DE69722219T2 - Gefrorene nahrungsmittel mit peptid gefrierschutzmitteln - Google Patents

Gefrorene nahrungsmittel mit peptid gefrierschutzmitteln

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Description

    Technischer Bereich der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts, welches AFPs enthält, und Nahrungsmittelprodukte, welche AFPs enthalten.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Frostschutzpeptide (AFPs) sind zum Verbessern der Gefriertoleranz von Nahrungsmitteln vorgeschlagen worden.
  • Frostschutzproteine sind in der Literatur beschrieben worden, siehe zum Beispiel Marilyn Griffith und K. Vanya Ewart in Biotechnology Advances, Vol. 13, Nr. 3, pp. 375-402, 1995. Frostschutzeigenschaften besitzen im Allgemeinen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: thermische Hysterese, Hemmung von Eis-Umkristallisation, Kontrolle von Eiskristallform und Interaktion mit Eiskeimbildnern.
  • Thermische Hysterese ist die am besten bekannte Eigenschaft von AFPs und die Eigenschaft wird normalerweise verwendet, um auf Vorhandensein von AFPs zu testen. Thermische Hysterese ergibt sich aus einer Senkung der augenscheinlichen Gefriertemperatur einer Lösung, welche ein thermische Hysterese wirksames AFP enthält, ohne die Schmelztemperatur zu beeinträchtigen. Die Identifizierung von AFP-Quellen durch thermische Hysterese Tests wird in der Literatur ausführlich beschrieben, siehe zum Beispiel John G. Duman in Cryobiology 30, 322-328 (1993).
  • Die Hemmung von Eis-Umkristallisation ist eine weitere Eigenschaft von AFPs. Diese Wirksamkeit wird auch als Eiskristall- Wachstumssuppression bezeichnet. Diese Eigenschaft kann durch Vergleichen der Eiskristallgröße von Kristallen in Gegenwart von AFP und in Abwesenheit von AFP zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden. Die Anwendung dieses Verfahrens beim Testen von Fisch-AFPs wird in US-Patent 5118792 (DNA Plant Technology Corporation) beschrieben.
  • Eine dritte Eigenschaft von AFPs ist ihre Fähigkeit, die Form von Eiskristallen zu beeinflussen. Diese Eigenschaft stammt von der selektiven Bindung von AFPs an bestimmte Flächen des Eiskristalls und dadurch Begrenzen des Kristallwachstums in bestimmte Richtungen. Die Gegenwart von Eiskristallen mit einer hexagonalen Doppelpyramidenform wird dann als indikativ für die Gegenwart von AFP angesehen. Dieses Verfahren wird zum Beispiel zum Testen der Wirksamkeit von extrazellulären Winterroggen-AFPs in WO-92/22581 (University of Waterloo) beschrieben.
  • Eine vierte Eigenschaft von AFPs ist ihre Fähigkeit, die Wirksamkeit von eiskeimbildenden Substanzen zu hemmen. Diese Interaktion zwischen AFP und einem Eiskeimbildner kann zum Beispiel erhöhte thermische Hysterese ergeben. Diese Eigenschaft wird zum Beispiel in WO-96/40973 (Universität von Notre Dame du Lac) getestet.
  • AFPs sind zum Verbessern der Gefriertoleranz von Produkten vorgeschlagen worden. Viele Anwendungen sind in diesem Zusammenhang vorgeschlagen worden.
  • Zum Beispiel sind AFPs zum Verstärken der Kryokonservierung von biologischen Materialien vorgeschlagen worden (WO-91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO-91/10361, The Regents of the University of California). Auch sind AFPs zum Verhindern von Lecken aus Liposomen, z. B. in Kosmetika oder Pharmazeutika vorgeschlagen worden (siehe WO-96/20695). Eine weitere mögliche Anwendung ist es, die Gefriertoleranz von Pflanzen durch Einschließen eines AFP darin (oder transgenetischem Produzieren darin) zu erhöhen (siehe J. Cell. Biochem. Suppl. Vol. 14e, 1990, Seite 303 XP002030248, Lee et al. Abstrakt R228). Auch sind Fisch-AFPS zur Verwendung in Nahrungsmittelprodukten vorgeschlagen worden, zum Beispiel in gefrorenen Joghurts oder Eiscreme (US-5620732 Pillsbury und WO-96/11586, HSC Research and Development Limited Partnership).
  • Bis jetzt ist die Verwendung von AFPs jedoch nicht in kommerziellem Maßstab angewendet worden. Die Anmelder sind der Meinung, dass einer der Gründe für das Fehlen von kommerzieller Implementierung ist, dass obwohl viele AFPs beschrieben worden sind, die Implementierung in tatsächlichen kommerziellen Produkten in der Praxis auf ernsthafte Probleme stößt.
  • Die Anmelder haben herausgefunden, dass einer der Hauptgründe für diese Probleme ist, dass aus der großen Anzahl an AFPs, die in der Literatur beschrieben worden sind, nur ein begrenzter Satz an AFPs für jede Anwendung geeignet angewendet werden kann; auch haben die Anwender herausgefunden, dass diese Auswahl an geeigneten AFPs von der gewünschten Anwendung und/oder den zu erreichenden Produktattributen abhängig ist.
