CN1226284A - 含有热稳定防冻蛋白的冷冻食品 - Google Patents

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Abstract

用于从天然来源中回收AFP的方法,所述方法包括以下步骤:a)将含有AFP的汁液从天然来源中分离出来;b)在温度至少为60℃下将天然来源或含有AFP的汁液热处理;c)将不溶部分除去。

Description

含有热稳定防冻蛋白的冷冻食品
本发明技术领域
本发明涉及用于分离防冻蛋白(AFP)的方法和涉及含有AFP的冷冻食品。
本发明背景
长期以来人们建议采用各种防冻蛋白(AFP)来改进食品对冷冻的忍受能力。
出于本发明的原因，术语“AFP”具有本领域所熟知的含义，即那些表现出抑制冰晶体生长的活性的蛋白质。参见美国专利第5,118,792号。
WO90/13571公开了通过化学或重组DNA技术制得的防冻肽。这些AFP可适用于食物中。其实施例3B显示，如果将水-冰混合物与0.01％(重量)的AFP一起冷冻进薄膜(film)中便改变了冰晶体的形状。
WO92/22581公开了来自植物的、可用来控制冰淇淋中冰晶体形状的AFP。该文献也描述了一种用于通过将植物叶子渗入萃取介质中而无须使植物破碎从植物的细胞外空隙中萃取多肽组分的方法。
WO94/03617公开了从酵母中制备AFP及其在冰淇淋中的应用。WO96/11586描述了通过微生物制备鱼的AFP。
有一些文献段落也提及用于低温保护的植物蛋白的分离和/或用途。低温保护蛋白在保护植物膜不受冻坏方面起了一定作用。然而这些蛋白没有抑制再结晶的性能，因此不包括在术语AFP的范围内。
Hincha在Journal of Plant Physiology(1992年，140,236-240)中描述了从甘蓝中分离出低温保护蛋白。
Volger在《Biochimica et Biiophysica Acta》(412,1975年，335-349)中描述了从菠菜中分离出低温保护叶蛋白。
Boothe在《PlantPhysiol》((1995年)，108:759-803)中描述了从蔓青中分离出蛋白。同样，人们相信这些蛋白是低温保护蛋白而不是AFP。
Neven在《Plant Molecular Biology》(21:291-305,1993)中描述了菠菜低温保护蛋白的DNA特征。
Salzman在《Am.J.Enol.Vitic.》(第44卷，第4期，1993年)的“第18届ASEV年会/东部的概括和回顾”中描述了在葡萄属的芽中存在蒸煮稳定的多肽。虽然该蛋白类同于鱼的防冻肽，但它们是低温保护蛋白而不是AFP。
Lin在《Biochemical and Biophysical Research Communication》，第183卷，第3期，1992年，第1103-1108页)中以及Lin在《PlantPhysiology》((1992年)，99:519-525)中描述了来自Arabidopsis Hakaira的15kDa低温保护多肽。
Houde在《The Plant Journal》((1995年)，8(4)，第583-593页中)提及来自小麦的低温保护蛋白。
此外-如实施例Ⅷ所示-加热后甘蓝、菠菜、蔓青和拟南芥属的浸出液没有再结晶抑制蛋白。
然而迄今AFP还未应用于市售食品中。其一个原因是获得AFP的成本高及过程复杂。另一个原因是直到现在才有人建议将其用于冷冻食品中的AFP不能结合进标准配方混合物中，因在处理过程中、尤其是在巴氏灭菌步骤过程中它们容易失稳。这种失稳相信是由于AFP的变性所引起，这是一个通常可从肽和蛋白中观察得到的众所周知的结果。
本发明的目的在于提供这些问题的解决方法。
我们惊奇地发现，通过一种新的较为简单的方法可将AFP从天然来源如冷冻驯化的植物中分离出来。该方法第一次使得可以鉴别在进行巴氏灭菌之前可方便结合进制备冷冻食品的混合物中的AFP。
