PT95666B

PT95666B - Processo para a preparacao de aditivos para alimentos

Info

Publication number: PT95666B
Application number: PT95666A
Authority: PT
Inventors: Herbert Hottinger; Peter Niederberger; David Pridmore; Ursula Staeger-Roose
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-10-24
Publication date: 1997-12-31
Also published as: FI97729B; FI905081A0; AU642914B2; BR9005387A; US5514586A; NZ235743A; NO904532D0; IE64531B1; GB2237275B; CA2027852A1; NO180181B; ZA908522B; EP0424771A1; EP0424771B1; DE69013458D1; DE69013458T2; IE903623A1; JP2648389B2; GB8923998D0; NO904532L

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se ã nucleação de gelo na congelação de substâncias alimentares e materiais biológicos semelhantes e aos aditivos para utilização na promoção dessa nucleação.

Ao realizar-se a congelação de substâncias ali mentares e demateriais biológicos semelhantes, é importante minimizar a formação de cristais de gelo de grandes dimensões vis to que estes tem geralmente efeitos prejudiciais sobre a textura ou a condição do material depois da descongelação. A Requerente descobriu que, se se realizar a congelação na presença de grande número de núcleos que promovem a formação de gelo, toda a água presente pode ser congelada sob a forma de pequenos cris tais. No entanto, hã sérias limitações sobre as substâncias que podem ser adicionadas aos alimentos de modo que os aditivos de nucleação não foram até hoje usados em proporção significativa.

Foi recentemente proposto adicionar aos materiais alimentares células de pseudomonas syringiae que possuem uma proteína natural capaz de provocar a nucleação do gelo.

Este microrganismo está largamente distribui1

do e é responsável em muitas substâncias pelo congelamento prematuro de plantas em desenvolvimento, tais como videiras, moran gos, batatas, tomateiros e semelhantes. Verificou-se que células de P. syringiae podem provocar a nucleação do gelo e a formação de pequenos cristais de gelo quando se encontram presentes em substâncias alimentares durante o congelamento. Além dis so, a patente de Invenção Norte-Americana Número 4200228 descre ve um processo que utiliza esses organismos na fabricação de ne ve, enquanto que o Pedido de Patente Internacional WO 83/03831 descreve a transformação de certos microrganismos hospedeiros com ADN que codifica a formação da proteína de nucleação de gelo a fim de produzir agentes microbianos para utilização na ini bição de super-arrefecimento.

No entanto, embora as leveduras e outros fungos tenham sido considerados como hospedeiros preferíveis nos métodos acima referidos, apenas E. coli e organismos naturais tais como P. syringiae são especifioamente mencionados. Não há assim qualquer menção específica a quaisquer microrganismos hos pedeiros que possam ser utilizados na prática como aditivos de materiais biológicos para ingestão, tais como alimentos.

P. syringiae é um membro do género Pseudomonas . Certas espécies deste género são patogénicas, por exemplo, o agente patogénico humano P. aeruginosa. Sabe-se também que certas estirpes de P. syringiae são agentes patogénicos para cer tas plantas. Semelhantemente, certas estirpes de E. coli são agentes patogénicos humanos bem conhecidos. Por consequência, não seria aconselhável a sua utilização como aditivos de alimen tos. Mesmo quando utilizados sob a forma de células mortas, há sempre perigo de a morte ser incompleta e de se verificar a sub sequente proliferação dos organismos sobreviventes durante a ar mazenagem e a descongelação dos alimentos e esses microrganismos não estão incluidos nas listas de organismos designados por GRAS (geralmente considerados como seguros) no Código de Regu lamentos Federais Norte-Americanos, Vol. 21, parte 170 a 199, Abril de 1986, publicado pela Imprensa Oficial do Governo Norte

-Americana.

A presente invenção baseia-se no conceito de se isolar o gene responsável pela expressão de uma proteína de nucleação de gelo em P. syringiae e em outros organismos e a uti lização deste num vector apropriado para transformar os organis mos que se encontram indicados na lista como microrganismos GRAS, quer na forma viva> quer na forma morta, em relação a ali mentos, como aditivos para alimentos ou outros materiais biológicos ingeríveis.

De acordo com um aspecto da presente invenção, proporcionam-se aditivos para promover a nucleação do gelo em materiais biológicos ingeríveis, a temperaturas inferiores a 0°C que compreendem uma proteína capaz de promover a citada nucleação de gelo por acção de microrganismos GRAS transformados por um vector que possui um ou mais genes que codifica a expressão da referida proteína ou por fracções dos mencionados microrganismos .

De acordo com um outro aspecto da presente in venção, proporcionam-se materiais biológicos ingeríveis que pos suem um ou mais dos referidos aditivos de acordo com a presente invenção.

De acordo com um outro aspecto da presente in venção, proporciona-se um processo para promover a nucleação de gelo em materiais biológicos ingeríveis de acordo com o qual es tes materiais são tratados com um ou mais aditivos de acordo com a presente invenção.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um processo para a congelação de materiais biológicos ingeríveis em que os referidos materiais são tratados com um ou mais aditivos de acordo com a presente invenção e a sua temperatura é depois baixada para se efectuar a congelação. Essas temperaturas estão convenientemente compreendidas dentro do intervalo de -5 a -20°C.

Os alimentos que podem ser vantajosamente tra tados de acordo com a presente invenção incluem hortaliças, fru ta, peixe, carne, pratos congelados preparados, gelados, massas congeladas, sumos congelados e alimentos liofilizados. Os produtos farmacêuticos de interesse incluem materiais liofilizados e fracções de sangue, tais como crioprecipitados.

A expressão GRAS (Generally Regarded as Safe = geralmente considerados como seguros), tal como é utilizado na presente memória descritiva, tem as significações referidas nos Regulamentos Federais Norte-Americanos acima citados. Esses microrganismos incluem leveduras, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou carlsbergensis, bactérias do ácido láctico, por exemplo, Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, etc., ba ctêrias do vinagre e certos fungos filamentosos, por exemplo, Aspergillus species.

Os microrganismos podem, ser utilizados sob a forma de células completas ou sob a forma das suas fracções. Verificou-se que as células completas são eficazes mesmo quando a proteína de nucleação do gelo está retida dentro das células.

Em alguns casos, no entanto, pode ser vantajoso fragmentar as células e utilizar apenas as fracções que possuem a proteína activa, por exemplo, fragmentos das paredes celulares.

Os microrganismos são transformados por um ve ctor apropriado para a finalidade. Em geral, utilizam-se plasmí deos quando se transformam hospedeiros procarióticos tais como bactérias. As leveduras podem ser transformadas com plasmídeos que podem, no entanto, ser concebidos de maneira a integrar o gene activo no ADN cromossõmico.

ADN que codifica a proteína de nucleação de gelo pode ser obtido a partir de organismos de ocorrência natural, tais como P. syringiae, P. fluorescens, P. coronafasciens, Xanthiomonas translucens ou Erwinea herbicola. Como variante, o ADN pode ser sintetizado com base em genes que já foram sequen4 ciados, por exemplo, INAW (R. L. Green e G. J. Warren, Nature,

Vol. 317, 1985, páginas 645 - 648) e INAZ (G. J. Warren d col.,

Nucleic Acids Research, Vol. 14, NQ 20, 1986, páginas 8047-8060) ou as sequências genéticas descritas na presente memória descri tiva.

•?**w*iRew

O gene isolado pode ser proporcionado com sítios de restrição terminais apropriados que permitem que ele se ja inserido num vector apropriado parao hospedeiro pretendido.

Assim, quando o hospedeiro pretendido é uma levedura, por exemplo, Yp42, um vector plasmídeo apropriado é pDP34 (patente Europeia Número 89810297.5-) utilmente modificado, por exemplo, o plasmídeo que contém o vector pUCl9 de E. coli, o plasmídeo de levedura completa de 2 micron e dois marca dores auxotróficos seleccionáveis de levadura, por exemplo, o gene URA3 para transformação fácil e escolha de pequeno número de cópias do plasmídeo na levedura e o alelo dLEU2 do gene LEU2 para induzir um grande número de cópias.

Deve notar-se que se deve garantir que o codão iniciador seja o primeiro ATG do gene visto que a levedura utiliza sempre o primeiro ATG que encontra para iniciar a trans lação e, se for necessário, podem cortar-se quaisquer ATG 5' do ATG real.

Os plasmídeos podem então ser utilizados para transformar uma estirpe apropriada de levedura e seleccionados pela presença dos marcadores auxotróficos.

A Requerente descobriu que as estirpes de levedura transformadas como se descreveu acima não produzem sempre a proteína de nucleação de gelo numa forma acessível e que é desejável incluir uma sequência de sinal da levedura para mar car a proteína de maneira a pertencer à superfície da célula. Essa sequência pode, por exemplo, ser a sequência de sinal PHO5 . (B. Wjeeh e col., Nucleic Acids Research, Vol. 12, NQ 20, 1984, páginas 7721 - 7739) ou a sequência principal pré-pro de factor ί

alfa (J. Kurjan e I. Herskowitz, Cell 30, 1982, páginas 933 - 943). A Requerente descobriu ainda que quando se utiliza a sequencia líder de factor alfa, uma sequencia de ligaçao está preferivelmente presente entre a sequência de péptido pré-pro e o gene de interesse, por exemplo, o ligador de 8 aminoácidos no factor alfa natural.

É também possível marcar a proteína de nuclea ção de gelo num organelo específico dentro da célula, por exemplo, o vacúolo. Para esta finalidade, pode ser introduzida a se quência pré-pro de carboxipeptidase Y (CPY) visto que esta proteína se sabe que se dirige para o vacúolo.

