FI97729B

FI97729B - Plasmidit jäänukleointiproteiinien ekspressoimiseksi

Info

Publication number: FI97729B
Application number: FI905081A
Authority: FI
Inventors: Herbert Hottinger; David Pridmore; Peter Niederberger; Ursula Staeger-Roose
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1996-10-31
Also published as: FI97729C; AU6469090A; IL95983A; DK0424771T3; AU642914B2; FI905081A0; NO904532L; GB2237275B; IE903623A1; ES2066084T3; NO180181C; AR248425A1; HU906403D0; IE64531B1; EP0424771B1; NZ235743A; GB2237275A; DE69013458D1; BR9005387A; HUT61884A

Description

97729

Plasmidit jäänukleointiproteiinien ekspressoimiseksi Plasraider för expression av isnukleringsprotein Tämän keksinnön kohteena on jään kiteytyminen elintarvikkeiden ja vastaavien biologisten materiaalien pakastuksessa ja tällaisen kiteytymisen edistämiseen käytetyt lisäaineet.

Elintarvikkeiden ja vastaavien biologisten materiaalien pakastamisessa on tärkeää minimoida suurten jääkiteiden muodostuminen, koska tällä on yleensä haitallinen vaikutus materiaalin rakenteeseen tai tilaan sulattamisen jälkeen. Jos pakastaminen suoritetaan jään muodostamista edistävien ytimien suuren määrän läsnäollessa, on havaittu, että kaikki mukana oleva vesi voidaan pakastaa pieninä kiteinä. Aineille, joita voidaan lisätä elintarvikkeeseen, kohdistuu vakavia rajoituksia eikä kiteyttämislisäaineita ole siten tähän mennessä merkittävässä määrin käytetty.

Äskettäin on ehdotettu lisättäväksi elintarvikkeisiin Pseudomonas svrinqiae-soluia, joissa on jään kiteyttämiseen kykenevää natiivia proteiinia. Tämä organismi on levinnyt laajalle ja se on monissa tapauksissa syynä kasvavien kasvien, kuten viinirypäleiden, mansikan, perunan, tomaattikasvien ja vastaavien ennenaikaiseen jäätymiseen. P. svrinqiae-soluien on havaittu voivan edistää jään kiteytymistä ja pienten jääkiteiden muodostumista, kun niitä on mukana elintarvikkeissa jäätymisen aikana. Lisäksi US-patentissa 4200228 on kuvattu menetelmä, jossa näitä organismeja käytetään lumenteossa, kun taas kansainvälisessä patenttihakemuksessa WO 83/03831 on kuvattu tiettyjen isäntäorganismien transformointi DNA:11a, joka koodaa jään kiteyttämisproteiinia, tarkoituksella valmistaa mikrobi-peräisiä aineita käytettäväksi alijäähtymisen estossa.

Vaikkakin hiivoja ja muita sieniä on ajateltu mahdollisiksi isänniksi edellä mainittuihin menetelmiin, erityisesti mainittuja ovat kuitenkin vain E. coli ja natiivit organismit, kuten P. svrinqiae. Siten ei ole mitään erityistä mainintaa mistään isäntämikro-organismeista, joita voitaisiin käyttää 2 97729 käytännöllisesti katsoen syötäväksi tarkoitettujen biologisten materiaalien, kuten elintarvikkeiden lisäaineina.

P. svringiae on Pseudomonas-suvun jäsen. Eräät suvun lajeista ovat patogeenejä, esimerkiksi ihmispatogeeni P. aeruginosa. Eräiden P. svrinqiae-kantoien tiedetään myös olevan patogeenejä tietyille kasveille. Samoin tietyt E. coli-kannat ovat yleisesti tunnettuja ihmispatogeeneja. Niin muodoin ne eivät ole käyttökelpoisia elintarvikkeiden lisäaineissa käytettäväksi. Vaikkakin niitä käytettäisiin tapettuina soluina, aina on olemassa vaara, että tappaminen on ollut epätäydellistä ja että eloonjääneet organismit myöhemmin lisääntyvät elintarviketta varastoitaessa ja sulatettaessa. Tällaiset mikro-organismit eivät siten sisälly listoihin organismeista, joille on annettu GRAS-status (Generally Regarded as Safe), U.S. Code of Federal Regulations, Vol. 21, osat 170 - 199, huhtikuu 1986, julkaisija U.S. Goverment Printing Office.

Esillä olevan keksinnön perustana on ajatus, että eristetään geeni, joka on vastuussa jään kiteyttävän proteiinin ekspres-. soimisesta P. syringiae:ssa ja muissa organismeissa, ja että käytetään tätä sopivassa vektorissa transformoimaan organisme-ja, jotka on elintarvikkeiden yhteydessä luetteloitu GRAS-lis-töillä joko elävässä tai tapetussa muodossa, elintarvikkeiden .·· tai muiden syötävien biologisten materiaalien lisäaineina.

• ·

Elintarvikkeisiin, jotka voidaan edullisesti käsitellä keksin- * nön mukaisesti, kuuluvat kasvikset, hedelmät, kala, lihat, valmistetut pakasteruoat, jäätelö, pakastetut taikinat, pakastetut mehut ja pakkaskuivatut elintarvikkeet. Mielenkiinnon . kohteena oleviin farmaseuttisiin tuotteisiin sisältyvät pak-• · · • · · ;** kaskuivatut materiaalit ja verijakeet, kuten kryosaoste.

:·. Tässä yhteydessä käytettynä GRAS-nimityksellä on edellä maini-tuissa U.S. Federal Regulations-säännöksissä annettu merkitys. Tällaisiin mikro-organismeihin kuuluvat hiivat, esimerkiksi ';*/ Saccharomvces cerevisiae tai carlsbergensis. maitohappobaktee-rit, esimerkiksi Lactococcus lactis. Lactobacillus bulgaricus 3 97729 jne., etikkabakteerit ja tietyt filamenttimaiset sienet, esimerkiksi Aspergillus-lajit.

Mikro-organismeja voidaan käyttää kokonaisina soluina tai niiden fraktioina. On olemassa viitteitä siitä, että kokonaiset solut ovat tehokkaita myös silloin, kun jään kiteyttävä proteiini on pysynyt solun sisällä. Eräissä tapauksissa voi kuitenkin olla edullista fragmentoida solut ja käyttää vain aktiivista proteiinia sisältäviä jakeita, esimerkiksi soluseinämän jakeita.

Mikro-organismit transformoidaan tarkoitukseen sopivalla vektorilla. Yleisesti sanoen käytetään plasmideja transformoitaessa prokaryoottisia isäntiä, kuten bakteereita. Hiivat voidaan transformoida plasmideilla, jotka voivat kuitenkin olla tarkoitetut integroimaan aktiivisen geenin kromosomaali-seen DNA:aan.

Jään kiteyttävää proteiinia koodaava DNA voi olla saatu luonnossa esiintyvistä organismeista, kuten seuraavista: P. svrinqiae. P. fluorescens. P, coronafasciens. Xanthomonas translucens tai Erwinia herbicola. DNA voi vaihtoehtoisesti olla syntetisoitu jo sekvensoitujen geenien, esimerkiksi INAW (R.L. Geen ja G.J. Warren, Nature, Voi. 317, 1985, s. 645-648) : : : ja INAZ (G.J. Warren et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 14,

No. 20, 1986, s. 8047-8060) tai tässä yhteydessä kuvattujen * · » sekvenssien pohjalta.

Eristetty geeni voi olla varustettu sopivilla terminaalisilla restriktiokohdilla, jotka tekevät mahdolliseksi sen insertoi- . misen aiotulle isännälle sopivaan vektoriin.

• · · • « • · « « · «

Kun aiottu isäntä on hiiva, esimerkiksi YP42, sopiva plasmidi-vektori on siten pDP34 (eurooppalainen patentti n:o .·*. 89810297,5), joka on sopivasti modifioitu, esimerkiksi plasmi- di, joka sisältää E. coli-vektorin pUC19, hiivan täydellisen 2 *·* ‘ mikronin plasmidin ja kaksi hiivan selektoitavaa auksotrofista markkeria, esimerkiksi URA3-geeni helppoa transformointia ja 4 97729 plasmidin pienen kopiomäärän selektointia varten hiivassa ja LEU2-geenin dLEU2-alleeli indusoitua suurta kopiomäärää varten.

Huomattakoon, että tulisi varmistua siitä, että initiaattori-kodoni on geenin ensimmäinen ATG, koska hiiva käyttää aina ensimmäistä löytämäänsä ATG:a translatoinnin aloittamiseen, ja tarvittaessa kaikki ATG:t on poistettava "oikean" ATG:n 5'-puolelta.

Plasmideja voidaan sen jälkeen käyttää transformoimaan sopiva hiivakanta ja selektoimaan auksotrofisten markkereiden mukanaolon avulla.

Nyttemmin on havaittu, että edellä kuvatulla tavalla transformoidut hiivakannat eivät aina tuota jään kiteyttävää proteiinia käytettävissä olevassa muodossa ja että mukaan on toivottavaa ottaa hiivan signaalisekvenssi, joka kohdistaa proteiinin solun pintaan. Tällainen sekvenssi voi olla esimerkiksi PH05-signaalisekvenssi (B. Wajeeh et ai., Nucleic Acids Research, Voi 12, No. 20, 1984, s. 7721-7739) tai alfa-faktorin pre-pro-johtosekvenssi (J. Kurjan ja I. Herskowitz, Cell 30, 1982, s. 933-943). Lisäksi on havaittu, että alfa-faktorin johtosekvenssiä käytettäessä pre-pro-peptidisekvenssin ja | mielenkiinnon kohteena olevan geenin välissä on suositellusti :"*· linkkerisekvenssi, esimerkiksi natiivin alfa-faktorin 8 amino-hapon linkkeri.

Jään kiteyttävä proteiini on myös mahdollista kohdistaa johonkin tiettyyn solun sisällä olevaan organilliin, esimerkiksi . vakuoliin. Tätä tarkoitusta varten voidaan tuoda karboksipep- • · 9 ;;; tidaasi Y:n (CPY) pre-pro-sekvenssi, koska tämän proteiinin • · _ tiedetään olevan suuntautunut vakuoliin.

