DE69736234T2 - Gefrorene nahrungsmittel mit peptid-gefrierschutzmitteln - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines AFPs enthaltenden Nahrungsmittelprodukts und AFPs enthaltende Nahrungsmittelprodukte.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Frostschutz-Peptide (anti-freeze peptides, AFPs) wurden vorgeschlagen, um die Gefriertoleranz von Nahrungsmitteln zu verbessern.
  • Frostschutz-Proteine wurden in der Literatur beschrieben, vgl. z.B. Marylin Griffith und K. Vanya Ewart in Biotechology Advances, Bd. 13, Nr. 3, S. 375-402, 1995. Frostschutz-Proteine haben im Allgemeinen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: thermische Hysterese, Hemmung der Eis-Rekristallisation, Steuerung der Eiskristallform und Wechselwirkung mit Eis-Kristallkeimbildnern.
  • Die thermische Hysterese ist die am besten bekannte Eigenschaft der AFPs, und die Eigenschaft wird normalerweise verwendet, um auf das Vorhandensein von AFPs zu testen. Die thermische Hysterese ergibt sich aus einer Absenkung der apparenten Gefriertemperatur einer Lösung, die ein für die thermische Hysterese aktives AFP enthält, ohne die Schmelztemepratur zu beeinflussen. Die Identifizierung von AFP-Quellen durch thermische Hysterese-Tests ist in der Literatur in großem Umfang beschrieben, vgl. z.B. John G. Duman in Cryobiology 30, 322-328 (1993).
  • Die Inhibierung der Eis-Rekristallisation ist eine andere Eigenschaft von AFPs. Diese Aktivität wird auch als Eiskristallwachstumsunterdrückung bezeichnet. Diese Eigenschaft kann getestet werden, indem zu einem bestimmten Zeitpunkt die Eiskristallgröße von Kristallen in Gegenwart von AFP und in Abwesenheit von AFP verglichen wird. Die Anwendung dieser Methode zum Testen von Fisch-AFPs ist im US-Patent 5,118,792 (DNA Plant Technology Corporation) beschrieben.
  • Eine dritte Eigenschaft der AFPs ist ihre Fähigkeit, die Form von Eiskristallen zu beeinflussen. Diese Eigenschaft stammt von der selektiven Bindung von AFPs an bestimmte Flächen des Eiskristalls, womit das Kristallwachstum in bestimmte Richtungen beschränkt wird. Das Vorhandensein von Eiskristallen mit hexagonaler Bipyramidenform wird dann als Anzeichen für das Vorhandensein von AFP angesehen. Dieses Verfahren ist beispielsweise zum Testen der Aktivität von extrazellulären Winterroggen-AFPs in der WO 92/22581 (University of Waterloo) beschrieben.
  • Eine vierte Eigenschaft von AFPs ist ihre Fähigkeit, die Aktivitat von Eis-Kristallkeimbildenden Substanzen zu inhibieren. Diese Wechselwirkung zwischen AFP und einem Eis-Kristallkeimbildner kann beispielsweise zu einer erhöhten thermischen Hysterese führen. Diese Eigenschaft wird beispielsweise in der WO 96/40973 (University of Notre dame du Lac) getestet.
  • AFPs wurden vorgeschlagen, um die Gefriertoleranz von Produkten zu verbessern. Viele Anwendungen wurden in diesem Zusammenhang vorgeschlagen.
  • Beispielsweise wurden AFPs vorgeschlagen, um die Cryokonservierung von biologischen Materialien zu verbessern (WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). AFPs wurden auch vorgeschlagen, um das Auslaufen von Liposomen zu verhindern, beispielsweise in kosmetischen oder pharmazeutischen Produkten (vgl. WO 96/20695). Eine weitere mögliche Anwendung ist zur Steigerung der Gefriertoleranz von Pflanzen, indem man in diesen ein AFP inkludiert (oder transgenetisch darin produziert) (vgl. J. Cell. Biochem. Suppl. Bd. 14e, 1990, S. 303 XP002030248, Lee et al., Abstract R228). Auch Fisch-AFPs wurden zur Verwendung in Nahrungsmittelprodukten vorgeschlagen, z.B. in gefrorenem Jogurt oder in Eiscreme ( US 5,620,732 Pillsbury und WO 96/11586, HSC Research and development limited partnership).
  • Bisher wurde jedoch die Verwendung von AFPs nicht in großtechnischem Umfang angewendet. Die Anmelder sind der Meinung, dass einer der Gründe für das Fehlen einer kommerziellen Implementierung der ist, dass obwohl viele AFPs beschrieben worden sind, in der Praxis die Implementierung in richtigen kommerziellen Produkten auf viele ernste Probleme stößt.
  • Die Anmelder fanden, dass einer der Hauptgründe für diese Probleme der ist, dass aus der großen Anzahl von AFPs, die in der Literatur beschrieben wurden, nur eine begrenzte Gruppe von AFPs zweckmäßig für jede Anwendung benützt werden kann; auch fanden die Anmelder heraus, dass diese Selektion geeigneter AFPs von der gewünschten Verwendung und/oder von zu erreichenden Produkt-Attributen abhängig ist.
