ES2281106T3 - Productos de confiteria congelados. - Google Patents
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Abstract
SE PUEDEN INCORPORAR PROTEINAS VEGETALES ANTIHIELO DE MANERA VENTAJOSA EN PRODUCTOS CONGELADOS DE CONFITERIA, DADO QUE TIENEN LA CAPACIDAD DE LIMITAR EL CRECIMIENTO DE LOS CRISTALES DE HIELO.
Description
Productos de confitería congelados.
La invención se refiere a productos alimenticios
congelados que contienen AFPs.
Se han descrito en la bibliografía proteínas
anticongelación; véase, por ejemplo, Marilyn Griffith y K. Vanya
Ewart, en Biotechnology Advances, vol. 13, nº. 3, págs.
375-402, 1995. Por lo general, las proteínas
anticongelación (AFPs) tienen una o más de las propiedades
siguientes: histéresis térmica, inhibición de la recristalización
del hielo, control de la forma de los cristales de hielo e
interacción con nucleantes del hielo.
La histéresis térmica es la propiedad mejor
conocida de las AFPs y la propiedad se usa normalmente para ensayar
la presencia de AFPs. La histéresis térmica resulta de una bajada de
la temperatura de congelación aparente de una solución que contiene
una AFP activa en cuanto a la histéresis térmica sin afectar a la
temperatura de fusión. La identificación de fuentes de AFPs por
ensayos de histéresis térmica se describe ampliamente en la
bibliografía; véase, por ejemplo, John G. Duman en Cryobiology 30,
322-328 (1993).
La inhibición de la recristalización del hielo
es otra propiedad de las AFPs. Esta actividad también se denomina
supresión del crecimiento de cristales de hielo. Esta propiedad se
puede ensayar comparando en un momento dado el tamaño del cristal
de hielo de los cristales en presencia de AFP y en ausencia de AFP.
La aplicación de este procedimiento en el ensayo de AFPs de pescado
se describe en la patente U.S. nº. 5.118.792 (DNA Plant Technology
Corporation).
Una tercera propiedad de las AFPs es su
capacidad de influir sobre la forma de cristales de hielo. Esta
propiedad deriva de la unión selectiva de las AFPs a ciertas caras
del cristal de hielo y de limitar por ello el crecimiento
cristalino en ciertas direcciones. La presencia de cristales de
hielo que tienen una forma de bipirámide hexagonal se considera
indicadora de la presencia de AFP. Este procedimiento se describe,
por ejemplo, para ensayar la actividad de AFPs de centeno de
invierno extracelulares en el documento WO 92/22581 (University of
Waterloo).
Una cuarta propiedad de las AFPs es su capacidad
de inhibir la actividad de sustancias nucleantes del hielo. Esta
interacción entre una AFP y un nucleante del hielo puede dar por
resultado, por ejemplo, un aumento de la histéresis térmica. Esta
propiedad se ensaya, por ejemplo, en el documento WO 96/40973
(University of Notre Dame du Lac).
Se han sugerido AFPs para mejorar la tolerancia
a la congelación de productos. En este contexto se han sugerido
muchas aplicaciones.
Por ejemplo, se han sugerido AFPs para reforzar
la crioconservación de materiales biológicos (WO 91/12718, Agouron
Pharmaceuticals; WO 910361, The Regents of the University of
California). También han sido aplicadas AFPs para prevenir el
escape de liposomas, por ejemplo, en productos farmacéuticos o
cosméticos (véase el documento WO 96/20695). Otra posible
aplicación es para aumentar la tolerancia a la congelación de
plantas incluyendo en ellas (o produciendo transgénicamente en
ellas) una AFP (véase J. Cell. Biochem. Suppl. Vol. 14e, 1990, pág
30 XP002030248, Lee y otros, abstract R228). También se han sugerido
AFPs de pescado para uso en productos alimenticios, por ejemplo, en
yogur helado o en helado (patente U.S. nº. 5.620.732, expedida a
Pillsbury, y documento WO 96/11586, HSC Research and Develpoment
limited parnership).
Hasta ahora, sin embargo, el uso de AFPs no se
ha aplicado a escala comercial. Los solicitantes son de la opinión
de que una de las razones de la falta de aplicación comercial es
que, aunque se han descrito muchas AFPs, en la práctica, su
incorporación en los productos comeciales encuentra problemas
serios.
Los solicitantes han encontrado que una de las
razones clave de estos problemas es que, del gran número de AFPs
que se han descrito en la bibliografía, sólo un conjunto limitado de
AFPs se puede usar para cada aplicación; también han encontrado los
solicitantes que esta selección de AFPs adecuadas depende de la
aplicación deseada y/o los atributos del producto a lograr.
Una fuente particularmente deseable de las AFPs
es material vegetal. Los materiales vegetales se pueden obtener
bastante fácilmente en grandes cantidades y se pueden usar
procedimientos de aislamiento relativamente sencillos para obtener
un concentrado que contiene AFP. Además, se cree que el uso de AFPs
de material vegetal será favorecido por los consumidores que tienen
tendencia a preferir fuentes vegetales naturales frente a, por
ejemplo, AFPs de aceites de pescado.
Marilyn Griffith y K. Vanya Ewart en
Biotechnology Advances, vol. 13, nº. 3, págs.
375-402, 1995, han dado una lista de 27 especies
vegetales importantes en las que se encuentra actividad de
anticongelación. Este artículo sugiere también una amplia gama de
posibles aplicaciones de las AFPs.
Los solicitantes han encontrado ahora que si se
selecciona una aplicación específica para AFPs vegetales, se crea
la necesidad de un ensayo específico para seleccionar el conjunto
limitado de AFPs que se puede aplicar ventajosamente en esta
solicitud.
El objetivo de la presente invención es, por
tanto, proporcionar las AFPs vegetales que se pueden usar
ventajosamente en productos de confitería congelados.
Sorprendentemente, los solicitantes han
encontrado que, a pesar del hecho de que un gran número de plantas
contienen AFPs, solo un número limitado de plantas contiene AFPs que
son capaces de proporcionar una buena textura a productos de
confitería congelados. Se ha encontrado sorprendentemente que, para
seleccionar las AFPs adecuadas, se puede usar un procedimiento de
ensayo relativamente sencillo.
Consecuentemente, un primer aspecto de la
invención se refiere a productos de confitería congelados que
comprenden una o más AFPs derivadas de Polystichum mohriodes,
Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum,
Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salí fragilis, Calluna
vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccharoides,
Oxalis, Geranium, Daucus carota (zanahoria), Vinca minor
(vincapervinca), Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia,
Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis,
Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra,
Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua (hierba de
lanza), Poa pratensis (hierba azul de Kentucky), Rostkovia
magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus
uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria
nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugrubis, Hypogymnia
physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon
glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis,
Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis y Festuca
contracta, en los que las AFPs en agua tienen un tamaño del
cristal de hielo después de rápida congelación a -40ºC seguida de
almacenamiento durante 1 hora a -6ºC (medido como se describe más
adelante) de menos de 15 \mum.
Varias referencias de la bibliografía han
sugerido que las AFPs pueden usarse potencialmente para influir
favorablemente sobre las propiedades de textura de productos de
confitería congelados tales como helados. Sin embargo, la mayoría
de estos documentos no proporciona una doctrina de cómo se pueden
alcanzar realmente en la práctica estas propiedades favorables.
Otra serie de documentos describe el uso de AFPs
de pescado. El documento WO 96/11586 da cuenta de la aplicación de
polipéptidos anticongelación de pescado en productos alimentarios
fermentados congelados. Este documento no explica el uso en estos
productos de AFPs específicas derivadas de plantas.
