PT924990E - Comida congelada contendo pépticos anticongelantes. - Google Patents

Description

ΡΕ0924990 1 DESCRIÇÃO "COMIDA CONGELADA CONTENDO PÉPTIDOS ANTICONGELANTES"

Descrição Âmbito Técnico da Invenção A presente invenção relaciona-se com um processo para a preparação de um produto alimentar contendo AFPs e com produtos alimentares contendo AFPs.

Antecedentes da Invenção

Os péptidos anticongelantes (AFPs) têm sido sugeridos para melhorar a tolerância ao congelamento de produtos alimentares.

As proteínas anticongelantes têm sido descritas na literatura, ver por exemplo Marilyn Griffith and K. Vanya Ewart in Biotechnology Advances, Vol 13, pp 375-402, 1995. As proteínas anticongelantes, normalmente possuem uma ou mais das seguintes propriedades: histerese térmica, inibição da recristalização de gelo, controle da forma dos cristais de gelo e interacção com nucleadores de gelo. A histerese térmica é a propriedade mais bem 2 ΡΕ0924990 conhecida das AFPs e a propriedade é normalmente utilizada para testar a presença de AFPs. Os resultados da histerese térmica resulta de uma diminuição da temperatura de congelação aparente de uma solução contendo um AFP de histerese térmica activa sem afectar a temperatura de fusão. A identificação de fontes de AFP por testes de histerese térmica é largamente descrita na literatura, ver exemplo John G. Duman in Cryobiology 30, 322-328 (1993). A inibição da recristalização de gelo é outra das propriedades dos AFPs. Esta actividade é também referida como supressão do crescimento de cristais de gelo. Esta propriedade pode ser testada por comparação num certo ponto do tempo do tamanho do cristal de gelo nos cristais na presença de AFP e na ausência de AFP. A aplicação deste método no teste de AFPs de peixe é descrita na patente US 5118792 (DNA Plant Technology Corporation).

Uma terceira propriedade dos AFPs é a sua capacidade de influenciar a forma dos cristais de gelo. Esta propriedade tem origem na ligação selectiva de AFPs a certas faces do cristal de gelo e deste modo limita o crescimento do cristal em certas direcções. A presença de cristais de gelo com forma de bipiramide hexagonal é então considerada indicativa da presença de AFP. Este método é por exemplo descrito para testar a actividade de AFPs ex-tracelular de centeio de Inverno em WO 92/22581 (University of Waterloo). 3 ΡΕ0924990

Uma quarta propriedade dos AFPs é a sua capacidade de inibir a actividade das substâncias nucle-adoras de gelo. Esta interacção entre um AFP e um nucleador de gelo pode por exemplo resultar num aumento da histerese térmica. Esta propriedade é por exemplo testada em WO 96/40973 (Universidade de Notre Dame du Lac) .

Os AFPs têm sido sugeridos para melhorar a tolerância ao congelamento dos produtos. Muitas aplicações têm sido sugeridas neste contexto.

Por exemplo os AFPs têm sido sugeridos para aumentar a criopreservação de materiais biológicos (WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of University of Califórnia). Também tem sido sugerido que os AFPs previnem o vazamento dos lipossomas e.g. em cosmética ou farmácia (ver WO 96/20695). Uma aplicação adicional possível é a de aumentar a tolerância de plantas ao congelamento incluindo nestes (ou na sua produção transgénica) um AFP (ver J. Cell. Biochem. Suppl. Vol. 14 e, 1990, page 303 XP002030248, Lee et. al., Abstract R28). Também os AFPs de peixe têm sido sugeridos para utilização em produtos alimentares por exemplo em iogurte congelado ou gelados (US 5620732 Pillsbury e WO 96/11586, FISC Research and Development limited partnership).

Até agora, no entanto a utilização de AFPs não tem sido aplicada numa escala comercial. Os solicitadores são da opinião que uma das razões para a falha na 4 ΡΕ0924990 implementação comercial é a de que apesar de muitos AFPs estarem descritos, na prática a implementação nos produtos comerciais actuais encontra sérios problemas.