  • Die WO 90/13571 offenbart Frostschutz-Peptide, die chemisch oder mittels rekombinanter DNA-Techniken erzeugt werden. Die AFPs können zweckmäßig in Nahrungsmittelprodukten, wie Eiscreme, verwendet werden. Beispiel 3B zeigt modifizierte Eiskristallformen, wenn eine Wasser-Eis-Mischung in Kombination mit 0,01 Gew.-% AFP zu einem Film gefroren wird.
  • Die WO 92/22581 offenbart AFPs aus Pflanzen. Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren zur Extraktion einer Polypeptid-Zusammensetzung aus extrazellulären Räumen von Pflanzen durch Infiltrieren von Blättern mit einem Extraktionsmedium ohne Aufbrechen der Pflanzenzellen.
  • Die WO 94/03617 offenbart die Herstellung von AFPs aus Hefe und ihre mögliche Verwendung in Eiscreme. Die WO 96/11586 beschreibt von Mikroben erzeugte Fisch-AFPs.
  • Die vorliegende Erfindung hat gefrorene Nahrungsmittelprodukte mit einer relativ harten und spröden Beschaffenheit zum Ziel, wobei diese Beschaffenheit bei längerer Lagerung bei niedrigen Temperaturen erhalten bleibt.
  • In einer Reihe von Literaturstellen wird nahe gelegt, dass AFPs potentiell verwendet werden können, um die Beschaffenheits-Eigenschaften gefrorener Konfekt-Produkte, wie Eiscreme, günstig zu beeinflussen. Die meisten dieser Dokumente liefern jedoch keine Lehre, wie diese günstigen Eigenschaften tatsächlich in der Praxis erreicht werden können.
  • Die WO 96/11586 (nicht vorveröffentlicht) lehrt die Anwendung von Fisch-Frostschutz-Polypeptiden in gefrorenen, fermentierten Nahrungsmittelprodukten. Harte und spröde Produkte werden nicht erwähnt.
  • Die WO 96/39878 (nicht vorveröffentlicht) beschreibt die Anwendung von AFP in Eiscreme, wobei ein spezifisches Gefrierverfahren verwendet wird. Für diese Anwendung geeignete AFPs können aus dem Blut und dem Muskelgewebe antarktischer Fische, arktischer Fische, Würmer und Insekten stammen. Wiederum werden harte und spröde Produkte nicht erwähnt.
  • Man fand überraschenderweise, dass AFPs in gefrorene Nahrungsmittelprodukte bequem eingebaut werden können, so dass sie zu den gewünschten Produkt-Eigenschaften führen, solange das Produkt und die Verarbeitungsbedingungen so variiert werden, dass die Eiskristall-Form spezifischen Anforderungen genügt.
  • Demgemäß betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines AFPs aufweisenden gefrorenen Nahrungsmittelprodukts, wobei die Bedingungen so gewählt werden, dass die Eiskristalle im Produkt ein Seitenverhältnis von mehr als 1,9, vorzugsweise von 1,9 bis 3,0, haben.
  • Wenn Nahrungsmittelprodukte gefroren werden, werden im gesamten Produkt Eiskristalle gebildet. Wenn AFPs in einzufrierende Nahrungsmittelprodukte eingeschlossen werden, kann dies im Allgemeinen zu einer günstigen Veränderung der Eis-Rekristallisationseigenschaften führen. Die Aggregation der Eiskristalle von AFP-hältigen Produkten kann die Sprödigkeit des Produkts bewirken.
  • Viele Konsumenten favorisieren relativ harte und spröde gefrorene Nahrungsmittelprodukte oder Ingredienzien derselben, wie Eiscreme oder Wassereis. Beispielsweise kann ein knuspriges Wassereis als attraktives Ingrediens bei gefrorenen Konfekt-Produkten verwendet werden, auch eine relativ harte Eiscreme wird von einer großen Konsumentengruppe gemocht.
  • Überraschenderweise fanden wir, dass AFPs die Möglichkeit bieten, gefrorene Nahrungsmittelprodukte zu formulieren, die einerseits relativ hart und spröde sind, und anderseits verbesserte Eis-Rekristallisationhemmungs-Eigenschaften haben. Die Anmelder stellten fest, dass diese vorteilhafte Kombination von Eigenschaften überraschenderweise erreicht werden kann, wenn das Seitenverhältnis der Eiskristalle im Produkt über 1,9, vorzugsweise zwischen 1,9 und 3, ist.
  • Das Seitenverhältnis von Eiskristallen ist als das Verhältnis der Länge und der Breite der Eiskristalle definiert. Ein Seitenverhältnis von über, vorzugsweise zwischen 1,9 und 3, entspricht länglichen Eiskristallen, deren Form nicht rundlich ist. Das Seitenverhältnis von Kristallen kann mit jedem geeigneten Verfahren bestimmt werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist in den Beispielen veranschaulicht. Vorzugsweise ist das Verhältnis zwischen 2,0 und 2,9, am meisten bevorzugt zwischen 2,1 und 2,8.