Lactococcus lactis on erityisen turvallinen ja hyväksyttävä .·,* elintarvikelaatuinen mikro-organismi, esimerkiksi LM0230- kanta. Eräs sopiva, tämän organismin transformoimiseen käytet-tävä plasmidi on pSC12vN, joka muodostuu E. coli-vektorista 5 97729 pUC18, ei-indusoitavasta pVA838-plasmidin erytromysiiniresis-tenssigeenistä (kts. jäljempänä viite 1) ja replikaation Lj_lactis-plasmidi-alkukohdasta. Tämä edellyttää kuitenkin promoottorin yhdistämistä mielenkiinnon kohteena olevan geenin lisäksi. Erityisen hyödylliseksi on havaittu modifioidun tacll-promoottorin. Suorempi tapa L. lactis-bakteerissa eks-pressointiin on L. lactis-geenin. kuten Z268-kannan fosfo-β-galaktosidaasi-geenin promoottorin käyttö (viite 2).

1. (B. Brigitte et ai., Gene 62, 1988, 249-261) 2. (F.L. Maorina et ai., Gene 19, 1982, 345-353)

Seuraavat mikro-organismit on tallennettu 24.10.1989 National Culture of Industrial and Marine Organisms-kokoelmaan, Aberdeen, Skotlanti, jäljempänä annetuilla numeroilla.

S. cerevisiae YP42 NCIMB 40215 L. lactis LM0230 NCIMB 40216 E. coli BZ234(pUC21ENA3) NCIMB 40217

Edellä mainittu E. coli NCIMB 40217 on transformoitu jäljempänä mainitulla pUC21ENA3-plasmidilla.

« ·

Seuraavat esimerkit on annettu ainoastaan havainnollisuuden : : : vuoksi: » » 0 • · · ·'·* Esimerkki 1 • · Jään kiteyttävien Pseudomonads-bakteereiden eristäminen

Noin 15 g suuruinen näyte lehtiä ja kukkasia otettiin Nestle'n . tutkimuskeskuksen, Vers-chez-les-Blanc, lähellä sijaitsevan • · < metsän kasveista ja laitettiin steriilin 500 ml ravistelupul- • · '·* loon. Lisättiin 100 ml steriiliä peptonia (0,1 %) ja fosfaatti (50 mM, pH 7)-puskuria ja pulloa ravisteltiin yksi tunti 30°C:ssa 300 rpm. Neste poistettiin ja solujäännökset ja bak-teerit pelletoitiin sentrifugoimalla 5 minuuttia 10.000 rpm. Supernatantti heitettiin pois ja pelletti suspendoitiin uudel-leen 10 ml:aan peptoni/fosfaattipuskuria. Tästä maljattiin 6 97729 viisi 0,04 ml erää Kings-agarmaljoilie, jotka oli täydennetty 40 μg/ml sykloheksimidillä ja 0,1 % sentrimidillä, ja inkuboi-tiin 48 tuntia huoneen lämpötilassa. Maljat ovat tärkeitä ja jokseenkin Pseudomonas-spesifisiä (sykloheksimidi tuhoaa sienet ja niiden germinoivat itiöt, ja sentrimidi on biologinen detergentti, joka tappaa useimmat bakteerit psuedomonas-bak-teereita lukuunottamatta).

Maljojen sisältämät pesäkkeet olivat kahta perustyyppiä. Ensimmäisen tyypin pesäkkeet olivat pieniä ja muodostivat yksittäisistä pesäkkeistä taustan, kun taas näiden päällä oli toisen tyypin suuret pesäkkeet (tämä teki mahdottomaksi sanoa, oliko jokin suuri pesäke kontaminoitunut pienellä).

Kahdesta maljasta testattiin yleisesti INA (Ice Nucleation Activity, jään kiteyttämisaktiivisuus)-aktiivisuuden läsnäolo pesemällä solut pois maljoilta 5 ml:aan peptoni/fosfaattipus-kuria ja testaamalla ne pisaranjäätymismenetelmällä. Tähän tarvitaan parafiinilla pesty alumiinivene (saatu pesemällä parafiinivahan (kiinteä) 1-prosenttinen ksyleeniliuos alumiinin pinnalle ja antamalla ksyleenin haihtua). 10 μΐ maljan ’ pesuliuoksen pisaroita laitettiin alumiiniveneeseen yhdessä '.·. kontrollien kanssa -9°C:ssa ja jäätymiselle annettiin pisteet. Molempien maljojen pesuliuokset jäätyivät toistettavissa : olevalla tavalla näissä olosuhteissa 30 sekunnin kuluessa, kun • » · taas kontrollit jäätyivät vain aika ajoin, jos lainkaan. Tämä • · · testi toistettiin kriittisemmässä -5°C lämpötilassa, jolloin maljojen pesuliuokset jäätyivät jälleen nopeasti ja toistettavasta kun taas kontrollien ei milloinkaan havaittu jäätyvän tässä lämpötilassa. Tämä vahvisti INA-bakteereiden mukanaolon näissä eristeissä.

• · • · • * · M» • · Jäljellä olevista maljoista poimittiin 300 yksittäistä pesä- • t ’·, kettä steriileillä hammastikuilla mikrotiitterilevyille ja .·*· kasvatettiin huoneen lämpötilassa 3 päivää. Sen jälkeen siir-• » · rettiin 10 μΐ pisaroita monikanavaisen pipetin avulla para- i · fiinillä päällystetyn alumiiniveneen päälle ja laitettiin • · -5°C:een. Tästä tunnistettiin 10 INA-bakteeria, joista yhdellä 7 97729 oli heikko aktiivisuus. Näistä puhdistettiin kaksi, INA5 ja INA7, puhdasviljelmiksi maljäämällä solut yksittäisiksi pesäkkeiksi ja ottamalla 50 mielivaltaista kloonia ja testaamalla niiden jään kiteyttävä aktiivisuus -5°C:ssa.

Kvalitatiivinen pisaraniäätvmis-standardimenetelmä 50 pisaraa, joiden tilavuus oli 10 μΐ, järjestettiin parafiinillä päällystetyn alumiiniveneen päälle ja tämä laitettiin alkoholihauteen pinnalle, jonka lämpötila oli ennalta valittu. Veneen pitoajaksi otetaan 1 minuutti ja laitetaan muistiin jäätyneiden pisaroiden lukumäärä. Tämä ilmoitetaan tässä lämpötilassa jäätyneiden pisaroiden prosentuaalisena määränä. Tulosten, jotka on saatu seuraavilla: vesi (A), M17-alusta (B), M17-alusta pplus LMO230 ja plasmidi pSC12vN (C) ja M17-alusta plus LMO230 ja plasmidi pDP135 (D), vertailu on esitetty kuviossa 1, jossa jäätyneiden pisaroiden prosenttimäärä on piirretty oordinaattana abskissana käytettyä lämpötilaa (-°C) vasten.

Kvantitatiivinen pisaraniäätvmis-standardimenetelmä v. Tämä perustuu G. Vali'n (J.Atmos.Sei. 28, 1971, 402-409) » » » laskelmiin jään kiteyttävien aineiden määrän laskemisesta, i Standardimenetelmässä otetaan 1 ml viljelmää ja solut pelle- • I t · toidaan sentrifugoimalla 2 minuuttia. Viljelyalusta heitetään • · 1 .V pois ja solut suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan TE-liuosta (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,0). Tästä TE-suspensiosta valmistetaan sarja-laimennukset 10-7 asti. Jokaisesta laimennuksesta pipetoidaan 10 pisaraa parafiinilla päällystetyn alumiiniveneen päälle ja vene laitetaan sen jälkeen alkoholi/vesihauteen • a *·ί· päälle, jonka lämpötila on ennalta valittu alle 0°C. 3 minuu-« » « V tin kuluttua laitetaan muistiin jäätyneiden pisaroiden luku-• ♦ määrä ja niiden asema laimennussarjassa. Jääytimien lukumäärä ,··1 tässä lämpötilassa lasketaan Vali'n kaavalla: • · • » · < • · t 1 8 97729 1 10° N(t) = In - x -

(1-f) V

jossa N(t) on jääytimien lukumäärä tässä annetussa lämpötilassa; f on jäätyneiden pisaroiden osuus; D on laimennusten määrä sarjassa; ja V on pisaran tilavuus ml:na. Sen jälkeen tämä normalisoidaan solukonsentraation suhteen ja lopuksi ilmoitetaan tämän luvun logaritmina. Tämä muodostaa kvantitatiivisen laskelman jään kiteyttävän aineen määrälle ja perustuu järjestyksen mukaiseen jäätymiseen laimennussarjassa, so. lämpötilan laskiessa ensin jäätyvät laimentamattomat pisarat, sen jälkeen 10"1 laimennussarjän jne. Tällä ei voi helposti kvantitatisoi-da puhtaan veden jäätymistä, joka on oleellisesti tilastollinen tapahtuma. Tästä syystä näille liuoksille, joissa ei ole jään nukleoitumista, käytetään kvalitatiivista määritystä.

Kromosomaalisen DNA:n eristäminen —: 100 ml Kings-alustaa siirrostettiin INA5:lla ja INA7:lla ja kasvatettiin yön yli 30°C:ssa. Soluja sentrifugoitiin 5 minuuttia 10.000 rpm ja supernatantti heitettiin pois. Solut suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 50 mM Tris, 50 mM EDTA ’ pH 8,0-liuosta, lisättiin 0,5 ml lysotsyymin 10 mg/ml uutta '···* liuosta 250 mM Tris, pH 8,0-puskurissa ja inkuboitiin jäillä * 45 minuuttia. Tähän lisättiin 1 ml STEP-liuosta (0,5 % SDS, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,4 M EDTA ja 1 mg/ml proinaasi K) ja inkuboitiin 3 tuntia 60°C:ssa. Tämä uutettiin kaksi kertaa 7 ml :11a 1:1 fenoli/kloroformiseosta ja faasit erotettiin : sentrifugoimalla. Sakkaan lisättiin 15 ml etanolia DNA:n .·:·. saostamiseksi ja neste kaadettiin varovasti pois. DNA liuo- · tettiin 5 ml:aan 10 mM Tris pH 8,0 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml • *' RNase-liuosta inkuboimalla 2-3 tuntia 60°C:ssa (tämä on ·...· yhdistetty liuentamis- ja RNase-käsittely) . DNA saostettiin uudelleen 10 ml :11a etanolia ja DNA kelattiin pois (DNA-massa .···. poistettiin kiertämällä sitä hammastikun ympäri koeputken reunaa vasten). Tämä DNA liuotettiin 5 ml:aan 10 mM Tris 97729 pH 7,5, 0,1 mM EDTA-liuosta, jolloin saatiin liuos, jonka väkevyys oli noin 1 mg/ml.

INA-geenin kloonaus

Oligo 17 on sekaoligonukleotidi, jonka pohjana on toistuvan sekvenssin 8 aminohapon teema, joka on säilynyt sekä INAZ:ssa että INAW:ssa [vastaavasti P. svrinqiae:sta (R.L.Green & G.J.Warren, Nature Voi 317, 1985, so. 645 - 648) ja P. fluo-rescens:sta (G.J.Warren et ai., Nucleic Acid Research, Voi 14, no 20, 1986, s. 8047 - 8060)] ja joka toistuu lähes 30 kertaa kummassakin tapauksessa (jäljempänä).

