CZ25299A3

CZ25299A3 - Způsob získávání nemrznoucích proteinů

Info

Publication number: CZ25299A3
Application number: CZ99252A
Authority: CZ
Inventors: Peter John Lillford; Andrew John Mcarthur; Christopher Michael Sidebottom; Peter Wilding
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 1999-07-14
Also published as: CA2261994A1; CN1226284A; IT1293767B1; SK8999A3; NO990317D0; US6090917A; ATE287451T1; GB2315752A; PA8434401A1; FR2751657A1; AR008409A1; JP4243663B2; AU3443797A; DE19732135A1; GB2315752A8; IL127652A0; DK0918863T3; SK282279B6; IL127652A; ZA976473B

Description

Způsob získávání nemrznoucích proteinů

• ·

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu izolace nemrznoucích proteinů (AFP) a mraženého potravinářského produktu obsahujícího AFP.

Dosavadní stav techniky

Nemrznoucí peptidy (AFP) byly navrženy pro zlepšení tolerance potravinářských produktů k zmrazování.

Pro účely předkládaného vynálezu má termín AFP význam, který je velmi dobře známý v oboru, zejména tak označuje ty proteiny, které vykazují vlastnost inhibice růstu ledových krystalů. Viz například US 5,118,792.

Patentová přihláška WO 90/13571 popisuje nemrznoucí peptidy vyráběné chemicky nebo rekombinačními DNA technikami. AFP mohou být výhodně použity v potravinářských produktech, jako je smetanová zmrzlina. Příklad 3B popisuje modifikované tvary ledových krystalů, když je směs vody a ledu mražena na film v kombinaci s 0,01 % hmotnostním AFP.

Patentová přihláška WO 92/22581 popisuje AFP z rostlin, které mohou být použity pro řízení růstu ledových krystalů ve smetanové zmrzlině. Tento dokument rovněž popisuje způsob extrakce směsi polypeptidů z extracelulárních prostorů rostlin prostřednictvím infiltrace listů extrakčním médiem bez narušení rostlinných buněk.

Patentová přihláška WO 94/03617 popisuje výrobu AFP z kvasinek a jejich případné použití ve smetanové zmrzlině.

Patentová přihláška WO 96/11586 popisuje rybí AFP vytvořené prostřednictvím mikrobů.

rovněž zmiňuje izolaci pro kryo-ochranu.

Několik odkazů v literatuře a/nebo použití rostlinných proteinů

Kryo-ochranné proteiny mají funkci v ochraně rostlinných blan proti poškození mrazem, tyto proteiny, ale nemají vlastnosti inhibice při rekrystalizaci a nejsou tudíž zahrnuty pod termín AFP.

Hincha v Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236-240 popisuje izolaci kryo-ochranných proteinů ze zelí.

Volger v Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), 335-349 popisuje izolaci kry-ochranných listových proteinů ze špenátu.

Boothe v Plant Physiology (1995), 108: 759-803 popisuje izolaci proteinů z Brassica napus. Tyto proteiny jsou opět považovány spíše za kryo-ochranné proteiny než za AFP.

Neven v Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993 popisuje DNA charakterizaci kryo-ochranného proteinu ze špenátu.

Salzman v Abstracts and Reviews of the 18th Annual Meeting of the ASEV/Eastern Sectiom in Am. J. Enol. Vitic., svazek 44, č. 4, 1993 popisuje přítomnost polypeptidů stabilních při varu v pupenech Vitis. Ačkoliv jsou tyto protein analogické rybím nemrznoucím proteinům, jsou kryo-ochrannými proteiny a ne AFP.

Lin v Biochemical and Biophysical Research

Communicatíon, svazek 183, č. 3, 1992, strany 1103-1108 a v

Lin, Plant Physiology (1992) 99, 519-525 popisuje kryo-ochranný polypeptid s molekulovou hmotností 15000 z

Arabidopsis Hakaira.

Houde v The Plant Journal (1995) 8(4), 583, 593 zmiňuje kryo-ochranné proteiny z pšenice.

Navíc - jak je ilustrováno v Příkladu VIII - nemají extrakty ze zelí, špenátu, Brassica napus a Arabidopsis proteiny, které inhíbují rekrystalizací po zahřátí.

Až doposud ale nebylo použití AFP aplikováno na komerčně dosažitelné produkty. Jedním důvodem pro tuto skutečnost je vysoká cena a složitý postup pro získání AFP. Dalším důvodem je to, že AFP, které až doposud byly navrhovány pro použití v mražených potravinářských produktech, nemohou být začleněny do standardní výrobní směsi, protože mají sklon k destabilizaci v průběhu zpracování, zejména v průběhu pasterizačního kroku.

Předpokládá se, že tato destabilizace je způsobována 15 denaturací AFP; což je velmi známý jev běžně pozorovaný u peptidů a proteinů.

Předkládaný vynález si klade za cíl vytvořit řešení pro shora zmiňované problémy.

o n

Podstata vynalezu

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že AFP mohou být izolovány z přírodních zdrojů, jako jsou rostliny aklimatizované na chlad, prostřednictvím relativně

2^ jednoduchého postupu. Tento postup vede nejprve na identifikaci AFP, které mohou být vhodně začleněny do směsi pro výrobu mražených produktů před jejich pasterizací.

Podle prvního aspektu se tedy předkládaný vynález týká způsobu získávání AFP z přírodních zdrojů, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

a) izolaci AFP obsahující šťávy z přírodního zdroje;

b) tepelnou úpravu přírodního zdroje nebo AFP obsahující šťávy na teplotu alespoň 60 °C;

c) odebrání nerozpustné frakce.

Krok c) shora uvedeného způsobu bude obvykle probíhat po krocích a) a b). Kroky a) a b) mohou být prováděny v jakémkoliv požadovaném pořadí, například může být proveden nejprve krok a) následovaný krokem b) (v tomto případě bude zahřívána šťáva bohatá na AFP) nebe může být nejprve proveden krok b) následovaný krokem a) (v těmto případě bude zahříván přírodní zdroj) nebo mohou být kroky a) a b) prováděny současně.