  • Vorzugsweise sind die gefrorenen Produkte der Erfindung spröde. Vorzugsweise ist die Mindest-Schichtdicke, bei welcher ein Bruchverhalten beobachtet werden kann, weniger als 10 mm, mehr bevorzugt von 1 bis 5 mm. Das Bruchverhalten kann entweder durch Herstellen von Schichten unterschiedlicher Dicke und Feststellen, bei welcher Mindestdicke ein Bruchverhalten auftritt, gemessen werden oder es kann aus dem Young-Modul, wie in den Beispielen beschrieben, berechnet werden.
  • Während der Formulierung und dem nachfolgenden Gefrieren von Nahrungsmittelprodukten können mehrere Parameter das Seitenver hältnis der zu bildenden Eiskristalle beeinflussen. Beispiele für Faktoren, die das Seitenverhältnis beeinflussen, sind nachstehend angegeben. Die Anmelder sind der Meinung, dass es wohl im Können des Fachmanns liegt, diese Bedingungen so zu wählen, dass das Seitenverhältnis der Eiskristalle in den gewünschten Bereich fällt.
  • Ein Faktor, der das Seitenverhältnis von Eiskristallen beeinflusst, ist die Geschwindigkeit, mit welcher das Produkt gefroren wird. Allgemein gesagt führt eine Erhöhung der Gefriergeschwindigkeit zu einer Verringerung des Seitenverhältnisses für die Eiskristalle. In diesem Zusammenhang kann die Temperatur des Gefrierens die Gefriergeschwindigkeit – und somit das Seitenverhältnis der Eiskristalle – beeinflussen. In diesem Zusammenhang sind Gefrierprozesse einschließlich eines Härtungsschritts beispielsweise bei einer Temperatur von unter –30° Fahrenheit (–34,44°C) manchmal bevorzugt. Die Lagerungstemperatur und Lagerungszeit können gleichermaßen das Seitenverhältnis beeinflussen, wobei höhere Lagerungstemperaturen und/oder längere Lagerungszeiten dazu neigen, die Bildung hoher Seitenverhältnisse zu begünstigen.
  • Ein weiterer Faktor, der das Seitenverhältnis von Eiskristallen beeinflusst, ist die Mobilität des Produkts während des Gefrierens. Wenn z.B. ein flüssiges Wassereis oder eine Eiscreme-Mischung gefroren werden soll, führt ruhiges Frieren zu einem ziemlich hohen Seitenverhältnis für die Eiskristalle, wogegen Rühren zu einem niedrigeren Seitenverhältnis führt. Mixen mit hoher Scherung führt zu noch niedrigeren Seitenverhältnissen.
  • Ein weiterer Faktor, der das Seitenverhältnis der Eiskristalle beeinflusst, ist das Vorhandensein und die Mengen von Ingredienzien. Beispielsweise kann das Vorhandensein von Ingredienzien, die dazu neigen, eine Netzwerk-Struktur im Produkt zu bilden (z.B. Gummis oder Fette), zu einem niedrigeren Seitenverhältnis führen als jenes bei Produkten ohne diese Ingredienzien. Auch andere Ingredienzien können zu niedrigeren Seitenverhältnissen führen, beispielsweise können hohe Feststoffmengen, z.B. große Zuckermengen, zu niedrigen Seitenverhältnissen führen.
  • Schließlich kann die Art und Menge der anwesenden AFPs zu einer Veränderung der Seitenverhältnisse führen. Einige AFPs scheinen die Bildung niedriger Seitenverhältnisse zu begünstigen, wogegen andere AFPs höhere Seitenverhältnisse zu induzieren scheinen. Ein geeigneter Test zur Auswahl dieser AFPs ist in den Beispielen beschrieben. Ein Variieren der Menge der AFPs kann ebenfalls zu einer Veränderung der Seitenverhältnisse führen.
  • Gemäß einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines AFP aufweisenden gefrorenen Nahrungsmittelprodukts, wobei die Formulierungs-, Gefrier- und Lager-Bedingungen so gewählt werden, dass die Eiskristalle im Produkt ein Seitenverhältnis von 1,9 bis 3 haben.
  • Das Verfahren der Erfindung kann auf jedes AFP enthaltende gefrorene Nahrungsmittelprodukt angewendet werden. Beispiele für geeignete Produkte sind Saucen, Mahlzeiten usw. Bevorzugte Nahrungsmittelprodukte sind gefrorene Konfekt-Produkte, wie Eiscreme und Wassereis.
  • Die Anmelder fanden, dass die AFPs zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren von einer Vielfalt von Quellen stammen können, wie Pflanzen, Fische, Insekten und Mikroorganismen. Sowohl natürlich vorkommende Spezies als auch durch genetische Modifizierung erhaltene Spezies können verwendet werden. Beispielsweise können Mikroorganismen oder Pflanzen genetisch modifiziert werden, damit sie AFPs exprimieren, und die AFPs können dann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Genmanipulationstechniken können, wie folgt, zur Herstellung von AFPs verwendet werden: Eine entsprechende Wirtszelle oder ein Wirtsorganismus würden mit einem Gen-Konstrukt, das das gewünschte Polypeptid enthält, transformiert. Die für das Polypeptid codierende Nukleotid-Sequenz kann in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, der für die für die Transkription und Translation notwendigen Elemente codiert, und in einer Weise, dass sie unter geeigneten Bedingungen (z.B. in der richtigen Orientierung und im korrekten Leserahmen und mit passenden Targeting- und Expressions-Sequenzen) exprimiert werden. Die zur Konstruktion dieser Expressionsvektoren notwendigen Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt.