Lactococcus lactis é um microrganismo de grau alimentar particularmente seguro e aceitável, por exemplo, a es tirpe LMO 230. Um plasmídeo apropriado para utilização na trans formação deste organismo é pSCl2vN, que consiste no vector pUC18 de E. coli, o gene de resistência à eritromicina não indutível do plasmídeo pVA838 (ver a referência bibliográfica 1, abaixo) e um plasmídeo de L. lactis origem da replicação. No entanto, este necessita a incorporação de um promotor em adição ao gene de interesse e a Requerente descobriu que o promotor tacll modificado é particularmente útil. Uma maneira mais directa para a expressão em L. lactis consiste em utilizar o promotor de um gene de L. lactis tal como o gene de fosfo-Zp-galactosidase da estirpe Z268 (referência 2).

1. (B. Brigitte e col., Gene 62, 1988, 249 - 261).

2. (F. L. Macrina e col., Gene 19, 1982, 345 - 353).

Os seguintes micorganismos foram depositados na National Culture of Industrial and marine Bactéria, Aberdeen Escócia, em 24 de Outubro de 1989, sob os seguintes números de acesso:

S.cerevisiae L. lactis E. coli

Yp42

LM0230

BZ234(PUC21ENA3)

NCIMB 40215 NCIMB 40216 NCIMB 40217 microrganismo Ε. coli NCIMB 40217 acima men cionado foi transformado com o plasmídio PUC21ENA3, referido na presente memória descritiva mais adiante.

Os seguintes Exemplos são apresentados apenas a título ilustrativo:

EXEMPLOS

Exemplo 1

Isolamento de Pseudomonades de Nucleagão de Gelo

Recolheu-se uma amostra de folhas e flores com cerca de 15 gramas, obtidas a partir de plantas das florestas próximas do Nestlé Research Cebtre, Vers-chez-les-Blanc, e colo cou-se num balão para agitação de 500 ml esterilizado. Adiciona ram-se 100 ml de peptona esterilizada (0,1%), fosfato (50 mM, pH 7) e agitou-se o balão a 300 rotações por minuto, a 30°C, du rante uma hora.

Retirou-se o líquido e os detritos das células e as bactérias foram separadas sob a forma de fase sólida por centrifugação a 10.OOOrotações por minuto durante cinco minutos. Rejeitou-se o líquido sobrenadante e ressuspendeu-se o pelete em 10 ml de tampão de peptona/fosfato. Deste, placaram-se cinco partes alíquotas de 0,04 ml em placas de agar de Kings suplementadas com 40 microgramas/mililitro de ciclo-heximida e 0,1% de cetramida e incubaram-se â temperatura ambiente durante quarenta e oito horas.

As placas são importantes e são razoavelmente específicas de Pseudomonas (a ciclo-heximida destrói os fungos e os seus esporos germinantes e a cetrimida é um detergente bio lógico que mata a maior parte das bactérias excepto as Pseudomonas) .

As placas continham dois tipos básicos de coEnsaio de Congelação de Gotícula Qualitativo Padrão

-5°C.

Cinquenta gotículas de 10 microlitros de volu me são colocadas numa barquinha de alumínio revestida com parafina e colocadas na superfície de um banho de álcool a uma temperatura previamente escolhida. A barquinha é temporizada para 1 minuto e regista-se o número de gotículas congeladas. Este nú mero é expresso como percentagem de gotículas congeladas àquela temperatura. Na Figura 1, está representada graficamente a comparação dos resultados obtidos com ãgua (A), meio M17 (B),meio

M17 mais LM0230 com plasmídio pSCVl2vN (C) e meio M17 mais LMO230 com plasmídio pDPl35 (D), em que a percentagem das gotículas congeladas é representada no eixo das ordenadas em função da temperatura (°C) representada no eixo das abcissas.

Ensaio de Congelação de Gotículas Quantitativo Padrão

Este ensaio baseia-se nos cálculos de G. Vali (J- Atmos. Sei. 28, 1971, 402 - 409) para a quantificação de substâncias de nucleação de gelo.

Um ensaio padrão compreende tomar 1 ml de cul tura e peletizar as células por centrifugação durante dois minutos. Rejeita-se o meio de cultura e ressuspendem-se as células em 1 ml de meio de TE (10 mM de tris, 1 mM de EDTA, pH 7,0).

Preparam-se diluições em serie ate 10 a partir desta suspensão em TE. Pipetam-se 10 gotículas de cada diluição para uma barquinha dealumínio revestida com parafina e coloca-se a barquinha num banhode água/álcool a uma temperatura inferior a 0°C prèviamente excolhida. Depois de três minutos, regista-se o número de gotículas congeladas e a sua posição na série de diluição. 0 número de núcleos de gelo a esta temperatura é calculada de acordo com a equação de Vali

10^

N(t) = ln —-— x —— (1-f) V

lónias. 0 primeiro tipo é constituído por colónias de pequenas dimensões e forma um enquadramento geral de colónias individuais enquanto sobreposto sobre ele estavam as colónias do segundo ti po de maiores dimensões (assim torna-se impossível dizer que uma colónia de grandes dimensões não estava contaminada com uma pequena) .

Duas das placas foram ensaiadas relativamente ã presença geral de actividade de nucleação de gelo (INA) lavan do as células para fora das placas com 5 ml de tampão de peptona/fosfato e submetendo-as ao ensaio de congelação de gotas.

Este ensaio necessita de uma barquinha de alu mínio revestida com parafina (obtida lavando uma com solução a 1% de cera de parafina (sólida) em xileno a superfície do alumí nio e deixando que o xileno seevapore). Colocaram-se gotas de 10 microlitros dos líquidos de lavagem da placa na barquinha de alumínio, em conjunto com o controlo, a -9°C e congelou-se. Ambas as lavagens das placas congelaram reprodutivelmente sob estas condições dentro de trinta segundos, enquanto os controlos congelam apenas ocasionalmente, se congelarem mesmo. Repetiu-se este ensaio ã temperatura mais crítica de -5°C em que os líquidos de lavagem das placas congelam de novo rápida e reprodutivelmente, enquanto os controlos nunca congelam a essa temperatu ra. Isto confirma a presença de bactérias com INA nestes produtos isolados.

Das restantes placas, retiraram-se trezentas colónias individuais com palitos esterilizados para placas de microtitulação e desenvolveram-se à temperatura ambiente durante três dias. Gotículas de 10 microlitros foram então transferi das com uma pipeta de canais múltiplos para uma barquinha de alu mínio revestido com parafina e colocadas a -5°C. Destas, identi ficaram-se dez bactérias com INA, uma com. actividade fraca. Purificaram-se duas destas, INA5 θ INA7, de maneira a obterem-se culturas puras, como determinado pela placagem das células em colónias simples e tomando cinquenta clones aleatoriamente e en saiando-as relativamente à actividade de nucleação -de gelo a

na qual

N(t) é o número de núcleos de gelo àquela temperatura determinada;

f é a fracção de gotículas congeladas;

D é o número de diluição na série; e

V é o volume da gotícula em mililitros.

Este valor é em seguida normalizado para a concentração das células e finalmente expresso como o logaritmo deste número. Esta é um cálculo quantitativo para uma substância de nucleação de gelo e baseia-se na congelação ordenada na série de diluição, isto é, quando a temperatura desce, primeira mente congelam as gotículas não diluídas, seguindo-se a série . ~ -1 . .

de diluição 10 e assim sucessivamente. Este ensaio nao pode ser utilizado facilmente para quantificar o cingelamento de ãgua pura, que é essencialmente um processo aleatório. Por consequên cia, isto significa o uso do ensaio qualitativo para estas soluções sem nucleação de gelo.

Isolamento de ADN Cromossomático

Inocularam-se 100 ml de meio de King com INA5 e INA7 e desenvolveram-se a 30°C durante uma noite. Centrifugaram-se as células a 10.000 rotações por minuto durante cinco mi nutos e rejeitou-se o líquido sobrenadante. Ressuspenderam-se as células em 5 ml de tri 50 mM, EDTA 50 mM de pH 8,0, 0,5 ml de uma solução fresca de 10 mg/ml delisózima em tris 250 mM de pH 8,0 e incubou-se em gelo durante quarenta e cinco minutos. A esta solução, adicionou-se 1 ml de STEP (0,5% de SDS, 50 mM de tris, pH 7,5, 0,4 M de EDTA e 1 mg/ml de proteinase K) e incubou-se a 60°C durante três horas.

Extraiu-se duas vezes com 7 ml de mistura de fenol/clorofórmio na proporção de 1:1 e separaram-se as fases por centrifugação. Adicionaram-se 15 ml de etanol para precipitar o ADN e o líquido foi cuidadosamente despejado. Dissolveu10

-se o ADN em 5 ml de tris 10 mM de pH 8,0, 10 mM de EDTA, 0,1 mg/ml de RNase com incubação a 60°C durante duas a três horas (este processo é uma solubilização e o tratamento de RNase conjuntos) . Precipitou-se novamente o ADN com 10 ml de etanol e separou-se o ADN (a massa de ADN foi retirada enrolando-a em vol ta de um palito de encontro ã parede do tubo). Dissolveu-se este ADN em 5 ml de tris 10 mM de pH 7,5 e 0,1 mM de EDTA, obtendo-se uma solução de cerca de 1 mg/ml.

Clonação do Gene de INA

Oligo 17 é um oligonucleõtido misto baseado num motivo de oito aminoácidos de sequência repetida que é conservada tanto em INAZ e INAW [de p. siringae (R. L. Green e G.

