierung auf die Vacuole
  • In den oben beschriebenen Fällen wird lediglich eine native Hefe-Signal-Sequenz an das ENA3-Protein angefügt und dies kann die Zielorientierung des Proteins auf die Membranen, wahrscheinlich über das endoplasmatische Retikulum, unterstützen oder auch nicht. Wenn ein Protein in das endoplasmatische Retikulum eingetreten ist, besteht der Standard- Stoffwechselweg in der Sekretion aus der Zelle, oder in diesem Fall möglicherweise in der Insertion in die äußere Membran. Hier wird das ENA3-Protein auf eine spezifische Organelle innerhalb der Zelle ausgerichtet, nämlich auf die Vacuole.
  • Das Protein Carboxypeptidase Y (CPY) wird zur Vacuole geleitet (L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, S. 887 - 897), und zwar in einer pre-pro-Form, die in der Vacuole durch Proteinase B (das PEP4-Gen-Produkt) prozessiert wird. Es wurde auch gezeigt, daß die für die Zielorientierung benötigten Sequenzen innerhalb der pre-pro-Leader-Sequenz lokalisiert sind. Diese wurde daher vor dem ENA3-Protein insertiert.
  • Bei dem Ausgangsmaterial handelte es sich um Ciba Geigy's pBR322/PHO5-pre-pro-CPY-Plasmid. Als spezifische Linker zwischen dem GAPDH/CAT-Promotor und der natürlichen StuI- Restriktionsstelle ungefähr 35 bp im CPY-pre-Peptid werden synthetische Oligonukleotide benötigt:
  • Die synthetisierten Oligonukleotide sind in Großbuchstaben gezeigt, und zwar handelt es sich dabei um Oligo 206 (oben) und Oligo 207 (unten). Das Plasmid pBR322/PHO5-pre-pro-CPY wurde mit den Restriktions-Enzymen HindIII und StuI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 800 bp-Fragment wurde ausgeschnitten, elektroeluiert und mit den hybridisierten Oligos 206 und 207 und dem mit EcoRI und HindIII verdauten pUC19-Plasmid gemischt und zusammenligiert. Dieses wurde in E. coli transformiert und die Transformanten wurden durch Restriktions-Enzym-Analyse unter Erhalt von Plasmid pUC19/CPY(p-p) durchmustert. Das Plasmid pUC19/CPY(p-p) wurde mit den Restriktions-Enzymen EcoRI und HincII verdaut, die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und das 340 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Dieses Fragment wurde mit mit EcoRI und HincII verdauten pUC18 gemischt, ligiert und in kompetente E. coli transformiert. Die Kolonien wurden durchmustert und das Plasmid pUC18/pre-pro-CPY wurde identifiziert.
  • Das Plasmid pUC18/pre-pro-CPY wurde mit den Restriktions- Enzymen EcoRI und HindIII verdaut und die Produkte wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 350 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Zu diesem wurde der Gel-gereinigte 680 bp SacI-EcoRI-GAPDHdSna/CAT-Promotor aus dem Plasmid pDP110 und mit Sacl plus HindIII verdautes pUC19 gegeben, dann wurde ligiert und in kompetente E. coli transformiert. Die Kolonien wurden durchmustert und das Plasmid pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY wurde identifiziert. Das Plasmid pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY wurde mit dem Restriktions-Enzym SalI verdaut und der Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit SacI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 750 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Das Plasmid pDP108 wurde mit dem Restriktions-Enzym NdeI verdaut und der Überhang wurde mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses wurde dann mit AatII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose- Gel aufgetrennt. Das 1500 bp-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Diese beiden isolierten Fragmente wurden dann mit dem oben beschriebenen mit SacI und AatII verdauten, Gel-gereinigten und dephosphorylierten 5 kb- pK19/ENA3-term-Fragment gemischt, ligiert und in kompetente E. coli transformiert. Die Kolonien wurden durch Restriktions-Enzym-Analyse und durch Gefrieren durchmustert, und in beiden Fällen wurden die gleichen Plasmide, nämlich pDP136, identifiziert. Das Insert von Plasmid pDP136 wurde in das Hefe-Expressions-Plasmid pDP34 übertragen, und zwar unter Erhalt von Plasmid pDP143, das in Fig. 19A der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist. Fig. 19B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-136 (aus pDP136), wobei P bzw. T den Promotor und den Terminator darstellen.