  • Eine Reihe von Expressionssystemen kann zur Expression der für das Polypeptid codierenden Sequenz verwendet werden. Zu diesen zählen – ohne darauf eingeschränkt zu sein – Bakterien-, Hefe-, Insekten-Zellsysteme, Pflanzen-Zellkultur-Systeme und Pflanzen, die alle mit den entsprechenden Expressionsvektoren transformiert wurden.
  • Eine große Vielfalt von Pflanzen und Pflanzen-Zellsystemen kann mit den Nukleinsäure-Konstrukten der gewünschten Polypeptide transformiert werden. Bevorzugte Ausführungsformen würden Mais, Tomate, Tabak, Karotten, Erdbeeren, Rapssamen und Zuckerrübe einschließen, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.
  • Für den Zweck der Erfindung bevorzugte AFPs stammen aus Fisch (d.h., sie werden entweder direkt aus Fisch erhalten, oder die Fisch-Proteine werden von anderen Organismen transgenetisch erzeugt). Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Fisch-Proteinen vom Typ III, am meisten bevorzugt HPLC 12, wie in unserem nicht vor-veröffentlichten Fall PCT/EP96/02936 (WO 97/2343) beschrieben.
  • Bei einigen natürlichen Quellen können die AFPs aus einer Mischung aus zwei oder mehreren verschiedenen AFPs bestehen.
  • Vorzugsweise werden jene AFPs gewählt, die signifikante Eis-Rekristallisationshemmungs-Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise sehen die erfindungsgemäßen AFPs eine Eis-Partikelgröße nach Rekristallisation – vorzugsweise gemäß den Beispielen gemessen – von weniger als 20 μm, mehr bevorzugt von 5 bis 15 μm, vor. Man nimmt an, dass die kleine Eiskristallgröße in Verbindung mit dem spezifischen Seitenverhältnis besonders vorteilhaft ist, um die gewünschten Strukturmerkmale zu erlangen.
  • Eine sehr vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung betrifft Produkt-Formulierungen, die so gewählt werden, dass bei der Zubereitung des Produkts ruhige Gefrierbedingungen verwendet werden können, während man dennoch das wie oben definierte Seitenverhältnis erhält.
  • Beispiele für solche Nahrungsmittelprodukte sind: gefrorene Konfekt-Mischungen, wie Eiscreme-Mischungen und Wassereis-Mischungen, die bei Umgebungstemperatur oder Kühlschrank-Temperatur gelagert werden sollen. Geeignete Produkt-Formen sind z.B.: eine Pulvermischung, die z.B. in einem Beutel oder in Sachets verpackt ist; wobei diese Mischung die Basis des gefrorenen Nahrungsmittelprodukts bilden kann, z.B. nach Zugabe von Wasser und gegebenenfalls anderen Ingredienzien und – gegebenenfalls – Versetzen mit Luft.
  • Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Mischung könnte eine (gegebenenfalls mit Luft versetzte) flüssige Mischung sein, die – nötigenfalls nach Zugabe weiterer Komponenten und gegebenenfalls weiterem Versetzen mit Luft – gefroren werden kann.
  • Der deutliche Vorteil der oben erwähnten Mischungen ist, dass das Vorhandensein des AFP-Ingrediens ein Gefrieren der Mischungen unter ruhigen Bedingungen, beispielsweise in einem Geschäfts- oder Heim-Gefriergerät, ermöglicht.
  • Sehr zweckmäßig sind diese Mischungen in geschlossenen Behältern (z.B. Kartons, Beuteln, Schachteln, Kunststoffbehältern usw.) verpackt. Für Einzelportionen ist die Packungsgröße im Allgemeinen von 10 bis 1000 g. Für Mehrportionen-Packungen können Größen von bis zu 500 kg zweckmäßig sein. Im Allgemeinen ist die Packungsgröße von 10 g bis 5000 g.
  • Wie oben angegeben, sind die bevorzugten Produkte, in welchen die AFPs verwendet werden, gefrorene Konfekt-Produkte, wie Eiscreme oder Wassereis. Vorzugsweise ist die Menge der AFPs von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, auf das Endprodukt bezogen. Wenn Trockenmischungen oder Konzentrate verwendet werden, kann die Konzentration höher sein, um zu gewährleisten, dass die Menge im endgültigen gefrorenen Produkt innerhalb der obigen Bereiche liegt.
  • Überraschenderweise fand man, dass Zusammensetzungen der Erfindung sehr geringe Mengen an AFPs enthalten können, während sie immer noch eine gute Qualität haben.