J. Warren, Nature, Vol. 317, 1985, páginas 645 - 648) e p. fluo rescens (G. J. Warren e col., Nucleic Acids Research, Vol. 14,

NQ 20, 1986, páginas 8047 - 8060, respeotivamente] e repetida quase trinta vezes em cada caso (veja-se abaixo:

AGYGSTQT Ala Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Thr

TTTTTTA 23 mero

5'GCC GGC TAC GGC AGC ACC CAG AC 3'

G G G G

AA A A 1024 misto ..

Efectuaram-se digestões de restrição analíticas de ADN tanto de INA5 como de INA7 e separaram-se os fragmen tos por electroforese em gel de agarose. Transferiu-se em segui da este para membrana de nylon Zetaprobe e hibridizaram-se com Oligo 17 radioactivamente quinasado (T. Maniatis e col., Molecu lar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1982). Depois de se lavar, o filtro foi submetido a auto-radiografia a -70°C com um alvo de intensificação durante seis horas. A auto-radiografia mostrou alguma hibridização de fundo não específica, mas também bons sinais.

Primeiramente, tanto INA5 como INA7 são idênticos. Os tamanhos dos fragmentos são os seguintes (INAZ dentro de parênteses); Saci 7 kb (?), Saci + BglII 6 kb (3,4 kb), BglII 16 - 19 kb (muito grande), BglII + EcoRI 5 kb (5kb), EcoRI 9 kb (23 kb), EcoRI + Pvul 7 kb (3,75 kb), Pvul 8 kb (?) e Sall) 1 kb (1 kb). Por consequência, muito embora os fragmentos EcoRI + BglII e Sall sejam os mesmos, a maior parte dos outros digestos de restrição é diferente.

Decidiu-se clonar o fragmento de 5 kb, BglII + EcoRI, num vector pUC e seleccionou-se com Oligo 17. Digeriram-se 60 microgramas de ADN INA5 com as enzimas de restrição BglII e EcoRI e separaram-se os fragmentos em gel de agarose a 0,7%. A área do gel que contém os fragmentos com os tamanhos de 4,4 - 4,5 kb foi cortada do gel e electro-eluída. Clonou-se essa mistura no plasmídio pUC21 [um plasmídio baseado em pUC19 (G. Yanisch-Perron e col., Gene 33, 1985, páginas 103 - 119)com uma disposição de clonação alternativa criada com oligonucleótidos sintéticos e que é clonado em pUC19 digerido com BamHI - Saci], procedendo da seguinte maneira (a sequência de aminoácidos madura do gene LacZ é representada na linha superior; a sequência de ADN e o seu complemento estão representados nas duas linhas do meio; os sítios de reconhecimento da enzima de restrição são representados na linha inferior. Os oligonucleóti dos sintéticos estão representados em letras maiusculas):

Thr

Met

Ile

Thr

Pro

Ser

Leu His

Ala

Cys

Arg

Ser

Thr

5'

atg

acc

atg

att

acg

cca

age

ttg cat

gee

tgc

agg

tgc

act

3'

tac

tgg

tac

taa

tgc

ggt

teg

aac gta

cgg

acg

tcc

acg

tga

<

Hind3 X Sphl X

PstI X

Sall X

Leu

Glu

Asp

Pro

Arg

Vai

Pro Ala

Leu

Ala

Asp

Leu

Ser

Arg

eta

gag

GAT

CCA

CGC

GTG

CCG GCG

CTA

GCA

GAT

CTC

TCG

AGG

gat

ctc

eta

gGT

GCG

CAC

GGC CGC

GAT

CGT

CTA

GAG

AGC

TCC

Xbal X BamHI X MlUI X Nael X Nhel X BglII X Xhol X

Ser	Ser	Asn	Ser	Leu
AGC	Tcg	aat	tea	ctg
tcg	age	tta	agt	gac
Saci	X	EcoRI >

Exemplo de Ligação

0,4 pmole (1 microlitro) de pUC21 digerido com BglII - EcoRI,

1,5 pmole (3 microlitros) de fragmento de BglII - EcoRI INA5 purificado, microlitros de tampão TE (Tris 10 mM de pH 7,5, EDTA 1 mM).

Misturam-se bem num tubo de microcentrifugação; depois aquece-se a 56°C durante dois minutos.

Adicionam-se 2 microlitros de 10 x T4 ADN ligase em tampão [tris 660 mM de pH 7,5, MgCl₂ 50 mM, ditiotreitol (DTT) 50 mM, 10 mM de adenosina-5’-trifosfato (ATP), 200 mi crogramas/mililitro de albumina de soro bovino (BSA)]. Adiciona-se 1 microlitro = 1 unidade de T4 ADN ligase. Mistura-se bem e incuba-se a 4°C durante três a quatro horas.

Exemplo de Células Competentes de E. coli

Inoculam-se 100 ml de meio de YT (8 g/1 de triptona Bacto, 5 g/1 deextracto de levedura Bacto, 5 g/1 de NaCl) com 1 ml de cultura fresca de células BZ234 realizada durante a noite.

Incuba-se a cultura a 37°C até se atingir a densidade óptica a 600 nm = 0,4.

Peletizam-se as células numa centrífuga a 10.000 rotações por minuto durante cinco minutos.

Regeita-se o líquido sobrenadante e ressuspende-se o pelete num volume igual de CaCl₂ 50 mM esterilizando a 4°C.

Incuba-se em gelo durante 20 minutos.

Peletizam-se as células a 10.000 rotações por minuto durante cinco minutos.

Rejeita-se o líquido sobrenadante e ressuspende-se em 1/10 do volume original de 50 mM de CaC^; 20% de glicerol.

Estas células de E. coli estão agora competen tes e podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser congeladas a -70°C para uso futuro.

Transformação

Coloca-se uma amostra alíquota de células competentes (100 microlitros) num tubo de vidro esterilizado previamente arrefecido.

Adiciona-se ao tubo o resultado da reacção de ligação acima referida e mistura-se bem.

Incuba-se em gelo durante vinte minutos.

Aquece-se a 22°C durante dois minutos.

Estas células podem agora ser placadas directamente em placas selectivas (como no caso da selecção com ampi cilina) ou adicionam-se 500 microlitros de meio de YT e incuba-se a 37^0 durante duas horas (como no caso da seleccção com ca namicina e eritromicina).

Destas placas de transformação selectivas, pi caram-se oito placas de microtitulação de colónias (768). Repli claram-se estas em filtro de nylon Zetaprobe, colocado numa pia ca de agar com YT suplementado com ampicilina e desenvolveu-se a 37°C durante a noite. Submeteram-se estas colónias a lise directamente sobre os filtros e hibridizaram-se com Oligo 17 radioactivamente quinasado. Depois de se lavar, submeteram-se os filtros a auto-radiografia à temperatura ambiente durante quarenta e cinco minutos, para identificar dez clones que se hibri dizam:

ΕΝΑ = Actividade

Placa β

7 de Nucleação de

Posição

Fl

F2

H9

D5

F6

A3

C8

C6

E10

BI

Gelo de E. coli

ENA

9

Verificou-se que todas estas colónias congelam a -5°C, usualmente dentro de vinte a trinta segundos, enquanto os controlos não congelam ao fim de dez minutos.

Fizeram-se preparações de ADN em pequena esca la a partir de todos os 10 clones e dirigiu-se o ADN com EcoRI e BglII (as enzimas foram utilizadas para cionar o gene e que deviam libertar um únuco inserto de 4,5 kb e o vector de plasmí dio de 2,7 kb). ENA 4 e 10 mostraram a presença de duas bandas inseridas e foram portanto postas de lado. As digestões analíti cas mostraram que ΕΝΑ 1 e 6 continham misturas de plasmídios. Com base nestes dados, escolheu-se ENA 3 para análise posterior O plasmídio pUC21/ENA3 é representado diagramaticamente na Figu ra 2A dos desenhos anexos; a Figura 2B representa um mapa de restrição do gene ENA3.

Construiu-se um mapa extensivo de restrição do plasmídio ENA3 como ponto de partida. Este mostrou que há considerável mas não perfeita homologia entre o inserto ENA3 e o gene INAZ publicado de Pseudomonas syringiae. O mapa de restrição foi utilizado para a subclonação extensiva do inserto ENA3 e a subsequente análise da sequência de ADN destes subclones.

Sequenciou-se o fragmento completo BglII-EcoRI e verificou-se que contém 4446 pb, nomeadamente doze pares de bases mais curto do que o gene INAZ publicado. Há duas insersões/supressões menores de um nucleótido, ambas fora da sequência de codificação da proteína. Estas são a inserção de um resi duo G a bp 594 no gene de ENA3 e a supressão de um nucleótido a bp 4396. Uma supressão mais importante ocorre aproximadamente a bp 1168 - 1179, com a supressão de doze pares de bases que preserva a estrutura da leitura da proteína (uma supressão de quatro aminoácidos). Isto ocorre a um motivo de sequência repetida 4 x de AACGCC'. Mais provavelmente, estas repetições são responsáveis pela supressão.

As duas sequências de P. syringae mostram uma homologia global de cerca 93% (determinada pelo programa de melhor adaptação de UWGCG) ao nível de ADN sendo a maioria das al terações as modificações usuais T—>C e G —> A. Ao nível da proteína, a homologia sobe para cerca de 98%. As modificações são a supressão de quatro aminoácidos e mais trinta e sete substituições de aminoácidos, das quais apenas treze são conservativas.

Exemplo 2

Expressão de ENA3 em Levedura

Uma importante primeira operação para a expresão do gene de nucleação de gelo ENA3 em levedura ê a remoção dos dois ATG que ficam imediatamente (14 bp e 8 bp) junto de 5¹ da ATG real. Isto é necessário porque a levedura toma sem pre a primeira ATG que encontra depois da iniciação de mARN, o que neste caso teria como resultado um péptido com quatro ami noácidos de comprimento e portanto originava muito pequena quan tidade de proteína de nucleação de gelo. Uma segunda consideração é a adição de um sítio de restrição útil para ajudar a adição dos promotores da levedura e/ou da sequência de sinal.

