KR20000029565A

KR20000029565A - 빙결억제펩티드를함유한냉동식품

Info

Publication number: KR20000029565A
Application number: KR1019997000623A
Authority: KR
Inventors: 리처드 안토니 펜; 데이비드 니담; 케이쓰 스몰우드
Original assignee: 알 브이 테이트 (로드니 비버스 테이트);에이치 드로이. 씨. 지. 오닌크;이. 에디, 산드라 웨드워즈 (에스 제이 에드워즈); 유니레버 엔.브이.
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2000-05-25
Also published as: SK9499A3; ES2268733T3; NO990316D0; PT924990E; IL127488A; EP0924990A1; ATE331441T1; CZ25199A3; CN1226139A; DE69736234T2; TR199900147T2; CA2261315A1; BR9710519A; PL331483A1; JP4338054B2; AU720354B2; IL127488A0; DK0924990T3; DE69736234D1; CN1081444C

Abstract

본 발명은 제품에서의 얼음 결정이 1.9 내지 3의 종횡비를 갖도록 조건을 선택하는, 빙결 억제 펩티드를 함유하는 냉동 식품의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

빙결 억제 펩티드를 함유한 냉동 식품{Frozen Food with Antifreeze Peptides}

빙결 억제 펩티드 (AFP)는 식료품의 냉동 허용도를 개선시키는 것으로 제안되어 왔다.

빙결 억제 단백질이 예를 들어, 문헌 [Marilyn Griffith 및 K. Vanya Ewart, Biotechnology Advances, Vol 13, No 3, pp 375-402, 1995 참조]에 설명되어 있다. 빙결 억제 특성은 일반적으로 열 히스테리시스 (hysteresis), 얼음 재결정화 억제, 얼음 결정 모양 조절 및 얼음 핵형성제와의 상호작용 중 하나 이상의 특성을 갖는다.

열 히스테리시스는 AFP의 가장 잘 알려진 특성이고, 이 특성은 보통 AFP의 존재 유무를 시험하는데 사용된다. 열 히스테리시스는 융점에는 영향을 주지 않으면서 열 히스테리시스 활성 AFP를 함유하는 용액의 겉보기 동결 온도를 저하시키기 때문에 생긴다. 열 히스테리시스 시험에 의해 AFP원의 존재를 확인하는 것이 문헌에 널리 설명되어 있다 [John G Duman, Cryobiology 30, 322-328 (1993) 참조].

얼음 재결정화 억제는 AFP의 또 다른 특성이다. 이 활성을 얼음 결정 성장 억제라고도 말한다. 이 특성은 AFP의 존재 및 부재하에서 결정의 얼음 결정 크기를 특정 시점에서 비교하여 시험할 수 있다. 어류 AFP 시험에 이 방법을 적용한 예가 미국 특허 제5,118,792호 (DNA Plant Technology Corporation)에 설명되어 있다.

AFP의 세 번째 특성은 얼음 결정의 모양에 영향을 주는 능력이다. 이 특성은 AFP가 얼음 결정의 특정 면에 선택적으로 결합하여 특정 방향으로 결정 성장을 제한하기 때문에 생긴다. 6각쌍뿔 모양을 한 얼음 결정의 존재는 AFP가 존재한다는 것의 징표로 생각된다. 예를 들어, 국제 특허 공개 제92/22581호 (워터루 (Wateloo) 대학)에서 가을 호밀 AFP의 세포외 활성을 시험하는데 이 방법을 설명하고 있다.

AFP의 네 번째 특성은 얼음 핵형성 물질의 활성을 억제하는 능력이다. AFP와 얼음 핵형성제간의 상호작용이 예를 들어, 열 히스테리시스를 증가시킬 수 있다. 이 특성은 예를 들어, 국제 특허 공개 제96/40973호 (노틀담 뒤 라크 (Notre dame du Lac) 대학)에서 시험되었다.

AFP가 제품의 냉동 허용도를 개선시키는 것으로 제안되어 왔다. 이와 관련하여 많은 용도들이 제안되어 왔다.

