CN1439019A - 抗冻蛋白、其生产和用途 - Google Patents

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Abstract

可来自地衣Nephroma arcticum的抗冻蛋白以及其氨基酸序列的一部分与氨基酸序列L－V－I－G－S－T－A－Q(E)－N－F－G－V－V(S)－A－A－A－T具有至少80％的重叠的具有抗冻活性的蛋白，及其修饰形式。还披露了所述蛋白的制备方法，所述蛋白在食品加工中的用途，以及含有所述蛋白的食品组合物。

Description

抗冻蛋白、其生产和用途
技术领域
本发明涉及抗冻蛋白，并且涉及所述蛋白的生产方法和用途。更具体地讲，本发明涉及从以前没有被用于这种目的的生物中获得抗冻蛋白；涉及由此所得到的新型抗冻蛋白；并且涉及所述蛋白在控制冷冻过程，特别是在生产冷冻食品中的用途；以及由此所获得的食品。
背景技术
所谓的‘抗冻蛋白’(AFPs)具有改变冰晶生长的特性。这种抗冻蛋白的作用与诸如食盐的较简单的离子型抗冻剂的作用不同。例如，AFP水溶液的冰点通常低于其熔点(滞后现象)。它们能抑制再结晶。这种蛋白似乎有助于生物在接近水的冰点的温度下存活，因此，出现在若干种不同类型的生物体内。这种蛋白的特性使它具有多种潜在的用途：特别是用于在冷冻情况下食用的食品，用来抑制再结晶，并且保持光滑的质地。在仅仅是为了保存而冷冻的食品中，AFPs在冷冻、保存、运输和解冻期间能抑制再结晶，从而通过减少细胞损伤来保持食品的质地，并且还能通过减少水分流失降低养分的损失(参见Griffith，M.和VanyaEwart，K.Biotechnology Advances，13，PP375-402)。
有多种AFPs的来源是已知的：最普遍报导过的有鱼和植物。某些细菌具有抗冻特性(参见Griffith等，同上，p382)：在少数情况下，还报导过从细菌中分离抗冻蛋白(例如，参见：Xu H，Griffith M，Patten CL等，Can J Microbiol 44：(1)64-73Jan 1998)。
人们可能认为具有抗冻特性的生物具有优势，但令人吃惊的是，抗冻蛋白并非在自然界中有更广泛的分布，并且也并非更容易发现。
将新型AFPs用于冷冻食品中的一个缺陷是，要确保这种AFPs是安全的，并且可以被消费者接受。消费者有理由要求确保他们所食用的东西是安全的。消费者还可能对特定类型的材料表现出偏好或排斥：例如，对‘天然’或‘有机’材料的偏爱，以及对‘添加剂’或‘化合物’或‘遗传修饰材料-(GM)’的排斥。食品生产商忽视这些偏爱是冒险的。
因此，需要是或者被认为是‘天然的’有效AFPs。如果所述材料来自具有被人类食用的历史的来源的话，由此所产生的合理的假设是，这种材料更有可能是安全的。这样可以减少进行深入的、成本高昂的毒性测试。
以前业已报导过某些地衣含有抗冻蛋白。具体地讲，来自Alectorianigricans，Caloplaca regalis，Himantormia lugubriS，Hypogymniaphysodes，Parmelia subrudecta，Ramalina farinacea，Stereocaulonglabrum，南极石脐和亚花松萝的AFPs是已知的[WO98/04148]。另外，业已推荐将这种AFPs用于冷冻甜食[WO98/04148]。
不过，将从地衣中获得的AFPs用作食品的成分具有若干缺陷。并非是所有的地衣都具有AFP活性。而具有AFP活性的地衣很多又不经常被人类所食用。地衣通常不能够以商业化规模增殖，很多地衣只能以很少的数量从环境中获得。因此，在地衣中仔细寻找AFPs的来源并非是显而易见的。尽管如此，所进行的所述研究导致了本发明的出现。
为了寻找合适的新的AFPs，选择在挪威野生生长的四种候选地衣进行试验。这四种地衣是冰岛衣，Nephroma arcticum(NephromatoceaePeltigerales科)，Umbilicaria hyperborea(石脐科)和Platismatia glauca。这四种地衣是在挪威森林中大量生长的许多地衣中的四种：每一种地衣都很容易以100克或100克以上的量收集到。
冰岛衣是最经常被用作食品的地衣物种。它业已被称为“面包苔藓(Brodmose)”。在十八和十九世纪，挪威政府鼓励人民在家庭中使用更多的地衣。冰岛衣大多数是在作物受冻和在战争期间被使用。它在最近的第二次世界大战中已经被使用过。业已将石脐科用作食物，并且具有“山羊面包”(geitbrod)的名称。Cetraria nivalis，Cladonia sp.和Peltigeraaphtosa也已被用作食品。
Nephroma arcticum也已经被用于食品中，不过不像冰岛衣那样被经常使用；另外，传统上它还被用作治疗皮肤疾病的药物。N.arcticum是具有较大和较厚叶状体的叶状地衣。在潮湿状态下，其上表面是黄绿色或绿色的，而在干燥状态下是稻草颜色的或灰绿色的。其下表面是棕色的，并且朝向其边缘是白色的。
这种地衣主要生长在背阴的岩石上以及地面上。它是北半球/高山生长的植物，其主要分布在低的高山环境中。它是一种出现在北美洲、亚洲(包括日本)和欧洲的环极地物种。在英国，这种地衣是非常罕见的。它出现在除了挪威南部的西海岸之外的挪威全国各地，不过，在每一个地方出现的数量通常很少。就目前所知，到现在为止还没有对其丰度进行过详细研究。在挪威，它不是一种受保护的物种，而且也不可能成为受保护的物种。
由于Nephroma arcticum的叶状体大并且厚，比较容易进行清洗。因此，很容易获得干净的样品。另外，在某些地方，所述地衣覆盖着大部分地面。因此，当发现这样一个地方之后，就能很快收集到所述地衣。
发明内容
本发明提供了可来自地衣Nephroma arcticum的抗冻蛋白(AFPs)，特别是具有L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T的N-末端的氨基酸序列的抗冻蛋白。