Os requerentes verificaram que uma das razões chave para estes problemas é o de apesar de estarem descritos na literatura um largo número de AFPs apenas um grupo limitado de AFPs pode ser aplicado de modo adequado para cada aplicação; os requerentes também verificaram que esta selecção de AFPs adequados está dependente da aplicação desejada e/ou das caracteristicas desejadas para o produto. WO 90/13571 descreve os péptidos anticongelantes produzidos quimicamente ou por técnicas de recombinação de DNA. Os AFGPs podem ser adequados para serem utilizados em produtos alimentares tais como gelados. O Exemplo 3B mostra formas de cristais de gelo modificadas se uma mistura de sorvete for congelada num filme em combinação com 0,01% de AFP. WO 90/13571 descreve AFPs de plantas. Este documento também descreve um processo de extracção de uma composição polipétidica de espaço extracelular de plantas por infiltração das folhas com um meio de extracção sem romper as células da planta. WO 94/03617 descreve a produção de AFPs de leveduras e a sua possibilidade de utilização em gelados. 5 ΡΕ0924990 WO 96/11586 descreve AFPs de peixe produzidos por micróbios. A presente invenção visa proporcionar produtos alimentares congelados com uma textura relativamente frágil e dura, sendo a dita textura mantida durante um prolongado tempo de armazenamento, a baixas temperaturas.

Um número de documentos na literatura tem sugerido que os AFPs podem ser utilizados potencialmente para influenciar favoravelmente as propriedades de textura de produtos confeccionados congelados tais como gelados. No entanto a maior parte destes documentos não proporciona o ensinamento de como na prática estas propriedades favoráveis podem ser realmente alcançadas WO 96/11586 (não pré-publicada) ensina a aplicação de polipéptidos anticongelantes de peixe em produtos alimentares fermentados congelados. Os produtos quebradiços e duros não são referidos. WO 96/39878 (não pré-publicada) descreve a aplicação de AFP em gelado utilizando um processo de congelamento especifico. Uma vez mais não são referidos produtos quebradiços e duros.

Surpreendentemente verificou-se que os AFPs podem ser convenientemente incorporados em produtos alimentares congelados para resultar produtos com as propriedades 6 ΡΕ0924990 desejadas desde que produto e as condições de processamento variem de modo a que a forma do cristal de gelo satisfaça os requisitos específicos.

Consequentemente num primeiro aspecto, a invenção relaciona-se com um processo para a produção de um produto alimentar congelado compreendendo AFP, no qual as condições são escolhidas de modo a que os cristais de gelo no produto tenham uma razão de aspecto de maior do que 1,9, preferencialmente 1,9 a 3,0.

Se os produtos alimentares são congelados, formam-se cristais de gelo em todo o produto. Se os AFPs forem incluídos nos produtos alimentares a serem congelados isto pode levar a uma alteração favorável nas propriedades de recristalização do gelo. A agregação cristais de gelo de produtos contendo AFP pode causar a fragilidade do produto.

Muitos consumidores são favoráveis a produtos alimentares congelados relativamente duros e quebradiços ou seus ingredientes tais como gelados ou sorvete. Por exemplo sorvete quebradiço pode ser utilizado como um ingrediente atractivo em produtos congelados confeccionados, também gelado relativamente duro agrada a um largo grupo de consumidores.

Surpreendentemente verificamos que os AFPs oferecem a oportunidade de formular produtos alimentares congelados que por um lado são relativamente duros e 7 ΡΕ0924990 frágeis e por outro lado melhoram as propriedades de inibição de recristalização de gelo. Os requerentes verificaram surpreendentemente que esta combinação vantajosa de propriedades pode ser alcançada se a razão de aspecto dos cristais de gelo no produto acima for superior a 1,9, preferencialmente entre 1,9 e 3. A razão de aspecto dos cristais de gelo é definida como a razão entre o comprimento e a largura dos cristais de gelo. Uma razão de aspecto acima, preferencialmente entre 1,9 e 3 corresponde a cristais de gelo alongados, os quais não tem forma redonda. A razão de aspecto de cristais pode ser determinada por muitos métodos adequados. Um método preferido é ilustrado nos exemplos. Preferencialmente a razão está entre 2,0 e 2,9, mais preferencialmente entre 2,1 e 2,8.

