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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines AFP-hältigen Nahrungsmittelprodukts
und AFP-hältige
Nahrungsmittelprodukte.
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Hintergrund
der Erfindung
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Frostschutz-Peptide
(anti-freeze peptides, AFPs) wurden zur Verbesserung der Gefriertoleranz
von Nahrungsmitteln vorgeschlagen. Für den Zweck dieser Erfindung
hat der Ausdruck „AFP" die im Stand der Technik
wohlbekannte Bedeutung, siehe z.B. „Antifreeze proteins and their
potential use in frozen food products", Marilyn Griffiths et al. Biotechnology
Advances, Bd. 13, S. 375–402,
1995.
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Die
WO 90/13571 offenbart Frostschutz-Peptide, die chemisch oder mittels
rekombinanter DNA-Techniken aus Pflanzen erzeugt werden. Die AFPs
können
zweckmäßig in Nahrungsmittelprodukten,
wie Eiscreme, verwendet werden.
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Die
WO 92/22581 offenbart AFPs aus Pflanzen, die zur Steuerung des Eiskristall-Wachstums
in Eiscreme verwendet werden können.
Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren zum Extrahieren einer
Polypeptid-Zusammensetzung aus interzellulären Räumen von Pflanzen durch Infiltrieren
von Blättern
mit einem Extraktionsmedium ohne Aufbrechen der Pflanzenzellen.
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Die
WO 94/03617 offenbart die Erzeugung von AFPs aus Hefe und ihre mögliche Verwendung
in Eiscreme. Die WO 96/11586 beschreibt von Mikroben erzeugte Fisch-AFPs.
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Die
WO 96/39878 offenbart gefrorene Zusammensetzungen, einschließlich Eiscreme,
die AFP enthalten. Die WO 96/39878 lehrt, dass solche gefrorene,
AFP-hältige
Zusammensetzungen vor der Lagerung keinem herkömmlichen Härtungsschritt unterzogen werden
müssen.
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Bisher
wurde jedoch die Verwendung von AFPs nicht auf im Handel erhältliche
Nahrungsmittelprodukte angewendet. Ein Grund dafür ist, dass es sich bisher
als schwierig erwies, ein gefrorenes Nahrungsmittelprodukt mit den
gewünschten
Gefüge-
und Ess-Merkmalen
reproduzierbar herzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung hat zum Ziel Lösungen für diese Probleme vorzusehen.
Insbesondere zielt die Erfindung darauf ab, gefrorene Nahrungsmittelprodukte
vorzusehen, die AFPs enthalten und kein sprödes Gefüge aufweisen, wobei dieses
Gefüge
bei längerer
Lagerung bei niedrigen Temperaturen beibehalten wird.
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Die
(nicht vorveröffentlichte)
PCT/EP97/03635 betrifft die Herstellung gefrorener Nahrungsmittelprodukte,
die AFPs enthalten und ein relativ hartes und sprödes Gefüge aufweisen,
indem das Seitenverhältnis der
Eiskristalle im Produkt adaptiert wird.
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Die
(nicht vorveröffentlichte)
PCT/EP97/03636 betrifft die Herstellung gefrorener Nahrungsmittelprodukte,
die AFPs enthalten und ein relativ weiches, wenn auch sprödes Gefüge aufweisen,
indem das Seitenverhältnis
der Eiskristalle im Produkt adaptiert wird.
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Überraschenderweise
zeigte es sich, dass es möglich
ist, gefrorene, AFP-hältige
Nahrungsmittelprodukte zu erhalten, die nicht spröde sind,
vorausgesetzt, dass das Verfahren zur Herstellung des AFP-hältigen Produkts
sorgfältig
ausgewählt
wird. Gemäß einem
ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines gefrorenen, AFP umfassenden Nahrungsmittelprodukts, wobei
das Produkt mindestens teilweise im Wesentlichen ohne freies AFP
vorgefroren wird, wonach das freie AFP darin eingebaut wird.
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Ohne
durch irgendeine Theorie gebunden zu sein, nehmen die Anmelder an,
dass die günstigen
Gefügeeigenschaften
des Produktes wie folgt erklärt
werden können:
Wenn die Nahrungsmittelprodukte vorgefroren sind, werden im ganzen
Produkt Eiskristalle gebildet. Wenn freie AFPs danach im vorgefrorenen
Produkt verfügbar
werden, führt
dies im Allgemeinen zur Beibehaltung der Form und Größe der ursprünglich gebildeten
Kristalle, selbst wenn das Produkt während der Lagerung Temperaturveränderungen
ausgesetzt ist. Die Anwesenheit der freien AFPs erst in einem späten Stadium
des Gefrierprozesses, d.h., nachdem zumindest ein Teil der Eiskristalle
gebildet wurde, scheint jedoch zu einer Verringerung des Aggregierens
zwischen den Eiskristallen des Endprodukts zu führen, was somit ein weniger
sprödes
Produkt ergibt.