还提供了包括与上述序列具有高度相似性的氨基酸序列的AFPs或其修饰形式。
本发明还包括编码所述蛋白的核酸序列和含有所述序列的载体。
本发明还提供了一种制备AFPs的方法，该方法包括从地衣Nephroma arcticum中提取AFP蛋白，这种蛋白在食品加工中的用途以及含有这种蛋白的食品组合物。
在本文中，术语‘抗冻蛋白’(AFP)表示这样一种蛋白，它可以是改性蛋白，它能够抑制冰晶的生长(例如，参见US5118792)。因此，‘AFP活性’是一种蛋白抑制冰晶生长的能力。例如，这种活性可以通过‘splat测定’证实(例如，参见Smallwood等，Biochem.J.340，385-391)。
‘能够来自’一种特定生物的蛋白，是由天然存在于这种生物中的基因所编码的蛋白。这种蛋白可以通过从所述生物本身中提取获得，或者通过在合适的宿主中异源表达编码这种蛋白的核酸序列而获得。
具体实施方式
本发明就是基于对存在于已知的人类食品来源中的具有高效AFP活性的一种蛋白的发现。从所述来源中提取这种蛋白得到了一种有效的AFP，这种AFP可能是安全的，因为它来自一种食品来源，并且它还可能被消费者认为是‘天然的’。
具体地讲，本发明包括可以从Nephroma arcticum中获得的具有抗冻特性的新型蛋白。这种蛋白是本发明人到目前为止所鉴定到的一种主要的抗冻蛋白，并且业已部分确定了它的序列。本发明还包括有可能产生这种地衣物种的抗冻活性的其他蛋白。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断，从Nephroma arcticum分离的主要AFP的表观分子量为大约29kDa(不过，由于技术的限制，该分子量值可能有+/-4kDa的误差范围)。业已确定该蛋白的N-末端氨基酸序列为：
L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T
正如所表明的，在8号位置(主要形式为Q，以E为少数的变体)和13号位置(主要形式为V，以S为少量变体)上，似乎存在某些序列杂合性。对肽序列数据库进行的相似性检索，没有鉴定到与该序列具有明显同源性的任何已知多肽。
本发明特别包括这种蛋白，无论它是从Nephroma arcticum中直接获得的，还是通过在遗传修饰过的生物中表达编码这种蛋白的DNA序列而获得的。
在本发明的范围内还包括来自任何来源的与上文所列举的序列具有高度的序列相似性的蛋白。对于本发明来说，具有AFP活性并且其氨基酸序列的一部分与上述序列具有至少80％重叠的所有蛋白都包括在本发明的范围内。更优选具有至少90％的重叠，最优选具有至少95％的重叠；例如，所述序列在其序列的合适的部分与上述序列的差别少于一个或二个残基。
对于本发明来说，可以按以下方式计算两个(部分)氨基酸序列的重叠程度：
(a)对这两种序列进行排比，并且统计出现在相同级别上的相同残基的数量(x)；
(b)统计每一种氨基酸的每一种变化、缺失或插入(1个点)，并且计算所述变化、缺失或插入的总数(y)；
(c)通过以下公式计算重叠的程度
x.100％/(x+y)
可以理解的是，当相似蛋白的氨基酸序列具有一个N-末端延伸部分时，由所述N-末端开始的氨基酸序列本身可能不具有至少80％的相似性。不过，所述蛋白构成了本发明的一部分，只要其氨基酸序列的至少一部分与上述序列具有至少80％的重叠就行。
本发明的范围还包括上述任何蛋白的任意的修饰形式，只要这种修饰不会明显影响所述改性蛋白的AFP活性(例如，通过splat测定判断)就行。例如，本发明包括糖基化蛋白。
本发明还包括编码本发明的新型蛋白的核酸序列。可以用本领域众所周知的方法方便地克隆并鉴定业已部分测序的主要AFP的DNA序列；在例11中披露了一种合适的方法。一旦获得了部分蛋白序列，就可以用类似方法产生编码其他AFPs的DNA序列。
在本发明的范围内，还包括含有编码本发明的AFP的DNA序列的载体。
对某些用途来说，可以在不破坏环境的前提下，从野外收集到足够的Nephroma arcticum。实际上，本发明人认为，某些地衣业已被商业化收获用作驯鹿饲料。因此，本发明提供了一种生产含有AFP的材料的方法，该方法包括从野外收集地衣Nephroma arcticum，并且从中回收具有AFP活性的提取物。
该方法在工业规模上的适用性明显取决于所述地衣的供应，并且本发明的一个重要特征是，本发明人业已检查了挪威中部的山脉，并且发现Nephroma arcticum资源丰富，因此可以以足够的数量采集用作加工食品的添加剂。本发明人业已发现了这种地衣的新的、丰富的地点，并因此认为N.arcticum在这些山脉中是非常普遍的。有趣的发现是，来自挪威植物博物馆的资料认为这种地衣是稀少的，并且给人的印象是这种地衣并不是很丰富的。这体现的是研究的缺乏，而不是这种地衣的实际分布情况。不过，所述山区的一个问题是，在这些地方，所述地衣的生长形式使得它难于被采集到。它们与土壤和苔藓非常紧密地结合在一起生长，并且每一个叶状体也比在低地上的体积要小。因此，采集的最佳方法可能是寻找位于树木线下面的资源丰富的地方。
用微生物制备粗制蛋白提取物的方法以及从所述提取物中部分或完全纯化具有特殊活性的蛋白的方法在本领域中是众所周知的。在例9中提供了一种适用于从N.arcticum分离非常纯的主要AFP制剂的方法，该方法采用了离子交换、亲和层析和凝胶过滤的组合方案。对于在食品制备中的用途来说，如此高的纯化程度是不必要的。不过，部分纯化可能是需要的，例如，通过纯化除去有可能经过长时间降解AFP的蛋白酶。
当需要将AFP用于食品中时，必须对所述提取方法进行改进，以便只使用无毒的化合物。在例6中披露了一种这样的方法，不过，也可以使用其他提取方法。因此，重要的是要指出将任何这样的AFP制剂用于冷冻食品，都必须证实该制剂确实是无毒的。存在从事这种研究的毒理学实验室，它们使用对本领域专业人员来说是众所周知的技术。