因此，在第一方面本发明涉及从天然来源中回收AFP的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将含有AFP的汁液从天然来源中分离出来；
b)将天然来源或含有AFP的汁液在至少为60℃的温度下进行热处理；
c)除去不溶的部分。
上述方法的步骤c通常在步骤a和b之后进行。步骤a和b可以以任何所需的顺序进行，如步骤a在前步骤b在后(在这种情况中将加热富含AFP的汁液)或步骤b在前步骤a在后(在这种情况中将加热天然来源)或步骤a和b同时进行。
我们惊奇地发现本发明的分离方法具有许多优点。
首先，通过使用此方法可以不必再如在根据WO92/22581的方法中所要求的那样需要避免天然来源如植物的破碎。这就马上显著增加了本方法的商业应用价值(如与WO92/22581相比)，因为不再需要用于特殊加工的高的投资费用。
同时，通过使用高温似乎可以从存在于天然来源的大量肽中提取出一种新的相当活性的AFP(从天然材料中)，所述AFP包括相当活性的w.r.t.冰再结晶抑制性能的肽。
第三，使用高温出乎意料之外地不会使所有的蛋白质的变性，但只是使一些蛋白质变性，而剩下的AFP温度稳定性得到增加。这就使得在组合物中可以包括需要经受较高温度，如巴氏灭菌步骤的分离出来的AFP。这是特别令人惊奇的，因为例如来自WO92/22581的AFP在加热条件下是不稳定的(参见实施例Ⅵ)。
本发明的方法包括在步骤b中将天然来源或富含AFP的汁液加热至高于60℃的温度。优选此温度为60-110℃、最优选为80-105℃。加热步骤可在分离富含蛋白的汁液(步骤a)之后进行或在分离富含蛋白的汁液之前进行。可用任何适宜的方法来加热汁液，如常规加热或微波加热，任选添加提取介质加热、蒸汽等。
如果使用提取介质，则最好其使用的体积较小以避免AFP组分发生不必要的稀释。虽然特别优选使用水，但可以使用任何适宜的提取介质。如需要，可在水用作提取介质之前将各种添加剂加入其中。然而最优选的是使用基本上不含各种添加剂的水。
本发明方法可以应用于任何热稳定的AFP的天然来源。包括在此范围内的是植物、鱼、昆虫和微生物。天然存在的种类或通过遗传修饰获得的种类都可以使用。例如可使微生物或植物经基因修饰后表达AFP，然后根据本发明可将此AFP分离出来。因此可获得与直接从天然来源中获得的AFP至少80％、更优选大于95％、最优选100％同源的AFP。出于本发明的原因，拥有如此高同源水平的蛋白也包括在术语AFP的范围内。同时这些可以表达编码AFP的基因转化的微生物或植物也包括在本发明的范畴内。
可使用遗传操作技术来生产述于本发明中的热稳定的AFP。通过用编码所需热稳定多肽的基因构成物可使合适的宿主细胞或有机体发生转化。可将编码热稳定多肽的核苷酸顺序插入到含有为转录作用和转译作用所需元件的适宜表达载体中，并且以一种在合适的条件下(如以适当的定向及正确的读框且具有合适的目标和表达序列)可将其表达出来的方式进行。构成这些表达载体所需的各种方法对于本领域技术人员是众所周知的。
可以采用许多表达体系来表达热稳定多肽的编码序列。这些体系包括(但不限于此)细菌、酵母昆虫细胞体系、植物细胞培养体系和具有用合适表达载体转化的植物。
采用在热稳定提取液中分离出来的多肽核酸构成物可以转变很多种植物和植物细胞体系。优选的实施方案包括(但不限于此)玉米、西红柿、烟草、胡萝卜、草莓、油菜籽和制糖甜菜。
优选AFP衍生自植物(这指的是AFP直接从作为天然来源的植物中获得，或与这些AFP具有高度同源的AFP在其它有机体中经转基因得到)。可采用任何含有热稳定AFP的植物，然而优选在寒冷的条件下仍可生长(因其含有AFP)的天然存在的植物(或其基因修饰的变种)。特别优选使用冬黑麦、多年生牧草和苔草。其它适宜的植物可以是例如木质植物、冬谷类等。