Preferencialmente o produto congelado da invenção é quebradiço. Preferencialmente a espessura minima da camada à qual se observa o comportamento de fractura é inferior a 10 mm, mais preferencialmente 1 a 5 mm. 0 comportamento à fractura pode ser medido por preparação de camadas com várias espessuras e determinando qual a espessura minima à qual ocorre o comportamento de fractura ou calcular a partir do Modulo de Young como descrito para os exemplos.

Durante a formulação e consequente congelamento dos produtos alimentares vários parâmetros podem 8 ΡΕ0924990 influenciar a razão de aspecto dos cristais de gelo que vão ser formados. Os exemplos de factores que influenciam a razão de aspecto são dados abaixo. Os requerentes acreditam que está bem dentro das capacidades dos especialistas no assunto escolher aquelas condições para as quais a razão de aspecto de cristais de gelo fica dentro do intervalo desejado.

Um factor que influência a razão de aspecto dos cristais de gelo é a velocidade de congelamento do produto. Vulgarmente falando um aumento da velocidade de congelação conduz a uma diminuição da razão de aspecto dos cristais. Neste contexto a temperatura de congelação pode influenciar a velocidade de congelação e deste modo a razão de aspecto dos cristais de gelo. Neste contexto os processos de congelação incluem um passo de endurecimento, e.g. temperaturas abaixo de -30 Fahrenheit são algumas vezes preferidas. A temperatura de armazenamento e o tempo de armazenamento também influenciam igualmente a razão de aspecto, pelo que temperaturas de armazenamento mais elevadas e/ou tempos de armazenamento longos tendem a favorecer a formação de elevadas razões de aspecto.

Outro factor que influencia o aspecto dos cristais de gelo é a mobilidade do produto durante a congelação. Por exemplo se uma mistura de sorvete liquida ou gelado for congelada, o congelamento tranquilo conduzirá a uma razão de aspecto bastante elevada para os cristais de gelo, enquanto a agitação conduz a uma razão de aspecto 9 ΡΕ0924990 baixa.

Outro factor que influencia a razão de aspecto de cristais de gelo é a presença de quantidades de ingredientes. Por exemplo a presença de ingredientes que tendem a formar estruturas em rede no produto (e.g. gomas ou gorduras) podem conduzir a uma razão de aspecto inferiores à dos produtos sem estes ingredientes. Também outros ingredientes podem conduzir a uma razão de aspecto inferior, por exemplo se o nível de sólidos for elevado e.g. níveis de açúcar elevados podem conduzir a baixas razões de aspecto.

Finalmente a natureza e quantidade de AFPs presentes pode também conduzir a uma alteração nas razões de aspecto. Alguns AFPs parecem favorecer a formação de razões de aspecto baixas, enquanto outros AFPs parecem induzir razões de aspecto elevadas. Um teste adequado para seleccionar estes AFPs está descrito nos exemplos. A variação da quantidade de AFPs pode também conduzir a uma alteração das razões de aspecto.

De acordo com o segundo modo de realização, a invenção relaciona-se com um processo para a produção de um produto alimentar congelado compreendendo AFP, em que a formulação, condições de congelação e armazenamento são escolhidas de modo a que os cristais de gelo no produto tenham uma razão de aspecto desde 1,9 a 3. 10 ΡΕ0924990 O processo da invenção pode ser aplicado a qualquer produto alimentar congelado contendo AFPs. Os exemplos de produtos adequados são molhos, refeições etc. Os produtos alimentares preferidos são produtos confeccionados congelados tais como gelados e sorvete.

Os requerentes verificaram que os AFPs para utilização no processo da invenção podem ter proveniência numa variedade de fontes tais como plantas, peixes, insectos e microorganismos. As espécies de origem natural podem ser utilizadas ou espécies que foram obtidas através de modificação genética. Por exemplo os microorganismos ou plantas podem ser geneticamente modificadas para expressar AFPs e os AFPs podem então ser utilizados de acordo com a presente invenção.