El documento WO 96/39878 describe la aplicación
de AFP en helado. Las AFPs adecuadas para esta aplicación pueden
derivarse de sangre y tejido muscular de peces antárticos, peces
árticos, gusanos e insectos. Tampoco se proporciona información de
que se puede usar AFP vegetal.
La patente U.S. nº. 5.118.792 describe en el
ejemplo 3B la inhibición de la recristalización por una proteína de
fusión A-Saf5 purificada en una mezcla de helado de
corte. Tampoco se considera en este documento el uso de AFPs
derivadas de plantas.
El documento WO 92/22581 describe una pluralidad
de polipéptidos derivados de espacios extracelulares del centeno de
invierno. Se han descrito en general varias posibles aplicaciones de
estos polipéptidos, entre otras en helados. Sin embargo, no se da
información alguna sobre qué polipéptidos se deben seleccionar para
obtener una buena calidad de helado. Los solicitantes han encontrado
que sólo algunas proteínas específicas del centeno de invierno son
adecuadas para uso en helados (véanse ejemplos).
Los solicitantes han encontrado que un gran
número de plantas no incluidas hasta el momento en los listados
como tales contienen un nivel significativo de AFPs. Por otra parte,
se ha encontrado que no todas las plantas que contienen AFP
proporcionan el tipo correcto de AFP para influir favorablemente
sobre la textura del confite congelado. Los solicitantes pretenden
ahora proporcionar una nueva selección particular de fuentes
vegetales que sorprendentemente proporcionan, por una parte, buenas
propiedades de la AFP y, por otra parte, son capaces de influir
favorablemente sobre las propiedades de textura de un helado.
Se ha encontrado en particular que se pueden
seleccionar AFPs adecuadas tomando una composición que comprende
AFP en una composición acuosa, congelando rápidamente esta
composición a -40ºC o menos y almacenándola seguidamente durante 1
hora a -6ºC. Las AFPs adecuadas dan por resultado un tamaño de
cristal, después de almacenamiento durante 1 hora en estas
condiciones, de menos de 15 \mum, más preferiblemente de
5-14 \mum, muy preferiblemente de 8 a 12 \mum.
La temperatura ventajosa de congelación rápida es de -40ºC a -100ºC,
preferiblemente de -80ºC.
En el ejemplo 1 se da una descripción detallada
de un ensayo adecuado para determinar esta característica.
Generalmente, el ensayo se puede aplicar a
cualquier composición adecuada que comprende AFP y agua. Por lo
general, el nivel de AFP en tal composición de ensayo no es crítica
y puede ser, por ejemplo, de 0,0001 a 0,5% en peso, más
preferiblemente de 0,0005 a 0,1% en peso y, muy preferiblemente, de
0,001 a 0,05% en peso, por ejemplo, de 0,01% en peso. El nivel de
agua en la composición acuosa es ventajosamente de 30% o más, por
ejemplo de 50% en peso a 99,9999% en peso.
Se puede usar cualquier composición adecuada que
contiene AFP y agua para realizar el ensayo. Si se desea pueden
estar presentes aditivos, por ejemplo, sacarosa o agentes tampón.
Generalmente, sin embargo, no será necesario obtener la AFP en
forma purificada. Para aplicaciones prácticas, generalmente será
suficiente preparar un extracto o jugo de material de la planta en
el que luego se pueda ensayar este extracto o jugo. En el ejemplo
II se da un procedimiento adecuado para preparar composiciones
líquidas adecuadas.
Normalmente, las plantas a ensayar en cuanto a
AFPs adecuadas han sido sometidas al frío. Por ejemplo, se pueden
ensayar plantas que crecen en climas fríos, por ejemplos, plantas
antárticas. Alternativamente, se pueden cosechar plantas durante el
invierno, preferiblemente de diciembre a marzo, más preferiblemente
de enero a febrero, muy preferiblemente en enero (en el hemisferio
norte), o de junio a septiembre, más preferiblemente de julio a
agosto, muy preferiblemente en julio (en el hemisferio sur).
Los solicitantes han sometido un gran número de
plantas al ensayo antes descrito. Los resultados se dan en los
ejemplos III y IV.
Son fuentes de AFPs Polystichum mohriodes,
Ranunculus biternatus, Nothofagus antártica, Cerastium fontanum,
Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salíx fragilis, Calluna
vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccharoides,
Oxalis, Geranium, Daucus carota (zanahoria), Vinca minor
(vincapervinca), Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia,
Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis,
Deschampsia antártica, Festuca contracta, Festuca rubra,
Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua (hierba de
lanza), Poa pratensis (hierba azul de Kentucky), Rostkovia
magellanica, Bambosoideae, Chorosidontium aciphyllum, Drepanocladus
uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria
nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugrubis, Hypogymnia
physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon
glabrum, Umbilicaria antártica, Usnea subfloridana, Poa trivialis,
Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis y Festuca
contracta.
En una realización son particularmente útiles
para aplicación en productos alimenticios las AFPs vegetales que
satisfacen el ensayo de tamaño del cristal antes definido y que
derivan de plantas no tóxicas o de baja toxicidad. En este
contexto, las preferidas son AFPs derivadas de zanahorias, hierbas,
bambú, etc.
Otra selección preferente de las fuentes
anteriores son las AFPs derivadas de la familia de líquenes, en
particular, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis,
Himantoformia lugrubis, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta,
Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antártica,
Usnea floridana. Estas AFPs tiene unas propiedades
particularmente buenas en productos de confitería congelados.
Otras AFPs que tienen una actividad
particularmente buena derivan de Juncus squarrosus o
Geranium.
Para algunas aplicaciones, se seleccionan las
AFPs que mantienen su capacidad para limitar el crecimiento del
cristal de hielo (evidenciado por el ensayo anterior) incluso
después de un tratamiento térmico por encima de 60ºC, muy
preferiblemente entre 80ºC y 105ºC, durante un período de al menos
30 segundos, más preferiblemente de al menos 1 minuto, 10 minutos o
incluso más de 1 hora. Son fuentes adecuadas de plantas que son
estables frente al calor, por ejemplo, Acer saccharoides,
Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae,
Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium
perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Paradiochloa flabellata,
Deschampsia antártica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis y
Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua.
Además de las plantas mencionadas antes, los
solicitantes han ensayado las AFPs de Secale cereale (centeno
de invierno). En el documento WO 92/22581 se han descrito varias
AFPs de centeno de invierno. Sorprendentemente, los solicitantes
han encontrado que la proteína de 32 kDa derivada del centeno de
invierno satisface el antes mencionado ensayo de tamaño del
cristal, mientras que otras proteínas del centeno de invierno no
satisfacen este ensayo (véase ejemplo IX). A los fines de la
invención, por tanto, si se usan AFPs derivadas de centeno de
invierno, preferiblemente se aplica la proteína de 32 kDa.
Otra realización preferente de la invención se
refiere al uso de productos de confitería congelados de AFPs de
plantas que satisfacen el ensayo anterior y que no derivan de
centeno de invierno.
Los productos congelados de acuerdo con la
presente invención comprenden al menos una AFP que puede derivar de
fuentes vegetales.
Las AFPs se pueden obtener de fuentes vegetales
por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, mediante
procedimientos de aislamiento descritos en los documentos antes
mencionados. Alternativamente, las AFPs se pueden extraer de las
plantas, por ejemplo, preparando un extracto de (partes) de la
planta y seguidamente una etapa opcional de concentración. En los
ejemplos se dan ejemplos de procedimientos adecuados para obtener
los mencionados extractos.
