SK8899A3 - Frozen food with antifreeze peptides - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy potravinových produktov obsahujúcich AFP a potravinových produktov obsahujúcich AFP.

Doterajší stav techniky

Anti-mrazové peptidy (AFP) boli navrhnuté na zlepšenie tolerancie k zmrazeniu potravín.

Anti-mrazové proteíny už boli v literatúre opísané, pozri napríklad Marilyn Griffith a K. Vanya Ewart v Biotechnology Advances, Diel 13, č. 3, str. 375 až 402, 1995. Anti-mrazové látky všeobecne majú jednu alebo viaceré z nasledujúcich vlastnosti: tepelná hysteréza, inhibícia rekryštalizácie ľadu, riadenie tvaru kryštálov ľadu a interakcia s ľadovými zárodočnými jadrami.

Tepelná hysteréza je najlepšie známa vlastnosť AFP látok a táto vlastnosť sa normálne používa na testovanie prítomnosti AFP látok. Tepelná hysteréza je spôsobená znížením zdanlivej teploty zamŕzania roztoku obsahujúceho aktívnu látku AFP s tepelnou hysterézou bez ovplyvnenia teploty zamŕzania. Identifikácia zdrojov AFP testami tepelnej hysterézy je zoširoka opísaná v literatúre, pozri napríklad John G. Duman v Cryobiology 30, 322 až 328 (1993).

Inhibícia rekryštalizácie ľadu je ďalšia vlastnosť AFP látok. Táto aktivita je tiež označovaná ako potlačenie rastu ľadových kryštálov. Táto vlastnosť sa môže testovať porovnávaním veľkosti ľadových kryštálov v určitom časovom bode pre kryštály v prítomnosti AFP látok a v neprítomnosti AFP látok. Aplikácia tejto metódy pri testovaní rybích AFP látok je opísaná v US patente 5,118,792 (DNA Plánt Technology Corporation).

Tretia vlastnosť AFP látok je ich schopnosť ovplyvniť tvar kryštálov ľadu. Táto vlastnosť pochádza zo selektívneho viazania AFP látok na určité plochy

-2kryštálu ľadu a tým obmedzenia rastu kryštálu v určitých smeroch. Prítomnosť kryštálov ľadu, ktoré majú hexagonálny bipyramidálny tvar sa potom považuje za indikátor prítomnosti AFP látok. Táto metóda je opísaná napríklad na testovanie aktivity extracelulárnych AFP látok ozimnej raži vo WO 92/22581 (University Waterloo).

Štvrtá vlastnosť AFP látok je ich schopnosť inhibovať aktivitu látok t· pôsobiacich na nukleáciu ľadu. Táto interakcia medzi a AFP látkami a nukleačným

- činidlom ľadu môže napríklad spôsobiť zvýšenú tepelnú hysterézu. Táto vlastnosť je napríklad testovaná vo WO 96/40973 (University of Notre dáme du Lac)

AFP látky boli navrhnuté na zlepšenie tolerancie produktov proti mrazu. V tomto kontexte boli navrhnuté mnohé aplikácie.

Látky AFP boli napríklad navrhnuté na zlepšenie kryoochrany biologických materiálov (WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). AFP látky boli tiež navrhnuté na zabránenie úniku z lipozómov napríklad v kozmetických alebo farmaceutických materiáloch (Pozri WO 96/20695). Ďalšou možnou aplikáciou je zvýšenie tolerancie k mrazu u rastlín začlenením do nich (alebo vyrobením v nich transgeneticky) AFP látok (Pozri J. Bunka. Biochem. Suppl. diel 14e, 1990, strana 303 XP002030248, Lee a spol., abstrakt R228). Na použitie v potravinových produktoch, napríklad v zmrazenom jogurte alebo zmrzline (US 5,620,732 Pillsbury a WO 96/11586, HSC Research and development limited partnership) boli tiež navrhnuté rybacie AFP látky.

Doteraz však použitie AFP látok nebolo aplikované v komerčnom merítku. Prihlasovatelia sa domnievajú, že jedným z dôvodov nedostatku komerčnej * realizácie je, že hoci boli opísané mnohé AFP látky, v praxi realizácia v skutočných komerčných produktoch naráža na vážne problémy.

Prihlasovatelia zistili, že jeden z kľúčových dôvodov týchto problémov je v tom, že mimo veľkého počtu AFP látok, ktoré boli opísané v literatúre, len obmedzená skupina AFP látok sa môže vhodne aplikovať pre každú aplikáciu; prihlasovatelia tiež zistili, že tento výber vhodných AFP látok je závislý od požadovanej aplikácie a/alebo atribútov produktu, ktoré sa majú dosiahnuť.