Překvapivě bylo zjištěno, že izolační postup podle předkládaného vynálezu má množství výhod.

Za prvé s použitím tohoto způsobu není dále nutné zamezit narušení přírodního zdroje, jako jsou rostliny, jak je to požadováno v postupech podle patentového spisu WO 92/22581. Tato skutečnost bezprostředně podstatně zvětšuje komerční využitelnost tohoto způsobu, například ve srovnání právě s postupy podle patentového spisu WO 92/22581, protože nejsou již dále potřebné velké investiční náklady pro specifické zpracování.

Prostřednictvím použití vysokých teplot se také ukazuje nová možnost extrakce z velké skupiny peptidů, přítomných v přírodních zdrojích, nového výběru velmi aktivních AFP z přírodního materiálu, přičemž tyto AFP zahrnují peptidy, které jsou velmi aktivní pokud se týká vlastností inhibice rekrystalizace ledu.

Za třetí, oproti očekáváním, použití vysokých teplot nedenaturuje všechen proteinový materiál, ale pravděpodobně denaturuje pouze některé z proteinů, zatímco zbývající AFP mají zvýšenou teplotní stabilitu. To potom umožňuje začlenění izolovaných AFP do směsí, které musí být podrobeny vyšším teplotám, například pasterizačnímu kroku. Tato skutečnost je obzvláště překvapivá, protože například AFP z patentového spisu WO 92/22581 nejsou stabilní za podmínek ohřevu (viz příklad VI).

Způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje v kroku

b) ohřev přírodního zdroje nebo šťávy, bohaté na AFP, na teplotu větší než 60°C. Výhodně se tato teplota pohybuje od 60 do 110°C, zvláště výhodně od 80 do 105°C. Krok ohřevu může probíhat po izolaci šťávy, bohaté na protein, (krok a)) nebo před izolací šťávy, bohaté na protein. Jakýkoliv vhodný způsob ohřevu této šťávy může být použit, například běžný nebo mikrovlný ohřev, propařování a podobně.

Pokud je použito extrakčního média, výhodně je toto médium použito v malých objemech pro zamezení zbytečnému ředění frakce s AFP. Může být použito jakéhokoliv vhodného extrakčního média, ačkoliv použití vody je obzvláště výhodné. Pokud je to žádoucí, mohou být do vody přidány příměsi, před jejím použitím jako extrakčního média. Obvzláště výhodně je ale voda použita v podstatě bez příměsí.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být aplikován na jakýkoliv přírodní zdroj tepelně stabilních AFP. V tomto seznamu jsou zahrnuty rostliny, ryby, hmyzy a mikroorganismy. Může být použito jak přírodně se vyskytujících druhů tak i druhů, které byly získány prostřednictvím genetické modifikace. Tak například mohou být geneticky modifikovány mikroorganismy nebo rostliny pro expresi AFP a tyto AFP potom mohou být izolovány podle předkládaného vynálezu. Takto mohou být získány AFP mající alespoň 80%, zvláště výhodně větší než 95% a obzvláště výhodně 100% homologii s AFP přímo získanými z přírodních zdrojů. Pro účely předkládaného vynálezu jsou proteiny mající tuto vysokou úroveň homologie rovněž zahrnuty pod termín AFP. Také tyto transformované mikroorganismy nebo rostliny, schopné exprese genů obsahujících AFP, jsou rovněž zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu.

Pro vytvoření tepelně stabilních AFP, popsaných podle předkládaného vynálezu, může být použito technik genetické manipulace. Vhodná hostitelská buňka nebo hostitelský organismus by byl transformován genovou konstrukcí, která “5 obsahuje požadovaný tepelně stabilní polypeptid. Kódová nukleotidová sekvence pro tento tepelně stabilní polypeptid může být uložena do vhodného vektoru pro expresi, obsahujícího nezbytné prvky pro transkripci a translaci, a tak, že dojde k její expresi za vhodných podmínek (například

0 při správné orientaci a správném čtecím rámci a s vhodnou sekvencí pro cílení a expresi). Postupy požadované pro vytvoření těchto vektorů pro expresi jsou velmi dobře známé osobám v oboru znalým.

Množství různých systémů pro expresi může být využito pro expresi kódové sekvence pro tepelně stabilní polypeptid. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na, bakterie, systémy kvasničných hmyzích buněk, živné systémy rostlinných buněk a rostliny, přičemž všechny tyto systémy jsou transformovány vhodnými vektory pro expresi.

• ► · » * • · ·

Široký výběr rostlin a rostlinných buněčných systémů může být transformován konstrukcemi nukleových kyselin pro požadované polypeptidy izolované v tepelně stabilním extraktu. Výhodná provedení by mohla zahrnovat, ale nejsou omezena na, kukuřici, rajčata, tabák, mrkev, jahody, řepkové semeno a cukrovou řepu.

Výhodně je AFP odvozen z rostlin (to znamená, že bud’ je AFP získán přímo z rostliny, jako přírodního zdroje, nebo jsou AFP, mající vysoký stupeň homologie s těmito AFP, transgenicky vytvářené v jiných organismech. Může být použita jakákoliv rostlina obsahující tepelně stabilní AFP, výhodně jsou ale využity přírodně se vyskytující rostliny (nebo jejich geneticky modifikované verze), které jsou schopné růst za podmínek chladu, takže obsahují AFP. Obzvláště výhodné je 15 použiti ozimého žita, trvalých trav a podobných druhu. Další vhodné rostliny mohou, například, pocházet ze skupiny dřevitých rostlin, ozimých obilovin a podobně.

