KR20000029554A

KR20000029554A - 열안정성동결방지단백질을함유하는냉동식품

Info

Publication number: KR20000029554A
Application number: KR1019997000612A
Authority: KR
Inventors: 피터 존 릴포드; 앤드류 존 맥아더; 크리스토퍼 마이클 사이드바텀
Original assignee: 알 브이 테이트 (로드니 비버스 테이트);에이치 드로이. 씨. 지. 오닌크;이. 에디, 산드라 웨드워즈 (에스 제이 에드워즈); 유니레버 엔.브이.
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2000-05-25
Also published as: ATE287451T1; TR199900145T2; EP0918863B1; IL127652A0; GB2315752A8; ITMI971752A1; AR008409A1; UY24641A1; CA2261994A1; DE19732135A1; IT1293767B1; JP2000515751A; AU726699B2; ES2235240T3; US6090917A; GB2315752B; ZA976473B; US6156880A; IL127652A; CZ25299A3

Abstract

a) 천연원료로부터 AFP 함유 액즙의 단리 단계;

b) 천연원료나 AFP 함유 액즙을 60℃이상의 온도로 열처리 단계;

c) 불용성 분획의 제거 단계를 포함하는, 천연원료로부터의 AFP의 회수 방법

Description

열 안정성 동결방지 단백질을 함유하는 냉동식품 {Frozen Food Product Containing Heat Stable Antifreeze Protein}

동결방지 단백질(AFP류)은 음식재료의 냉동에 대한 내성을 향상시키기 위해 제안되어 왔다.

본 발명에서, 용어 AFP는 업계에서 잘 알려진 의미 즉 빙 결정(ice crystal)의 성장을 억제하는 활성을 나타내는 단백질이란 의미를 갖는다. (예:미국 특허 5,1998,792를 참조)

세계 특허 제 90/13571호에는 화학적으로 혹은 DNA 재조합기술에 의해 제조되는 동결방지 펩티드에 대해 개시되어 있다. AFP류는 식품에 적절하게 사용될 수 있다. 실시예 3B에는 물-얼음 혼합물들이 AFP 0.01 중량%와 함께 냉동되어 필름을 형성할 경우 개조된 빙 결정 형상이 도시되어 있다.

세계 특허 제 92/22581호에는 아이스크림에서 빙 결정의 모양을 제어하는 데 사용될 수 있는 식물로부터 수득한 AFP류가 개시되어 있다. 또한 이 문헌에서는 식물을 파괴하지 않으면서 추출배지를 잎에 침윤시킴으로써 식물의 세포외공간으로부터 폴리펩티드 조성물을 추출하는 과정이 기술되어있다.

세계 특허 제 94/03617호는 이스트로부터의 AFP의 제조 및 아이스크림에서 이들이 사용될 수 있음을 개시하고 있다. 또한 세계 특허 제 96/11586호에서는 미생물에 의해 생성된 어류 AFP류를 기술하고 있다.

또한 일부 문헌에는 동결방지를 위한 식물단백질의 단리 및/또는 사용이 언급되어 있다. 동결방지 단백질들은 빙결시 손상에 대해 식물 세포막을 보호하는 기능을 가지고 있다. 그러나 이들 단백질들은 재결정화 억제 특성이 없으며 따라서 AFP라는 용어에도 포함되지 않는다.

힌차(Hincha)는 문헌[Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236-240]에서 양배추로부터 동결방지 단백질의 단리에 관해 기술하고 있다.

볼가(Volger)는 문헌[Brochimica et Acta, 412 (1975), 335-349]에서 시금치로부터 동결방지 잎 단백질의 단리에 관해 기술하고 있다.

부드(Boothe)는 문헌[Plant physiol (1995), 108: 759-803]에서 브라시카나푸스(Brassica napus)로부터 단백질의 단리에 관해 기술하고 있다. 마찬가지로 이러한 단백질들은 AFP라기 보다는 더 동결방지 단백질들로 여겨지고 있다.

네븐(Neven)은 문헌[Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993]에서 시금치의 동결방지 단백질의 DNA 특성을 기술하고 있다.

살즈만(Salzman)은 문헌[Abstracts and Reviews of the 18th Annual Meeting of the ASEV/Eastern Section n Am. J. Enol. Vitic, Vol 44 No. 4, 1993]에서 비티스(Vitis)싹 내에 열 안정성 폴리펩티드가 있음을 기술하고 있다. 비록 상기 단백질들이 어류의 동결방지 단백질과 유사하지만, 이들은 동결방지 (Cryoprotective)단백질이지 AFP는 아니다.

린(lin)은 문헌[Biochemical and Biophysical Research Communication, vol. 183, No. 3, 1992, p1103~1108및 Plant Physiology (1992), 99, 519-525]에서 아라비돕시스 하카이라(Arabidopsis Hakaira)로부터의 15kDa의 동결방지 단백질에 관해 기술하고 있다.

후드(Houde)는 문헌[The Plant Journal (1995) 8(4), 583-593]에서 밀로부터의 동결방지 단백질에 관해 언급하고 있다.

또한 실시예 VIII에 제시된 바와 같이, 양배추, 시금치, 브라시카 나푸스와 아라비돕시스의 추출물들은 가열후에는 재결정화를 억제시키는 단백질을 가지고 있지 않다.

그러나 지금까지 AFP의 사용은 시판되고 있는 식품에는 사용되고 있지 않다. 그 이유중 하나는 AFP를 수득하는 데 비용이 많이 든다는 것과 그 과정이 복잡하다는 것이다. 또 다른 이유로는 지금까지 냉동식품에 사용하기위해 제시된 AFP는 공정, 특히 저온 살균 과정동안에 불안정해지는 경향이 있기 때문에 일반적인 제제 혼합물에는 혼입될 수 없다는 것이다. 이러한 불안정성은 AFP의 변성에 기인하는 것으로 믿어지고 있다. 이것은 펩티드나 단백질에서 일반적으로 관찰되는 공지된 효과이다.

본 발명은 이들 문제들에 대한 해결책을 제공하는 것을 목적으로 한다.