  • Bisher nahm man allgemein an, dass ziemlich große Mengen an AFP notwendig sind, um eine angemessene Verbesserung der Rekristallisationseigenschaften zu erlangen. Der Grund dafür ist, dass man allgemein annimmt, dass die AFPs auf signifikante Teile der Oberfläche der Eiskristalle wirken und daher nicht in ziemlich großen Mengen anwesend sein müssen, z.B. 0,01 Gew.-% oder mehr, um eine angemessene Wirkung zu erhalten.
  • Überraschenderweise stellte man nun auch fest, dass bei gefrorenen Produkten verbesserte Rekristallisationseigenschaften und eine gesteigerte Temperatur-Toleranz bereits erhalten werden können, wenn geringe Mengen an AFPs verwendet werden.
  • Überraschenderweise stellte man fest, dass die Menge an AFPs auch nur 0,1 bis 50 ppm betragen kann, während immer noch adäquate Rekristallisationseigenschaften und Temperatur-Toleranz in gefrorenen Konfekt-Produkten vorgesehen werden. Obwohl die Anmelder keineswegs durch irgendeine Theorie gebunden sein wollen, könnte der Grund dafür sein, dass die Wechselwirkung zwischen den Feststoffen des gefrorenen Konfekts und den AFPs einen ausgezeichneten Mechanismus für die Hemmung des Kristallwachstums vorsieht. Am zweckmäßigsten beträgt die Menge an AFP von 1 bis 40 ppm, besonders bevorzugt von 2 bis 10 ppm.
  • Für den Zweck der Erfindung umfasst der Ausdruck gefrorenes Konfekt-Produkt Milch-hältige gefrorene Konfektzubereitungen, wie Eiscreme, gefrorenes Jogurt, Sorbet, Fruchteis, Milcheis und gefrorener Pudding, Wassereissorten, Granitas (grobkörnige Sorbets) und gefrorene Fruchtpürees. Für einige Anwendungen ist die Verwendung von AFPs in gefrorenen, fermentierten Nahrungsmittelprodukten weniger bevorzugt.
  • Vorzugsweise ist die Menge an Feststoffen im gefrorenen Konfekt (z.B. Zucker, Fett, Geschmacksstoff usw.) mehr als 4 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 30 Gew.-%, mehr bevorzugt von 40 bis 70 Gew.-%.
  • Bei einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die harten und knusprigen gefrorenen Konfekt-Formulierungen verwendet, um einen Beschaffenheitskontrast in Eis-Konfekt-Zubereitungen zu erzeugen. Vorzugsweise enthalten solche Eis-Konfekt-Zubereitungen als einzelne Elemente in ihrer Struktur die AFP-enthaltende Zusammensetzung gemäß der Erfindung. Beispielsweise kann ein relativ weicher Eiscreme-Kern mit einer dünnen Schicht der Zusammensetzung der Erfindung überzogen sein, womit eine relativ harte und knusprige Schicht, die den Eiscreme-Kern umgibt, vorgesehen wird. Eine andere Ausführungsform könnte der Einbau der Formulierung der Erfindung als Einschlüsse in Eis-Konfekt-Zubereitungen sein. Eine dritte Ausführungsform wäre das Abwechseln von Eiscreme-Schichten mit der Formulierung der Erfindung, um dünne, knusprige Schichten vorzusehen, die mit den Eiscreme-Schichten abwechseln.
  • Beispiel I
  • Eine Vormischung zur Herstellung von Eiscreme wurde hergestellt, indem gemischt wurde:
    Ingrediens Gew.-%
    Magermilchpulver 10,00
    Saccharose 13,00
    Maltodextrin (MD40) 4,00
    Johannisbrotkernmehl 0,14
    Butterfett 8,00
    Monoglycerid (Palmitat) 0,30
    Vanillin 0,01
    AFP (Typ III HPLC-12, vgl. WO 97/2343) 0,01 oder keines (Kontrolle)
    Wasser Rest
  • Diese Mischung kann bei Umgebungstemperatur beispielsweise in einem Kunststoffbehälter praktisch gelagert werden.
  • Die Mischungen können bei der Herstellung einer Eiscreme durch Homogenisieren bei 2000 psi (137,9 bar) und 65°C, gefolgt von einer Ablagerung über Nacht bei 5°C, verwendet werden. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Gefriergeräts (MF50 SSHE Technohoy, ausgestattet mit einem Feststoff-Schläger („solid dasher"), der sich mit 240 U/min drehte, gefroren. Die Extrusionstemperatur betrug –4,5°C, die % Volumssteigerung war 110. Das Produkt wird dann bei –35°C gefroren und bei –80°C gelagert.
  • Nach zweimonatiger Lagerung hatte die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine deutlich bessere Beschaffenheit als die Kontroll-Probe.