AGYGSTQT Ala Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Thr TTTTTTA 23 mer, 5,GCC GGC TAC GGC AGC ACC CAG AC3' G G G G 1024 miksi

AA A A

:Y: Analyyttisesti restriktiopilkkomiset suoritettiin sekä INA5:n että INA7:n DNA:11a ja fragmentit erotettiin agaroo-:sigeelielektroforeesin avulla. Tämä siirrettiin sen jälkeen ,···, Zetaprobe-nailonmembraanille ja hybridisoitiin radioaktiivi- sesti kinsoidun Oligo 17:n kanssa (T. Maniatis et ai.. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor, NY 1982). Pesun jälkeen suodatin autoradiografoitiin -70°C:ssa 6 tunnin ajan käyttämällä vahvistusverkkoa. Autoradiograafissa esiintyi jonkin verran taustaa, epäspesifistä hybridisoitumis-ta, mutta myös hyviä signaaleja. Ensiksikin sekä INA5 että • · · : INA7 ovat identtisiä. Fragmenttien koot olivat seuraavat ’ (INAZ) ) ; Sacl 7 kb (7), Sacl + Bglll 6 kb (3,4 kb), Bglll

*... 16 - 19 kb (hyvin suuri) , Bglll + EcoRI 5 kb (5 kb) , EcoRI

·;·. 9 kg (23 kb), EcoRI + PvuI 7 kb (3,75 kb), PvuI 8 kb (7), ja Y : Sali 1 kb (1 kb). Vaikkakin EcoRI + Bglll- ja Sali-fragmentit : ovat samoja, pääosa muista restriktiopaloista on sen vuoksi erilaisia.

10 97729 5 kb Bglll + EcoRI-fragmentti päätettiin kloonata pUC-vekto-riin ja seuloa Oligo 17:11a. 60 ^g INA5-DNA:a pilkottiin restriktioentsyymeillä Bglll ja EcoRI ja fragmentit erotettiin 0,7-prosenttisella agaroosigeelillä. Geelialue, joka sisälsi fragmenttikoot 4,4 - 5,5 kb, irrotettiin leikkaamalla geelistä ja elektroeluoitiin. Tämä seos kloonattiin pUC21-plasmidiin [pUC19 (C.Yanisch-Perron et ai, Gene 22, 1985, s. 103 - 119)-pohjäinen plasmidi, jossa on vuorottainen kloonauspatteri ja joka on muodostettu kloonaamalla synteettisiä oligonukleoti-dejä BamHI - Saclrlla pilkottuun plasmidiin pUC19] seuraavasti (LacZ-geenin valmis aminohapposekvenssi on esitetty ylemmällä rivillä; DNA-sekvenssi ja sen komplementti on esitetty kahdella keskirivillä; restriktioentsyymin tunnistamiskohdat on esitetty alemmalla rivillä. Synteettiset oligonukleotidit on esitetty isoilla kirjaimilla.):

Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu His Ala Cys Arg Ser Thr Leu Glu Asp Pro 5'atg acc atg att acg cca age ttg cat gcc tgc agg tgc act eta gag GAT CCA

3, tae tgg tae taa tgc ggt teg aac gta egg acg tee acg tga gat ete cta gGT

< Hind3 X SphI X PstI X Sali X Xbal X BamHI X

: : ·' Arg Vai Pro Ala Leu Ala Asp Leu Ser Arg Ser SEr Asn Ser Leu .···. CGC GTG CCG GCG CTA GCA GAT CTC TCG AGG AGC Teg aat tea ctg3' GCG CAC GGC CGC GAT CGT CTA GAG AGC TCC tcg age tta agt gac5, : Mlul X Nael X Nhel X Bglll X Xhol X SacI X EcoRI>

Esimerkki liqatointi:

Mikrofuugiputkessa sekoitetaan hyvin . 0,4 pikomoolia (1 μΐ) Bglll - EcoRI-pilkottua pUC21-plasmidia, • · 1,5 pikomoolia (3 μΐ) puhdistettua Bglll - EcoRI INA5-frag- » · *·] # menttia, ;*·. 13 μΐ TE-puskuria, minkä jälkeen kuumennetaan 2 minuuttia 56°C:ssa, lisätään 2 μΐ ΙΟχ T4 DNA-ligaasipuskuria, [660 mM Tris pH 7,5; 50 mM MgCl; 50 mM ditiotreitoli (DTT) ; 10 mM edenosiini-5'-trifosfaatti (ATP) ; 200 μg/ml naudanseerumialbumiini (BSA) ] , lisätään 1 μΐ - 1 yksikkö T4 DNA-ligaasia, sekoitetaan hyvin ja inkuboidaan 3-4 tuntia 4°C:ssa.

11 97729

Esimerkki E. coli-kompetenttisolut:

Siirrostetaan 100 ml YT-alustaa (8 g/1 Bacto-tryptoni; 5 g/1 Bacto-hiivauute; 5 g/1 NaCl) 1 ml :11a BZ234-solujen uudella yön yli vanhalla viljelmällä, inkuboidaan viljelmää 37°C:ssa, kunnes OD6000 = 0,4, pelletoidaan soluja sentrifuugissa 5 minuuttia 10.000 rpm, heitetään supernatantti pois ja suspendoidaan pelletti uudelleen yhtä suureen tilavuuteen steriiliä 50 mM CaCl-liuosta 4°C:ssa, inkuboidaan jäillä 20 minuuttia, pelletoidaan soluja 5 minuuttia 10.000 rpm, heitetään supernatantti pois ja suspendoidaan uudelleen l/l0:aan alkuperäisestä 50 mM CaCl-tilavuudesta; 20 % glysero li.

Nämä E. coli-solut ovat nyt kompetentteja ja ne voidaan käyttää välittömästi tai ne voidaan pakastaa -70°C:ssa myöhempää käyttöä varten.

Transformointi: 100 μΐ kompetentteja soluja laitetaan esi jäähdytettyyn sterii-liin lasiseen koeputkeen, * tähän lisätään edellä oleva ligatointireaktioseos ja sekoitetaan hyvin, inkuboidaan jäillä 20 minuuttia, kuumennetaan 2 minuuttia 42°C:ssa.

• · · • · • · · :]:* Nämä solut voidaan nyt maljata suoraan selektiivimaljoille ./ * (kuten ampisilliiniselektion tapauksessa) tai niihin voidaan *... lisätä 500 μΐ YT-alustaa ja inkuboida 2 tuntia 37°C:ssa (kuten • kanamysiini- ja erytromysiiniselektion tapauksessa) .

• I · * * Näiltä selektiivisiltä transformaatiomaljoilta poimittiin pesäkkeiden (768) 8 mikrotiitterilevyä. Nämä replikoitiin Zetaprobe-nailonsuodattimelle, joka oli laitettu ampisillii- 12 97729 nilla täydennetyn YT-agarmaljän päälle, ja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa. Pesäkkeet lyysattiin suoraan suodattimilla ja hybridisoitiin radioaktiivisesti kinasoidun Oligo 17:n kanssa. Pesun jälkeen suodattimet autoradiografoitiin huoneen lämpötilassa 45 minuutin ajan ja tunnistettiin 10 hybridisoituvaa kloonia;

ENA - E. coli ice Nucleating Activity Malja Asema ENA

1 Fl 1 1 F2 2 3 H9 3 5 D5 4 5 F6 5 6 A3 6 6 C8 7 7 C6 8 7 E10 9 ·:·! 8 B1 10 .···. Kaikkien näiden pesäkkeiden osoitettiin jäätyvän -5°C:ssa, : .·, tavallisesti 20 - 30 sekunnin kuluessa, kun taas kontrollit eivät jäätyneet 10 minuutin kuluessa. Pienimittaisia DNA-pre- • · !” paraatteja valmistettiin kaikista 10 kloonista ja DNA pilkot- ·’ tiin EcoRI:lla ja BglII:lla (geenin kloonaamiseen käytetyillä entsyymeillä, joiden tulisi irrottaa ainutkertainen 4,5 kb insertti ja 2,7 kb plasmidivektori). ENA 4:ssa ja 10:ssa näkyi mukana kaksi inserttivyöhykettä ja nämä laitettiin sen vuoksi syrjään. Analyyttiset pilkkomiset osoittivat, että ΕΝΑ 1 ja 6 :*:* sisälsivät plasmidien seoksia. Näiden arvojen perusteella ./ jatkoanalyysiin valittiin ENA3. Mukaanliitettyjen piirustusten • · *... kuviossa 2A on esitetty kaaviollisesti plasmidi pUC21/ENA3; m‘]\ kuvio 2B esittää ENA3-geenin restriktiokarttaa.

Lähtökohtana rakennettiin ENA3-plasmidin laaja restriktio-kartta. Tämä osoitti, että ENA3-insertin ja Pseudomonas svrin-qiae'n julkaistun INAZ-geenin välillä oli huomattava, mutta ei 13 97729 täydellinen homologia. Restriktiokarttaa käytettiin ENA3-insertin laajaan alikloonaamiseen ja näiden alikloonien myöhempään DNA-sekvenssianalyysiin.

Täydellinen Bglll - EcoRI-fragmentti on sekvensoitu ja se sisältää 4446 emäsparia, so. se on 12 emäsparia lyhyempi kuin julkaistu INAZ-geeni. Siinä on kaksi pientä yhden nukleotidin insertiota/deleetiota, kummatkin proteiinia koodaavan sekvenssin ulkopuolella. Nämä ovat G:n insertio bp 594:ssa ENA3-geenissä ja nukleotidin deleetio bp 4396:ssa. Tärkeämpi deleetio esiintyy noin bp 1168 - 1179:ssa deleetion koskiessa 12 emäs-paria, mikä säilyttää proteiinin lukukehyksen (4 aminohapon deleetio). Tämä esiintyy 'AACGCC':n 4x toistosekvenssin teemassa. Mitä luultavimmin nämä toistot ovat syynä deleetioon.

Näillä kahdella P. svringiae-sekvenssillä on noin 93 % koko-naishomologia (määritettynä UWGCG:n Bestfit-ohjelmalla) DNA-tasolla, pääosan ollessa tavanomaisia muutoksia T -> C ja G -> A. Proteiinitasolla homologia nousee noin 98 %:iin.

;··’ Muutokset ovat 4 aminohapon deleetio ja 37 aminohapon substituutiot, joista vain 13 on 'konservatiivisia'.

