ES2259807T3 - Polipeptidos anticongelacion de zanahoria. - Google Patents
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Abstract
SE PUEDEN AISLAR, A PARTIR DE ZANAHORIAS, NUEVOS POLIPEPTIDOS DE ANTICONGELACION QUE PUEDAN TENER UNA INFLUENCIA POSITIVA SOBRE LAS PROPIEDADES DE PRODUCTOS DE CONSUMO, COMO POR EJEMPLO PRODUCTOS DE CONFITERIA CONGELADOS.
Description
Polipéptidos anticongelación de zanahoria.
La invención se refiere a polipéptidos
anticongelación (AFP) y el producto de alimentación que contiene los
AFP.
Se han sugerido los polipéptidos anticongelación
(AFP) para mejorar la tolerancia a la congelación de productos
alimenticios.
Para el propósito de la invención, el término
AFP tiene el significado que se conoce en la técnica, a saber
aquellas proteínas que inhiben el crecimiento de cristales de hielo.
Véase, por ejemplo, el documento US 5.118.792.
El documento WO 90/13571 describe péptidos
anticongelación producidos químicamente o mediante técnicas de ADN
recombinante a partir de plantas. Los AFP se pueden usar de manera
adecuada en productos alimenticios tales como helados. El ejemplo 3
B muestra formas de cristales de hielo modificados si se congela una
mezcla de agua-hielo en una película en combinación
con 0,01% en peso de AFP.
El documento WO 92/22581 describe los AFP de
plantas que se pueden usar para controlar la forma de los cristales
de hielo en un helado. Este documento también describe un
procedimiento para extraer una composición de polipéptidos a partir
de espacios intracelulares de plantas infiltrando las hojas con un
medio de extracción sin romper las células de las plantas.
El documento WO 94/03617 describe la producción
de los AFP a partir de levaduras y su uso posible en helados. El
documento WO 96/11586 describe los AFP de peces producidos por
microbios.
Sin embargo, hasta ahora el uso de los AFP no se
ha aplicado a productos de consumo comercialmente disponibles. Una
razón de esto son los costes elevados y procedimiento complicado
para obtener los AFP. Otro problemas que las fuentes de los AFP son
o bien difíciles de obtener en cantidades suficientes (por ejemplo,
pez que contiene los AFP) o no son directamente adecuados para uso
en productos de alimentación.
La presente invención pretende proporcionar
polipéptidos anticongelación novedosos que tienen la ventaja de que
se pueden obtener fácilmente a partir de una fuente natural
abundante y que proporcionan buenas propiedades a los productos en
los que se usan.
Se ha encontrado que los polipéptidos
anticongelación que poseen buenas propiedades de inhibición de la
recristalización se pueden obtener a partir de zanahorias. En
particular se ha encontrado que los polipéptidos anticongelación
obtenidos a partir de zanahorias muestran notablemente mejores
propiedades cuando se compara con polipéptidos aislados de otras
raíces vegetales. En particular los polipéptidos anticongelación de
la invención son capaces de proporcionar buenas propiedades de
inhibición de recristalización sin cambiar significativamente la
forma del cristal de los cristales de hielo, con ello es posible
conducir a propiedades más favorables, por ejemplo helados
blandos.
Los solicitantes han encontrado que los
polipéptidos anticongelación eficaces se zanahorias se caracterizan
generalmente por un peso molecular aparente en
SDS-PAGE de 36 kDa.
En este contexto será evidente para los expertos
en la técnica que debido a la variación, por ejemplo, en SDS PAGE,
el peso molecular aparente solamente se puede determinar con alguna
variación en los resultados. Para el propósito de la invención estas
variaciones, por ejemplo, entre 30 y 40 kDa o entre 34 y 38 kDa
también están abarcados dentro del alcance de la expresión "peso
molecular aparente de 36 kDa".
Los solicitantes también han encontrado que los
polipéptidos anticongelación eficaces comprenden fragmentos que
tienen una secuencia de aminoácidos como la representada en los
ejemplos.
La secuencia de aminoácidos completa del AFP
preferido de la invención se representa más adelante. De acuerdo con
lo anterior, la invención se refiere a una proteína anticongelación
que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el listado
1:
También abarcado dentro de la invención están
las isoformas y derivados de los polipéptidos anteriormente
mencionados que todavía poseen las propiedades anticongelación y que
muestran al menos 75% de homología con el polipéptido del listado 1
más preferido más que 85%, más preferido más que 95%. Para el
propósito de la invención el término derivado también abarca
polipéptidos modificados que todavía poseen las propiedades
anticongelación, por ejemplo formas glicosiladas de los
polipéptidos anteriores.
También abarcadas dentro de la invención están
secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos como se han
descrito anteriormente. En particular la invención se refiere a
secuencias de nucleótidos del listado 1 y alelos de los mismos.
También abarcados dentro de la invención están
fragmentos de nucleótidos derivados de la región codificadora que
son capaces de hibridarse a genes relacionados que codifican
péptidos anticongelación.
Aunque las proteínas de la invención se pueden
fácilmente directamente aislar de zanahorias, también se pueden usar
técnicas de manipulación genética para producir las proteínas
descritas en la invención.
Una célula hospedadora apropiada u organismo no
humano se transformaría por una construcción génica que codifica el
polipéptido deseado. La secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido se puede insertar en un vector de expresión adecuado que
contiene los elementos necesarios para transcripción y traducción y
de una manera que se expresarán en condiciones apropiadas (por
ejemplo, en una orientación apropiada y con secuencias de dirección
y expresión apropiadas). Los procedimientos requeridos para
construir estos vectores de expresión son bien conocidos por los
expertos en la técnica.