  • WO-90/13571 offenbart Frostschutz-Peptide, welche chemisch oder durch Rekombinant-DNA-Techniken hergestellt werden. Die AFPs können in Nahrungsmittelprodukten wie Eiscreme geeignet verwendet werden. Beispiel 3B zeigt modifizierte Eiskristallformen, falls ein Wassereisgemisch in Kombination mit 0,01 Gew.-% AFP, in einen Film gefroren wird.
  • WO-91/10361 offenbart die Verwendung von Frostschutz-Polypeptiden oder Glycopeptiden, hergeleitet aus der Flüssigkeit oder dem Serum von arktischem und antarktischem Fisch.
  • WO-92/22581 offenbart AFPs von Pflanzen, welche zum Kontrollieren von Eiskristallwachstum in Eiscreme verwendet werden können. Dieses Dokument beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum Extrahieren einer Polypeptid-Zusammensetzung aus extrazellulären Räumen von Pflanzen durch Infiltrieren von Blättern mit einem Extraktionsmedium ohne Zerreißen der Pflanzenzellen.
  • WO-94/03617 offenbart die Herstellung von AFPs aus Hefe und ihre mögliche Verwendung in Eiscreme. WO-96/11586 beschreibt durch Mikroben hergestellte Fisch-AFPs.
  • Die vorliegende Erfindung zielt auf das Vorsehen von Lösungen für die obigen Probleme. Insbesondere zielt die Erfindung auf das Vorsehen von gefrorenen Nahrungsmittelprodukten mit einer relativ weichen, jedoch brüchigen Textur, wobei besagte Textur bei verlängerter Lagerung bei niedrigen Temperaturen erhalten bleibt.
  • Überraschend ist herausgefunden worden, dass AFPs bequem in gefrorene Nahrungsmittelprodukte eingeschlossen werden können, um die gewünschten Produkteigenschaften zu ergeben, so lange die Verarbeitungsbedingungen so variiert werden, dass die Eiskristallform bestimmte Anforderungen erfüllt.
  • Entsprechend betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen Nahrungsmittelprodukts, welches AFP umfasst, wobei die Bedingungen so gewählt werden, dass die Eiskristalle in dem Produkt ein Seitenverhältnis von 1,1 bis 1,9 haben.
  • Falls Nahrungsmittelprodukte gefroren werden, werden Eiskristalle im Produkt gebildet. Falls AFPs in den zu gefrierenden Nahrungsmittelprodukten eingeschlossen werden, kann dies zu einer Veränderung in den Eis-Umkristallisationseigenschaften führen. Aggregation der Eiskristalle von AFP-enthaltenden Produkten kann die Brüchigkeit des Produkts verursachen.
  • Viele Konsumenten bevorzugen relativ weiche und brüchige Nahrungsmittelprodukte oder Inhaltsstoffe wie Eiscreme und Wassereis. Zum Beispiel kann weiches Wassereis als attraktiver Inhaltsstoff in gefrorenen Konfektprodukten verwendet werden, auch wird relativ brüchige Eiscreme von einer großen Konsumentengruppe gemocht.
  • Wir haben überraschend herausgefunden, dass AFPs die Möglichkeit bieten, gefrorene Nahrungsmittelprodukte zu formulieren, welche einerseits relativ weich, aber brüchig sind, und andererseits verbesserte Eis-Umkristallisationseigenschaften beibehalten. Die Anmelder haben herausgefunden, dass diese vorteilhafte Kombination an Eigenschaften überraschend erreicht werden kann, falls das Produkt AFPs enthält und ein Seitenverhältnis der Eiskristalle in dem Produkt zwischen 1,1 und 1,9 hat.
  • Das Seitenverhältnis von Eiskristallen ist definiert als der Quotient der Länge und der Breite der Eiskristalle. Ein Seitenverhältnis von zwischen 1,1 und 1,9 entspricht rundlichen Eiskristallen, welche in der Form nicht verlängert sind. Das Seitenverhältnis von Kristallen kann durch jedes geeignete Verfahren bestimmt werden. Ein bevorzugtes Verfahren wird in den Beispielen veranschaulicht. Vorzugsweise liegt der Quotient zwischen 1,2 und 1,8, insbesondere bevorzugt zwischen 1,3 und 1,7.
  • Vorzugsweise sind die gefrorenen Produkte der Erfindung brüchig. Vorzugsweise ist die minimale Schichtdicke, bei welcher Bruchverhalten beobachtet werden kann, geringer als 10 mm, bevorzugter von 1 bis 5 mm. Bruchverhalten kann entweder gemessen werden (durch Herstellen von Schichten mit variierender Dicke und Bestimmen, bei welcher minimalen Dicke Bruchverhalten auftritt), oder aus dem Young-Modulus wie in den Beispielen beschrieben berechnet werden.