Obzvláště výhodně jsou tepelně stabilní AFP odvozeny z Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana,

Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata,

Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta a Poa annua. 25

Šťáva, bohatá na AFP, může být separována z jejího zdroje prostřednictvím jakéhokoliv vhodného postupu, například lisováním, filtrováním, homogenizací, extrakcí a podobně. Výhodně je přírodní zdroj AFP, jako je rostlinný materiál, upraven na malé kousky nebo na kaši předtím, než je shromážděna frakce, bohatá na protein, například filtrací.

• ·

• · · · · • ·

Tato macerace může být prováděna jakýmkoliv vhodným způsobem, například v mísidle. Je zcela v rozsahu schopností a znalostí osoby v oboru znalé, aby rozdělila materiál na takovou formu, že může snadno proběhnout shromáždění šťávy bohaté na protein.

Po shromáždění a ohřevu (v požadovaném pořadí) proteinové frakce může být potom výsledný vzorek, obsahující AFP, upraven jakýmkoliv vhodným postupem, aby se odebrala nerozpustná frakce a zůstala tak kapalná frakce, bohatá na AFP. Nerozpustná frakce může být odebrána, například, filtrací, srážením a podobně. Kapalina, bohatá na AFP, může potom být výhodně dále zpracovávána pro koncentraci nebo pro izolaci AFP, aby byly uvedeny do formy vhodné pro další použití. Příklady vhodných procesů jsou sušení pro získání prášku nebo pasty či těsta, další koncentrace pro získání koncentrátu AFP, chromatografie pro separaci AFP od extrakčního média a podobně. Je opět zcela v rozsahu znalostí a schopností osoby v oboru znalé, aby stanovila vhodné prostředky a podmínky pro odpovídající izolaci.

Pro některé přírodní zdroje mohou AFP, získané shora popisovanými postupy, sestávat ze směsi dvou nebo více různých AFP. Pokud je to žádoucí, mohou být tyto AFP separovány prostřednictvím jakéhokoliv běžného procesu, například chromatografii, nebo jinými procesy založenými na rozdílech fyzikálních/chemických vlastností, jako je molekulová hmotnost.

Rovněž pokud je to žádoucí, může být stanoveno složení aminokyselin a sekvence izolovaných AFP. Jakýkoliv vhodný postup pro určení těchto vlastnosti může být použit.

Příklady vhodných postup jsou popsány v příkladech v popisu • ft · • ft ·< > · · níže. Rovněž pokud je to žádoucí, může být stanovena sekvence nukleových kyseliny, která obsahuje AFP. Vektory obsahující sekvenci nukleových kyselin, schopnou kódování aminokyselin, jsou rovněž zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu.

Na základě shora uvedených informací je rovněž možné geneticky modifikovat další přírodní zdroje tak, že vytvářejí výhodné AFP, jak byly identifikovány výše. Příklady vhodných AFP jsou uvedeny níže v příkladech.

Bylo zjištěno, že AFP získané prostřednictvím shora uvedeného popisu mají zvýšenou schopnost vydržet tepelnou úpravu. Lze předpokládat, že takové AFP nebyly nikdy předtím izolovány. Jak je popsáno výše, je tato zvýšená tepelná odolnost obzvláště zajímává pro použití v potravinářských produktech, které procházejí krokem tepelné úpravy, například pasterizací.

Další aspekt předkládaného vynálezu se tedy týká AFP, které mají tepelnou stabilitu, jak bylo prokázáno s žádným podstatným snížením vlastností inhibice rekrystalizace po tepelné úpravě trvající jednu hodinu při teplotě 80°c nebo 10 minut při teplotě 100°C. Vhodný test pro zjišťování vlastností inhibice rekrystalizace ledu je popsán v příkladech v popisu níže a zahrnuje rychlé zmrazení na teplotu -40 °C následované skladováním po dobu jedné hodiny při teplotě -60°C. Výhodně AFP, které jsou podrobeny tomuto testu po tepelné úpravě, mají za následek velikost částic ledových krystalů, která je méně než o 5 pm větší než velikost krystalů ledu vzorku se stejným AFP, který nebyl tepelně upraven. Výhodně je rozdíl menší než 3 pm, zvláště výhodně menší než 1 pm.

Výhodně jsou vybrány ty AFP, které mají značně výrazné vlastnosti inhibice rekrystalizace ledu. Vhodný test pro určení rekrystalizačních vlastností je naznačen v příkladu VI v popisu níže. Výhodně zajišťují AFP podle předkládaného vynálezu velikost ledových částic následně po testu inhibice rekrystalizace ledu - jak je popsáno v příkladech - než 15 pm nebo menší, zvláště výhodně od 5 do 15 pm.

AFP jsou výhodně použity v potravinářských produktech, výhodně v potravinářských produktech, které jsou mražené nebo určené k zmrazení. Obzvláště výhodné je použití AFP v produktech, které jsou zahřátý, například při pasterizaci nebo sterilizaci, před zmrazováním. Obzvláště výhodné je použití v mražených cukrářských produktech.

¹⁵

Příklady takovýchto potravinářských produktů jsou: mražené cukrářské směsi, jako jsou směsi pro smetanovou zmrzlinu a směsi pro ovocnou zmrzlinu, které jsou určeny pro pasterizaci před zmrazováním. Takovéto směsi jsou obvykle skladovány při teplotě okolí. Vhodnými formami produktu jsou například: prášková směs, která je balena v pytli nebo v sáčcích. Uvedená směs je schopná vytvořit základ pro mražený potravinářský produkt, například po přidání vody a případně dalších ingrediencí a - případně - po provzdušnění.

Dalším příkladem vhodné směsi by mohla být kapalná směs (případně provzdušněná), která, pokud je to nezbytné, po přidání dalších komponentů a případném dalším provzdušnění může být mrazena.

Zjevnou výhodou shora zmiňovaných směsí je to, že přítomnost AFP ingredience umožňuje směsím, aby byly mrazeny • » ·

9 9

9 9 9

9 999

9 9

9 za statických podmínek, například v domácím zmrazovači nebo ve zmrazovači v obchodě, bez vytváření nepřijatelných tvarů ledových krystalů a tudíž s texturou odlišnou od produktů obvykle získávaných prostřednictvím statického zmrazování.