También se pueden modificar genéticamente
microorganismos o plantas para expresar AFPs y luego se pueden usar
las AFPs de acuerdo con la presente invención.
Se pueden usar técnicas de modificación genética
para producir AFPs que tienen al menos 80%, más preferiblemente más
de 95%, muy preferiblemente 100% de homología con las AFPs obtenidas
directamente de fuentes vegetales que contienen naturalmente las
AFPs. A los fines de la invención, estas AFPs que contienen este
alto nivel de homología quedan comprendidas en el término "AFP
derivada de plantas". A los fines de la invención,
preferiblemente, el término "AFP derivada de plantas" no
incluye AFPs que se presentan naturalmente en fuentes no vegetales,
por ejemplo, de pescado, y que se producen por plantas por vías
transgenéticas.
Las técnicas de manipulación genética se pueden
usar como sigue: Una célula u organismo hospedador apropiado se
transformaría por una construcción de genes que contiene la región
codificadora para el polipéptido deseado.
La secuencia de nucleótido que codifica el
polipéptido se puede insertar en un vector de expresión adecuado.
Este vector codifica los elementos necesarios para transcripción y
traducción, y de manera tal que se expresarán en condiciones
apropiadas (por ejemplo, en la orientación apropiada y el marco de
lectura correcto, con el señalamiento de diana apropiado y las
secuencias de expresión apropiadas).
Los procedimientos requeridos para construir
estos vectores de expresión son bien conocidos por los expertos en
la técnica.
Se pueden utilizar varios sistemas de expresión
para expresar la secuencia que codifica el polipéptido. Entre éstas
están incluidas, aunque no exclusivamente, bacterias, levaduras,
sistemas celulares de insectos, sistemas de cultivo de células de
plantas y plantas, todos ellos transformados con los vectores de
expresión apropiados.
Las AFPs obtenibles de las fuentes antes
mencionadas se pueden usar en cualquier producto de confitería
congelado adecuado. A los fines de la invención, el término
producto de confitería congelado incluye confites tales como
helado, yogur congelado, sorbete de agua, serbete, leche helada y
natillas congeladas, refrescos congelados, granizados y purés de
fruta congelados. Para algunos fines, es menos preferido el uso de
productos alimenticios fermentados congelados.
Preferiblemente, el nivel de AFPs en un producto
de confitería congelado es de 0,0001 a 0,5% en peso en relación al
producto final, más preferiblemente de 0,0005 a 0,3% en peso, muy
preferiblemente, de 0,001 a 0,2% en peso.
Preferiblemente, el nivel de sólidos en el
confite final (por ejemplo, azúcar, grasa, agente saboreador, etc)
es mayor que 2% en peso, preferiblemente de entre 4 y 70% en
peso.
Si se desea, a los productos de confitería
congelados de la invención se puede insuflar aire, por ejemplo, a
un aumento de volumen de 50 a 100%.
El procedimiento para preparar el producto de
confitería congelado de la invención se puede seleccionar entre
cualquier procedimiento de preparación. Por lo general, las AFPs se
pueden añadir en varias etapas de la preparación, por ejemplo, se
pueden añadir en la primera premezcla de ingredientes o se pueden
añadir más tarde durante una etapa posterior del proceso de
preparación. Para algunas aplicaciones a veces se prefiere añadir
las AFPs en una etapa relativamente tardía del proceso de
producción, por ejemplo, después de la congelación (parcial) del
producto.
El procedimiento de congelación para productos
de confitería congelados se puede seleccionar entre cualquier
procedimiento de congelación adecuado y opcionalmente puede
comprender una etapa de insuflación de aire a un aumento de volumen
de 50 a 300%. Para algunos fines es ventajoso que el procedimiento
de congelación implique una etapa de endurecimiento en frío, por
ejemplo, a una temperatura de -35ºC o más baja.
Para algunas aplicaciones puede ser ventajoso
incluir una mezcla de dos o más AFPs diferentes en el producto de
confitería congelado. Una razón para esto puede ser, por ejemplo,
que la fuente vegetal de las AFPs a usar contenga más de una AFP y
es más conveniente añadir éstas porque, por ejemplo, ambas están
presentes en el extracto de planta a usar. Alternativamente, a
veces puede ser deseable añadir más de una AFP de diferentes
fuentes.
La invención se ilustrará ahora mediante los
ejemplos siguientes.
El procedimiento preferido es como sigue:
- Ia:
- Se midió la actividad de anticongelación usando un "ensayo de listón" modificado (Knight y otros, 1988). 2,5 \mul de la solución a investigar en sacarosa al 30% (p/p) se pasaron a un cubreobjetos circular de 16 mm, limpio, marcado apropiadamente. Encima de la gota de solución se puso un segundo cubreobjetos y el sandwich es prensó entre el índice y el pulgar. El sandwich se dejó caer en un baño de hexano a -80ºC en una caja de hielo seco. Cuando se habían preparado todos los sandwich, éstos se pasaron del baño de hexano a -80ºC a la cámara de visión que contenía hexano a -6ºC usando tenazas enfriadas en hielo seco. Después de pasarlos a -6ºC, se podía ver que los sandwich cambiaban de un aspecto transparente a un aspecto opaco. Se registraron las imágenes con una cámara de video y se grabaron en un sistema de análisis de imágenes (LUCIA, Nikon) usando un objetivo de 20x. Las imágenes de cada listón se registraron al tiempo 0 y nuevamente después de 60 minutos.
Alternativamente (menos preferido) las
propiedades se pueden medir como sigue:
- Ib:
- Una muestra de un producto que contenía AFP que contenía agua se ajusta a un nivel de sacarosa de 30% en peso (si el nivel de partida de la muestra es de más de 30% esto se hace por dilución; si el nivel de sacarosa es inferior a 30%, se añade sacarosa hasta el nivel de 30%).
Se pone una gota de 3 \mul de la muestra en un
cubreobjetos de 22 mm. Se pone encima un cubreobjetos de 16 mm y
sobre la muestra se pone un peso de 200 g para asegurar un espesor
uniforme del disco. Los bordes del cubreobjetos se cierran con un
barniz de uñas transparente.
El cubreobjetos se pone en la platina de un
microscopio de temperatura controlada Linkham THM 600. Se enfría
rápidamente la platina (50º/min) a -40ºC para producir una gran
población de pequeños cristales. Se registra el estado de la fase
de hielo (tamaño de los cristales de hielo) por fotomicrografía a
35 mm a los tiempos T=0 y T=1 hora. Un tamaño medio de partícula
(determinación visual, media numérica) de menos de 15 \mum indica
una AFP adecuada para uso en productos de confitería congelados.
- A.
- Un tejido fresco de partes de la planta, por ejemplo, raíces, tallos, brotes u hojas, se puede moler con mortero y maza (enfriado a 4ºC) en un volumen igual de tampón A (por ejemplo, EDTA 10 mM, ácido ascórbico 20 mM, tamponado con Tris a pH 7,4) mantenido sobre hielo. Los homogeneizados se filtran a través de una o más capas de muselina y se mantienen sobre hielo antes de su uso.
Generalmente, este procedimiento se puede
aplicar a la mayoría de plantas y proporciona jugo de plantas
frescas. Greneralmente, se puede usar la planta entera para este
fin, aunque, por razones prácticas, sólo se pueden usar a veces
partes de la planta (por ejemplo, hojas de árboles madereros, raíces
de vegetales de raíz y tallos de plantas herbosas).
- B.