  • Während der Formulierung und nachfolgendem Gefrieren von Nahrungsmittelprodukten können mehrere Parameter das Seitenverhältnis der zu bildenden Eiskristalle beeinflussen. Beispiele für Faktoren, welche das Seitenverhältnis beeinflussen, werden unten gegeben. Die Anmelder nehmen an, dass es gut innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns ist, jene Bedingungen so auszuwählen, dass das Seitenverhältnis der Eiskristalle in die gewünschte Bandbreite fällt.
  • Ein Faktor, welcher das Seitenverhältnis von Eiskristallen beeinflusst, ist die Gefriergeschwindigkeit des Produkts. Allgemein gesprochen führt eine Erhöhung der Gefriergeschwindigkeit zu einer Verringerung beim Eiskristall-Seitenverhältnis. In diesem Zusammenhang kann die Gefriertemperatur die Gefriergeschwindigkeit und dadurch das Seitenverhältnis der Eiskristalle beeinflussen. In diesem Zusammenhang werden Gefrierverfahren welche einen Härtungsschritt, z. B. bei einer Temperatur unter -30 Fahrenheit einschließen, manchmal bevorzugt. Die Lagerungstemperatur und Lagerungszeit können gleichermaßen das Seitenverhältnis beeinflussen, wobei höhere Lagerungstemperaturen und/ oder längere Lagerungszeiten dazu neigen, die Bildung von hohen Seitenverhältnissen zu begünstigen.
  • Ein weiterer Faktor, welcher das Seitenverhältnis von Eiskristallen beeinflusst, ist die Beweglichkeit des Produkts während des Gefrierens. Zum Beispiel falls ein flüssiges Wassereis oder Eiscremegemisch gefroren werden soll, wird Ruhegefrieren zu einem ziemlich hohen Seitenverhältnis für die Eiskristalle führen, während Rühren zu einem niedrigeren Seitenverhältnis führt. Hochschermischung wird zu noch niedrigeren Seitenverhältnissen führen.
  • Ein weiterer Faktor, das Seitenverhältnis der Eiskristalle zu beeinflussen, sind die Gegenwart und Mengen an Inhaltsstoffen. Zum Beispiel kann die Gegenwart von Inhaltsstoffen, welche dazu neigen, eine vernetzte Struktur in dem Produkt zu bilden (zum Beispiel Gummi oder Fette) zu einem niedrigeren Seitenverhältnis führen als in Produkten ohne diese Inhaltsstoffe. Auch andere Inhaltsstoffe können zu niedrigeren Seitenverhältnissen führen, zum Beispiel hohe Feststoffgehalte, z. B. können hohe Zuckergehalte zu niedrigeren Seitenverhältnissen führen.
  • Letztendlich kann die Art und Menge an vorhandenen AFPs zu einer Veränderung in Seitenverhältnissen führen. Einige AFPs scheinen die Bildung von niedrigen Seitenverhältnissen zu begünstigen, während andere AFPs höhere Seitenverhältnisse hervorzurufen scheinen. Ein geeigneter Test, um diese AFPs auszuwählen, wird in den Beispielen beschrieben. Variationen in der Menge an AFPs kann zu einer Veränderung der Seitenverhältnisse führen.
  • Gemäß einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen Nahrungsmittelprodukts, welches AFP umfasst, wobei die Formulierung, Gefrier- und Lagerungsbedingungen so gewählt werden, dass die Eiskristalle in dem Produkt ein Seitenverhältnis von 1,1 bis 1,9 aufweisen.
  • Das Verfahren der Erfindung kann auf jedes gefrorene Nahrungsmittelprodukt angewendet werden, welches AFPs enthält. Beispiele für geeignete Produkte sind Saucen, Mahlzeiten usw. Bevorzugte Nahrungsmittelprodukte sind gefrorene Konfektprodukte wie Eiscreme und Wassereis.
  • Die Anmelder haben herausgefunden, dass die AFPs zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung aus einer Vielzahl an Quellen kommen können, wie Pflanzen, Fischen, Insekten und Mikroorganismen. Sowohl natürlich vorkommende Arten können verwendet werden, als auch Arten, welche durch genetische Modifikationen erhalten wurden. Zum Beispiel können Mikroorganismen oder Pflanzen genetisch modifiziert werden, um AFPs zu exprimieren, und die AFPs können dann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Genetische Manipulationsverfahren können verwendet werden, um AFPs wie folgt herzustellen: Eine passende Wirtszelle oder Organismus würde durch ein Genkonstrukt transformiert, das das gewünschte Polypeptid enthält. Die Nucleotidsequenz welche für das Polypeptid kodiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, welcher für die nötigen Elemente zur Transkription und Translation auf solch eine Weise kodiert, dass sie unter passenden Bedingungen exprimiert werden (z. B. in der richtigen Ausrichtung und richtigem Leserahmen und mit passenden Ziel- und Expressionssequenzen). Die Verfähren, welche benötigt werden, um diese Expressionsvektoren zu konstruieren, sind den Fachleuten gut bekannt.
  • Eine Anzahl an Expressionssystemen kann genutzt werden, um die hitzebeständige Polypeptid-kodierende Sequenz zu exprimieren. Dieses schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Bakterien, Hefe, Insektenzellensysteme, Pflanzenzellenkultursysteme und Pflanzen, alle mit den passenen Expressionsvektoren transformiert.