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Für den Zweck
der Erfindung umfasst der Ausdruck „freies AFP" alle Formen von
AFP, die mit den Eiskristallen in Wechselwirkung treten können. Das
Fehlen von freien AFPs heißt,
dass entweder kein AFP im System vorhanden ist, oder dass AFP in
einer Form vorhanden ist, die nicht mit den Eiskristallen in Wechselwirkung
treten kann. Das Vorhandensein von freiem AFP kann durch Verwendung
des Rekristallisations-Inhibierungstests, wie in den Beispielen
veranschaulicht, gezeigt werden.
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Viele
Konsumenten mögen
weniger spröde
gefrorene Nahrungsmittelprodukte oder Ingredienzien, wie Eiscreme
oder Wassereis. Überraschenderweise
stellten wir fest, dass AFPs die Möglichkeit bieten, gefrorene Nahrungsmittelprodukte
zu formulieren, die einerseits weniger spröde sind und anderseits verbesserte
Eis-Rekristallisations-
und Temperaturtoleranz-Eigenschaften nach schlechter Lagerung beibehalten.
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Erfindungsgemäße Produkte
sind durch eine Brinell-Härte
ausgezeichnet, die signifikant geringer ist als bei Produkten derselben
Zusammensetzung, bei welchen freies AFP vor dem Gefrieren vorhanden
ist. Vorzugsweise beträgt
bei –18°C die Kraft
(in N), gemessen bei einer Verschiebung von 2 mm, wie in den Beispielen
für Produkte,
bei welchen das freie AFP vor dem (teilweisen) Gefrieren vorhanden
ist, mindestens das 1,5-fache der Kraft (in N) für dieselbe Zusammensetzung,
in welcher freies AFP erst nach dem (teilweisen) Vorgefrieren vorhanden
ist. Mehr bevorzugt beträgt
die Kraft das 2,0- bis 4,0-fache der Kraft von Produkten der Erfindung.
Die Kraft für
erfindungsgemäße Produkte,
wie oben angegeben gemessen, ist vorzugsweise von 5 bis 100 N, mehr
im Allgemeinen 7 bis 40 N, mehr spezifisch von 10 bis 30 N.
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Das
Seitenverhältnis
der Eiskristalle in Zusammensetzungen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt
wurden, ist vorzugsweise weniger als 2,0, z.B. von 1,0 bis 1,9.
Das Seitenverhältnis
von Eiskristallen wird als durchschnittliches Verhältnis der
Länge und
der Breite der Eiskristalle definiert. Ein Seitenverhältnis von
weniger als 2,0 entspricht rundlichen Eiskristallen, die keine längliche
Form haben. Das Seitenverhältnis
von Kristallen kann mit jedem geeigneten Verfahren bestimmt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren ist in den Beispielen veranschaulicht.
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Vorzugsweise
sind die gefrorenen Produkte der Erfindung nicht spröde. Vorzugsweise
ist die Mindest-Schichtendicke, bei welcher ein Bruchverhalten beobachtbar
ist, mehr als 10 mm, mehr bevorzugt, mehr als 50 mm. Das Bruchverhalten
kann entweder durch Herstellen von Schichten mit unterschiedlicher
Dicke und Feststellen, bei welcher Mindestdicke ein Bruchverhalten
eintritt, gemessen werden, oder es kann aus dem Young-Modul wie
in den Beispielen beschrieben, errechnet werden.
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Während der
Formulierung und dem nachfolgenden Gefrieren von Nahrungsmittelprodukten
können mehrere
Parameter das Seitenver hältnis
der zu bildenden Eiskristalle beeinflussen. Beispiele für Faktoren,
die das Seitenverhältnis
beeinflussen, sind nachstehend angeführt. Die Anmelder sind der
Meinung, dass es wohl im Können
des Fachmanns liegt, diese Bedingungen so auszuwählen, dass das Seitenverhältnis der
Eiskristalle in den gewünschten
Bereich fällt.
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Ein
Faktor, der das Seitenverhältnis
von Eiskristallen beeinflusst, ist die Geschwindigkeit, mit welcher das
Produkt eingefroren wird. Allgemein gesagt kann eine Erhöhung der
Gefriergeschwindigkeit zu einer Verringerung des Seitenverhältnisses
bei den Eiskristallen führen.