- Procedimiento para extraer AFPs de fuentes que son capaces de resistir al calor tales como hierbas. Este procedimiento se ejemplifica usando hierba mezclada. SIn embargo, se apreciará que este procedimiento se puede aplicar igualmente a otras clases estables frente al calor.
El tejido de mezcla de hierbas (Poa
Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) se
cortó en enero (la temperatura en ese mes fue de 3,5ºC, que
aseguraba la aclimatación fría apropiada de las plantas). El tejido
de las plantas se transportó rápidamente al laboratorio para su
posterior tratamiento y se lavó a fondo con agua para eliminar la
suciedad.
Se pusieron 500 g de recortes de hierba en un
horno de microondas de 650 watts y se calentó a potencia total
durante 5 minutos, por lo que la temperatura subió a
85-100ºC. Los recortes de hierba se enfriaron luego
a temperatura ambiente.
Después de la etapa de calentamiento, se separó
de los recortes el jugo rico en AFP por filtración. La masa se
agitó continuamente durante 5 minutos en presencia de un volumen
igual de agua y luego se estrujó a través de 3 capas de
muselina.
Exploración de varias plantas. Se cosecharon en
enero (a mediados del invierno) plantas no antárticas. Las plantas
antárticas se cosecharon a mediados del verano
(febrero-marzo).
A no ser que se indique lo contrario, se usaron
raíces para preparar un jugo que contenía AFP de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Ejemplo IIa.
Las muestras se sometieron al ensayo del Ejemplo
Ia. Las AFPs adecuadas para aplicación en productos de confitería
congelados se señalan con un signo positivo (+).
Adicionalmente, se midió la propiedad de
histéresis térmica de los jugos como sigue. La histéresis térmica
de una muestra de un producto que contenía AFPs se determinó
poniendo el producto fundido sobre un microdisco (Camlab Cambridge,
longitud del sendero 0,1 mm). Los extremos del microclisé se cierran
con vaselina. Se introduce hielo en la muestra usando un atomizador
de aerosol congelante. El disco se introduce luego en un baño de
etanol de temperatura regulada a -0,1ºC. Después de un equilibrado
durante 5 minutos, se comprueba la mezcla. Si el hielo había
fundido completamente, se bajó en escalones de 0,1ºC la temperatura
del baño, siguiendo a cada bajada un equilibrado. Estas etapas se
repitieron hasta alcanzar una temperatura a la que existía una
pequeña cantidad de cristales de hielo en la muestra. Después de
equilibrar a esa temperatura, se bajó la temperatura del baño en
escalones de 0,01ºC por minuto. El punto de congelación de la
muestra se registra como la temperatura a la que comienza la
propagación de hielo desde los cristales equilibrados. Luego se
determina la temperatura de fusión de la muestra subiendo la
temperatura, partiendo del punto de congelación, en escalones de
0,01ºC por minuto hasta que funde la totalidad de los cristales de
hielo. Esta temperatura es la temperatura de fusión de la muestra.
La histéresis térmica de la muestra es la diferencia entre la
temperatura de fusión y la temperatura de congelación. Las AFPs con
un grado significativo de histéresis térmica se indican con un
signo positivo (+). Se obtienen los resultados siguientes.
Estos resultados revelan claramente que aunque
un gran número de plantas presentan propiedades de histéresis
térmica, sólo una pequeña proporción de éstas satisface el ensayo de
recristalización.
Exploración de varias plantas. Las plantas no
antárticas se cosecharon en enero (mediados del invierno). Las
plantas antárticas se cosecharon a mediados del verano
(febrero-marzo).
A no ser que se indique lo contrario, se usaron
raíces para preparar el jugo que contenía AFP de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Ejemplo IIa.
Las muestras se sometieron al ensayo del Ejemplo
Ia. Las AFPs adecuadas para aplicación en productos de confitería
congelados se indican con un signo positivo (+).
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
\newpage
Se hizo mezclando los ingredientes una premezcla
líquida para preparar helado:
Esta mezcla se puede pasteurizar
convenientemente a 85ºC durante 15 segundos y luego se almacena fría
en un bote.
Las mezclas se pueden usar en la preparación de
un helado batiendo en una mezcladora doméstica a un mayor volumen
de aproximadamente 100%, congelando luego reposadamente en una
nevera doméstica.
La composición de acuerdo con la invención tenía
una textura marcadamente mejor que la muestra de control.
Se pueden obtener resultados similares usando
las siguientes fuentes de plantas: Acer sacharoides,
Bamboo, Buddiela, Isothecium myosuroides, Ramalina
farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis,
Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa
flabellata, Deschampsia antártica, Carex aquatilis,
Colobanthus quintensis y Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa
annua.
\newpage
Se preparó mezclando una premezcla líquida para
preparar un helado:
Los ingredientes se mezclaron a temperatura
ambiente y seguidamente se pasteurizó la mezcla a 89ºC durante 60
segundos. Con la mezcla se llenaron asépticamente envases de 500 ml,
que se cerraron y se almacenaron a temperatura ambiente.
Las mezclas se pueden usar en la preparación de
un helado batiendo en una mezcladora doméstica a un aumento de
volumen de aproximadamente 70%, congelando luego reposadamente en
una nevera doméstica. Después de 2 meses de almacenamiento, la
composición de acuerdo con la invención tenía una textura
marcadamente mejor que la muestra de control.
Este ejemplo describe el aislamiento y
secuenciación de AFP de zanahoria. Se pueden usar procedimientos
similares para otras AFPs vegetales.
Se homogeneizó tejido de raíces de zanahoria en
tres volúmenes (p/v) de tampón (ácido ascórbico 20 mM, EDTA 10 mM,
Tris/HCl 50 mM, pH 7,2) en una mortero con maza y se filtró a
través de una capa de muselina. El filtrado se centrífugo a 6.000 g
durante 10 min a 4ºC; se recogió el material sobrenadante y se
centrífugo a 100.000 g durante 1 hora a 4ºC. El material
sobrenadante de esta etapa se denomina la fracción soluble y las
pellas, fracción microsomal.
El material sobrenadante se aplicó a una columna
de 30 ml de flujo rápido Q Sepharose (Pharmacia) preequilibrada en
Tris/HCl 50 mM, pH 7,4, a un caudal de 5 ml/min impulsado por una
bomba HiLoad P-50 controlada por un sistema
Gradifrac de cromatografía a baja presión (Pharmacia) a 4ºC, y el
eluido estaba controlado a OD 280 por un monitor de UV (monitor
UV1, Pharmacia), y se registró en un registro gráfico (REC 102,
Pharmacia). Se recogieron fracciones de 5 ml. La columna se lavó
con Tris/HCl 50 mM pH 7,4 al mismo caudal hasta que OD volvió a
cero. Se aplicó luego un gradiente de 150 ml de NaCl
0-0,4 M en Tris/HCl pH 7,4 y seguidamente se hizo un
lavado de la columna con NaCl 2 M. Las fracciones eluidas se
sometieron luego al ensayo de listón como en el Ejemplo I.
Se combinaron y concentraron las fracciones que
presentaban actividad anticongelación usando polietilenglicol como
sigue: Las fracciones se pasaron a un tubo de diálisis de corte a 10
kDA (Sigma) que se había lavado con agua corriente, se
mantuvieron en EDTA 50 mM a ebullición durante 10 minutos y se
enjuagó en agua milliQ. El tubo de diálisis que contenía la muestra
a concentrar estaba recubierto con un compuesto de polietilenglicol
de peso molecular 15.000-20.000 (Sigma) y se incubó
a 4ºC durante como máximo 4 horas o hasta que el volumen de la
muestra dentro del tubo se había reducido en hasta 10 veces.
