ES2259807T3 - Polipeptidos anticongelacion de zanahoria. - Google Patents

Polipeptidos anticongelacion de zanahoria.

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ES2259807T3
ES2259807T3 ES97951868T ES97951868T ES2259807T3 ES 2259807 T3 ES2259807 T3 ES 2259807T3 ES 97951868 T ES97951868 T ES 97951868T ES 97951868 T ES97951868 T ES 97951868T ES 2259807 T3 ES2259807 T3 ES 2259807T3
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Charlotte Juliette Doucet
Richard Anthony Fenn
Andrew John Mcarthur
Christopher Michael Sidebottom
Margaret Felicia Smallwood
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Abstract

SE PUEDEN AISLAR, A PARTIR DE ZANAHORIAS, NUEVOS POLIPEPTIDOS DE ANTICONGELACION QUE PUEDAN TENER UNA INFLUENCIA POSITIVA SOBRE LAS PROPIEDADES DE PRODUCTOS DE CONSUMO, COMO POR EJEMPLO PRODUCTOS DE CONFITERIA CONGELADOS.

Description

Polipéptidos anticongelación de zanahoria.
Campo técnico de la invención
La invención se refiere a polipéptidos anticongelación (AFP) y el producto de alimentación que contiene los AFP.
Antecedentes de la invención
Se han sugerido los polipéptidos anticongelación (AFP) para mejorar la tolerancia a la congelación de productos alimenticios.
Para el propósito de la invención, el término AFP tiene el significado que se conoce en la técnica, a saber aquellas proteínas que inhiben el crecimiento de cristales de hielo. Véase, por ejemplo, el documento US 5.118.792.
El documento WO 90/13571 describe péptidos anticongelación producidos químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante a partir de plantas. Los AFP se pueden usar de manera adecuada en productos alimenticios tales como helados. El ejemplo 3 B muestra formas de cristales de hielo modificados si se congela una mezcla de agua-hielo en una película en combinación con 0,01% en peso de AFP.
El documento WO 92/22581 describe los AFP de plantas que se pueden usar para controlar la forma de los cristales de hielo en un helado. Este documento también describe un procedimiento para extraer una composición de polipéptidos a partir de espacios intracelulares de plantas infiltrando las hojas con un medio de extracción sin romper las células de las plantas.
El documento WO 94/03617 describe la producción de los AFP a partir de levaduras y su uso posible en helados. El documento WO 96/11586 describe los AFP de peces producidos por microbios.
Sin embargo, hasta ahora el uso de los AFP no se ha aplicado a productos de consumo comercialmente disponibles. Una razón de esto son los costes elevados y procedimiento complicado para obtener los AFP. Otro problemas que las fuentes de los AFP son o bien difíciles de obtener en cantidades suficientes (por ejemplo, pez que contiene los AFP) o no son directamente adecuados para uso en productos de alimentación.
La presente invención pretende proporcionar polipéptidos anticongelación novedosos que tienen la ventaja de que se pueden obtener fácilmente a partir de una fuente natural abundante y que proporcionan buenas propiedades a los productos en los que se usan.
Se ha encontrado que los polipéptidos anticongelación que poseen buenas propiedades de inhibición de la recristalización se pueden obtener a partir de zanahorias. En particular se ha encontrado que los polipéptidos anticongelación obtenidos a partir de zanahorias muestran notablemente mejores propiedades cuando se compara con polipéptidos aislados de otras raíces vegetales. En particular los polipéptidos anticongelación de la invención son capaces de proporcionar buenas propiedades de inhibición de recristalización sin cambiar significativamente la forma del cristal de los cristales de hielo, con ello es posible conducir a propiedades más favorables, por ejemplo helados blandos.
Los solicitantes han encontrado que los polipéptidos anticongelación eficaces se zanahorias se caracterizan generalmente por un peso molecular aparente en SDS-PAGE de 36 kDa.
En este contexto será evidente para los expertos en la técnica que debido a la variación, por ejemplo, en SDS PAGE, el peso molecular aparente solamente se puede determinar con alguna variación en los resultados. Para el propósito de la invención estas variaciones, por ejemplo, entre 30 y 40 kDa o entre 34 y 38 kDa también están abarcados dentro del alcance de la expresión "peso molecular aparente de 36 kDa".
Los solicitantes también han encontrado que los polipéptidos anticongelación eficaces comprenden fragmentos que tienen una secuencia de aminoácidos como la representada en los ejemplos.
La secuencia de aminoácidos completa del AFP preferido de la invención se representa más adelante. De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere a una proteína anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el listado 1:
1
2
También abarcado dentro de la invención están las isoformas y derivados de los polipéptidos anteriormente mencionados que todavía poseen las propiedades anticongelación y que muestran al menos 75% de homología con el polipéptido del listado 1 más preferido más que 85%, más preferido más que 95%. Para el propósito de la invención el término derivado también abarca polipéptidos modificados que todavía poseen las propiedades anticongelación, por ejemplo formas glicosiladas de los polipéptidos anteriores.
También abarcadas dentro de la invención están secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos como se han descrito anteriormente. En particular la invención se refiere a secuencias de nucleótidos del listado 1 y alelos de los mismos.
También abarcados dentro de la invención están fragmentos de nucleótidos derivados de la región codificadora que son capaces de hibridarse a genes relacionados que codifican péptidos anticongelación.