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Ein
weiterer Faktor, der das Seitenverhältnis von Eiskristallen beeinflusst,
ist die Mobilität
des Produkts während
dem Gefrieren. Wenn z.B. ein flüssiges
Wassereis oder eine Eiscreme-Mischung
gefroren werden soll, wird ruhiges Gefrieren zu einem relativ hohen
Seitenverhältnis
für die
Eiskristalle führen,
wogegen Rühren zu
einem niedrigeren Seitenverhältnis
führt.
Mischen mit hoher Scherung wird zu noch niedrigeren Seitenverhältnissen
führen.
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Ein
weiterer Faktor, der das Seitenverhältnis der Eiskristalle beeinflusst,
ist das Vorhandensein und die Mengen von Ingredienzien. Beispielsweise
kann das Vorhandensein von Ingredienzien, die dazu neigen, eine Netzwerkstruktur
im Produkt zu bilden (z.B. Gummis oder Fette) zu einem niedrigeren
Seitenverhältnis
führen als
bei Produkten ohne diese Ingredienzien. Auch andere Ingredienzien
können
zu einem niedrigeren Seitenverhältnis
führen,
z.B. große
Feststoffmengen, beispielsweise große Zuckermengen, können zu
niedrigen Seitenverhältnissen
führen.
Auch große
Phasenvolumina für
das Eis können
zu höheren
Seitenverhältnissen
führen.
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Schließlich können die
Art und Menge der vorhandenen AFPs zu einer Veränderung in Seitenverhältnissen
führen.
Einige AFPs scheinen die Bildung niedriger Seitenverhältnisse
zu begünstigen,
wogegen andere AFPs höhere
Seitenverhältnisse
zu induzieren scheinen. Eine Veränderung
der Menge an AFPs kann zu einer Veränderung in den Seitenverhältnissen
führen.
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Das
Verfahren der Erfindung involviert zumindest das teilweise Vorgefrieren
des Produkts bevor freies AFP vorhanden ist. Bei diesem teilweisen
Vorgefrieren werden vorzugsweise mindestens 20 Gew.-% des in der
Vormischung vorhandenen Wassers, z.B. von 30–100 Gew.-%, vorzugsweise 40–80 Gew.-%,
gefroren. Dieses Vorgefrieren kann mit jedem geeigneten Verfahren
erfolgen. Besonders bevorzugt ist jedoch das teilweise Vorgefrieren
in einer Einrichtung, in welcher das Gefrieren und das Versetzen
mit Luft (falls erwünscht) zur
gleichen Zeit stattfinden. Geeignete Einrichtungen dafür sind beispielsweise
Dünnschicht-Wärmeaustauscher,
wobei das Nahrungsmittelprodukt beispielsweise auf eine Temperatur
zwischen –2
und –6°C vorgefroren
wird.
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In
einer ersten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt das Vorgefrieren in der Abwesenheit von AFP. Nach
dem Vorgefrieren wird das freie AFP dann zur Verfügung gestellt,
beispielsweise durch Zusetzen zum vorgefrorenen Produkt, z.B. durch
Einmischen einer Lösung
von AFP in das vorgefrorene Produkt, beispielsweise durch Mischen
in einem feststehenden Mischer. Alternativ kann die einzufrierende
Mischung in zwei oder mehrere Ströme geteilt werden, wobei mindestens
einer der Ströme,
der AFP-frei ist, vorgefroren wird und danach mit dem (den) übrigen Strom
(Strömen),
die das AFP aufweisen, gemischt wird. Bei einer anderen zweckmäßigen Ausführungsform
werden zwei oder mehrere Gefriergeräte der Reihe nach verwendet,
wobei das AFP dem System zwischen zwei Gefriergeräten zugesetzt
wird.
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Bei
einer zweiten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt das Vorgefrieren in Anwesenheit von unfreiem
AFP. Nach dem Vorgefrieren, wird das AFP zur Verfügung gestellt,
z.B. durch Gewährleisten,
dass das unfreie AFP in freier Form freigesetzt wird. Dies kann
beispielsweise erreicht werden, indem die Verarbeitungsbedingungen
variiert werden, so dass AFP-Einkapselungen geöffnet werden, um das AFP freizusetzen.
Alternativ können
Komplexe, in welchen das AFP in unfreier Form vorliegt, so verändert werden,
dass freies AFP freigesetzt wird.