의외로, AFP는 신규하고 비교적 간단한 공정에 의해 저온순화된 식물과 같은 천연 원료로부터 단리될 수 있음이 밝혀졌다. 이 공정에 의해 처음으로 냉동식품을 저온살균하기 전에 냉동식품제조를 위한 혼합물 속에 편리하게 혼입할 수 있는 AFP를 확인할 수 있다.

따라서 본 발명의 첫 번째 측면은,

a) 천연 원료로부터 AFP 함유 액즙을 단리하는 단계;

b) 60℃이상온도에서 천연원료 또는 AFP 함유 액즙을 열처리하는 단계; 및

c) 불용성 분획을 제거하는 단계를 포함하는, 천연 원료로부터의 AFP의 회수 방법에 관한 것이다.

위 과정중 단계 c는 일반적으로 단계 a와 b 후에 이루어진다. 단계 a와 b는 어떠한 순서대로 하더라도 무방하며, 예를 들어 단계 b를 단계 a후에 진행하거나 (이 경우 AFP 농축액즙이 열처리될 것이다) 또는 단계 b를 단계 a 전에 진행시킬 수도 있고 (이 경우 천연원료가 열처리될 것이다) 단계 a와 단계 b를 동시에 할 수도 있다.

의외로 본 발명의 단리방법이 많은 장점을 가지고 있음이 밝혀졌다.

첫째로 본 발명을 사용함으로써 세계 특허 제 92/22581호에 따른 방법에서 요구되는 것과 같은 식물과 같은 천연원료의 파괴를 피할 필요가 더 이상 없다. 이로 인해 세계 특허 제 92/22581호에 비해 본 방법의 상업적인 유용성이 곧바로 상당히 높아지는 데, 이는 특별한 가공으로 인한 높은 투자 비용이 이제 더 이상 필요하지 않기 때문이다.

또한 높은 온도를 사용함으로써 천연원료에 존재하는 상당량의 펩티드로부터 매우 활성이 강한 새로운 천연원료로부터의 AFP류(상기 AFP는 빙 재결정(ice-recrystallisation) 억제 특성을 갖는 활성이 매우 큰 펩티드를 포함한다.)을 추출하는 것이 가능한 것 같다.

셋째로, 예상외로 높은 온도를 사용하여도 모든 단백질성 물질이 변성되는 것은 아니며, 단지 일부의 단백질만이 변성되는 것 같다. 반면에 남아있는 AFP의 온도 안정성은 상승된다. 이는 예를 들어 저온살균 단계와 같이 좀 더 높은 온도를 거칠 필요가 있는 조성물에 단리된 AFP류를 포함시키는 것을 가능하게 한다. 이것은 특히 놀라운 일이다. 왜냐하면 예를 들어 세계 특허 제92/22581호에서 AFP류가 가열과정 중에는 안정하지 않은 것으로 나타나있기 때문이다 (예시 6 참조).

본 발명의 방법중 단계 b는 60℃보다 높은 온도에서 천연원료 또는 AFP 농축액즙을 가열하는 단계를 포함한다. 온도는 60℃내지 110℃가 바람직하며 가장 바람직하게는 80℃내지 105℃ 이다. 가열단계는 단백질 농축액즙의 단리(단계 a) 후나 단백질 농축액즙의 단리 단계 전에 실행할 수 있다. 농축액즙을 가열시키기 위해서는 통상적인 방법이나 초단파가열 또는 첨가된 추출 배지와 함께 가열하거나 증기에 쬐어 가열하는 등의 적절하다면 어떠한 방법도 사용될 수 있다.

만일 추출배지가 사용된다면, AFP분획의 불필요한 희석을 막기위해 소량 사용되는 것이 바람직하다. 물을 사용하는 것이 특히 바람직하지만, 다른 적절한 추출배지도 사용될 수 있다. 만약 필요하다면 추출배지로 물을 사용하기 전에 첨가제를 물에 첨가할 수도 있다. 그러나 실제적으로 첨가제가 없는 물을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 방법은 열 안정성 AFP류를 함유하는 어떠한 천연원료에도 적용될 수 있다. 여기에는 식물, 어류, 곤충류, 미생물등이 포함된다. 천연생물이 사용될 수도 있고 유전적 변형을 통해 얻어지는 종을 사용할 수도 있다. 예를들어 미생물이나 식물은 AFP를 발현하기위해 유전적으로 변형될 수 있고 이어서 발현된 AFP는 본 발명에 따라 단리될 수 있다. 천연원료로부터 직접 수득한 AFP와 80%이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100% 동형인 AFP를 얻을 수 있다. 본 발명에서는 이러한 높은 수준의 동형 단백질 역시 AFP라는 개념속에 포함된다. 또한 이러한 AFP를 암호화하는 유전자를 발현시킬 수 있는 이들 변형된 미생물이나 식물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

유전자 조작 기술은 본 발명에서 기술된 열 안정성 AFP를 제조하는데 사용될 수 있다. 적절한 숙주세포 또는 유기체는 열 안정성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 구조물에 의해 형질전환될 것이다. 열 안정성 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 전사와 번역에 필요한 요소를 가진 적절한 발현 벡터 내로 개재시킬 수 있으며 이러한 방법은 적절한 조건(예를 들어 적절한 위치, 정확한 리딩프레임, 적절한 타게팅 및 발현 서열) 하에서 발현될 수 있다. 이러한 발현 백터를 구성하기 위해 필요한 방법들은 업계에 공지되어 있다.

많은 발현계가 열 안정성 폴리펩티드 암호화 서열을 발현하는 데 이용될 수 있다. 여기에는 박테리아, 이스트 곤충 세포계, 식물세포 배양계 또는 적절한 발현 벡터에 의해 변형된 모든 식물이 포함되며 이에 국한되지 않는다.

매우 다양한 식물과 식물세포계는 열에 안정한 추출물에서 단리된 폴리펩티드의 핵산 구조물에 의해 변형될 수 있다. 바람직한 구현 예에는 옥수수, 토마토, 담배, 딸기, 평지씨(rape seed)및 사탕무우등이 포함되며 이에 국한되지 않는다.