Se puede utilizar numerosos sistemas de
expresión para expresar la secuencia codificadora de polipéptidos.
Éstos incluyen, pero no se limitan a bacterias, levaduras, sistemas
de células de insecto, sistemas de cultivo de células de plantas y
plantas todas transformadas con los vectores apropiados. Se
prefieren levaduras, plantas y sistemas de cultivo de cultivo de
plantas en este contexto.
Se pueden transformar una amplia variedad de
plantas y sistemas de células de plantas con las construcciones de
ácido nucleico de los polipéptidos. Las realizaciones preferidas
incluirían, pero no se limitan a, maíz, tomate, tabaco, zanahorias,
fresas, semilla de colza y remolacha azucarera.
Una realización preferida de la invención se
refiere al uso de los AFP de la invención para incrementar la
tolerancia a la helada de las plantas. Este caso, por ejemplo, se
hace mediante el procedimiento anterior en el que las plantas se
transforman para asegurar (incrementar) la producción de los AFP de
la invención, por lo tanto incrementando la tolerancia a la helada
de dichas plantas.
La invención también se refiere a anticuerpos
que específicamente se unen a un (epítope de los) polipéptidos de
la invención.
Basándose en la información anterior también es
posible modificar genéticamente otras fuentes naturales de manera
que producen los AFP ventajosos como se han identificado en esta
memoria descriptiva anteriormente.
Preferiblemente los AFP se eligen que tengan
propiedades significativas de inhibición de recristalización de
hielo. Un ensayo adecuado para determinar las propiedades de
inhibición de recristalización se indica en el ejemplo I. También
preferiblemente los AFP de acuerdo con la invención proporcionan un
tamaño de partícula de hielo en el producto congelado (longitud
media de cristal) tras recristalización de menos de 50 \mum, más
preferiblemente entre 5-40 \mum.
Los AFP se pueden usar convenientemente en
varios productos, preferiblemente en productos de alimentación que
están congelados o de pretenden congelar. Las zanahorias que
comprenden el AFP a niveles de origen natural no están abarcadas
dentro del alcance de la invención. Sin embargo, el producto de
alimentación que contienen (partes) de las zanahorias están
abarcadas dentro de este término. También están abarcadas zanahorias
que se han transformado para sobre expresar el AFP de la invención,
es decir, que contienen el AFP a niveles significativamente más
altos que las zanahorias no transformadas.
Los ejemplos de tales productos de alimentación
son: productos de alimentación congelados tales como vegetales,
salsas, sopas, aperitivos, productos de confitería congelados tales
como helado o polo, productos lácteos etc.
Los productos preferidos en los que los que se
usan AFP son o vegetales congelados o productos de confitería
congelados tales como helado o polo. Preferiblemente el nivel de los
AFP está entre 0,00001 y 0,5% en peso basándose en el producto
final.
Si se usan mezclas secas o concentradas, la
concentración puede ser más alta con el fin de asegurar que el
nivel en el producto final congelado está dentro de los intervalos
anteriores. Sorprendentemente se ha encontrado que las
composi-
ciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de los AFP mientras que son todavía de buena calidad.
ciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de los AFP mientras que son todavía de buena calidad.
Los niveles preferidos de AFP están entre
0,00001 y 0,5% en peso, más preferiblemente 0,00005 a 0,3% en peso,
los más preferido 0,0001 a 0,2% en peso.
Para el propósito de la invención no es
necesario añadir el AFP en forma purificada al producto de
alimentación. También es posible añadir una composición que
comprende los AFP por ejemplo, un extracto del material natural que
produce al AFP. También es posible modificar el producto de
alimentación de manera que se produzca el AFP in situ por
ejemplo añadiendo microorganismos modificados genéticamente que son
capaces de producir el AFP en el producto de alimentación, o incluso
para modificar genéticamente el producto de alimentación (por
ejemplo el vegetal) de manera que (el vegetal) en sí mismo sea capaz
reproducir el AFP in situ.
Para el propósito de la invención el término
producto de confitería congelado incluye confituras congeladas que
contienen leche tales como helado, yogurt helado, mantecado,
sorbete, leche helada y natillas heladas, polos, granito y purés de
frutas congelados.
Preferiblemente el nivel de sólidos en el dulce
congelado (por ejemplo, azúcar, grasa, aromatizante, etc) es más de
3% en peso, más preferido entre 10 y 70% en peso, por ejemplo 40 a
70% en peso.
Los productos de confitería congelados de
acuerdo con la invención se pueden producir mediante cualquier
procedimiento adecuado para la producción de confitería congelada.
Sin embargo especialmente preferiblemente todos los ingredientes de
la formulación se mezclan completamente antes de comenzar el proceso
de congelación.
Las zanahorias (Daucus carota variedad Autumn
King) se desarrollaron en tiestos individuales. Cuando las plantas
tenían aproximadamente doce semanas de edad, se transfirieron a una
habitación fría y se y se mantuvieron a 4ºC en luz constante durante
4 semanas para la aclimatación al frío. Las plantas se regaron tres
veces a la semana.