As técnicas de modificação genética podem ser utilizadas para produzir AFPs como se segue: uma célula hospedeira ou microorganismo será transformada por construção de um gene que contem o polipéptido desejado. A codificação da sequência de nucleótidos para o polipéptido pode ser inserida num vector de expressão adequado codificando os elementos necessários para a transcrição e tradução de modo a que estes sejam expressos nas condições apropriadas (e.g com a orientação adequada e corrigir o quadro de leitura e sequências de expressão e alvo apropriadas). Os métodos requeridos para construir estes vectores de expressão são bem conhecidos pelos especialistas no assunto. 11 ΡΕ0924990

Um número de sistemas de expressão pode ser utilizado para expressar a sequência que codifica polipé-ptidos. Estes incluem, mas não se limitam a, bactérias, sistemas de células de leveduras de insectos, sistema de cultura de células de plantas e plantas todas transformadas com os vectores de expressão apropriados.

Uma grande variedade de plantas e sistemas de células de plantas podem ser transformadas com os ácidos nucleicos construtores dos polipéptidos desejados. Os modos de realização preferidos devem incluir, mas não se limitam a, milho, tomate, tabaco, cenouras, morangos, semente de colza e açúcar de beterraba.

Para o objectivo da invenção os AFPs preferidos derivam de peixe (i.e. eles são obtidos directamente a partir de peixe, ou de proteínas de peixe produzidas transgenicamente por outros organismos). Especialmente preferida é a utilização de proteínas de peixe de tipo III, mais preferencialmente HPLC 12 como descrito no nosso caso não pré-publicado PCT/EP96/02936 (WO 97/2343).

Nalgumas fontes naturais os AFPs podem existir como uma mistura de dois ou mais AFPs diferentes.

Preferencialmente os AFPs que são escolhidos têm propriedades significativas de inibição de recristalização de gelo. Preferencialmente os AFPs de acordo com a invenção 12 ΡΕ0924990 proporcionam um tamanho de cristal de gelo após recri-talização - preferencialmente medido de acordo com os exemplos - de menos do que 20 pm, mais preferencialmente desde 5 até 15 pm. Sabe-se que o pequeno tamanho de cristal de gelo combinado com a razão de aspecto específica é especialmente vantajoso para se obter as características estruturais desejáveis.

Um modo de realização muito vantajoso da invenção relaciona-se com as formulações do produto que são escolhidas de modo a que na preparação do produto sejam utilizadas as condições de congelação quiescente, enquanto se continua a obter a razão de aspecto como definido acima.

Os exemplos de tais produtos alimentares são: misturas confeccionadas congeladas tal como misturas de gelado e misturas de sorvete que são pretendidas para serem guardadas à temperatura ambiente ou temperatura de refrigerador. As formas de produto adequadas são por exemplo: uma mistura em pó que é empacotada por exemplo num saco ou em saquetas. Sendo a dita mistura capaz de formar a base do produto alimentar congelado e.g. após adição de água e opcionalmente outros ingredientes e arejamento opcional.

Outro exemplo de uma mistura adequada pode ser uma mistura líquida (opcionalmente arejada) a qual, se necessário após adição dos componentes adicionais e após arejamento opcional pode ser congelada. 13 ΡΕ0924990 A vantagem clara das misturas mencionadas acima é a de que a presença de ingredientes AFP permite às misturas serem congeladas sob condições quiescentes, por exemplo numa loja ou num congelador de casa.

Muito convenientemente estas misturas podem ser empacotadas em contentores fechados (e.g. cartões, sacos, caixas, contentores de plástico etc.) para porções únicas o tamanho do pacote deve ser normalmente desde 10 até 1000 g. Para porções múltiplas o tamanho adequado dos pacotes podem ir até 500 kg. Normalmente o tamanho do pacote deverá ser desde 10 g até 5000 g.

Como acima indicado os produtos preferidos onde os AFPs são utilizados são produtos confeccionados congelados tais como gelado ou sorvete. Preferencialmente o nivel de AFPs vão desde 0, 0001 até 0,5% peso com base no produto final. Se as misturas secas ou concentrados são utilizadas, a concentração pode ser mais elevada com o objectivo de assegurar que o nivel no produto final congelado esteja dentro dos intervalos acima.

Surpreendentemente verificou-se que as composições da invenção podem conter quantidades de AFPs muito baixas mantendo-se uma boa qualidade.