  • Das Plasmid pDP143 wurden wie oben beschrieben in YP42 transformiert. Die Transformanten wurden verwendet, um Kulturen von SD2-Medium in inokulieren und wurden bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Das Gefrierspektrum von YP42 plus Plasmid pDP143 ist in Fig. 20 der beigefügten Zeichnungen dargestellt, in der log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • Beispiel 4 Expression in Lactococcus lactis
  • Die Expression des ENA3-Gens mit seinem nativen Pseudomonas-Promotor wurde ohne Erfolg versucht (Daten nicht gezeigt, obwohl die wichtigen -35- und -10-Regionen sehr ähnlich zum Lactococcus lactis-Phospho-β-galactosidase- Promotor sind (B. Boizet et al., Gene 62, 1988, 249 - 261) (nicht gezeigt). Was aber wichtig sein kann, ist die Gegenwart eines möglichen mRNA-Leaders mit 60 - 65 Basenpaaren direkt vor dem initiierenden "ATG". Dieses wurde untersucht, indem ein Hybrid-Promotor mit den -35- und -10- Sequenzen des ENA3-Promotors und dem potentiellen Leader des Phospho-β-galactosidase-Promotors konstruiert wurde. Dies wurde unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden durchgeführt, die im folgenden angegeben sind:
  • Bei den Basenpaaren 1 bis 45 handelt es sich um den modifizierten ENA3-Promotor. Die Basenpaare 46 bis 115 stellen die entsprechende Sequenz des Phospho-β-galactosidase-Gens dar. Von den Basenpaaren 146 bis 120 folgt die Erkennungsstelle für das Restriktions-Enzym NdeI, einschließlich des "ATG"s für das ENA3-Gen. Die synthetischen Oligonukleotide sind in Großbuchstaben gezeigt.
  • Die Oligonukleotide wurden kinasiert und wie beschrieben aneinander hybridisiert. Das Plasmid pDP108 wurde mt den Restriktions-Enzymen NdeI und AatII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 1,5 kb- Fragment, das das 5'-Ende des ENA3-Gens enthielt, wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit den obigen synthetischen Oligonukleotiden, dem oben beschriebenen SacI - AsuII-600 bp-Hefe-Promotor- Fragment von pK19/GAPDH-dSna und dem gereinigten und mit Phosphatase behandelten 5 kb-SacI - AatII-Fragrnent von pK19/ENA3-term gemischt und ligiert. Diese Ligation wurden in kompetente E. coli-Zellen transformiert und auf YT- Platten, die mit Kanamycin ergänzt worden waren, ausplattiert. Die Transformanten wurden durch Restriktions- Enzym-Verdauungen, die Eisnukleierungs-Aktivität und DNA- Sequenzierung unter Erhalt des Plasmids pDP133 durchmustert.
  • Das Plasmid pDP133 wurde mit den Restriktions-Enzymen AsuII und XbaI verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und das 3,5 kb-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Bei dem Plasmid pSC12vN handelt es sich um eine Ciba Geigy-Konstruktion, die aus dem E. coli-Vektor pUC18, dem nicht-induzierbaren Erythromycin-Resistenz-Gen des Plasmids pVA838 (F. L. Macrina et al., Gene 19, 1982, 345 - 353) und einem Lactococcus lactis-Plasmid-Replikationsstartpunkt, der in ihren Laboratorien isoliert wurde, besteht. pSC12vN wurde mit den Restriktions-Enzymen ClaI und XbaI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die Religation dieses Vektors auszuschließen. Das INAZ-βGAL-ENA3-DNA-Fragment und das ClaI - XbaI-verdaute pSC12vN wurden zusammengemischt und ligiert. Dieses wurde in E. coli transformiert und die Kolonien wurden durch Restriktions-Enzym-Analyse und auf eisnukleierende Aktivität durchmustert. So wurde das Plasmid pDP135 identifiziert. Die Plasmide pSC12vN und pDP135 sind in den Fig. 21 und 22A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt, in denen L. lactis º den L. Lactis-Plasmid-Replikationsstartpunkt darstellt. Fig. 22B zeigt die Restriktionkarte von ENA-133 (aus pDP133), wobei P bzw. T den Promotor und den Terminator darstellen.