Se molieron tejidos frescos de zanahorias con
una mano de almirez y un mortero (enfriado hasta 4ºC) en un volumen
igual de tampón A (EDTA 10 mM, ácido ascórbico 20 mM, tamponado con
Tris hasta pH 7,4) mantenido en hielo. Los homogenatos se filtraron
a través de una capa de muselina y se mantuvo en hielo antes del uso
adicional.
Como comparación se desarrollaron varias plantas
diferentes con raíces y se prepararon homogenatos a partir de las
raíces como de ha indicado anteriormente.
La actividad anticongelación se midió usando un
"ensayo de impacto" (Knight y col., 1988). 2,5 \mul de la
solución bajo investigación en sacarosa al 30% (p/p) se transfirió
sobre un cubreobjetos limpio, apropiadamente marcado, circular de 16
mm. Se colocó un segundo cubreobjetos sobre la parte superior de la
gota de solución y el sándwich se presionó conjuntamente entre el
dedo y el pulgar. El sándwich se dejó caer en un baño de hexano
mantenido a -80ºC en una caja de hielo seco. Cuando se han preparado
todos los sándwich, se transfirieron los sándwiches desde el baño
de hexano a -80ºC a la cámara de observación que contiene hexano
mantenido a -6ºC usando fórceps preenfriado en el hielo seco. Tras
la transferencia hasta -6ºC, se puede observar que los sándwiches
cambian de una apariencia transparente a opaca. Se grabaron las
imágenes mediante una cámara de vídeo y se grabaron en un sistema de
análisis de imágenes (LUCIA, Nikon) usando un objetivo 20 x. Las
imágenes de cada impacto se grabaron en el tiempo = 0 y otra vez
después de 30-60 minutos. Se comparó el tamaño de
los cristales de hielo en ambos ensayos. Si el tamaño a los
30-60 minutos es similar o se incrementa solo
moderadamente (es decir incremento de menos de 20%, más preferido
menos de 10% de incremento, lo más preferido menos de 5% de
incremento) comparado con el tamaño de t = 0, esto es una indicación
de buenas propiedades de inhibición de recristalización de cristal
de
hielo.
hielo.
Resultados: a partir del ensayo de impacto de
sándwich parece que las muestras de raíces de zanahorias, el tallo
de zanahorias y hojas de zanahorias posee propiedades de inhibición
de recristalización de hielo significativas, mediante las que las
raíces y hojas son más activas. Como comparación se ensayó una
muestra de raíces de zanahoria no aclimatadas, que mostró menos
actividad significativa. Para los siguientes ejemplos, se usó tejido
de raíces para ensayo adicional sobre zanahorias.
Como comparación se investigaron varias raíces
vegetales diferentes mediante el ensayo de impacto de sándwich en
sacarosa al 30%. Entre estos vegetales están nabo, col rizada, coles
de Bruselas, col de invierno, colza, pak choi, chirivía y fresa.
Ninguna de estas fuentes de material proporcionó actividad
inhibidora significativa de recristalización de hielo.
Se homogeneizó tejido de raíz de zanahoria en
tres volúmenes(p/v)de tampón (ácido ascórbico 20 mM,
EDTA 10 mM, Tris/HCl 50 mM, pH 7,2) en un mortero y mano de almirez
preenfriado y se filtró a través de una CAAP de muselina. El
filtrado se centrifugó a 6.000 g, diez minutos a 4ºC; el
sobrenadante se enfrió y se centrifugó a 100.000 g durante 1 hora a
4ºC. El sobrenadante de 100.000 g de esta etapa se denomina la
fracción soluble y el sedimento la fracción microsoma.
El sobrenadante se aplicó a 30 ml de Q Sefarosa
de flujo rápido (Farmacia) columna preequilibrada en Tris/HCl 50 mM,
pH 7,4 a un caudal de 5 ml/min suministrado por una bomba HiLoad
P-50 controlado por un sistema de cromatografía de
baja presión Gradifrac (Pharmacia) a 4ºC y el eluato se controló a
una DO de 280 mediante un monitor de UV (Monitor UV1, Pharmacia)
grabado sobre un grabador de cartas (REC 102, Pharmacia). Se
recogieron fracciones de 5 ml. La columna se lavó con Tris/HCl 50
mM, pH 7,4 al mismo caudal hasta que la DO a 280 regresó a 0.
Después se aplicó un gradiente de 150 ml de NACl
0-0,4 M en Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 se aplicó
seguido de lavado en columna de NaCl 2 M. Las fracciones de eluato
se sometieron al ensayo de impacto en el ejemplo I.
Las fracciones que contenían actividad
anticongelación como se evidenciaba mediante inhibición de la
recristalización se reunieron y se concentraron usando
polietilenglicol como sigue: las fracciones se transfirieron tubería
de diálisis de corte de 10 kDa (Sigma) que se han lavado en agua de
frío, se sometieron a ebullición en EDTA 50 mM pH 7,5 durante 10
minutos y se enjuagaron en agua mili Q. La tubería de diálisis que
contenía la muestra a concentrar se cubrió con compuesto de
polietilenglicol sólido peso molecular 15.000-20.000
(Sigma) y se incubaron a 4ºC durante hasta 4 horas o hasta que el
volumen dentro de la tubería de diálisis se redujo hasta 10
veces.
El concentrado reunido de la columna de Sefarosa
Q se aplicó o bien a una columna de fenil Sefarosa, una columna de
permeación de gel SMART superdex 75 o a una columna de permeación de
gel FPLC superdex 75.