예를 들어, AFP는 생물학적 물질의 동결보존성을 개선시키는 것으로 제안되어 왔다 (국제 특허 공개 제91/12718호, 아고우론 파마슈티칼즈 (Agouron Pharmaceuticals), 국제 특허 공개 제91/10361호, 더 리전츠 오브 더 유니버서티 오브 캘리포니아 (The Regents of the University of California)). 또한, AFP는 예를 들어, 화장품 또는 약품에서 리포좀의 누출을 막는 것으로 제안되어 왔다 (국제 특허 공개 제96/20695호 참조). 또 다른 용도로 AFP를 식물에 도입시킴으로써 (또는 식물 내에서 형질전환 기법으로 생성시킴으로써) 식물의 냉동 허용도를 증가시키는 것이 가능하다 [J. Cell. Biochem. Suppl. vol. 14e, 1990, page 303 XP002030248, Lee 외, 요약 R228 참조]. 또한, 예를 들어 프로즌 요구르트 또는 아이스크림과 같은 식품에 어류 AFP를 사용하는 것이 제안되어 왔다 [미국 특허 제5,620,732호, 필스버리 (Pillsbury) 및 국제 특허 공개 제96/11586호, 에이치에스씨 리서치 앤드 디벨럽먼트 리미티드 파트너쉽 (HSC Research and development limited partnership)].

그러나, 오늘날까지 AFP는 상업적 규모로는 사용되지 않았다. 많은 AFP가 개시되었음에도 불구하고, 상업적으로 실시될 수 없었던 이유 중 하나는 실제 상업 제품 제조에서는 실제로 심각한 문제점에 부딪치기 때문이라는 것이 본 출원인들의 견해이다.

본 출원인들은, 이런 문제점에 대한 중요한 이유 중의 하나로, 문헌에 설명되어 있는 매우 많은 AFP 중에 오로지 한정된 몇몇 AFP만이 각 용도에 적절히 사용될 수 있다는 것을 발견하였고, 또한 본 출원인들은 적당한 AFP를 선별하는 것이 원하는 용도 및(또한) 이루고자 하는 제품 특성에 따라 이루어지는 것을 발견하였다.

국제 특허 공개 제90/13571호에서는 화학적으로 또는 DNA 재조합 기술에 의해 생성된 빙결 억제 펩티드를 기재하고 있다. AFP는 아이스크림과 같은 식품에 적절히 사용될 수 있다. 실시예 3B는 빙수 혼합물을 AFP 0.01 중량%와 조합하여 막으로 냉동시켰을 때의 변경된 얼음 결정 모양을 보여준다.

국제 특허 공개 제92/22581호는 식물에서 얻어진 AFP를 기재하고 있다. 또한, 이 문헌은 식물 세포를 파괴하지 않고 추출 매질에 잎을 침윤시킴으로써 식물의 세포외 공간으로부터 폴리펩티드 조성물을 추출하는 방법을 설명하고 있다.

국제 특허 공개 제94/03617호는 효모로부터 AFP를 제조하는 방법 및 아이스크림에 사용될 가능성을 기재하고 있다. 국제 특허 공개 제96/11586호는 미생물에 의해 생산된 어류 AFP를 기재하고 있다.

본 발명은 저온에서 장기간 저장시에도 유지되는, 비교적 딱딱하고 바삭바삭한 텍스쳐 (texture)를 갖는 냉동 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

아이스크림과 같은 빙과류 제품의 텍스쳐 특성에 유리하게 영향을 주기 위해 AFP가 잠재적으로 사용될 수 있다는 것을 많은 문헌들이 제안하고 있다. 그러나, 이런 문헌의 대부분은 이런 유리한 특성들이 실제로 달성될 수 있는 방법을 제공하고 있지는 않다.

국제 특허 공개 제96/11586호 (미리 공개되지 않음)는 냉동 발효 식품에서 어류 빙결 억제 폴리펩티드의 사용을 교시하고 있다. 딱딱하고, 부서지기 쉬운 제품은 언급하지 않는다.

국제 특허 공개 제96/39878호 (미리 공개되지 않음)는 특이한 동결 과정을 사용함으로써 아이스크림에서의 AFP의 사용을 설명하고 있다. 이런 용도에 적절한 AFP는 남극 어류, 북극 어류, 벌레 및 곤충의 혈액 및 근육 조직으로부터 유래될 수 있다. 이 문헌에서도 역시 딱딱하고 부서지기 쉬운 제품을 언급하지는 않는다.

놀랍게도, 제품 및 공정 조건을 변화시켜서 얼음 결정 모양이 특정 요건을 충족시키도록 한다면, AFP를 냉동 식품에 편리하게 배합하여 원하는 제품 특성을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다.

따라서 제1측면으로, 본 발명은 냉동 식품 중의 얼음 결정이 1.9 이상, 바람직하게는 1.9 내지 3.0의 종횡비를 갖도록 조건을 선택하는, AFP를 함유한 냉동 식품의 제조 방법에 관한 것이다.