特别优选热稳定AFP衍生自槭树属saccharoides(Acersaccharoides)、竹、醉鱼草属、园枝猫尾藓、树花属farinaceae(Ramalinafarinacea)、松萝属subfloridana(Usnea subfloridana)、连翘属、酢浆草属、早熟禾属Trivialis(Poa Trivialis)、毒麦属Perenne(Loium Perenne)、绒毛草、雀麦属Sterilis(Bromus Sterili)、Parodiochloa flabellata、发草属antartica(Deschampsia antartica)、苔草属aquatilis(Carex aquatilis)、Colobanthus quintensis和翦股颖属tenuis(Agrostis tenuis)、羊茅属contracta(Festuca contracta)和早熟禾。
通过任何方便的方法如压滤、过滤、均化、萃取等可将富含AFP的汁液从其来源中分离出来。在通过例如过滤收集富含蛋白部分之前，优选将AFP的天然来源如植物材料切成小块或制成淤浆。可通过任何适宜的方法如在掺合机中进行浸渍作用。将植物材料分成这种小块的形式使得更容易收集富含AFP汁液将完全是本领域技术人员力所能及的事。
在蛋白部分收集和加热(以所需的顺序进行)后，为了除去不溶部分并保留富含AFP液体部分，可通过方便的方法处理所得含有AFP的样品。不溶部分可通过如过滤、沉淀等方法除去。然后最好进一步处理富含AFP液体以浓缩或分离AFP，并将其做成适合于进一步使用的形式。适宜方法的例子是干燥以获得粉末或糊状物，进一步浓缩以获得AFP浓缩液，色谱法将AFP从提取介质中分离出来等。确定得到适当分离的所需的适宜方法和条件同样也是本领域技术人员力所能及的事。
对于一些天然来源而言，通过上述方法获得的AFP可由两种或多种不同的AFP的混合物所组成。如需要，通过任何常规方法如色谱法或其它基于物理/化学性质如分子量的不同可分离这些AFP。
同样如需要，可确定分离出来的AFP的氨基酸组成及其序列。可以采用任何适宜的确定方法。适宜方法的例子述于实施例中。同样如需要，可确定为编码AFP的核酸序列。含有能够编码氨基酸的核酸序列的载体也包括在本发明的范畴内。
基于以上资料，也可以对其它天然来源进行基因修饰使得它们生产出如上所述的有利的AFP。适宜AFP的例子见述于实施例中。
我们发现，通过上述方法获得的AFP承受热处理的能力提高了。我们相信这些AFP以前从未被分离过。如上所述，这种增强了的耐热性特别适用于必须经受一个加热步骤如巴氏灭菌的食品。
因此本发明的另一个方面涉及由在80℃热处理1小时、或在100℃热处理10分钟后，其再结晶抑制性能仍未有明显减少证明了其热稳定性的AFP。一种适用于确定冰再结晶抑制性能的实验述于实施例中，它包括快速冷冻至-40℃，然后在-6℃下贮存1小时。优选经过热处理后经受此实验的AFP得到的冰晶体颗粒比起具有相同AFP但未经热处理的样品的冰晶体颗粒来不大于5μm。优选其差值不大于3μm、最优选不大于1μm。
优选选择具有显著冰晶体再结晶抑制性能的那些AFP。一种确定再结晶抑制性能的适宜实验示于实施例Ⅵ中。优选根据本发明的AFP能提供依据冰再结晶抑制测定(如示于实施例中)的冰颗粒大小为不大于15μm、更优选为5-5μm。
可方便地将AFP用于食品中，优选用于冷冻或即将冷冻的食品中。特别优选的是AFP用于冷冻前需通过例如巴氏灭菌或消毒加热的食品中。特别优选用于冷冻糖食中。
这些食品的例子是：冷冻糖食混合物如冷冻前需进行巴氏灭菌的冰淇淋混合物和冻果子露混合物。这些混合物通常贮存于室温下。适宜的食品形式是例如：包装于例如袋中或小香包中的粉末混合物。在添加水及任选的其它成分和进行充气(任选)后，所述混合物可以形成冷冻食品的基础。
适宜混合物的另一个例子可以是液体混合物(任选进行充气)，如需要，在添加其它成分及任选的进一步充气后可将其冷冻。
上述混合物很明显的优点是AFP成分的存在使得混合物可以在静止的条件下如在商店或家用冷冻机中进行冷冻而不会形成不可接受的冰晶体形状，因此而获得与通常经静止冷冻所得到的产品不一样的结构。
可以很方便地将这些混合物包装于密闭容器中(如纸板箱、袋子、盒子、塑料容器等)。对于单份包装的大小一般为10-1000克。对于多份包装的大小可多至500千克。通常包装大小为10-5000克。