Las proteínas anticongelación de raíces de
zanahoria se purificaron mediante cromatografía de permeación de gel
como sigue:
Alícuotas de 20 \mul de muestra se aplicaron a
una columna de permeación de gel SMART superdex 75 (Pharmacia)
preequilibrada en Tris/HCl 50 mM pH 7,4 que contenía NaCl 0,15 M
(tampón E) a una caudal de 40 \mul/minuto y los componentes se
separaron mediante permeación en gel ala mismo caudal en tampón de
equilibrio. El eluato se controló a una DO de 280 y DO de 215. Se
recogieron fracciones de 80 \mul entre 0,85 y 0,89 ml, fracciones
de 40 \mul entre 0,89 y 1,24 ml y fracciones de 100 \mul entre
1,24 y 3,0 ml. El volumen vacío de (Vo) de la columna era 0,91 ml
como se determinó mediante el volumen de retención de Blue Dextran.
La columna de superdex se calibró mediante la aplicación de 10
\mul de una solución que contiene 5 mg/ml de BSA (Mr 66 kDa,
retención (Ve) = 1,02 ml), 3 mg/ml de carbónico anhidrasa (Mr 29
kDa, Ve = 1,22 ml), 2 mg/ml de Citocromo C (Mr 12,4 kDa, Ve = 1,41
ml) y 2 mg/ml de Aprotinina (Mr 6,5 kDa, Ve = 1,59 ml) y se
identificaron una curva patrón representada gráficamente de Ve/Vo
contra fracciones de log de Mr que contenía actividad
anticongelación mediante los ensayos de impacto como se describe en
el ejemplo I, con un pico de actividad que mostraba un volumen de
retención de 1,16 ml y un peso molecular aparente de 40 kDa. Esta
medición confirmó que la banda de 36 kDa de zanahorias aclimatadas
al frío era un péptido anticongelación.
Se llevó a cabo un SDS-PAGE de
acuerdo con Laemli (1970) usando el mini sistema Biorad. Las
muestras a analizar mediante SDS-PAGE se
disolvieron en tampón de muestra de SDS-PAGE (Laemli
1970), calentadas durante 5 minutos a 100ºC sobre un bloque de
calentamiento en seco (Techne) y se centrifugó durante 3 minutos a
10.000 g a temperatura ambiente. Se aplicaron muestras
(10-50 \mul) a minigeles (Biorad, 0,75, 1,0 ó 1,5
mm de espesor, archilamida al 10, 12, 15% o gradiente de
archilamida al 10-20% (prevertido de Biorad) y
separadas electroforéticamente. Los polipéptidos separados se
fijaron y se tiñeron en el gel o bien con azul Coomassie (azul
brillante Coomassie al 0,1% (p/v) en a´cido acético/metanol/agua
mili Q {5:4:31, por volumen}) o teñido por plata usando el kit de
tinción de plata Biorad de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Los geles se secaron entre dos hojas de celofán Gelair
en un secador de aire de gel de Biorad de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se usaron kits de marcadores de alto y
bajo peso molecular de Sigma de acuerdo con las instrucciones del
fabricante para la determinación de Mr aparente sobre
SDS-PAGE.
La cromatografía de intercambio iónica se llevó
a cabo con raíz de zanahoria aclimatada al frío y raíz de zanahoria
no aclimatada al frío. Los geles de SDS-PAGE
mostraron la presencia de una banda de 36 kDa en la muestra
aclimatada al frío. Esta banda era mucho menos abundante en la raíz
de zanahoria no aclimatada al frió. Esta banda de 36 kDa se atribuyó
por lo tanto a actividad anticongelación.
Para la secuenciación de proteínas, la proteína
de zanahorias de 36 kDa se purificó como se ha descrito en el
ejemplo previo y después para asegurar la purificación adicional de
la muestra a secuenciar se eliminó del gel de SDS PAGE y después se
digirió proteolíticamente in situ en la rodaja de gel de
poliacrilamida.
Las preparaciones de proteína de 36 kDa en su
mayor parte puras, se cargaron en un gel de poliacrilamida al 12%.
Estas bandas cada una de 2 \mug de proteína se cargaron y se
sometieron a electroforesis en el gel hasta que el frente del tinte
alcanzó la parte inferior del gel. Después el gel se tiñó con azul
brillante Coomassie al 0,2% (o/v), metanol al 30% (v/v), ácido
acético al 1% (v/v) durante 20 minutos y después la destaína con
metanol al 30% hasta que las bandas de proteínas se pudieran
visualizar. La banda de 36 kDa se identificó mediante comparación
con marcadores de peso molecular cargados en las bandas adyacentes y
al banda de cada banda se eliminó con una cuchilla de bisturí,
teniendo cuidado de excluir las bandas contaminantes.
Las rodajas de gel se transfirieron a un tubo
eppendorf limpio y se lavaron dos veces con 0,5 ml de acetonitrilo
al 50% (v/v), Tris/HCl 100 mM, pH 8,5. El lavado retiró algo de las
manchas de Coomassie y también deshidrató parcialmente las rodajas
de gel. Después las rodajas de gel se retiraron del tubo y se
sometieron a secado al aire en una mesa de laboratorio hasta que se
habían contraído significativamente y se comenzaron a abarquillar.
Después se volvieron a transferir al tubo eppendorf y se
rehidrataron primeramente con, 10 \mul de Tris/HCl 100 mM, pH 8,5
que contenía 1 \mug de endoproteinasa Lys C (Boehringer Mannheim).