El concentrado combinado de la columna de Q
Sepharose se aplicó a una columna de
fenil-Sepharose, una columna de penetración en gel
SMART superdex 75 o una columna de penetración en gel FPLC superdex
75.
Las proteínas anticongelación de raíz de
zanahoria se purificaron por cromatografía de penetración en gel
como sigue:
Se aplicaron partes alícuotas de 20 \mul de
muestra a una columna SMART superdex 75 (Pharmacia) preequilibrada
en Tris/HCl pH 7,4 que contenía NaCl 0,15 M (tampón E) a un caudal
de 40 \mul/min y se separaron los componentes por penetración en
gel al mismo caudal en tampón de equilibrado. El eluido se controló
a OD 280 y OD 215. Se recogieron fracciones de 80 \mul entre 0,85
y 0,89 ml, de 40 \mul entre 0,89 y 1,24 ml y de 100 \mul entre
1,24 y 3,0 ml. El volumen vacío (Vo) de la columna era de 0,91 ml
según se determinó por el volumen de retención de una solución de
Blue Dextran. La columna superdex se calibró por aplicación de 10
\mul de una solución que contenía 5 mg/ml de BSA (Mr 66 kDA,
retención (Ve) = 1,41 ml), 3 mg/ml de anhidrasa carbónica (Mr 29
kDA, Ve = 1,22 ml), 2 mg/ml de Cytochrome C (Mr 12,4 kDa, Ve = 1,41
ml) y 2 mg/ml de Aprotinin (Mr 6,5 kDA, Ve = 1,59 ml) y se trazó
una curva patrón de Ve/Vo frente a log de Mr. Las fracciones que
presentaban actividad anticongelación se identificaron por los
ensayos con listón del Ejemplo I, con un pico de actividad que
mostraba un volumen de retención de 1,16 ml y un peso molecular
aparente de 40 kDa. Estas mediciones confirmaron que la banda de 38
kDa de las zanahorias aclimatadas era un péptido
anticongelación.
Se realizó SDS-PAGE de acuerdo
con Laemmli (1970) usando el minisistema Biorad. Las muestras a
analizar por SDS-PAGE se disolvieron en tampón de
muestras de SDS-PAGE (Laemmli 1970), la solución se
calentó durante 5 min a 100ºC sobre una placa caliente (Techne) y
se centrifugó a 10.000 g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
Las muestras (10-50 \mul) se aplicaron a minigeles
(Biorad, 0,75, 1,0 o 1,5 mm de espesor, acrilamida al 10, 12, 15% o
gradiente de acrilamida de 10-20% {prevertida de
Biorad}) y se separaron por electroforesis. Los polipéptidos
separados se fijaron y tiñeron en el gel con azul de Coomassie (0,1%
p/v), azul brillante Coomassie en ácido acético/metanol/agua milli
Q {5:4:31 en volumen}) o con plata usando el kit de tinción con
plata Biorad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los
geles se secaron entre dos hojas de celofán Gelair en una secadora
de gel Biorad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para
determinar el Mf aparente de SDS-PAGE se usaron de
acuerdo con las instrucciones del fabricante kits de marcadores de
los intervalos de bajo y de alto peso molecular.
La cromatografía de intercambio iónico es
realizó con raíces de zanahoria aclimatada al frío y raíces de
zanahoria no aclimatada al frío. Los geles de
SDS-PAGE resultantes presentaban una banda a
aproximadamente 38 kDA en la muestra de frío. La banda era mucho
menos abundante en la raíz no aclimatada al frío. Por tanto, esta
banda de (aproximadamente) 38 kDA se atribuyó a la actividad de
anticongelación.
Para la secuenciación de la proteína, la
proteína de raíz de zanahoria de aproximadamente 38 kDA se purificó
como se ha descrito en el ejemplo anterior y luego, para asegurar
una mayor purificación, la muestra a secuenciar se eliminó del gel
de SDS PAGE y luego se digirió proteolíticamente in situ en
la lámina de gel de poliamida.
Las preparaciones de proteína en su mayor parte
pura de aproximadamente 38 kDa, que todavía tenía algunas proteínas
contaminantes minoritarias, se cargaron en gel de poliacrilamida al
12%. Se cargaron tres hileras, cada una con 2 \mug de proteína, y
se sometieron a electroforesis en el gel hasta que el frente del
colorante alcanzó el fondo del gel. El gel se tiñó luego con azul
brillante Coomassie al 0,2% (p/v), metanol al 30% (v/v), ácido
acético al 1% (v/v) durante 20 minutos y luego se destiño con
metanol al 30% de metanol hasta que se pudieron ver las bandas de
la proteína. La banda de 38 kDa se identificó por comparación con
marcadores del peso molecular cargados en hileras adyacentes y la
banda de cada hilera se cortó con un cuchillo de escalpelo teniendo
cuidado de no eliminar bandas contaminantes.
Las rodajas de gel se pasaron a un tubo
eppendorp limpio y se lavaron dos veces con 0,5 ml de acetonitrilo
al 50% (v/v), Tris/Cl, pH 8,5. El lavado eliminó parte del teñido
con Coomassie y también deshidrató en parte las rebanadas de gel.
Luego se eliminaron del tubo las rebanadas de gel y se secaron al
aire en el banco de laboratorio hasta que se habían contraído
significativamente y habían comenzado a rizarse. Luego se volvió a
pasarlas al tubo eppendorp y se rehidrataron con, primeramente, 10
\mul de Tris/Cl 100 mM, pH 8,5 que contenía 1 \mug de
endoproteinasa Lys C (Boehringer Mannheim). Ésta es una proteinasa
que escinde específicamente cadenas de polipéptido en el lado
carboxiterminal de restos de lisina. Se añadió más tampón Tris a las
rebanadas de gel hasta que se rehidrataron completamente y luego se
incubaron a 37ºC durante 16 horas.
Después de la incubación, se añadió 1 \mul de
ácido trifluoroacético al tubo para parar la reacción y luego se
lavaron las rebanadas de gel dos veces con 0,3 ml de acetonitrilo al
60% (v/v), TFA al 0,1% (v/v) a 30ºC durante 30 minutos. Esto era
para deshidratar en parte nuevamente las rebanadas de gel haciendo
que se contrajeran y que eluyeran los péptidos que se habían
generado. El material sobrenadante se pasó a otro tubo eppendorp y
luego se secó en un evaporador centrífugo durante 2 horas hasta que
la muestra estuvo casi a sequedad, y se volvió a poner en
suspensión a un volumen de 0,1 ml con TFA al 0,1%.
\newpage
Se separaron luego los péptidos por HPLC en fase
inversa en un sistema de micropurificación Smart (Pharmacia). El
péptido digerido se cargó en una columna C18 (2,1 x 100 mm)
equilibrada en TFA al 0,1% (disolvente A) a un caudal de 0,1
ml/min. La columna se eluyó luego con un gradiente de
0-70% de disolvente B (acetonitrilo al 90% v/v,
0,085% de TFA v/v) durante 70 minutos al mismo caudal. La densidad
óptica se controló a 214 nm y los picos individuales de péptido se
reunieron en el colector de fracciones por escalonamiento manual.
Los polipéptidos se secuenciaron cargándolos en un secuenciador de
proteínas modelo 492 de Perkin Elmer usando los ciclos de química
en fase líquida recomendados por el fabricante.