  • Eine große Vielzahl an Pflanzen und Pflanzenzellensystemen kann mit den Nucleinsäurekonstrukten der gewünschten Polypeptide transformiert werden. Bevorzugte Ausführungsformen würden Mais, Tomate, Tabak, Karotten, Erdbeeren, Ölraps und Zuckerrüben einschließen, aber sind nicht darauf beschränkt.
  • Zum Zweck der Erfindung werden bevorzugte AFPs von Fisch hergeleitet. Besonders bevorzugt wird die Verwendung von pflanzlichem Ursprung (z. B. direkt von Pflanzen erhaltene Proteine oder diese Proteine, transgenetisch hergestellt durch andere Organismen), insbesondere hergeleitet von Winterroggen oder mehrjährigen Gräsern.
  • Bei einigen natürlichen Quellen können die AFPs aus einem Gemisch aus zwei oder mehr unterschiedlichen AFPs bestehen.
  • Es werden vorzugsweise jene AFPs gewählt, welche signifikante Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften haben. Ein geeigneter Test zum Bestimmen der Umkristallisationseigenschaften wird in den Beispielen angezeigt. Vorzugsweise sehen AFPs gemäß der Erfindung eine Eispartikelgröße bei Umkristallisation, vorzugsweise wie gemäß den Beispielen gemessen, von weniger als 20 um vor, bevorzugter von 5 bis 15 um. Es wird angenommen, dass die kleine Eiskristallgröße in Verbindung mit dem speziellen Seitenverhältnis besonders vorteilhaft ist, um die wünschenswerten Strukturmerkmale zu erhalten.
  • Eine sehr vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung betrifft Produktformulierungen, welche so ausgewählt werden, dass bei der Herstellung des Produkts Ruhegefrierbedingungen verwendet werden können, während noch das Seitenverhältnis wie oben definiert erhalten wird.
  • Beispiele für solche Nahrungsmittelprodukte sind: gefrorene Konfektgemische wie Eiscremegemische, von welchen beabsichtigt ist, dass sie bei Umgebungs- oder Kühlschranktemperaturen gelagert werden. Geeignete Produktformen sind zum Beispiel: ein Pulvergemisch, welches zum Beispiel in einer Tüte oder in Sachets verpackt ist. Wobei besagtes Gemisch in der Lage ist, die Basis des gefrorenen Nahrungsmittelprodukts zu bilden, z. B. nach Zugabe von Wasser und gegebenenfalls anderen Inhaltsstoffen und gegebenenfalls Belüftung.
  • Ein weiteres Beispiel für ein geeignetes Gemisch könnte ein flüssiges Gemisch (gegebenenfalls belüftet) sein, welches, falls nötig, nach Zugabe von weiteren Bestandteilen und gegebenenfalls weiterer Belüftung gefroren werden kann.
  • Der deutliche Vorteil der oben erwähnten Gemische ist, dass es die Gegenwart des AFP-Inhaltsstoffes den Gemischen ermöglicht, unter Ruhebedingungen eingefroren zu werden, zum Beispiel in einem Laden- oder Haushaltsgefriergerät.
  • Sehr bequem werden diese Gemische in verschlossenen Behältern verpackt (z. B. Kartons, Tüten, Schachteln, Kunststoffbehältern usw.). Für einzelne Portionen wird die Packungsgröße im Allgemeinen von 10 bis 1000 g betragen. Für Mehrfachportionen können Packungsgrößen von bis zu 500 kg geeignet sein. Im Allgemeinen wird die Packungsgröße von 10 g bis 5000 g betragen.
  • Wie oben angezeigt sind die bevorzugten Produkte, in welchen die AFPs verwendet werden, gefrorene Konfektprodukte wie Eiscreme oder Wassereis. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an AFPs von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, basierend auf dem Endprodukt. Falls Trockengemische oder Konzentrationen verwendet werden, kann die Konzentration höher sein um sicherzustellen, dass der Gehalt im fertigen gefrorenen Produkt innerhalb der obigen Bandbreiten ist.
  • Überraschend ist herausgefunden worden, dass Zusammensetzungen der Erfindung sehr geringe Mengen an AFPs enthalten können, während sie noch von guter Qualität sind.
  • Bis jetzt entsprach es der allgemeinen Ansicht, dass ziemlich hohe Gehalte an AFPs erforderlich sind, um eine angemessene Verbesserung der Umkristallisationseigenschaften zu erhalten. Der Grund dafür ist, dass üblicherweise angenommen wird, dass die AFPs auf signifikante Teile der Oberfläche der Eiskristalle einwirken und daher in ziemlich hohen Gehalten vorhanden sein müssen, z. B. 0,01 Gew.-% oder mehr, um eine angemessene Wirkung zu erhalten.
  • Überraschend ist nun herausgefunden worden, dass für gefrorene Produkte verbesserte Umkristallisationseigenschaften und erhöhte Temperaturtoleranz bereits erhalten werden können, falls niedrige Gehalte von AFPs verwendet werden.