식품을 동결시키면, 얼음 결정은 제품 전체에 형성된다. AFP가 냉동되는 식품에 함유되어 있으면, 일반적으로 얼음 재결정화 특성에 유리한 변화를 일으킬 수 있다. AFP 함유 제품의 얼음 결정 집합체는 제품의 부서짐을 유발할 수 있다.

많은 소비자들은 아이스크림 또는 샤베트와 같이 비교적 딱딱하고 부서지기 쉬운 냉동 식품 또는 성분을 선호한다. 예를 들어 부드러운 샤베트는 빙과류 제품에 매력적인 성분으로 사용될 수 있고, 또한 비교적 딱딱한 아이스크림은 많은 소비자들이 좋아한다.

놀랍게도, 본 발명자들은 AFP가 한편으로는 비교적 딱딱하고 부서지기 쉽고 다른 한편으로는 개선된 얼음 재결정화 억제 특성을 갖는 냉동 식품을 제조할 수 있는 기회를 제공한다는 것을 발견하였다. 본 출원인들은 놀랍게도 제품에서 얼음 결정의 종횡비가 1.9 초과, 바람직하게는 1.9 내지 3인 경우 이러한 특성의 유리한 조합이 달성될 수 있다는 것을 발견하였다.

얼음 결정의 종횡비는 얼음 결정의 길이와 폭의 비로 정의된다. 1.9 내지 3의 종횡비는 모양이 둥글지 않은 기다란 얼음 결정에 해당한다. 임의의 적당한 방법에 의해 결정의 종횡비를 측정할 수 있다. 바람직한 방법이 실시예에서 설명된다. 2.0 내지 2.9의 종횡비가 바람직하고, 2.1 내지 2.8이 가장 바람직하다.

본 발명의 냉동 식품은 부서지기 쉬운 것이 바람직하다. 부서짐 거동이 관찰될 수 있는 최소 층 두께는 바람직하게는 10 mm 미만, 보다 바람직하게는 1 내지 5 mm이다. 부서짐 거동은 다양한 두께의 층들을 제조해서 부서짐 거동이 생기는 최소 두께에서 측정하거나 실시예에 설명되는 것과 같이 영률 (Young's Modulus)로부터 계산될 수 있다.

배합시키고 이후에 식품을 동결시키는 동안, 몇몇 파라미터들이 형성되는 얼음 결정의 종횡비에 영향을 미칠 수 있다. 종횡비에 영향을 끼치는 인자의 예들을 아래에 나타내었다. 본 출원인들은 얼음 결정의 종횡비가 원하는 범위 내에 속하는 조건을 선택하는 것을 숙련자들이 능히 해낼 수 있다고 본다.

얼음 결정의 종횡비에 영향을 끼치는 하나의 인자는 제품의 동결 속도이다. 일반적으로 말하면, 동결 속도가 빨라지면 얼음 결정의 종횡비는 감소한다. 이와 관련하여, 동결 온도는 동결 속도 및 그에 따라 얼음 결정의 종횡비에 영향을 끼칠 수 있다. 이와 관련해서 예를 들어 -30 ℉ 아래의 온도에서의 경화 단계를 포함하는 동결 공정이 때로는 바람직하다. 저장 온도 및 저장 시간도 마찬가지로 종횡비에 영향을 줄 수 있어서, 높은 저장 온도 및(또는) 긴 저장 시간에서 높은 종횡비가 얻어지는 경향이 있다.

얼음 결정의 종횡비에 영향을 끼치는 또 다른 인자로는 동결시 제품의 움직임이다. 예를 들어, 액상의 샤베트 또는 아이스크림 믹스를 동결시키고자 하는 경우, 정지 상태에서의 동결은 얼음 결정의 종횡비가 상당히 높아지게 하는 반면, 교반을 동반하는 동결은 종횡비가 낮아지게 한다. 고전단 혼합은 종횡비가 더욱 낮아지게 한다.

얼음 결정의 종횡비에 영향을 끼치는 또 다른 인자는 성분들의 존재 및 그의 양이다. 예를 들어, 제품에서 망상 구조를 형성하는 경향이 있는 성분 (검 또는 지방)이 존재한다면 이들 성분이 없는 제품에서보다 낮은 종횡비를 얻게될 수 있다. 또한, 다른 성분들도 낮은 종횡비를 유도할 수 있는데, 예를 들어 높은 고형분 함량 (예를 들어, 많은 설탕량)은 낮은 종횡비를 유도할 수 있다.