WO 90/13571 opisuje anti-mrazové peptidy vyrábané chemicky alebo

-3pomocou techniky rekombinantnej DNA. AFP látky sa môžu vhodne použiť v potravinových produktoch ako je napríklad zmrzlina. Príklad 3B ukazuje modifikované tvary kryštálov ľadu, ak sa zmes vody a ľadu zmrazí na film v spojení s 0,01 % hmotnostného AFP látky.

WO 92/22581 opisuje AFP látky z rastlín, ktoré sa môžu použiť ma riadenie rastu kryštálov v zmrzline. Tento dokument tiež opisuje spôsob extrahovania polypeptidovej zmesi z extracelulárnych priestorov rastlín pomocou infiltrovania listov s extrakčným činidlom bez rozbitia buniek rastliny.

WO 94/03617 opisuje výrobu AFP látok z kvasiniek a ich možné použitie v zmrzline. WO 96/11586 opisuje rybacie AFP látky vyrábané pomocou mikróbov.

Tento vynález má za cieľ poskytnúť riešenia vyššie uvedených problémov. Konkrétne má vynález za cieľ poskytnúť zmrazené potravinové produkty, ktoré majú relatívne mäkkú ale krehkú textúru, táto textúra sa zachováva počas dlhej doby uskladnenia pri nízkych teplotách.

Prekvapivo sa zistilo, že AFP látky môžu byť vhodne včlenené do zmrazených potravinových produktov, čím sa poskytnú požadované vlastnosti produktu, pričom sa produkt a podmienky spracovania menia tak, že tvar kryštálov ľadu vyhovuje špecifickým požiadavkám.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob výroby zmrazeného potravinového produktu zahrnujúceho AFP látky, kde sa podmienky vyberajú tak, že kryštály ľadu * v produkte majú pomer strán od 1,1 do 1,9.

Ak sú potravinové produkty zmrazené, kryštály ľadu sa tvoria vo vnútri produktu. Ak v potravinových produktoch, ktoré majú byť zmrazené sú zahrnuté AFP látky, môže to viesť k zmene vlastnosti rekryštalizácie ľadu. Agregácia kryštálov ľadu AFP obsahujúcich produktov môže spôsobiť krehkosť produktu.

Mnohí konzumenti uprednostňujú relatívne mäkké a krehké potravinové produkty alebo ich zložky, ako napríklad zmrzlina alebo vodná ľadová dreň. Napríklad mäkká vodná ľadová dreň sa môže použiť ako atraktívna zložka

-4v zmrazených cukrárenských produktoch, relatívne krehká zmrzlina je tiež obľúbená širokou skupinou konzumentov.

Prekvapivo sme zistili, že AFP látky ponúkajú príležitosť pripraviť zmrazené potravinové produkty, ktoré z jednej strany sú relatívne tvrdé a krehké a z druhej strany majú zlepšené vlastnosti rekryštalizácie ľadu. Prihlasovatelia zistili, že sa prekvapivo táto výhodná kombinácia vlastností môže dosiahnuť, ak je pomer strán kryštálov ľadu v produkte je medzi 1,1 a 1,9.

. Pomer strán kryštálov ľadu je definovaný ako pomer dĺžky a šírky kryštálov ľadu. Pomer strán medzi 1,1 a 1,9, zodpovedá zaokrúhleným kryštálom ľadu, ktoré nie sú tvarovo predĺžené. Pomer strán kryštálov sa môže určiť pomocou vhodnej metódy. Výhodná metóda je ilustrovaná v príkladoch. Výhodne je pomer medzi 1,2 a 1,8, najvýhodnejšie medzi 1,3 a 1,7.

Výhodne sú zmrazené produkty podľa tohto vynálezu krehké. Výhodne je minimálna hrúbka vrstvy, pri ktorej sa môže pozorovať lámavé správanie sa, menej než 10 mm, výhodnejšie od 1 do 5 mm. Lámavé správanie sa môže byť buď merané pripravením vrstiev s premenlivou hrúbkou a určením, pri ktorej minimálnej hrúbke nastane lámavé správanie sa alebo vypočítané z Youngových modulov, ako je opísané v príkladoch.

Počas prípravy a následného zmrazenia potravinových produktov môžu viaceré parametre ovplyvniť pomer strán kryštálov ľadu, ktorý sa tvorí. Príklady faktorov ovplyvňujúcich pomer strán sú uvedené nižšie. Prihlasovatelia veria, že je v schopnostiach skúsených odborníkov vybrať tieto podmienky tak, že pomer strán kryštálov ľadu spadá do požadovaného rozsahu.