Ésta es una proteinasa que específicamente escinde las cadenas de
polipéptidos sobre el lado terminal carboxi de residuos lisina. Se
añadió tampón Tris adicional a las rodajas de gel hasta que estaban
completamente rehidratadas y se incubaron después a 37ºC durante
16
horas.
horas.
Después de la incubación se añadió 1 \mul de
ácido trifluoroacético al tubo para detener la reacción y después
las rodajas de gel se lavaron dos veces con 0,3 ml de acetonitrilo
al 60% (v/v), TFA al 0,1% (v/v) a 30ºC durante 30 minutos. Esto se
hizo para deshidratar de nuevo parcialmente las rodajas de gel
provocando que se contrajeran y fluyeran los péptidos que se habían
generado. El sobrenadante se transfirió a otro tubo eppendorf limpio
y después de secó en un evaporador centrífugo durante 2 horas hasta
que al muestra estaba casi seca y se volvió a suspender hasta un
volumen de 0,1 ml con TFA al 0,1%.
Después los péptidos se separaron mediante HPLC
de fase inversa sobre un sistema de micropurificación Smart
(Pharmacia). La digestión del péptido se cargó en una columna C18
(2,1 x 100 mm) equilibrada en TFA al 0,1% (disolvente A) a un caudal
de 0,1 ml/min. Después la columna se eluyó con un gradiente de
0-70% de disolvente B (acetonitrilo al 90% v/v, TFA
al 0,085% v/v) durante 70 minutos l mismo caudal. La densidad óptica
se controló a 214 nm y los picos individuales de péptido se
recogieron en el recolector de fracciones mediante etapas manuales.
Los polipéptidos se secuenciaron mediante carga en un secuenciador
de proteínas modelo 492 de Perkin Elmer usando los ciclos de
química de fase líquida como recomienda el fabricante.
Se analizaron varios fragmentos de polipéptidos
(A-E) en la banda de 36 kDa y tenía secuencias
sustancialmente homólogas a:
Una línea de cultivo de suspensión de células de
zanahoria (NOR) se obtuvo del departamento de Bioquímica y Biología
molecular, Universidad de Leeds. El cultivo se mantuvo mediante
subcultivo de 10 ml del cultivo en 90 ml de medio Murashige y Skoog
reciente (Sigma) que contenía 25 g/l de sacarosa y 1 mg/l de
2,4-D cada siete días. Los cultivos se incubaron en
un incubador de agitación orbital a 150 rpm a 25ºC en la
oscuridad.
El cultivo de NOR se trató en frío como
sigue:
Los cultivos de NOR se transfirieron a 4ºC
después de 4 días y 7 días de crecimiento a 25ºC. Los cultivos se
recogieron a t = 0 d, t = 7 d y t = 14 d. Además de la recolección,
el volumen de células aglomerado (PCV) se determinó para cada
cultivo en cada instante.
Las muestras de medio de los cultivos de
suspensión NOR se analizaron como sigue. Aproximadamente 1/10 del
volumen de una alícuota congelada de medio de cultivo de suspensión
acondicionado se permitió que se descongelara. La parte
descongelada (concentrado congelado) se eliminó y se ensayó para
evaluar la actividad mediante ensayos de impacto de sándwich como
se describe en el ejemplo I. Se encontró que el medio de cultivos
aclimatados al frió contenían significativamente más actividad que
el medio de cultivos no aclimatados al frío.
El medio de zanahoria de NOR aclimatado al frío
se tamponó mediante la adición de 100 \mul de Tris/HCl 1 M pH
7,4. La purificación de actividad se realizó después mediante
cromatografía de intercambio iónico y permeación de gel usando un
procedimiento basado en el del ejemplo II: el medio tamponado se
aplicó a columna de Sefarosa Q de1 ml (Pharamcia) a un caudal de 1
ml/min y las moléculas se eluyeron con alícuotas de 3 ml de tris/HCl
500 mM pH 7,4 que contiene concentraciones de NaCl partiendo a 0,1 M
e incrementando hasta 0,5 M en etapas de 0,1 M. Las fracciones de 1
ml se recogieron y se ensayaron para evaluar la actividad como en el
ejemplo I.
La actividad anticongelación en las fracciones
activas de intercambio iónico se purificaron mediante cromatografía
de permeación de gel como sigue. La fracción activa de antes se
precipitó con acetona y el gránulo se resuspendió en 50 \mul de
Tris/HCl 50 mM + NaCl 0,15 M, pH 7,2. Después esto se centrifugó a
10.000 g durante 10 minutos, se cargaron 20 \mul en una columna
de permeación de gel Superdex 75 en el sistema SMART de Pharmacia.
El caudal era 40 \mul/min y la fase móvil era tris/HCl 50 mM +
NaCl 0,15 M, pH 7,2. Se recogieron las fracciones de 80 \mul y
se sometió a impacto. La actividad se detectó en fracciones que
corresponden a una retención de 1,16 ml.
El aislamiento adicional de las proteínas
activas se puede hacer mediante análisis SDS-PAGE en
línea con el ejemplo II.
Los cultivos de raíces de zanahoria se iniciaron
como sigue.