AFP는 식물로부터 얻는 것이 바람직하다 (이는 AFP를 천연원료인 식물로부터 직접적으로 얻거나 또는 이들 AFP류와 고도로 동형인 AFP류를 다른 유기체내에서 유전적 조작에 의해 얻을 수 있음을 의미한다.). 열 안정성 AFP를 함유하는 어떠한 식물도 사용될 수 있으나 바람직하게는 AFP류를 함유하고 있으면서 냉조건하에서 자랄 수 있는 천연적으로 존재하는 식물(또는 이들의 유전적 변형물)을 사용한다. 겨울호밀, 다년생 목초, 사초류의 식물등을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 다른 적절한 식물로는 예로 목초식물, 겨울밀등이 있다.

열 안정성 AFP류는 아서사카로이드(Aser saccharoide), 대나무, 취어초, 이소테시움 미오수로이드(Isothecium myosuroides), 라말리나 파리나스(Ramalina farinaceae), 우스네아 서브플로리다나(Usnea subfloridana), 포르시디아 (Forsythia), 옥살리스(Oxalis), 포아 트리비알리스(Poa Trivialis), 롤리움 퍼렌(Lolium Perenne), 홀쿠스 라나투스(Holcus Lanatus), 브로머스 스테릴리스 (Bromus Sterilis), 파로디오클로아 플라벨라타(Parodiochloa flabellata), 데스참프시아 안트아티카(Deschampsia antartica), 카렉스 아쿠아틸리스(Carex aquatilis), 콜로반더스 퀸텐시스(Colobanthus quintensis), 아그로스티스 테누이스(Agrostis tenuis), 페스투카 컨트랙타(Festuca contracta), 포아 아누아(Poa annua) 등으로부터 유래되는 것이 특히 바람직하다.

AFP농축액즙은 예를 들어 압축, 여과, 균질화, 추출등의 어떠한 편리한 과정에 의해서도 원료로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는 식물재료와 같은 천연재료를 여과 등에 의해 단백질 농축분획이 모이기 전에 작은조각으로 나누거나 슬러리(slury)로 만든다. 이러한 분쇄 과정은 예를 들어 블렌더와 같은 어떠한 적절한 방법에 의해서도 행해질 수 있다. 단백질 농축액즙을 쉽게 모으기 위해 적절한 형태로 원료를 나누는 것은 당업자에게는 용이할 것이다.

단백질 분획을 모으고 가열한 후(원하는 순서대로)AFP 함유 샘플은 불용성 분획을 제거하고 AFP농축액 분획을 얻기 위해 어떠한 편리한 방법에 의해서도 처리될 수 있다. 불용성 분획은 예를 들어 여과, 침전으로 제거할 수 있다. 이어서 더 유익하게는 AFP농축액즙을 더 처리하여 AFP류를 농축 또는 단리시켜 더 사용하기에 적절한 형태로 만들 수 있다. 적절한 방법의 예로는 건조시켜 가루나 페이스트(paste)를 얻거나 더 농축하여 AFP 농축액을 얻거나 크로마토그래피하여 추출배지로부터 AFP를 단리하는 방법이 있다. 마찬가지로 적절한 단리를 위한 적절한 방법 및 조건을 결정하는 것은 당업자에게는 용이하다.

일부 천연원료의 경우 위와 같은 방법에 의해 얻어진 AFP는 둘 이상의 상이한 AFP류의 혼합물로 이루어질 수 있다. 필요할 경우 이 AFP를 다른 통상적인 방법, 예를 들어 크로마토그래피법이나 분자량과 같은 물리적/화학적 성질의 차이에 기초한 다른 방법에 의해서도 분리할 수 있다.

또한 필요하다면 단리된 AFP의 아미노산 조성 및 서열을 측정할 수 있다. 이들의 측정을 위해서 어떠한 적절한 방법도 사용된다. 이에 필요한 적절한 방법의 예들이 실시예에 기술되어 있다. 또한 필요한 경우 AFP를 암호화하는 핵산서열순서 역시 측정할 수 있다. 아미노산을 암호화 할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 벡터역시 본 발명의 범위에 포함된다.

이상의 정보에 기초하여, 상기에서 확인한 것과 같은 유익한 AFP류를 수득할 수 있도록 다른 천연 원료를 유전적으로 변형시키는 것 또한 가능하다. 적절한 AFP의 예들이 실시예에 나와있다.

상기의 방법에 의해 얻어지는 AFP는 열처리를 견딜수 있는 능력이 증가함이 밝혀졌다. 이러한 AFP류는 이전에는 결코 단리된 적이 없는 것으로 여겨진다. 위에서 언급하였듯이 이렇게 향상된 내열성은 저온살균과 같은 열처리과정을 거쳐야하는 식품에 사용하면 특히 유익하다.

따라서 본 발명의 또 다른 측면은 80℃에서 1시간동안 또는 100℃에서 10분동안 열처리 후에도 재결정화 억제 특성이 현저히 감소하지 않는 것에 의해 증명되는 바와 같은 열 안정성을 가지는 AFP와 관련된다. 빙 재결정화의 방해성질을 결정하기 위한 적절한 시험을 실시예에서 기술하고 있으며, 이에는 -40℃로 급속 냉동한 후에 -60℃에서 1시간 보관하는 방법도 포함된다. 바람직하게는 열처리 후에 본 시험에 사용되는 AFP의 빙 결정 크기를 5㎛보다 작고, 이는 열처리되지 않은 동일 샘플의 빙 결정크기보다 크게 한다. 이들간 차이가 3㎛이하인 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 1㎛이하인 것이 가장 좋다.

빙 재결정화 억제 특성이 상당한 AFP를 선택하는 것이 바람직하다. 재결정화 억제 특성을 측정하기 위한 적절한 시험이 실시예 VI에 나와있다. 바람직하게는 본 발명에 의한 AFP는 실시예에서 기술한 것과 같은 빙 재결정화 억제 분석을 거친 경우 크기가 15㎛이하, 더 바람직하게는 5내지 15㎛의 얼음 알갱이를 제공한다.