• · Esimerkki 2 • , ^ ;·; ENA3 :n eksoressointi hiivassa ENA3-jään kiteyttävän geenin hiivassa ekspressoinnin tärkeä ensimmäinen vaihe on kahden 'ATG':n, jotka ovat oikean 'ATG':n 5'-puolen läheisyydessä (14 bp ja 8 bp), poistaminen. Tämä on tarpeen, koska hiiva aina ottaa ensimmäisen 'ATG':n, jonka :*·’ se löytää mRNAtn käynnistämisen jälkeen, mikä tässä tapaukses-* sa johtaisi pituudeltaan 4 aminohapon peptidiin, joka siten on • · hyvin pieni osa jään kiteyttämisproteiinista. Toinen huomioon *··· otettava seikka on, että lisätään hyödyllinen restriktiokohta, :‘i‘ joka auttaa hiivapromoottoreiden ja/tai signaalisekvenssien lisäämistä.

14 97729 ENA3-term:n rakentaminen

Plasmidi ENA3 pilkottiin restriktioentsyymillä EcoRI ja 5'-ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Tämä pilkottiin sen jälkeen BglII:lla ja Pvul:lla ja sen jälkeen DNA-fragmentit erotettiin agaroosigeelillä. 4,5 kb fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Plasmidi pUC21/LYS2-term2 (R.D.Pridmore, julkaisemattomia tuloksia) on E. coli:n vektori pUC21, jossa on hiivan LYS2 kaksisuuntainen terminaattori (U.N.Fleig et ai., Gene 46, 1986, s. 237 - 245). Tämä plasmidi pilkottiin Nhel:lla ja 5'-ylite korjattiin Klenow'in entsyymillä (Maniatis et ai.). Tämä pilkottiin seuraavaksi Pstlrlla ja fragmentit erotettiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä.

190 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Nämä kaksi fragmenttia sekoitettiin Pstlrlla ja BamHI:-11a pilkotun pK19 (R.D.Pridmore, Gene 56, 1987, s. 309 - 312)-vektorin kanssa ja ligatoitiin. Transformanteista testattiin aluksi jään kiteyttämisaktiivisuus. Sen jälkeen yksi näistä karakterisoitiin edelleen restriktioentsyymianalyysin avulla. Näin varmistuttiin plasmidista pK19/ENA3-term, joka on esitet-;V ty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuviossa 3A. Kuvio 3B esittää ENA3-term:n restriktiokarttaa, jossa Lys2 T on hiivan ; LYS2 kaksisuuntainen terminaattori.

« · Tämä plasmidi pilkottiin sen jälkeen restriktioentsyymeillä • i ’·’ Aatu ja Sacl ja 5 kb fragmentti geelipuhdistettiin ja defos-foryloitiin (Maniatis et ai.). Tämä fragmentti valmistettiin niin, että se otti vastaan tulevat promoottori-ENA3 5'-rakenteet .

• * % f · • · « pDP105:n rakentaminen: * • « • · » · ♦ * *,,, pDP105 : n rakentamisessa eristetään DNA-fragment ti alkaen Taql- restriktiokohdasta, joka on noin +8 bp ENA3-geenin 'ATG':sta, SphI-restriktiokohtaan asti, noin +185 bp. 'ATG' :n DNA-sek-venssi ja ENA3-geeni Taql-restriktiokohtaan asti korvataan * i i synteettisillä oligonukleotideillä, jotka lisäävät myös uudet restriktioentsyymikohdat EcoRI ja Ndel 'ATG':n 5'-päähän.

15 97729

Plasmidi EC1 on ENA3-aliklooni, joka sisältää promoottorin ja 'ATG':n kattavan 750 bp Sphl-fragmentin. EC1 pilkottiin rest-riktioentsyymeillä Sphl ja Taql, fragmentit erotettiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä ja 180 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Tämä fragmentti sekoitettiin synteettisten oligonukleotidien 124 ja 125 kanssa ja ligatoi-tiin Sphl:11a ja EcoRIrlla pilkottiin pUC19-kloonausvektoriin. Oikean insertin sisältävät plasmidit tunnistettiin restriktio-analyysin avulla ja varmistettiin lopuksi DNA-sekvenssianalyysin avulla. Tämä asettaa EcoRI- ja Ndel-restriktiokohdat vastaavasti 5'-päähän ja osittain 'ATG':n päälle.

ENA3-geenin 'ATG':n lähellä oleva DNA-sekvenssi, jossa on TaqI-restriktiokohta:

Taql - 175 bp 5'ATGCTGTAATGAATATCGACAAA3'-------------- 3 , TACGACATTACTTATAGCTGTTT5,-------------- Sphl

Linkkereinä käytetty oligonukleotidien DNA-sekvenssi: <Ndel> Taql ... <EcoRI> _ /·; 5'aattgatatgaatat3' : 3 , gtatacttatgac5 , ‘ GAPDH-promoottorin lisääminen

Valmistettiin ja testattiin kaksi GAPDH-promoottorirakennetta. Ciba Geigy-yhtiöltä saatiin 2 kB Hindlll-fragmentti, joka si-: j*; sälsi täydellisen GAPD-geenin (J.P.Holland & M.J. Holland, The Journal of Biological Chemistry, Voi. 258, no. 19, 1979, s.

_· · 9839 - 9845) . Geeni katkaistiin HindIII:lla ja siirrettiin E^.

: ‘ coli-vektoriin pK19. Promoottorin lyhentämiseksi muodostettiin '...· kaksi deleetiota pilkkomalla plasmidi Smalrlla (katkaisemalla ;'j'; pK19-linkkerijonon sisällä) ja joko SnaBI:lla (bp 424) tai .···. Sspl:lla (bp 646), jotka kaikki entsyymit tuottavat yhteen- 16 97729 sopivat tasapäät, jotka kaikki ligatoituivat uudelleen itsestään. Näin saatiin vastaavasti 600 bp ja 400 bp pitkät GAPDH-promoottorit plasmideille pKl9/GAPDH-dSna ja pK19/GAPDH-dSsp.

dSna- ja dSsp-promoottorit eristettiin seuraavasti. Plasmidit pilkottiin restriktioentsyymillä AsuII ja 5'-ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Sen jälkeen tämä pilkottiin Sacl:lla ja tuotteet erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä. Oikean-kokoiset DNA-vyöhykkeet poistettiin leikkaamalla ja DNA elek-troeluoitiin ulos geelifragmentista.

pDP105-plasmidi pilkottiin restriktioentsyymillä EcoRI ja 5'-ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Sen jälkeen tämä pilkottiin SpHIrlla ja fragmentit erotettiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä. Oikea 200 bp fragmentti poistettiin geelistä leikkaamalla ja elektroeluoitiin.

pDP105 ENA3 5' DNA-fragmentti ligatoitiin näihin kahteen promoottoriin yhdensuuntaisesti Sacl:11a ja Sphl:lla pilkottuun E. coli-vektoriin pUC19. Näin saatiin plasmidit pDP106 (dSsp) ja pDP107 (dSna).

Plasmidit pDP106 ja pDP107 pilkottiin restriktioentsyymeillä I.! Sphl ja Sacl ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä. Gee-listä poistettiin leikkaamalla vastaavasti 550 bp ja 750 bp • « · •1j/ fragmentit ja nämä elektroeluoitiin. Plasmidi ENA3 pilkottiin • » *···1 restriktioentsyymeillä Aatu ja Sphl ja fragmentit erotettiin • · *.· 1 agaroosigeelillä. Geelistä poistettiin leikkaamalla 1,3 kb fragmentti, joka elektroeluoitiin. Tämä ENA3 5' 1,3 kb Aatu -Sphl-fragmentti sekoitettiin pDP106:n ja 107:n eristettyjen fragmenttien kanssa erikseen ja ennalta valmistetun pkl9/ENA3-; term Aatu - Sacl 5 kb-fragmentin kanssa ja ligatoitiin. Tästä .1:· identifioitiin vastaavasti plasmidit pDP108 ja pDP109.

«rtit Hill) I·.··*» . . .

‘ GAPDH/CAT-promoottorit • ·

Rakennettiin toinen sarja promoottoreita, jotka sisälsivät .···. lisäksi E. coli-promoottorin hiivan GAPDH-promoottorin ja 17 97729 ENA3-geenin välissä. Tämän tarkoituksena oli helpottaa rakenteiden aktiivisuuden seulomista ennen niiden siirtämistä hiivaan. Valittu E. coli-promoottori oli Tn9:n kloramfenikoli-resistenttiysgeenin promoottori (N.K.Alton & D.Vapnek, Nature 282, 1979, s. 864 - 869). Jotta vältettäisiin ei-toivottujen E. coli-sekvenssien liittyminen rakenteeseen, syntetisoitiin myös promoottori ja tätä käytettiin linkkerinä GAPDH-promoottorin ja ENA3-geenin välissä seuraavasti:

AsuII EcoRI Ndel GAPDH 5' r.r.CGAATTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGaattcatatg3' ENA3 promoot- tori 3,aagcTTAAAAACTCAATAGCTCTAAAAGTCCTCGATTCCTTAAgtatac5, geeni

Isot kirjaimet tarkoittavat syntetisoituja. Ylempi juoste on Oligo 141 ja alempi Oligo 142. Nämä oligonukleotidit puhdistettiin tavalliseen tapaan, minkä jälkeen ne kuivattiin ja liuotettiin uudelleen konsentraatiossa 300 pikomoolia/mikro-litra. 300 pikomoolia kutakin oligonukleotidiä sekoitettiin 10 //l:aan hybridisointipuskuria (150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8,0 ja 1 mM EDTA). Sen jälkeen tämä kuumennettiin 95°C:een 5 minuutiksi ja sen jälkeen inkuboitiin 55°C:ssa yön yli näiden kahden komplementtisen oligonukleotidin hybridisoimiseksi.

.'* Myös seuraavat DNA-fragment it eristettiin. Plasmidit ··;/ pK19/GAPDH-dSsp ja -dSna pilkottiin restriktioentsyymeillä • · '···' AsuII ja Sacl ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä.

• « *.* ; 400 bp ja 600 bp fragmentit poistettiin geelistä leikkaamalla ja nämä elektroeluoitiin. Plasmidi pDP108 pilkottiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja Aatu ja geelistä eristettiin 1,5 kb DNA-fragmentti. Tämä 1,5 kb pDP108-fragmentti sekoitettiin : ·*. erikseen näiden kahden AsuII - Sacl GAPDH-fragmentin, .·;· pK19/ENA3-term 5 kb Sacl - Aatu puhdistetun fragmentin ja • · AsuII - EcoRI-linkkerin (CAT-promoottori) kanssa ja ligatoi-• ' tiin. Transformantit testattiin sekä restriktioanalysoimalla *...· pienen mitan DNA-preparaatit, jään kiteyttämisaktiivisuuden ja .·;·. DNA-sekvensoinnin avulla. Nämä vastasivat toisiaan täsmälleen, .···. jolloin saatiin plasmidit pDPHO (dSsp) ja pDPlll (dSna) .