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Wie
oben angegeben, kann das AFP in mehreren Formen zugesetzt werden.
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Wenn
das AFP z.B. in freier Form als solches oder in Lösung oder
als Teil eines Produkt-Stromes zugegeben wird, dann wird es erfindungsgemäß nach einem
zumindest teilweisen Vorgefrieren des Produkts zugesetzt.
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Wenn
das AFP in unfreier Form zugegeben wird, dann kann das AFP auch
vor dem teilweisen Vorgefrieren zugegeben werden, solange das Wesen
des AFP-Systems und die Verarbeitungsbedingungen so gewählt werden,
dass im Wesentlichen kein freies AFP vor dem (teilweisen) Vorgefrieren
verfügbar
wird.
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Bei
einer sehr bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das AFP durch Einschluss in gelierte Teilchen
in eine unfreie Form gebracht. Jedes Geliermittel kann verwendet
werden. Vorzugsweise wird die Stärke
des Gels so gewählt,
dass die Gele unter normalen Scherbedingungen im Gefriergerät zerbrechen,
wodurch das AFP in freier Form freigesetzt wird. Geeignete Gele
können
beispielsweise auf Basis essbarer Geliermittel vorliegen, wie Alginat,
Jota- oder Kappa-Carrageenan, Gellan, Agar, Pektin, Furcelleran,
Guargummi, Johannisbrotkernmehl, besonders bevorzugt sind Alginat-Gele.
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Vorzugsweise
werden die Gel-Festigkeit der Gele, die Teilchengröße und die
Form so gewählt,
dass die gelierten Teilchen während
des Gefriervorgangs zerbrochen werden. Im Allgemeinen kann die Gel-Festigkeit
durch Variieren der Menge an Geliermittel variiert werden. Außerdem werden
unregelmäßig geformte
Teilchen leichter aufgebrochen als runde Teilchen. Es liegt im Können des
Fachmanns jene Bedingungen zu entwickeln, die zu den gewünschten
Teilchen führen.
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Eine
alternative Form von unfreiem AFP betrifft das Einbauen des AFP
in flüssige
Kristallstrukturen, beispielsweise in Liposome, wobei die Liposome
so gewählt
werden, dass das AFP nach dem teilweisen Vorgefrieren des Produkts
in freier Form freigesetzt wird. Geeignete Liposom-Strukturen können beispielsweise auf
essbaren grenzflächenaktiven
Materialien, z.B. Mono- oder Diglyceriden, basieren.
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Andere
Techniken können
ebenfalls zur Herstellung von unfreiem AFP verwendet werden. Beispiele für diese
sind eingekapseltes AFP, Einschließen von AFPs in Emulsionssystemen
usw..
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Nachdem
das freie AFP im vorgefrorenen Produkt verfügbar wird, kann das Produkt
gegebenenfalls weiter behandelt werden, z.B. kann es weiter gefroren
werden (nachgehärtet,
z.B. auf eine Temperatur von weniger als –18°C), es können andere Ingredienzien zugesetzt
werden, das Produkt kann verpackt, geformt, extrudiert usw. werden.
Vorzugsweise ist jedoch die Temperatur des Produkts nach dem Verfügbarwerden
des freien AFP nicht so hoch, dass die meisten der Eiskristalle
schmelzen.
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Das
Verfahren der Erfindung kann auf jedes gefrorene Produkt, das AFPs
enthält,
angewendet werden. Beispiele für
gefrorene Nahrungsmittelprodukte, die AFP enthalten können, sind
be arbeitete Nahrungsmittelprodukte, wie z.B. gefrorene Bäckerei-Produkte, z.B. Teige,
Rührteige,
Kuchen usw., gefrorene kulinarische Produkte, beispielsweise Suppen,
Saucen, Pizzas, gefrorene Pflanzenprodukte, wie Kompott, Kartoffelpüree, Tomatenmark
usw. Ein sehr bevorzugtes erfindungsgemäßes Produkt ist ein gefrorenes
Konfekt-Produkt.
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Für die Zwecke
der Erfindung inkludiert der Ausdruck „gefrorenes Konfekt-Produkt" Milch-hältige gefrorene
Konfektprodukte, wie Eiscreme, gefrorenes Joghurt, Scherbet, Sorbet,
Milcheis und gefrorenen Pudding, Wassereissorten, Granitas (grobkörnige Sorbets)
und gefrorene Fruchtpürees.
Besonders bevorzugte Produkte der Erfindung sind Eiscreme und Wassereis.
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Die
Anmelder stellten fest, dass die AFPs zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren
aus einer Vielfalt von Quellen, wie Pflanzen, Fischen, Insekten
und Mikroorganismen, stammen können.