* Jedeným faktorom ovplyvňujúcim pomer strán kryštálov ľadu je rýchlosť zmrazenia produktu. Všeobecne povedané vzrast rýchlosti zmrazenia vedie k poklesu pomeru strán kryštálov ľadu. V tomto kontexte teplota zmrazenia môže ovplyvniť rýchlosť zmrazenia a tým pomer strán kryštálov ľadu. V tomto kontexte sú niekedy výhodné procesy zmrazenia zahrnujúce krok stuhnutia napríklad pri teplote pod -34 °C. Teplota uskladnenia a čas uskladnenia môže rovnako ovplyvniť pomer strán, pričom vyššie teploty uskladnenia a/alebo dlhší čas uskladnenia smerujú k výhodnej tvorbe vyššieho pomeru strán.

-5Ďalší faktor ovplyvňujúci pomer strán kryštálov ľadu je pohyb produktu počas zmrazenia. Napríklad, ak sa má zmraziť kvapalná zmes na vodnú ľadovú dreň alebo zmrzlinu, kľud pri zmrazení bude viesť k ďaleko vyššiemu pomeru strán kryštálov ľadu, zatiaľ čo premiešavanie vedie k nižšiemu pomeru strán. Vysokostrihové miešanie bude viesť k ešte menším pomerom strán.

Ďalším faktorom na ovplyvnenie pomeru strán kryštálov ľadu je prítomnosť a množstvá zložiek. Napríklad prítomnosť zložiek, ktoré vedú k tvorbe sieťovej štruktúry v produkte (napríklad gúm alebo tukov), môže viesť k nižšiemu pomeru strán než v produktoch bez týchto zložiek. Iné zložky tiež môžu viesť k nižšiemu pomeru strán, napríklad vysoké hladiny tuhých látok, napríklad vysoké hladiny cukru môžu viesť k nízkemu pomeru strán.

Nakoniec povaha a množstvo prítomných AFP látok môže viesť k zmene pomeru strán. Niektoré AFP látky sa javia ako priaznivé na tvorbu nízkeho pomeru strán, kým iné AFP látky sa javia ako látky vyvolávajúce vyššie pomery strán. Vhodný test na výber týchto AFP látok je opísaný v príkladoch. Variácie v množstve AFP látok môžu tiež viesť k zmene v pomere strán.

Podľa druhého uskutočnenia sa vynález týka spôsobu výroby zmrazeného potravinového produktu zahrnujúceho AFP látky, kde zloženie, zmrazenie a podmienky uskladnenia sú vyberané tak, že kryštály ľadu v produkte majú pomer strán od 1,1 do 1,9.

Spôsob podľa tohto vynálezu sa môže aplikovať na zmrazené potravinové produkty obsahujúce AFP látky. Príkladmi vhodných produktov sú omáčky, múčne jedlo atď. Výhodnými potravinovými produktmi sú zmrazené cukrárenské produkty, ako napríklad zmrzlina a ľadová dreň.

Prihlasovatelia zistili, že AFP látky určené pre použitie v spôsobe podľa tohto vynálezu môžu pochádzať z rôznych zdrojov, ako napríklad rastlín, rýb, hmyzu a mikroorganizmov. Môžu sa použiť aj prirodzene sa vyskytujúce látky aj látky, ktoré sa získali pomocou genetickej modifikácie. Napríklad môžu byť mikroorganizmy alebo rastliny geneticky modifikované tak, aby prejavovali expresiu AFP látok a AFP látky sa môžu potom použiť v zhode s týmto vynálezom.

Techniky genetickej manipulácie sa môžu použiť na výrobu AFP látok takto:

-6vhodná hostiteľská bunka alebo organizmus by sa mohol transformovať pomocou génového konštruktora, ktorý obsahuje požadovaný polypeptid. Nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid sa môže včleniť do vhodného expresívneho vektora kódujúceho potrebné prvky pre transkripciu a transláciu a takým spôsobom, že bude prebiehať ich expresia za vhodných podmienok (napríklad v správnej orientácii a správnom čítacom rámci a s vhodnými cieliacimi a expresívnymi sekvenciami). Metódy vyžadované na konštrukciu týchto expresívnych vektorov sú dobre známe odborníkom v tejto oblasti.

Na expresiu sekvencie kódujúcej polypeptid sa môžu použiť početné expresívne systémy. Tieto zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, baktérie, kvasinkové bunkové systémy hmyzu, systémy rastlinných bunkových kultúr a rastliny, všetky transformované s vhodnými expresívnymi vektormi.