Aunque las proteínas de la invención se pueden fácilmente directamente aislar de zanahorias, también se pueden usar técnicas de manipulación genética para producir las proteínas descritas en la invención.
Una célula hospedadora apropiada u organismo no humano se transformaría por una construcción génica que codifica el polipéptido deseado. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se puede insertar en un vector de expresión adecuado que contiene los elementos necesarios para transcripción y traducción y de una manera que se expresarán en condiciones apropiadas (por ejemplo, en una orientación apropiada y con secuencias de dirección y expresión apropiadas). Los procedimientos requeridos para construir estos vectores de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Se puede utilizar numerosos sistemas de expresión para expresar la secuencia codificadora de polipéptidos. Éstos incluyen, pero no se limitan a bacterias, levaduras, sistemas de células de insecto, sistemas de cultivo de células de plantas y plantas todas transformadas con los vectores apropiados. Se prefieren levaduras, plantas y sistemas de cultivo de cultivo de plantas en este contexto.
Se pueden transformar una amplia variedad de plantas y sistemas de células de plantas con las construcciones de ácido nucleico de los polipéptidos. Las realizaciones preferidas incluirían, pero no se limitan a, maíz, tomate, tabaco, zanahorias, fresas, semilla de colza y remolacha azucarera.
Una realización preferida de la invención se refiere al uso de los AFP de la invención para incrementar la tolerancia a la helada de las plantas. Este caso, por ejemplo, se hace mediante el procedimiento anterior en el que las plantas se transforman para asegurar (incrementar) la producción de los AFP de la invención, por lo tanto incrementando la tolerancia a la helada de dichas plantas.
La invención también se refiere a anticuerpos que específicamente se unen a un (epítope de los) polipéptidos de la invención.
Basándose en la información anterior también es posible modificar genéticamente otras fuentes naturales de manera que producen los AFP ventajosos como se han identificado en esta memoria descriptiva anteriormente.
Preferiblemente los AFP se eligen que tengan propiedades significativas de inhibición de recristalización de hielo. Un ensayo adecuado para determinar las propiedades de inhibición de recristalización se indica en el ejemplo I. También preferiblemente los AFP de acuerdo con la invención proporcionan un tamaño de partícula de hielo en el producto congelado (longitud media de cristal) tras recristalización de menos de 50 \mum, más preferiblemente entre 5-40 \mum.
Los AFP se pueden usar convenientemente en varios productos, preferiblemente en productos de alimentación que están congelados o de pretenden congelar. Las zanahorias que comprenden el AFP a niveles de origen natural no están abarcadas dentro del alcance de la invención. Sin embargo, el producto de alimentación que contienen (partes) de las zanahorias están abarcadas dentro de este término. También están abarcadas zanahorias que se han transformado para sobre expresar el AFP de la invención, es decir, que contienen el AFP a niveles significativamente más altos que las zanahorias no transformadas.
Los ejemplos de tales productos de alimentación son: productos de alimentación congelados tales como vegetales, salsas, sopas, aperitivos, productos de confitería congelados tales como helado o polo, productos lácteos etc.
Los productos preferidos en los que los que se usan AFP son o vegetales congelados o productos de confitería congelados tales como helado o polo. Preferiblemente el nivel de los AFP está entre 0,00001 y 0,5% en peso basándose en el producto final.
Si se usan mezclas secas o concentradas, la concentración puede ser más alta con el fin de asegurar que el nivel en el producto final congelado está dentro de los intervalos anteriores. Sorprendentemente se ha encontrado que las composi-
ciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de los AFP mientras que son todavía de buena calidad.
Los niveles preferidos de AFP están entre 0,00001 y 0,5% en peso, más preferiblemente 0,00005 a 0,3% en peso, los más preferido 0,0001 a 0,2% en peso.
Para el propósito de la invención no es necesario añadir el AFP en forma purificada al producto de alimentación. También es posible añadir una composición que comprende los AFP por ejemplo, un extracto del material natural que produce al AFP. También es posible modificar el producto de alimentación de manera que se produzca el AFP in situ por ejemplo añadiendo microorganismos modificados genéticamente que son capaces de producir el AFP en el producto de alimentación, o incluso para modificar genéticamente el producto de alimentación (por ejemplo el vegetal) de manera que (el vegetal) en sí mismo sea capaz reproducir el AFP in situ.
Para el propósito de la invención el término producto de confitería congelado incluye confituras congeladas que contienen leche tales como helado, yogurt helado, mantecado, sorbete, leche helada y natillas heladas, polos, granito y purés de frutas congelados.
Preferiblemente el nivel de sólidos en el dulce congelado (por ejemplo, azúcar, grasa, aromatizante, etc) es más de 3% en peso, más preferido entre 10 y 70% en peso, por ejemplo 40 a 70% en peso.
Los productos de confitería congelados de acuerdo con la invención se pueden producir mediante cualquier procedimiento adecuado para la producción de confitería congelada. Sin embargo especialmente preferiblemente todos los ingredientes de la formulación se mezclan completamente antes de comenzar el proceso de congelación.
Ejemplos Ejemplo I
Las zanahorias (Daucus carota variedad Autumn King) se desarrollaron en tiestos individuales. Cuando las plantas tenían aproximadamente doce semanas de edad, se transfirieron a una habitación fría y se y se mantuvieron a 4ºC en luz constante durante 4 semanas para la aclimatación al frío. Las plantas se regaron tres veces a la semana.