마지막으로, 존재하는 AFP의 특성 및 양이 종횡비의 변화를 일으킬 수 있다. 몇몇 AFP는 낮은 종횡비의 형성에 유리한 것으로 보이는 반면, 또 다른 AFP는 보다 높은 종횡비를 유도하는 것으로 보인다. 이들 AFP를 선별하기 위한 적당한 시험이 실시예에서 설명된다. AFP 양의 변동도 종횡비의 변화를 일으킬 수 있다.

두 번째 실시형태에 따라서, 본 발명은 배합, 동결 및 저장 조건이 제품 중의 얼음 결정이 1.9 내지 3의 종횡비를 갖도록 선택되는, AFP를 함유한 냉동 식품의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법을 AFP를 함유하는 모든 냉동 식품에 적용할 수 있다. 적합한 제품의 예로는 소스, 밀 (meal) 등이 있다. 아이스크림 및 샤베트와 같은 빙과류 제품이 바람직하다.

본 출원인들은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 AFP를 식물, 어류, 곤충 및 미생물과 같은 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 자연 상태의 종 또는 유전적 개질을 통해 얻을 수 있는 종을 모두 사용할 수 있다. 예를 들어 미생물 또는 식물을 유전적으로 개질시켜 AFP를 발현하도록 할 수 있고, 이 AFP를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

AFP를 제조하는데 아래와 같이 유전자 조작 기술을 사용할 수 있다. 적당한 숙주 세포 또는 유기체를 원하는 폴리펩티드를 함유하는 유전자 구조물에 의해 형질전환시킨다. 폴리펩티드를 코팅하는 헥산 서열을 전사 및 번역을 위한 필수 요소를 코딩하는 적당한 발현 벡터에, 이들이 적당한 조건에서 (예를 들어, 적절한 방향성 및 정확한 리딩 프레임에서 적절한 타겟팅 및 발현 순서대로) 발현되도록 삽입할 수 있다. 이들 발현 벡터의 구축에 필요한 방법은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.

폴리펩티드 코딩 서열을 발현시키는 데는 많은 발현계를 이용할 수 있다. 이들의 예로는 적절한 발현 벡터로 형질전환된 박테리아, 효모 곤충 세포계, 식물 세포 배양계 및 식물이 있지만, 여기에 한정되지는 않는다.

갖가지 식물 및 식물 세포계를 원하는 폴리펩티드의 핵산 구조물로 형질전환시킬 수 있다. 바람직한 실시형태는 옥수수, 토마토, 담배, 당근, 딸기류, 평지씨 및 사탕무가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 목적에 있어서, 바람직한 AFP는 어류에서 유래한 것들이다 (즉, 이들을 어류에서 직접 얻거나, 형질전환에 의해 다른 유기체가 생산한 어류 단백질에서부터 얻을 수 있다). 어류 단백질 III형을 사용하는 것이 특히 바람직하고, 본 출원인들의 미리 공개되지 않은 사건 제PCT/EP96/02936호 (국제 특허 공개 제97/2343호)에서 설명되어 있는 HPLC 12가 가장 바람직하다.

일부 천연 공급원에서, AFP는 2종 이상의 상이한 AFP의 혼합물로 구성될 수 있다.

뚜렷한 얼음-재결정화 억제 특성을 갖는 AFP를 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 AFP는 재결정화시에 바람직하게는 20 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 5 내지 15 ㎛의 얼음 입도 (실시예에 따라 측정하는 것이 바람직함)를 제공한다. 특정 종횡비와 함께 작은 크기의 얼음 결정이 원하는 구조적 특성을 얻는데 특히 유리하다고 생각된다.

본 발명의 매우 이로운 실시형태는 상기에서 정의된 종횡비는 그대로 얻으면서 제품의 제조시에 정지 상태의 동결 조건을 사용할 수 있도록 선택되는 제품 유형에 관한 것이다.

이런 식품의 예로는 상온 또는 냉장 온도에서 저장되도록 고안된 아이스크림 믹스 및 샤베트 믹스와 같은 빙과류 믹스가 있다. 적당한 제품 형태는 예를 들어, 봉지 또는 새세이 (sachet)에 포장되는 분말 믹스이다. 상기 믹스는 예를 들어, 물 및 임의적인 다른 성분을 첨가하고 (임의로) 공기 주입을 하면 냉동 식품의 주성분을 형성할 수 있다.

적당한 믹스의 또 다른 예로는, 필요하다면 추가의 성분 첨가 및 임의적인 추가의 공기 주입 후에 동결시킬 수 있는 (경우에 따라서는 공기 주입된) 액상 믹스가 있을 수 있다.