如上所述，其中使用AFP的优选食品是冷冻糖食如冰淇淋或冻果子露。基于最终食品的重量计，优选AFP的含量为0.0001-0.5％(重量)。如果使用干混合物或浓缩物，则为了确保在最终冷冻食品中其含量能在上述范围内，其浓度可高些。
我们惊奇地发现，本发明的组合物可以含很低量的AFP，但其质量仍然良好。
我们惊奇地发现AFP的含量可以低至0.1-50ppm而在冷冻的糖食中仍能提供足够的再结晶性能和温度忍受能力。虽然本申请人决不希望受缚于任何理论，但其原因可能是冷冻糖食固体与AFP之间的相互作用为抑制晶体生长提供了一个极好的机制。AFP最常见的含量为1-40ppm、特别优选为2-10ppm。
出于本发明的原因，术语“冷冻糖食”包括含有冷冻糖食如冰淇淋的牛奶、冷冻保加利亚奶酒、冷冻果汁水、果汁冰水、牛奶冻和冷冻乳蛋糕、冻果子露、粗粒冰糕(granitas)和冷冻水果泥。对于一些应用则不太优选AFP用在冷冻发酵食品中。
优选固体在冷冻糖食(如糖、脂肪、香料等)中的含量大于4％(重量)，例如优选大于30％(重量)、更优选为40-70％(重量)。
根据本发明的冷冻糖食可以通过任何适用于生产冷冻糖食的方法进行生产。然而特别优选在巴氏灭菌及冷冻过程开始前使配方中的所有成分充分混合。冷冻过程可包括如在不大于华氏-30度的温度下进行的一个硬化步骤。
实施例Ⅰ
首先通过收集汁液，然后进行热处理并分离AFP来分离AFP。
在一月份(该月份的平均温度为3.5℃，确保植物得到适当的低温驯化作用)收割冬黑麦(Halo变种)。将其组织迅速送至实验室以便进一步处理，并用水彻底清洗以除去污垢。
在室温下、于Waring掺合机中，用800克水将400克冬黑麦剪下物搅匀直至叶组织完全得到碎裂。通过4层软棉布过滤来收集富含AFP的汁液。
然后通过将汁液煮沸10分钟来使富含AFP的汁液经历温度处理。这使得蛋白质发生沉淀，而用于本发明中的AFP则保持在溶液中。通过在15,000g下离心20分钟或通过进一步经软棉布过滤使上清液从沉淀物中分离出来。
通过冷冻干燥可以使AFP从上清液中分离出来。
为了对照，可如下获得冬黑麦的质外体的浸出液(细胞外浸出液)：将经过30天冷驯化的黑麦植物叶切成3厘米长，并在蒸馏水中彻底清洗以除去任何的细胞内含物。将叶片在纸巾上拍干，然后全部浸入5mM EDTA、10mM抗坏血酸、2mM己酸、2mM苄脒和1mM苯基甲基磺酸氟(PMSF)的提取介质中。在瓷烧瓶中将其进行真空渗透60分钟，然后取出叶子并完全拍干。将其排列。纵长(lengthways)被截留于塑料注射针筒中，和缓地以2000Xg离心30分钟。将质外体的浸出液收集在注射器下面的微量离心管中。
实施例Ⅱ
首先通过加热天然来源的物质，然后分离富含AFP的汁液并分离AFP来进行AFP的分离。
在一月份(该月份的平均温度为3.5℃，确保植物得到适当的低温驯化作用)收割混合牧草组织(早熟禾属Trivialis、毒麦属Perenne、绒毛草、雀麦属Sterilis)。将牧草组织迅速送至实验室以便进一步处理，并用水彻底清洗以除去污垢。
将500克的牧草剪下物放置于650瓦微波炉中，并以全功率加热5分钟，藉此温度升高至85-100℃。然后将牧草剪下物冷却至室温。
或者将牧草剪下物与500克沸水混合，将此混合物重新加热至100℃，在搅拌下煮沸10分钟，然后冷却至60℃。
加热步骤后，通过过滤使富含AFP的汁液从剪下物中分离出来。在等体积水的存在下将其连续搅拌5分钟，然后通过3层软棉布进行压榨。
可将上清液进行冷冻干燥以除去水，然后贮存。或者可将上清液冷冻贮存。
实施例Ⅲ
通过混合以下成分得到用于制备冰淇淋的液体预混合物：
成分                 ％(重量)
脱脂奶粉             11.390
蔗糖                 3.410
麦芽糖糊精(MD40)     4.000
刺槐豆胶             0.072
玉米糖浆63DE         20.705