18 97729

Siirtäminen hiivan ekspressointiplasmidiin Näiden rakenteiden testaamiseen käytetty hiivan ekspressoin-tiplasmidi saatiin Ciba-Ceigy-yhtiön bioteknologian osastolta. Tämä on plasmidi pDP34-Xho (pDP34, kts. eurooppalainen patenttihakemus n:o 89810297.5-. Xho-modifikaatio on Sacl:lla ja BamHIrlla pilkottu pDP34, johon on lisätty pUC21:n valmistamiseen käytetyt oligonukleotidit, kts. sivu 9), joka muodostuu E. coli-vektorista pUC19, täydellisestä hiivan 2 mikronin plasmidista ja kahdesta hiivan selektoitavasta auksotrooppi-sesta markkerista. Ensimmäinen on URA3-geeni, joka helpottaa transformointia ja plasmidin matalakopioista selektointia hiivassa, ja toinen on suuren kopiomäärän indusointiin sopiva LEU2-geenin dLEU2-alleelli.

Plasmidi pDP34-Xho pilkottiin restriktioentsyymeillä Sacl ja Mlul. Myös plasmidit pDP108, 109, 110 ja 111 pilkottiin restriktioentsyymeillä Sacl ja Mlul. pDP34-plasmidi ligatoitiin yksitellen näihin neljään plasmidipalaan ja transformoitiin E_i_coli-isäntään· Transformantit selektoitiin ampisilliinimal-joilla pDP34-plasmidin selektoimiseksi. Restriktioanalyysi ....: tunnisti plasmidit pDP112 (jossa on ENA3-konstruktio pDP108:sta), pDP113 (109), pDP114 (110) japDP115 (111). Plasmidit pDP114, pDP115 ja pDP34Xho on esitetty kaaviollises-ti vastaavasti oheisten piirustusten kuvioissa 4A, 5A ja 6.

• · t •”t: ENA-110:n (pDP110:sta) ja ENA-lll:n (pDPlll:sta) restriktio- • « *··· kartat on esitetty kuvioissa 4B ja 5B, joissa P tarkoittaa • « · promoottoria ja T terminaattoria.

Hiivan transformointi . ·’· Hiivasolut siirrostetaan yli yön vanhasta viljelmästä YPD-• « · .*:* alustaan (1 % Bacto-hiivauute, 2 % Bacto-peptoni, 2 % deks-• · troosi) ja kasvatetaan yön yli 30°C:ssa.

: ’ Otetaan viljelmä, jonka OD600 on noin 2,0, ·...· pelletoidaan 50 ml solususpensiota 5 minuuttia 3.000 rpm, hylätään supernatantti ja pestään solut 50 ml:ssa TE-puskuria, • · 19 97729 suspendoidaan solut uudelleen 20 ml:aan 1 M litiumasetaattia (TE:ssa), inkuboidaan 90 minuuttia 30°C:ssa varovasti ravistellen, pelletoidaan soluja 5 minuuttia 3.000 rpm, hylätään supernatantti ja suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan 1 M LiOAc:a, 200 μΐ erät kompetentteja soluja, joissa 1 μg DNA:a, inkuboidaan 10 minuuttia 30°C:ssa, lisätään 1 ml 50 % PEG-liuosta (TE:ssa), sekoitetaan ja inkuboidaan 30°C:ssa 60 minuuttia, annetaan lämpöshokki 42°C:ssa 5 minuutin ajan, pelletoidaan soluja mikrofuugissa 5 sekunnin ajan, hylätään supernatantti, suspendoidaan solut uudelleen 300 ^l:aan 800 mM sorbitolia ja maljataan selektiivimaljoille.

ENA3-geenin eksoressointi hiivassa

Plasmidit pDP112, pDP113, pDP114 ja pDP115 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla hiivakantaan YP42 (genotyyppi; a, ura3-52, bis4-580, leu2). Transformantit selektoitiin SD (0,67 % Bacto-hiivan typpialusta ilman aminohappoja, 2 % deks-.·.· troosi) -minimaaliagarmaljoilla, jotka oli täydennetty histi- !.! diinillä (20 mg/litra) ja leusiinilla (30 mg/litra) , 30°C:ssa.

Transformantit puhdistettiin sivelemällä transformoidut pesäk- * · » keet kaksi kertaa samoille selektiivimal joille yksittäisiksi *···* pesäkkeiksi. Kustakin plasmidikonstruktiosta saaduilla pesäk-• · keillä siirrostettiin viljelmät YPD-alustassa, joita kasvatettiin sekoittaen 30°C:ssa. Nämä kasvatettiin log-faasin alkuun niin, että OD600 oli noin 1,0, ja solut pelletoitiin jne. YP42 plus pDP114 ja pDPP115-plasmidien jään kiteyttämisspektrit on ; .* esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuvioissa 7 ja • · · .*:· 8. Näissä kuvioissa on esitetty log (jääydin/solu) oordinaat- _ · · tana ja piirrettynä abskissana esitettyä alijäähtymistä (- C) : ‘ vasten YPD-alustalla (o).

• .;· YP42 plus pDPH4- ja pDP115-plasmideja kasvatettiin myös SD2-.··· alustassa (0,67 % Bacto-hiivan typpialusta ilman aminohappoja, 20 97729 0,5 % casaminohapot, 2 % dekstroosi ja 50 mM natriumsitraatti pH 6,0) 30°C:ssa samalla sekoittaen. Vastaavat jäätymisspekt-rit SD2-alustalla on esitetty oheisten piirustusten kuvioissa 7 ja 8 (o).

pDP14o:n rakentaminen

Plasmidi pDP133 on kuvattu jäljempänä. Tämä plasmidi pilkottiin restriktioentsyymeillä MluI ja Sacl, sekoitettiin Mlul:lla ja Sacl:11a pilkotun pDP34Xho:n kanssa ja ligatoi-tiin. Tämä transformoitiin kompetentteihin E. coli-soluihin ja transformantit selektoitiin ampisilliinilla täydennetyillä YT-maljoilla. Pesäkkeet seulottiin jäätymis- ja restriktioent-syy-mianalyysien avulla. Saatu plasmidi pDP140 on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuviossa 9A. Kuvio 9B esittää ENA-133:n (pDP133:sta) restriktiokarttaa, jossa P tarkoittaa promoottoria ja T terminaattoria.

pDP140 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla YP42:aan. Pesäkkeitä viljeltiin SD2-alustassa 30°C:ssa samalla sekoittaen. YP42 plus pDP140-plasmidin jäätymisspektri on esitetty .... oheisten piirustusten kuviossa 10, jossa log (jääydin/solu) on ,·.· piirretty alijäähtymistä (-°C) vasten.

• · • .

. UB14-promoottorin valmistaminen ia lisääminen * * · • · • · · i • · · *··· Lähtömateriaali on Ciba Geigy-yhtiön plasmidi KS+/UB14, joka • « ·.· muodostuu villityypin hiivakannasta S288C saadusta 6 kb geno- misesta Sacl-fragmentista, joka sisältää UB14-geenin (E.

Ozkaynak et ai.. The EMBO Journal, Voi 6, no 5, 1987, 1429- 1439) kloonattuna Bluescript-plasmidin KS+ (Stratagene Cloning ; ;* Systems, USA) Sacl-kohtaan. Plasmidi KS+/UB14 pilkottiin • · · .·;· restriktioentsyymeillä Hindlll ja Bglll, fragmentit erotettiin » _ · · agaroosigeelillä, 1 kb vyöhyke poistettiin leikkaamalla ja : * elektroeluoitiin. Plasmidi Bluescript SK+ (Stratagene Cloning *... Systems, USA) pilkottiin restriktioentsyymeillä Hindlll ja

Bglll. Molemmat DNA-framgnetit sekoitettiin yhteen, ligatoi-.·· tiin ja transformoitiin kompetentteihin E. coli-soluihin.

21 97729

Transformantit selektoitiin ampisilliinilla täydennetyillä YT-maljoilla, analysoitiin restriktioentsyymipalojen avulla ja identifioitiin plasmidi BAl. Plasmidin BAl sisältävä E. coli-kanta infektoitiin sen jälkeen Stratagene-yhtiön ohjeiden mukaisesti auttajafaagilla M13/K07 ja supernatantitsta otettiin talteen BAl:n yksijuosteinen muoto. Tämä puhdisteen myöhempää käyttöä varten.

UB14-promoottori modifioitiin oligonukleotidin ohjaaman paikka-spesifisen mutageneesin avulla, millä liitettiin EcoRV-restriktiokohta välittömästi ennen UB14-geenin 'ATG':a seuraavasti : 5'actttaactaatagattATGcagattttcgtcaa3' 3,aactaatagatatcgcagattttcg5 , < >

EcoRV

jossa ylempi sekvenssi on genominen UB14-geeni 'ATG':n ympärillä (osoitettu isoin kirjaimin) ja alempi sekvenssi (isoilla kirjaimilla) on mutageneesiin käytetty Oligo 166 (uusi EcoRV-restriktiokohta on osoitettu alapuolella). Mutageneesi suori-... tettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti "Oligonucleotide- directed in vitro mutagenesis system, Version 2"-systeemillä ,\! (Amersham, UK) . Transf ormantit selektoitiin ampisilliinilla täydennetyillä YT-maljoilla, analysoitiin restriktioentsyy- * « ·*· millä EcoRV ja tunnistettiin plasmidi SK+/UB14-EcoRV.

• · · «··

I I

V Plasmidi pDP108 pilkottiin restriktioentsyymillä Ndel ja ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Tämä pilkottiin sen jälkeen restriktioentsyymillä Aatu ja fragmentit erotettiin agaroosi- geelillä. Geelistä erotettiin leikkaamalla 1,5 kb DNA-frag- . ,· mentti, joka elektroeluoitiin. Plasmidivektori pGEM7 (Promega, ··· ,··· USA) pilkottiin restriktioentsyymeillä Hindlll ja Aatll.

* i '. . pGEM7-vektori, UB14-promoottori ja pDP108 5' ENA3 DNA-frag- : ’’ mentti sekoitettiin ja ligatoitiin. Tämä ligaatio transformoi-tiin kompetentteihin E. coli-soluihin ja maljattiin ampisil- « * .‘r liinilla täydennetyille YT-maljoille. Transformantit analysoi- 4 · ,’·· tiin ja identifioimiin plasmidi BFl.