상기 언급된 믹스의 명백한 잇점은 AFP 성분의 존재로 인해 정지 상태, 예를 들면 상점 또는 가정의 냉장고에서 믹스를 동결시킬 수 있다는 것이다.

이 믹스는 매우 편리하게 밀폐 용기 (예를 들면, 카튼, 봉지, 상자, 플라스틱 용기 등)에 포장할 수 있다. 소량 판매용 포장 크기는 일반적으로 10 내지 1000 g이 될 것이다. 다량 판매용 포장 용량은 500 kg 이하가 적당할 수 있다. 일반적으로, 포장 용량은 10 g 내지 5000 g이 될 것이다.

상기에서 설명된 바대로, AFP를 사용하는 제품으로는 아이스크림 또는 샤베트와 같은 빙과류 제품이 바람직하다. AFP의 양은 최종 제품을 기준으로 0.0001 내지 0.5 중량%가 바람직하다. 건조 믹스 또는 농축액을 사용한다면, 최종 냉동 제품 중의 AFP 양이 상기 범위 내에 있도록 하기 위해 농도를 높일 수 있다.

놀랍게도, 본 발명의 조성물이 AFP를 매우 소량 함유하여도 양호한 품질을 그대로 유지할 수 있다는 것을 발견하였다.

지금까지는 재결정성을 적당히 개선시키기 위해서는 AFP 양이 꽤 많이 필요하다고 일반적으로 생각해 왔다. 그 이유는, AFP가 얼음 결정 표면의 상당히 많은 부분에 작용하기에 적당한 효과를 얻기 위해서는 상당히 많은 양, 예를 들면 0.01 중량% 이상으로 존재할 필요가 있다고 통상 여겨졌기 때문이다. 놀랍게도, 적은 양의 AFP를 사용하더라도 재결정화 특성이 개선되고 온도 내성이 증가된 냉동 제품을 얻을 수 있다는 것을 본 발명에 와서 발견하였다.

놀랍게도, 0.1 내지 50 ppm 정도로 적은 양의 AFP를 사용하여도 빙과류 제품에 적절한 재결정화 특성 및 온도 내성을 그대로 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 출원인들이 이 결과를 어떤 이론과 결부시켜서 제한하는 것을 결코 원하지는 않지만, 이런 결과는 빙과류의 고형분과 AFP 간의 상호작용이 결정 성장을 억제하는데 탁월한 메카니즘을 제공하기 때문일 것이다. AFP의 양이 1 내지 40 ppm인 것이 가장 알맞고, 2 내지 10 ppm이 특히 바람직하다.

본 발명의 목적에 있어 빙과류 제품이란 용어는 아이스크림, 프로즌 요구르트, 밀크 샤베트, 쇼베트, 아이스 밀크 및 냉동 카스타드 (custard)와 같은 우유 함유 빙과류, 샤베트, 그라니타 (granitas) 및 냉동 과즙 퓨레가 포함된다. 일부 용도에서는 냉동 발효 식품에 AFP를 사용하는 것이 덜 바람직하다.

빙과류 중의 고형분 함량 (예를 들면, 당, 지방, 향미제 등)은 4 중량% 이상, 바람직하게는 30 중량% 이상, 보다 바람직하게는 40 내지 70 중량%이다.

본 발명의 매우 바람직한 실시형태에서는 빙과에서 텍스쳐 콘트라스트 (contrast)를 형성하기 위해 딱딱하고 부서지기 쉬운 빙과류 배합물을 사용한다. 이런 빙과는 그의 구조물 중에 별도의 요소로서 본 발명에 따른 AFP 함유 조성물을 함유하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 비교적 부드러운 아이스크림 코어를 본 발명의 조성물로 된 얇은 층으로 둘러싸서 아이스크림 코어를 둘러싸는 비교적 딱딱하고 부서지기 쉬운 외층을 제공할 수 있다. 또 다른 실시형태는 빙과 내에 본 발명의 배합물을 함유물로서 배합하는 것이다. 세 번째 실시형태에서는 아이스크림 층들과 본 발명의 배합물을 얇고 부서지기 쉬운 층들이 아이스크림층들과 벌갈아서 존재하도록 하는 것이다.

본 발명은 빙결 억제 펩티드 (AFP)를 함유하는 식품의 제조 방법 및 AFP를 함유하는 식품에 관한 것이다.

＜실시예 I＞

아이스크림 제조용 예비 혼합물을 아래의 성분들을 혼합하여 제조하였다.