瓜尔豆胶             0.048
Genulacta L100       0.020
奶油                 9.015
微晶纤维素RC581      0.240
明胶                 0.140
单酸甘油酯(棕榈酸酯) 0.450
香草醛               0.010
AFP(实施例Ⅰ*)      0.100或0(对照)
水                    余量
*注：AFP作为浓缩的AFP溶液(使用一些添加的水作为稀释剂)添加，百分数指的是AFP的量。
可方便地在85℃使该混合物进行巴氏灭菌15秒，然后冷冻贮存在容器中。
通过采用常规家用混合器搅打至膨胀量约为100％，接着在家用冷冻机中进行静止冷冻，这些混合物可用于制备冰淇淋。根据本发明的组合物的结构明显好于对照样品。
通过使用实施例Ⅱ的AFP代替实施例Ⅰ的AFP可获得相当好的结果。
实施例Ⅳ
通过混合以下成分得到用于制备冰淇淋的液体预混合物：
成分                ％(重量)
脱脂奶粉            10.00
蔗糖                13.00
麦芽糖糊精(MD40)     4.00
刺槐豆胶             0.14
熔融奶油             8.00
单酸甘油酯(棕榈酸酯) 0.30
香草醛               0.01
AFP(实施例Ⅰ*)     0.01或0(对照)
水                    余量
*注：AFP作为在一些水中的浓缩AFP液添加，百分数指的是AFP的量。
以上所有成分在室温下混合，然后在89℃下进行巴氏灭菌60秒。将混合物无菌装入到500毫升的包装袋中、密封并在室温下贮存。
通过采用常规家用混合器搅打至膨胀量约为70％，接着在家用冷冻机中进行静止冷冻，以上混合物可用于制备冰淇淋。
贮存两个月后，根据本发明的组合物的结构明显好于对照样品。
通过使用实施例Ⅱ的AFP代替实施例Ⅰ的AFP可获得相当好的结果。
实施例Ⅴ
重复实施例Ⅳ，不同的是在无菌包装和密封之前将冰淇淋混合物预先充气至70％的膨胀量。
所得产品可在室温下贮存，通过将混合物放置到家用冷冻机中并在静止条件下进行冷冻可制得冰淇淋。
实施例Ⅵ
可如下测定AFP的冰再结晶抑制性能：
将含有AFP的产品的样品调节到蔗糖含量为30％(重量)(如果样品的起始含量大于30％，则通过稀释来调节，如果起始含量较低，则加入蔗糖至达到30％的含量)。
将3μL的一滴样品置于22毫米宽的条状盖玻片上。然后将直径为16毫米的盖玻片放置于其上，在样品上加上200克的重物以确保载玻片厚度均匀。盖玻片的边缘用纯的指甲清漆密封。
将载玻片放置于Linkham THM 600的温控显微镜载物台上。使载物台迅速冷却(50℃/分)到-40℃以得到大量的小晶体。然后将载物台的温度迅速升高(50℃/分)到-6℃并保持在该温度下。
使用Leica Aristoplan显微镜观察在-6℃时的冰相。使用偏振光条件及λ板来增强冰晶体的对比度。通过35毫米的照相显微镜记录冰相在T=0和T=1小时的状态。
通常该实验可以适用于任何适宜的含有AFP和水的组合物。通常AFP在这种实验组合物中的含量不是很关键的，它可以为例如0.0001-0.5％(重量)、更优选为0.0005-0.1％(重量)、最优选为0.001-0.05％(重量)，例如为0.01％(重量)。
任何含有AFP和水的适宜组合物都可以用来进行此实验。然而一般不需要得到纯化的AFP。对实际应用而言，通常制备液体浸出液或天然材料的汁液已经足够，其中可对此浸出液或汁液进行实验。
该方法可应用于例如由实施例Ⅰ或Ⅱ(有或没有浓缩步骤)获得的含AFP的浸出液。
测量了几个样品的再结晶抑制性能。这些样品是由一年中不同时间收获的黑麦所得。如上测量根据实施例Ⅰ经浸渍和加热后所得的AFP汁液的再结晶性能。作为对比，使用在温室中(在通常不诱发AFP形成的温度下)生长的黑麦。
测量到以下冰晶体的大小。