Até agora a crença geral era a de que os niveis de AFPs bastante elevados eram necessários para se obter um melhoramento razoável nas propriedades de recistalização. A 14 ΡΕ0924990 razão para deve-se ao facto de se pensar que os AFPs actuam em partes significativas da superficie dos cristais de gelo e deste modo precisam de estar presentes em níveis bastante elevados e.g. 0,01 % peso ou mais para se conseguir um efeito razoável.

Surpreendentemente verificou-se que também podem ser obtidos produtos congelados com propriedades de congelação melhoradas e aumento da tolerância à temperatura utilizando baixos níveis de AFPs.

Surpreendentemente verificou-se que os níveis de AFPs podem ser tão baixos como 0,1 a 50 ppm proporcionando mesmo assim produtos congelados com propriedades de recris-talização adequadas e tolerância à temperatura. Apesar dos requerentes não pretenderem estarem ligados a qualquer teoria, a razão para isto pode ser devido ao facto de a interacção entre os sólidos dos produtos confeccionados congelados e os AFPs proporcionarem um excelente mecanismo para inibir o crescimento de cristais. Mais convenientemente o nível de AFP vai desde 1 até 4 0 ppm, especialmente preferido desde 2 até 10 ppm.

Para o propósito da invenção o termo produto confeccionado congelado inclui leite contendo confecção congelada tal como gelados, iogurte congelado, sorvete, sorvete, leite gelado e pudim congelado, sorvete, grani- 15 ΡΕ0924990 zados e puré de fruta congelado. Para algumas aplicações a utilização de AFPs em produtos alimentares congelados fermentados é menos preferida.

Preferencialmente o nível de sólidos e confecções congeladas (e.g. açúcar, gordura, aras etc.) é maior do que 4% peso, preferencialmente mais do que 30% peso, e mais preferencialmente desde 4 a 70% peso

Num modo de realização muito preferido da invenção as formulações de confeitaria congeladas duras e quebradiças são utilizadas para criar a textura de contraste em confecções de gelo. Preferencialmente essas confecções de gelo contem como elementos distintos na sua estrutura a composição contendo AFP de acordo com a invenção. Por exemplo um centro de gelado relativamente macio pode ser revestido com uma camada fina da composição da invenção proporcionando deste modo uma camada relativamente dura e quebradiça que envolve o núcleo de gelado. Outro modo de realização pode ser a incorporação da formulação da invenção como inclusão em confecções - gelo. Um terceiro modo de realização é o de alternar as camadas de gelado com a formulação da invenção para criar camadas finas quebradiças alternadas com camadas de gelado.

Exemplo I

Uma pré-mistura para preparação de gelado pode ser efectuada misturando: 16 ΡΕ0924990 AFO (Tipo III HPLC-12, ver WO 97/2343) Água

Componente

Leite em pó desnatado Sacarose

Maltodextrina (MD40)

Goma de feijão Locust óleo de manteiga Monoglicerido (palmitato) vanilina % em peso 10,00 13, 00 4.00 0,14 8.00 0,30 0,01 0,01 ou nenhum (controlo) A perfazer

Esta mistura pode ser convenientemente guardada à temperatura ambiente e.g. num contentor de plástico.

As misturas podem ser utilizadas na preparação de um gelado por homogeneização a 2000 psi e 650C seguido de envelhecimento de um dia para o outro a soc. Esta mistura é congelada utilizando-se um congelador (MF50 SSHE Technohoy equipado com um misturador sólido rodando a 240 rpm) . A temperatura de extrusão é de -4,50C, o excesso foi de 110%. O produto é então congelado a -350C e guardado a -80°C.

Após dois meses de armazenamento a composição de acordo com a invenção tem marcadamente uma melhor textura do que a amostra de controlo.

Exemplo II

Um gelado foi preparado com a seguinte formulação : 17 ΡΕ0924990

Componente

Leite em pó desnatado Sacarose

Maltodextrina (MD40)

Goma de feijão Locust Óleo de manteiga Monoglicerido (palmitato) Vanilina AFO (Tipo III HPLC-12) Água % em peso 10,00 13, 00 4.00 0,14 8.00 0,30 0,01 0,01 ou nenhum (controlo) A perfazer O método de preparação foi como o do exemplo 1.