Velmi výhodně jsou tyto směsi baleny v uzavřených kontejnerech (například kartónech, pytlích, krabicích, plastových kontejnerech a podobně). Pro jednu dávku nebo porci bude velikost balení obecně od 10 do 1000 g. Pro více dávek mohou být vhodná balení o velikosti až 500 kg. Obecně se velikost balení bude pohybovat od 10 g do 5000g.

Jak je uvedeno výše, výhodnými produkty, ve kterých je použito AFP, jsou mražené cukrářské produkty, jako je ovocná zmrzlina nebo smetanová zmrzlina. Výhodné množství AFP je od 0,0001 do 0,5 % hmotnostního z hmotnosti finálního 15 produktu. Pokud je použito suchých směsí nebo koncentrátů, může být koncentrace vyšší, aby se zajistilo, že množství ve finálním mraženém produktu se bude pohybovat ve shora uvedených rozsazích.

Překvapivě bylo zjištěno, že směsi podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat velmi nízká množství AFP, zatímco stále zachovávají dobrou kvalitu.

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že množství AFP může být nízké až od 0,1 do 50 ppm, přičemž jsou ještě zajištěny odpovídající rekrystalizační vlastnosti a teplotní tolerance mražených cukrářských produktů. Ačkoliv si přihlašovatelé vynálezu nepřejí být vázáni jakoukoliv teorií, může být důvodem pro tuto skutečnost to, že interakce mezi pevnými látkami v mraženém cukrářském produktu a AFP zajišťuje vynikající mechanismus pro inhibici růstu krystalů. Zvláště

AA • · * · ·· · • AAAA • A · A • AAAA A • ·

A A ·

AAA

výhodně se množství AFP pohybuje od 1 do 40 ppm, obzvláště výhodně od 2 do 10 ppm.

Pro účely předkládaného vynálezu zahrnuje termín mražený cukrářský produkt mléko obsahující mražené cukrářské výrobky, jako je smetanová zmrzlina, mražený jogurt, šerbet, ledové mléko a mražený pudink, ovocné zmrzliny, granity a mražené ovocné dřeně a podobně. Pro některé aplikace je použití AFP v mražených zakysaných potravinářských produktech méně výhodné.

Výhodně je množství pevných látek v mraženém cukrářském produktu (například cukr, tuk, příchutě a podobně) větší než 4 % hmotnostní, například větší než 30 % hmotnostních, zvláště výhodně od 40 do 70 % hmotnostních.

Mražené cukrářské produkty podle předkládaného vynálezu mohou být vyrobeny prostřednictvím jakéhokoliv způsobu vhodného pro výrobu mražených cukrovinek. Obzvláště výhodně jsou ale všechny ingredience směsi plně promíchány před pasterizací a předtím, než začne proces zmrazování. Zmrazovací proces může výhodně zahrnovat ztužovací krok, například, při na teplotu -30° Fahrenheita (~34,4°C) nebo nižší.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Izolace AFP nejprve shromážděním šťávy následovaným tepelnou úpravou a izolací AFP.

Ozimé žito (Halo variety) bylo posekáno v lednu (průměrná teplota v tomto měsíci byla 3,5°C, což zajišťovalo vhodnou aklimatizaci rostlin na chlad). Tkáň byla rychle převezena do laboratoře pro další zpracování a promyta vodou pro odstranění nečistot.

400 g odřezků bylo homogenizováno při teplotě okolí v mísidlu Waring s 800 g vody, dokud nebyla listová tkáň zcela rozrušena. Prostřednictvím filtrace skrz 4 vrstvy mušelínu byla shromážděna šťáva bohatá na AFP.

Tato šťáva, bohatá na AFP, byla potom podrobena teplotní úpravě varem šťávy po dobu 10 minut. To způsobilo usazování proteinu, zatímco AFP pro použití podle předkládaného vynálezu zůstal v roztoku. Část plovoucí na povrchu byla oddělena od usazeniny prostřednictvím odstředění při 15 000 g po dobu 20 minut nebo prostřednictvím další filtrace skrz mušelín.

AFP mohly být izolovány z části plovoucí na povrchu sublimačním sušením.

Pro kontrolní účely byl získán apoplastický extrakt (extracelulární extrakt) z ozimého žita následujícím způsobem: listy z 30 denních rostlinek žita, aklimatizovaných na chlad, byly řezány na 3 cm délky a promyty destilovanou vodou pro odstranění jakéhokoliv buněčného obsahu. Kousky listů byly klepáním sušeny na papírovém ručníku a zcela ponořeny do extrakčního média z 5 mM EDTA, 10 mM kyseliny askorbové, 2 mM kyseliny kapronové, 2 mM benzamidinu a 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF). Kousky listů potom byly vakuově infiltrovány v baňce Buchner po dobu 60 minut, načež po této době byly listy vyjmuty a klepáním zcela vysušeny. Potom byly podélně uspořádány v oddělovacím válci plastové stříkačky a jemně odstředěny při 2000 X g po dobu 30 minut.

• · · • · ·

Apoplastický extrakt byl shromažďován v eppendorfově trubici pod stříkačkou.

Příklad II

Izolace AFP nejprve ohřátím přírodního zdroje, následovaným izolací šťávy, bohaté na AFP, a izolací AFP.

Smíchaná trávová tkáň (obsahující Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus a Bromus sterilis) byla posekána v lednu (průměrná teplota v tomto měsíci byla 3,5°C, což zajišťovalo vhodnou aklimatizaci rostlin na chlad). Trávová tkáň byla rychle převezena do laboratoře pro další zpracování a promyta vodou pro odstranění nečistot.

500 g trávových odřezků bylo vloženo do mikrovlně trouby o výkonu 650 Wattů a ohříváno při plném výkonu po dobu 5 minut, čímž byla teplota zvýšena na 85 až 100°C. Trávové odřezky byly potom ochlazeny na teplotu okolí.