* * * 22 97729

Plasmidi BFl pilkottiin restriktioentsyymeillä SacI ja Aatu, fragmentit erotettiin agaroosigeelillä ja 2 kb fragmentti elektroeluoitiin. Tämä sekoitettiin jo kuvatun puhdistetun ja defosforyloidun 5 kb pkl9/ENA3-term, Sad - Aatll-fragmentin kanssa, ligatoitiin ja transformoitiin kompetentteihin E. coli-soluihin. Transformantit selektoitiin YT-maljoilla, jotka oli täydennetty kanamysiinillä, ja analysoitiin restriktioent-syymipalojen, jäätymisen ja DNA-sekvensoinnin avulla, jolloin saatiin plasmidi pDP118. pDP118:n ENA3-insertti transformoitiin sen jälkeen hiivan ekspressointivektoriin pDP34, jolloin saatiin plasmidi pDP120. Plasmidi pDP120 on esitetty kaavioi-lisesti oheisten piirustusten kuvioissa 11A. Kuvio 11B esittää ENA-118:n (pDP118:sta) restriktiokarttaa, jossa P ja T tarkoittavat vastaavasti promoottoria ja terminaattoria.

pDP120 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla YP42:aan. Pesäkkeitä viljeltiin SD2-alustassa 30°C:ssa samalla sekoittaen. YP42 plus pDP120:n jäätymisspektri on esitetty oheisten piirustusten kuviossa 12, jossa log (jääydin/solu) on piirretty alijäähtymistä (-°C) vasten.

ENA3-geenin kohdistaminen hiivassa Jään kiteyttämisproteiinin kohdistumisen ja mahdollisesti sen ·. fenotyyppisen ekspressoitumisen parantamista varten teimme konstruktioita, joissa natiivin hiivan signaalisekvenssit oli fuusioitu ENA3-proteiinin aminopäähän. Valittiin kaksi, PH05- * signaalisekvenssi (B.Wajeeh et ai. Nucleic Acids Research,

Voi 12, no 20, 1984, s. 7721 - 7739), ja alfa-faktorin pre-pro-johtosekvenssi (J.Kurjan & I.Herskowitz, Cell 30, 1982, s. 933 - 943).

• · · • · · • » · ♦ · · *·] _ PH05-signaalisekvenssi PH05-signaalisekvenssiin päästiin syntetisoimalla kaksi komp-lementtista oligonukleotidiä, jotka toimivat linkkerinä samal-la sisältäen halutut aminohapposekvenssit seuraavasti (syn-*···' teettiset oligonukleotidit on osoitettu isoilla kirjaimilla) : 23 97729 ★ ★★★★***

EcoRI met phe lys ser vai val tyr ser ile leu ala ala

5'gAATTCA ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC CGT

3, cttaaGT TAC AAA TTT AGA CAA CAA ATA AGT TAA AAT CGG CGA

Signaalin katkaisukohta

ser leu ala asn ala gly MET

TCT TTG GCC AAT GCA GGt atg3' ENA3-geeni AGA AAC CGG TTA CGT CCA Tac5,

Ylempi oligonukleotidi on oligo 174 (59 mer) ja alempi on oligo 175 (57 mer). Näitä kahta oligonukleotidiä sekoitettiin yhteen suurin piirtein yhtä suuret moolimäärät ja hybridisoi-tiin runsassuolaisessa liuoksessa. Nämä hybridisoidut oligo-nukleotidit sekoitettiin seuraavien puhdistettujen fragmenttien kanssa: jo kuvattu pK19/ENA3-term 5 kb, Sacl- ja Aatll-pilkottu, geelipuhdistettu ja defosforyloitu fragmentti; pDPlll:n 700 bp Sacl- ja EcoRI-pilkottu ja geelipuhdistettu fragmentti; ja pDPlll:n 1,45 kb Ndel- ja Aatll-pilkottu ja geelipuhdistettu fragmentti. Tämä ligatoitiin ja transformoi-' ' tiin E. coli'iin. Transformantit valittiin aluksi aktiivisuu-‘•V tensa perusteella E. coli'ssa ja sen jälkeen restriktioent-’...' syymianalyysin avulla, jolloin saatiin plasmidi pDP117 ja j.j j pDP34:ssa plasmidi pDP120. DNA-sekvenssianalyysi osoitti, että osa PH05-signaalisekvenssistä oli kaksinkertaistunut. 8 ami-nohappoa, jotka on merkitty (*, kts. edellä), ovat kahdentuneet, jolloin saadaan seuraava signaalisekvenssi: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 . met phe lys ser vai vai tyr ser met phy lys ser vai vai • · · 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 i tyr ser ile leu ala ala ser leu ala asn ala gly MET ENA3-geeni

;'·· I

signaalin katkaisukohta

Plasmidi pDP121 on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustus-'···' ten kuviossa 13A. Kuvio 13B esittää ENA-117:n (pDP117:sta) 24 97729 restriktiokarttaa, jossa P, SS ja T esittävät vastaavasti promoottoria, signaalisekvenssiä ja terminaattoria.

Plasmidi pDP121 transformoitiin hiivakantaan YP42 ja pesäkkeet selektoitiin SD + HIS + LEU-maljoilla. Transformanttien viljelmiä kasvatettiin SD2-alustassa ja niistä määritettiin jään kiteyttämisaktiivisuus. YP42 plus pDP121:n jäätymisspektri on esitetty oheisten piirustusten kuviossa 14, jossa log (jää-ydin/solu) on piirretty alijäähtymistä (-°C)) vasten.

Alfa-faktorin johto-osa

Pre-pro-alfa-faktorin johto-osan lähtömateriaali on Ciba Geigy-yhtiön pUC/PH05-alfa-faktorin johtoplasmidi. Tämä on modifioitu niin, että se sisältää EcoRI-restriktiokohdan, PH05-promoottorin 8 bp palan ja sitä seuraavan 'ATG':n ja alfa-faktorin johto-osan. Myös pre-pro-katkaisualuetta on modifioitu liittämällä Bglll-restriktiokohta KEX2-katkaisukoh-taan ja PvuII-restriktiokohta 6 bp verran ennen tätä (Chiron Corp.-modifikaatio).

Plasmidi pUC/PH05-alfa-faktorin johto-osa pilkottiin restrik- tioentsyymeillä EcoRI ja Hindlll ja fragmentit erotettiin ·...’ agaroosigeelillä. 300 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ·,· j ja elektroeluoitiin. Plasmidi pDPlll pilkottiin restriktioent- syymeillä EcoRI ja Sacl ja fragmentit erotettiin agaroosigee- :V: Iillä. 650 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektro- eluoitiin. Vastaavasti alfa-faktorin johto-osan ja GAPDH-dSna- CAT-promoottorin nämä kaksi komponenttia sekoitettiin restrik- tioentsyymeillä Sacl ja Hindlll pilkotun pUC19:n kanssa, liga- . toitiin ja transformoitiin E. coli-bakteeriin. Transformantit • · · •j* analysoitiin ja identifioitiin plasmidi pUC/GAPDH- dSna-Cat-alfa-faktorin johto-osa.

f'; Plasmidi pUC/GAPDH-dSna-CAT-alfa-faktorin johto-osa pilkottiin restriktioentsyymillä Bglll ja 5'-ylite täytettiin K1 enow'in ’ entsyymillä. Sen jälkeen tämä pilkottiin restriktioentsyymillä '···' Sacl ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä. 940 bp frag- 25 97729 mentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Plasmidi pDPlll pilkottiin restriktioentsyymillä Ndel ja 5'-ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Sen jälkeen tämä pilkottiin restriktioentsyymillä Aatu ja fragmentit erotettiin agaroosi-geelillä. 1400 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Nämä kaksi puhdistettua fragmenttia sekoitettiin pK19/ENA3-term 5 kb, Sacl- ja Aatll-pilkotun, geelipuhdistetun ja defosforyloidun fragmentin kanssa, ligatoitiin ja transformoitiin E. coli-bakteeriin. Transformantit seulottiin aluksi jään kiteyttävän aktiivisuuden suhteen ja sen jälkeen restrik-tioentsyymianalyysin avulla ja lopuksi DNA-sekvenssianalysiin avulla, jolloin identifioitiin plasmidi pDP126. Sen jälkeen insertti siirrettiin hiivassa testaamista varten plasmidiin pDP34, jolloin saatiin plasmidi pDP129, joka on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuviossa 15A. Kuvio 15B esittää ENA-126:n (pDP126:sta) restriktiokarttaa, jossa P, T ja L tarkoittavat vastaavasti promoottoria, terminaattoria ja johto-osaa. Plasmidi pDP129 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla hiivakantaan YP42. Transformanteilla siirrostettiin viljelmät SD2-alustassa ja inkuboitiin 30°C:ssa sekoittaen.

YP42 plus pDP129-plasmidin jäätymisspektri on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuviossa 16, jossa log (jääydin/solu) on piirretty alijäähtymistä (-°C) vasten.

• · · • <· j Alfa-faktorin iohto-osa plus linkkeri « · • · • · · ;*;* Viimeaikainen informaatio alfa-faktorin johto-osan käytöstä rekombinanttiproteiinien hiivassa valmistamista varten on tuonut esiin ylimääräisen vaatimuksen. Natiivissa alfa-faktorissa seuraa pre-pro-peptidiä 8 aminohapon linkkeri ja sen . jälkeen alfa-faktorin peptidi. Linkkeri-alfa-faktori-yhdis- • · · **j* telmä toistuu 5 kertaa geenissä ja linkkerit poistuvat alfa-faktorin prosessoinnin aikana. Tämä informaatio viittaa sii-hen, että linkkeri tulisi lisätä pre-pro-johto-osan jälkeen ja :*·'· ennen mielenkiinnon kohteena olevaa geeniä. Tämä on tehty linkkereinä käytettyjen synteettisten oligonukleotidien avul-la, joilla halutut aminohapot on insertoitu.