Construção do ENA3 - term.

Digeriu-se o plasmídio ENA3 com a enzima de restrição EcoRI e a parte suspensa 5' foi preenchida com enzima de Kleenow. Subsequentemente, digeriu-se com BglII e Pvul e, em seguida, resolveram-se os fragmentos de ADN num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 4,5 kb e electroeluiu-se. 0 plasmídio pUC21/LYS2-term2 (resultados obtidos por R. D. Pridmora, não pu blicados) é o vector de E. coli, pUC21, que contém o terminador bidireccional de levedura LYS2 (U. N. Fleig e col., Gene 46, 1986, pãginas 237 - 245). Digeriu-se este plasmídio com Nhel e reparou-se a parte suspensa 5' de Klenow (Maniatis e col.). Em seguida digeriu-se com PstI e separaram-se os fragmentos num gel de agarose a 2%. Cortou-se o fragmento com 190 pb e electro eluiu-se. Misturaram-se estes dois fragmentos com o vector pk 19 digerido com PstI e BamHI (R. D. Pridmore, Gene 56, 1987, pá ginas 309 - 312) e ligou-se.

Ensaiaram-se inicialmente os transformantes relativamente ã actividade de nucleação de gelo. Um destes foi ainda caracterizado por análise com enzima derestrição para con firmar o plasmídio pkl9/ENA3-term. que estã representado diagra maticamente na Figura 3A dos desenhos anexos. A Figura 3B repre senta um mapa de restrição de ENA3-term. em que LYS2T representa o terminador bidireccional LYS2 de levedura.

Digeriu-se então este plasmídio com as enzimas de restrição Aatll e Saci e purificou-se em gel o fragmento de 5 kb e desfosforilou-se (Maniatis e col.). Este fragmento foi preparado para aceitar as futuras construções do promotor-ENA3 5'.

Construção de pDP105

A construção de pDPlO5 envolve o isolamento de um fragmento de ADN a partir do sítio de restrição Taql, cer ca de +8 bp a partir de ATG do gene ENA3, para o sítio de res

trição Sphl, cerca de +185 pb. A sequência de ADN de ATG e o gene ENA3 até ao sítio de restrição Taql é substituído por oligonucleótidos sintéticos que também adicionam os novos sítios das enzimas de restrição EcoRI e Ndel 5' do ATG.

plasmídio AC1 ê um subclone de ENA3 que con tém um fragmento Sphl de 750 pb que cobre o promotor e ATG. Digeriu-se ECl com as enzimas de restrição Sphl e Taql, separaram-se os fragmentos em gel com 2% de agarose e cortou-se o fra gmento de 180 pb e electro-eluiu-se. Misturou-se este fragmento com os oligonucleótidos sintéticos 124 e 125 e ligou-se ao vector de clonação pUC19 digerido com EcoRI e Sphl. Identificaram-se os plasmídios que possuem o inserto correcto por análise de restrição e finalmente confirmaram-se por análise de sequência de ADN. Isto coloca a restrição 5' de AcoRI e Ndel e a sobreposição de ATG respectivamente.

A sequência de ADN em volta de ATG do gene ENA3 mostra o sítio de restrição de Taql:

Taql

175 bp 'ATGCTGTAÃTGAATATCGACAAA³'................

₃,TACGACATTACTTATAGCTGTTT ,................ Sphl

A sequência de ADN dos oligonucleótidos utilizou como ligadores:

< Ndel >

<EcoRI> ^Taql

5'AATTCATÃTGAATAT³'

3ιGTATACTTATAGC51

Adição do Promotor GAPDH

Prepararam-se e ensaiaram-se duas construções do promotor GAPDH. O fragmento de HindIII de 2 kb contendo o ge ne GAPDH completo (J. P. Holland e M. J. Holland, The Journal

of Biological Chemistry, Vol. 258, NQ 19, 1979, páginas 9839 - 9845) foi fornecido por Ciba Geigy. Cortou-se o gene com HindIII e transferiu-se para o vector pKl9 de E. coli. Construiram-se duas supressões para encurtat o promotor digerindo o plasmídio com Smal (cortando dentro do sistema do ligador pH19) e ou com SnaBI (424 pb) ou com SSpI (646 pb), originando todas as enzimas extremidades embotadas compatíveis, todas auto-religadas. Isto originou comprimentos do promotor de GAPDH de 600 pb e 400 pb respectivamente para os plasmídios pKl9/GAPDH-dSna e pKl9/GAPDH-dSsp.

Isolaram-se os promotores dSna e dSsp procedendo da seguinte maneira:

Digeriram-se os plasmídios com a enzima de res trição AsuII e a suspensão 5' encheu-se com enzima de Klenow.

Em seguida digeriu-se com Saci e separaram-se os produtos num gel com 1% de agarose. Cortaram-se as bandas de ADN com o tamanho correcto e electro-eluiu-se o ADN para fora do fragmento de gel.

Digeriu-se o plasmídio pDP105 com a enzima de restrição EcoRI e preencheu-se a parte suspensa com enzima de Klenow. Em seguida digeriu-se com Sphl e separaram-se os fragmentos em gel com 2% de agarose. Cortou-se o fragmento correcto de 200 pb para fora do gel e electro-eluiu-se.

Ligou-se o fragmento pDPlO5 ENA3 5’ ADN aos dois promotores em paralelo com o vector pUC19 de E. coli digerido com Saci e Sphl. Isso originou os plasmídios pDP106 (dSsp) e pDPlO7 (dSna).

Digeriram-se os plasmídios pDP106 e pDPlO7 com as enzimas de restrição Sphl e Saci e separaram-se os fragmentos num gel de agarosa. Cortaram-se respectivamente os fragmentos de 550 pb e de 750 pb do gel e electro-eluiram-se. Digeriu-se o plasmídio ENA3 com as enzimas de restrição Aatll e Sphl e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 1,3 kb do gel e electro-eluiu-se. Misturou-se este fragmento ENA3 5’ de 1,3 kb AatXI - Sphl com os fragmentos isolados pDP106 e 107 separadamente e com o fragmento pkl9/ENA3-term Aatll - Saci 5 kb previamente preparado e ligaram-se. A partir deste, identificaram-se os plasmídios pDPlO8 e pDPlO9, respectivamente.

Promotores GAPDH/CAT

Construiu-se uma segunda linha de promotores que também continha um promotor de E, coli entre o promotor de levedura GAPDH e o gene ENA3. Isto fez-se para facilitar a selecção das construções relativamente à sua actividade antes de se terem transformado na levedura. O promotor de E. coli escolhido era o do gene da resistência a cloranfenicol de Tn9 (N.

K. Alton e D. Vapnek, Nature 282, 1979, páginas 864 - 869). Tam bém, para evitar a incorporação de sequências indesejadas de E. coli na construção, sintetizou-se o promotor e utilizou-se como ligador entre o promotor GAPDH e o gene ENA3 da seguinte forma:

AsuII

GAPDH ⁵'ttCGAATTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCT promotor 31aagcTTAAAAACTCAATAGCTCTAAAAGTCCTCGA

EcoRI Ndel

AAGGaattcatatg³' ENA3 TTCCTTAAgtatao51 gene

As letras maiusculas denotam as que foram sin tetizadas, sendo a cadeia superior Oligo 141 e a cadeia inferior Oligo 142.

Purificaram-se estes oligonucleótidos como é usual, depois secaram-se e redissolveram-se de maneira a obter-se uma concentração de 300 picomoles por microlitro. Misturaram-se 300 picomoles de cada um dos oligonucleótidos com um volume de 10 microlitros de tampão de hibridização (150 mM de

NaCl, 100 mM de tris de pH 8,0 e 1 mM de EDTA). Aqueceu-se em seguida esta mistura a 95°C durante cinco minutos e depois incu bou-se a 55°C durante a noite para hibridizar os dois oligonucleótidos complementares.

Isolaram-se também os seguintes fragmentos de ADN. Digeriram-se os plasmídios pKl9/GAPDH-dSsp e pKl9/GAPDH-dSna com as enzimas de restrição AsuII e Saci e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortaram-se os fragmentos de 400 bp e 600 bp do gel e electroeluíram-se. O plasmídio pDP108 foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Aatll e isolou -se o fragmento do ADN com 1,5 kb do gel. Misturou-se este fragmento pDP108 de 1,5 kb com os dois fragmentos AsuII - Saci GAPDH individualmente, o fragmento purificado pkl9/ENA3-ter de 5 kb Saci - Aatll e o ligador AsuII - EcoRI (promotor de CAT) e ligou-se. Ensaiaram-se os transformantes tanto por análise de restrição de preparações em pequena escala de ADN, como por actividade de nucleação de gelo e sequenciamento de ADN. Estes correspondiam exactamente originando os plasmídios pDPllO (dSs$ e pDPlll (dSna).

Transferência para o Plasmídio de Expressão em Levedura

O plasmídio de expressão em levedura utilizado para ensaiar estas construções foi fornecido pelo Departamen to de Biotecnologia da Ciba-Geigy. Este ê o plasmídio pDP34-Xho (pDP34 veja-se o Pedido de Patente Europeia 89810297.5-, A modificação Xho é pDP34 digerido com Saci e BamHI e os oligonucleótidos usados para fazer pUC21 adicionados ver página 8) que consiste no vector pUC19 de E, coli, no plasmídio de 2micron completo da levedura e dois marcadores auxotróficos de levedura seleccionáveis. 0 primeiro é o gene URA3 para a transformação fácil e a selecção de pequeno número de cópias do plasmídio na levedura e, em segundo lugar, o alelo dLEU2 do gene de LEU2 para um grande número de cópias induzido.