Se analizaron varios fragmentos de polipéptido
(A-E) en la banda de 38 kDa y tenían secuencias
sustancialmente homólogas a:
Los cultivos de células para producir proteínas
anticongelación se hicieron como sigue:
Se iniciaron nuevos cultivos de células
basándose en los procedimientos descritos por Gamborg y Welter 1985,
Torres 1989, Dodds y Roberts, 1985.
Zanahoria aclimatada al frío (otoño): se
esterilizó la superficie de la raíz almacenada primeramente
lavándola con el detergente Teepol al 10% y frotando seguidamente
bajo un chorro de agua; enjuagando luego con un chorro de agua
durante 15 minutos. Cuando se podía hacer (por razones de tamaño),
se peló la raíz. Ésta se cortó asépticamente en rebanadas de 0,5 cm
que se pusieron en etanol al 70% (v/v) durante 10 minutos con
sacudidas y, seguidamente, en Domestos al 10% v/v+ 2 gotas de Tween
20 (Sigma) durante 25 minutos, también con sacudidas. Las piezas
cortadas se lavaron 3 x con agua destilada estéril. De las rodajas
se cortaron cilindros de aproximadamente 0,5 cm de diámetro usando
un escalpelo estéril y el resto se cortó en trozos de
2-3 mm de largo. Estos discos de tejido (explantes)
se pasaron asépticamente sobre medio de MS sólido que contenía 30
g/l de sacarosa, 10 mg/l de ácido indolacético (IAA), 0,1 mg/l de
quinetina y 8 g/l de agar técnico, contenido en recipientes
estériles 60 ml de esterilina. Los implantes se incubaron a 20ºC en
la oscuridad.
Cuando era necesario, los callos resultantes se
dividieron en piezas menores que se cultivaron sobre medio fresco.
Se iniciaron luego los cultivos en suspensión a partir del callo
activo que crecía.
Adicionalmente, se obtuvieron líneas de cultivo
(NOR y OX6) en suspensión de células de zanahoria del Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Leeds. 10 ml
de estos cultivos se subcultivaron en 90 ml de medio fresco de
Murashige y Skoog (Sigma) que contenía 25 g/l de sacarosa y 1 mg/l
de 2,4-D cada siete días. Los cultivos se
incubaron en una incubadora orbital de sacudidas a 150 rpm a 25ºC en
la oscuridad.
El cultivo de NOR se trató en frío como
sigue:
Se añadió un cultivo NOR de 18 x 5 ml de 7 días
a matraces Erlenmeyer de 18 x 100 ml que contenían 45 ml de medio
MS de zanahoria. Los cultivos se incubaron a 25ºC durante 4 días
como se ha descrito, luego se bajó a 4ºC la temperatura de la
incubadora. Se separaron inmediatamente dos matraces y se
recolectaron las células y el medio como se ha descrito previamente
al tiempo t=0. Los matraces restantes se recolectaron por duplicado
a t= 8 h, 1 d, 2 d, 4 d, 7 d, 9 d, 11 d y 14 d.
Se repitió el tratamiento de aclimatación al
frío usando cultivos de NOR y OX6, que se pasaron a 4ºC después de
4 d y t d de crecimiento a 25ºC. Los cultivos se cosecharon a t=0,
t=7 d y t=14 d. Además de cosechar, se determinó el PVCV para cada
cultivo en cada tiempo de cosecha.
Las células de NOR aclimatadas al frío se
prepararon para análisis con listón como en el Ejemplo I de la
siguiente manera: Se molieron a polvo fino en nitrógeno líquido,
usando un mortero con maza, células congeladas rápidamente. Las
muestras pulverizadas es pusieron en suspensión en 2x volúmenes en
EDTA 10 mM + ácido ascórbico 20 mM, se mezclaron batiendo durante
30 segundos y luego se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos.
Partes alícuotas de 10 \mul de los materiales sobrenadantes se
listonaron usando el tampón de control como control negativo. La
actividad de RI se pudo detectar en células aclimatadas en frío y el
medio, pero no en todas las muestras no aclimatadas en frío.
Las muestras del medio de la suspensión de NOR
se analizaron como sigue: El medio de zanahoria de NOR se tamponó
añadiendo 100 \mul de Tris/HCl 1M, pH 7,4. La mezcla se aplicó a
una columna de Q Sepharose de 1 ml (Pharmacia) a un caudal de 1
ml/min y las moléculas unidas se eluyeron con alícuotas de 3 ml de
Tris/HCl 50 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M.
Se reunieron fracciones de 1 ml.
Este procedimiento de intercambio iónico se usó
también pata fraccionar a t=0,2 d, 4 d, 7 d, 11 d, muestras del
medio aclimatadas en frío, y a t=7 d muestras no aclimatadas en
frío. Las fracciones se ensayaron en cuanto a su actividad por el
ensayo de listón sandwich de emparedado como se ha descrito en el
Ejemplo I.
La actividad de anticongelación en el medio de
cultivo se purificó por cromatografía de penetración en gel de la
siguiente manera: El eluido de NaCl 0,5 M aclimatado en frío 14 de
la columna de Q Sepharose (fracción 2) anterior se precipitó con
acetona y la pella se puso en suspensión en 50 \mul de Tris/HCl 50
mM + NaCl 0,15 M, pH 7,2. La suspensión se centrífugo luego a
10.000 g durante 10 minutos y se cargaron 20 \mul en una columna
de penetración en gel Superdex 75 en el sistema Pharmacia SMART. El
caudal era de 40 \mul/min y la fase móvil era Tris/HCl 50 mM +
NaCl 0,15 M, pH 7,2. Se reunieron fracciones de 80 \mul y se
listonaron. Se repitió el procedimiento usando de eluido de NaCl
aclimatado no en frío 14d de la columna Q Sepharose y medio
recientemente preparado.
Se pueden aislar las proteínas activas por
análisis SDS PAGE como se ha descrito antes.
Se preparó extracto de raíz de raíces de
zanahoria aclimatadas al frío restregando en agua fría zanahorias
aclimatadas en frío arrancadas recientemente. Se quitó la parte de
arriba y se extrajo el jugo empleando un exprimidor de jugo
doméstico (Russel Hobss, modelo nº. 9915). El jugo se congeló en
bloques de 1 l y se almacenó a -20ºC antes de usarlo en pruebas de
helados.
El jugo de AFP de zanahoria se añadió a la
formulación de helado siguiente:
El helado se preparó congelando la formulación
anterior e insuflando aire para aumentar el volumen en 100,6%.
Las mediciones se hicieron en muestra fresca y
muestras que se habían almacenado a -10ºC durante un período de 10
días.
Como comparación se midió de la misma manera una
muestra sin extracto de zanahoria. Las mediciones se hicieron de la
siguiente manera:
Se equilibraron las muestras a -18ºC en una
cámara ambiental Prolan durante aproximadamente 12 horas. De cada
lote de helado se escogieron como representativas tres muestras y de
cada una se preparó un disco en una cámara Cryostat de temperatura
controlada untando un portaobjetos de microscopio con una delgada
capa de helado del centro de cada bloque. Se aplicó al portaobjetos
una sola gota de trementina y luego se aplicó un cubreobjetos. Cada
disco, a su vez, es pasó a una platina de microscopio de temperatura
controlada (Leit LaborLuxS, objetivo Leica 10 x, temperatura
-18ºC), se tomaron imágenes de cristales de hielo (aproximadamente
400 cristales individuales de hielo) y se reunieron y pasaron a un
sistema de archivo y análisis de imágenes (LEICA Q520MC).