  • Überraschend ist herausgefunden worden, dass der Gehalt von AFPs so niedrig wie 0,1 bis 50 ppm sein kann, während noch angemessene Umkristallisationseigenschaften und Temperaturtoleranz in gefrorenen Konfektprodukten vorgesehen wird. Obwohl die Anmelder in keinster Weise durch Theorie gebunden sein wollen kann der Grund dafür sein, dass die Interaktion zwischen den Feststoffen des gefrorenen Konfekts und den AFPs einen hervorragenden Mechanismus zum Hemmen von Kristallwachstum vorsieht. Am günstigsten beträgt der Gehalt an AFP von 1 bis 40 ppm, insbesondere bevorzugt von 2 bis 10 ppm.
  • Zum Zweck der Erfindung schließt der Begriff gefrorenes Konfektprodukt Milch enthaltende gefrorene Konfekte ein, wie Eiscremes, gefrorene Joghurts, Sherbet, Sorbet, Eismilch und gefrorenen Pudding, Wassereis, Granitas und gefrorene Fruchtpürees. Für einige Anwendungen wird die Verwendung von AFPs in gefrorenen fermentierten Nahrungsmittelprodukten weniger bevorzugt.
  • Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Feststoffen in dem gefrorenen Konfekt (z. B. Zucker, Fett, Geschmacksstoff usw.) mehr als 30 Gew.-%, bevorzugter von 40 bis 70 Gew.-%.
  • In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die weichen aber brüchigen, gefrorenen Konfektformulierungen verwendet, um Texturkontrast in Eiskonfekten zu erzeugen. Vorzugsweise enthalten solche Eiskonfekte als trennende Elemente in ihrer Struktur die AFP enthaltende Zusammensetzung gemäß der Erfindung. Zum Beispiel kann ein relativ harter Eiscremekern mit einer dünnen Schicht der Zusammensetzung der Erfindung überzogen werden und dadurch eine relativ weiche, aber brüchige äußere Schicht vorsehen, welche den Eiscremekern umgibt. Eine weitere Ausführungsform könnte der Einschluss der Formulierung der Erfindung als Inklusionen in Eiskonfekten sein. Eine dritte Ausführungsform wäre der Wechsel von Schichten aus Eiscreme mit der Formulierung der Erfindung, um dünne weiche aber brüchige Schichten im Wechsel mit den Eiscremeschichten zu erzeugen.
    • Beispiel 1
  • Isolierung von AFPs aus Winterroggen
  • Winterroggen (der Sorte Halo) wurde im Januar geschnitten (mittlere Temperatur in jenem Monat war 3,5ºC, was die passende Kälte-Akklimatisierung der Pflanzen sicherstellte). Das Gewebe wurde schnell zur weiteren Handhabung ins Labor transportiert und gründlich mit Wasser gewaschen, um Schmutz zu entfernen.
  • 400 g der Abschnitte wurden bei Umgebungstemperatur in einem Waring-Mischer mit 800 g Wasser homogenisiert, bis das Blattgewebe vollständig zerrissen war. Der AFP-reiche Saft wurde durch Filtration durch 4 Schichten Musselin gesammelt.
  • Der AFP-reiche Saft wurden dann einer Temperaturbehandlung durch Sieden des Safts für 10 Minuten unterworfen. Dies verursachte das Ausfällen von Protein während das AFP zur Verwendung gemäß der Erfindung in der Lösung verblieb. Der Flüssigkeitsüberstand wurde durch Zentrifugation bei 15000 g für 20 Minuten oder durch weitere Filtration durch Musselin vom Niederschlag getrennt.
  • Die AFPs können aus dem Flüssigkeitsüberstand durch Gefriertrocknen isoliert werden.
    • Beispiel II
  • Isolierung von AFPs aus Gras.
  • Gemischtes Grasgewebe (welches Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus und Bromus sterilis enthielt) wurde im Januar geschnitten (mittlere Temperatur in jenem Monat war 3,5ºC, was die passende Kälte-Akklimatisierung der Pflanzen sicherstellte). Das Grasgewebe wurde schnell zur weiteren Handhabung ins Labor transportiert und gründlich mit Wasser gewaschen, um Schmutz zu entfernen.
  • 500 g Grasabschnitte wurden in einen 650 Watt Mikrowellenofen platziert und bei voller Kraft für 5 Minuten erhitzt, wodurch die Temperatur auf 85 bis 100ºC erhöht wurde. Die Grasabschnitte wurden dann auf Umgebungstemperatur gekühlt.
  • Nach dem Erhitzungsschritt wurde der AFP-reiche Saft von den Abschnitten durch Filtration abgetrennt. Die Masse wurde kontinuierlich für 5 Minuten in Gegenwart eines gleichen Volumens an Wasser gerührt und dann durch 3 Schichten Musselin gequetscht.
  • Der Flüssigkeitsüberstand kann gefriergetrocknet werden, um das AFP zu isolieren.