Mnohé z rastlín a rastlinných bunkových systémov sa môžu transformovať s nukleovými kyselinovými konštruktormi požadovaných polypeptidov. Výhodné uskutočnenia by mohli zahrnovať, ale nie sú na ne obmedzené, kukuricu, rajčiny, tabak, karotku, jahody, repku a cukrovú repu.

Pre účely tohto vynálezu sú výhodné AFP látky získané z rýb (t.j. sú buď priamo získané z rýb. Zvlášť výhodné je použitie rastlinného pôvodu (t.j. proteíny priamo získané z rastlín alebo tieto proteíny transgeneticky tvorené inými mikroorganizmami) zvlášť získanými z ozimnej raži alebo z trvalých tráv.

Pre niektoré prirodzené zdroje AFP látok môžu pozostávať zo zmesi dvoch alebo viacerých rôznych AFP látok.

Výhodne sú vyberané tie AFP látky, ktoré majú významné inhibičné vlastnosti pre rekryštalizáciu ľadu. Výhodne AFP látky podľa tohto vynálezu poskytujú veľkosť častíc ľadu po rekryštalizácii, výhodne merané podľa príkladov, menej ako 20 pm, výhodnejšie od 5 do 15 pm. Predpokladá sa, že malá veľkosť kryštálov ľadu spojená so špecifickým pomerom strán, je zvlášť výhodná na získanie požadovaných štrukturálnych rysov.

Veľmi výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka zloženia produktov, ktoré je vyberané tak, že sa pri príprave produktu môžu použiť podmienky zmrazenia v kľude, pričom sa ešte získa taký pomer strán, ako je definovaný vyššie.

-7Príklady takých potravinových produktov sú: zmrazené cukrárenské zmesi, ako napríklad zmrzlinové zmesi a zmesi na ľadovú dreň, ktoré sú určené na uskladnenie pri teplote okolia alebo chladničky. Vhodné produktové formy sú napríklad: práškové zmesi, ktoré sa balia napríklad do vreciek alebo v sáčkov. Takáto zmes je schopná tvoriť základ zmrazeného potravinového produktu, napríklad po pridaní vody a voliteľne ďalších zložiek a voliteľne po prevzdušnení.

Ďalším príkladom vhodných zmesí by mohla byť kvapalná zmes (voliteľne prevzdušnená), ktorá sa, ak je to potrebné po pridaní ďalších zložiek a voliteľnom ďalšom prevzdušnení, môže zmraziť.

Jasnou výhodou vyššie zmienených zmesí je, že prítomnosť AFP zložky umožňuje zmrazenie zmesí za podmienok pokoja, napríklad v mrazničke obchodu alebo domácej mrazničke.

Veľmi vhodne sú tieto zmesi balené v uzavretých kontajneroch (napríklad kartónoch, vreckách, krabiciach, plastových kontajneroch atď.). Pre jednotlivé porcie bude veľkosť balenia všeobecne od 10 do 1000 g. Pre mnohonásobné porcie môžu byť vhodné veľkosti balenia do 500 kg. Všeobecne veľkosť balenia bude od 10 g do 5000 g.

Ako je naznačené vyššie, výhodné produkty, v ktorých sú použité AFP látky, sú zmrazené cukrárenské produkty, ako napríklad zmrzlina alebo ľadová dreň. Výhodne je hladina AFP látok od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného z konečného produktu. Ak sú použité suché zmesi alebo koncentráty, koncentrácia môže byť vyššia, aby sa zabezpečilo, že hladina v konečnom zmrazenom produkte bude vo vyššie uvedených rozsahoch.

Prekvapivo sa zistilo, že zmesi podľa tohto vynálezu môžu obsahovať veľmi nízke množstvá AFP látok, pričom je ešte dobrá kvalita.

Doteraz sa všeobecne verilo, že na získanie rozumného zlepšenia vlastnosti rekryštalizácie sa požadujú značne vysoké hladiny AFP látok. Dôvodom pre to je to, že sa bežne predpokladá, že AFP látky pôsobia na významné časti povrchu kryštálov ľadu a preto, aby sa dosiahol rozumný účinok, musia byť prítomné pri značne vysokých hladinách, napríklad 0,01 % hmotnostného alebo viac.

-8Prekvapivo sa teraz tiež zistilo, že pre zmrazené produkty sa zlepšené rekryštalizačné vlastnosti a zvýšená teplotná tolerancia môžu získať už vtedy, keď sú použité nízke hladiny AFP látok.