    • Transformation des Lactococcus lactis-Stammes LM0230
  • Eine Übernachtkultur von L. lactis LM0230 in M17G (M17- Medium plus 0,5 % Glucose) wurde für ein 1 % Inokulum in frisches M17G-Medium verwendet. Dieses wurde bei 30ºC bis zu einer optischen Dichte (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von ungefähr 0,4 gezüchtet und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation mit 10 000 UpM 5 min lang pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in einem gleichen Volumen PS- Puffer (7 mM Na-Phosphat, pH 6,6, 0,5 Molar Sucrose) bei 4ºC resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum pelletiert und schließlich in 1/100 Volumen PS-Puffer resuspendiert und bis zur Verwendung auf Eis gelagert (kompetente Zellen). Die Transformation wurde unter Verwendung eines Biorad Gene Pulser in Verbindung mit der Puls-Steuerung und den Gene Pulser-Küvetten mit einem Elektrodenabstand von 0,2 cm durchgeführt. 100 ul der kompetenten Zellen wurden mit einem Volumen von 1 - 4 ul DNA in entweder Wasser oder TE-Puffer gemischt und dann auf den Boden der vorgekühlten Küvette pipertiert. Die Probe wurde bei 2000 Volt mit 400 Ohm Widerstand gepulst. Die Probe wurde dann aus der Küvette in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und auf Eis gestellt. Schließlich wurden die Zellen 1 min mit einer Mikrozentrifuge pelletiert, in 300 ul M17G- Medium resuspendiert und 1 h bei 30ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann auf M17G-Platten, die mit 4 ug/ml Erythromycin ergänzt worden waren, ausplattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert.
  • Das Plasmid pDP135 wurde wie oben beschrieben in den L. lactis-Stamm LM0230 transformiert. Die Transformanten wurden verwendet, um Kulturen von M17G-Medium, das mit 4 ug/ml Erythromycin ergänzt worden war, zu inokulieren und dann wurde bei 20ºC unter Schütteln bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 1,0 inkubiert. Diese Kulturen wurden wie oben beschrieben untersucht und die Ergebnisse wurden graphisch dargestellt. Das Gefrierspektrum von LM0230 plus Plasmid pDP135 ist in Fig. 23 der beigefügten Zeichnungen dargestellt, wobei log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.
    • P-β-Gal-Promotor
  • Ein weiteres, direkteres Konzept zur Expression von fremden Genen in L. lactis besteht in der Verwendung des Promotors eines bekannten echten L. lactis-Gens. Bei einem veröffentlichten derartigen Gen handelt es sich um das Phospho-β- galactosidase-Gen des Stamms Z268. Die Synthese wurde folgendermaßen vorgenommen:
  • Die 6 Oligonukleotide wurden wie üblich synthetisiert und gereinigt. 100 pmol jedes Oligonukleotids wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt und die 5'-Phosphate wurden unter Verwendung des Enzyms T4-Polynukleotid-Kinase und von [γ-³²P]ATP als Phosphat-Donor angefügt. Diese Oligonukleotide wurden dann wie beschrieben aneinander hybridisiert. Das Plasmid pJDC9 (J.-D. Chen und D. A. Morrison, Gene 64, 1988, 155-164) wurde mit den Restriktions-Enzymen SacI und HindIII verdaut und auch mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Plasmid pDP108 wurde mit den Restriktions-Enzymen NdeI und HindIII verdaut und die Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt, und das 3,85 kb-Fragment, welches das komplette ENA3-Gen und den LYS2-Terminator enthielt, wurde ausgeschnitten und elektroeluiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit HindIII - SacI- verdautem pJDC9, dem Oligonukleotid-Gemisch und dem zuvor gereinigten SacI - AsuII-600-bp-Hefe-Promotor-Fragment von pK19/GAPDH-dSna gemischt und ligiert. Dieses wurde dann in kompetente E. coli-Zellen transformiert, 2 h bei 37ºC in 500 ul frischem YT-Medium exprimiert, auf YT-Platten, die mit 100 ug/ml Erythromycin ergänzt worden waren, ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kolonien wurden zuerst durch Restriktions-Enzym-Analyse und auf eisnukleierende Aktivität und schließlich durch DNA-Sequenzierung durchmustert. Dadurch ergab sich Plasmid pDP137, das zwei einzelne Basenpaar-Deletionen im sequenzierten Promotor enthielt (mit dem # markiert, vgl. oben).