本发明还提供了一种生产具有AFP活性的材料的方法，该方法包括在能合成所述蛋白的条件下培养含有编码本发明的新型蛋白的DNA序列的生物，所述DNA序列受合适的基因调控元件的控制，并且从培养物中回收具有AFP活性的提取物。该生物可以是Nephroma arcticum的一种组成生物，其中，所述编码AFP的基因是天然存在的，或者是一种业已作过遗传学修饰的不同的生物，以便能生产AFP。
地衣由两种或两种以上共生生活的生物组成。地衣共生菌是一种真菌，而共生光合生物是藻类或兰细菌。在某些场合下，包括Nephromaarcticum，所述真菌同时与藻类和兰细菌共生生活在一起。共生光合生物通过光合作用提供能量。
可以培养诸如Nephroma arcticum的地衣的组成生物。具体地讲，可以培养单一的组成生物：可以生产真菌共生物的培养物，可以生产藻类共生物的培养物，并且可以生产细菌共生物的培养物。可以通过标准AFP测定确定能产生大部分AFP的培养物。然后，就可以将所述培养物用作AFP的商业来源。该方法所具有的优点是，一方面它不会产生环境问题，因为不会将N.arcticum从野外消除，另一方面不采用GM技术。这一点有可能是重要的，因为某些消费者不希望其食品中含有添加剂或者是通过遗传修饰技术生产的成分。在例12中披露了如何培养所述组成生物。
另一种方法是培养含有编码本发明的抗冻蛋白的DNA序列的遗传转化的生物，所述DNA序列受一种基因启动子的控制，该启动子适合导致所述DNA序列在所述转化的生物中产生抗冻蛋白。可以将编码所述抗冻蛋白的DNA序列插入合适的表达载体中，该载体含有在合适条件下转录并翻译成所需蛋白的必要因子，包括该序列的正确取向，正确的读框以及合适的导向和表达序列。制备合适的载体的方法，以及用该载体转化多种不同类型生物的方法为本领域所熟知。
原则上讲，可以用这种方法对任何生物进行修饰，以便产生所需要的蛋白，例如，可以对细菌、酵母、植物或植物、昆虫或动物细胞进行修饰。一般优选细菌、酵母和植物或植物细胞系统。另外，适用于实施本发明方法的遗传转化过的生物构成了本发明的另一方面。
用遗传转化过的生物生产AFP的优点可能包括更容易控制所述生物，和所述生物生长的更快，以及有可能获得更高的产量。提取和部分纯化或全面纯化也可能更容易进行。特别是当AFP被设计成分泌到培养基中时更是这样。分泌的另一个优点是，对于某些宿主生物来说，至少在培养基中积累的蛋白酶的含量通常比较低，这样，就可以增强AFP的稳定性。
适用于由所述培养的生物制备含有蛋白的提取物的方法为本领域所熟知；适用于从所述提取物中部分或全面纯化AFP的步骤类似于在上文所披露的从N.arcticum提取物本身中提取它所采用的步骤。
还可以提供适用于生产本发明的AFPs的合适的遗传转化的生物，这种生物因为具有较强的抗冻能力，它本身就是有用的。该方法特别适用于植物：所述植物可以是诸如小麦或玉米的禾本科植物；或者是诸如大豆、番茄或莴苣的双子叶植物。所述植物同样构成了本发明的一部分。
本发明的AFPs通常可用于若干种产品中，优选用于冷冻食品或者打算冷冻的食品中。所述食品的例子有：冷冻食品，如蔬菜、酱油、汤、小吃、乳制品和冷冻甜食。我们所说的冷冻甜食包括果汁冻、水冰、granites、冰冻果泥和含乳冷冻甜食，如冰淇淋、冷冻酸奶或乳蛋糕、果汁牛奶冻和冰乳。优选的食品是冷冻蔬菜和冷冻甜食，例如，冰淇淋、水冰。如果使用干燥混合物或浓缩物的话，其浓度可能较高，以便确其保在最终冷冻食品中的含量在理想范围内。
例如，可以通过在例7中所披露的再结晶抑制(RI)测定，确定添加到食品中的含有AFP的溶液的合适的用量。RI测定是定量测定，但是它也是费时间的，并且需要特殊设备。Jarman等(WO99/37782)早先业已披露了用于测定冰再结晶抑制的分析方法。本发明人业已发现，对于大多数用途来说，AFP的优选含量占最终产品重量的0.00005-0.3％，特别是0.0001-0.2％。
在制备食品时，没有必要添加高度纯化形式的AFP：可以作为含有AFP的组合物形式添加，例如，产生AFP的生物的提取物。不过，正如上文所讨论过的，部分纯化可能是有利的，例如，可以除去蛋白酶。
可以用本领域所公知的任何合适的方法生产本发明的冷冻甜食。优选在冷冻之前，在环境温度下或者在高于环境温度的温度下将有关配方的所有成分充分混合。冷冻甜食中的固体含量(例如，糖、脂肪、香味剂)被适当调整到占最终产品重量的至少3％，通常在10-70％的范围内，特别是40-70％。
提供下面的实施例仅仅是出于说明目的。
例1
采集地衣并运送到实验室进行研究
在本实施例中所使用的地衣样品是从亚高山环境中采集的。
用手挑选地衣，并且在运送到实验室期间将地衣装在纸袋中。在清洗之前，在实验室中，将所述纸袋放入+5℃的冷藏室中。
首先用自来水清洗所述地衣。然后用手清洗地衣，并且在潮湿状态下保存。在清洗之后，用液氮冲洗，并且转移到冰箱中(-80℃)，将它装在位于硬纸盒里面的纸袋中，直到装在苯乙烯容器中随同干冰一起运送到英国。所有地衣都是在采集之后36小时之内清洗，并且在液氮中冷冻的。
例2
测定两种食用地衣(Nephroma arcticum和冰岛衣)中的AFP活性。
地衣组织的匀浆：
用在-20℃下预冷的研钵和研棒在液氮中将在-80℃下保存的冷冻组织研磨成细粉。将所述细粉转移到一个新的研钵和研棒中，并且用等体积的缓冲液A(0.2M Tris；10mM EDTA；20mM抗坏血酸；pH7.8；30％蔗糖w/w)进一步匀浆。以14000rpm的速度将匀浆物离心(Jouanl4台式离心机)4分钟，并将上清液保持在冰上待用。
通过splat测定检测AFP活性：