Prekvapivo sa zistilo, že hladina AFP látok môže byť nízka až 0,1 až 50 ppm, pričom sa ešte poskytujú zodpovedajúce rekryštalizačné vlastnosti a teplotná tolerancia v zmrazených cukrárenských produktoch. Hoci prihlasovatelia si neželajú viazať sa akoukoľvek teóriou, dôvodom pre toto môže byť, že interakcia medzi tuhými látkami zmrazeného cukrárenského produktu a AFP látkami poskytuje vynikajúci mechanizmus inhibovania rastu kryštálu. Najvhodnejšie je hladina AFP od 1 do 40 ppm, zvlášť výhodne od 2 do 10 ppm.

Pre účely vynálezu pojem zmrazený cukrárenský produkt zahrnuje mlieko obsahujúce zmrazené sladkosti, ako napríklad zmrzlina, zmrazený jogurt, šerbet, ovocná zmrzlina, ľadové mlieko a zmrazený puding, ľadové drene, granity a zmrazené ovocné pyré. Pre niektoré aplikácie je menej výhodné použitie AFP látok v zmrazených fermentovaných potravinových produktoch.

Výhodne je hladina tuhých látok v zmrazených sladkostiach (napríklad cukor, tuk, príchuť atď.) viac ako 30 % hmotnostných, výhodnejšie od 40 do 70 % hmotnostných.

Vo veľmi výhodnom uskutočnení vynálezu sa používajú mäkké ale chrumkavé zmrazené cukrárenské prípravky na vytvorenie textúrneho kontrastu v ľadových sladkostiach. Výhodne takéto ľadové sladkosti obsahujú ako oddelené prvky vo svojej štruktúre AFP látky obsahujúcej zmesi podľa tohto vynálezu. Napríklad relatívne tvrdé zmrzlinové jadro sa môže obaliť s tenkou vrstvou zmesi podľa tohto vynálezu, čím sa poskytne relatívne mäkká ale chrumkavá vrstva okolia zmrzlinového jadra. Ďalšie uskutočnenie by mohlo byť v začlenení prípravku podľa tohto vynálezu ako inkludovanej časti ľadových sladkostí. Tretie uskutočnenie by malo striedať vrstvy zmrzliny s prípravkom podľa tohto vynálezu, čím sa vytvoria tenké mäkké ale chrumkavé vrstvy striedavo s vrstvami zmrzliny.

-9Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Oddelenie AFP látok z ozimnej raži

Ozimná raž (Halo variety) sa skosila v januári (priemerná teplote v tomto mesiaci bola 3,5 °C, čo zabezpečuje vhodnú studenú aklimatizáciu rastlín). Tkanivo sa rýchlo prenieslo do laboratória na ďalšie spracovanie a premyla sa dôkladne na odstránenie špiny.

400 g odrezkov sa homogenizovalo pri teplote okolia v zariadení Waring blender s 800 g vody, kým sa listové tkanivo úplne nerozrušilo. Šťava bohatá na AFP látky sa oddelila filtráciou cez 4 vrstvy mušelínu.

Šťava bohatá na AFP látky sa potom podrobila teplotnému opracovaniu varom počas 10 minút. To spôsobilo zrážanie proteínu, kým AFP látky na použitie podľa tohto vynálezu zostali v roztoku. Supernatant sa oddelil od zrazeniny pomocou centrifugácie pri 15000 g počas 20 minút alebo pomocou ďalšej filtrácie cez mušelín.

AFP sa môžu izolovať z tohto supernatantu pomocou vymrazovacieho sušenia.

Príklad 2

Izolácia AFP z tráv

Zmiešané trávové tkanivo (obsahujúce Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lana tus a Bromus sterilis) sa skosila v januári (priemerná teplote v tomto mesiaci bola 3,5 °C, čo zabezpečuje vhodnú studenú aklimatizáciu rastlín). Tkanivo trávy sa rýchlo prenieslo do laboratória na ďalšie spracovanie a premyla sa dôkladne na odstránenie špiny.

500 g odrezkov trávy sa umiestnilo do 650 Wattovej mikrovlnovej piecky a zahorievalo sa pri plnom výkone počas 5 minút, pričom teplota vzrástla na 85 až 100 °C. Odrezky trávy sa potom ochladili na laboratórnu teplotu.

-10Po kroku zahrievania sa na AFP látky bohatá šťava oddelila od odrezkov pomocou filtrácie. Táto hmota sa kontinuálne premiešavala počas 5 minút v prítomnosti rovnakého objemu vody a potom sa pretlačila cez 3 vrstvy mušelínu.

Tento supernatant sa môže sušiť vymrazením, čím sa izoluje AFP látka.