AFP는 식품 특히 냉동 식품이나 냉동하려고 하는 식품에 편리하게 사용될 수 있다. 식품에 있어 AFP를 사용하는 것은 냉동 전에 저온살균 또는 멸균하기 위해 가열시키는 제품의 경우에 특히 바람직하다. 냉동제과 제품에 사용하는 것이 특히 바람직하다.

그런 제품의 예로는, 냉동 전에 저온살균하는 아이스크림 제품, 얼음제품과 같은 냉동제과 제품이 있다. 그러한 제품들은 보통 실온에서 저장된다. 적절한 제품형태로는 예를 들어 자루속이나 작은 주머니(Sachets)내에 포장되는 가루제품이 그 예이다. 상기 제품은 예를 들어 물이나 임의로 다른 재료를 첨가하고 임의로 통기과정을 거친 후에 냉동식품의 기초를 형성할 수 있다.

적절한 제품의 다른 예는 액상 제품인데(임의로 통기된) 만일 필요하다면 다른 부수적 재료를 더 첨가하고 임의로 더 많이 통기화를 시킨 후에 냉동시킬 수 있다.

위에 언급된 제품의 명백한 잇점은 AFP성분의 존재로 인해, 예를 들어 상점이나 집에 있는 냉동기로 정적상태하에서 원하지 않는 형태의 빙 결정의 생성없이 얼릴 수 있으며 이는 정적상태를 통해 일반적으로 얻어지는 제품과는 질감이 다르다.

매우 편리하게도 이러한 혼합물은 밀폐된 용기 안에 포장된다 (예를 들어 카톤(Carton), 가방, 상자, 플라스틱 용기등). 1번 분량으로 사용될 용기 크기는 10내지 1000g 정도가 일반적이다. 여러번 사용할 분량으로는 500Kg 이하가 적절할 수 있다. 일반적으로 용기 크기는 10내지 5000g정도이다.

위에서 언급된 대로 AFP를 사용하는 적절한 제품은 아이스크림이나 얼음과 같은 냉동제과 제품이 바람직하다. 바람직하게는 AFP의 사용함량은 최종 제품 무게의 0.0001내지 0.5 중량%이다. 만약 건조혼합물이나 농축물을 사용한다면, 최종 냉동제품의 함량이 상기에 언급된 범위내로 하기 위해서는 농축을 더 시켜야 할 것이다.

의외로 본 발명의 조성물은 매우 적은 양의 AFP를 함유해도 여전히 품질이 좋을 수 있음이 밝혀졌다.

의외로 냉동제과 제품에서 적절한 재결정성과 내열성을 나타내면서도 AFP 함량은 0.1내지 50ppm까지 낮출 수 있음을 알게 되었다. 본 출원인이 결코 어떤 이론에 구속되고자 함이 아니나, 이러한 성질을 나타내는 이유는 냉동제과 고형물과 AFP 사이의 상호작용이 결정 성장을 억제하는 어떤 특수한 메카니즘을 제공하기 때문일 수 있다. 가장 편리하게는 AFP함량이 1내지 40ppm 이고, 2내지 10ppm 이 특히 바람직하다.

본 발명에서 냉동제과 제품이라는 개념에는 아이스크림, 냉동 요구르트, 샤베트, 소베트(Sorbet), 아이스밀크, 냉동 카스타드와 같은 우유 함유 냉동제과제품 물-얼음, 그래니타스(granitas), 냉동 과일 퓨레가 포함된다. 몇몇의 용도로서 발효식품에 사용하는 것은 덜 바람직하다.

냉동제과류내의 고체성분(예; 설탕, 지방, 향료등)의 함량은 4 중량%이상, 예를 들면 30중량% 이상이 바람직하며 더 바람직하게는 40~70중량% 이다.

본 발명에 의한 냉동제과 제품은 냉동제과류 제조에 적절한 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 그러나 특히 바람직하게는 저온살균과 냉동과정이 시작되기 전에 제품의 모든 재료를 완전히 섞는 것이다. 냉동과정에서 예를 들어 화씨 -30F이하의 온도로 경화시키는 과정을 포함하는 것이 이로울 것이다.

본 발명은 동결방지 단백질들(AFP류)의 분리과정과 AFP류 함유 냉동식품에 관한 것이다.

＜실시예 I＞

먼저 액즙을 모은 후 열처리를 하여 AFP를 단리함으로써 이루어지는 AFP류의 단리

겨울호밀(할로 (Halo)변종)을 1월에 베었다 (월 평균기온은 식물의 적절한 저온순화를 보장하는 3.5℃이었다.). 상기 조직을 추가 처리를 위해 빨리 실험실로 운반하고 물로 철저히 씻어서 먼지를 제거하였다.

식물잎 조직이 완전히 분쇄될 때까지 자른 호밀 400g과 800g을 워링블렌더(waring blender) 내에서, 상온에서 균질화시켰다. AFP 농축액즙을 4층의 모슬린을 통해 여과하여 수집하였다.

이어서 AFP 농축액즙을 10분간 끊여 온도 처리하였다. 이에 의해 단백질은 침전되었고 반면 본 발명에서 사용될 AFP는 용액 속에 남았다. 15,000g에서 20분간 원심분리하거나 모슬린을 통해 더 여과시켜 상층액을 침전물과 분리하였다.

AFP는 냉동건조에 의해 상층액으로부터 단리할 수 있다.