样品           1小时后的冰晶体大小(μm)
对照           25
12月样品       17
1月样品        10
2月样品        15
3月样品        18
4月样品        18
5月样品        25
这些测量结果表明，为了获得良好的AFP活性，应在冬季月份如12月-4月收割植物。特别优选的是能提供冰晶体大小小于15μm或更小的样品。在以上情况中可通过在1月或2月收割植物来达到这个目的。
对进行过热处理(在60℃下1小时)的1月AFP样品进行相同的测量。在再结晶性能方面没有观察到显著的减少。
作为对比，使用实施例Ⅰ的质外体的浸出液。1小时后得到最终的冰晶体大小为11.1μm；经热处理后(在100℃下煮沸10分钟)1小时后实验结果的冰晶体的大小为16.8μm。该实施例显示来自冬黑麦的质外体的浸出液不是热稳定性的。
实施例Ⅶ
从Silsoe(UK)处获得1月收割的牧草的未经热处理过的牧草浸出液。将浸出液离心1小时以除去污垢和不溶碎屑，离心机：SorvallRC3C，转子：H6000A，温度：+5℃，转速：5000转/分(7268g)。
将浸出液的样品冷冻干燥以确定其总固含量。经测定此值为11.48毫克/毫升。然后使干燥的浸出物用30％的蔗糖溶液再水化至其初始总固体浓度。按需要通过用30％的蔗糖溶液稀释浸出液来制备几种溶液。
采用实施例Ⅵ的测定方法来测量防冻活性。
在T=0和T=1小时处的再结晶抑制测定图具有其通过Zeiss TGA10分析器所测量的平均冰晶体大小。所得结果示于下表中。
样品     总固体(mg/ml)     冰晶体大小(μm) -6℃下1小时内冰晶体的生长(μm)
    T=0 T=1小时(-6℃下)
未经稀释     11.48     5.2     7.3     2.1
 50％浸出液     5.74     5.5     7.6     2.1
 25％浸出液     2.87     6.3     8.9     2.6
 12.5％浸出液     1.435     6.6     13.1     6.5
 6.25％浸出液     0.7175     8.1     14.7     6.6
    3.125％浸出液     0.359     7.4     17.0     9.6
    1.5625％浸出液     0.179     9.0     20.3     11.3
这些结果表明，对于牧草浸出液不同的稀释浓度，在-6℃下1小时内最终的晶体大小不同，冰晶体的大小也有变化。可以看出在牧草浸出液中的固体含量可以有很大的变化，而仍可获得良好的再结晶抑制性能。优选选择这些浓度使得1小时后冰晶体的大小不大于15微米。
用经过热处理后(在100℃下10分钟)的牧草浸出液进行类似的实验。看不到再结晶抑制性能的显著变坏。
另外再采用相同的再结晶抑制实验来测试实施例Ⅱ的牧草浸出液。得到如下结果：
热处理        晶体大小(μm)
              T=0       T=1
60℃,1小时    9.6       11.1
煮沸10分钟    9.8       11.3
这些结果表明，即使是加热后经冷驯化的牧草的浸出液仍保持其抑制冰晶体生长的能力。
实施例Ⅷ
在1月收割几种含有AFP的植物。通过在等体积保持于冰中的缓冲剂A(10mM EDTA、20mM抗坏血酸，用Tris缓冲至pH=7.4)中，用研杵和研钵(冷却至4℃)研磨新鲜组织如根部、杆茎、芽或叶得到浸出液。将组织均浆通过一层或多层软棉布过滤，在进一步使用前将其保存于冰中。
使浸出液进行实施例Ⅵ的再结晶抑制性能实验(在60℃下加热1小时和煮沸10分钟后)。
由于维持再结晶抑制性能而被证实含有热稳定AFP的有以下植物：槭树属saccharoides、竹、醉鱼草属、园枝猫尾藓、树花属farinaceae、松萝属subfloridana、连翘属、酢浆草属、早熟禾属Trivialis、毒麦属Perenne、绒毛草、雀麦属Sterilis、Parodiochloaflabellata、发草属antartica、苔草属aquatilis、Colobanthus quintensis和翦股颖属tenuis、羊茅属contracta和早熟禾。