  • Beispiel II
  • Eine Eiscreme wurde aus der folgenden Formulierung hergestellt:
    Ingrediens Gew.-%
    Magermilchpulver 10,00
    Saccharose 13,00
    Maltodextrin (MD40) 4,00
    Johannisbrotkernmehl 0,14
    Butterfett 8,00
    Monoglycerid (Palmitat) 0,30
    Vanillin 0,01
    AFP (Typ III HPLC-12) 0,01 oder keines (Kontrolle)
    Wasser Rest
  • Das Herstellungsverfahren war wie in Beispiel 1.
  • Proben beider Produkte wurden bei –18°C in einem Prolan-Umweltschrank etwa 12 h lang äquilibriert. Mikroskop-Objektträger wurden präpariert, indem eine dünne Schicht Eiscreme aus dem Zentrum dünner Glasplättchen gestrichen wurde.
  • Jeder Objektträger wurde auf einen Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch (bei –18°C) transferiert, wo Bilder von Eiskristallen (etwa 400 einzelne Eiskristalle) gesammelt und durch eine Videokamera zu einem Bild-Aufbewahrungs- und -Analysesystem übermittelt wurden.
  • Die aufbewahrten Bilder des Eiskristalls wurden manuell durch Umzeichnen seines Umfangs hervorgehoben, wodurch dann der gesamte Kristall ge"highlighted" wurde. Die Bilder der hervorgehobenen Kristalle wurden dann unter Verwendung der Bildanalyse- Software gemessen, die die Anzahl der Pixel zählt, die notwendig sind, um die längste gerade Linie (Länge), die kürzeste gerade Linie (Breite), das Seitenverhältnis (Länge/Breite) zu vervollständigen.
  • Das durchschnittliche Seitenverhältnis wurde für die Kristalle berechnet.
  • Für die Kontrollprobe war das Seitenverhältnis 1,45.
  • Für die AFP enthaltende Probe war das Seitenverhältnis 2,24.
  • Beispiel III
  • Die Sprödigkeit der Eiscreme von Beispiel II wurde durch Berechnungen über das Bruchverhalten der Eiscreme bestimmt. Unter Verwendung des 3-Punkt-Biegetests wurde der Young-Modul gemessen.
  • Der Young-Modul wurde gemessen, indem Streifen aus Eiscreme hergestellt wurden, diese 18 h lang in einem Gefrierschrank äquilibriert wurden und in einen Temperier-Schrank transferiert wurden. Die Streifen wurden auf eine 3-Punkt-Biege-Vorrichtung platziert, wie in Handbook of Plastics Test Methods (2. Ausgabe), Hg. R.P.Brown, George Godwin Ltd, 1981, beschrieben. Das Testen der Proben erfolgte sofort bei einer Verformungsgeschwindigkeit von 50 mm/min. Aus der Kraft-Verformungskurve wurde die anfängliche Neigung gemessen und verwendet, um den Young-Modul gemäß der folgenden Gleichung zu messen:
    Figure 00110001
    -worin L = Balkenspanne (110 mm), B = Probenbreite, W = Probenhöhe. Gewöhnlich wurden acht Proben getestet, um einen mittleren Young-Modul-Wert zu erhalten.
  • Unter Verwendung der von Williams & Cawood in Polymer Testing 9, 15-26 (1990) beschriebenen Berechnungen kann die Bruchzähigkeit errechnet werden.
  • Die Ergebnisse waren wie folgt: Für die Kontroll-Probe wurde eine Dicke von 966 Metern als notwendig berechnet, um eine spröde Schicht zu erhalten. Für die AFP-hältige Probe fand man eine Sprödigkeit (Bruchverhalten) bereits bei einer Dicke von 3 mm. Dies zeigt deutlich die verbesserte Sprödigkeit von Produkten der Erfindung. Beide Proben ergaben relativ weiche Produkte.
  • Beispiel IV
  • Dieses Beispiel beschreibt eine Methodik zur Auswahl jener AFPs, die die Bildung von Eiskristallformen, wie sie bei der Erfindung bevorzugt werden, begünstigen.
  • Das Eiskristallwachstum unter normalen Umständen erfolgt entlang der a-Achse des Kristalls. Wenn AFPs vorhanden sind, ist das Wachstum verändert. Diese selektive Beeinflussung der Kristallform kann dadurch erklärt werden, dass AFPs dazu neigen, an bestimmte Teile des Eiskristalls zu binden, wodurch sie das Wachstum des Eiskristalls in bestimmte Richtungen hemmen. Die Bindung kann beispielsweise an den Prisma-Ebenen (normal zur a-Achse) oder an den Pyramiden-Ebenen (von diesen Ebenen abstehend) erfolgen.
  • Die Anmelder stellten fest, dass AFPs, die die Bildung von Seitenverhältnissen gemäß der vorliegenden Erfindung begünstigen, beispielsweise gefunden werden können, indem man jene AFPs auswählt, die zur Bindung an die Prisma-Ebene neigen. Die Methodik zur Auswahl dieser spezifisch bindenden AFPs kann jede geeignete Methodik sein. Bei einem zweckmäßigen Test wird das sogenannte „Einzel-Eiskristall-'Halbkugel'-Wachstums-Experiment" („Single ice crystal 'hemisphere' growth experiment") verwendet, das auf der in Knight C.A., C.C. Cheng und A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of α-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes beschriebenen Technik beruht.