Se molieron tejidos frescos de zanahorias con una mano de almirez y un mortero (enfriado hasta 4ºC) en un volumen igual de tampón A (EDTA 10 mM, ácido ascórbico 20 mM, tamponado con Tris hasta pH 7,4) mantenido en hielo. Los homogenatos se filtraron a través de una capa de muselina y se mantuvo en hielo antes del uso adicional.
Como comparación se desarrollaron varias plantas diferentes con raíces y se prepararon homogenatos a partir de las raíces como de ha indicado anteriormente.
La actividad anticongelación se midió usando un "ensayo de impacto" (Knight y col., 1988). 2,5 \mul de la solución bajo investigación en sacarosa al 30% (p/p) se transfirió sobre un cubreobjetos limpio, apropiadamente marcado, circular de 16 mm. Se colocó un segundo cubreobjetos sobre la parte superior de la gota de solución y el sándwich se presionó conjuntamente entre el dedo y el pulgar. El sándwich se dejó caer en un baño de hexano mantenido a -80ºC en una caja de hielo seco. Cuando se han preparado todos los sándwich, se transfirieron los sándwiches desde el baño de hexano a -80ºC a la cámara de observación que contiene hexano mantenido a -6ºC usando fórceps preenfriado en el hielo seco. Tras la transferencia hasta -6ºC, se puede observar que los sándwiches cambian de una apariencia transparente a opaca. Se grabaron las imágenes mediante una cámara de vídeo y se grabaron en un sistema de análisis de imágenes (LUCIA, Nikon) usando un objetivo 20 x. Las imágenes de cada impacto se grabaron en el tiempo = 0 y otra vez después de 30-60 minutos. Se comparó el tamaño de los cristales de hielo en ambos ensayos. Si el tamaño a los 30-60 minutos es similar o se incrementa solo moderadamente (es decir incremento de menos de 20%, más preferido menos de 10% de incremento, lo más preferido menos de 5% de incremento) comparado con el tamaño de t = 0, esto es una indicación de buenas propiedades de inhibición de recristalización de cristal de
hielo.
Resultados: a partir del ensayo de impacto de sándwich parece que las muestras de raíces de zanahorias, el tallo de zanahorias y hojas de zanahorias posee propiedades de inhibición de recristalización de hielo significativas, mediante las que las raíces y hojas son más activas. Como comparación se ensayó una muestra de raíces de zanahoria no aclimatadas, que mostró menos actividad significativa. Para los siguientes ejemplos, se usó tejido de raíces para ensayo adicional sobre zanahorias.
Como comparación se investigaron varias raíces vegetales diferentes mediante el ensayo de impacto de sándwich en sacarosa al 30%. Entre estos vegetales están nabo, col rizada, coles de Bruselas, col de invierno, colza, pak choi, chirivía y fresa. Ninguna de estas fuentes de material proporcionó actividad inhibidora significativa de recristalización de hielo.
Ejemplo II
Se homogeneizó tejido de raíz de zanahoria en tres volúmenes(p/v)de tampón (ácido ascórbico 20 mM, EDTA 10 mM, Tris/HCl 50 mM, pH 7,2) en un mortero y mano de almirez preenfriado y se filtró a través de una CAAP de muselina. El filtrado se centrifugó a 6.000 g, diez minutos a 4ºC; el sobrenadante se enfrió y se centrifugó a 100.000 g durante 1 hora a 4ºC. El sobrenadante de 100.000 g de esta etapa se denomina la fracción soluble y el sedimento la fracción microsoma.
El sobrenadante se aplicó a 30 ml de Q Sefarosa de flujo rápido (Farmacia) columna preequilibrada en Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 a un caudal de 5 ml/min suministrado por una bomba HiLoad P-50 controlado por un sistema de cromatografía de baja presión Gradifrac (Pharmacia) a 4ºC y el eluato se controló a una DO de 280 mediante un monitor de UV (Monitor UV1, Pharmacia) grabado sobre un grabador de cartas (REC 102, Pharmacia). Se recogieron fracciones de 5 ml. La columna se lavó con Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 al mismo caudal hasta que la DO a 280 regresó a 0. Después se aplicó un gradiente de 150 ml de NACl 0-0,4 M en Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 se aplicó seguido de lavado en columna de NaCl 2 M. Las fracciones de eluato se sometieron al ensayo de impacto en el ejemplo I.
Las fracciones que contenían actividad anticongelación como se evidenciaba mediante inhibición de la recristalización se reunieron y se concentraron usando polietilenglicol como sigue: las fracciones se transfirieron tubería de diálisis de corte de 10 kDa (Sigma) que se han lavado en agua de frío, se sometieron a ebullición en EDTA 50 mM pH 7,5 durante 10 minutos y se enjuagaron en agua mili Q. La tubería de diálisis que contenía la muestra a concentrar se cubrió con compuesto de polietilenglicol sólido peso molecular 15.000-20.000 (Sigma) y se incubaron a 4ºC durante hasta 4 horas o hasta que el volumen dentro de la tubería de diálisis se redujo hasta 10 veces.