Las imágenes de cristales de hielo almacenadas
se destacaron manualmente moviéndolas en torno al perímetro, lo que
luego destaca el cristal entero. Luego se midieron las imágenes de
los cristales destacados usando software de análisis de imágenes
que cuenta el número de pixels requerido para completar la líneas
recta más larga (longitud), la línea recta más corta (anchura), la
relación de aspecto (longitud/anchura). Los datos para cada cristal
de hielo individual de un lote de helado se llevaron a una hoja de
despliegue de datos en la que se analizaron los datos para
encontrar la media y la desviación estándar.
Las mediciones de la dureza del helado se hizo
usando la máquina de ensayo universal Hounsfield HK10KM, una celda
de carga Hounsfield 100N y una sonda de acero inoxidable cilíndrica
de 10 cm. Las muestras de helado se prepararon por incubación
durante 16 horas de bloquee de helado de 486 ml en una cámara Prolan
de control de la temperatura fijada a -18ºC.
El bloque de helado se sacó de la cabina Prolan
de temperatura controlada y se puso en la máquina universal de
ensayos Hounsfield K10KM. La sonda cilíndrica de 10 mm se empujó
contra el bloque de helado a una velocidad constante de 400 mm/min
a una profundidad de 20 mm. Se usó la fuerza máxima durante la
compresión y se expresó como la dureza del helado. Si se observó un
agrietamiento o una fractura frágil de la muestra, ello se indica
en la columna a la derecha de la tabla.
Se obtuvieron los resultados siguientes.
Se pueden enunciar las conclusiones
siguientes:
(a) El tamaño inicial del cristal es menor
en el helado que contiene AFP de zanahoria, por lo que la AFP
inhibe la recristalización.
(b) Los cristales del helado que contiene
AFP de zanahoria están retrasados en los procesos de
recristailización.
(c) La forma de los cristales en helados
con AFP de zanahoria no es significativamente diferente de las
formas de cristales vistas en helados convencionales.
(d) Las propiedades del material de helado
que contiene AFP de zanahoria no son iguales a las del helado
convencional. A saber, los helados son más duros que el helado
convencional pero más blandos que el helado que contiene, por
ejemplo, AFPs de pescado. En segundo lugar, se observó que el helado
que contiene AFP de zanahoria es susceptible a la fractura.
Se obtienen análogamente muy buenos resultados
usando Geranium o Juncus squarrosus.
Este ejemplo describe el aislamiento de varias
proteínas de centeno de invierno y su ensayo.
Se cortaron en trozos de 3 cm de largo hojas de
plantas de centeno de invierno aclimatadas en frío 30 días y se
lavaron a fondo con agua destilada para eliminar células contenidas.
Los trozos de hojas se restregaron en seco con una toallita de
papel y se sumergieron totalmente en un medio de extracción de EDTA
5 mM, ácido ascórbico 10 mM, ácido caproico 2 mM, benzamidina 2 mM
y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF). Luego se infiltraron
en vacío en un matraz Buchner durante 60 minutos y después se
sacaron las hojas y se frotaron para secarlas completamente. Se
colocaron a lo largo en un cilindro de jeringa de plástico y se
centrifugaron suavemente a 2000 x g durante 30 minutos. El extracto
apoplástico se recogió en un tubo eppendorp debajo de la
jeringa.
El extracto apoplástico se concentró 7 veces
usando un ultrafiltro Amicon con membrana PM10. La purificación
inicial se realizó cargando 50 \mul de extracto apoplástico
concentrado en una columna de exclusión por tamaños Superdex 75PC
3,2/3,0 (intervalo de separación 3-70 kDa) en un
sistema de separación SMART, ambos de Pharmacia. El tapón era
Tris/HCl 50 mM a pH 9,5. La separación se hizo a un caudal de 50
\mul/min y se recogieron fracciones de 50 \mul hasta un volumen
de 2,5 ml, que se ensayaron en cuanto a la recristalización como se
describe en el Ejemplo I.
Las fracciones activas se cargaron en una
columna MonoQ FPLC de intercambio aniónico fuerte, de Pharmacia,
equilibrada en Tris/HCl 50 mM a pH 9,5 y se eluyeron las proteínas
usando el mismo tampón con un gradiente lineal a NaCl 0,5 M. El
tampón de elusión se añadió a una concentración de NaCl 0,5 M en 25
minutos, se mantuvo durante 10 minutos y se redujo a 0 M en 15
minutos. La cromatografía se realizó a un caudal de 1 ml/min y se
recogieron fracciones de 1 ml. Las fracciones que eran positivas en
el ensayo de acuerdo con el Ejemplo I se concentraron en una
concentradora centrífuga Centrican PM10 a 7000 rpm hasta que el
volumen se redujo a 50 microlitros y el concentrado se cargó en la
columna S75. La fracción que satisfizo el ensayo del Ejemplo I era
un pico individual a aproximadamente sal 150 mM.
Esta fracción activa se separó con SDS PAGE
(metodología similar a la del Ejemplo VII). Esto confirmó que la
fracción activa era la de 32 kDA.
La fracción de 32 kDa de la proteína de centeno
de invierno se puede usar ventajosamente en la preparación de
productos de confitería congelados.
Claims (9)
1. Un producto de confitería congelado
que comprende uno o más polipéptidos anticongelación derivados de
Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus
antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex
acetosella, Sali fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica,
Pisum sativum, Acer saccharoides, Oxalis, Geranium, Daucus
carota (zanahoria), Vinca minor (vincapervinca), Vinca
major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus
squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica,
Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum
alpinum, Poa annua (hierba de lanza), Poa pratensis
(hierba azul de Kentucky), Rostkovia magellanica, Bambosoideae,
Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium
myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca
regalis, Himantormia lugrubis, Hypogymnia physodes, Parmelia
subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria
antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne,
Holcus lanatus, Bromus sterilis y Festuca contracta, en
el que los polipéptidos anticongelación en una composición acuosa
tienen un tamaño numérico medio del cristal de hielo después de
congelación rápida a -40ºC o menos, seguida de almacenamiento
durante 1 hora a -6ºC o menos, inferior a 15 \mum.
2. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los polipéptidos
anticongelación derivan de Alectoria nigricans, Caloplaca
regalis, Himantormia lugrubis, Hypogymnia physodes, Parmelia
subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria
antartica, Usnea subfloridana.
3. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los polipéptidos
anticongelación derivan de Juncus squarrosus o
Geranium.
4. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los polipéptidos
anticongelación mantienen su capacidad de limitar el crecimiento del
cristal después de un tratamiento térmico por encima de la
temperatura de 60ºC durante un período de al menos 30 segundos, más
preferiblemente, de más de 1 minuto.
5. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 4, en el que los polipéptidos
anticongelación derivan de Acer saccharoides, Bamboo, Buddiela,
Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana,
Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus,
Bromus sterilis, Paradiochloa flabellata, Deschampsia antartica,
Carex aquatilis, Colobanthus quintensis y Agrostis tenuis,
Festuca contracta, Poa annua.
6. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los polipéptidos
anticongelación son derivados de una planta no tóxica.
7. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido
anticongelación es la proteína de 32 kDa derivada de centeno de
invierno.
8. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto está
sustancialmente exento de polipéptidos anticongelación de centeno de
invierno.
9. Un producto de confitería congelado
de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona entre helado,
yogur congelado, sorbete o leche helada.