성분 중량%

탈지분유 10.00

수크로스 13.00

말토덱스트린 (MD 40) 4.00

로커스트 콩 검 0.14

버터 오일 8.00

모로글리세리드 (팔미테이트) 0.30

바닐린 0.01

AFP (HPLC-12 III형,

국제 특허 공개 제97/2343호 참조) 0.01 또는 없음 (대조 혼합물)

물 나머지

이 혼합물을 실온에서 예를 들어, 플라스틱 용기 내에 편리하게 저장할 수 있다.

이 혼합물을 2000 psi 및 65 ℃에서 균질화한 다음, 5 ℃에서 하룻밤 동안 숙성시킴으로써 아이스크림 제조에 사용할 수 있다. 이 혼합물을 동결장치 (240 rpm으로 회전하는 솔리드 교반기가 장착된 MF50 SSHE Technohoy)를 사용하여 동결시켰다. 압출 온도는 -4.5 ℃이고, 용적증가량 (overrun)은 110 %였다. 이어서, 생성물을 -35 ℃에서 냉동시키고, -80 ℃에서 저장하였다.

두 달간 저장한 후에 본 발명에 따른 조성물은 대조 샘플보다 현저하게 더 우수한 텍스쳐를 가졌다.

＜실시예 II＞

하기의 성분을 조합하여 아이스크림을 제조하였다.

성분 중량%

탈지분유 10.00

수크로스 13.00

말토덱스트린 (MD 40) 4.00

로커스트 콩 검 0.14

버터 오일 8.00

모로글리세리드 (팔미테이트) 0.30

바닐린 0.01

AFP (HPLC-12 III형) 0.01 또는 없음 (대조 혼합물)

물 나머지

제조 방법은 실시예 I과 동일하였다.

두 제품의 샘플을 프로란 (Prolan) 환경 캐비넷에서 대략 12 시간 동안 -18 ℃에서 평형시켰다. 얇은 유리판 중앙에 아이스크림을 얇은 층으로 발라서 현미경용 슬라이드를 제조하였다.

얼음 결정 (약 400개의 개별 얼음 결정)의 이미지가 수집되고, 이미지 저장 및 분석 시스템으로 비디오 카메라를 통해 연계되는 온도 조절 (18 ℃) 현미경 단으로 각 슬라이드를 옮겼다.

윤곽을 따라 손으로 그려서 저장된 얼음 결정 이미지를 두드러지게 한 다음, 전체 결정을 눈에 띄게 하였다. 그 다음 최장 직선 (길이), 최단 직선 (폭), 종횡비 (길이/폭)을 완료하기에 필요한 픽셀의 수를 세는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 두드러진 결정의 이미지를 측정하였다.

결정의 평균 종횡비를 계산하였다.

대조 샘플의 종횡비는 1.45였다.

AFP를 함유하는 샘플의 종횡비는 2.24였다.

＜실시예 III＞

아이스크림의 부서짐 거동을 계산함으로써 실시예 II의 아이스크림의 부서짐성을 측정하였다. 삼점 벤드 테스트 (3-Point bend test)룰 이용하여 영률 (Young's Modulus)을 측정하였다.

아이스크림 조각을 제조하고, 이를 냉동장치 캐비넷에서 18 시간 동안 평형시키고, 온도 캐비넷으로 이동시킴으로써 영률을 측정하였다. 이 조각들을 문헌 [Handbook of Plastics Test Methods (2판), ed R. P. Brown, George Godwin Ltd, 1981]에서 설명된 삼점 벤드 장치에 놓았다. 50 mm/분의 녹임 속도에서 샘플 시험을 즉시 수행하였다. 강제 녹임 곡선으로부터, 초기 기울기를 측정하여 하기의 식에 따라 영률을 측정하는데 사용하였다.

영률 (Pa) = (기울기·L) / (4·B·W)

식 중, L은 빔 스팬 (110 mm), B는 샘플 폭, W는 샘플 높이이다. 보통은 8개의 샘플을 시험하여 평균 영률 수치를 구했다.

문헌 [Williams ＆ Cawood, Polymer Testing 9 15-26 (1990)]에서 설명된 계산법을 사용하여 파괴 인성을 계산할 수 있다.

결과는 다음과 같았다. 대조 샘플에 대해서는 부서지기 쉬운 층을 얻기 위해 966 미터의 두께가 필요한 것으로 계산되었다. AFP 함유 샘플에 대해서는 부스러짐 (부서짐 거동)을 3 mm의 두께에서 이미 발견하였다. 이는 본 발명의 제품이 부서짐 면에서 개선되었음을 명백히 증명한다. 두 샘플 모두 비교적 부드러운 제품이 얻어졌다.