El concentrado reunido de la columna de Sefarosa Q se aplicó o bien a una columna de fenil Sefarosa, una columna de permeación de gel SMART superdex 75 o a una columna de permeación de gel FPLC superdex 75.
Las proteínas anticongelación de raíces de zanahoria se purificaron mediante cromatografía de permeación de gel como sigue:
Alícuotas de 20 \mul de muestra se aplicaron a una columna de permeación de gel SMART superdex 75 (Pharmacia) preequilibrada en Tris/HCl 50 mM pH 7,4 que contenía NaCl 0,15 M (tampón E) a una caudal de 40 \mul/minuto y los componentes se separaron mediante permeación en gel ala mismo caudal en tampón de equilibrio. El eluato se controló a una DO de 280 y DO de 215. Se recogieron fracciones de 80 \mul entre 0,85 y 0,89 ml, fracciones de 40 \mul entre 0,89 y 1,24 ml y fracciones de 100 \mul entre 1,24 y 3,0 ml. El volumen vacío de (Vo) de la columna era 0,91 ml como se determinó mediante el volumen de retención de Blue Dextran. La columna de superdex se calibró mediante la aplicación de 10 \mul de una solución que contiene 5 mg/ml de BSA (Mr 66 kDa, retención (Ve) = 1,02 ml), 3 mg/ml de carbónico anhidrasa (Mr 29 kDa, Ve = 1,22 ml), 2 mg/ml de Citocromo C (Mr 12,4 kDa, Ve = 1,41 ml) y 2 mg/ml de Aprotinina (Mr 6,5 kDa, Ve = 1,59 ml) y se identificaron una curva patrón representada gráficamente de Ve/Vo contra fracciones de log de Mr que contenía actividad anticongelación mediante los ensayos de impacto como se describe en el ejemplo I, con un pico de actividad que mostraba un volumen de retención de 1,16 ml y un peso molecular aparente de 40 kDa. Esta medición confirmó que la banda de 36 kDa de zanahorias aclimatadas al frío era un péptido anticongelación.
Se llevó a cabo un SDS-PAGE de acuerdo con Laemli (1970) usando el mini sistema Biorad. Las muestras a analizar mediante SDS-PAGE se disolvieron en tampón de muestra de SDS-PAGE (Laemli 1970), calentadas durante 5 minutos a 100ºC sobre un bloque de calentamiento en seco (Techne) y se centrifugó durante 3 minutos a 10.000 g a temperatura ambiente. Se aplicaron muestras (10-50 \mul) a minigeles (Biorad, 0,75, 1,0 ó 1,5 mm de espesor, archilamida al 10, 12, 15% o gradiente de archilamida al 10-20% (prevertido de Biorad) y separadas electroforéticamente. Los polipéptidos separados se fijaron y se tiñeron en el gel o bien con azul Coomassie (azul brillante Coomassie al 0,1% (p/v) en a´cido acético/metanol/agua mili Q {5:4:31, por volumen}) o teñido por plata usando el kit de tinción de plata Biorad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los geles se secaron entre dos hojas de celofán Gelair en un secador de aire de gel de Biorad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron kits de marcadores de alto y bajo peso molecular de Sigma de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la determinación de Mr aparente sobre SDS-PAGE.
La cromatografía de intercambio iónica se llevó a cabo con raíz de zanahoria aclimatada al frío y raíz de zanahoria no aclimatada al frío. Los geles de SDS-PAGE mostraron la presencia de una banda de 36 kDa en la muestra aclimatada al frío. Esta banda era mucho menos abundante en la raíz de zanahoria no aclimatada al frió. Esta banda de 36 kDa se atribuyó por lo tanto a actividad anticongelación.
Ejemplo III
Para la secuenciación de proteínas, la proteína de zanahorias de 36 kDa se purificó como se ha descrito en el ejemplo previo y después para asegurar la purificación adicional de la muestra a secuenciar se eliminó del gel de SDS PAGE y después se digirió proteolíticamente in situ en la rodaja de gel de poliacrilamida.
Las preparaciones de proteína de 36 kDa en su mayor parte puras, se cargaron en un gel de poliacrilamida al 12%. Estas bandas cada una de 2 \mug de proteína se cargaron y se sometieron a electroforesis en el gel hasta que el frente del tinte alcanzó la parte inferior del gel. Después el gel se tiñó con azul brillante Coomassie al 0,2% (o/v), metanol al 30% (v/v), ácido acético al 1% (v/v) durante 20 minutos y después la destaína con metanol al 30% hasta que las bandas de proteínas se pudieran visualizar. La banda de 36 kDa se identificó mediante comparación con marcadores de peso molecular cargados en las bandas adyacentes y al banda de cada banda se eliminó con una cuchilla de bisturí, teniendo cuidado de excluir las bandas contaminantes.
Las rodajas de gel se transfirieron a un tubo eppendorf limpio y se lavaron dos veces con 0,5 ml de acetonitrilo al 50% (v/v), Tris/HCl 100 mM, pH 8,5. El lavado retiró algo de las manchas de Coomassie y también deshidrató parcialmente las rodajas de gel. Después las rodajas de gel se retiraron del tubo y se sometieron a secado al aire en una mesa de laboratorio hasta que se habían contraído significativamente y se comenzaron a abarquillar. Después se volvieron a transferir al tubo eppendorf y se rehidrataron primeramente con, 10 \mul de Tris/HCl 100 mM, pH 8,5 que contenía 1 \mug de endoproteinasa Lys C (Boehringer Mannheim). Ésta es una proteinasa que específicamente escinde las cadenas de polipéptidos sobre el lado terminal carboxi de residuos lisina. Se añadió tampón Tris adicional a las rodajas de gel hasta que estaban completamente rehidratadas y se incubaron después a 37ºC durante 16
horas.