Para cada cultivo individual de 10 semillas de
Daucus carota variedad Autumn King esterilizadas en al
superficie se colocaron en 10 ml de medio MS que contenía 25 g/l de
sacarosa y 0,5 g/l de MES en matraces Erlenmeyer de 250 ml
estériles. Las semillas se germinaron mediante agitación a 150 rpm
en la oscuridad a 25ºC durante 3 semanas. Después se retiraron las
hojas y tallos asépticamente. Las raíces se reemplazaron en 100 ml
de medio reciente y se incubaron con agitación durante 2 semanas
adicionales.
Se prepararon homogenatos de cultivos de raíces
tratadas y no tratadas con frío como sigue. Las raíces de
congelación rápida se molieron hasta 3 x en nitrógeno líquido en un
mortero y mano de almirez frío se transfirieron después a un mortero
y mano de almirez frío se molido y se molieron hasta con 0,5 x de
volumen de Tris . HCl 50 mM enfriado con hielo + EDTA 10 mM pH 7,4
que contenía sacarosa al 30% p/p. Los homogenatos se centrifugaron a
10.000 g durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante se ensayó para
evaluar la actividad como en el ejemplo I. Se detectó
significativamente más actividad en cultivo de raíces tratadas con
frío que en cultivos de raíces no tratadas con frío.
Extractos de raíces de raíces de zanahoria
aclimatadas al frío se prepararon mediante fregado de zanahorias
aclimatadas al frío recientemente cogidas. Se retiraron las partes
superiores y se extrajo zumo empleando un extractor de zumo
doméstico (Russell Hobbs, modelo nº 9915). Se congeló el zumo en
bloques de 1 litro y se almacenaron a -20ºC antes de la recogida
para uso en ensayos de helados. El zumo de AFP de zanahoria se
añadió a la siguiente formulación de helado:
Ingrediente | partes por peso | |
Lecha en polvo desnatada | 10,000 | |
Sacarosa | 13,000 | |
MD40 | 4,000 | |
Goma de semilla de algarroba | 0,144 | |
Genulacta L100 | 0,016 | |
MGP | 0,300 | |
Aceite de mantequilla | 8,000 | |
Vainillina | 0,012 | |
Agua | 64,528 | |
Extracto de zanahoria (de zanahorias aclimatadas | 4,472 | |
al frío que contienen 1-10 mg de AFP por kg) |
Se preparó helado mediante congelación de la
formulación anterior y aireación hasta 106% de esponjamiento.
Se hicieron mediciones sobre la muestra fresca y
sobre muestras que se habían deteriorado mediante almacenamiento a
-10ºC durante un período de 10 días. Como comparación se midió una
muestra sin extracto de zanahoria de al misma manera. Las mediciones
se hicieron como sigue:
Se equilibraron muestras a -18ºC en una cabina
de ambiente Prolan durante aproximadamente 12 horas. Se eligieron
tres muestras representativamente de cada lote de helado y se
preparó un portaobjetos de cada una en una cabina de control de
temperatura Cryostat haciendo un frotis de una capa fina de helado
del centro de cada bloque en un portaobjetos. Se aplicó una sola
gota de trementina artificial al portaobjetos y se aplicó después un
cubre objetos. Cada portaobjetos, a su vez, se transfirió después a
una platina de microscopio de temperatura controlada (Leit
LabourLux S, objetivo Leica x 10, temperatura -18ºC). Las imágenes
de los cristales de hielo (aproximadamente 400 cristales de hielo
individuales9 se recogieron y se transmitieron a través de una
cámara de vídeo (Sanyo CCD) a una almacenamiento de imágenes y
sistema de análisis (LEICA Q520MC).
Las imágenes de cristales de hielo almacenadas
se realzaron manualmente mediante dibujo alrededor del perímetro
que realzó después el cristal completo. Las imágenes de los
cristales realzados se midieron después usando un software de
análisis de imágenes que cuenta el número de píxeles requeridos para
completar la línea recta más larga (longitud), línea recta más
corta (anchura), la relación de aspecto (longitud/anchura). Los
datos de cada cristal de helado individual de un lote de helado se
importó a una hoja de cálculo donde se llevaron a cabo los análisis
de los datos para encontrar la media, y desviación estándar.
Las mediciones de dureza fe helado se llevaron a
cabo usando un ensayador universal Hounsfield H10KM, una celda de
carga Hounsfield 100 N y una sonda de acero inoxidable cilíndrica de
10 cm. Las muestras de helado se prepararon mediante incubación de
16 horas de bloques de halado de 486 ml en una cabina de control de
temperatura Prolan fijada a -18ºC.
Se retiró el bloque de hielo de la cabina de
control de temperatura Prolan y se colocó el ensayador Universal
Hounsfield H10KM. La sonda cilíndrica de 10 cm se introdujo en el
bloque de hielo a una velocidad constante de 400 mm/min hasta una
profundidad de 20 mm. La fuerza máxima registrada durante la
compresión se usó y se expresó como dureza de helado. Si se observó
resquebrajamiento o desmenuzamiento de la muestra esto se indicó
en la columna de la mano derecha.