Príklad 3

Predzmes na prípravu zmrzliny sa pripravila zmiešaním:

Zložka sušené odstredené mlieko sacharóza maltodextrín (MD4O) obilný sirup 63DE maslový olej monoglycerid (palmitan) vanilín guma rohovníka obyčajného guarová guma karagénan mikrokryštalická celulóza želatína % hmotnostné

11,39

3,14

4,00

20,71

9.00

0,45

0,01

0,07

0,05

0,02

0,24

0,14

AFP (z Príkladu ľ) 0,01 alebo žiadne (kontrolná vzorka) voda doplnok *AFP látka sa pridáva ako koncentrovaný roztok; percentá zodpovedajú množstvu AFP látky

Táto zmes sa môže pohodlne uskladniť pri laboratórnej teplote napríklad v plastovom kontajneri.

Zmes sa môže šľahať s konvenčným domácim mixérom na našľahanie asi

-11 100 %, po čom nasleduje zmrazenie v kľude v domácej mrazničke.

Po dvoch mesiacoch uskladnenia mala zmes podľa tohto vynálezu značne lepšiu textúru než kontrolná vzorka.

Príklad 4

Predzmes na prípravu zmrzliny sa pripravila zmiešaním:

Zložka % hmotnostné

Sušené odstredené mlieko

10,00 sacharóza

13,0 maltodextrín (MD40) 13,00 Guma rohovníka obyčajného Maslový olej monoglycerid (palmitan) vanilín

AFP (z Príkladu II*) voda

4,00

0,14

8,00

0,30

0,01

0,01 alebo žiaden (kontrolná vzorka) doplnok *AFP látka sa pridáva ako koncentrovaný roztok; percentá zodpovedajú množstvu AFP látky

Príklad 5

Pripravili sa zmrzliny zmrazením a prevzdušnením na 70 % našľahanie so zložením podľa Príkladu 4:

Vzorky oboch produktov sa ponechali dosiahnuť rovnováhu pri -18 °C v klimatizačnej skrini Prolan počas približne 12 hodín.

Pripravili sa mikroskopovacie plátky pomocou roztretia tenkej vrstvy zmrzliny do stredu tenkých sklených platní.

Každý plátok sa preniesol na teplotné riadenú mikroskopovaciu plošinu (pri

-12-18 °C), kde sa snímali obrazy kryštálov ľadu (asi 400 individuálnych kryštálov ľadu) a preniesli sa pomocou videokamery do systému uchovania a analýzy obrazu.

Uložené obrazy kryštálov sa ručne zvýraznili pomocou obkreslenia okolo ich obvodu, čo potom zvýrazní celý kryštál. Obrazy zvýraznených kryštálov sa potom merali použitím softvéru analýzy obrazu, ktorý počítal počet pixelov potrebných na vyplnenie najdlhšej priamky (dĺžka), najkratšej priamky (šírka), pomer strán (dĺžka/šírka).

Pre kryštály sa vypočítal priemer pomeru strán.

Pre kontrolnú vzorku bol pomer strán 1,45.

Pre vzorku obsahujúcu AFP látky bol pomer strán 1,75.

Príklad 6

Krehkosť zmrzliny Príkladu 4 bola určená výpočtami lámavého správania sa zmrzliny. Použitím 3-bodového ohybového testu sa merali Youngové moduly.

Youngové moduly boli merané pripravením pásikov zmrzliny, ich ponechaním dosiahnuť rovnováhu počas 18 hodín v skrinke mrazničky a prenesením do teplotnej skrinky. Pásiky sa umiestnili na 3-bodový ohybový kruh, ako je opísaný v Handbook of Plastics Test Methods (2. vydanie), ed. R.P. Brown, George Godwin Ltd, 1981. Testovanie vzorky sa vykonalo ihneď pri deformačnej rýchlosti 50 mm/min. Z krivky sila-deformácia sa merala počiatočná smernica a použila sa na vypočítanie Youngových modulov podľa nasledujúcej rovnice:

Youngov modul (Pa) = Smernica. L/4.B.W kde L = rozpätie lúčov (110 mm), B = šírka vzorky, W = výška vzorky. Obvykle sa testovalo osem vzoriek, čím sa získala priemerná hodnota Youngových modulov.

Použitím výpočtov opísaných Williamsom & Cawoodom v Polymér Testing 9, 15-26 (1990) sa môže vypočítať tuhosť voči lámaniu.

Výsledky boli nasledujúce: Pre kontrolnú vzorku bola vypočítaná hrúbka 966 metrov, ako hodnota potrebná na získanie krehkej vrstvy. Pre vzorku obsahujúcu AFP látky sa už zistila krehkosť (lámavé správanie sa) pri hrúbke 3 mm.