Después de la incubación se añadió 1 \mul de ácido trifluoroacético al tubo para detener la reacción y después las rodajas de gel se lavaron dos veces con 0,3 ml de acetonitrilo al 60% (v/v), TFA al 0,1% (v/v) a 30ºC durante 30 minutos. Esto se hizo para deshidratar de nuevo parcialmente las rodajas de gel provocando que se contrajeran y fluyeran los péptidos que se habían generado. El sobrenadante se transfirió a otro tubo eppendorf limpio y después de secó en un evaporador centrífugo durante 2 horas hasta que al muestra estaba casi seca y se volvió a suspender hasta un volumen de 0,1 ml con TFA al 0,1%.
Después los péptidos se separaron mediante HPLC de fase inversa sobre un sistema de micropurificación Smart (Pharmacia). La digestión del péptido se cargó en una columna C18 (2,1 x 100 mm) equilibrada en TFA al 0,1% (disolvente A) a un caudal de 0,1 ml/min. Después la columna se eluyó con un gradiente de 0-70% de disolvente B (acetonitrilo al 90% v/v, TFA al 0,085% v/v) durante 70 minutos l mismo caudal. La densidad óptica se controló a 214 nm y los picos individuales de péptido se recogieron en el recolector de fracciones mediante etapas manuales. Los polipéptidos se secuenciaron mediante carga en un secuenciador de proteínas modelo 492 de Perkin Elmer usando los ciclos de química de fase líquida como recomienda el fabricante.
Se analizaron varios fragmentos de polipéptidos (A-E) en la banda de 36 kDa y tenía secuencias sustancialmente homólogas a:
100
Ejemplo IV a Cultivo de células de zanahoria
Una línea de cultivo de suspensión de células de zanahoria (NOR) se obtuvo del departamento de Bioquímica y Biología molecular, Universidad de Leeds. El cultivo se mantuvo mediante subcultivo de 10 ml del cultivo en 90 ml de medio Murashige y Skoog reciente (Sigma) que contenía 25 g/l de sacarosa y 1 mg/l de 2,4-D cada siete días. Los cultivos se incubaron en un incubador de agitación orbital a 150 rpm a 25ºC en la oscuridad.
El cultivo de NOR se trató en frío como sigue:
Los cultivos de NOR se transfirieron a 4ºC después de 4 días y 7 días de crecimiento a 25ºC. Los cultivos se recogieron a t = 0 d, t = 7 d y t = 14 d. Además de la recolección, el volumen de células aglomerado (PCV) se determinó para cada cultivo en cada instante.
Las muestras de medio de los cultivos de suspensión NOR se analizaron como sigue. Aproximadamente 1/10 del volumen de una alícuota congelada de medio de cultivo de suspensión acondicionado se permitió que se descongelara. La parte descongelada (concentrado congelado) se eliminó y se ensayó para evaluar la actividad mediante ensayos de impacto de sándwich como se describe en el ejemplo I. Se encontró que el medio de cultivos aclimatados al frió contenían significativamente más actividad que el medio de cultivos no aclimatados al frío.
El medio de zanahoria de NOR aclimatado al frío se tamponó mediante la adición de 100 \mul de Tris/HCl 1 M pH 7,4. La purificación de actividad se realizó después mediante cromatografía de intercambio iónico y permeación de gel usando un procedimiento basado en el del ejemplo II: el medio tamponado se aplicó a columna de Sefarosa Q de1 ml (Pharamcia) a un caudal de 1 ml/min y las moléculas se eluyeron con alícuotas de 3 ml de tris/HCl 500 mM pH 7,4 que contiene concentraciones de NaCl partiendo a 0,1 M e incrementando hasta 0,5 M en etapas de 0,1 M. Las fracciones de 1 ml se recogieron y se ensayaron para evaluar la actividad como en el ejemplo I.
La actividad anticongelación en las fracciones activas de intercambio iónico se purificaron mediante cromatografía de permeación de gel como sigue. La fracción activa de antes se precipitó con acetona y el gránulo se resuspendió en 50 \mul de Tris/HCl 50 mM + NaCl 0,15 M, pH 7,2. Después esto se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos, se cargaron 20 \mul en una columna de permeación de gel Superdex 75 en el sistema SMART de Pharmacia. El caudal era 40 \mul/min y la fase móvil era tris/HCl 50 mM + NaCl 0,15 M, pH 7,2. Se recogieron las fracciones de 80 \mul y se sometió a impacto. La actividad se detectó en fracciones que corresponden a una retención de 1,16 ml.
El aislamiento adicional de las proteínas activas se puede hacer mediante análisis SDS-PAGE en línea con el ejemplo II.
Ejemplo IV b Cultivo de células de zanahoria
Los cultivos de raíces de zanahoria se iniciaron como sigue.