＜실시예 IV＞

이 실시예는 본 발명에서 바람직한 얼음 결정 모양의 형성을 유리하게 하는 AFP를 선택하는 방법론을 설명하고 있다.

보통의 조건하에서는 얼음 결정 성장이 결정 축을 따른다. AFP가 존재한다면, 성장은 변화된다. 이렇게 결정 모양이 선택적으로 영향을 받는 것은 AFP가 얼음 결정의 특정 부분에 결합하려 하고, 이렇게 함으로써 특정 방향으로 얼음 결정의 성장을 제한한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 결합은 예를 들어, (a-축에 수직인) 기둥 면 또는 (이들 면과 떨어져서 투영되는) 피라미드상 면에서 일어날 수 있다.

본 출원인들은 예를 들어, 기둥 면에서 결합하는 경향이 있는 AFP를 선택함으로써 본 발명에 따른 종횡비의 형성에 유리한 AFP를 찾을 수 있다는 것을 발견하였다. 특별히 이런 결합 AFP를 선택하는 방법론은 임의의 적당한 방법론이 될 수 있다. 문헌 [Knight C.A., C.C. Cheng 및 A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of α-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes]에서 설명되는 기술에 기초한 소위 "단일 얼음 결정 '반구체' 성장 실험"을 사용하는 시험이 적당하다.

잘 단열된 51 플라스틱 비이커에 탈이온수를 채우고, -1 ℃로 온도 조절된 캐비넷에 놓았다. 이어서, 이를 위에서부터 느리게 냉동시켰다. 2일 후에 대략 4 cm 두께의 단일 얼음 결정이 비이커를 덮었다. 단결정 X-선 회절 방법을 사용하여 이 결정의 결정학상 배향을 측정하였다. 큰 단결정으로부터 한쪽 면은 기둥 면과 평행하고, 다른 면은 기저면에 평행하게 대략 2 cm의 크기로된 입방형의 얼음을 잘라내었다. 따라서, 배향된 단결정의 얼음이 만들어졌다.

황동 손가락 냉각기 (대략 1 cm 직경)가 있는 장치를 사용하여 여기서 배향된 시드 결정을 냉동시켰다. 우선 시드를 파내서 시드 결정이 그 주위에서 맞도록 하였다. 이어서, 손가락 냉각기를 통해 냉매를 순환시키고, 시드는 급속히 냉각되었다.

이이서, 시드 결정이 있는 손가락 냉각기를 조사 중인 물질로된 용액을 포함하는 단열된 100 ml 비이커에 담그었다. 용액의 초기 온도는 실온 (∼18 ℃)이고, 냉각은 손가락 냉각기에 의해서만 이루어졌다. 초기에는 시드 결정이 부분적으로 녹았지만, 나중에는 단결정 반구체로 성장했다. 몇 시간 (6 내지 8) 후에 5 내지 7 cm의 직경을 갖는 반구체가 형성되었다.

여러 AFP 용액으로 실험을 수행하였다. 사용된 AFP 용액의 AFP 농도는 10^-3mg/ml였다.

이어서, 반구체를 손가락 냉각기로부터 빼내서 -15 ℃로 온도 조절된 캐비넷으로 이동시켰다. 표면을 닦고, 적어도 하룻밤 (16 시간 이상)은 캐비넷 안에 두었다. 일체형 팬에 의해 캐비넷을 통해 공기를 순환시켰다. 이 시간 동안, 얼음 표면층의 증발이 일어났다. 따라서, 얼음 반구체 표면은 매끈한 거울면을 갖게 되었다. 그러나, AFP를 함유하는 반구체에서는 표면 상에 울퉁불퉁한 패치가 보였다. 이것은 AFP가 반구체 표면상에 결합된 패치에 해당된다. 큰 AFP 분자는 얼음 분자가 증발하는 것을 막아서, 얼음과 선택적인 결합이 일어나는 표면에서는 표면상에 AFP 분자의 울퉁불퉁한 매트가 생긴다. 반구체의 배향이 알려져 있고, 이런 울퉁불퉁한 패치와 기저 및 기둥 방향 사이의 각도로 잰 거리를 광학 각도계로 측정할 수 있기 때문에, 결합 평면의 성질을 용이하게 측정할 수 있다.