Alternativně byly trávové odřezky smíchány s 500 g vařící vody a směs byla opět zahřáta na 100°C, načež následovalo vaření po dobu 10 minut za míchání a potom byla směs ponechána, aby vychladla na 60°C

Po tomto ohřívacím kroku byla z odřezků prostřednictvím filtrace oddělena šťáva bohatá na AFP. Hmota byla kontinuálně míchána po dobu 5 minut za přítomnosti stejného objemu vody a potom protlačována skrz 3 vrstvy mušelínu.

Část plovoucí na povrchu mohla být sublimačně sušena pro izolaci AFP. Alternativně mohla být tato část plovoucí na povrchu mražena pro skladování.

• 9 • · « · · · · · · • ··· · 9 9 · • · ······ ··· ··· • · · · · • · · · · · ·

Příklad III

Mixováním byl vytvořen zmrzliny:	premix pro výrobu smetanové
Ingredience	% hmotnostní
Sušené odstředěné mléko	11,39
Sacharóza	3,41
Maltodextrin (MD40)	4
Karubová guma	0,072
Kukuřičný sirup 63DE	20,705
Guarová guma	0,048
Genulakta L100	0,02
Máslo	9,015
Avicel RC581	0,24
želatina	0,14
monoglycerid (palmitát)	0,45
vanilín	0,01
AFP (podle příkladu I*)	0,01 nebo žádný (kontrolní)
voda	zbytek do 100 %

* Poznámka - AFP je přidán jako koncentrovaný roztok s použitím určitého množství přidané vody jako ředícího prostředku; procentní množství označuje množství AFP.

Tato směs byla vhodně pasterizována při teplotě 85°C po dobu 15 sekund a uskladněna chlazená v nádobě.

Tato směs mohla být použita při výrobě smetanové zmrzliny prostřednictvím šlehání běžným domácích mixérem na zvětšení objemu přibližně 100%, načež následovalo statické zmrazování v domácím zmrazovači. Směs podle předkládaného vynálezu měla znatelně lepší texturu než kontrolní vzorek.

Velmi dobré výsledky jsou dosaženy s použitím AFP podle příkladu II namísto AFP podle příkladu I.

Příklad IV

Mixováním byl vytvořen smetanové zmrzliny:

Ingredience sušené odstředěné mléko sacharóza maltodextrin (MD40) karubová guma mléčný tuk monoglycerid (palmitát) vanilín

AFP (podle příkladu II*) voda kapalný premix pro výrobu % hmotnostní

0,14

0,3

0,01

0,01 nebo žádný (kontrolní) zbytek do 100 % * Poznámka - AFP je přidán jako koncentrovaný roztok v určitém množství vody; procentní množství označuje množství

AFP.

• · · · <

Ingredience byly smíchány při teplotě okolí, načež následovala pasterizace po dobu 60 sekund při teplotě 89°C. Směs byla asepticky plněna do balení o obsahu 50 ml, utěsněna a skladována při teplotě okolí.

s

Tato směs mohla být použita pri výrobě smetanové zmrzliny prostřednictvím šlehání běžným domácích mixérem na zvětšení objemu přibližně 70%, načež následovalo statické zmrazování v domácím zmrazovači.

Po dvou měsíčním skladování měla směs podle ¹⁰ předkládaného vynálezu znatelně lepší texturu než kontrolní vzorek.

Příklad V byl opakován příklad IV, ale nyní byla směs smetanové zmrzliny předem provzdušněna na zvětšení objemu 70% před aseptickým plněním a utěsněním.

Výsledný produkt mohl být skladován při teplotě okolí a mohla z něj být vyrobena smetanová zmrzlina prostřednictvím vložení směsi do domácího zmrazovače a zmrazováním za statických podmínek.

Příklad VI

Vlastnosti AFP, týkající se inhibice rekrystalizace ledu, mohou být zjištěny následovně:

Vzorek produktu obsahujícího AFP byl nastaven na úroveň sacharózy 30 % hmotnostních (Pokud je počáteční • · · · · · · ······· ·· · ·· · · množství sacharózy ve vzorku větší než 30 % hmotnostních, je to provedeno zředěním, pokud je počáteční množství sacharózy ve vzorku menší než 30 % hmotnostních, je to provedeno přidáním sacharózy na požadovanou úroveň 30 % hmotnostních.)

Kapička vzorku o velikosti 3 pL je položena na krycí sklíčko o průměru 22 mm. Potom je na vršek položeno krycí sklíčko o průměru 16 mm a na tento vzorek je položeno 200 gramové závaží pro zajištění jednotné tloušťky vzorku. Hrany krycího sklíčka jsou utěsněny bezbarvým lakem na nehty.

Sklíčko je uloženo na blok mikroskopu Linkham THM 600 s řízenou teplotou. Blok je potom rychle ochlazen (50°C za minutu) na teplotu -40 °C pro vytvoření velké populace malých krystalů. Teplota bloku je potom rychle zvýšena (50°C za minutu) na -6°C a je udržována na této teplotě.

Ledová fáze je sledována při teplotě -6°C s použitím mikroskopu Leica Aristoplan. Polarizované světelné podmínky ve spojení s lambda destičkou byly použity pro zvýšení kontrastu ledových krystalů. Stav ledové fáze (velikost ledových krystalů) je zaznamenán prostřednictvím 35 mm mikrofotografie při T=0 a T=1 hodina.

Obecně tento test může být aplikován na jakoukoliv vhodnou směs zahrnující AFP a vodu. Obecně není množství AFP v těchto testovaných směsích nějak zvlášť kritické a může být například od 0,0001 do 0,5 % hmotnostního, výhodně od 0,0005 do 0,1 % hmotnostního, zvláště výhodně od 0,001 do 0,05 % hmotnostního, například 0,01 % hmotnostního.