  • Ein gut isolierter 5 l-Plastikbecher wurde mit entionisiertem Wasser gefüllt und in einen Schrank mit Temperatursteuerung bei –1°C gegeben. Man ließ es dann langsam von oben her frieren. Nach zwei Tagen bedeckte ein einziger Kristall aus Eis mit einer Dicke von etwa 9 cm den Becher. Die kristallographische Orientierung dieses Kristalls wurde unter Verwendung von Einkristall-Röntgen-Diffraktions-Methoden bestimmt. Würfel aus Eis mit einer Abmessung von etwa 2 cm wurden aus dem großen Einkristall geschnitten, so dass eine Oberfläche parallel zur Prisma-Ebene war und eine andere parallel zur Basisfläche. So wurden orientierte Einkristalle aus Eis erzeugt.
  • Eine Vorrichtung wurde verwendet, die aus einem Messing-Kaltfinger (etwa 1 cm Durchmesser) bestand, auf welchen ein orientierter Impfkristall aufgefroren wurde. Der Keim wurde zuerst ausgehöhlt, so dass der Impfkristall um ihn herumpassen würde. Danach wurde Kühlmittel durch den Finger zirkuliert, und der Keim wurde an ihm festgefroren.
  • Der Finger mit dem Impfkristall wurde dann in einen isolierten 100 ml-Becher getaucht, der eine Lösung des zu untersuchenden Materials enthielt. Die Anfangstemperatur der Lösung war Raumtemperatur (~ 18°C), und die einzige Kühlung wurde durch den Kaltfinger vorgesehen. Anfänglich schmolz der Impfkristall teilweise, jedoch dann wuchs er zu einer Einkristall-Halbkugel. Nach mehreren Stunden (6-8) war eine Halbkugel mit einem Durchmesser von 5-7 cm gebildet.
  • Der Versuch wurde mit verschiedenen AFP-Lösungen durchgeführt. Die verwendeten AFP-Lösungen hatten eine AFP-Konzentration von 10–3 mg/ml.
  • Die Halbkugel wurde dann vom Kaltfinger entfernt und in einen Temperatur-gesteuerten Schrank bei –15°C gebracht. Die Oberfläche wurde abgeschabt, und man beließ sie im Schrank mindestens über Nacht (16 Stunden oder mehr). Luft wurde mit einem eingebauten Ventilator durch den Schrank zirkuliert. Während dieser Zeit fand die Verdampfung der Oberflächenschichten des Eises statt. Die Oberfläche der Eis-Halbkugel erhielt somit eine spiegelglatte Oberfläche. Bei einer AFP-hältigen Halbkugel sieht man jedoch raue Flecken an der Oberfläche. Diese entsprechen den Flecken, an welchen AFP an die Oberfläche der Halbkugel gebunden hatte. Die großen AFP-Moleküle verhindern, dass die Eismoleküle verdampfen, und so wird eine raue Matte von AFP-Molekülen an der Oberfläche aufgebaut an jenen Oberflächen, wo vorzugsweise eine Bindung an das Eis auftritt. Da die Orientierung der Halbkugel bekannt ist und der Winkelabstand zwischen diesen rauen Flecken und den Basis- und Prisma-Richtungen mit einem optischen Goniometer gemessen werden kann, kann die Art der Bindungsebene leicht bestimmt werden.
  • Dieser Test kann verwendet werden, um jene AFPs auszuwählen, die dazu neigen, an die primären oder sekundären Prisma-Ebenen zu binden. Beispielsweise neigt das AFP, Typ I, von der Winterflunder oder von Pleuronectes quadritaberulatus („Alaskan plaice") dazu, an die (2 0 – 2 1)1 Bindungsstelle zu binden, wogegen AFGPs von Notothenia coriiceps („Antarktic cod") dazu neigen, an die (1 0 – 1 0)3 oder 5 Bindungsstelle zu binden, während AFP III von Antarktis-Aalmutter („Antarctic eel pout") dazu neigt, an die (1 0 – 1 0)2 oder 3 Bindungsstelle zu binden.
  • Es liegt sehr wohl im Können des Fachmanns, den obigen Test zur Bestimmung jener AFPs zu verwenden, die dazu neigen, die Bildung von Eiskristallen mit hohen Seitenverhältnissen zu begünstigen. Um ihre Zweckmäßigkeit in gefrorenen Produkten der Erfindung zu testen, kann das tatsächliche Produkt hergestellt werden, und das Seitenverhältnis der Kristalle im Produkt kann bestimmt werden.
  • Beispiel V
  • Test zum Bestimmen der Eiskristallgröße nach Rekristallisation.
  • Eine Probe einer AFP-hältigen Lösung in Wasser wird auf eine Saccharose-Menge von 30 Gew.-% eingestellt (Wenn die Ausgangsmenge der Probe mehr als 30% war, erfolgte dies durch Verdünnung, wenn die Ausgangsmenge niedriger war, wurde Saccharose zugegeben für die 30%-Menge).