通过改进的“splat测定”测定AFP活性(SmallWood等，Isolation andcharacterisation of a novel antifreeze protein from carrot(Daucus carota)，Biochem.J.340，385-391)。将要进行研究的4毫升溶液转移到一个清洁的作过适当标记的13毫米的圆形盖玻片上。将另一个盖玻片放在液滴上面，用手指将这两个盖玻片压在一起，以便形成一个夹心体。将该夹心体放入一个干冰盒子中的保持在-80℃下的庚烷溶液中。在制备了所有夹心体之后，用在干冰中预冷的镊子将这些夹心体从-80℃的庚烷溶液中转移到装有-6℃庚烷的观察室中。在将夹心体转移到-6℃时，可以观察到夹心体从透明外观向不透明外观的转变。在光学照相显微镜(尼康)上用20倍物镜观察冰晶，并且在-6℃下培养60分钟后，用摄象机和图象分析系统(LUCIA，尼康)记录图象。
对于半定量分析来说，对一系列1∶2的上清液稀释液进行分析，以便确定能够检测到较小的冰晶体积的最低的稀释比例。按照生产商的说明，利用BSA标准曲线，通过Bio-Rad蛋白测定，确定上清液中的蛋白含量。
结果：
制备Nephroma arcticum和冰岛衣的提取物，并测定AFP活性。检测的Nephroma arcticum的AFP活性呈阳性。检测的冰岛衣的AFP活性呈阴性。Nephroma arcticum表现出明显的AFP活性：Nephroma arcticum样品的一系列1∶2的稀释液表明，在总蛋白含量为0.1毫克/毫升的水平上，仍然可以检测到AFP活性。
例3
测定三种丰富地衣(Nephroma arcticum、Umbilicaria hyperborea和 Platismatia glauca)的AFP活性。
蛋白提取：
三种地衣Nephroma arcticum(Nephromatoceae Peltigerales科)、Umbilicaria hyperborea(石脐科)和Platismatia glauca是于冬天在挪威采集的，并且在-80℃下保存。
将地衣组织浸入液氮中，并马上用独立的研钵手工研磨，同时定期添加液氮。
通过在4℃下在玻璃烧杯中，在Tris/HCl‘提取缓冲液’(分别为750毫升、550毫升和550毫升)中搅拌磨碎的地衣组织(Nephromaarcticum250克，Umbilicaria hyperborea128克和Platismatia glauca100克)，制备粗制蛋白提取物。1升‘提取缓冲液’含有一瓶购自Sigma的通用蛋白酶抑制剂混合物。所述通用蛋白酶抑制剂混合物含有4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)，抑蛋白酶肽，苯丁抑制素，反式环氧琥珀酰-L-亮氨酰-酰胺(4-胍基)丁烷(E-64)，亮抑酶肽和EDTA钠盐。
在Waring商用搅切机中，将粗制蛋白提取物匀浆5分钟，并通过购自Calbiochem的米拉布过滤。用Virtis Freezemobile 25EL将三种地衣粗制提取物冷冻干燥一夜，并在-20℃下保存。
Splat测定：
将1毫升冷冻干燥的粗制提取物(Nephroma arcticum、Umbilicariahyperborea和Platismatia glauca)悬浮在装在Eppendorf试管中的500□l的超纯净水中，并且在微型离心机(MSE Micro Centaur)上，以13000rpm的速度离心5分钟。保留上清液，并将每一种提取物的50□l的样品用于检测热稳定性，在95℃下，在eppendorf试管Thermomixer5436中检测2分钟。通过在下面将要详细说明的形式的splat测定，马上测定两种粗制提取物(热处理过的或未处理过的)AFP活性(有关所使用的测定的进一步的信息披露于Byass等，Unilever WO9804148中)。
将用于splat测定的样品与等体积的60％的蔗糖混合，使蔗糖的最终浓度为0％。将待检测的所述样品的少量试样(5微升)压在2片显微镜盖玻片之间。通过将该夹心体转移到干冰/三甲基戊烷的溶液(-70℃)中进行快速冷却，然后再转移到冷却到-6℃的三甲基戊烷溶液中。按照下面所提供的评分系统，以半定量形式评估AFP活性。
Splat得分  观察到的晶体形态学
+++++      非常小，非常密集的晶体
+++       小，不密集；或者小，相当密集，具有某些中等大小的晶体
+++    小，不密集，具有中等大的晶体；或者小-中等，不密集
+      中等或大的晶体，具有某些小晶体
+    大，圆形分离的晶体(例如，30％的蔗糖对照)
结果：
    测试样品     Splat得分
    Nephroma arcticum     +++++
    Umbilicaria hyperborea     ++
    Platismatia glauca     ++
    负对照(仅含有30％蔗糖)     +
以上结果表明，在检测过的三种地衣中，Nephroma arcticum产生了大部分的AFP活性。
例4
放大用Nephroma arcticum制备含有AFP提取物。
将8.94克冷冻干燥的Nephroma arcticum提取物(按照例3中“蛋白提取”部分所披露的方法制备)重新悬浮在70毫升冰镇的纯净水中，并且在4℃下搅拌20分钟。在Sorval离心机上，用GSA转子以8000rpm的速度将粗制提取物离心20分钟。依次用Nalgene0.8□膜过滤消毒装置和0.2□膜过滤消毒装置对上清液进行过滤。将Nephroma arcticum的棕色的提取物分装到塑料试管中，并且冷冻保藏直到需要使用。
例5
从Nephroma arcticum中提取的AFP的热稳定性研究
如果将要被用作食品的食用成分的AFP是在其生产期间通过巴斯德灭菌的话，重要的是，AFP在有可能使用的温度下是稳定的。在本实施例中，研究了从Nephroma arcticum中提取的AFP的热稳定性。
用BCA蛋白测定试剂盒(由Pierce提供)分析含有AFP的提取物(按例3方法制备)的总蛋白浓度。发现该提取物的总蛋白含量大约为5.8毫克/毫升。对该提取物的少量样品进行稀释，以便它的蛋白的最终浓度为2毫克/毫升，然后将16微升稀释过的提取物放入5个eppendorf试管的每一个中。将其中的4个试管放入95℃下的eppendorfThermomixer中。对每一个试管进行不同时间的热处理：1分钟、2分钟、5分钟或10分钟。用第5个试管作对照，并且不进行热处理。在加热之后，将所述样品马上放在冰上，并且通过splat测定测定AFP活性。