Sowohl natürlich
vorkommende Spezies wie auch Spezies, die durch genetische Modifizierung
erhalten wurden, können
verwendet werden. Beispielsweise können Mikroorganismen oder Pflanzen
genetisch modifiziert werden, so dass sie AFPs exprimieren, und
die AFPs können
dann gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Genetische
Manipulationstechniken können
verwendet werden, um AFPs wie folgt herzustellen: Eine geeignete
Wirtszelle oder ein Wirtsorganismus würden durch ein Genkonstrukt,
das das gewünschte
Polypeptid enthält,
transformiert. Die für
das Polypeptid codierende Nukleotid-Sequenz kann in einen geeigneten
Expressionsvektor insertiert werden, der für die für die Transkription und Translation
notwendigen Elemente codiert, und in einer Weise, dass sie unter
geeigneten Bedingungen (z.B. in der richtigen Orientierung und im korrekten
Leserahmen und mit passenden Targeting- und Expressions-Sequenzen)
exprimiert werden. Die zur Konstruktion dieser Expressionsvektoren
notwendigen Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt.
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Eine
Reihe von Expressionssystemen kann zur Expression der für das Polypeptid
codierenden Sequenz verwendet werden. Zu diesen zählen – ohne darauf
eingeschränkt
zu sein – Bakterien-,
Hefe-, Insekten-Zellsysteme, Pflanzen-Zellkultur-Systeme und Pflanzen,
die alle mit den entsprechenden Expressionsvektoren transformiert
wurden.
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Eine
große
Vielfalt von Pflanzen und Pflanzen-Zellsystemen kann mit den Nukleinsäure-Konstrukten der
gewünschten
Polypeptide transformiert werden. Bevorzugte Ausführungsformen
würden
Mais, Tomate, Tabak, Karotten, Erdbeeren, Rapssamen und Zuckerrübe einschließen, ohne
auf diese eingeschränkt
zu sein.
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Für den Zweck
der Erfindung stammt ein Satz bevorzugter AFPs aus Fisch. Besonders
bevorzugt ist die Verwendung von Fisch-Proteinen vom Typ III, am
meisten bevorzugt HPLC 12, wie in unserem Fall WO97/02343 geoffenbart.
Ein anderes bevorzugtes AFP kann aus Pflanzenquellen stammen, wie
Gras oder Winterroggen, wie in unserem nicht vorveröffentlichten
Fall PCT/EP97/03634 beschrieben, oder Karotte, wie in unserer nicht
vorveröffentlichten
Anmeldung PCT/EP97/06181 beschrieben. Besonders bevorzugt ist die Verwendung
von Pflanzen-AFPs.
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Bei
einigen natürlichen
Quellen können
die AFPs aus einer Mischung aus zwei oder mehreren verschiedenen
AFPs bestehen. Vorzugsweise werden jene AFPs ausgewählt, die
signifikante Eis-Rekristallisations-Inhibierungseigenschaften haben,
dies kann gemäß den Beispielen
gemessen werden.
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Wie
oben angegeben, sind die bevorzugten gefrorenen Produkte, in welchen
die AFPs verwendet werden, gefrorene Konfekt-Produkte, wie Eiscreme
oder Wassereis. Vorzugsweise beträgt die Menge der AFPs von 0,0001
bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf das Endprodukt.
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Überraschenderweise
stellte man fest, dass Zusammensetzungen der Erfindung sehr geringe
Mengen an AFPs enthalten können
und noch immer von guter Qualität
sein können.
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Vorzugsweise
beträgt
die Menge an Feststoffen im gefrorenen Konfekt (z.B. Zucker, Fett,
Geschmacksstoffe usw.) mehr als 3 Gew.-%, mehr bevorzugt, von 4
bis 70 Gew.-%.
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Beispiel I
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Eiscreme
wurde aus folgenden Formulierungen zubereitet:
Anmerkung:
AFP Typ III HPLC-12 ist in der WO 97/02343 beschrieben.
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Das
Herstellungsverfahren war wie folgt:
Für die Zusammensetzungen B und
C (Vergleich) wurden alle Ingredienzien gemischt und in einem Dünnschicht-Wärmeaustauscher
auf eine Extrusionstemperatur von –6,1°C und eine Volumssteigerung
(„overrun") von 94% (B) oder
113 (C) gefroren, gefolgt von einer Nachhärtung auf –35°C in einem herkömmlichen
Gebläse-Tiefkühler („blast
freezer"). Die Zusammensetzung
A wurde wie die anderen Zusammensetzungen gemischt und vorgefroren,
jedoch wurde nach dem Extrudieren das AFP im Nachhinein zugesetzt
und in einem feststehenden Mischer homogen in das Produkt eingemischt.