Para cada cultivo individual de 10 semillas de Daucus carota variedad Autumn King esterilizadas en al superficie se colocaron en 10 ml de medio MS que contenía 25 g/l de sacarosa y 0,5 g/l de MES en matraces Erlenmeyer de 250 ml estériles. Las semillas se germinaron mediante agitación a 150 rpm en la oscuridad a 25ºC durante 3 semanas. Después se retiraron las hojas y tallos asépticamente. Las raíces se reemplazaron en 100 ml de medio reciente y se incubaron con agitación durante 2 semanas adicionales.
Se prepararon homogenatos de cultivos de raíces tratadas y no tratadas con frío como sigue. Las raíces de congelación rápida se molieron hasta 3 x en nitrógeno líquido en un mortero y mano de almirez frío se transfirieron después a un mortero y mano de almirez frío se molido y se molieron hasta con 0,5 x de volumen de Tris . HCl 50 mM enfriado con hielo + EDTA 10 mM pH 7,4 que contenía sacarosa al 30% p/p. Los homogenatos se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante se ensayó para evaluar la actividad como en el ejemplo I. Se detectó significativamente más actividad en cultivo de raíces tratadas con frío que en cultivos de raíces no tratadas con frío.
Ejemplo V Preparación de helado
Extractos de raíces de raíces de zanahoria aclimatadas al frío se prepararon mediante fregado de zanahorias aclimatadas al frío recientemente cogidas. Se retiraron las partes superiores y se extrajo zumo empleando un extractor de zumo doméstico (Russell Hobbs, modelo nº 9915). Se congeló el zumo en bloques de 1 litro y se almacenaron a -20ºC antes de la recogida para uso en ensayos de helados. El zumo de AFP de zanahoria se añadió a la siguiente formulación de helado:
Ingrediente partes por peso
Lecha en polvo desnatada 10,000
Sacarosa 13,000
MD40 4,000
Goma de semilla de algarroba 0,144
Genulacta L100 0,016
MGP 0,300
Aceite de mantequilla 8,000
Vainillina 0,012
Agua 64,528
Extracto de zanahoria (de zanahorias aclimatadas 4,472
al frío que contienen 1-10 mg de AFP por kg)
Se preparó helado mediante congelación de la formulación anterior y aireación hasta 106% de esponjamiento.
Se hicieron mediciones sobre la muestra fresca y sobre muestras que se habían deteriorado mediante almacenamiento a -10ºC durante un período de 10 días. Como comparación se midió una muestra sin extracto de zanahoria de al misma manera. Las mediciones se hicieron como sigue:
Se equilibraron muestras a -18ºC en una cabina de ambiente Prolan durante aproximadamente 12 horas. Se eligieron tres muestras representativamente de cada lote de helado y se preparó un portaobjetos de cada una en una cabina de control de temperatura Cryostat haciendo un frotis de una capa fina de helado del centro de cada bloque en un portaobjetos. Se aplicó una sola gota de trementina artificial al portaobjetos y se aplicó después un cubre objetos. Cada portaobjetos, a su vez, se transfirió después a una platina de microscopio de temperatura controlada (Leit LabourLux S, objetivo Leica x 10, temperatura -18ºC). Las imágenes de los cristales de hielo (aproximadamente 400 cristales de hielo individuales9 se recogieron y se transmitieron a través de una cámara de vídeo (Sanyo CCD) a una almacenamiento de imágenes y sistema de análisis (LEICA Q520MC).
Las imágenes de cristales de hielo almacenadas se realzaron manualmente mediante dibujo alrededor del perímetro que realzó después el cristal completo. Las imágenes de los cristales realzados se midieron después usando un software de análisis de imágenes que cuenta el número de píxeles requeridos para completar la línea recta más larga (longitud), línea recta más corta (anchura), la relación de aspecto (longitud/anchura). Los datos de cada cristal de helado individual de un lote de helado se importó a una hoja de cálculo donde se llevaron a cabo los análisis de los datos para encontrar la media, y desviación estándar.
Las mediciones de dureza fe helado se llevaron a cabo usando un ensayador universal Hounsfield H10KM, una celda de carga Hounsfield 100 N y una sonda de acero inoxidable cilíndrica de 10 cm. Las muestras de helado se prepararon mediante incubación de 16 horas de bloques de halado de 486 ml en una cabina de control de temperatura Prolan fijada a -18ºC.
Se retiró el bloque de hielo de la cabina de control de temperatura Prolan y se colocó el ensayador Universal Hounsfield H10KM. La sonda cilíndrica de 10 cm se introdujo en el bloque de hielo a una velocidad constante de 400 mm/min hasta una profundidad de 20 mm. La fuerza máxima registrada durante la compresión se usó y se expresó como dureza de helado. Si se observó resquebrajamiento o desmenuzamiento de la muestra esto se indicó en la columna de la mano derecha.
Se obtuvieron los siguientes resultados
Muestra Longitud Anchura Factor Relación Dureza Observación de
media del media del de forma media de /N la fractura de
cristal/\mum cristal/\mum medio del aspecto /- desmenuzamiento
cristal /-
AFP de 26,79 \pm 1,3 19,00 \pm 0,9 1,15 \pm 0,013 1,43 \pm 0,024 40,8 Sí
zanahoria
- fresca
AFP de 33,48 \pm 1,3 24,61 \pm 0,9 1,13 \pm 0,013 1,37 \pm 0,020 59,9 Sí
zanahoria -
alterado
Cont. - 33,67 \pm 1,1 24,79 \pm 0,8 1,12 \pm 0,008 1,38 \pm 0,018 27,3 No
fresca
Cont. - 61,77 \pm 2,7 46,54 \pm 2,0 1,11 \pm 0,010 1,37 \pm 0,020 32,7 No
alterado
Esto prueba que el AFP tiene buenas propiedades de inhibición de recristalización de hielo.