이 시험은 1차 또는 2차 기둥면에 결합하는 경향이 있는 AFP를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 남극 대구로부터의 AFGPs는 (10-10)^{3 또는 5}결합 자리에 결합하려는 경향이 있고, 남극 등가시치로부터의 AFP III형은 (10-10)^{2 또는 3}결합 자리에 결합하려는 경향이 있는 반면,겨울 가자미목 어류 또는 알라스칸 가자미 AFP I형은 (20 내지 21)¹결합 자리에 결합하려는 경향이 있다.

높은 종횡비로된 얼음 결정의 형성을 유리하게 하는 경향이 있는 AFP를 측정하는 상기 시험은 숙련자들이 충분히 잘 해낼 것이다. 본 발명의 냉동 제품에 대한 그의 적합성 시험에서, 실제 제품을 제조할 수 있고, 제품으로된 결정의 종횡비를 측정할 수 있다.

＜실시예 V＞

재결정화에 따른 얼음 결정 크기 측정에 관한 시험

수크로스의 양이 30 중량%가 되도록 AFP 함유 수용액 샘플을 조정하였다 (샘플의 출발량이 30 % 이상일 경우는 이를 희석하고, 출발량이 이 보다 적을 경우는 수크로스를 30 % 수준까지 첨가하였다).

일반적으로, AFP 및 물을 포함하는 모든 적당한 조성물에 이 시험을 사용할 수 있다. 일반적으로, 이런 시험 조성물에서의 AFP의 양은 그다지 중요하지는 않으며, 예를 들어 0.0001 내지 0.5 중량%, 보다 바람직하게는 0.0005 내지 0.1 중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 0.5 중량%, 예를 들어 0.01 중량%일 수 있다.

3 ㎕의 샘플 방울을 22 mm의 덮개 유리에 놓는다. 이어서, 직경 16 mm의 덮개 유리를 위에 놓고, 슬라이드 두께가 균일하도록 200 g 추를 샘플에 놓았다. 덮개 유리의 가장자리를 투명한 네일 바니시 (nail varnish)로 봉하였다.

이 슬라이드를 린크햄 (Linkham) THM 600 온도 조절 현미경 단에 놓았다. 이 단을 -40 ℃로 빠르게 (분 당 50 ℃) 냉각시켜서 작은 결정들로 이루어진 커다란 덩어리가 생성되었다. 이어서, 스테이지 온도를 -6 ℃까지 (분 당 50 ℃) 빠르게 상승시키고, 이 온도로 유지하였다.

레이카 아리스토플랜 (Leica Aristoplan) 현미경을 사용하여 얼음상을 -6 ℃에서 관찰하였다. 람다 플레이트와 함께 편광 조건을 사용하여 얼음 결정의 콘트라스트를 개선시켰다. 얼음상의 상태 (얼음 결정의 크기)를 T=0 및 T=1 시간에서 35 mm 광현미경에 의해 기록하였다. 이렇게 하여 20 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 5 내지 15 ㎛의 평균 입도 (육안 측정, 수평균)가 본 발명에 따른 제품에 사용하기에 바람직한 AFP라는 것을 나타내었다.

Claims

냉동 식품 중의 얼음 결정의 종횡비가 1.9 이상이 되도록 조건을 선택하는, 빙결 억제 펩티드 (AFP)를 함유하는 냉동 식품의 제조 방법.
제1항에 있어서, 종횡비가 1.9 내지 3.0인 것인 방법.
제1항에 있어서, 종횡비에 영향을 끼치는 조건이 동결 속도, 동결시 제품 움직임, 저장 온도 및 시간, 제품의 배합비, 및 AFP의 특성 및 양, 및 이들 조건의 조합으로 구성되는 군 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 냉동 식품이 빙과류 제품인 방법.
AFP를 0.0001 내지 0.5 중량% 함유하고, 얼음 결정의 종횡비가 1.9 이상인 빙과류 제품.
제5항에 있어서, 종횡비가 1.9 내지 3.0인 빙과류 제품.
제5항에 있어서, AFP가 얼음 결정의 제1 또는 제2 기둥면에 우선적으로 결합하는 빙과류 제품.
제5항의 빙과 제품인 별도의 요소를 함유하는, 텍스쳐 콘트라스트가 있는 빙과류 제품.
제8항에 있어서, AFP를 0.0001 내지 0.5 중량% 포함하고 1.9 내지 3.0의 얼음 결정 종횡비를 갖는 얇은 샤베트(water ice)층과, 얇은 아이스크림층들을 교대로 포함하는 빙과류 제품.
제5항의 빙과류 제품의 제조에서 사용하기에 적당한 아이스크림 믹스.