Pro provedení tohoto testu může být použito jakékoliv vhodné směsi zahrnující AFP a vodu. Obecně ale nebude nutné získat AFP v čištěné formě. Pro praktické aplikace by obvykle

mělo postačovat připravení kapalného extraktu nebo šťávy z přírodního materiálu, přičemž tento extrakt nebo šťáva potom mohou být testovány.

Tento postup může být aplikován, například pro AFP ⁵ obsahující extrakty, které jsou získány v příkladu I nebo II s nebo bez kroku koncentrace.

Byly změřeny vlastnosti inhibice rekrystalizace několika vzorků. Vzorky byly získány ze žita, které bylo sklízeno v několika časových okamžicích v průběhu roku. Šťávy s AFP, získané po extrakci a ohřevu podle příkladu I byly testovány na jejich vlastnosti při rekrystalizaci, jak je popisováno výše. Pro srovnání bylo použito žita, které vyrostlo ve skleníku (při teplotách, které obvykle neindukují vytváření AFP).

Byly změřeny následující velikosti	ledových krystalů
Vzorek	Velikost ledového krystalu po 1 hodině (pm)
kontrolní	25
prosincový vzorek	17
lednový vzorek	10
únorový vzorek	15
březnový vzorek	18
dubnový vzorek	18
květnový vzorek	10

Tato měření ukázala, že pro dosažení dobré aktivity AFP by rostliny měly být sklízeny v průběhu zimních měsíců, například od prosince do dubna. Obzvláště výhodné jsou vzorky schopné zajištění velikostí ledových krystalů 15 pm nebo menších. V tomto případě to může být dosaženo sklizením rostlin v lednu nebo v únoru.

Stejná měření byla provedena na vzorcích s AFP z ledna, které byly tepelně upraveny (po dobu 1 hodiny na teplotě 60° C). Nebylo pozorováno žádné podstatné omezení

Γ) vlastností inhibice při rekrystalizaci.

Pro srovnání bylo použito apoplastického extraktu podle příkladu I. Ten měl za následek finální velikost ledových krystalů po 1 hodině 11,1 pm; přičemž po tepelné úpravě prováděné varem po dobu 10 minut při teplotě 100°C měl ¹⁵ test za výsledek po 1 hodině velikost ledových krystalů 16,8 pm. Tento příklad ukazuje, že apoplastický extrakt z ozimého žita není tepelně stabilní.

Příklad VII

Tepelně neupravený travní extrakt z trávy sklizené v lednu byl získán ze Silsoe (UK). Tento extrakt byl odstřeďován po dobu 1 hodiny pro odstranění zeminy a nerozpustné drtě za následujících podmínek: Odstředivka:

5

Sorvall RC3C, Rotor: H6000A, Teplota: +5°C, Rychlost rotoru: 5000 otáček za minutu (7268 g).

Vzorek extraktu byl sublimačně sušen pro určení jeho celkového obsahu pevných látek. Ten byl zjištěn na hodnotě

11,48 mg/ml. Vysušený extrakt byl potom rehydratován 30% roztokem sacharózy na jeho původní celkovou koncentraci

4

• ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · · · • · ···· ···· • · · · · ···· · ··· ··· • · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ·· pevných látek. Zředěním extraktu podle potřeby 30% roztokem sacharózy bylo vytvořeno několik roztoků.

Prostřednictvím testu podle příkladu VI byla změřena vlastnost aktivity odolnosti proti zmrazování.

Obrazy v okamžicích T = 0 a T = 1 hodina z testů inhibice rekrystalizace měly jejich střední velikosti ledových krystalů, změřené s použitím analyzátoru Zeiss TGA

10. Získané výsledky jsou znázorněny v tabulce níže:

Vzorek	Celkový obsah tuhých látek (mg/ml)	Velikost ledových krystalů	Růst ledových krystalů za 1 hodinu při -6°C (pm)
T = 0	T = 1 hodina při -6°C
neředěný	11,48	5,2	7,3	2,1
50% extrakt	5,74	5,5	7,6	2,1
25% extrakt	2,87	6,3	co	2, 6
12,5% extrakt	1,435	6, 6	13,1	6, 5
6,25% extrakt	0,7175	8,1	14,7	6, 6
3,125% extrakt	0, 359	7,4	17	9,6
1,5625% extrakt	0,179	9	20,3	11,3

Tyto výsledky ukazují změnu ve finální velikosti krystalů a změnu ve velikosti ledových krystalů po 1 hodině při teplotě -6°C pro různé roztoky travního extraktu. Může být patrné, že množství pevných látek v travním extraktu může být měněno v širokém rozsahu, zatímco jsou stále dosahovány • · · · · · dobré vlastnosti inhibice při rekrystalizaci. Výhodně jsou tyto koncentrace voleny tak, že výsledkem je velikost ledových krystalů po 1 hodině 15 mikrometrů nebo menši.

Podobný test byl proveden s travním extraktem, který byl předtím podroben tepelné úpravě (po dobu 10 minut při teplotě 100°C). Žádné podstatné zhoršení vlastností inhibice při rekrystalizaci nebylo pozorováno.

Dále byly rovněž testovány travní extrakty podle příkladu II s použitím stejného testu inhibice při rekrystalizaci. Byly získány následující výsledky:

Tepelná úprava

60°C; 1 hodina var; 10 minut

Velikost krystalů v pm T - 0 T = 1

9,6 11,1

9,8 11,3

Tyto výsledky ukazují, že dokonce po ohřevu si extrakt trávy, aklimatizované na chlad, udržel schopnost bránit růstu ledových krystalů.

Příklad VIII

Několik rostlin, obsahujících AFP, bylo sklizeno v 25 lednu. Byly získány extrakty prostřednictvím mletí čerstvé tkáně, například kořenů, stvolů, puků nebo listů, tloukem a moždířem (ochlazeným na teplotu 4°C) ve stejném objemu pufru A (10 mM EDTA, 20 mM kyseliny askorbové, pufrovaném prostředkem Tris na pH 7,4) uloženém na ledu. Homogenní směsi 30 jsou filtrovány skrz jednu nebo více vrstev mušelínu a skladovány na ledu před dalším použitím.