26 97729

Plasmidi pUC/GAPDH-dSna-CAT-alfa-faktorin johto-osa pilkottiin restriktioentsyymeillä Sad ja Bglll ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä. 940 bp fragmenttia poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Plasmidi pDPlll pilkottiin restriktioentsyymeillä Ndel ja Aatll ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä. 1400 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Nämä kaksi puhdistettua fragmenttia sekoitettiin kahden hybridisoidun oligonukleotidin 208 ja 209 sekä edellä kuvatun pK19/ENA3-term Sad - AatII-fragmentin kanssa, ligatoitiin ja transformoitiin E. coli-bakteeriin. Transfor-mantit seulottiin restriktioentsyymipalojen ja DNA-sekvenssi-analyysin avulla, jolloin tunnistettiin plasmidi pDP127, jolla myös on jään kiteyttävää aktiivisuutta. Insertti transformoitiin hiivan ekspressointiplasmidiin pDP34, jolloin saatiin plasmidi pDP130, joka on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuviossa 17A. Kuvio 17B esittää ENA-127:n (pDP127:sta) restriktiokarttaa, jossa P, T ja L tarkoittavat vastaavasti promoottoria, terminaattoria ja johto-osa + link-keriä. Plasmidi pDP130 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla YP42:aan. Transformanteilla siirrostettiin viljelmät SD2-alustassa ja kasvatettiin 30°C:ssa sekoittaen. YP42 plus pDP130-plasmidin jäätymisspektri on esitetty oheisten piirus-tusten kuviossa 18, jossa log (jääydin/solu) on piirretty ali-jäähtymistä (-°C) vasten.

Vakuoliin kohdistaminen • · · • · • · • ·

Edellä kuvatuissa tapauksissa ainoastaan lisätään natiivin hiivan signaalisekvenssi ENA3-proteiiniin. Tämä voi auttaa tai voi olla auttamatta proteiinin kohdistamista membraaneihin, . luultavasti endoplasmisen retikulumin kautta. Proteiinin tul- • · tua endoplasmiseen retikulumiin, oletusreitti on erittyminen • « *] ulos solusta tai mahdollisesti tässä tapauksessa insertoi-*’·, tuminen ulkomembraaniin. Tässä tapauksessa kohdisteaan ENA3-proteiinin tiettyyn organelliin solun sisällä, nimittäin * * vakuoliin.

• · · • 4 .

• · · -a au i aim i j i Et < I · 27 97729

Karboksi-peptidaasi Y (CPY)-proteiini ohjautuu vakuoliin (L.A.Valls et ai, Cell 48, 1987, s. 887 - 897) pre-pro-muodossa, jonka proteinaasi B (PEP4-geenituote) prosessoi vakuolin sisällä. On myös osoitettu, että kohdistamiseen tarvittavat sekvenssit ovat logalisoituneet pre-pro-johto-sekvenssin sisälle. Sen vuoksi insertoidaan tämän ENA3-proteiinin eteen.

Lähtömateriaali on Ciba Geigy-yhtiön pBR322/PH05-pre-pro CPY-plasmidi. GAPDH/CAT-promoottorin ja luonnonmukaisen Stul-rest-riktiokohdan väliin tarvitaan spesifisenä linkkerinä synteettisiä oligonukleotidejä noin 35 emäsparia CPY pre-peptidiin: .stui.

EcoRI MetLysAlaPheThrSerLeuLeuCysGlyLeuGlyLeu 5'gAATTCATATGAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGGACTAGGcctg3' 3, cttaaGTATACTTTCGTAAGTGGTCAAATGATACACCTGATCCggac5,

Syntetisoidut oligonukleotidit on esitetty isoin kirjaimin. Ne ovat Oligo 206 (ylempi) ja Oligo 207 (alempi). Plasmidi pBR322/PH05-pre-pro-CPY pilkottiin restriktioentsyymeillä Hindlll ja Stui ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä.

800 bp fragmentti erotettiin leikkaamalla, elektroeluoitiin ja sekoitettiin hybridisoitujen oligojen 206 ja 207 ja EcoRI :11a ja Hindlllrlla pilkotun pUC19-plasmidin kanssa ja i '··; ligatoitiin yhteen. Tämä transformoitiin E. coli-bakteeriin ja ·' transformantit seulottiin restriktioentsyymianalyysin perus-

III

·...' teella, jolloin saatiin plasmidi pUC19/CPY (p-p) . Plasmidi • · ·.· pUC19/CPY(p-p) pilkottiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja

Hindi, fragmentit erotettiin agaroosigeelillä ja erotettiin leikkaamalla 340 bp fragmentti, joka elektroeluoitiin. Tämä fragmentti sekoitettiin EcoRI:11a ja Hindi :11a pilkotun . .* pUC18:n kanssa, ligatoitiin ja transformoitiin kompetentteihin • # ♦ .·;· E. coli-bakteereihin. Pesäkkeet seulottiin ja identifioitiin • · ’· · plasmidi pUC18/pre-pro-CPY.

Plasmidi pUC18/pre-pro-CPY pilkottiin restriktioentsyymeillä ,·;· EcoRI ja Hindlll ja tuotteet erotettiin agaroosigeelillä.

.·.· 350 bp fragmentti poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoi- t

tiin. Tähän lisättiin geelipuhdistettu 680 bp Sacl EcoRI

28 97729 GAPDHdSna/CAT-promoottoriplasmidista pDPHO ja ligatoitiin SacI- ja HindiII-pilkottu pUC19 ja transformoitiin kompetent-teihin E. coli-bakteereihin. Pesäkkeet seulottiin ja identifioitiin plasmidi pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY. Plasmidi pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY pilkottiin restriktioentsyy-millä Sali ja ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Sen jälkeen tämä pilkottiin SacI:11a ja fragmentit erotettiin agaroo-sigeelillä. Erotettiin leikkaamalla 750 bp fragmentti, joka elektroeluoitiin. Plasmidi pDP108 pilkottiin restriktioentsyy-millä Ndel ja ylite täytettiin Klenow'in entsyymillä. Sen jälkeen tämä pilkottiin AatII:lla ja fragmentit erotettiin aga-roosigeelillä. 1500 bp fragmentti erotettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Nämä kaksi eristettyä fragmenttia sekoitettiin jo kuvatun pK18/ENA3-term 5 kb, SacI- ja Aatll-pilkotun, geelipuhdistetun ja defosforyloidun fragmentin kanssa, ligatoitiin ja transformoitiin kompetentteihin E. coli-bakteerei-hin. Pesäkkeet seulottiin restriktioentsyymin avulla ja jäätymisen avulla, joista kummastakin identifioitiin sama plasmidi, pDP136. Plasmidin pDP136 insertti siirrettiin hiivan ekspres-sointiplasmidiin pDP34, jolloin saatiin plasmidi pDPl43, joka on esitetty oheisten piirustusten kuviossa 19A. Kuvio 19B esittää ENA-136:n (pDP136:sta) restriktiokarttaa, jossa P ja T \ tarkoittavat vastaavasti promoottoria ja terminaattoria.

: 1 Plasmidi pDP143 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla YP42:aan. Transformanteilla siirrostettiin viljelmät SD2- • · · .*.· alustassa ja inkuboitiin 30°C:ssa samalla sekoittaen. YP42 * · plus pDP143-plasmidin jäätymisspektri on esitetty oheisten piirustusten kuviossa 20, jossa log (jääydin/solu) on piirretty alijäähtymistä (-°C) vasten.

• ·

Esimerkki 4 • · · • · • « •\ Ekspressointi Lactococcus laetis-bakteerissa ENA3-geeniä on yritetty ekspressoida natiivista Pseudomonas- • · ’·* promoottoristaan ilman menestystä (tuloksia ei ole esitetty), ·...' vaikka tärkeät -35 ja -10 alueet ovat hyvin samankaltaiset 29 97729 kuin Lactococcus lactis fosfo-E-galaktosidaasi-promoottorissa (B. Boizet et al.. Gene 62, 1988, 249-261) (arvoja ei ole esitetty) . Tärkeää voi kuitenkin olla, että 60-65 emäsparin mahdollinen mRNA-johto-osa on välittömästi ennen käynnistävää 'ATG':a. Tämä rakenne testattiin rakentamalla hybridipromoot-torin, jossa oli -35 ja -10 sekvenssit ENA3-promoottorista ja mahdollinen johto-osa fosfo-S-galaktosidaasi-promoottorista.

Tämä tehtiin käyttämällä synteettisiä oligonukleotidejä jäljempänä kuvatulla tavalla:

AsuII |-35| |-10| < Oligo 186 5'11CGAATGCTTGATAAGTGCGCTGCTTTTATTTAAAGGAT 3,aagcTTACGAACTATTCACGCCACGAAAATAAATTTCCTA < . Oligo 187 _10_20_30_40

X Oligo 214 X

CTAGGAATTTTCCATTTCCTTGGTTTTCAGAACACAGAAT GATCCTTAAAAGGTAAAGGAACCAAAAGTCTTGTGTCTTA X . Oligo 217 _50_60_70_80

Ndel V Oligo 215 > CTCGTCTCAAATGCTTTTTTTGAAAGGACTTACACAtatg3' i _: GAGCAGAGTTTACGAAAAAAACTTTCCTGAATGTGTATac5, 1 . X .Oligo 216. > .

• · · 90 100 110 120 » 4

Emäspari 1 - 45 on modifioitu ENA3-promoottori. Emäspari 46 - 115 on vastaava sekvenssi fosfo-S-galaktosidaasigeenistä.

Emäsparien 146 - 120 jälkeen seuraa restriktioentsyymin Ndel « » '·'· tunnistamiskohta, mukaanlukien 'ATG' ENA3-geenillä. Synteetti-• · · • · set oligonukleotidit on esitetty isoilla kirjaimilla.

• · « « .··· Oligonukleotidit kinatisoitiin ja hybridisoitiin toisiinsa • · kuvatulla tavalla. Plasmidi pDP108 pilkottiin restriktio- ’·’ entsyymeillä Ndel ja Aatu ja fragmentit erotettiin agaroosi-• · · ·... geelillä. 1,5 kb fragmentti, joka sisälsi ENA3-geenin 5'-pään, 30 97729 poistettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Tämä DNA-frag-mentti sekoitettiin edellä kuvattujen synteettisten oligonuk-leotidien, jo kuvatun pK19/GAPDH-dSna:sta saadun Sacl - AsuII 600 bp hiivan promoottorifragmentin ja 5 kb Sacl - Aatll-puh-distetun ja fosfatoidun pK19/ENA3-term:sta saadun fragmentin kanssa ja ligatoitiin. Tämä ligaatio siirrettiin kompetenttei-hin E_j_coli-soluihin ja maljattiin kanamysiinillä täydennetyille YT-maljoille. Transformantit seulottiin restriktioent-syymipalojen, jään kiteyttämisaktiivisuuden ja DNA-sekvensoinnin avulla, jolloin identifioitiin plasmidi pDP133.