2毫克/毫升Nephroma arcticum提取物的splat活性：
    材料     SPLAT得分
    Nephroma arcticum提取物，不加热     +++++
    Nephroma arcticum提取物，加热1分钟     +++++
    Nephroma arcticum提取物，加热2分钟     +++
    Nephroma arcticum提取物，加热5分钟     ++
    Nephroma arcticum提取物，加热10分钟     ++
由于从Nephroma arcticum中提取的AFP在95℃下加热时能够存活，因此它适用于在生产期间要通过巴斯德灭菌进行消毒的食品中。例如，冰淇淋“混合物”在冷却和冷冻之前，通常要在82℃的温度下保持25秒，以便进行巴斯德灭菌。结果表明，从Nephroma arcticum中提取的AFP在所述巴斯德灭菌过程中能够存活。
例6
通过适合(进行毒理学测定)在冷冻食品中采用的方法从Nephroma arcticum中制备AFP。
取样
用相同方法制备独立的制剂，并且将提取物合并到一起，以便形成最终的提取物。分别使用29克(提取物1)和35克(提取物2)组织。所使用的组织是由发明人之一(Rolv Lundheim)在1999/2000冬季，在挪威采集的N.arcticum，运送到(在干冰上)英国的实验室中，并且在-70℃下保存待用。
所使用的缓冲液
提取缓冲液包括200mM Tris-HCl(Fisher chemicals)，20mM抗坏血酸(抗坏血酸钠，Sigma)，10mM EDTA(二钠盐，Sigma)，pH7.8。
透析缓冲液是50mM Tris-HCl，3mM EDTA，pH7.5。
提取
在液氮中用研钵和研棒将N.arcticum组织研磨成细粉。将磨碎的材料放入装有180毫升冷却过的提取缓冲液的烧杯中，并且在冰上搅拌30分钟。通过薄棉布过滤所得到的提取物。用研钵和研棒以及少量的额外缓冲液(提取物1，40毫升，提取物2，80毫升)再次研磨固体材料。同样用薄棉布对二次提取物进行过滤。来自以上两个步骤的合并的过滤液就是粗制提取物(提取物1，大约140毫升，提取物2，大约200毫升)。
纯化
在摇动水浴中，在60℃下对粗制提取物进行加热。当提取物的温度达到60℃时，将其培养15分钟。然后在冰上冷却提取物，在被冷却到4℃的Sorvall RC-5B上用SS34转子以1000rpm的速度离心20分钟。由于在该处理之后，上清液并未完全澄清，以相同的速度在干净的试管中对上清液进行再次离心。
用截断分子量为6000-8000D的Spectra/Por透析管对提取物进行透析。透析缓冲液如上文所述。缓冲液体积为2升(提取物1)，或3升(提取物2)。并且在大约18小时的时间内3次更换缓冲液。透析是在4℃下进行的。
浓缩
将透析过的提取物保留在透析管中，并且放入夹层盒。用PEG(聚乙二醇17500，Fluka)覆盖样品。将样品保持在4℃下，同时其体积减少。在PEG浴中放置大约2天之后，提取物的体积为35毫升(提取物1)和30毫升(提取物2)。在浓缩之后，再次以15000rpm的速度对提取物进行离心，并且依次通过0.45和0.22微米的针筒式过滤装置进行过滤。
最终提取物的制备和鉴定
将按上述方法制备的两种提取物合并在一起，并且以5毫升的量进行分装，然后在-20℃下冷冻。该提取物就是用于RI测定和水冰测定的提取物(参见例7)。
通过splat测定测定所述提取物的AFP活性。获得了以下结果(按照例2所述方法进行评分)。结果表明，所述最终提取物可以稀释100倍，并且在splat测定中仍然具有活性。
    稀释     Splat得分
    1/2     +++++
    1/10     ++++/+++++
    1/50     ++++
    1/100     ++/+++
测定该提取物的pH为6.9。
采用生产商说明书中的标准方法微孔平板形式，通过考马斯Plus-200蛋白测定，估算所述提取物的蛋白浓度。估计所述最终提取物的总蛋白浓度为大约1毫克/毫升。
例7
确定需要向食品中添加多少AFP
再结晶抑制(RI)测定：
用蔗糖晶体将含有来自Nephroma arcticum的AFP(按例6方法制备)的溶液调整到蔗糖含量为30wt％。将一滴3微升的样品放在22毫米的盖玻片上。
然后将直径为16毫米的盖玻片放在其表面，并且在样品上放200克的砝码，以确保具有均匀的载玻片厚度。用透明的指甲油密封所述盖玻片的边缘。将所述载玻片放置在Linkam THM600温控显微镜平台上。将所述平台迅速冷却(每分钟50℃)到-40℃，以便产生大量小的结晶。然后将所述平台的温度迅速升高(每分钟50℃)到+6.0℃，并且保持在该温度下。用Leitz OrtholuxII显微镜在-6℃下观察冰相。通过偏振光调节和λ平板增强所述冰晶体的反差。在T＝0和T＝60分钟记录图象，并且用图象分析软件(AnalySIS，Soft-Imaging Software GmbH，D48153，Munster，Hammerstrasse，89德国)进行分析。按以下方法计算晶体生长。
按以下方法测定在特定时间点上的冰晶体群的平均大小：获取该群体的图象(用上述装置获取)，然后挑选该图象中包括至少200个冰晶体的区域。通过描绘每一个晶体的外形，并且用所述图象分析软件计算其最大直径，确定每一个晶体的最大直径。
每一个RI实验进行3次(因此，分析了至少600个冰晶体的图象)。表格中的数据记录的是平均冰晶体生长(即在0时间和60分钟之后平均冰晶体直径的差别)。
计算可信度极限，可信度水平为平均95％。