Ejemplo VI
Las secuencias de péptidos mostradas en el ejemplo III se analizaron por su aptitud para degenerar el diseño de cebador de oligonucleótido. Se eligió parte del péptido D (GLY-PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO) y se sintetizó el cebador cp3 (CGI CCI GTI CCI YTI TTY TTY CC, en el que I = inopina e Y = C o T) (Genosys).
La primera hebra de ADNc se preparó a partir de 5 \mug de ARN de raíces de zanahoria aclimatadas al frío (1 mes como en el ejemplo I) usando transcriptasa inversa Superscript (Stratagene) y un cebador de de oligonucleótidos OG1 (GAGAGAGGATCCTCGAG (T) ^{15}) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó como molde la reacción de la primera hebra de ADNc, conjuntamente con los cebadores cp3 y OG1, en PCR posterior. Las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico usando ADN polimerasa Taq (Gibco BRL) durante 30 ciclos (1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los cebadores se usaron a una concentración de 1 \muM. El producto de PCR de aproximadamente 800 pares de bases resultante se purificó en gel y se clonó en el vector pTAg (RyD Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de PCR cp3 clonado se secuenció usando el procedimiento de secuenciación didesoxi empleado mediante el kit Sequenase (USB). La secuencia de nucleótidos cp3 y secuencia de aminoácidos deducida eran sustancialmente similares a:
3
Con el fin de obtener la región codificadora completa del AFP de zanahoria, se construyó una librería de ADNc. Se usó un poli (A) + columna rápida (Stratagene) para purificar ARNm a partir de 500 \mug de ARN total de zanahoria CA (1 mes), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todo poli (A) resultante + ARN para la síntesis de ADNc y posterior construcción de librería usando el kit del vector ZAP lambda (Stratagen). Se seleccionaron 1 x 10^{5} clones de fago recombinantes mediante hibridación usando el producto de PCR cp3 como una sonda marcada con ^{32}P.
Se seleccionaron las placas positivas para pureza fago - mids escindido antes de las inserciones se caracterizaron mediante análisis de secuencias de ADN. Se secuenciaron dos clones de ADNc hasta finalización. Aunque las regiones no traducidas de 5' y 3' contenían alguna variabilidad de secuencia, las regiones codificadoras eran idénticas. Las regiones codificadoras de los dos clones de ADNc eran sustancialmente similares a:
5
El análisis de secuencia parcial de otros 4 clones también indicó que contenían la misma región codificadora que los clones secuenciados completamente y de este modo todos los positivos de la selección de librería eran similares a las transcrpciones representadas a partir del mismo gen. La existencia de una sola copia del gen de AFP en el genoma de zanahoria estaba sustanciada adicionalmente mediante el hecho de que el análisis de Southern de ADN genómico de zanahoria digerida por enzima de restricción sugería que solamente un fragmento se hibridaza a la sonda.
Ejemplo VII
Con el fin de probar que el ADNc de zanahoria como se muestra en el ejemplo VI representaba un AFP, se llevó a cabo la expresión de la región codificadora como sigue. Uno de los ADNc se clonó primero en un vector de plásmido pUC intermedio (Messong, 1983) que contenía un módulo promotor doble CaMV 35S (Guerineau, J. F., Woolsten, S., Brooks, L., y Mollineaux, P. (1988)) y después en un vector binario, como se describe más adelante. Todas las enzimas usadas fueron suministradas por Gibco BRL y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El fagémido pBluescript (Stratagene) que contenía el clon de ADNc se digirió con Xho I y los extremos 3' se cargaron usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. El fragmento de ADNc se liberó después del vector mediante digestión con Eco RI. El fragmento de Eco RI/ADNc romo se clonó después en el vector del plásmido pUC intermedio digerido Eco RI/romo. El módulo de expresión CaMV-ADNc se subclonó después como un fragmento Hind III parcial en el vector binario Hind III-corte pBin 19 (Bevan 1984). La construcción del vector binario se introdujo después en tabaco usando transformación mediada por Agrobacterium (como se describe en Draper, J., Scout, R., Armatage, P., y Walden, R. (1988)).
Se analizó callo de tabaco transgénico para expresión de la actividad de inhibición de recristalización tan pronto como se regeneró suficiente material existente resistente a kanamicina. se realizaron extractos de proteína a pequeña escala a partir de varios callos resistentes a kanamicina más algún callo de tabaco de tipo salvaje. Se molieron aproximadamente 2 g de tejido en 1-2 ml de tampón sacarosa (Tris 50 mM sacarosa al 30%, EDTA 10 mM, ascorbato 20 mM, pH 7,2) usando un mortero y una mano de almirez. La solución se centrifugó a 10.000 x g durante 2 minutos y se retiró el sobrenadante a un tubo reciente. Se ensayó una alícuota de 3 \mul de extracto de proteína para evaluar al actividad de recristalización usando el procedimiento de ensayo de impacto de sándwich de sacarosa del ejemplo I. Todos los extractos de callos resistentes a kanamicina ensayados demostraron actividad de inhibición de recristalización.