제어목적으로 겨울호밀의 아포플라스틱(apoplastic) 추출물(세포외 추출물)은 다음과 같은 과정을 통해 수득할 수 있다. 30일간 저온 순화된 호밀의 잎을 3Cm 길이로 잘라 희석된 물에 넣어 철저히 씻어 세포함유물을 제거한다. 잎 조각들은 종이타월에 펴서 말린 후 EDTA 5mM, 아스코르브산 10mM, 카르복실산 2mM, 벤자미딘(benzamidine) 2mM, 페닐메틸술포닐 플루오라이드(FMSF) 1mM가 든 추출용 배지에 전체를 침윤시켰다. 이어서 부흐너(Buchner) 플라스크에서 60분동안 진공여과를 시킨 후 잎을 제거하고 펴서 완전히 말렸다. 그 다음에는 잎들은 길이대로 정렬하고 플라스틱 시린지 배럴(plastic syringe barrel)을 잘라 2000 x g에서 30분간 원심분리했다. 아포플라스틱 추출물은 그 시린지 아래있는 에펜도로프 튜브(eppendorf tube)에 수집하였다.

＜실시예 II＞

먼저 천연원료를 가열하고 AFP 농축액즙을 단리하고 AFP를 단리함으로써 이루어지는 AFP류의 단리

혼합 잔디 조직(Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis)을 1월에 베었다 (월평균기온은 식물의 적절한 저온순화를 보장하는 3.5℃이었다.). 추가처리를 위해 조직을 빨리 실험실로 운반하고 물로 철저히 세척하여 먼지를 제거하였다.

자른 잔디 500g을 650와트 전자렌지에 넣고 5분간 최대 전력으로 가열하고 이에 의해 온도는 85℃내지 100℃ 까지 상승하였다. 이어서 자른 잔디를 상온으로 냉각시켰다.

또는 자른 잔디를 500g의 끓는 물과 섞고 이 혼합물을 100℃까지 재가열한 후 교반하면서 10분간 끓인 다음 60℃로 냉각시켰다.

이러한 가열 단계후 여과에 의해 AFP 농축액즙을 베어낸 잔디로터 분리하였다. 상기 여과액을 같은 부피의 물의 존재하에서 5분간 계속해서 교반한 다음 3층의 모슬린을 통해 짰다.

상층액을 냉동건조시켜 물을 제거한 다음 저장하였다. 또는 상층액을 냉동저장할 수도 있다.

＜실시예III＞

아이스크림제조용 액체 예비 혼합물을 아래의 성분들을 혼합하여 제조하였다.

재료 중량%

탈지 분유 11.390

수크로스 3.410

말토덱스트린 (MD 40) 4.000

로쿠스트 빈 검 (Locust bean gum) 0.072

옥수수 시럽 63DE 20.705

구아 검 0.048

제누락타 (Genulacta) L100 0.020

버터 9.015

아비셀 (Avicel) RC581 0.240

젤라틴 0.140

모노글리세라이드 (팔미테이트) 0.450

바닐린 0.010

AFP (실시예 Ⅰ＊) 0.100 또는 없음 (대조군)

물 나머지 중량

주의＊: AFP는 농축 AFP용액으로 첨가되는데 희석액으로 물을 약간 첨가할수 있으며, 상기%는 AFP의 양을 나타낸다.

이 혼합물은 85℃에서 15초간 저온 살균하고 캔에서 서늘히 보관할 수 있다.

이 혼합물은 전통적인 가정용 믹서기를 이용하여 오버런(overrun)이 약 100%에 해당될 때까지 거품을 내고,이어서 가정용 냉동고에서 정적으로 냉동시켜 아이스크림을 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 대조시료에 비해 현저히 양호한 질감을 가지고 있었다.

실시예 I의 AFP보다는 실시예 II의 AFP를 사용할 때 더 좋은 결과를 얻는다.

＜실시예 IV＞

아이스크림 제조용 액체 예비 혼합물을 아래의 성분들을 혼합하여 제조하였다.

성분 중량%

탈지 분유 10.00

수크로스 13.00

말토덱스트린 (MD 40) 4.00

로커스트 빈 검 0.14

버터 오일 8.00

모노글리세라이드 (팔미테이트) 0.30

바닐린 0.01

AFP (실시예 2＊) 0.01 또는 없음 (대조군)

물 나머지 전중량

주의＊ : AFP는 약간의 물이 있는 농축 AFP용액으로 첨가되고 상기 %는 AFP의 양을 나타낸다.

위 성분들은 상온에서 섞고 89℃에서 60초간 저온살균하였다. 이 혼합물은 무균적으로 500ml 팩속에 넣어, 봉한 다음 상온에서 보관하였다.

이 혼합물은 전통적인 가정용 믹서기를 이용하여 오버런(overrun)이 약 70%에 해당될 때까지 거품을 내고 이어서 가정용 냉동고에서 정적으로 냉동시킴으로써 아이스크림을 제조하는 데 사용될 수 있다.

2달간 저장한 후 본 발명에 따른 조성물은 대조시료보다는 현저히 양호한 질감을 가졌다.

실시예I의 AFP보다는 실시예 II의 AFP를 사용할 때 더 좋은 결과를 얻는다.

＜실시예V＞

실시예 IV를 반복하였으나, 아이스크림 혼합물을 무균상태로 봉하기 전에 70% 오버런(overrun)이 될 때까지 예비 통기시켰다.

결과물은 상온에서 저장할 수 있고, 상기 혼합물은 가정용 냉장고 속에 넣고 정적인 조건하에서 얼려 아이스크림을 얻을 수 있다.

＜실시예 VI＞

AFP의 빙 재결정 억제 특성은 다음과 같이 측정될 수 있다.

AFP를 함유하는 제품시료의 수크로스 함량을 30중량%로 조정하였다. (시료의 출발함량이 30중량% 이상일 경우 이는 희석에 의해 이루어졌고, 출발농도가 낮을 경우에는 수크로스를 30중량%까지 첨가시켰다.)

시료 3㎕를 22mm 커버슬립상에 놓았다. 그 다음 16mm 직경의 커버슬립을 상부에 놓고 200g 중량을 시료에 놓아서 슬라이드 두께를 일정하게 하였다. 커버슬립의 가장자리를 깨끗한 에나멜 니스로 봉하였다.

린크햄(Linkham) THM 600 온도조절된 현미경 재물대에 슬라이드를 놓았다. 이 재물대를 -40℃로 급속히 냉각(분당 50℃)시켜 많은 수의 작은 결정을 생성시켰다. 그 다음 이 재물대의 온도를 -6℃로 급속히 상승(분당 50℃)시키고 이 온도로 유지시켰다.