Das Produkt hatte eine Volumssteigerung von 96%. Bei der Extrusionstemperatur
enthielt das Produkt etwa 40 Gew.-% Eis, entsprechend etwa 60% des Wassers,
das gefroren wird. Nach dem Mischen des AFP wurde das Produkt A
auch auf eine Temperatur von –35°C in einem
Gebläse-Tiefkühler nachgehärtet.
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Die
Produkte wurden einer schlechten Lagerung unterzogen, indem sie
für eine
Zeitdauer von 10 Tagen bei –10°C gehalten
wurden.
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Proben
der Produkte wurden bei –18°C in einem
Prolan-Umweltschrank etwa 12 h lang äquilibriert. Mikroskop-Objektträger wurden
präpariert,
indem eine dünne
Schicht Eiscreme aus dem Zentrum der dünnen Glasplättchen gestrichen wurde.
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Jeder
Objektträger
wurde auf einen Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch (bei –18°C) transferiert, wo
Bilder von Eiskristallen (etwa 400 einzelne Eiskristalle) gesammelt
und durch eine Videokamera zu einem Bild-Aufbewahrungs- und -Analysesystem übermittelt
wurden.
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Die
aufbewahrten Bilder des Eiskristalls wurden manuell durch Umzeichnen
seines Umfangs hervorgehoben, wodurch der gesamte Kristall ge"highlighted" wurde. Die Bilder
der hervorgehobenen Kristalle wurden dann unter Verwendung der Bildanalyse-Software gemessen,
die die Anzahl der Pixel zählt,
die notwendig sind, um die längste
gerade Linie (Länge),
die kürzeste
gerade Linie (Breite), das Seitenverhältnis (Länge/Breite) zu vervoll ständigen.
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Das
durchschnittliche Seitenverhältnis
wurde für
die Kristalle berechnet.
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Die
folgenden Ergebnisse wurden erhalten: Tabelle
1
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Die
Härte der
gehärteten
Proben (vor der falschen Lagerung) wurde mit einem Brinell-Härtetest
getestet, wobei Eiscreme-Proben (bei –18°C) in einen Instron-Universal-Tester
eingeführt
werden und ein kugelförmiger
Ball (Durchmesser: 15 mm) in die Eiscreme mit konstanter Geschwindigkeit
(5 mm/min) gestoßen
wird und der Widerstand gegen die Bewegung gemessen wird. Für Probe
A ist die Kraft bei einer Verschiebung von 2 mm etwa 18 N, für Probe
B war die Kraft etwa 47 N; für
C etwa 15 N.
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Beispiel II
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Die
Sprödigkeit
der Eiscremes aus Beispiel I kann durch Berechnungen hinsichtlich
des Bruchverhaltens der Eiscreme bestimmt werden. Unter Verwendung
eines 3-Punkt-Biegetests wurde der Young-Modul gemessen.
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Der
Young-Modul kann durch Herstellen von Eiscreme-Streifen, 18-stündiges Equilibrieren
derselben in einem Gefrierschrank und Transferieren in einen Temperatur-Schrank
gemessen werden. Die Streifen werden auf eine 3-Punkt-Biege-Vorrichtung
platziert, wie in Handbook of Plastics Test Methods (2. Ausgabe),
herausgegeben von R.P.Brown, George Godwin Ltd, 1981, beschrieben.
Das Testen der Proben erfolgt sofort mit einer Verformungsgeschwindigkeit
von 50 m/min. Aus der Kraft-Verformungs-Kurve wird das anfängliche
Gefälle
gemessen und zur Berechnung des Young-Moduls gemäß der folgenden Gleichung verwendet:
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- – worin
L = Balkenspanne (110 mm), B = Probenbreite, W = Probenhöhe. Gewöhnlich wurden
acht Proben getestet, um einen mittleren Young-Modul-Wert zu ergeben.
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Unter
Verwendung der von Williams & Cawood
in Polymer Testing 9, 15–26
(1990) beschriebenen Berechnungen kann die Bruchzähigkeit
berechnet werden.
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Die
Ergebnisse sind wie folgt: Zusammensetzung A (gemäß der Erfindung)
hat eine signifikant geringere Sprödigkeit als Zusammensetzung
B und eine der Zusammensetzung C vergleichbare Brüchigkeit.