    • Beispiel III
  • Ein Vorgemisch zum Herstellen von Eiscreme wurde hergestellt durch Mischen von:
  • Inhaltsstoff Gew.-%
  • Magermilchpulver 11,39
  • Sucrose 3,14
  • Maltodextrin (MD40) 4,00
  • Maissirup 63DE 20,71
  • Butteröl 9,00
  • Monoglycerid (Palmitat) 0,45
  • Vanilin 0,01
  • Johannisbrotgummi 0,07
  • Guar Gum 0,05
  • Carrageen 0,02
  • Mikrokristalline Cellulose 0,24
  • Gelatine 0,14
  • AFP (von Beispiel I*) 0,01 oder keines (Kontrolle) Wasser Ausgleich
  • *Anmerkung: AFP wird als konzentrierte Lösung zugegeben; der Prozentsatz bezieht sich auf Menge an AFP.
  • Dieses Gemisch kann bequem bei Umgebungstemperatur gelagert werden, z. B. in einem Kunststoffbehälter.
  • Das Gemisch kann mit einem herkömmlichen Haushaltsmixer zu einem Überlauf von etwa 100% geschlagen werden, gefolgt von Ruhegefrieren in einem Haushaltsgefriergerät.
  • Nach zwei Monaten Lagerung hat die Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine deutlich bessere Textur als die Kontrollprobe.
    • Beispiel IV
  • Ein flüssiges Vorgemisch für die Herstellung von Eiscreme wurde hergestellt durch Mischen von:
  • Inhaltsstoff Gew.-%
  • Magermilchpulver 10,00
  • Sucrose 13,00
  • Maltodextrin (MD40) 4,00
  • Johannisbrotgummi 0,14
  • Butteröl 8,00
  • Monoglycerid (Palmitat) 0,30
  • Vanilin 0,01
  • AFP (von Beispiel II*) 0,01 oder keines (Kontrolle) Wasser Ausgleich
  • *Anmerkung: AFP wird als konzentrierte Lösung zugegeben; der Prozentsatz betrifft die Menge an AFP.
    • Beispiel V
  • Eiscremes wurden durch Gefrieren und Belüften auf 70% Überlauf der Formulierung gemäß Beispiel IV hergestellt:
  • Proben von beiden Produkten wurden bei -18ºC in einem Prolan-Umgebungsschrank für etwa 12 Stunden äquilibriert. Mikroskop-Objektträger wurden durch Schmieren einer dünnen Schicht Eiscreme von dem Zentrum von dünnen Glasplatten hergestellt.
  • Jeder Objektträger wurde auf einen temperaturkontrollierten Mikroskoptisch (bei -18ºC) übertragen, wo Bilder von Eiskristallen (etwa 400 einzelne Eiskristalle) gesammelt und durch eine Videokamera auf ein Bildlagerungs- und Analysesystem übertragen wurden.
  • Die gelagerten Eiskristallbilder wurden durch Zeichnen entlang der äußeren Begrenzungen manuell belichtet, was dann den gesamten Kristall belichtet. Bilder der belichteten Kristalle wurden dann unter Verwendung der Bildanalyse-Software gemessen, welche die Anzahl an Pixeln zählt, welche notwendig sind, die längste gerade Linie (Länge), kürzeste gerade Linie (Breite), das Seitenverhältnis (Länge/Breite) zu vervollständigen.
  • Das durchschnittliche Seitenverhältnis für die Kristalle wurde berechnet.
  • Für die Kontrollprobe betrug das Seitenverhältnis 1,45.
  • Für die AFP enthaltende Probe betrug das Seitenverhältnis 1,7.
    • Beispiel VI
  • Die Brüchigkeit der Eiscreme von Beispiel IV wurde durch Berechnungen an dem Bruchverhalten der Eiscreme bestimmt. Unter Verwendung einer 3-Punkt Biegungstests wurde der Young-Modulus gemessen.
  • Der Young-Modulus wurde durch Herstellen von Streifen aus Eiscreme, ihr Äquilibrieren für 18 Stunden in einem Gefrierschrank und' Übertragen auf einen Temperaturschrank gemessen. Die Streifen wurden auf ein 3-Punkt Biegegerät platziert, wie in Handbook of Plastics Test Methods (2nd Edition), ed. R. P. Brown, George Godwin Ltd, 1981 beschreiben. Das Testen der Proben wurde unverzüglich bei einer Deformationsgeschwindigkeit von 50 mm/min durchgeführt. Aus der Kraft-Deformationskurve wurde die Anfangsneigung gemessen und verwendet, um den Young-Modulus gemäß der folgenden Gleichung zu berechnen:
  • worin L = Strahlenspanne (110 mm), B = Probenbreite, W = Probenhöhe. Üblicherweise wurden acht Proben getestet, um einen Young- Modulus-Mittelwert zu ergeben.
  • Unter Verwendung der durch Williams & Cawood in Polymer Testing 9, 15-26 (1990) beschriebenen Berechnungen kann die Bruchfestigkeit berechnet werden.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt: Für die Kontrollprobe wurde eine Dicke von 966. m als notwendig berechnet, um eine brüchige Schicht zu erhalten. Für die AFP enthaltende Probe wurde Brüchigkeit (Bruchverhalten) bereits bei einer Dicke von 3 mm gefunden. Dieses zeigt deutlich die verbesserte Brüchigkeit von Produkten der Erfindung. Produkte mit AFP waren relativ hart.