As amostras dos dois produtos foram equilibradas a -18°C num armário ambiental Prolan durante aproxi-madamente 12 horas. As lâminas de microscópio foram preparadas manchando placas de vidro fino, desde o centro, com uma fina camada de gelado.

Cada lâmina foi transferida para o microscópio com temperatura controlada (-18°C) onde as imagens dos cristais de gelo (cerca de 400 cristais de gelo) foram colhidas e retransmitidas através de uma câmara de video e foram guardadas numa imagem e sistema de análise.

As imagens dos cristais de gelo guardadas foram realçadas desenhando-se o perímetro à sua volta o que realça todo o cristal. As imagens realçadas foram medidas 18 ΡΕ0924990 utilizando um software de análise de imagem que conta o número de pixels necessários para completar a linha direita mais longa (comprimento), linha direita mais curta (largura), razão de aspecto (comprimento/largura).

Foi calculada a média da razão de aspecto para os cristais.

Para a amostra de controlo a razao de aspecto foi de 1,45.

Para a amostra contendo AFP a razão de aspecto foi de 2,24.

Exemplo III A fragilidade do gelado do exemplo II foi determinada calculando-se o comportamento à fractura do gelado. Utilizando o teste de curva de 3-Pontos mediu-se o Modulo de Young. 0 Módulo de Young foi medido preparando-se tiras de gelado, equilibrando-as durante 18 horas num armário congelador e transferindo estas para um armário com temperatura. As tiras foram colocadas num equipamento de curva de 3 pontos como descrito em Handbook of Plastics Test Methods (2nd Edition), ed R. P. Brown, George Godwin

Ltd, 1981. 0 teste foi efectuado nas amostras com uma velocidade de deformação de 50 mm/min. Da curva força- 19 ΡΕ0924990 deformação, foi medido o declive inicial e utilizado para calcular o Módulo de Young de acordo com a seguinte equação:

Declive . L Módulo de Young (Pa) = -

4 . B . W onde L= alcance do feixe, B= largura da amostra, W comprimento da amostra. Normalmente são testadas oito amostras para dar um valor médio do Módulo de Young.

Utilizando os cálculos descritos por Williams & Cawood in Polymer testing 9, 15-26 (1990) a dureza à frac- tura pode ser calculada.

Os resultados são os seguintes: para a amostra de controlo foi calculada uma espessura de 966 m como sendo a necessária para obter uma camada quebradiça. Para a amostra contendo AFP quebradiços (comportamento à fractura) foi encontrada para uma espessura de 3 mm. Isto mostra claramente o melhoramento da fragilidade dos produtos da invenção. Ambas as amostras deram produtos relativamente macios.

Exemplo IV

Este exemplo descreve uma metodologia para seleccionar aqueles AFPs que favorecem a formação de formas preferidas de cristais de gelo na invenção. 20 ΡΕ0924990 O crescimento dos cristais de gelo sob circunstâncias normais dá-se ao longo do eixo-a do cristal. Se os AFPs estiverem presentes o crescimento é alterado. Isto influência selectiva na forma do cristal pode ser explicada pelo facto dos AFPs terem tendência a se ligar a certas partes do cristal de gelo e por isso inibem o crescimento dos cristais em certas direcções. A ligação pode por exemplo ter lugar nos planos do prisma (perpendicular ao eixo-a) ou no plano piramidal (projecção destes planos)

Os requerentes verificaram que os AFPs que favorecem a formação das razões de aspecto de acordo com a presente invenção podem por exemplo ser encontrados seleccionando aqueles AFPs que tendem a se ligar ao plano do prisma. A metodologia para seleccionar estes AFPs de ligação especifica pode ser qualquer metodologia adequada. Um teste adequado chamado '"experiência de crescimento do hemisfério de cristal de gelo único", baseado na técnica descrita por Knight C. A., C.C. Cheng and A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of a-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.

Uma proveta de plástico bem isolada foi cheia com água desionizada, e colocada num armário de temperatura controlada a -1°C. Em seguida foi congelada lentamente desde o topo. Após dois dias um cristal de gelo simples de aproximadamente 4 cm de espessura cobria a proveta. A 21 ΡΕ0924990 orientação cristalográfica deste cristal foi determinada utilizando-se métodos de difracção de raio X de cristal único. Cubos de gelo, de aproximadamente 2 cm de dimensão, foram cortados do grande cristal único, de modo a que uma superfície fosse paralela ao plano do prisma, e outra paralela ao plano basal. Assim foram produzidos os cristais de gelo únicos orientados.