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| AU7207998A (en) * | 1997-03-14 | 1998-10-12 | Unilever Plc | Frozen food product |
| DE69830304T2 (de) * | 1997-03-14 | 2005-10-20 | Unilever N.V. | Gefrierschutzpeptide enthaltendes gefrorenes produkt |
| EP1002101A2 (en) * | 1997-07-31 | 2000-05-24 | Ice Biotech Inc. | Antifreeze proteins, dna and expression systems |
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| GB9801408D0 (en) | 1998-01-22 | 1998-03-18 | Unilever Plc | Frozen food product |
| GB9801420D0 (en) * | 1998-01-22 | 1998-03-18 | Unilever Plc | Frozen food product |
| PT1158866E (pt) | 1999-03-10 | 2003-03-31 | Unilever Nv | Utilizacao de proteinas anti-congelacao em confeccoes de gelado |
| GB9929696D0 (en) | 1999-12-15 | 2000-02-09 | Unilever Plc | Processes and organisms for the production of anti-freeze proteins |
| GB0010314D0 (en) * | 2000-04-27 | 2000-06-14 | Unilever Plc | Anti-freeze proteins their production and use |
| US20050161631A1 (en) * | 2002-04-12 | 2005-07-28 | Walker Virginia K. | Antifreeze proteins for inhibition of clathrate hydrate formation and reformation |
| NZ540743A (en) * | 2002-12-20 | 2008-06-30 | Unilever Plc | Preparation of antifreeze protein |
| EP2926668B1 (en) | 2003-04-11 | 2020-07-29 | Cargill, Incorporated | Pellet systems for preparing beverages |
| JP2005126533A (ja) * | 2003-10-22 | 2005-05-19 | Nippon Shokubai Co Ltd | 氷結晶成長抑制剤、氷結晶成長開始温度低下剤、及び水の凝固コントロール剤 |
| EP1541034A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-06-15 | Unilever Plc | Frozen confectionery product |
| EP1623631B1 (en) * | 2004-07-27 | 2007-04-11 | Unilever Plc | Aerated food products containing hydrophobin |
| ES2303985T3 (es) * | 2004-07-27 | 2008-09-01 | Unilever N.V. | Productos alimentarios aireados que contienen hidrofobina. |
| EP1809120B1 (en) * | 2004-10-18 | 2013-06-26 | Unilever PLC | Low fat frozen confectionery product |
| AU2006201781B8 (en) | 2005-07-14 | 2008-05-15 | Unilever Plc | Low fat frozen confectionery product |
| PT1926389E (pt) * | 2005-09-23 | 2009-03-23 | Unilever Nv | Produtos gaseificados com ph reduzido |
| DE602006019450D1 (de) * | 2005-09-23 | 2011-02-17 | Unilever Nv | Durchlüftete produkte mit verringerter aufrahmung |
| JP4740336B2 (ja) * | 2005-09-23 | 2011-08-03 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 冷凍空気混入組成物の製造方法 |
| ES2306039T3 (es) | 2005-12-21 | 2008-11-01 | Unilever N.V. | Dulce aireado congelado. |
| ES2351479T3 (es) * | 2006-01-31 | 2011-02-07 | Unilever Plc | Composiciones aireadas que comprenden hidrofobina. |
| CN101400696A (zh) | 2006-03-13 | 2009-04-01 | 日本水产株式会社 | 具有冰核形成活性的蛋白质 |
| ES2331436T3 (es) | 2006-08-07 | 2010-01-04 | Unilever N.V. | Confituras heladas. |
| ATE550948T1 (de) | 2006-10-20 | 2012-04-15 | Nestec Sa | Eisstrukturierende peptiden aus milch |
| BRPI0705417B1 (pt) * | 2006-12-20 | 2016-08-16 | Unilever Nv | produto alimentício aerado e processos para a produção de um produto alimentício aerado |
| US20100086662A1 (en) * | 2007-03-26 | 2010-04-08 | Andrew Richard Cox | Aerated food products being warm or having been heated up and methods for producing them |
| WO2008116733A1 (en) * | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Unilever N.V. | Aerated food products being warm containing soluble and/or insoluble solids and methods for producing them |
| IL192687A (en) * | 2007-07-31 | 2011-07-31 | Unilever Plc | Coating preparation, coating process and coated frozen confection |
| CN101356946B (zh) * | 2007-07-31 | 2013-07-24 | 荷兰联合利华有限公司 | 用于涂覆的组合物，涂覆工艺和冷冻涂覆的糖食 |
| CA2702696A1 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | Unilever Plc | Method for producing a foaming agent |
| NZ571979A (en) * | 2007-10-25 | 2010-05-28 | Unilever Plc | Aerated fat-continuous products |
| KR101700711B1 (ko) * | 2007-11-21 | 2017-01-31 | 로스킬드 유니베르시테트 | 얼음-결합 활성을 포함하는 폴리펩티드 |
| US20100112139A1 (en) * | 2008-03-28 | 2010-05-06 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Foaming Agents Comprising Hydrophobin |
| CN101684144A (zh) * | 2008-09-26 | 2010-03-31 | 江南大学 | 一种冰结构蛋白的制造方法 |
| JP2012505645A (ja) * | 2008-10-16 | 2012-03-08 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 消泡剤を含むハイドロフォビン溶液 |
| EP2358743B1 (en) | 2008-12-16 | 2012-10-10 | Unilever PLC | Method for extracting hydrophobin from a solution |
| CN102427734A (zh) * | 2009-05-18 | 2012-04-25 | 株式会社钟化 | 加热用加工食品的制造方法 |
| US8394444B2 (en) * | 2009-05-29 | 2013-03-12 | Conopco, Inc. | Oil-in-water emulsion |
| US8357420B2 (en) * | 2009-05-29 | 2013-01-22 | Conopco, Inc. | Oil-in-water emulsion |
| CA2704702C (en) * | 2009-06-02 | 2018-06-12 | Unilever Plc | Aerated baked products |
| JP2010285359A (ja) * | 2009-06-09 | 2010-12-24 | Kaneka Corp | 植物由来氷結晶化阻害剤 |
| EA023709B1 (ru) | 2010-10-04 | 2016-07-29 | Унилевер Н.В. | Способ получения пищевого газового гидрата |
| EA026262B9 (ru) | 2011-07-11 | 2017-08-31 | Унилевер Н.В. | Замороженный кондитерский продукт с гелевым покрытием |
| RU2547395C1 (ru) * | 2014-06-06 | 2015-04-10 | Олег Иванович Квасенков | Способ производства мороженого "полюс" (варианты) |
| RU2547394C1 (ru) * | 2014-09-12 | 2015-04-10 | Олег Иванович Квасенков | Способ производства мороженого "тихий дон" (варианты) |
| CN113080373A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-07-09 | 贵州老锄头食品股份有限公司 | 一种荞麦红稗面条及其制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60226588A (ja) * | 1984-04-24 | 1985-11-11 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 酵素修飾蛋白質系不凍剤 |
| US5194269A (en) * | 1988-01-20 | 1993-03-16 | Lee Tung Ching | Production of frozen foods and other products |
| US5118792A (en) * | 1989-05-10 | 1992-06-02 | Dna Plant Technology Corporation | Ice crystal growth suppression polypeptides and method of making |
| CA2110510C (en) * | 1991-06-13 | 1999-08-24 | Marilyn Griffith | Cold tolerances in plants |
| AU4571993A (en) * | 1992-07-29 | 1994-03-03 | Unilever Plc | Process for producing anti-freeze peptides |
| ZA95746B (en) * | 1994-02-04 | 1996-07-31 | Unilever Plc | Ice confections |
| US5620732A (en) * | 1995-06-07 | 1997-04-15 | The Pillsbury Company | Method of making ice cream |
| DK0836646T3 (da) * | 1995-07-05 | 2005-12-19 | Unilever Nv | Anti-frysepeptider fra havfisk som additiver til födevareprodukter |
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