Digeriu-se o plasmídio pDP34-Xho com as enzi21

mas de restrição Saci e Mlul. Também se digeriram os plasmídios pDP108, 109, 110 e 111 com as enzimas de restrição Saci e MulI. Ligou-se o plasmídio pDP34 aos quatro digestos de plasmídios in dividualmente e transformou-se em E. coli. Escolheram-se os transformantes em placas de ampicilina para escolher o plasmídio pDP34.

Identificaram-se por análise de restrição os plasmídios pDO112 (contendo a construção ENA3 de pDP108), pDP113 (109) , pDPH4 (110) e pDPH5 (111) . Os plasmídios pDPH4, pDP115 e pDP34-Xho estão representados diagramaticamente nas Figuras 4A, 5A e 6 dos desenhos anexos respectivamente. Os mapas de restrição de ENA-110 (de pDPUO) e de ENA-111 (de pDPlll) estão representados nas Figuras 4B e 5B, em que P representa o promotor e T representa o terminador.

Transformação da Levedura

Inocúlam-se células de levedura de uma cultura realizada durante a noite em meio de YPD (1% de extracto de Bacto-levedura, 2% de Bacto-peptona, 2% de dextrose) e cultivam -se durante a noite a 30°C.

Interrompe-se a cultura a cerca de ϋΟθθθ=2,0.

Peletizam-se 50 ml de suspensão de células a 3.000 rotações por minuto durante cinco minutos.

Rejeita-se o líquido sobrenadante e lavam-se as células com 50 ml de tampão TE.

Ressuspendem-se as células em 20 ml de acetato de lítio 1 M (em TE).

Incuba-se a 30°C durante noventa minutos com ligeira agitação por sacudimento.

Peletizam-se as células a 3.000 rotações por

minuto durante cinco minutos.

Rejeita-se o líquido sobrenadante e ressuspen dem-se as células em 1 ml de LiOAc 1 M.

Fazem-se tomas alíquotas de 200 microlitros de células competentes mais 1 micrograma de ADN.

Incuba-se a 30°C durante 10 minutos.

Junta-se 1 ml de solução de PEG a 50% (em TE).

Mistura-se e incuba-se a 30°C durante sessenta minutos.

Sujeita-se a choque térmico a 42°C durante cinco minutos.

Peletizam-se as células em microcentríguga com centrifugação durante cinco segundos.

Rejeita-se o líquido sobrenadante.

Ressuspendem-se as células em 300 microlitros de sorbitol 800 mM e placam-se em placas selectivas.

Expressão do Gene ENA3 em Levedura

Transformaram-se os plasmídios pDP112, pDP113, pDPH4 e pDP115 na estirpe de levedura YP42 (genotipo; , ura3-52, his4-580, leu2), como se descreveu acima. Seleccionaram-se os transformantes em meio de SD (0,67% de Bacto base azotada de levedura sem aminoácidos, 2% de dextrose) em placas de agar mínimas suplementado com histidina (20 mg/litro) e leucina (30 mg/litro) a 30°C. Picaram-se as colónias transformadas nas mesmas placas selectivas duas vezes para colónias únicas para puri ficar os transformantes. Utilizaram-se as colónias de cada cons trução de plasmídio para inocular culturas em meio de YPD de

plasmídio para inocular culturas em meio de YPD que foram desenvolvidas a 30°C com agitação. Desenvolveram-se estas até ao início da fase logarítmica, ϋΟ^θθ aproximadamente igual a 1,0 e peletizaram-se as células, etc. Os espectros de nucleação de gelo de YP42 mais plasmídios pDPH4 e pDPH5 são representados diagramaticamente nas Figuras 7 e 8 dos desenhos anexos. Estas Figuras representam log (núcleos de gelo/célula) marcados nas ordenadas graficamente em função da temperatura de superarrefecimento (°C) em abcissas para o meio de YPD.

Também se desenvolveram YP42 mais plasmídios pDP114 e pDPH5 em meio de SD2 (0,67% de Bacto-a base de azoto de levedura sem aminoácidos, 0,5% de ácidos de casamino, 2% de dextrose e 50 mM de citrato de sódio de pH 6,0) a 30°C, com agi tação. Os correspondentes espectros de congelação em meio de SD2 estão representados nas Figuras 7 e 8 dos desenhos anexos.

Construção de pDPl40

O plasmídio pDO133 é descrito mais adiante. Digeriu-se este plasmídio com as enzimas de restrição MluI e Saci, misturou-se com pDP34-Xho digerido com MluI e Saci e ligou-se. Transformou-se este plasmídio em células de E. coli com petentes e escolheram-se os transformantes em placas de YT suplementado com ampicilina. Seleccionaram-se as colónias por con gelação e anãlise de enzimas de restrição para se obter o plasmídio pDPl40 que é representado diagramaticamente na Figura 9 A dos desenhos anexos. A Figura 9B representa um mapa de restrição de ENA-133 (de pDPl33), no qual P representa o promotor e T representa o terminador.

Transformou-se pDP140 em YP42 como se descreveu acima. Cultivaram-se as colónias em meio SD2 a 30°C, com agitação. 0 espectro de congelação de YP42 mais plasmídio pDP140 está representado na Figura 10 dos desenhos anexos.

Preparação e Adição do Promotor UBI4

material de partida é o plasmídio KS+/UBI4 da firma Ciba-Geigy, que consiste no fragmento Saci genómico de 6 kb da estirpe de levedura do tipo natural S288C contendo o ge ne UB14 (E. Ozkaynak e col., The EMBO Journal, Vol. 6, NQ 5, 1987, 1429 - 1439), clonado no sítio de Saci do plasmídio de Bluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems, USA).

Digeriu-se o plasmídio KS+/UBI4 com as enzimas de restrição HindIII e BglII, resolveram-se os fragmentos num gel de agarose, cortou-se a banda de 1 kb e electroeluiu-se Digeriu-se o plasmídio Bluescript SK+ (Stratagene Cloning Systems, USA) com as enzimas de restrição HindIII e BglII. Juntaram-se os dois fragmentos de ADN um com o outro, ligaram-se e transformaram-se em células de E. coli competentes. Seleccionaram-se os transformantes em placas de meio de YT suplementado com ampicilina, analisou-se por digestão com enzimas de restrição e identificou-se o plasmídio BAI. Infectou-se então a estir pe de E. coli que contém o plasmídio BAI com o fago auxiliador M13/K07 de acordo com as instruções da firma Stratagene e recuperou-se a forma com uma única cadeia de BAI a partir do sobrenadante. Purificou-se este para utilização posterior.

promotor UBI4 foi modificado por mutagénese específica com oligonucleótidos de sítio dirigido para introduzir um sítio de restrição de EcoRV directamente antes da ATG para o gene UBI4 seguinte:

5' 3' actttaactaatagattATGcagattttcgtcaa

_.AACTAATAGATATCGCAGATTTTCG_r.

< > 5'

EcoRV em que a sequência superior é o gene UBI4 genómico à volta do ATG (indicado com as letras maiusculas superiores) e a sequen cia inferior (em letras maiusculas) é o Oligo 166 utilizado para a mutagénese (sendo o novo sítio de restrição de EcoRV indicado na parte inferior).

A mutagénese fez-se com o sistema de mutagênese in vitro dirigido para o oligonucleótido, Versão 2 (Amers

ham, Grã-Bretanha) de acordo com as instruções do fabricante.

Os transformantes foram escolhidos em placas de YT suplementado com ampicilina, analisados com enzima de restrição EcoRV e o plasmídio SK+/UBI4-EcoRV identificado.

Digeriu-se o plasmídio pDP108 com a enzima de restrição Ndel e a parte suspensa preenchida com enzima de Klenow. Este foi em seguida digerido com a enzima de restrição Aatll e os fragmentos resolvidos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de ADN com 1,5 kb do gel e electro-eluiu-se. Digeriu-se o vector do plasmídio pGEM7 (Promega, Estados Unidos da América) com as enzimas de restrição HindIII e Aatll. Misturaram-se o vector pGEM7, o promotor UBI4 e o fragmento de ADN pDPlO8 5' ENA3 e ligaram-se. Esta ligação foi transformada em células de E. coli competentes e placadas em placas de YT suplementado com ampicilina. Analisaram-se os transformantes e identificou-se o plasmídio BFl.

Digeriu-se o plasmídio BFl com enzimas de res trição Saci e Aatll, resolveram-se os fragmentos num gel de aga rose e electro-eluiu-se o fragmento com 2 kb. Misturou-se este com o fragmento pK19/ENA3-term. de 5 kb previamente descrito, purificado com Saci - Aatll e desfosforilado e transformou-se em células de E. coli competentes. Seleccionaram-se os transfor mantes em placas de meio de YT suplementado com canamocina e analisaram-se por digestões com enzima de restrição, congelação e sequenciamento de ADN, para se obter o plasmídio pDP118.Trans feriu-se então o inserto ENA3 de pDPH8 para o vector de expres são de levedura pDP34 para se obter o plasmídio pDPl20. 0 plasmídio pDP120 é representado diagramaticamente na Figura 11A dos desenhos anexos. A Figura 11B representa um mapa de restrições de ENA-118 (de pDP118), em que P e T respectivarnente representam o promotor e o terminador.