얼음상을 레이카 아리스토플랜(Leica Aristoplan) 현미경을 사용하여 -6℃에서 관찰하였다. 람다 플레이트와 편광조건을 사용하여 빙 결정과의 대조를 향상시켰다. 얼음상의 상태(빙 결정의 크기)를 T=0 및 T=1 시간에서 35mm 현미경 사진으로 기록하였다.

일반적으로 본 실험은 AFP와 물로 구성되는 어떠한 적절한 조성물에도 적용될 수 있다. 일반적으로 실험 시료 조성물에서 AFP의 농도는 그리 중요하지 않으며 예로 0.001내지 0.5중량%로 할 수 있으며 더 바람직하게는 0.005내지 0.1 중량%, 가장 바람직하게는 0.001내지 0.05 중량%이며 예를 들면 0.01 중량 %이다.

AFP와 물을 함유하는 어떠한 적절한 조성물도 본 실험을 수행하는데 사용될 수 있다. 그러나 일반적으로 AFP를 정제된 형태로 얻을 필요는 없다. 실제 적용시에는 보통 천연원료로부터 실험할 액상추출액이나 액즙을 준비하면 충분하고, 이 추출액이나 액즙으로 실험할수 있다.

농축단계 유무를 불문하고 실시예 I 또는 II에 의해 얻어지는 AFP 함유 추출물에 이 방법을 적용할 수 있다.

일부 시료의 재결정화 억제 특성을 측정하였다. 상기 시료들을 1년동안 수차례 수확된 호밀로부터 수득하였다. 실시예 I에 따라 추출및 가열한 후 얻어지는 AFP액즙의 재결정화 특성을 상기와 같이 측정하였다. 비교용으로는 온실(AFP 형성을 야기하지 않는 온도의)에서 자란 호밀을 사용하였다.

다음은 측정된 빙 결정크기이다.

시료 1시간 후의 빙 결정크기 (㎛)

대조군 25

12월 시료 17

1월 시료 10

2월 시료 15

3월 시료 18

4월 시료 18

5월 시료 25

이들 측정으로부터 식물의 AFP 활성은 12~4월 정도의 겨울동안 수확될 경우에 더 좋음을 알 수 있다. 크기가 15㎛ 이하인 빙 결정을 수득할 수 있는 시료가 특히 바람직하다. 이 경우 1월이나 2월에 식물을 수확함으로써 얻을수 있다.

열처리(60℃에서 1시간)한 1월의 AFP 시료에 동일한 측정을 하였다. 재결정화 성질이 실질적으로 감소하지 않았다.

대조군으로서 실시예 I의 아포플라스틱 추출물을 사용하였다. 이 실험에서 1시간 후의 최종 얼음 알갱이 크기는 11.1㎛ 이었다. 100℃에서 10분간 끓여 열처리 한 후에는 1시간 후에, 빙 결정의 크기는 16.8㎛ 이었다. 본 실시예에서는 겨울밀로부터 추출한 아포플라스틱 추출물이 열에 안정하지 않음을 보여주고 있다.

＜실시예 VII＞

1월에 수확한 잔디로부터 추출한 열처리되지 않는 추출물을 실소(Silsoe) (영국)로 부터 얻었다. 본 추출물을 다음과 같은 조건에서 1시간동안 원심분리시켜 오물및 불용성 물질을 제거하였다. 원심분리 : 소발(Sorvall) RC 3C, 로터(Rotor): H6000A, 온도:+5, 로터속도: 5000rpm (7268g)

추출물 샘플을 냉동건조시켜 총 고형 함량을 측정하였다. 이는 11.48 mg/ml 이었다. 다음으로 건조 추출물을 30%의 수크로스 용액으로 초기 총 고형 농도까지 재수화하였다. 상기 추출물은 필요한 만큼 30%수크로스 용액으로 희석하여 일부 용액을 제조하였다.

실시예 VI의 분석법을 사용하여 냉동억제 활성을 측정하였다.

빙 재결정화 억제 분석으로부터 얻은 T=0 과 T=1 시간에서의 사진에는 제이스(Zeiss) TGA 10분석기를 사용하여 측정한 빙 결정크기의 중간치가 있다.

그 결과는 아래 표에 나와있다.

시료	총 고형성분(㎎/㎖)	빙 결정의 크기 (㎛)	-6℃에서 1시간 후 빙 결정의 성장
시료	총 고형성분(㎎/㎖)	T=0	-6℃에서 1시간 후 빙 결정의 성장	-6℃에서 1시간저장
원액	11.48	5.2	7.3	2.1
50% 추출액	5.74	5.5	7.6	2.1
25% 추출액	2.87	6.3	8.9	2.6
12.5% 추출액	1.435	6.6	13.1	6.5
6.25% 추출액	0.7175	8.1	14.7	6.6
3.125% 추출액	0.359	7.4	17.0	9.6
1.5625% 추출액	0.179	9.0	20.3	11.3

이 결과에서는 최종 결정 크기가 다양함을 보여주고 있고 아울러 잔디 추출물의 각종 희석액을 -6℃에서 1시간동안 두었을 경우 빙 결정 크기의 변화를 보여주고 있다. 여전히 좋은 재결정화 특성을 얻으면서도 잔디 추출물내의 고체함량의 비율이 매우 다양함을 알 수 있다. 1시간 후에 빙 결정크기가 15㎛이하가 되도록 하는 농도를 선택하는 것이 바람직하다.

열처리(100℃에서 10분간)를 거친 잔디 추출물에 대해 유사한 실험을 행하였다. 재결정화 억제 특성은 현저하게 줄어들지 않음을 알았다.

또한 실시예 II의 잔디추출물을 동일한 재결정화 억제 실험을 통해 테스트하였다. 그 결과는 다음과 같이 얻어졌다.