-13Toto jasne ukazuje zlepšenú krehkosť produktov podľa tohto vynálezu. Produkty s AFP boli relatívne tvrdé.

Príklad 7

Tento príklad opisuje metodológiu výberu tých AFP látok, ktoré zlepšujú tvorbu tvaru kryštálov ľadu, ako výhodných pre tento vynález.

Rast kryštálov ľadu za normálnych okolností prebieha pozdĺž a-osi kryštálu. Ak sú prítomné AFP látky, rast sa zmení. Tento selektívny vplyv na tvar kryštálu sa môže vysvetliť skutočnosťou, že AFP látka má sklon viazať sa na určité časti kryštálu ľadu a tým spôsobí inhibovanie rastu kryštálov ľadu v určitých smeroch. Viazanie môže napríklad prebiehať na prizmatických rovinách (kolmých na a-os) alebo na pyramidálnych rovinách (prečnievajúcich tieto roviny).

Zistilo sa, že AFP látky, ktoré podporujú tvorbu pomeru strán podľa tohto vynálezu, môžu napríklad byť zistené pomocou vybratia tých AFP látok, ktoré majú sklon viazať sa na prizmatickú rovinu. Metodológiou pre výber týchto špecificky sa viažucich AFP látok môže byť akákoľvek vhodná metodológia. Vhodný test používa takzvaný Pokus rastu samostatnej 'hemisféry¹ kryštálu ľadu“, založený na technike opísanej v Knight C.A., C.C. Cheng a A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409 až 418, Adsorption of a-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surfface planes.

Dobre izolovaných 51 plastových kadičiek sa naplnilo s deionizovanou vodou, a umiestnili sa do tepelne riadenej skrine pri -1 °C. Potom sa ponechala pomaly z vrchu zmrznúť. Po dvoch dňoch monokryštál ľadu približne 4 cm hrubý pokryl kadičku. Kryštalografická orientácia tohto kryštálu sa určila použitím monokryštálových rôntgenových difrakčných metód. Kocky ľadu, rozmeru približne 2 cm, sa rezali z veľkého monokryštálu tak, že jeden povrch bol paralelný s prizmatickou rovinou, a ďalšia je paralelná k rovine základne. Vyrábali sa teda orientované monokryštály ľadu.

Použili sa prístroje pozostávajúce z mosadzného chladeného nosiča

-14(približne 1 cm priemer), na ktorý sa primrazil orientovaný zárodočný kryštál. V jadre sa najprv vytvoril otvor, takže sa zárodočný kryštál naň mohol pripevniť. Potom cez nosič chladivo cirkulovalo a jadro sa naň pevne primrazilo.

Nosič so zárodočným kryštálom sa potom ponoril do izolovanej 100 ml kadičky obsahujúcej roztok študovaného materiálu. Počiatočnou teplotou roztoku bola laboratórna teplota (asi 18 °C), a uskutočnilo sa chladenie len chladeným nosičom. Počiatočné sa zárodočný kryštál čiastočne topil, ale potom rástol na monokryštálovú hemisféru. Po niekoľkých hodinách (6 až 8) sa vytvorila hemisféra s priemerom 5 až 7 cm.

Pokus sa uskutočnil s rôznymi AFP roztokmi. Použité AFP roztoky mali koncentráciu AFP látky 10'³ mg/ml.

Hemisféra sa potom odobrala z chladeného nosiča, a preniesla sa do teplotné riadenej skrine pri -15 °C. Povrch bol oškrabaný a nechal sa v skrini najmenej počas noci (16 hodín alebo viac). Cez skriňu cirkuloval vzduch pomocou vnútorného vetráku. Počas tejto doby sa prejavovalo odparenie povrchových vrstiev ľadu. Povrch hemisféry ľadu sa teda stáva hladkým zrkadlovým povrchom. Avšak pre hemisféru obsahujúcu AFP látky vidno na povrchu hrubé pláty. Tieto zodpovedajú plátom, kde sa AFP látky viazali na povrch hemisféry. Veľké AFP molekuly bránia molekulám ľadu odpariť sa, a tak sa na povrchu vybuduje hrubý chumáč AFP molekúl pri povrchoch, kde sa prejavuje preferenčné viazanie na ľad. Pretože orientácia hemisféry je známa, a uhlová vzdialenosť medzi týmito drsnými plátmi a bazálnym a prizmatickým smerom sa môže merať pomocou optického goniometra, môže sa ľahko určiť povaha roviny viazania.

Tento test sa môže použiť na výber tých AFP látok, ktoré majú sklon viazať sa na pyramidálne roviny. Napríklad AFP z príkladu 1 a 2 má sklon viazať sa na pyramidálne roviny. Veľký počet iných rastlinných extraktov má tiež sklon spôsobiť pyramidálne viazanie.