制备Nephroma arcticum AFP制剂的若干稀释液，以便了解该样品能够稀释到何种程度并且仍然能有效抑制冰的再结晶。在实际操作中，如果所述稀释液或制剂的样品能在3μm或更低的RI测定中能导致结晶生长，我们就认为AFP制剂或AFP制剂的稀释液能够实现对冰再结晶的有效抑制。
RI测定结果
通过分析1200个晶体的图象确定平均晶体生长。
AFP制剂的稀释比例 晶体生长(平均值，μm) 可信度极限
1∶10  1.09 +/-0.17
1∶20  2.01 +/-0.25
1∶50  3.67 +/-0.48
1∶100  4.79 +/-0.62
1∶200  6.84 +/-0.62
以上结果表明，可以将AFP制剂稀释20倍，但仍然能获得对冰再结晶的有效抑制。因此，将该制剂的1∶20的稀释液(＝5％)用于例8所示的冷冻食品原型中。
例8
将地衣AFP用于水冰中
为了制备水冰，制备两种液体预混合物：
(A)20％蔗糖+0.2刺槐豆胶，用水配制(负对照；不是本发明的)。
用水配制的20％蔗糖+0.2刺槐豆，含有从Nephroma arcticum中提取的AFP。业已用所述预混合物将AFP的浓度稀释到能提供大约2μm的RI值。在这种情况下，它是1∶20的稀释液或5％的浓度——有关RI的数据参见例7。
因此，预混合物B具有以下配方：
  成分     重量百分比
  蔗糖     20.00
  LBG     0.2
  AFP制剂(用含水缓冲液制备)     5.00
  水     74.80
通过Vickers硬度测定确定硬度
按照以下方法制备每一种配方(A，B)的水冰方块(10毫米×55毫米×95毫米)。在Gelato Chef2000(Magimix UK Ltd)冰淇淋生产机中将每一种配方冷冻到-35℃。将该混合物转移到预先冷却到-30℃，其内部尺寸为10毫米×55毫米×95毫米的硅橡胶模具中。在脱模之前，在-30℃下将该制剂冷冻1小时，并且在通过Vickers硬度测定测定其硬度之前，在-25℃下保存。
Vickers硬度测定是一种压痕测定，它包括将一个锥形体形状的尖头压入材料表面，并且记录所施加的力，作为尖头顶端位移的函数。力和位移是在压痕加载周期和非加载周期测定的。该测定披露于“Handbook ofPlastics Test materials”Ed.R.P.Brown，Pub.George Godwin Limited，TheBuilder Group，1-3 Pemberton Row，Fleet Street，London，1981。Vickers锥形体几何学是工程工业标准(BSi47，1990)。在其顶端的顶角为136度。硬度是按照以下公式确定的： H V = F max A
其中，Hv是Vickers硬度，Fmax是所施加的最大的力(参见图2)，
而A是在所述材料表面所留下的压痕的突出面积。面积A是通过假定所述压痕具有与形成它的尖头，即Vickers锥形体具有相同的几何形状而测定的，因此，所述突出的面积可以根据图3中由di所提供的压痕深度来测定。
A＝24.5di 2
来自硬度测定的结果
用每一种混合物制备3个冷冻块。对每一种冷冻混合物一共进行8次硬度读数[8个压痕分布在3个冰冻块之间，以便使来自一个冷冻块的误差能够适应所述结果中的另一个的]。硬度数据(Mpa)
冷冻混合物 硬度(8次测定的平均值) 标准误差
蔗糖+LBG   1.03   0.32
蔗糖+LBG+AFP   2.75   0.78
以上结果表明，地衣AFP能明显改变冷冻食品的质地，采用这种特定配方(通常是水冰)，并且使用这种特定浓度的AFP，产生了较硬的质地。
例9
纯化AFP用于N-末端分析
为了获得准确的N-末端序列资料，需要制备一种非常纯的样品。下面就提供用于制备这种样品的方法。有必要指出的是，通常没有必要制备这样纯的样品用作食品添加剂。
提取AFP
在液氮中用预先冷却的研棒和研钵将8.6克干净的、干燥的地衣组织研磨成细粉。以1∶1的比例将所述细粉在缓冲液A(0.2mM Tris；10mMEDTA，20mM抗坏血酸；pH7.8)中匀浆。将匀浆物放入50毫升Falcon试管中，并且在冰上超声处理15分钟，然后转移到1.5毫升Eppendorf试管中，并且在4℃下以14000rpm的速度离心4分钟。收集上清液，并且保持在冰上。再次用4毫升缓冲液A提取沉淀，并且将上清液加入早先获得的上清液中。通过在4℃下，以14000rpm的速度离心10分钟，使合并的上清液澄清，并且在HiTrap脱盐柱(Pharmacia)上按照生产商的说明将盐脱到缓冲液B(50mM Tris-HCl；pH7.5)中。
离子交换层析
对脱盐的样品进行过滤(0.2微米微过滤器)，并将1.5毫升样品以1毫升/分钟的速度加样到用相同缓冲液预平衡的6毫升Mono Q阴离子交换柱上。监测洗脱液的导电性和OD280，并且收集2毫升的级份。当OD280恢复到本底时，添加线性梯度的0-0.5M氯化钠。抗冻活性在大约0.2M氯化钠浓度下洗脱(通过splat测定判断)。
亲和层析
合并活性阴离子交换级份，并浓缩(通过在4℃下，在聚乙二醇化合物“PEG”中透析浓缩)。将浓缩样品加样到28毫升Concanavalin A(ConA)柱(Pharmacia FPLC)上，该柱业已用3倍柱体积的缓冲液C[Tris缓冲的盐溶液(TBS-20mM Tris/HCl；0.5M氯化钠；pH7.4)；1mM氯化钙，1mM氯化锰]平衡过，并通过2倍柱体积的缓冲液C洗涤。所述活性是通过大约3倍柱体积的缓冲液D(TBS，100mM甲基α-D-甘露糖吡喃糖苷)洗脱的。流速为2毫升/分钟，并且在整个过程中收集2毫升的级份。合并活性级份，并进行浓缩，并且加样到下面所披露的凝胶过滤柱上。
凝胶过滤层析
用Millipore 30kDa截断浓缩仪，将活性级份浓缩10倍，并测定流通物和保留物的抗冻活性。合并活性浓缩物，并进一步浓缩(10倍)；对22微升样品进行过滤，并且加样到Pharmacia SMART系统上的业已用缓冲液B(50mM Tris-HCl，pH7.5)预平衡过的Superdex75凝胶渗透柱上。流速为40微升/分钟，并收集50微升的级份。合并凝胶过滤步骤之后的活性级份，浓缩，并用于例10所披露的N-末端分析。