열처리 결정크기(㎛)

T=0 T=1

60℃에서 1시간 9.6 11.1

10분간 끓임 9.8 11.3

이들 결과로부터 심지어 열처리를 하고 난 후에도 저온순화 잔디 추출물의 빙 결정의 성장 억제 능력이 유지됨을 알 수 있다.

＜실시예 VIII＞

AFP를 함유하는 일부 식물을 1월에 수확했다. 이들의 추출액은 얼음위에서 보관된 완충용액 A(트리스(Tris)로 pH7.4까지 완충시킨 10mM EDTA, 20mM 아스코르브산)내에서 막자 및 막자 사발(4℃로 냉각됨)로 뿌리, 줄기, 싹, 잎등의 생조직을 갈아서 수득하였다. 균질물은 하나이상의 모슬린 층을 통해 여과시키고 추가 사용을 하기에 앞서 얼음에 보관한다.

추출물은 60℃에서 1시간 가열하고 10분간 끓인 후에 실시예 Ⅵ에서의 재결정화 억제 실험을 했다.

다음의 식물들은 재결정화 억제 특성을 유지함으로써 증명된 바와같이 열 안정성 AFP를 포함하였다. :아서 사카로이드(Acer saccharoides), 대나무, 부들레이아(Buddleia), 이소테시움 미오수로이드(Isothecium myosuroides), 라말리나 파리나시아(Ramalina farinaceae), 우스네아 서브플로리다나(Usnea subfloridana), 포르시티아(Forsythia), 옥살리스(Oxalis), 포아 트리비알리스(Poa Trivialis), 롤리움 퍼렌(Lolium Perenne), 홀쿠스 라나투스(Holcus Lanatus), 브로무스 스테릴리스(Bromus Sterilis), 파로디오클로아 플라벨라타(Parodiochloa flabellata), 데스캄프시아 안타르티카(Deschampsia antartica), 카렉스 아쿠아틸리스(Carex aquatilis), 콜로반투스 쿠인텐시스(Colobanthus quintensis), 아그로스티스 테누이스(Agrostis tenuis), 페스투카 콘트락타(Festuca contracta), 포아 아누아(poa annua)

다음의 식물들은 열 안정성 AFP를 포함하지 않았다 : 양배추, 시금치, 브라시카 나푸스(Brassica napus), 아라비놉시스(Arabinopsis)

＜실시예 IX＞

AFP의 열이력 활성도를 다음과 같이 테스트 할 수 있다.

뜨거운 물이 있는 욕조 속에 에펜도르프(Eppendorfs)를 넣고 여기에 시료 1㎖를 넣어 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 본 시료의 열이력 특성을 다음과 같이 측정하였다.

녹인 시료를 마이크로슬라이드(Camlab Cambridge, 시료 길이 0.1㎜)위에 놓는다. 마이크로슬라이드의 끝은 와셀린으로 봉했다.

얼음을 분무동결시킨 에어로졸을 사용하여 시료내에 도입하였다. 그 다음 온도가 -0.1℃로 조절된 에탄올이 든 욕조 속에 슬라이드를 침윤시켰다. 시료를 5분간 평형을 시킨다음 그 시료를 체크했고 이들 단계들은 소량의 빙 결정이 시료내에 존재하는 온도에 도달할 때까지 반복한다. 이 온도에서의 평형후에 욕조의 온도를 분당 0.01℃로 감소시켰다. 평형화된 결정으로부터 얼음이 생겨나는 온도를 상기 시료의 어는 점으로 기록한다.

그 다음 본 시료의 녹는 점을 어는 점에서 시작해서 모든 빙 결정이 녹을 때까지 분당 0.01℃로 차차 올림으로써 측정한다. 이 온도가 상기 시료의 녹는점이다.

상기 시료의 열이력 현상은 녹는점과 어는 점과의 차이이다.

본 실험과정은 첫번째 시료(열처리 전의)및 열처리 후 냉각한 두번째 시료에 행한다.

유사하게 열 안정성은 물에서 30초동안 시료를 끓인 후 열이력 형상을 측정하는 상기 실험에 의해 결정할 수 있다. 일부시료의 열이력현상을 측정했다.

시료를 연간 몇 번 수확된 겨울밀로부터 수득하였다. 실시예 I에 따라 추출하고 가열한 후 얻은 AFP 과즙액의 열이력 현상을 실시예 Ⅵ에서와 같이 측정했다. 대조군으로서는 온실(일반적으로 AFP 형성을 일으키지 못하는 온도에서) 에서 자란 겨울밀을 사용했다.

이하의 열이력현상을 측정하였다.

시료 열이력현상(℃)

대조군 0.04

12월 시료 0.18

1월 시료 0.21

2월 시료 0.17

3월 시료 0.15

4월 시료 0.12

5월 시료 0.05

이들 측정치들을 통해 좋은 AFP 활성을 위해 식물은 12~3월 정도의 겨울동안에 수확해야함을 보여주고 있다.

열처리(60℃에서 1시간)된 1월의 AFP 시료에서도 동일한 측정을 하였다. 열이력현상이 실질적으로 감소되지는 않았다.

＜실시예Ⅹ＞

AFP의 아미노산 서열 결정

실시예 II의 열 안정성 잔디 추출물을 10kDa 크기의 막을 구비한 아미콘 (Amicon) 초여과 챔버를 사용하여 약 10배정도로 농축시켰다. 결과농축물은 모노 Q, (Pharimacia) HR 5/5 FPLC 음이온 교환 칼럼상에 적재하였다. 칼럼에 결합된 것을 50mM 트리스/HCl 완충용액(pH 8.5)에 넣고, RI활성 분획을 NaCl 선형구배로 용출하여 최종농도가 0.5M인 동일 트리스 완충액(pH8.5)을 제조하였다. 크로마토그래피를 1㎖/분의 유속으로 수행하고 1㎖분획을 수집하여 재결정 억제 활성도를 분석했다(실시예 IX에서와 같이).