Foi utilizado um equipamento consistindo de um dedo frio de metal (aproximadamente 1 cm de diâmetro) sobre o qual foi congelado uma semente de cristal orientado. A semente foi primeiro escavada de modo a que o cristal semente coubesse à sua volta. 0 refrigerador circulou através do dedo e semente congelou rapidamente. 0 dedo, com o cristal semente, foi então mergulhado numa proveta isolada de lOOmL contendo uma solução do material a investigar. A temperatura inicial da solução era a temperatura ambiente (-18°C) e o único arrefecimento foi proporcionado pelo dedo frio. Inicialmente o cristal semente derreteu parcialmente, mas depois cresceu num cristal de hemisfério único. Após várias horas (6-8) formou-se um hemisfério de 5-7. A experiência foi efectuada com várias soluções de AFP. As soluções de AFP utilizadas tinham uma concentração de AFP de 1CT3 mg/mL. 0 hemisfério foi então removido do dedo frio, e 22 ΡΕ0924990 movido para um armário de temperatura controlada a -150°C. A superfície foi raspada e foi deixada na cabine pelo menos de um dia para o outro (16 horas ou mais) . 0 ar circulou através da cabine por meio de uma ventoinha integral. Durante este tempo ocorreu a evaporação das camadas superficiais do gelo. A superfície do gelo hemisférico começou assim a ter uma superfície espelhada macia. No entanto, para um hemisfério contendo AFP encontram-se pedaços ásperos. Isto corresponde a pedaços onde o AFP se ligou sobre a superfície do hemisfério. As moléculas grandes de AFP previnem a evaporação das moléculas de gelo, e assim forma-se uma esteira áspera de moléculas de AFP na superfície das superfícies onde ocorre a ligação preferencial ao gelo. Como a orientação do hemisfério é conhecida, e a distância angular entre estes pedaços ásperos e as direcções do prisma e basal podem ser medidas, através de um goniómetro óptico a natureza de ligação plana pode ser facilmente determinada.

Este teste pode ser utilizado para seleccionar AFPs que tendem a ligar-se a planos de prismas primários e secundários. Por exemplo AFP de tipo I da solha de pedras de Inverno ou da solha avessa do Alasca tendem a ligar-se ao sítio de ligação (2 0 - 2 l)1, enquanto os AFPGs do bacalhau do Atlântico tendem a ligar-se ao sítio de ligação (1 0 - 1 O)3, enquanto AFP III da lota do Antártico tendem a ligar-se ao sítio de ligação (10-1 O)2 ou 3.

Estará bem dentro da capacidade do especialista 23 ΡΕ0924990 no assunto utilizar o teste acima para determinar aqueles AFPs que tendem a favorecer a formação de razões de aspecto elevadas dos cristais de gelo. Para testar a sua aptidão em produtos congelados da invenção, o produto actual pode ser preparado e a razão de aspecto dos cristais no produto pode ser determinada.

Exemplo V

Teste para determinar o tamanho do cristal de gelo após recristalização.

Uma amostra de uma solução em água contendo AFP foi ajustada até um nivel de sacarose de 30% peso (se o nivel de partida da amostra for maior do que 30% isto é efectuado por diluição, se o nivel de partida for inferior adiciona-se sacarose até um nivel de 30%).

Normalmente o teste pode ser aplicado a qualquer composição adequada compreendendo AFP e água. Normalmente o nivel de AFP na composição teste não é muito critico e pode por exemplo ir desde 0,0001 até 0,5%, mais preferencialmente 0,0005 até 0,1% peso, mais preferencialmente 0,001 até 0,05%, por exemplo 0,01%.