以下植物不合热稳定AFP：甘蓝、菠菜、蔓青和拟南芥属。
实施例Ⅸ
可如下测试AFP的热滞后活性：
将1毫升样品放置在热水浴中的微量离心管，并在60℃下加热1小时。然后如下测量样品的热滞后性能：
将熔融的样品放置于显微载玻片(Camlab Cambridge，光程长度为0.1毫米)。显微载玻片的末端用矿脂密封。
使用气溶胶冷冻喷涂将冰引入到样品中。然后将载玻片浸入-0.1℃乙醇温度调节浴中。平衡5分钟后检查样品。如果冰完全熔化，则平衡后浴的温度将以0.1℃逐步降低。重复这些步骤直至温度达到少量冰晶体存在于样品中的温度为止。于此温度平衡后，浴温以0.01℃/分逐步降低。当冰开始从平衡的晶体中蔓延时记录此时样品冰点的温度。
然后通过使温度从冰点开始以0.01℃/分逐步升高直至所有冰晶体熔化来测定样品的熔融温度。此温度是样品的熔融温度。
样品的热滞后是熔融温度与凝固温度之差。
对第一样品(热处理之前)和第二样品(热处理之后)上进行这个测试程序，然后进行冷却。
类似地，通过上述测试可以测定热稳定性(其中样品在水中煮沸30秒)，然后测定热滞后性能。测定几个样品的热滞后性能。
样品是由一年中从不同时间收获的冬黑麦所得。如在实施例Ⅵ中测量根据实施例Ⅰ经浸渍和加热后所得的AFP汁液的热滞后性能。作为对比，使用在温室中(在通常不诱发AFP形成的温度下)生长的冬黑麦。
以下是所测得的热滞后性能：
样品               热滞后(℃)
对照                0.04
12月样品            0.18
1月样品             0.21
2月样品             0.17
3月样品             0.15
4月样品             0.12
5月样品             0.05
这些测量结果表明，为了获得良好的AFP活性，应在冬季月份如12月-3月收割植物。
对进行过热处理(在60℃下1小时)的1月AFP样品进行相同的测量。在热滞后性能方面没有观察到显著的减少。
实施例Ⅹ
测定AFP的氨基酸序列。
使用具有10kDa截留值膜的Amicon超滤室对实施例Ⅱ的热稳定牧草浸出液进行约10次的浓缩。将所得的浓缩液上于一个MonoQ(Pharmacia)HR 5/5 FPLC阴离子交换柱中。结合到柱上的是在50mMTris/HCl缓冲液(pH=8.5)中，用NaCl至在相同pH=8.5 Tris缓冲液中0.5M的最终浓度线性梯度洗脱RI活性部分。以1毫升/分的流速进行层析，收集1毫升部分并测定再结晶抑制活性(如实施例Ⅸ)。
将活性部分汇合在一起，并在Sorvall SS 34转子(8×50毫升)将以10,000转/分离心的centricon PM10离心浓缩器(Amicon)中离心10分钟，浓缩至0.05毫升的体积。将浓缩液上于到以SMART微分离体系(Pharmacia)运转的Superdex 75 PC 3.2/30凝胶过滤柱上。该柱以0.05毫升/分的流速用50mM Tris/HCl缓冲液(pH=8.5)洗脱。上入总体积为3.5毫升的样品后收集0.05毫升组分。用组分测定再结晶抑制活性(如实施例Ⅸ)，最具活性的组分在进行N-末端测序前先在SDS PAGE凝胶上进行分离及电印迹。
将活性的Superdex 75组分溶于凝胶上样缓冲液(50mMTris/HCl,pH=6.8,10％甘油，10mM二硫苏糖醇，2％SDS)中，然后根据Laemmli法在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。电泳后，使凝胶夹紧一张甲醇润湿的蛋白印迹膜(Perkin Elmer)，并在含有10％甲醇的10mM的3(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)缓冲液(pH=11.0)中、在20伏下、进行电印迹16小时。印迹后用甲醇、然后再用MilliQ(Millipore)水简单洗涤该膜，用考马斯亮蓝的0.1％(w/v)溶液进行结合蛋白的显色。