활성인 부분을 함께 넣어 소발(Sorvall) SS 34로터 (rotor) (8 x 50㎖)내의 센트리콘(Centricon)PM10 원심 농축기 상에서 10분동안 10000rpm의 속도로 원심분리시켜 부피가 0.05㎖가 되도록 농축시켰다. 농축액은 SMART 초분리계(pharmacia) 상에서 작동하는 슈퍼덱스(Superdex) 75PC 3.2/30 젤 여과 칼럼 상에 적재하였다. 칼럼을 0.05㎖/분의 유속으로 50mM Tris/HCl 완충용액 (pH8.5)으로 용출시켰다. 시료의 총 부피가 3.5㎖가 될 때까지 적재한 후, 0.05㎖를 수집하였다. 분획의 재결정화 억제 활성도를 분석한 후(실시예 Ⅸ에서와 같이) 가장 활성이 큰 분획을 SDS PAGE 겔상에서 분리하여, N 말단을 서열화하기 전에 전기 흡착시켰다.

활성 슈퍼덱스 75 분획을 겔 부하 완충용액(50mM 트리스/HCl, pH 6.8, 10% 글리세롤, 10mM 디티오스라이톨(dithiothreithol), 2% SDS)에 넣고 그 다음에 람믈리(Laemmli)방법에 따라 10% 폴리아크릴라미드 젤(Polyacrylamide gel)에서 분리했다.

전기영동 후에 그 겔(gel)을 메탄올에 적신 프로블로트(Problott) (Perkin Elmer) 막 사이에 끼운 다음 10mM의 10% 메탄올을 함유하는 3 (Cyclohexylamino)-1-프로판 술폰산(CAPS)완충용액내에서 16시간동안 20V의 전압에서 전기 흡착시켰다.

흡착 후 그 막을 메탄올로 먼저 간단히 씻고 그 다음 밀리 Q (Milliporo) 물로 씻은 다음 부착된 단백질을 0.1%(w/v)의 아주 푸른 코마시(coomassie) 용액으로 가시화하였다.

외현 분자량이 25kDa와 35kDa인 두개의 단백질 띠가 코마시에 염색되어 가시화되었다. 35kDa 단백질은 RI 활성이 가장 큰 분획과 특히 밀접하게 상관이 있는 것으로 보였다. 두 개의 단백질 띠를 스칼펠 (Scalpel) 칼로 잘라 서열화하였다.

이전에 가장 활성이 큰 분획의 겔은 은염색하였을 때 65~70kDa에서 단백질 띠를 나타내었기 때문에, 외현 분자량이 65내지 75kDa에 해당하는 막 중에 염색되지 않은 부분을 또한 서열화하였다.

막의 잘려진 3부분 모두를 블랏 시퀀싱 카트리지(Blott Sequeucing Cartridge) 상에 부하시켜 서열화하였고 그 서열을 제조자(Perkin-Elner)에 의해 기술된 반응과 전환 사이클로 측정했다. N 말단 서열은 아래와 같다.

25kDa AFP는 N말단 서열이 하기 서열 및 그의 실질적인 동족체인 것을 포함한다.

ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR

35kDa AFP는 N말단 서열이 하기 서열 및 그의 실질적인 동족체인 것을 포함한다.

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO

65내지 70kDa AFP는 N말단 서열이 하기 서열 및 그의 실질적인 동족체인 것을 포함한다.

X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

각 서열상에 나타난 X는 밝혀지지 않았으나 식물단백질에서 발견되는 아미노산의 일종일 수 있다. 본 발명에서 실제적으로 동형이라는 의미는 아미노산이 80% 이상 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95~100%가 겹치는 것을 말한다.

Claims

a) 천연원료로부터 AFP 함유 액즙의 단리 단계;

b) 천연원료나 AFP 함유 액즙을 60℃이상의 온도로 열처리 단계;

c) 불용성 분획의 제거 단계를 포함하는, 천연원료로부터의 AFP의 회수 방법
제1항에 있어서, 상기 단계 a및 단계 b(순서는 무방)는 단계 c 전에 일어나는 방법
60℃에서 1시간, 80℃에서 1시간, 또는 100℃에서 10분간의 열처리 후에 빙 재결정화 억제 특성이 현저히 감소하지 않는 것에 의해 증명된 열 안정성을 가지는 AFP류.
제3항에 있어서, -40℃로 급속히 얼린 다음 -6℃에서 1시간 동안 저장한 후의 수(水)중의 열처리된 AFP 조성물의 빙 결정크기가 5㎛보다 작고 열처리되지 않은 동일한 AFP의 빙 결정크기보다 큰 AFP류.
제3항 또는 제4항에 있어서, -40℃로 급속히 얼리고 -6℃에서 1시간동안 저장한 후의 수중의 AFP 조성물의 빙 결정 크기가 15㎛ 이하인 AFP류.
제3항과 제4항에 있어서, 분자량이 25kDa, 35kDa, 및 65~75kDa인 단백질을 하나 이상 함유하는 AFP류.
제6항에 있어서, N 말단 서열이 하기 서열 및 그의 실질적인 동족체인 것을 포함하는 AFP류.

25 kDa AFP:

ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR

35 kDa AFP:

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO

65-75 kDa AFP:

X-GUL-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR
제7항의 AFP류 중 하나 이상을 암호화할 수 있는 핵산 서열을 가지는 벡터.
제7항의 AFP류 중 적어도 하나 이상을 발현시킬 수 있는 형질전환된 유기체.
제3항에 따른 AFP를 0.0001내지 0.5 중량 % 함유하는 냉동제과 제품.
제3항의 AFP를 함유하는, 제10항에 따른 냉동제과 제품의 제조에 사용하기에 적합한 예비 혼합물. 제3항의 그 AFP를 포함.
60℃에서 1시간, 80℃에서 1시간 또는 100℃에서 10분간 열처리 한 후에도 빙 재결정 억제 특성이 실질적으로 감소되지 않는 것으로 나타나는 열 안정성을 가지는 AFP 0.0001내지 0.5 중량 % 를 함유하는 제제 혼합물을 제조하고, 이어서 정적조건하에서 동결시키는 것을 포함하는 냉동제과 제품의 제조방법.