  • Das Plasmid pDP137 wurde mit den Restriktions-Enzymen AsuII und XbaI verdaut und die DNA-Fragmente wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das 3,95 kb-Fragment wurde ausgeschnitten und die DNA wurde elektroeluiert. Dieses Fragment wurde mit dem oben beschriebenen XbaI - ClaI-verdauten pSC12vN-Plasmid gemischt, ligiert und in kompetente E. coli transformiert. Die Kolonien wurden mittels der eisnukleierenden Aktivität und durch Restriktions-Enzym-Analyse unter Identifizierung des Plasmids pDP148 durchmustert, das in Fig. 24A der beigefügten Zeichnungen schematisch dargestellt ist, wobei L. lactis º den L. lactis-Plasmid-Replikationsstartpunkt darstellt. Fig. 24B zeigt eine Restriktionskarte von ENA-137 (aus pDP137), wobei P bzw. T den Promotor und den Terminator darstellen. Das Plasmid pDP148 wurde wie oben beschrieben in LM0230 transformiert. Die Transformanten wurden verwendet, um Kulturen von M17G- Medium, das mit 4 ug/ml Erythromycin ergänzt worden war, zu inokulieren und diese wurden unter Schütteln bei 20ºC gezüchtet. Das Gefrierspektrum von LM0230 plus Plasmid pDP148 ist in Fig. 25 der beigefügten Zeichnungen dargestellt, wobei log (Eiskeime/Zelle) gegen die Unterkühlung (-ºC) graphisch dargestellt ist.

Claims (8)

1. Das Plasmid pDP143 mit der in Figur 19 wiedergegebenen Restriktionskarte.
2. Verwendung des Plasmids pDP143 nach Anspruch 1 als Vektor zur Hefetransformierung zur Expression eines eisnukleierenden Proteins, für das eine DNA-Sequenz ENA3 kodiert, die die in Figur 2 wiedergegebene Restriktionskarte aufweist.
3. Der Saccharomyces cerevisiae Stamm NCIMB40215, der das in Anspruch 1 beanspruchte Plasmid pDP143 enthält.
4. Das Plasmid pDP148 mit der in Figur 24 wiedergegebenen Restriktionskarte.
5. Verwendung des Plasmids pDP148 nach Anspruch 4 als Vektor zur Laktokokken-Transformierung zur Expression eines eisnukleierenden Proteins, für das eine DNA-Sequenz ENA3 kodiert, die die in Figur 2 wiedergegebene Restriktionskarte aufweist.
6. Der Lactococcus lactis Stamm NCIMB40216, der das in Anspruch 4 beanspruchte Plasmid pDP148 enthält.
7. Das zur Konstruktion der in Anspruch 1 oder Anspruch 4 beanspruchten Plasmide pDP143 und pDP148 verwendete Plasmid, wobei das genannte Plasmid pUC21ENA3 ist und die in Figur 2 wiedergegegebene Restriktionskarte aufweist.
8. Der Escherichia coli Stamm NCIMB40217, der das in Anspruch 7 beanspruchte Plasmid pUC21ENA3 enthält.
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