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Beispiel III
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Die
Beispiele I und II können
wiederholt werden, indem man anstatt Fisch-AFP 4 Gew.-%, AFP enthaltenden
Karottensaft verwendet, der durch Abschrubben frisch geernteter,
an die Kälte
akklimatisierter Karotten in Wasser erhalten wurde. Die Spitzen
werden entfernt, und der Saft wird unter Verwendung eines Haushalts-Entsafters
extrahiert. Der Karottensaft wird als Quelle der AFPs anstelle von
Fisch-AFP-HPLC12 verwendet.
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Beispiel IV
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Die
Beispiele I und II können
unter Verwendung von 0,015 Gew.-% Winterroggen-AFPs als AFP-Quelle
an Stelle von Fisch-AFP HPLC12 wiederholt werden.
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Der
Winterroggen wird im Jänner
geschnitten (mittlere Temperatur: 3,5°C), das Gewebe wird rasch ins Labor
zur weiteren Behandlung transportiert und zum Entfernen von Schmutz
gründlich
mit Wasser gewaschen. 400 g der Schnitzel werden in einem Warren-Mixer
mit 800 g Wasser homogenisiert, bis das Gewebe voll ständig aufgebrochen
war. Der AFP-reiche Saft wird durch Filtern durch 4 Lagen Musselin
gesammelt. Der Saft wird 10 min lang gekocht. Der Überstand
wird vom Niederschlag durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 15.000
getrennt. Das AFP kann dann durch Gefriertrocknen isoliert werden.
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Beispiel V
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Die
Eis-Rekristallisations-Inhibierungseigenschaften der AFPs können wie
folgt bestimmt werden:
Eine Probe eines AFP-hältigen Produkts
wurde auf einen Saccharose-Wert von 30 Gew.-% eingestellt (wenn der
Ausgangswert der Probe mehr als 30% war, erfolgte dies durch Verdünnung, wenn
der Ausgangswert niedriger war, wurde Saccharose auf die Menge von
30% zugegeben).
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Ein
3 μl-Tropfen
der Probe wurde auf ein 22 mm Deckglas gegeben. Ein Deckglas mit
einem Durchmesser von 16 mm wurde dann darauf gegeben, und ein Gewicht
von 200 g wurde auf der Probe platziert, um eine gleichmäßige Objektträger-Dicke
zu gewährleisten.
Die Ränder
des Deckglases wurden mit durchsichtigem Nagellack versiegelt.
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Der
Objektträger
wurde auf einem Temperatur-gesteuerten Linkham THM 600-Mikroskoptisch
platziert. Der Tisch wurde rasch (50°C pro Minute) auf –40°C gekühlt, um
eine große
Population kleiner Kristalle zu erzeugen. Die Tisch-Temperatur wurde
dann rasch (50°C
pro Minute) auf –6°C angehoben
und auf dieser Temperatur gehalten.
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Die
Eisphase wurde bei –6°C unter Verwendung
eines Leica Aristoplan-Mikroskops beobachtet. Polarisierte Licht-Bedingungen
in Verbindung mit einer Lambda-Platte wurden verwendet, um den Kontrast
der Eiskristalle zu verstärken.
Der Zustand der Eisphase (Größe der Eiskristalle)
wurde mit 35 mm Photomikrographie bei T = 0 und T = 1 Stunde aufgenommen.
Die Eiskristallgröße (Länge) wurde
durch Umzeichnen des Umfangs der Kristalle bestimmt. Die maximale
Länge jedes
einzelnen Eiskristalls einer Charge von Eiscreme wurde auf ein Kalkulationsblatt übertragen,
wo die Analyse des Daten-Sets durchgeführt wurde, um den Mittelwert
und die Standardabweichung herauszufinden.
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Im
Allgemeinen kann dieser Test auf jede geeignete Zusammensetzung,
die AFP und Wasser umfasst, angewendet werden. Im Allgemeinen ist
die AFP-Menge in einer solchen Test-Zusammenset zung nicht sehr kritisch
und kann beispielsweise von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, mehr bevorzugt,
0,0005 bis 0,1 Gew.-%, am meisten bevorzugt 0,001 bis 0,05 Gew.-%,
z.B. 0,01 Gew.-%, betragen.
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Jede
geeignete Zusammensetzung, die AFP und Wasser umfasst, kann zur
Durchführung
des Tests verwendet werden. Im Allgemeinen wird es jedoch nicht
notwendig sein, das AFP in gereinigter Form zu erhalten. Für praktische
Anwendungen würde
es normalerweise ausreichen, einen flüssigen Extrakt oder einen Saft eines
natürlichen
Materials herzustellen, wobei dieser Extrakt oder Saft dann getestet
werden kann.