Bude určite v schopnostiach odborníkov, použiť vyššie uvedený test na určenie tých AFP látok, ktoré majú sklon napomáhať tvorbe vysokého pomeru strán kryštálov ľadu. Na testovanie ich vhodnosti v zmrazených produktoch podľa tohto vynálezu, sa môže vyrobiť tento aktuálny produkt a môže sa určiť pomer strán

-15kryštálov v produkte.

Príklad 8

Test určenia veľkosti kryštálu ľadu pri rekryštalizácii

Vzorka AFP obsahujúceho roztoku vo vode sa upravila na hladinu obsahu sacharózy 30 % hmotnostných (ak východisková hladina vzorky je viac ako 30 % hmotnostných, dosiahlo sa to zriedením, ak východisková hladina bola nižšia, pridala sa sacharóza do hladiny 30 % hmotnostných).

Všeobecne sa test môže aplikovať na akúkoľvek vhodnú zmes zahrnujúcu AFP látku a vodu. Všeobecne hladina obsahu AFP látky v tejto testovej zmesi nie je veľmi kritická a môže napríklad byť od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného, výhodnejšie 0,0005 až 0,1 % hmotnostného, najvýhodnejšie 0,001 až 0,05 % hmotnostného, napríklad 0,01 % hmotnostného.

pl kvapka vzorky sa umiestnila na 22 mm krycie sklíčko. Potom sa na vrch položí krycie sklíčko 16 mm priemeru a na vzorku sa umiestni 200 g hmotnosť, aby sa zabezpečila vrstva s rovnomernou hrúbkou. Hrany krycieho sklíčka sa uzavrú s čírym lakom na nechty.

Preparát sa umiestni na plošinu Linkham THM 600 teplotné riadeného mikroskopu. Plocha sa rýchlo chladí (50 °C za minútu) na -40 °C, aby sa vytvorila veľká populácia malých kryštálov. Teplota plochy sa potom rýchlo zvyšuje (50 °C za minútu) do -6 °C a udržuje sa pri tejto teplote.

Ľadová fáza sa pozoruje pri -6 °C použitím Leica Aristoplan mikroskopu. Podmienky polarizovaného svetla v spojení s lambda platňou boli použité na zlepšenie kontrastu kryštálov ľadu. Stav ľadovej fázy (veľkosť kryštálov ľadu) sa zaznamenáva pomocou 35 mm fotomikrografie pri T = 0 a T = 1 hodina. Pritom priemerná časticová veľkosť (vizuálne určenie, číselný priemer) pod 20 pm, výhodnejšie medzi 5 a 15 pm indikuje výhodné AFP látky pre použitie v produktoch podľa tohto vynálezu.

Claims (9)

1. Spôsob výroby zmrazeného potravinového produktu zahrnujúceho protimrazové polypeptidy, vyznačujúci sa tým, že podmienky sú vyberané tak, že kryštály ľadu v produkte majú pomer strán, definovaný ako dĺžka delená šírkou, od 1,1 do 1,9.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, že podmienky ovplyvňujúce pomer strán sú vybrané zo skupiny: rýchlosť zmrazenia, pohyb produktu počas zmrazenia, teplota a čas uskladnenia, zloženie produktu a povaha a množstvo protimrazových polypeptidov a ich kombinácií.

3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zmrazeným potravinovým produktom je zmrazený cukrárenský produkt.

4 Zmrazený cukrárenský produkt, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného protimrazových polypeptidov, a tento produkt má pomer strán kryštálov ľadu od 1,1 do 1,9.

5. Zmrazený cukrárenský produkt podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že protimrazové polypeptidy sa výhodne viažu na pyramidálne roviny kryštálov ľadu.

6. Zmrazený cukrárenský produkt majúci textúrny kontrast, vyznačujúci sa t ý m, že tento produkt zahrnuje diskrétne prvky cukrárenského produktu podľa nároku 4.

7. Zmrazený cukrárenský produkt podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje tenké zmrzlinové vrstvy striedavo s tenkými vrstvami ľadovej drene, kde vrstvy ľadovej drene obsahujú od 0,0001 do 0,5 % hmotnostných protimrazových polypeptidov a majú pomer strán kryštálov ľadu od 1,9 do 3,0.

8. Zmrzlinová zmes, vyznačujúca sa tým, že je vhodná na použitie pri príprave zmrazeného cukrárenského produktu podľa nároku 4.

9. Zmrzlinová zmes podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že jej príprava zahrnuje prevzdušnenie a zmrazenie v kľude.