Se obtuvieron los siguientes resultados
Muestra | Longitud | Anchura | Factor | Relación | Dureza | Observación de |
media del | media del | de forma | media de | /N | la fractura de | |
cristal/\mum | cristal/\mum | medio del | aspecto /- | desmenuzamiento | ||
cristal /- | ||||||
AFP de | 26,79 \pm 1,3 | 19,00 \pm 0,9 | 1,15 \pm 0,013 | 1,43 \pm 0,024 | 40,8 | Sí |
zanahoria | ||||||
- fresca | ||||||
AFP de | 33,48 \pm 1,3 | 24,61 \pm 0,9 | 1,13 \pm 0,013 | 1,37 \pm 0,020 | 59,9 | Sí |
zanahoria - | ||||||
alterado | ||||||
Cont. - | 33,67 \pm 1,1 | 24,79 \pm 0,8 | 1,12 \pm 0,008 | 1,38 \pm 0,018 | 27,3 | No |
fresca | ||||||
Cont. - | 61,77 \pm 2,7 | 46,54 \pm 2,0 | 1,11 \pm 0,010 | 1,37 \pm 0,020 | 32,7 | No |
alterado |
Esto prueba que el AFP tiene buenas propiedades
de inhibición de recristalización de hielo.
Las secuencias de péptidos mostradas en el
ejemplo III se analizaron por su aptitud para degenerar el diseño de
cebador de oligonucleótido. Se eligió parte del péptido D
(GLY-PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO)
y se sintetizó el cebador cp3 (CGI CCI GTI CCI YTI TTY TTY CC, en el
que I = inopina e Y = C o T) (Genosys).
La primera hebra de ADNc se preparó a partir de
5 \mug de ARN de raíces de zanahoria aclimatadas al frío (1 mes
como en el ejemplo I) usando transcriptasa inversa Superscript
(Stratagene) y un cebador de de oligonucleótidos OG1
(GAGAGAGGATCCTCGAG (T) ^{15}) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se usó como molde la reacción de la primera hebra de
ADNc, conjuntamente con los cebadores cp3 y OG1, en PCR posterior.
Las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico usando ADN
polimerasa Taq (Gibco BRL) durante 30 ciclos (1 minuto a 94ºC, 1
minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Todos los cebadores se usaron a una concentración de
1 \muM. El producto de PCR de aproximadamente 800 pares de bases
resultante se purificó en gel y se clonó en el vector pTAg (RyD
Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
producto de PCR cp3 clonado se secuenció usando el procedimiento de
secuenciación didesoxi empleado mediante el kit Sequenase (USB). La
secuencia de nucleótidos cp3 y secuencia de aminoácidos deducida
eran sustancialmente similares a:
Con el fin de obtener la región codificadora
completa del AFP de zanahoria, se construyó una librería de ADNc. Se
usó un poli (A) + columna rápida (Stratagene) para purificar ARNm a
partir de 500 \mug de ARN total de zanahoria CA (1 mes), de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todo poli (A)
resultante + ARN para la síntesis de ADNc y posterior construcción
de librería usando el kit del vector ZAP lambda (Stratagen). Se
seleccionaron 1 x 10^{5} clones de fago recombinantes mediante
hibridación usando el producto de PCR cp3 como una sonda marcada con
^{32}P.
Se seleccionaron las placas positivas para
pureza fago - mids escindido antes de las inserciones se
caracterizaron mediante análisis de secuencias de ADN. Se
secuenciaron dos clones de ADNc hasta finalización. Aunque las
regiones no traducidas de 5' y 3' contenían alguna variabilidad de
secuencia, las regiones codificadoras eran idénticas. Las regiones
codificadoras de los dos clones de ADNc eran sustancialmente
similares a:
El análisis de secuencia parcial de otros 4
clones también indicó que contenían la misma región codificadora que
los clones secuenciados completamente y de este modo todos los
positivos de la selección de librería eran similares a las
transcrpciones representadas a partir del mismo gen. La existencia
de una sola copia del gen de AFP en el genoma de zanahoria estaba
sustanciada adicionalmente mediante el hecho de que el análisis de
Southern de ADN genómico de zanahoria digerida por enzima de
restricción sugería que solamente un fragmento se hibridaza a la
sonda.
Con el fin de probar que el ADNc de zanahoria
como se muestra en el ejemplo VI representaba un AFP, se llevó a
cabo la expresión de la región codificadora como sigue. Uno de los
ADNc se clonó primero en un vector de plásmido pUC intermedio
(Messong, 1983) que contenía un módulo promotor doble CaMV 35S
(Guerineau, J. F., Woolsten, S., Brooks, L., y Mollineaux, P.
(1988)) y después en un vector binario, como se describe más
adelante. Todas las enzimas usadas fueron suministradas por Gibco
BRL y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El fagémido pBluescript (Stratagene) que
contenía el clon de ADNc se digirió con Xho I y los extremos 3' se
cargaron usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. El
fragmento de ADNc se liberó después del vector mediante digestión
con Eco RI. El fragmento de Eco RI/ADNc romo se clonó después en el
vector del plásmido pUC intermedio digerido Eco RI/romo. El módulo
de expresión CaMV-ADNc se subclonó después como un
fragmento Hind III parcial en el vector binario Hind
III-corte pBin 19 (Bevan 1984). La construcción del
vector binario se introdujo después en tabaco usando transformación
mediada por Agrobacterium (como se describe en Draper, J.,
Scout, R., Armatage, P., y Walden, R. (1988)).
Se analizó callo de tabaco transgénico para
expresión de la actividad de inhibición de recristalización tan
pronto como se regeneró suficiente material existente resistente a
kanamicina. se realizaron extractos de proteína a pequeña escala a
partir de varios callos resistentes a kanamicina más algún callo de
tabaco de tipo salvaje. Se molieron aproximadamente 2 g de tejido en
1-2 ml de tampón sacarosa (Tris 50 mM sacarosa al
30%, EDTA 10 mM, ascorbato 20 mM, pH 7,2) usando un mortero y una
mano de almirez. La solución se centrifugó a 10.000 x g durante 2
minutos y se retiró el sobrenadante a un tubo reciente. Se ensayó
una alícuota de 3 \mul de extracto de proteína para evaluar al
actividad de recristalización usando el procedimiento de ensayo de
impacto de sándwich de sacarosa del ejemplo I. Todos los extractos
de callos resistentes a kanamicina ensayados demostraron actividad
de inhibición de recristalización.