• ·

4 • 4

Tyto extrakty byly podrobeny testu inhibice při rekrystalizací podle příkladu VI, jak po ohřevu při teplotě 60 °C po dobu 1 hodiny tak i po varu po dobu 10 minut.

Následující rostliny obsahovaly tepelně stabilní AFP, 5 jak bylo potvrzeno udržením vlastností inhibice při rekrystalizací: Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensís a Agrostis tenuis, Festuca contracta a Poa annua.

Následující rostliny neobsahovaly tepelně stabilní

AFP: zelí, špenát, Brassica napus a Arabinopsis.

Příklad XI

Aktivita termální hystereze AFP může být testována následujícím způsobem:

ml vzorky byly vloženy do trubice Eppendorf v horké vodní lázni a ohřívány po dobu 1 hodiny při teplotě 60°C. Potom byly měřeny vlastnosti termální hystereze vzorků následovně:

Roztavený produkt je položen na mikrosklíčko (Camlab

Cambridge, délka dráhy 0,1 mm). Konce mikrosklíčka jsou utěsněny žlutou vazelínou.

Do vzorku je přiveden led s použitím aerosolového zmrazovacího spreje. Sklíčko potom bylo ponořeno v etanolem teplotně regulované lázni na teplotu -0,l°C. Po 5 minutovém • · • · « vyvážení byl vzorek zkontrolován. POkud se led zcela roztavil byla teplota lázně snižována v O,1°C krocích následovaných vyvážením. Tyto kroky byly opakovány, dokud nebylo dosaženo teploty, při které ve vzorku existovalo malé množství ledových krystalů. Po vyvážení při této teplotě byla teplota lázně snižována v krocích 0,01°C za minutu. Teplota tuhnutí vzorku je zaznamenána jako teplota, při které začíná šíření ledu od vyvážených krystalů.

Potom je stanovena teplota tání vzorku prostřednictvím zvyšování teploty počínajíc od teploty tuhnutí v krocích 0,01°C za minutu, dokud se neroztaví všechny ledové krystaly. Tato teplota je teplotou tání vzorku.

Termální hystereze vzorku je rozdíl mezi teplotou tání a teplotou tuhnutí.

Tato testovací procedura je provedena na prvním vzorku (před tepelnou úpravou) a na druhém vzorku po tepelné úpravě následované ochlazením.

Podobně může být stanovena tepelná stabilita prostřednictvím shora popisovaného testu, ve kterém je vzorek vařen ve vodě po dobu 30 sekund, načež následuje stanovení termální hystereze. Byla změřena termální hystereze několika vzorků.

Vzorky byl získány z ozimého žita, které bylo sklizeno v několika časových okamžicích v průběhu roku. Šťávy s AFP, získané po extrakci a ohřevu podle příkladu I, byly testovány na jejich termální hysterezi podle tohoto příkladu. Pro srovnání bylo použito ozimého žita, které vyrostlo ve

00

0000 000 000 0

0 0000 0000

0000 0000 0 000 000

0 0 0 0 0 0

0000000 00 0 00 00

0 skleníku (při teplotách, které obvykle neindukují vytváření AFP) .

Byly změřeny následující hodnoty termální hystereze:

Vzorek kontrolní prosincový vzorek lednový vzorek únorový vzorek březnový vzorek dubnový vzorek květnový vzorek

Termální hystereze (°C)

0,04

0, 18

0,21

0,17

0,15

0,12

0,05

Tato měření ukázala, že pro dosažení dobré aktivity AFP by rostliny měly být sklízeny v průběhu zimních měsíců, například od prosince do dubna.

Stejná měření byla provedena na vzorcích s AFP z ledna, které byly tepelně upraveny (po dobu 1 hodiny na teplotě 60°C). Nebylo pozorováno žádné podstatné omezení vlastností termální hystereze.

Příklad X

Stanovení sekvence aminokyselin AFP.

Tepelně stabilní travní extrakt podle příkladu II byl koncentrován přibližně deset krát s použitím ultrafiltrační komory Amicon s membránou, oddělující látky od molekulové ·· ·« • · · » · · · • · · · · · ·· hmotnosti 10000. Výsledný koncentrát byl uložen na sloupec aniontoměniče Mono Q (Pharmacia) HR 5/5 FPLC. Vazba na sloupec probíhala v 50 mM Tris HCl pufru s pH 8,5 a Rl-aktivní frakce byla vymývána s lineárním gradientem NaCl na finální koncentraci 0,5M ve stejném pufru Tris s pH 8,5. Byla provedena chromatografie s průtokovou rychlostí 1 ml . min'¹ a byly shromažďovány 1 ml frakce, které byly testovány na aktivitu inhibice při rekrystalizaci (jako v příkladu VII) .

θ Aktivní frakce byly slity dohromady a koncentrovány na objem 0,05 ml na odstředivém koncentrátoru Centricon PM10 (Amicon), odstřeďovány při 10000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut v rotoru Sorvall SS 34 (8 x 50 ml). Tento koncentrát byl vložen na sloupec Supredex 75 PC 3,2/30 pro filtraci na c

gelu s mikroseparačním systémem SMART (Pharmacia). Sloupec byl promyt 50mM Tris/HCl pufrem s pH 8,5 při rychlosti průtoku 0,05 ml . min'¹. Byly shromažďovány frakce o velikosti 0,05 ml, poté co byl vložen vzorek o celkovém objemu 3,5 ml. Frakce byly testovány na aktivitu inhibice při ⁰ rekrystalizaci (jako v příkladu VII) a nejaktivnější frakce byly podrobeny dělení na gelu SDS PAGE a elektroblotu před analýzou N-terminální sekvence.