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Der
obige Rekristallisationstest kann verwendet werden, um festzustellen,
ob AFPs adäquate
Eis-Rekristallisations-Inhibierungseigenschaften aufweisen. Zu diesem
Zweck ist eine (zahlengemittelte) Länge der Eiskristalle von weniger
als 15 μm
beispielsweise 5–15 μm, ein Beweis
für gute
Rekristallisations-Inhibierungseigenschaften.
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Der
obige Rekristallisationstest kann auch verwendet werden, um zu überprüfen, ob
freies AFP im System vorhanden ist. Wenn AFP in freier Form vorhanden
ist, zeigt der obige Test normalerweise eine (zahlengemittelte)
Länge der
Eiskristalle von weniger als 15 μm,
z.B. 5–15 μm. Wenn das
System frei von AFPs ist oder nur AFPs in unfreier Form enthält, ist
die Länge
normalerweise mehr als 15 μm,
z.B. 25 μm
oder mehr.
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Beispiel VI
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Eiscreme
mit den folgenden Formulierungen wurde hergestellt.
- K:
- Zusammensetzung C
aus Beispiel I (Vergleich)
- L:
- Zusammensetzung C
aus Beispiel I einschließlich
10% Alginat-Kügelchen
(siehe unten) und entsprechend weniger Wasser (Vergleich)
- M:
- Zusammensetzung B
aus Beispiel L einschließlich
10% Alginat-Kügelchen
(siehe unten) und entsprechend weniger Wasser (Vergleich)
- N:
- Zusammensetzung C
aus Beispiel I einschließlich
10% AFP-hältige Alginat-Kügelchen
(siehe unten) und entsprechend weniger Wasser (erfindungsgemäß)
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Alginat-Kügelchen
wurden hergestellt, indem 0,333 Gew.-% Natriumalginat-Lösung in
eine 0,123 Gew.-% CaCl2-Lösung getropft
wurde.
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AFP-hältige Alginat-Kügelchen
wurden hergestellt, indem eine Lösung
von 0,333 Gew.-% Natriumalginat und 0,05 Gew.-% AFP (Typ III HPLC-12)
in eine 0,123 Gew.-% CaCl2-Lösung getropft
wurde. Die CaCl2-Lösungen wurden gut gerührt, und
die Tropfengröße der Alginat-Kügelchen
wurde durch Besprühen
mit einer Aerosol-Spritzpistole
gesteuert, wobei ein Luftgebläse
angeordnet war, um zu gewährleisten,
dass die Tropfen weggeblasen werden, bevor sie zu groß werden.
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Die
Zusammensetzungen K-N wurden in einem Dünnschicht-Wärmeaustauscher auf eine Extrusionstemperatur
von etwa –5,4°C und eine
Volumssteigerung von etwa 97% gefroren. Während des Gefrierprozesses
zerfielen die Alginat-Kügelchen.
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Die
durchschnittliche Länge,
Breite und das Seitenverhältnis
der Formulierungen wurden (gemäß Beispiel
I) nach Extrusion und Härtung
auf –25°C gemessen.
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Die
Brinell-Härte
der Proben wurde gemäß Beispiel
I gemessen.
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Die
Ergebnisse sind wie folgt:
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Härtemessungen
zeigten, dass die Zusammensetzungen M und N härter als die Zusammensetzungen K
und L waren. Die Zusammensetzung N war jedoch bedeutend weniger
hart als die Zusammensetzung M.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass AFP, wenn es in einer solchen Form zugesetzt
wird, dass es erst nach erfolgtem teilweisem Vorgefrieren freigesetzt
wird (Zusammensetzung N), Kristallformen (Seitenverhältnis) ähnlich wie
die Zusammensetzungen ohne AFP (Zusammensetzungen K und L) liefert.
Das Seitenverhältnis der
Zusammensetzung N war jedoch signifikant niedriger als das Seitenverhältnis der
Zusammensetzung M, in welcher AFP in freier Form vorhanden war,
bevor der Gefrierprozess einsetzte. Die Zusammensetzungen M und
N hatten beide vorteilhaft kleine Kristallgrößen, die Zusammensetzung N
war jedoch dahingehend vorteilhaft, dass sie im Vergleich zur Formulierung
M eindeutig eine verringerte Härte
hatte.
Anmerkung: AFP Typ III HPLC-12 ist in der WO 97/02343 beschrieben.