通过考马斯染色可显色出表观分子量为25kDa和35kDa的两条蛋白带。35kDa蛋白似乎特别与最活性的RI组分密切相关。将这两条谱带用解剖刀片切下并进行测序。对与表观分子量为65-75kDa相对应的膜的未染色部位也进行测序，因最活性组分的凝胶银染已经表明在该分子量中有一个蛋白谱带。
通过将膜的所有三个切下的部位放进印迹测序筒(cartridge)进行测序，按生产商(Perkin-E1mer)所述使用反应和转化周期确定其序列。以下给出N-末端序列表。
25kDa的AFP含有N-末端基本上与下述同源的序列：
ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR
35kDa的AFP含有N-末端基本上与下述同源的序列：
ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO
65-75kDa的AFP含有N-末端基本上与下述同源的序列：
X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR
在每个次序中X指可以在植物蛋白中发现的任何氨基酸的未知氨基酸。出于本发明的目的，术语“基本上与…同源”意指在氨基酸中至少80％、更优选大于90％、最优选95-100％重叠。

Claims (12)

1．从天然来源中回收AFP的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将含有AFP的汁液从天然来源中分离出来；
b)以至少60℃的温度将天然来源或含AFP的汁液热处理；
c)除去不溶部分。
2．根据权利要求1的方法，其中步骤a和b(顺序可换)在步骤c之前进行。
3．具有热稳定性的AFP，通过在60℃下热处理1小时、在80℃下热处理1小时或在100℃下热处理10分钟后，冰再结晶抑制性能没有显著的减少而得到证实。
4．根据权利要求3的AFP，其中在水中经热处理过的AFP的组合物在快速冷冻至-40℃、然后在-6℃下贮存1小时后的冰晶体的大小比未经热处理过的相同AFP的冰晶体的大小不大于5μm。
5．根据权利要求3或4的AFP，其中在水中的AFP的组合物在快速冷冻至-40℃、然后在-6℃下贮存1小时后的冰晶体的大小为不大于15μm。
6．根据权利要求3或4的AFP，它含有一种或多种分子量为25kDa、35kDa和65-75kDa的蛋白。
7．根据权利要求6的AFP，它具有与下述基本上同源的N-末端序列：
25kDa的AFP：
ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR
35kDa的AFP：
ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO
65-75kDa的AFP：
X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR
8．含有可以编码权利要求7的至少一种AFP的核酸序列的载体。
9．可以表达权利要求7的至少一种AFP的转化有机体。
10．含有0.0001-0.5％(重量)根据权利要求3的AFP的冷冻糖食。
11．适用于生产含有权利要求3的AFP的根据权利要求10的冷冻糖食的预混合物。
12．用于制备冷冻糖食的方法，该方法包括制备含有0.0001-0.5％(重量)AFP的配方混合物，所述AFP具有热稳定性，这通过在60℃下热处理1小时、在80℃下热处理1小时或在100℃下热处理10分钟后冰再结晶抑制性能仍没有显著的减少而得到证实，然后在静止条件下使混合物冷冻。
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