Uma gota de 3pL da amostra é colocada numa lamela de 22 mm. Uma lamela de 16 mm de diâmetro é então colocada no topo e um peso de 200 g de peso foi colocada na amostra para garantir uma espessura de lâmina uniforme. As margens da lamela são seladas com verniz de unhas claro. 24 ΡΕ0924990 A lâmina é colocada num microscópio Linkham THM 600 de patamar de temperatura controlada. O patamar é arrefecida rapidamente (50°C por minuto) a -40°C para produzir uma grande população de pequenos cristais. A temperatura do patamar é então aumentada rapidamente (50°C por minuto) até -6°c e deixada a este temperatura. A fase de gelo é observada a -6°C utilizando um microscópio Leica Aristoplan. Foram utilizadas condições de luz polarizada em conjugação com uma placa lambda para aumentar o contraste dos cristais de gelo. O estado da fase do gelo (tamanho de cristais de gelo) é gravado numa fotomicrografia de 35 mm a T = 0 e T = 1 hora. Pelo que um tamanho de partícula médio (determinação visual, numero médio) abaixo de 20 pm, mais preferencialmente entre 5 e 15 pm indica AFPs preferidos para utilização em produtos de acordo com a invenção.

Lisboa, 27 de Setembro de 2006

Claims (20)

1. ΡΕ0924990 1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de um produto alimentar congelado compreendendo polipéptidos anticongelantes, em que as são condições escolhidas de modo a que os cristais de gelo no produto tenha uma razão de aspecto, definida como o comprimento a dividir pela largura, de mais do que 1,9.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a razão de aspecto está entre 2,0 e 2,9.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as condições para influenciar a razão de aspecto são seleccionadas de um grupo consistindo de: razão de congelação, mobilidade do produto durante a congelação, temperatura de armazenamento e tempo, formulação do produto e natureza e quantidade de polipetidos anticongelantes e suas combinações.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que as condições que influenciam a razão de aspecto compreendem adição desde 0,0001 até 0,5% peso de polipéptidos anticongelantes.
5. 5. Processo de acordo coma reivindicação 4, em que os polipéptidos anticongelantes compreendem proteínas anticongelantes tipo III de peixe. 2 ΡΕ0924990
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que o produto alimentar congelado é um produto confeccionado congelado.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que o produto confeccionado congelado é seleccionado de um gelado, água gelo e leite gelado.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 em que o produto confeccionado congelado é congelado de modo quiescente.
9. 9. Produto confeccionado congelado compreendendo desde 0,0001 até 0,5% peso de polipéptidos anticongelantes, tendo o referido produto uma razão de aspecto de cristal de gelo maior do que 1,9.
10. 10. Produto confeccionado congelado de acordo com a reivindicação 9, em que a razão de aspecto está entre 2,0 e 2,9. de acordo anticonge-do prisma de acordo
11. 11. Produto congelado confeccionado com a reivindicação 9, em que os polipéptidos lantes se ligam preferencialmente a planos primário e secundário de cristais de gelo.
12. 12. Produto confeccionado congelado 3 ΡΕ0924990 com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11 que é quebradiço.
13. 13. Produto confeccionado congelado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12 que é seleccionado de um gelado, água gelada e leite gelado.
14. 14. Produto confeccionado congelado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 13, em que os polipetidos anticongelantes são produzidos por manipulação genética.
15. 15. Produto confeccionado congelado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, em que as proteínas anticongelantes compreendem uma proteína anticongelante de tipo III de peixe.
16. 16. Produto confeccionado congelado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, em que as proteínas anticongelantes compreendem uma proteína anticongelante de tipo III HPLC 12.
17. 17. Produto confeccionado congelado compreendendo o referido produto elementos de um produto confeccionado congelado de qualquer uma das reivindicações de 9 a 16.
18. 18. Produto confeccionado congelado de acordo com a reivindicação 17, compreendendo camadas finas de gelo alternadas com camadas de gelo, em que as camadas de sorve- 4 ΡΕ0924990 te compreendem desde 0,0001 até 0,5% de polipéptidos anticongelantes e tem uma razão de aspecto de cristal de gelo desde 1,9 a 3,0.
19. 19. Produto confeccionado congelado de acordo com a reivindicação 17, em que os elementos discretos são inclusões.
20. 20. Produto confeccionado congelado de acordo com a reivindicação 19, em que os elementos discretos são uma camada fina a qual reveste o centro de gelado. Lisboa, 27 de Setembro de 2006