Transformou-se o pDP120 em YP42 como se descreveu acima. Cultivaram-se as colónias em meio de SD2 a 30°C, com agitação. 0 espectro de congelação de YP42 e mais pDP120 es

tá representado na Figura 12 dos desenhos anexos, em que se representa graficamente a variação de log (núcleos de gelo/célula) em função do superarrefecimento (°C).

Marcação com Objectivo do Gene ENA3 em Levedura

Para melhorar o objectivo da proteína de nucleação de gelo^e potencialmente a sua expressão fenotípica, a Requerente fez construções com sequências de sinal de levedura natural fundidas com a extremidade amino da proteína ENA3. Escolheram-se duas, a sequência de sinal PHO5.(B. Wajeeh e col., Nucleic Acids Research, Vol. 12, NQ 20, 1984, páginas 7721 -7739) e a sequência condutora pré-pro de factor alfa (J. Kurjan e I. Herskowitz, Cell 30, 1982, páginas 933 - 943).

Sequência de Sinal PHO5

Conseguiu-se a sequência de sinal PHO5 pela síntese de dois oligonucleótidos complementares que actuam como ligador, enquanto contêm as sequências de aminoãcidos requeridas seguintes (os oligonucleótidos sintéticos estão indicados em letras maiusculas):

kkkkkkkk

EcoRI met phe lys ser vai vai tyr ser ile leu ala ala ⁵ gAATCAA ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT ₃,cttaaGT TAC AAA TTT AGA CAA CAA ATA AGT TAA AAT CGG CGA sítio do sinal de clivagem

ser	leu	ala	asn	ala	gly	MET
TCT	TTG	GCC	AAT	GCA	GGt	atg³'	ENA3 gene
AGA	AAC	CGG	TTA	CGT	CCA	^Tac5’

O oligonucleótido superior é Oligo 174 (59 meros) e o inferior é Oligo 175 (57 meros). Estes dois oligonucleótidos foram misturados um com o outro em aproximadamente quantidades equimolares e hibridizados numa solução com um ele vado teor de sal. Misturaram-se estes oligonucleótidos hibridi

zados com os seguintes fragmentos purificados: o pKl9/ENA3-term.

de 5 kb, fragmento digerido com Saci e Aatll, purificado em gel e desfosforilado; o fragmento pDPlll de 700 bp, digerido com

Saci e EcoRI e purificado em gel; e o fragmento de pDOlll de

1,45 kb digerido com Ndel e Aatll e purificado com gel.

Ligou-se este e transformou-se em E. coli. Es colheram-se os transformantes inicialmente pela sua actividade em E. coli e depois por análise de enzimas de restrição que ori gina o plasmídio pDP117 e em pDP34 o plasmídio pDPl20. A análise da sequência de ADN mostrou que uma parte do sinal de PH05 era duplicada. Os oito aminoácidos assinalados com asterisco (* ver abaixo) são duplicados que originam a seguinte sequência de sinal:

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13 14	15
met	phe	lys	ser	vai	vai	tyr	ser	met	phe	lys	ser	vai vai	tyr
16	17	18	19	20	21	22	23	24	25
ser	ile	leu	ala	ala	ser	leu	ala	asn	ala	gly	MET	gene	ENA3

sítio de sinal de clivagem

O plasmídio pDPl21 é representado diagramaticamente na Figura 13A dos desenhos anexos. A Figura 13B representa um mapa de restrição de ENA-117 (de pDPll7) em que P, SS e T representam respectivamente o promotor, sequência do sinal e terminador.

O plasmídio pDPl21 foi transformado na estirpe de levedura YP42 e seleccionaram-se as colónias em placas de SD + HIS + LEU, Desenvolveram-se as culturas dos transformantes em meio de SD2 e ensaiaram-se relativamente â sua actividade de nucleação de gelo. O espectro de congelação de ΎΡ42 mais pDP120 é representado na Figura 14 dos desenhos anexos.

Líder de Factor Alfa

O material de partida para o líder de pré-pro

4,

-alfa-factor é o plasmídio líder do factor pUC/PH05-alfa da Ciba-Geigy. Este foi modificado para conter um sítio de restrição de EcoRI, 8 bp do promotor de PH05 seguido por ATG e líder de alfa-factor. A região de clivagem pré-pro foi também modificada com inclusão de um sítio de restrição de BglII no sítio de clivagem KEX2 e um sítio de restrição com PvuII 6 pb antes deste (uma modificação da Chiron Corp.).

Digériu-se o líder do plasmídio pUC/PH05-alfa-factor com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento com 300 pb e electro-eluiu-se. Digeriu-se o plasmídio pDPlll com as enzimas de restrição EcoRI e Saci e separaram-se os fragmentos num gel de sílica. O fragmento com 650 bp foi cortado e ele ctro-eluído. Misturaram-se estes dois componentes do líder de alfa-factor e do promotor GAPDH-dSna-CAT, respectivamente, conjuntamente com pUC19 digerido com as enzimas de restrição Saci e HindIII, ligou-se e transformou-se em E. coli. Analisaram-se os transformantes e identificou-se o plasmídio de guiamento pUC/ /GAPDH-dSna-CAT-alfa fzctor.

Digeriu-se o plasmídio líder de pUC/GAPDH-dSna-CAT-alfa-factor com a enzima de restrição BglII e a suspensão 5' foi preenchida com enzima de Klenow. Digeriu-se então esta com enzima de restrição Saci e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento com 940 pb e electro-eluiu-se o plasmídio pDPlll com a enzima de restrição Ndel e com a saliência 5' preenchida com enzima de Klenow. Digeriu-se então esta com enzima de restrição Aatll e separaram-se os fragmentos em gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 1.400 pb e electro-eluiu-se. Misturaram-se estes dois fragmentos purificados com o fragmento pK19/ENA3-ter de 5 kb, digerido com Saci e Aatll, purificado em gel e desfosforilado. Ligou-se e transformou-se em E. coli.

Seleccionaram-se os transformantes inicialmen te pela sua actividade de nucleação de gelo e, em segundo lugar,

por anãlise com enzima de restrição e, finalmente, por análise de sequência de ADN, para identificar o plasmídio pDP126.

Transferiu-se então o inserto para pDP34 a fim de ensaiar em levedura, originando-se o plasmídio pDP129, que é representado diagramaticamente na Figura 15A dos desenhos anexos. A Figura 15B representa um mapa de restrição de ENA-126 (de pDP126) em que Ρ, T e L representam, respectivamente, promo tor, terminador e líder. Transformou-se o plasmídio pDP129 na . estirpe de levedura YP42 como se descreveu acima. Utilizaram-se os transformantes para inocular culturas em meio de SD2 e incubaram-se a 30°C, com agitação. 0 espectro de congelação de YP42 mais plasmídio pDPl29 está representado diagramaticamente na Fi gura 16 dos desenhos anexos, em que se representa graficamente log(núcleos de gelo/célula) em função do superarrefecimento (°C)

Líder de Alfa-Factor Mais Ligador

A informação recente sobre a utilização do lí der de alfa-factor para a produção de proteínas recombinantes em levedura implicou um requisito adicional. No factor alfa-natural, o péptido pré-pro ê seguido por um ligador de oito amino ácidos e, em seguida, pelo péptido do factor alfa. 0 arranjo li gador-factor alfa é repetido cinco vezes no gene e os ligadores são removidos durante o processamento do factor alfa. A informa ção implica que o ligador deva ser adicionado depois do guiador pré-pro e antes do gene que interessa. Isso realizou-se com auxílio de oligonucleótidos sintéticos como ligadores para inserir oa aminoãcidos requeridos.

Digeriu-se o plasmídio pUC/líder de GAPDH-dsna-Cat-factor alfa com as enzimas de restrição Saci e BglII e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento com 940 bp e electro-eluiu-se. Digeriu-se o plasmídio pDPlll com as enzimas de restrição Ndel e Aatll e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 1.400 . pb e electro-eluiu-se. Misturaram-se os dois fragmentos purifi- 30 -

cados com os dois oligonucleótidos 208 e 209 hibridizados e o fragmento pKl9/ENA3-term Saci - Aatll descrito previamente ligou-se e transformou-se em E. coli.

Seleccionaram-se os transformantes por digestões com enzimas de restrição e por análise de sequência de ADN para identificar o plasmídio pDPl27, que também apresenta actividade de nucleação. Tranferiu-se o inserto para o plasmídio de expressão de levedura pDP34 originando o plasmídio pDPl30, que está diagramaticamente representado na Figura 17A dos desenhos anexos. A Figura 17B representa um mapa de restrição de ENA-127 (de pDP127) em que Ρ, T e L representam respectivamente o promo tor, terminador e líder + ligador. Transformou-se o plasmídio pDP130 em YP42 como se descreveu acima. Usaram-se os transformantes para inocular culturas de meio SD2 e desenvolveu-se a 30°C com agitação. O espectro de congelação de YP42 mais plasmí dio pDPl30 está representado na Figura 18 dos desenhos anexos, na qual se representa graficamente log(núcleos de gelo/célula) em função do superarrefecimento (°C).

Os casos acima descritos apenas adicionam uma sequência de sinal de levedura natural à proteína ENA3 e podem ou não auxiliar a marcação da proteína para as membranas, prova velmente por intermédio do retículo endoplásmico.

Uma vez que a proteína entre no- retículo endoplãsmico, o percurso de falha é o da secreção para fora da célula ou possivelmente no nosso caso, a inserção na membrana exterior. No caso presente, marcou-se como alvo da proteína ENA3 um organelo específico dentro da célula, nomeadamente o vacúolo.