结论
在上面所提供的纯化方案中，利用凝胶电泳(用银染色的SDS-PAGE)鉴定AFP。该技术一致性地确定了与AFP活性同时纯化的29kDa的阴性染色的带(通过splat测定判断)。因此，该蛋白被认为是AFP，并且按例20所述方法对该带进行N-末端测序。
例10
测定来自Nephroma arcticum的AFP的N-末端序列。
将同样为90微升的纯化的N.arcticum AFP样品(按例9所述方法制备)加样到4个相邻的泳道中，并且通过SDS-PAGE分离，然后通过Western吸印方法吸印到PVDF膜上。所述膜业已用甲醇浸泡过，并且，所使用的吸印缓冲液是10mM CAPS，pH11，和10％甲醇。用丽春红对所述膜进行染色，并且用针标记有关的带，然后用水除去染料。将所述膜风干并且保存。测序是用Procise492蛋白测序仪(应用生物系统)按照生产商的说明进行的。下面提供了所获得的N-末端序列。本发明人认为，作为本发明主题的AFP的该序列是新的，并且是独特的。
例10中所披露的N-末端序列[SEQ ID NO：1]
1L       10F
2V       11G
3I       12V
4G       13V(S)
5S       14A
6T       15A
7A       16A
8Q(E)    17T
9N
例11
用遗传修饰过的生物生产AFP
为了在商业上更常见的宿主生物中生产Nephroma arcticum AFP，将AFP基因克隆到选择的宿主系统中，并在其中进行表达。基于细菌、酵母、植物、植物细胞、昆虫细胞、和动物细胞的GM表达系统是已知的。一般优选基于细菌、酵母和植物的表达系统。下面介绍如何克隆来自Nephroma arcticum的AFP基因。
克隆来自Nephroma arcticum的AFP基因
在例10中提供了Nephroma arcticum AFP的N-末端。一旦了解了该序列，就可以克隆AFP的完整的基因——不需要进行任何进一步的有创造性的步骤——通过使用本领域众所周知的克隆真核生物基因的标准技术。下面提供了对该方法的说明。
对于真核生物来说，可以采用若干种方法克隆其N-末端氨基酸序列已知的基因。所有真核生物基因都具有一个聚腺苷酸尾巴，并且将该信息用于克隆。通常，第一个步骤是获得业已长时间接触寒冷天气(并因此诱导了AFP的产生)的Nephroma arcticum样品。然后用专门出售的标准试剂盒，并且按照生产商的说明，从所述样品中分离聚腺苷酸化RNA。或者，可以从地衣的组成生物的AFP生产培养物中分离聚腺苷酸化RNA。在这种情况下，要对培养的细胞进行冷冲击，以便诱导细胞产生AFP。冷冲击可以通过将1烧瓶细胞放在冰上而完成。一旦分离了聚腺苷酸化RNA，就可以用逆转录酶制备互补的DNA。可以获得用于该步骤的标准试剂盒。可以将第一股cDNA链直接用于聚合酶链式反应(PCR)中，或者制备双链DNA，并用于PCR，或者制备cDNA文库。
在PCR中，将所述DNA用作该反应的模板。PCR反应需要2种引物。一种引物被设计成已知的N-末端氨基酸序列，并最有可能是简并的，因为密码子使用所固有的简并性。N-末端氨基酸序列TAQNFGVVA的引物序列的例子是：
ACI GCI CAR AAY TTY GGI GTI GTI GC[SEQ ID NO：2]
其中，I＝肌苷，R＝A或G，Y＝C或T
除了该例子之外，本领域技术人员可以设计出很多种不同的引物，这些引物可以设计成所述N-末端氨基酸序列(正如在例10中所提供的)的不同部分。另外，本领域技术人员通常倾向于在克隆实验中使用N-末端序列的多种引物。
所使用的第二种引物是dT寡核苷酸序列，它能结合在该克隆的聚腺苷酸尾巴的3’末端。采用这种引物的PCR反应能产生可以标准方法分离，并且克隆到合适载体上的带。然后对载体插入片段进行测序，并且将DNA翻译成相应的氨基酸序列，以便验证从Nephroma arcticum中获得的N-末端序列的存在。通过将所述DNA序列克隆到一种表达载体上，可以生产并检测AFP，以便证实它具有与直接从Nephroma中分离的AFP相同的特性。
另一个克隆途径是利用cDNA在合适的载体中制备文库。然后可以筛选该文库中编码Nephroma蛋白的基因。可以用若干种方法筛选所述基因。例如，可以制备上述N-末端氨基酸序列的简并引物，并且用某种方式进行标记，例如，用放射性进行标记。然后可以用该引物筛选所述文库，因为它能结合存在于该文库中的与它互补的链。然后可以按上述方法对鉴定的克隆进行测序。还可以制备一种抗从Nephroma中纯化的AFP蛋白的抗体，并用于筛选所述文库，如果业已在一种表达载体中制备了所述文库的话。同样，可以按上述方法对所述克隆进行测序。
例12
通过培养从Nephroma arcticum中获得的生物生产AFP
地衣真菌可以在实验室条件下单独生长。这就需要一种能提供正常情况下所述真菌从光合共生物中获得的养分，以及所述地衣从环境中获得的微量元素的生长培养基。所述真菌可以在液体培养基中生长或者是在含有合适生长培养基的琼脂表面生长。所述真菌还可以在消过毒的土壤上生长(Stocker-Worgotter，E.and Turk R.1991.Lichenologist.23.127-138)。
从地衣叶状体上切下子囊果(子囊真菌的有性子实体)，并且用磷酸缓冲的盐溶液洗涤，如Bubrick和Galun所披露的(1986.Lichenologist.18，47-49)。然后可以将所述子囊果固定在装有合适生长培养基的培养皿上面(Bishcoff，H.W.and Bold H.C.1963.University ofTexas Publications No.6318，Physiological studies.4，1-95)。会释放出孢子并且落在所述生长培养基上。在孢子萌发之后，可以将琼脂的小块转移到液体培养基中(Ahmadjian，U.1993.The Lichen symbiosis.JohnWiley&sons Inc.New York)。Stocker-Worgotter，E.和Turk R.1991提供了生长培养基的例子(Lichenologist.23.127-138)。