  • Im Allgemeinen kann der Test an jeder geeigneten Zusammensetzung, die AFP und Wasser umfasst, angewendet werden. Im Allgemeinen ist die AFP-Menge in einer solchen Test-Zusammensetzung nicht sehr entscheidend und kann beispielsweise von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, mehr bevorzugt 0,0005 bis 0,1 Gew.-%, am meisten bevorzugt 0,001 bis 0,05 Gew.-%, z.B. 0,01 Gew.-%, sein.
  • Ein 3 μl Tropfen der Probe wird auf ein 22 mm-Deckglas gegeben. Ein 16 mm-Durchmesser-Deckglas wird dann oben darauf gegeben, und ein Gewicht von 200 g wird auf der Probe platziert, um eine einheitliche Objektträger-Dicke zu gewährleisten. Die Ränder des Deckglases werden mit durchsichtigem Nagellack verschlossen.
  • Der Objektträger wird auf einem Temperatur-gesteuerten Linkham THM 600-Mikroskoptisch platziert. Der Tisch wird rasch (50°C pro Minute) auf –40°C gekühlt, um eine große Population kleiner Kristalle zu erzeugen. Die Tisch-Temperatur wird dann rasch (50°C pro Minute) auf –6°C angehoben und auf dieser Temperatur gehalten.
  • Die Eisphase wird bei –6°C unter Verwendung eines Leica Aristoplan-Mikroskops beobachtet. Polarisierte Licht-Bedingungen in Verbindung mit einer Lambda-Platte wurden verwendet, um den Kontrast der Eiskristalle zu verstärken. Der Zustand der Eisphase (Größe der Eiskristalle) wird mit 35 mm Photomikrographie bei T = 0 und T = 1 Stunde aufgenommen. Wobei eine durchschnittliche Partikelgröße (visuelle Bestimmung, Zahlenmittel) von unter 20 μm, mehr bevorzugt zwischen 5 und 15 μm, bevorzugte AFPs zur Verwendung in erfindungsgemäßen Produkten anzeigt.

Claims (20)

  1. Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen, Frostschutz-Polypeptide umfassenden Nahrungsmittelprodukts, wobei die Bedingungen so gewählt werden, dass die Eiskristalle im Produkt ein Seitenverhältnis, definiert als die Länge geteilt durch die Breite, von mehr als 1,9 haben.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Seitenverhältnis zwischen 2,0 und 2,9 ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen zum Beeinflussen des Seitenverhältnisses ausgewählt sind aus der Gruppe von: Geschwindigkeit des Gefrierens, Mobilität des Produkts während des Gefrierens, Lagertemperatur und -zeit, Formulierung des Produkts und Art und Menge der Frostschutz-Polypeptide und Kombinationen davon.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Bedingungen zum Beeinflussen des Seitenverhältnisses das Zugeben von 0,0001 bis 0,5 Gew.-% Frostschutz-Polypeptiden umfassen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Frostschutz-Polypeptide ein Fisch-Frostschutz-Protein vom Typ III umfassen.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das gefrorene Nahrungsmittelprodukt ein gefrorenes Konfekt-Produkt ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das gefrorene Konfekt-Produkt ausgewählt ist aus Eiscreme, Wassereis und Milcheis.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das gefrorene Konfekt-Produkt ruhig gefroren wird.
  9. Gefrorenes Konfekt-Produkt, umfassend 0,0001 bis 0,5 Gew.-% Frostschutz-Polypeptide, wobei das Produkt ein Eiskristall-Seitenverhältnis von mehr als 1,9 hat.
  10. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach Anspruch 9, wobei das Sei tenverhältnis zwischen 2,0 und 2,9 ist.
  11. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach Anspruch 9, wobei die Frostschutz-Polypeptide vorzugsweise an die primären oder sekundären Prisma-Ebenen von Eiskristallen binden.
  12. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches spröde ist.
  13. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welches ausgewählt ist aus Eiscreme, Wassereis und Milcheis.
  14. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Frostschutz-Polypeptide durch Genmanipulation erzeugt sind.
  15. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Frostschutz-Proteine ein Fisch-Frostschutz-Protein vom Typ III umfassen.
  16. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei die Frostschutz-Proteine ein Typ III-HPLC-12-Frostschutz-Protein umfassen.
  17. Gefrorenes Konfekt-Produkt mit einem Beschaffenheits-Kontrast, wobei das Produkt einzelne Elemente eines gefrorenen Konfekt-Produkts eines der Ansprüche 9 bis 16 umfasst.
  18. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach Anspruch 17, umfassend dünne Eiscreme-Schichten, die mit dünnen Wassereis-Schichten abwechseln, wobei die Wassereis-Schichten 0,0001 bis 0,5 Gew.-% Frostschutz-Polypeptide aufweisen und ein Eiskristall-Seitenverhältnis von 1,9 bis 3,0 haben.
  19. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach Anspruch 17, wobei die einzelnen Elemente Einschlüsse sind.
  20. Gefrorenes Konfekt-Produkt nach Anspruch 19, wobei die einzelnen Elemente eine dünne Schicht sind, die einen Kern aus Eiscreme überziehen.
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