También se habían producido plantas de tabaco transgénicas estables que expresan el AFP de zanahoria. Se han sometido extractos de hojas de plantas de tabaco de tipo salvaje y transgénicas a análisis de Northern usando el ADNc de AFP como sonda. El mensaje de AFP era solo detectable en las plantas de tabaco transgénicas. Esto sugiere que el mensaje de AFP es estable en las plantas de tabaco transgénicas crecidas en invernadero. Cuando se compara con la transcripción de zanahoria nativa, la transcripción de AFP de tabaco parece que e4s ligeramente mayor. Esta discrepancia se puede explicar mediante el procedimiento de construcción del módulo de expresión de AFP. Debido a la señal de poliadenilación de CaMV 35S es lo más 3' en la construcción, es probable que esta señal se use en el mensaje de EFP transgénico, dando lugar a una transcripción más larga. Los extractos de hoja se planta de tabaco de tipo salvaje y transgénicas se han analizado mediante transferencia de Western usando un anticuerpo de AFP de zanahoria. Solamente se detectó una proteína de reacción cruzada en las plantas de tabaco transgénicas. A pesar de la diferencia de transcripción, la proteína producida en tabaco parece que es del mismo tamaño que el AFP de zanahoria nativa.
Los datos anteriores proporcionan la prueba de que la proteína purificada a partir de zanahoria y el ADNc correspondiente representan un AFP activo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Unilever N. V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Weena 455
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rotterdam
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 3013 AL
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 010-4605351
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: 010-4606290
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Unilever PLC
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Unilever House, Blackfriars
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): EC4P 4BQ
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEÍBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco Floppy
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/EP97/06181
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Asn Leu Phe Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Pro Glu Glu Ile Ser Ala Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Thr Xaa Leu Asp Leu Ser Phe Asn Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Arg Leu Ser Ser Thr Ser Leu Ser Gly Pro Val Pro Leu Phe}
\sac{Phe Pro Gln Leu Xaa Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Glu Val Ile Pro Xaa Gln Leu Ser Thr Leu Pro Asn Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 999 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACATERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 . . 996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
PROCEDIMEINTO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN. /codón _ comienzo = 1
\hskip6.5cm
/ producto = "proteína anticongelación" 
\hskip6.5cm
/ evidencia = EXPERIMENTAL 
\hskip6.5cm
/ número = 1 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 332 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:
9
10 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Val Pro Leu Phe Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / des = "cebador cp3"
\vskip0.500000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACATERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc _ característica
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 . . 12
\vskip0.500000\baselineskip
OTRA INFORMACIÓN. /nota = "N se usa para indicar inosina (i)"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGNCCNGTNC CNYTNTTYTT YCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / des = "cebador OG1"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGAGAGGAT CCTCGAGTTT TTTTTTTTTT TT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 829 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / des = "secuencia de nucleótidos de cp3 (véase la solicitud de patente página 26/27)"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
POLARIDAD NEGATIVA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Daucus carota
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
VARIEDAD: Autumn King
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACATERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
LOCALIZACIÓN: 1 . . 591
\vskip0.500000\baselineskip
OTRA INFORMACIÓN. /codón _ partida = 1
\hskip6.5cm
/ producto = "proteína anticongelación" 
\hskip6.5cm
/ número = 1 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 197 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:
14

Claims (14)

1. Un polipéptido que tiene actividad anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se representa en el listado I, e isoformas o derivados de los mismos que muestran al menos 75% de homología con la secuencia de aminoácidos del listado I y que todavía posee actividad anticongelación.
2. Un polipéptido que tiene actividad anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se representa en el listado I, e isoformas o derivados de los mismos que muestran más de 85% de homología con la secuencia de aminoácidos del listado I y que todavía posee actividad anticongelación.
3. Un polipéptido que tiene actividad anticongelación que tiene una secuencia de aminoácidos como se representa en el listado I.
4. Una secuencia de ácidos nucleico aislado que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una secuencia de ácidos nucleico aislado que codifica la secuencia de nucleótidos como se representa en el listado I.
6. Un procedimiento de obtención de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, mediante el cual el polipéptido se aísla a partir de zanahorias aclimatadas al frío.
7. Un procedimiento de obtención de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, mediante el cual el polipéptido se expresa mediante un organismo no humano modificado genéticamente.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, mediante el cual el organismo es un microorganismo, una planta o una cultivo de células.
9. Un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Un producto de alimentación que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la condición de que el producto de alimentación no sea una zanahoria.
11. El producto de alimentación de la reivindicación 10 que es un producto de confitería congelado o un vegetal congelado.
12. Un procedimiento de producción de un producto de alimentación que comprende un polipéptido de anticongelación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las etapas de
(a)
añadir al producto de alimentación una composición que comprende dicho polipéptido de anticongelación; o
(b)
producción in situ de dicho polipéptido de anticongelación.
13. Uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para incrementar la tolerancia a la helada de las plantas.
14. Un microorganismo, línea celular o planta transformada mediante una construcción génica que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la condición de que la planta no sea una planta de zanahoria no modificada.
ES97951868T 1996-11-19 1997-11-06 Polipeptidos anticongelacion de zanahoria. Expired - Lifetime ES2259807T3 (es)

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