También se habían producido plantas de tabaco
transgénicas estables que expresan el AFP de zanahoria. Se han
sometido extractos de hojas de plantas de tabaco de tipo salvaje y
transgénicas a análisis de Northern usando el ADNc de AFP como
sonda. El mensaje de AFP era solo detectable en las plantas de
tabaco transgénicas. Esto sugiere que el mensaje de AFP es estable
en las plantas de tabaco transgénicas crecidas en invernadero.
Cuando se compara con la transcripción de zanahoria nativa, la
transcripción de AFP de tabaco parece que e4s ligeramente mayor.
Esta discrepancia se puede explicar mediante el procedimiento de
construcción del módulo de expresión de AFP. Debido a la señal de
poliadenilación de CaMV 35S es lo más 3' en la construcción, es
probable que esta señal se use en el mensaje de EFP transgénico,
dando lugar a una transcripción más larga. Los extractos de hoja se
planta de tabaco de tipo salvaje y transgénicas se han analizado
mediante transferencia de Western usando un anticuerpo de AFP de
zanahoria. Solamente se detectó una proteína de reacción cruzada en
las plantas de tabaco transgénicas. A pesar de la diferencia de
transcripción, la proteína producida en tabaco parece que es del
mismo tamaño que el AFP de zanahoria nativa.
Los datos anteriores proporcionan la prueba de
que la proteína purificada a partir de zanahoria y el ADNc
correspondiente representan un AFP activo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Unilever N. V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Weena 455
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rotterdam
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 3013 AL
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 010-4605351
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: 010-4606290
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Unilever PLC
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Unilever House, Blackfriars
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): EC4P 4BQ
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco Floppy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/EP97/06181
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Asn Leu Phe Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Pro Glu Glu Ile Ser Ala Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Thr Xaa Leu Asp Leu Ser Phe Asn
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Arg Leu Ser Ser Thr Ser Leu Ser Gly
Pro Val Pro Leu Phe}
\sac{Phe Pro Gln Leu Xaa Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Glu Val Ile Pro Xaa Gln Leu Ser Thr
Leu Pro Asn Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 999 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACATERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . 996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- PROCEDIMEINTO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN. /codón _ comienzo = 1
\hskip6.5cm/ producto = "proteína anticongelación"
\hskip6.5cm/ evidencia = EXPERIMENTAL
\hskip6.5cm/ número = 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 332 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Val Pro Leu Phe Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / des = "cebador cp3"
\vskip0.500000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACATERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc _ característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . 12
\vskip0.500000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN. /nota = "N se usa para indicar inosina (i)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGNCCNGTNC CNYTNTTYTT YCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / des = "cebador OG1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAGAGGAT CCTCGAGTTT TTTTTTTTTT TT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 829 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / des = "secuencia de nucleótidos de cp3 (véase la solicitud de patente página 26/27)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACATERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . 591
\vskip0.500000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN. /codón _ partida = 1
\hskip6.5cm/ producto = "proteína anticongelación"
\hskip6.5cm/ número = 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 197 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:
Claims (14)
1. Un polipéptido que tiene actividad
anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se
representa en el listado I, e isoformas o derivados de los mismos
que muestran al menos 75% de homología con la secuencia de
aminoácidos del listado I y que todavía posee actividad
anticongelación.
2. Un polipéptido que tiene actividad
anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se
representa en el listado I, e isoformas o derivados de los mismos
que muestran más de 85% de homología con la secuencia de aminoácidos
del listado I y que todavía posee actividad anticongelación.
3. Un polipéptido que tiene actividad
anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se
representa en el listado I.
4. Una secuencia de ácidos nucleico aislado que
codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3.
5. Una secuencia de ácidos nucleico aislado que
codifica la secuencia de nucleótidos como se representa en el
listado I.
6. Un procedimiento de obtención de un
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, mediante el cual el polipéptido se aísla a partir de zanahorias
aclimatadas al frío.
7. Un procedimiento de obtención de un
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, mediante el cual el polipéptido se expresa mediante un
organismo no humano modificado genéticamente.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, mediante el cual el organismo es un
microorganismo, una planta o una cultivo de células.
9. Un anticuerpo capaz de unirse específicamente
al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Un producto de alimentación que comprende un
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la
condición de que el producto de alimentación no sea una
zanahoria.
11. El producto de alimentación de la
reivindicación 10 que es un producto de confitería congelado o un
vegetal congelado.
12. Un procedimiento de producción de un
producto de alimentación que comprende un polipéptido de
anticongelación de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 que comprende las etapas de
- (a)
- añadir al producto de alimentación una composición que comprende dicho polipéptido de anticongelación; o
- (b)
- producción in situ de dicho polipéptido de anticongelación.
13. Uso del polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para incrementar la tolerancia a la helada de
las plantas.
14. Un microorganismo, línea celular o planta
transformada mediante una construcción génica que codifica el
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la
condición de que la planta no sea una planta de zanahoria no
modificada.
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