    • Beispiel VII
  • Dieses Beispiel beschreibt eine Methode, jene AFPs auszuwählen, welche die Bildung von Eiskristallformen begünstigen, wie in der Erfindung bevorzugt.
  • Eiskristallwachstum unter normalen Bedingungen findet entlang der a-Achse des Kristalls statt. Falls AFPs vorhanden sind, wird das Wachstum verändert. Dieses selektive Beeinflussen der Kristallform kann durch die Tatsache erklärt werden, dass AFPs dazu neigen, sich an bestimmte Teile des Eiskristalls zu binden und dadurch hemmen sie das Wachstum des Eiskristalls in bestimmte Richtungen. Bindung kann zum Beispiel an den Prismaflächen (senkrecht zur a-Achse) oder an den Pyramidenflächen (welche aus diesen Flächen hervortreten) stattfinden.
  • Die Anmelder haben herausgefunden, dass AFPs, welche die Bildung von Seitenverhältnissen gemäß der vorliegenden Erfindung begünstigen, durch Selektieren jener AFPs gefunden werden können, welche dazu neigen, an die Pyramidenflächen zu binden. Die Methode zum Auswählen dieser spezifischen Bindungs-AFPs kann jede geeignete Methode sein. Ein geeigneter Test verwendet das sogenannte "Einzeleiskristall-'Halbkugel'-Wachstumsexperiment" basierend auf dem in Knight C. A., C. C. Chang und A. L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of α-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes beschriebenen Verfahren.
  • Ein gut isolierter 51 Kunststoffbecher wurde mit entionisiertem Wasser gefüllt und in einen temperaturkontrollierten Schrank bei -1ºC platziert. Er durfte dann langsam von oben gefrieren. Nach zwei Tagen bedeckte ein etwa 4 cm dicker Eis-Einzelkristall den Becher. Die kristallographische Ausrichtung dieses Kristalls wurde unter Verwendung von Einzelkristall-Röntgen-Diffraktionsverfahren bestimmt. Eiswürfel von etwa 2 cm Abmessung wurden so aus dem großen Einzelkristall geschnitten, dass eine Oberfläche parallel zur Prismafläche war und eine andere parallel zur Grundfläche. So wurden ausgerichtete Einzelkristalle aus Eis hergestellt.
  • Es wurde ein Apparat verwendet, welcher aus einem Messing- Kältefinger (etwa 1 cm Durchmesser) bestand, auf welchen ein ausgerichteter Kristallkeim gefroren wurde. Der Keim wurde zuerst ausgehöhlt, so dass der Kristallkeim darum herum passen würde. Kühlmittel wurden dann durch den Finger zirkuliert und der Keim gefror daran fest.
  • Der Finger mit dem Kristallkeim wurde dann in einen isolierten 100 ml Becher getaucht, welcher eine Lösung aus dem zu untersuchenden Material enthielt. Die Anfangstemperatur der Lösung war Raumtemperatur (~ 18ºC) und das einzige Kühlen wurde durch den Kältefinger vorgesehen. Anfangs schmolz der Kristallkeim teilweise, aber dann wuchs er in eine Einzelkristallhalbkugel. Nach mehreren Stunden (6-8) war eine Halbkugel mit einem Durchmesser von 5-7 cm gebildet worden.
  • Der Versuch wurde mit verschiedenen AFP-Lösungen durchgeführt. Die verwendeten AFP-Lösungen hatten eine AFP-Konzentration von 10&supmin;³ mg/ml.
  • Die Halbkugel wurde dann von dem Kältefinger entfernt und auf einen temperaturkontrollierten Schrank bei -15ºC übertragen. Die Oberfläche wurde gekratzt und sie wurde in dem Schrank mindestens über Nacht (16 Stunden oder mehr) gelassen. Luft wurde mittels eines Gebläses durch den Schrank zirkuliert. Während dieser Zeit fand Abdampfung der Oberflächenschichten des Eises statt. Die Oberfläche der Eishalbkugel kam so zu einer glatten Spiegeloberfläche. Jedoch werden bei einer Halbkugel, welche AFP enthält, raue Flecken auf der Oberfläche gesehen. Diese entsprechen den Flecken, wo das AFP sich an die Oberfläche der Halbkugel gebunden hat. Die großen AFP-Moleküle hindern die Eismoleküle am Verdampfen und so wird an den Oberflächen, wo bevorzugtes Binden an das Eis stattfindet, an der Oberfläche eine raue Matte an AFP-Molekülen aufgebaut. Da die Ausrichtung der Halbkugel bekannt ist und der Winkelabstand zwischen diesen rauen Flecken und den Grund- und Prisma-Richtungen mittels eines optischen Goniometers gemessen werden kann, kann die Art der Bindungsfläche leicht bestimmt werden.
  • Dieser Test kann verwendet werden, uni jene AFPs auszuwählen, welche dazu neigen, sich an die Pyramidenflächen zu binden. Zum Beispiel neigen die AFPs von Beispiel I und II dazu, an die Pyramidenflächen zu binden. Auch eine große Anzahl an anderen Pflanzenextrakten neigt dazu, Pyramidenbindung zu ergeben.