A proteína carboxi-peptidase Y (CPY) é dirigi da para o vacúolo XL. A. Valls e col., Cell 48, 1987, páginas 887 - 897) numa prê-pro forma que é processada dentro do vacúolo por proteinase B (o produto do gene PEP4). Também se mostrou que as sequências necessárias para a marcação estão localizadas dentro da sequência de guiamento pré-pro. Por consequência, in31

seriu-se esta na frente da proteína ENA3.

material de partida é o plasmídio pBR322/ /PH05-pré-pro CPY da firma Ciba-Geigy. São necessários oligonucleótidos sintéticos como ligadores específicos entre o promotor GAPDH/CAT e o sítio de restrição natural StuI aproximadamen te 35 bp no pre-péptido CPY:

EcoRI .StuI.

MetLysAlaPheThrSerLeuLeuCysGlyLeuGlyLeu ⁵'gAATTCATATGAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGGACTAGGcctg³' ₃,cttaaGTATACTTTCGTAAGTGGTCAAATGATACACCTGATCCggac₅ι

Os oligonucleótidos sintetizados estão representados em letras maiusculas e são Oligo 206 (superior) e Oligo 207 (inferior).

Digeriu-se o plasmídio pBR322/PH05-pre-pro-CPY com as enzimas de restrição HindIII e StuI e separaram-se os fragmentos em gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 800 pb, electro-eluiu-se a mistura com os Oligos 206 e 207 hibridizados e o plasmídio pUC19 digerido com EcoRI e HindIII e ligaram-se em conjunto. Transformou-se este em E. coli e selecciona ram-se os transformantes por análise com enzima de restrição pa ra se obter o plasmídio pUC19/CPY(p-p). Digeriu-se o plasmídio pUC19/CPY(p-p) com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII, resolveram-se os fragmentos em gel de agarose e cortou-se o fragmento com 340 pb e electro-eluiu-se. Misturou-se este fragmento com pUC18 digerido com EcoRI e HindIII, ligou-se e transformou-se em E. coli competente. Seleccionaram-se as colónias e identificou-se o plasmídio pUC18/pre-pro-CPY.

Digeriu-se o plasmídio pUC18/pre-pro-CPY com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII e resolveram-se os produtos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 350 bp e ele ctro-eluiu-se. Para este efeito, adicionou-se o promotor de 680 bp Sal EcoRI GAPDHdSna/CAT purificado em gel do plasmídio pUC19 digerido com Saci e HindIII do plasmídio pDPUO e transformaram

-se em E. coli competente. Seleccionaram-se as colónias e identificou-se o plasmídio pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY.

Digeriu-se o plasmídio pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY com a enzima de restrição Sall e a saliência foi preenchida com enzima de Klenow. Em seguida digeriu-se esta com Saci e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 750 bp e electro-eluiu-se. Digeriu-se o plasmídio pDPlO8 com a enzima de restrição Ndel e asaliência foi preenchida com enzima de Klenow. Em seguida digeriu-se esta com Aatll e resolveram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 1.500 pb e electro-eluiu-se. Misturaram-se estes dois fragmentos isolados com o fragmento previamente descrito pKl9/ENA3-term, de 5 kb, digerido com Saci e Aatll, purificado com gel e desfosforilado, ligou-se e transformou-se em E. coli competente. Seleccionaram-se as colónias por análise com enzima de restrição e por congelação, ambas as quais identi ficaram os mesmos plasmídios, pDPl36.

Transferiu-se o inserto do plasmídio pDP136 para o plasmídio pDP34 deexpressão de levedura para originar o plasmídio pDP143, que é representado na Figura 19A dos desenhos anexos. A Figura 19B representa um mapa de restrição de ENA-136 (de pDP136) em que P e T representam respectivamente o promotor e o terminador.

Transformou-se o plasmídio pDPl43 em YP42 como se descreveu acima. Usaram-se os transformantes para inocular culturas demeio de SD2 e incubaram-se a 30°C com agitação.

espectro de congelação de YP42 mais plasmídio pDP143 está representado na Figura 20 dos desenhos anexos, em que se represen ta graficamente log(núcleos de gelo/célula) em função do superarrefecimento (°C).

Exemplo 4

Expressão em Lactococcus lactis

Experimentou-se sem sucesso a expressão do ge

ne ENA2 a partir do seu promotor natural de Pseudomonas natural (dados não representados), muito embora as importantes regiões

-35 e -10 sejam muito semelhantes ao promotor de fosfo-beta-galactosidase de Lactococcus lactis (B. Boiset e col., Bene 62,

1988, 249 - 261) (dados não representados).

Mas o que pode ter importância é a presença de um possível líder de mARN de 60 - 65 pares de bases directamente antes da ATG de iniciação. A Requerente verificou isto construindo um promotor híbrido com as sequências -35 e -10 do promotor ENA3 e o potencial líder do promotor de fosfo-beta-galactosidase. Isto fez-se com utilização dos oligonucleótidos co mo se mostra em seguida:

AsuII |-35 | |-10 | < Oligo 186 ttCGAATGCTTGATAAGTGCGCTGGTTTTATTTAAAGGAT ,aagcTTACGAACTATTCACGCGACGAAAATAAATTTCCTA ^J < . Oligo 187 .

20 30 40

X Oligo 214 X

CTAGGAATTTTCCATTTCCTTGGTTTTCAGAACACAGAAT GATCCTTAAAAGGTAAAGGAACCAAAAGTCTTGTGTCTTA

X . Oligo 217

60 70

Ndel

Oligo 215 >

CTCGTCTCAAATGCTTTTTTTGAAAGGACTTACACAtatg⁰

GAGCAGAGTTTACGAAAAAAACTTTCCTGAATGTGTATac,., X .Oligo 216. ? .

100 110 120 par de bases 1 a 45 é o promotor ENA3 modificado. 0 par de bases 46 a 115 é a correspondente sequência do gene de fosfo-beta-galactosidase. A partir do par de bases 146 a 120, segue-se o sítio de reconhecimento para a enzima de restrição Ndel, incluindo a ATG para o gene ENA3. Os oligonucleó

tidos sintéticos estão representados em letras maiusculas.

Os oligonucleótidos foram quinasados e hibridizados uns com os outros como se descreveu. Digeriu-se o plasmídio pDPlO8 com as enzimas de restrição Ndel e Aatll e separaram-se os fragmentos num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 1,5 kb contendo a extremidade 5' do gene ENA3 e electro-eluiu -se. Misturou-se este fragmento de ADN com o oligonucleótido sintético acima mencionado, o fragmento do promotor de levedura de 600 pb Saci - AsuII antes descrito a partir de pK19/GAPDH-dSna e o fragmento de 5 kb purificado com Saci - Aatll e fosfotasado de pKl9/ENA3-term. e ligou-se. Transformou-se esta ligação em células de E. coli competentes e placou-se em placas de YT suplementadas com canamicina. Seleccionaram-se os transformantes por digestões com enzima de restrição, actividade de nucleação de gelo e sequenciamento de ADN, para identificar o plasmídio pDP133.

Digeriu-se o plasmídio pDPl33 com as enzimas de restrição AsuII e Xbal e separaram-se os fragmentos num gel de agarose e cortou-se o fragmento com 3,5 kb e electro-eluiu-se.

O plasmídio pSC12vN é uma construção da firma Ciba-Geigy que consiste novector de E. coli, pUC18, o gene de resistência â eritromicina não induzível do plasmídio pVA838 (F. L. Macrina e col., Gene 19, 1982, páginas 345 - 353) e um plasmídio de Lactococcus lactis origem de replicação, isolado nos seus laboratórios.

Digeriu-se pSC12vN com as enzimas de restrição Ciai e Xbal e tratou-se com fosfatase alcalina para eliminar a religação deste vector. Misturaram-se o fragmento INAZGal-ENA3 ADN e o pSCl2vN digerido com Ciai e Xbal e ligaram-se. Transformaram-se estes em E. coli e seleccionaram-se as colónias por análise com enzimas de restrição e por actividade de nuclea • ção de gelo.

Isso identificou o plasmídio pDP135. Os plasmídios pSC12vN e pDP135 estão representados diagramaticamente nas Figuras 21 e 22A dos desenhos anexos, em que L. lactis o si gnifica origem em L. lactis. A Figura 22B representa um mapa de restrição de ENA-133 (de pDP133) em que P e T representam respectivamente promotor e terminador.

Transformação da Estirpe LMO23Q de Lactococcus lactis

Utilizou-se uma cultura durante a noite de L. lactis LMO230 em M17G (meio M17 mais 0,5% de glucose)para um inóculo a 1% em meio de M17G fresco. Desenvolveu-se este a 30°C até uma densidade óptica (ΏΟ^θθ) igual a aproximadamente 0,4 e peletizaram-se as células por centrifugação a 10.000 rotações por minuto durante cinco minutos. Rejeitou-se o líquido sobrena dante e ressuspenderam-se as células num volume igual de.tampão de PS (fosfato de Na 7 mM de pH 6,6, sacarose 0,5 molar) a 4°C. Peletizaram-se de novo as células e finalmente ressuspenderam-se em 1/100 do volume de tampão de PS e armazenaram-se em gelo até ã sua utilização (células competentes).

Conseguiu-se a transformação usando um Biorad TM

Gene Pulser em associaçao com o controlador de impulsos e com cuvetes de impulsador de genes com uma folga entre eléctrodos igual a 0,2 cm.

Misturaram-se 100 microlitros de células competentes com um volume de 1 a 4 microlitros de ADN ou em água ou em tampão de TE e em seguida pipetaram-se para o fundo da cu vete previamente arrefecida. Pulsou-se a amostra a 2.000 volts com uma resistência de 400 ohms. Retirou-se então a amostra da cuvete para uma microcentrifugadora esterilizada e colocou-se em gelo. Finalmente peletizaram-se as células numa microcentrífuga durante um minuto, ressuspenderam-se em 300 microlitros de meio M17G e incubaram-se durante uma hora a 30°C. Placaram-se então as células em placas de M17G suplementado com 4 microgramas/mililitro de eritromicina e incubou-se a 30°C durante a noi te.