Plasmidi pDP133 pilkottiin restriktioentsyymeillä AsuII ja Xbal ja fragmentit erotettiin agaroosigeelillä ja 3,5 kb fragmentti erotettiin leikkaamalla ja elektroeluoitiin. Plasmidi pSC12vN on Ciba Geigy-yhtiön konstruktio, joka muodostuu E. coli-vektorista pUC18, plasmidista pVA838:sta (F.L. Maorina et ai., Gene 19, 1982, 345-353} saadusta ei-indusoituvasta erytromysiini-resistenttiysgeenistä ja Lactococcus lactis-plasmidireplikaation alkukohdasta ja joka on eristetty heidän laboratorioissaan. pSC12vN pilkottiin restriktioentsyymeillä Clal ja Xbal ja käsiteltiin alkalisella fosfataasilla tämän i · » t ' vektorin uudelleenligatoitumisen estämiseksi. INAZ-SGAL-ENA3 DNA-fragmenttia Clal - Xbal-pilkottu pSC12vN sekoitettiin * I 1 ’>fi yhteen ja ligatoitiin. Tämä transformoitiin E. coli-soluihin i ja pesäkkeet seulottiin restriktioentsyymianalyysin ja jään ·’” kiteyttämisaktiivisuuden perusteella. Tämä identifioitiin ·· · .·.* plasmidiksi pDP135. Plasmidit pSC12vN ja pDP135 on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuvioissa 21 ja 22A, joissa L. lactis o on L. lactis plasmidi-replikaation alkukohta. Kuvio 22B esittää ENA-133:n (pDP133:sta) restriktiokart-taa, jossa P ja T tarkoittavat vastaavasti promoottoria ja • i '··· terminaattoria.

« ·· • · ♦ « i

• I

Lactococcus lactis-kannan LM0230 transformointi i i 1 1 « I > * • · L. lactis-kannan LM0230 yön yli vanhasta viljelmästä M17G- t | '·' alustassa (M17-alusta plus 0,5 % glukoosia) otettiin 1 % siir- «41 *,,, roste uuteen M17G-alustaan. Tätä kasvatettiin 30°C:ssa opti- 31 97729 seen tiheyteen (OD600) noin 0,4 ja solut pelletoitiin sentri-fugoimalla 5 minuuttia 10.000 rpm. Supernatantti hylättiin ja solut suspendoitiin uudelleen yhtä suureen tilavuuteen PS-pus-kuria (7 mM Na-fosfaatti, pH 6,6, 0,5 M sakkaroosi) 4°C:ssa.

Solut pelletoitiin uudelleen ja lopuksi suspendoitiin PS-pus-kuriin 1/100 tilavuudesta ja säilytettiin jäissä käyttöön asti (kompetentit solut). Transformointi toteutettiin käyttämällä Biorad Gene Pulser™-laitetta yhdessä Pulse Controller-lait-teen ja Gene Pulser-kyvettien kanssa ja 0,2 cm elektrodiväliä.

100 μΐ kompetentteja soluja sekoitettiin yhdessä 1 - 4 μΐ suuruisen DNA-tilavuuden kanssa joko veteen tai TE-puskuriin ja sen jälkeen pipetoitiin esijäähdytetyn kyvetin pohjalle. Näytettä pulssitettiin 2000 voltin jännitteellä ja 400 ohmin vastuksella. Sen jälkeen näyte poistettiin kyvetistä steriiliin mikrofuugiputkeen ja laitettiin jäihin. Lopuksi solut pelletoitiin minuutin ajan mikrofuugissa, suspendoitiin uudelleen 300 μΐ-.aan M17G-alustaa ja inkuboitiin yksi tunti 30°C:ssa.

Sen jälkeen solut maljattiin M17G-maljoille, jotka oli täydennetty 4 μg/ml erytromysiinillä, ja inkuboitiin yön yli 30°C:ssa.

Plasmidi pDP135 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla . . L. lactis-kantaan LMO230. Transformanteilla siirrostettiin viljelmät M17G-alustassa, joka oli täydennetty 4 μg/ml erytro-'·· mysiinillä, ja inkuboitiin 20°C:ssa samalla sekoittaen OD600-'· arvoon noin 1,0 asti. Nämä viljelmät testattiin kuvatulla • * · tavalla ja tulokset esitettiin käyränä. LM0230 plus pDP135-•· plasmidin jäätymisspektri on esitetty oheisten piirustusten kuviossa 23, jossa log (jääydin/solu) on piirretty alijäähtymistä (-°C) vasten.

. .·. Ρ-β-Gal-promoottori ’.. Toinen suorempi tapa ekspressoida vieraita geenejä L. lactis-• ’·· soluissa on käyttää tunnetun bonafide L. lactis-geenin pro-/ moottoria. Eräs tällainen julkaistu geeni on kannan Z268 ·;·, fosfo-S-galaktosidaasigeenin promoottori. Synteesi tapahtui seuraavasti: 32 97729

AsuIII

< Oligo 220 X # Oligo 221

5'ttCGAACAACAGTTTGATTAATAAATTTGTAAAAGTTATTTGAGACGAGATCACTCATTCCATTT 3, aagcTTGTTGTCAAACTAATTATTTAAACATTTTCAATAAACTCTGCTCTAGTGAGTAAGGTAAA < Oligo 222 X

| Ndel X # Oligo 215 > CCTTGGTTTTCAGAACACAGAATCTCGTCTCAAATGCTTTTTTTGAAAGGACTTACACAtatg3 ' GGAACCAAAAGTCTTGTGTCTTAGAGCAGAGTTTACGAAAAAAACTTTCCTGAATGTGTATag5,

Oligo 217 X Oligo 216 > Nämä 6 oligonukleotidiä syntetisoitiin ja puhdistettiin tavalliseen tapaan. 100 pikomoolia kutakin oligonukleotidiä sekoitettiin mikrofuugiputkessa ja 5'-fosfaatit lisättiin käyttämällä T4 polynukleotidikinaasi-entsyymiä ja [ _32P]ATP:a] fosfaattidonorina. Nämä oligonukleotidit hybridisoitiin sen jälkeen toisiinsa kuvatulla tavalla. Plasmidi pJDC9 (J.D.Chen ja D.A.Morrison, Gene 64, 1988, 155-164) pilkottiin restrik-tioentsyymeillä Sacl ja Hindlll ja myös käsiteltiin alkalisel-la fosfataasilla. Plasmidi pDP108 pilkottiin restriktioentsyy-meillä Ndel ja Hindlll ja fragmentit erotettiin agaroosigee-lillä ja erotettiin leikkaamalla 3,85 kb fragmentti, joka ·: sisälsi täydellisen ENA3-geenin ja LYS2-terminaattorin, ja tämä elektroeluoitiin. DNA-fragment ti sekoitettiin Hindlll -Sacl-pilkotun pJDC9:n, oligonukleotidimiksin ja jo puhdiste- : tun, pK19/GAPDH-dSna:sta saadun Sacl - AsuII 600 bp hiivan « ·· · ···_ promoottori fragment in kanssa ja ligatoitiin. Sen jälkeen tämä transformoitiin kompetentteihin EJ__coli-soluihin, espressoi- • · · * · · _ tiin 2 tunnin ajan 37°C:ssa 500 μΐ-.ssa tuoretta YT-alustaa, maljattiin YT-maljoille, jotka oli täydennetty 100 μg/ml erytromysiinillä, ja inkuboitiin yön yli 37°C:ssa. Pesäkkeet seulottiin aluksi restriktioentsyymianalyysin ja jään kiteyt- ♦ ς.·,: tämisaktiivisuuden perusteella ja lopuksi DNA-sekvensoinnin : perusteella. Näin saatiin plasmidi pDP137, joka sisältää kaksi .·' yhden emäsparin deleetiota sekvensoidussa promoottorissa ,,, (merkitty / = , kts. edellä).

:: : Plasmidi pDP137 pilkottiin restriktioentsyymeillä AsuII ja

Xbal ja DNA-fragmentit erotettiin agaroosigeelillä. 3,95 kb 33 97729 fragmentti poistettiin leikkaamalla ja DNA elektroeluoitiin.

Tämä fragmentti sekoitettiin jo kuvatun Xbal - Clal-pilkotun pSC12vN-plasmidin kanssa, ligatoitiin ja transformoitiin kompetentteihin E. coli-soluihin. Pesäkkeet seulottiin jään kiteyttämisaktiivisuuden ja restriktioentsyymianalyysin avulla, jolloin identifioitiin plasmidi pDP148. Tämä on esitetty kaaviollisesti oheisten piirustusten kuviossa 24A, jossa L. lactis on L. lactis plasmidi-replikaation alkukohta. Kuvio 24B esittää ENA-137:n (pDP137:sta) restriktiokarttaa, jossa P ja T tarkoittavat vastaavasti promoottoria ja terminaattoria. Plasmidi pDP148 transformoitiin edellä kuvatulla tavalla LM0230-kantaan. Transformanteilla siirrostettiin viljelmät M17G-alustassa, joka oli täydennetty 4 μg/ml erytromysiinillä, ja kasvatettiin 20°C:ssa samalla sekoittaen. LM0230 plus pDP148:n plasmidin jäätymisspektri on esitetty oheisten piirustusten kuviossa 25, jossa log (jäädyin/solu) on piirretty alijäähdytämistä (-°C) vasten.

··« • · • · · • · • · • · · • · • · ·

Claims

34 97729
1. Plasmidi pDP143, jonka restriktiokartta on esitetty kuvassa 19 .
2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen plasmidin pDPl43 käyttö vektorina hiivatransformointia varten jäänukleointiproteiinin ekspressoimiseksi, jota proteiinia kuvan 2 restriktiokartassa oleva DNA-sekvenssi ENA3 koodaa.
3. Saccharomvces cerevisiae-kanta NCIMB40215 sisältäen patenttivaatimuksen 1 mukaisen plasmidin pDP143.
4. Plasmidi pDP148, jonka restriktiokartta on esitetty kuvassa 24 .
5. Patenttivaatimuksen 4 mukaisen plasmidin pDP148 käyttö vektorina laktokokkitransformointia varten jäänukleointiproteiinin ekspressoimiseksi, jota proteiinia kuvan 2 restriktiokartassa oleva DNA-sekvenssi ENA3 koodaa.
6. Lactococcal lactis-kanta NCIMB40216 sisältäen patenttivaatimuksen 4 mukaisen plasmidin pDP148. i ' 7. Plasmidi, jota käytetään patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukai- . sen plasmidin pDP143 ja pDP148 muodostamiseksi, tunnet - • · · t u siitä, että plasmidi on PUC21ENA3, jonka restriktiokartta ‘ on esitetty kuvassa 2.
8. E.coli-kanta NCIMB40217 sisältäen patenttivaatimuksen 7 mukaisen plasmidin PUC21ENA3. • · · • · • · · a i « in t mu i l t a ; 35 97729