Aktivní frakce Superdex 75 byly rozpuštěny v pufru pro filtraci na gelu (50 mM tris/HCl, pH 6,8, 10% glycerol, mM dithiothreitol, 2% SDS) a potom separovány na 10% polyacrylamidovém gelu podle Laemliho metody. Po elektroforéze byl gel uložen na membránu Problott (Perkin Elmer) zvlhčenou methanolem a elektroblotován při 20 voltech po dobu 16 hodin v 10 mM pufru kyseliny 3(cyklohexylamino)-1• 0 propansulfonové (CAPS) (pH 11,0), obsahujícím 10% methanol.

• · • · · · ·

Po provedení blotu byla membrána krátce promyta methanolem a potom vodou milli 0 (Millipore) a vázaná bílkovina byla vizualizována roztokem 0,1 % objemových briliantové modři coomassie.

Dva pásy bílkoviny se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 25000 a 35000 byly vizualizovány barvením modří coomassie. Protein s molekulovou hmotností 35000 vykazoval obzvláště blízkou korelaci s nej aktivnějšími Rl-frakcemi. Oba tyto pásy byly vyříznuty skalpelem a byla analyzována sekvence. Nezbarvená oblast membrány odpovídající zdánlivé molekulové hmotnosti 65000 - 75000 byla rovněž porobena analýze sekvence, protože stříbrné zbarvení gelů nejaktivnějších frakcí již předtím ukázalo pás bílkoviny na této molekulové hmotnosti.

U všech tří vyříznutých oblastí byla analyzována sekvence prostřednictvím vložení do komory pro blotový automatický analyzátor a byla určena sekvence s použitím cyklů reakce a přeměny, jak je popsáno výrobcem (Perkin-Elmer). Seznam N-terminálních sekvencí je uveden níže.

AFP s molekulovou hmotností 25000 zahrnuje sekvenci od N-zakončení, v podstatě homologní K:

ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X25 ILE-VAL-PRO-THR

AFP s molekulovou hmotností 35000 zahrnuje sekvenci od N-zakončení, v podstatě homologní k:

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALAALA-X-VAL-PRO • · • · · ···«>· ·

AFP s molekulovou hmotností 65000 až 75000 zahrnuje sekvenci od N-zakončení, v podstatě homologní k: X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

V každé sekvenci X označuje neznámou, kterou může být jakákoliv aminokyselina nacházející se v rostlinných bílkovinách. Pro účely předkládaného vynálezu termín v podstatě homologní k označuje alespoň 80 % souhlasných aminokyselin, zvláště výhodně více než 90 %, obzvláště výhodně 95 až 100 %.

Claims

1. Způsob získávání AFP, definovaných v nárocích 2 až 4, z přírodních zdrojů, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

la) izolaci AFP obsahující šťávy z přírodního zdroje a potom tepelnou úpravu této AFP obsahující šťávy na teplotu alespoň 60°C; nebo lb) tepelnou úpravu přírodního zdroje na teplotu alespoň 60°C, následovanou izolací AFP obsahující šťávy z tohoto přírodního zdroje;

II) odebrání nerozpustné frakce, přičemž krok la nebo IB probíhá před krokem II.

2. AFP, které je možno získat z rostlin, vyznačující se tím, že mají teplotní stabilitu prokázanou žádným podstatným snížením vlastností inhibice při rekrystalizací ledu, které je prokázáno tím, že velikost ledových krystalů směsi tepelně upravených AFP ve vodě po rychlém zmrazení na -40°C, následovaném skladováním při teplotě -6°C po dobu 1 hodiny, je o méně než 5 pm větší než velikost ledových krystalů stejných AFP, které nejsou tepelně upraveny, po tepelné úpravě po dobu 1 hodiny při teplotě 60°C, jedné hodiny při teplotě 80°C nebo 10 minut při teplotě 100°C.

3. AFP podle nároku 2,vyznačující se tím, že velikost ledových krystalů směsi AFP ve vodě po rychlém zmrazení na -40°C, následovaném skladováním při teplotě -6°C po dobu 1 hodiny, je 15 pm nebo menší.

·· • ·· ·· • · · · ··· · · · · • · · · · · · · · · on · · · · · ··«« · ··· ··· '-'V · · · · « · · ·*· «··· ·» · ·· >·

4 4444 44 4 >4 44

9. Způsob výroby mraženého cukrářského produktu, vyznačující se tím, že zahrnuje vytvoření výrobní směsi zahrnující 0,0001 až 0,5 % hmotnostních AFP, přičemž uvedené .AFP mají teplotní stabilitu

4 4 4 · 4 4

4 4··4 · · 4 · • 4 · < 4444 4 *44 «··

4. AFP podle nároku 2, vyznačující se tím, že zahrnují jeden nebo více proteinů majících molekulovou hmotnost 25000, 35000 a 65000 až 75000, a mají N-terminální sekvenci v podstatě homologní k:

AFP s molekulovou hmotností 25000:

ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-XILE-VAL-PRO-THR

10 AFP s molekulovou hmotností 35000:

ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALAALA-X-VAL-PRO

AFP s molekulovou hmotností 65000 až 75000:

15 X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR.

5. Vektor obsahující sekvenci nukleových kyselin, schopnou kódování alespoň jednoho z AFP definovaných v nároku 4.

6. Transformovaný organismus schopný exprese alespoň

20 jednoho z AFP definovaných v nároku 4.

7. Mražený cukrářský produkt zahrnující od 0,0001 do 0,5 % hmotnostních AFP definovaných v nároku 2.

8. Premix vhodný pro použití při výrobě mraženého cukrářského produktu definovaného nároku 7, přičemž tento premix zahrnuje AFP definované v nároku 2.

44 44 · ·4 *4 • 4 4 4 4 4 4 4 ·

5 prokázanou žádným podstatným snížením vlastností inhibice při rekrystalizaci ledu po tepelné úpravě po dobu 1 hodiny při teplotě 60°C, jedné hodiny při teplotě 80°C nebo 10 minut při teplotě 100°C, načež následuje zmrazování směsi za statických podmínek.