Transformou-se o plasmídio pDPl35 na estirpe

LMO230 de E. coli como se descreveu acima. Usaram-se os transformantes para inocular culturas de meio M17G suplementado com agitação até se obter uma ϋΟθθθ aproximadamente igual a 1,0.

Ensaiaram-se estas culturas como jã se descre veu e representaram-se graficamente os resultados. O espectro de congelação de LMO230 mais o plasmídio pDP135 estão representados na Figura 23 dos desenhos anexos, na qual se representa graficamente log(núcleos de gelo/célula) em função do superarre fecimento (°C)

Promotor de P-/3 -Gal

Uma tentativa mais directa para a expressão de genes estranhos em L. lactis consiste em utilizar o promotor de um gene de L·. lactis conhecido. Um desses genes publicados é o de fosfo-beta-galactosidase da estirpe Z268. A síntese fez-se como se indica seguidamente:

AsuIIj < Oligo 220 X # Oligo 221 ⁵ ttCGAACAACAGTTTGATTAATAAATTTGTAAAAGTTATTTGAGACGAGATCACTCATT ₃,aagcTTGTTGTCAAACTAATTATTTAAACATTTTCAATAAACTCTGCTCTAGTGAGTAA < Oligo 222 χ

X # Oligo 215

CCATTTCCTTGGTTTTCAGAACACAGAATCTCGTCTCAAATGCTTTTTTTCAAAGGACTT

GGTAAAGGAACCAAAAGTCTTGTGTCTTAGAGCAGAGTTTACGAAAAAAACTTTCCTGAA Oligo 217 X Oligo 216 |NdeI

7* 3 · ACACAtatg⁰TGTGTATag₅!

Sintetizaram-se e purificaram-se os seis oli37

gonucleótidos como é usual. Num tubo de microcentrífuga mistura ram-se 100 picomoles de cada oligonucleõtido e adicionaram-se os 5'-fosfatos usando a enzima T4-polinucleótido-quinase e ('f -³²P)ATP como doador de fosfato. Estes oligonucleótidos foram então hibridizados uns com os outros como se descreveu.

Digeriu-se o plasmídio pJDC9 (J-D. Chen e D.

A. Morrison, Gene 64, 1988, 155 - 164) com as enzimas de restri ção Saci e HindIII e tratou-se também com fosfatase alcalina. Digeriu-se o plasmídio pDPlO8 com as enzimas de restrição Ndel e HindIII e separaram-se os fragmentos num gel de agarose e cor tou-se o fragmento com 3,85 kb que contém o gene ENA3 completo e o terminador LYS2 e electro-eluiu-se. Misturou-se este fragmento de ADN com pJDC9 digerido com HindIII - Saci, a mistura de oligonucleótidos e o fragmento promotor de levedura de 600 pb previamente purificado com Saci - AsuII a partir de pKl9/ /GAPDH-dSna e ligou-se. Transformou-se depois este em células de E. coli competentes, expressou-se durante duas horas a 37°C em 500 microlitros de meio de YT fresco, placou-se em placas de YT suplementado com 100 microgramas/mililitro de eritromicina a 37°C durante a noite.

As colónias foram inicialmente seleccionadas por análise com enzima de restrição e relativamente à actividade de nucleação de gelo e, finalmente, por sequenciamento de ADN Este processamento originou o plasmídio pDP137 que contém duas supressões de pares de bases simples dentro do promotor sequenciado (marcado com = veja-se acima).

Digeriu-se o plasmídio pDP137 com as enzimas de restrição AsuII e Xbal e separaram-se os fragmentos de ADN num gel de agarose. Cortou-se o fragmento de 3,95 kb e electró-eluiu-se o ADN. Misturou-se este fragmento com o plasmídio pSC12vN digerido com Xbal - Ciai, anteriormente descrito, ligou -se e transformou-se em E. coli competente. Seleccionaram-se as colónias por actividade de nucleação de gelo e análise com enzi ma de restrição para identificar o plasmídio pDPl48 que é repre

sentado diagramaticamente na Figura 24A dos desenhos anexos, na qual L. lactis o significa origem de L. lactis. A Figura 24B re presenta um mapa de restrição de ENA-137 (de pDPl37) no qual P e T representam, respectivamente, promotor e terminador.

Transformou-se o plasmídio pDP148 em LMO230, como se descreveu acima. Usaram-se os transformantes para inocu lar culturas de meio M17G suplementado com 4 microgramas/milili tro de eritromicina e desenvolveram-se a 20°C, com agitação.

espectro de congelação de LMO230 mais o pias mídio pDPl48 estã representado na Figura 25 dos desenhos anexos na qual se representa graficamente log(núcleos de gelo/célula) em função do superarrefecimento (°C).

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã Processo para a preparação de aditivos para alimentos que promovem a nucleação de gelo em materiais biológi cos ingeríveis, a temperaturas inferiores a 0°C, compreendendo uma proteína capaz de promover a referida nucleação de gelo, transportada por micro-organismos geralmente considerados como seguros (GRAS) transformados por um vector de expressão que pos sui um ou mais genes que codificam a expressão da mencionada pro teína ou por fracções dos citados micro-organismos, caracteriza do pelo facto de o referido vector ser um plasmídio que compreende, na estrutura de leitura correcta, um vector de clonação e ADN que codificam a mencionada proteína capaz de promover a nucleação de gelo e,no caso de um micro-organismo GRAS de leveduru, substancialmente o plasmídio de 2 micron da levedura comple ta, pelo menos um marcador aoxotrófico seleccionável da levedura e o alelo dLEU2 do gene LEU2 e, no caso de um micro-organismo GRAS de Lactococcus, adicionalmente um gene de resistência a eritromicina não indutível e um promotor do plasmídio lactocõ39 cico e origem de replicação.

- 25 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofacto de o referido vector de clonação ser um vector de clonação de E. coli.

- 35 Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o mencionado vector, no caso de se empregar um micro-organismo GRAS de levedura, incluir uma se quência de sinal de levedura para produzir uma proteína de fusão marcada para a superfície da célula de levedura.

4§ Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência de sinal de levedura ser a sequência PHO5 ou a sequência líder de pre-pro de factor alfa.

- 55 Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo:facto de a sequência do factor alfa ser separa da do ADN que codifica a proteína de nucleação de gelo por uma sequência de um ligador.

- 6ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o citado vector ser o plasmídio pDP143, como é contido na estirpe NCIMB40215 de S. cerevisiae.

- 7ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido vector, no caso de se empregar um micro-organismo lactocócico GRAS, compreender o promotor de um gene de L. lactis.

- 8ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o mencionado vector, no caso de se em pregar um micro-organismo lactocócico GRAS, ser o plasmídio pDP 148, como é contido na estirpe NCIMB40216 de L. lactis.

Processo para a transformação de uma estirpe de levedura GRAS, caracterizado por se empregar um plasmídio que compreende, na estrutura de leitura correcta, um vector de clonação de E. coli, o ADN que codifica uma proteína capaz de promover a nucleação de gelo a temperaturas inferiores a 0°C, substancialmente o plasmídio de 2 micron de levedura completa, pelo menos um marcador auxotrófico seleccionável de levedura e o alelo dLEU2 do gene LEU2.

- 10® Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o plasmidio ser pDP143.

- llã Processo de acordo com a reivindicação 10, ca racterizado pelo facto de se empregar a estirpe NCIMB42015 de

S. cerevisiae transformada com o plasmidio pDP143.

- 12ã Processo para a transformação de um micro-organismo lactocócico GRAS, caracterizado por se empregar um pias mídio que compreende um vector de clonação, o ADN que codifica uma proteína capaz de promover a nucleação de gelo a temperaturas inferiores a 0°C, um gene de resistência a eritromicina não indutível e um promotor de plasmidio lactocócico.

- 13a Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado pelo facto de o plasmidio ser pDP148.

- 14ã Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado pelo facto de se empregar a estirpe NCIMB42016 de

L. lactis, transformada com o plasmídio pDP148.

- 15â Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado por se empregar o plasmídio pUC21ENA3.

- 16â Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado por se empregar a estirpe NCIMB42017 de E. coli.

- 175 Processo de acordo com as reivindicações 9 ou 12, caracterizado por se empregar um plasmídio em que o vector de clonação é um vector de clonação de E. coli.

- 18ã Processo para a obtenção de materiais biológicos ingeríveis, caracterizado por se incorporar um ou mais aditivos de acordo com a reivindicação 1.

- 19ã Processo para a obtenção de hortaliças, fruta peixe, carne, pratos congelados preparados, gelados, massas congeladas, sumos congelados, produtos alimentares liofilizados, produtos farmacêuticos liofilizados e crioprecipitados de sangue, caracterizado por se incorporar um ou mais aditivos quando preparados de acordo com a reivindicação 1.

- 2Qa Processo para promover a nucleação de gelo em materiais biológicos ingeríveis, caracterizado por se tratar os referidos materiais com um ou mais aditivos quando preparados de acordo com a reivindicação 1.

- 21ã Processo para congelar materiais biológicos ingeríveis, caracterizado por se tratar os mancionados materiais com um ou mais aditivos quando preparados de acordo com a reivindicação 1 e se fazer dosar a temperatura até se conseguir o congelamento.

- 22ã Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por se fazer descer a temperatura para um valor compreendido dentro do intervalo de -5° a -20°C.

- 44 A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 25 de Outubro de 1989, sob o número 8923998.

Lisboa, 24 de Outubro de 1990