  • Es liegt gut innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns, den obigen Test zu verwenden, um jene AFPs zu bestimmen, welche dazu neigen, die Bildung von hohen Seitenverhältnissen von Eiskristallen zu begünstigen. Zum Testen ihrer Eignung in gefrorenen Produkten der Erfindung kann das tatsächliche Produkt hergestellt werden und das Seitenverhältnis der Kristalle in dem Produkt kann bestimmt werden.
    • Beispiel VIII Test zum Bestimmen der Eiskristallgröße nach Umkristallisation
  • Eine Probe von einer AFP-enthaltenden Lösung in Wasser wird an einen Sucrosegehalt von 30 Gew.-% angepasst (falls der Anfangsgehalt der Probe mehr als 30% beträgt wurde dies durch Verdünnung durchgeführt, falls der Anfangsgehalt geringer war, wurde Sucrose bis zum Gehalt von 30% zugegeben).
  • Im Allgemeinen kann der Test auf jede geeignete Zusammensetzung, welche AFP und Wasser umfasst, angewendet werden. Im Allgemeinen ist der Gehalt an AFP in solch einer Testzusammensetzung nicht sehr kritisch und kann zum Beispiel von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugter von 0,0005 bis 0,1 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 0,001 bis 0,05 Gew.-%, zum Beispiel 0,01 Gew.-% betragen.
  • Ein 3 ul Tropfen der Probe wird auf einen 22 mm Abdeckstreifen platziert. Ein Abdeckstreifen mit 16 mm Durchmesser wird dann darauf platziert und ein 200 g Gewicht wird auf der Probe platziert, um eine gleichförmige Objektträgerdicke sicherzustellen. Die Kanten des Abdeckstreifens werden mit klarem Nagellack versiegelt.
  • Der Objektträger wird auf einen Linkham THM 600 temperaturkontrollierten Mikroskoptisch platziert. Der Tisch wird schnell (50ºC pro Minute) auf -40ºC gekühlt, um eine große Population an kleinen Kristallen herzustellen. Die Tischtemperatur wird dann schnell (50ºC pro Minute) auf -6ºC erhöht und bei dieser Temperatur gehalten.
  • Die Eisphase wird bei -6ºC unter Verwendung eines Leica- Aristoplan Mikroskops beobachtet. Polarisierte Lichtbedingungen in Verbindung mit einer Lambda-Platte wurden verwendet, um den Kontrast der Eiskristalle zu verstärken. Der Zustand der Eisphase (Größe der Eiskristalle) wird durch 35 mm Photomikrographie bei T = 0 und T = 1 Stunde aufgezeichnet. Wobei eine durchschnittliche Partikelgröße (visuelle Bestimmung, Zahlendurchschnitt) von unter 20 um, bevorzugter zwischen 5 und 15 um bevorzugte AFPs zur Verwendung in Produkten gemäß der Erfindung anzeigt.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen Nahrungsmittelprodukts, welches Frostschutz-Polypeptide umfasst, wobei die Bedingungen so gewählt werden, dass die Eiskristalle in dem Produkt ein Seitenverhältnis haben, wie definiert als die Länge geteilt durch die Breite, von 1,1 bis 1,9.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bedingungen zum Beeinflussen des Seitenverhältnisses ausgewählt werden aus der Gruppe von: Gefriergeschwindigkeit, Beweglichkeit von Produkt während des Gefrierens, Lagerungstemperatur und Zeit, Formulierung des Produkts und Art und Menge der Frostschutz-Polypeptide und Kombinationen daraus.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das gefrorene Nahrungsmittelprodukt ein gefrorenes Konfektprodukt ist.
4. Gefrorenes Konfektprodukt, welches von 0,0001 bis 0,5 Gew.-% Frostschutz-Polypeptide umfasst, wobei besagtes Produkt ein Eiskristall-Seitenverhältnis von 1,1 bis 1,9 hat.
5. Gefrorenes Konfektprodukt gemäß Anspruch 4, wobei die Frostschutz-Polypeptide vorzugsweise an die Pyramidenflächen von Eiskristallen binden.
6. Gefrorenes Konfektprodukt mit einem Texturkontrast, wobei besagtes Produkt getrennte Elemente von einem Konfektprodukt nach Anspruch 4 umfasst.
7. Gefrorenes Konfektprodukt gemäß Anspruch 6, welches dünne Eiscremeschichten im Wechsel mit dünnen Wassereisschichtenumfasst, wobei die Wassereisschichten von 0,0001 bis 0,5 Gew.-% Frostschutz-Polypeptide umfassen und ein Eiskristall-Seitenverhältnis von 1,9 bis 3,0 haben.
8. Eiscremegemisch, welches zur Verwendung bei der Herstellung eines gefrorenen Konfektprodukts nach Anspruch 4 geeignet ist.
9. Eiscremegemisch gemäß Anspruch 8, wobei die Herstellung Belüftung und Ruhegefrieren einbezieht.
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