还可以利用由Stocker-Worgotter改进的(1995.Canadian Journal ofBotany74(Suppl 1)S579-S589)的由Yamamoto Y所披露的方法(1990.博士论文，京都大学)，从分解的叶状体中获得所述真菌的培养物。
可以用类似方法培养地衣的光合共生物。为了获得纯性培养物，切割小的叶状体片段，并且在解剖显微镜下通过微量移液管除去藻类细胞，并且转移到合适的生长培养基中(Ahmadjian，V.1973.In：The LichensV.Ahmadjian and M.E.Hale，eds.Academic Press，New York，pp.653-659)。所述藻类细胞可以在液体和固体(琼脂)培养基上生长。对培养方法和培养基的详细说明可以参见Ahmadjian 1993。
Nephroma arcticum包括Coccomyxa属的藻类(Peveling，E.andGalun，M.1976.New Phytol.77.713)和念珠藻属的兰细菌(Wetmore，C.M.1960.Publ.Mus.Mich.State.Univ.Biol.Serl，369)。念珠藻属的兰细菌和Coccomyxa属的藻类可以从诸如美国典型培养物保藏中心的保藏机构获得。这些生物并非来自Nephroma arcticum，不过，用这些培养物进行的研究，业已提供了适合培养所述生物的生长培养基的信息。有若干研究者业已培养了从地衣中获得的念珠藻属的兰细菌(Ahmadjian 1993)。
                             序列表<110>尤尼利弗公开有限公司(Unilever plc)
 荷兰联合利华有限公司(Unilever NV)<120>抗冻蛋白、其生产和用途<130>F3258<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>17<212>PRT<213>Nephroma arcticum<220><221>变体<222>(13)..(13)<223>残基13可以是V和S<400>1Leu Val Ile Gly Ser Thr Ala Glx Asn Phe Gly Val Val Ala Ala Ala1               5                   10                  15Thr<210>2<211>26<212>DNA<213>人工的<220><223>PCR引物<220><221>修饰碱基<222>(3)..(3)<223>i<220><221>修饰碱基<222>(6)..(6)<223>i<220><221>修饰碱基<222>(18)..(18)<223>i<220><221>修饰碱基<222>(21)..(21)<223>i<220><221>修饰碱基<222>(24)..(24)<223>i<400>2acngcncara ayttyggngt ngtngc                          26

Claims (19)

1.一种可来自地衣Nephroma arcticum的抗冻蛋白。
2.一种具有抗冻活性的蛋白，其氨基酸序列的一部分与序列L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T具有至少80％的重叠。
3.如权利要求2的抗冻蛋白，所述蛋白可来自Nephroma arcticum。
4.如权利要求1-3中任意一项的抗冻蛋白，其分子量为25-33kDa。
5.如权利要求2-4中任意一项的抗冻蛋白，所述蛋白的氨基酸序列的一部分与序列L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T具有至少90％的重叠。
6.如权利要求2-4中任意一项的抗冻蛋白，所述蛋白的氨基酸序列包括序列L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T。
7.如权利要求1-6中任意一项的抗冻蛋白，所述蛋白具有至少一种共价修饰。
8.如权利要求7的抗冻蛋白，其中，所述修饰是糖基化。
9.一种编码上述任意一项权利要求的抗冻蛋白的核酸序列。
10.一种含有权利要求9的核酸序列的载体。
11.一种用于生产上述任意一项权利要求的抗冻蛋白(AFP)的方法，该方法包括以下步骤：
(i)从野外收集Nephroma arcticum；
(ii)用步骤(i)的材料制备含有蛋白的提取物，所述提取物具有AFP活性。
12.一种用于生产上述任意一项权利要求的抗冻蛋白(AFP)的方法，该方法包括以下步骤：
(i)在能合成所述蛋白的条件下培养含有权利要求9的DNA序列的生物，所述DNA序列受合适的基因调控元件的控制，并且；
(ii)从培养物中回收具有AFP活性的提取物。
13.如权利要求12的方法，其中，所述生物是Nephroma arcticum的一种组成生物。
14.如权利要求12的方法，其中，所述生物由于遗传修饰而含有权利要求9的DNA序列。
15.如权利要求14的方法，其中，所述抗冻蛋白被引导分泌到培养基中。
16.一种遗传修饰过的生物，含有权利要求9的核酸序列。
17.用权利要求11-15中任意一项的方法制备的具有AFP活性的含有蛋白的提取物，所述提取物适合用作食品添加剂。
18.一种含有权利要求1-8中任意一项的抗冻蛋白的食品。
19.如权利要求18的食品，所述食品是冷冻甜食制品。
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