CN1290300A

CN1290300A - 冷冻食品

Info

Publication number: CN1290300A
Application number: CN98813922A
Authority: CN
Inventors: C·D·亚曼; C·M·斯德博托姆; S·特维格; D·沃拉尔
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2001-04-04
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: CA2319118A1; HUP0101252A3; US6852841B1; IL137256A0; GB9801408D0; ATE307205T1; PL342578A1; BR9814776A; HUP0101252A2; EP1049783A2; AU747087B2; AU2418899A; IL137256A; DE69831979D1; TR200002101T2; EP1049783B1; WO1999037782A3; SK10952000A3; WO1999037782A2; JP2002504316A

Abstract

抗冻蛋白及其修饰形式,所述蛋白含有至少40%的氨基酸S、T或N,并与下列氨基酸序列至少有80%的重叠:D－E－Q－P－N－T－I－S－G－S－N－N－T-V－R－S－G－K－N－V－L－A－G－N－D－N－T－V－I-S-G－D－N－N－S－V－S－G－S－N－N－T－V－V－S－G－N－D－N－T－V－T－G－S－N－H－V－V－S－G－T－N－H－I－V－T－D－N－N-N－N－S－G－N－D－N－N－V－S－G－S－F－H-T-V－S－G－G－H－N－T－V－S－G－S－N－N－T－V－S－G－N－H－V－V－S－G－S－N－K－V－V－T－D－A。

Description

冷冻食品

本发明技术领域

本发明涉及抗冻蛋白(AFPs)和含有AFPs的冷冻食品。

本发明背景

有人认为抗冻蛋白(AFPs)能改进食品的抗冻性。

对于本发明来说，术语AFP具有本领域众所周知的含义，即这些蛋白具有抑制冰晶生长的活性。例如，参见US5，118，792。

WO90／13571披露了通过化学或重组DNA技术生产的抗冻肽。所述AFPs适合用于食品中。例3B证实，如果将冰果子露混合物与0．01wt％的AFP组合冷冻成薄膜的话，会产生改进的冰晶形状。

WO92／22581披露了源于植物的AFPs，可将其用于在冰淇淋中控制冰晶性状。该文献还披露了在不破坏植物的条件下，通过用提取介质浸润叶片从植物的胞外间隙中提取多肽组合物的方法。

WO94／03617披露了用酵母生产AFPs，及其在冰淇淋中的可能的用途。WO96／11586披露了由微生物生产的鱼AFPs。

若干文献还提到了植物蛋白的分离和／或用于低温防护的用途。低温防护蛋白具有保护植物膜免受冻害的功能。不过，所述蛋白不具有再结晶抑制特性。因此，不属于术语AFPs的范围。

Hincha在植物生理学杂志，1992，140，236-240中披露了从甘蓝中分离低温防护蛋白。Volger在生物化学和生物物理学学报，412(1975)，335-349中披露了从菠菜中分离低温防护叶片蛋白。Boothe在植物生理学(1995)，108∶759-803中披露了从欧洲油菜(Brassicanapus)中分离蛋白。上述蛋白同样被认为是低温防护蛋白而不是AFPs。Neven在植物分子生物学21∶291-305，1993中披露了菠菜低温防护蛋白的DNA鉴定。Salzman在美国葡萄酒酿制和葡萄栽培杂志的ASEV／东部第18届年会的文摘和综述，44卷，No．4，1993中披露了煮沸稳定性多肽在葡萄芽中的存在。尽管所述蛋白是鱼抗冻肽的类似物，但它们是低温防护蛋白而不是AFPs。Lin在生物化学和生物物理学研究通讯，183卷，No．3，1992，1103-1108页中以及Lin在植物生理学(1992)99，519-525中披露了源于Arabidopsis Hakaira的15Kda低温防护多肽。Honde在植物杂志(1995)8(4)，583-593中提到了源于小麦的低温防护蛋白。

不过，到目前为止，AFPs尚未应用到商业销售的食品上。造成这种状况的一个原因是成本高昂和获得AFPs的工艺复杂。另一个原因是，到目前为止，被建议用于冷冻食品中的AFPs不能够掺入标准的制备混合物中，因为它们倾向于在加工期间，特别是在巴斯德灭菌步骤中去稳定。这种去稳定作用被认为是由AFPs的变性所致；这是肽和蛋白上常见的众所周知的作用。

在我们的非先期公开的专利申请：PCT／EP97／03634中披露了AFPs可以从诸如冷驯化牧草的天然材料中通过一种新的比较简单的方法分离。该方法导致了能在进行巴斯德灭菌之前方便地掺入用于制备冷冻食品的混合物中的AFPs首次鉴定。

上述从牧草中回收AFPs的方法包括以下步骤：

a)从所述牧草中分离含有AFP的汁液；

b)在至少60℃的温度下加热处理所述牧草或含有AFP的汁液；

c)除去不可溶性组分。

上述方法的步骤c)通常是在步骤a)和b)之后进行。步骤a)和b)可以任何需要的顺序进行，例如，步骤a)在步骤b)之后(在这种情况下，将对富含AFP的汁液进行加热)或者步骤b)在步骤a)之后(在这种情况下，将对所述天然材料进行加热)或者步骤a)和b)同时进行。

上述方法具有若干优点。首先，通过使用该方法不再需要避免破坏牧草，而在WO92／22581中的方法中是必要的。这直接地、显著地提高了该方法的商业应用性，例如，相对WO92／22581提高了商业应用性，因为不再需要特殊加工所用的高投入成本。另外，通过使用高温，有可能从存在于牧草中的大量肽中提取出活性很高的AFP，这种AFP具有活性很高的w．r．t．冰再结晶抑制特性。一般，与预料的情况相反，高温的使用不会使所有的蛋白类材料变性，而似乎只能让某些蛋白变性，同时，剩余的牧草AFP具有高温稳定性。这使得它可以将分离的AFPs加入需要进行高温处理，例如，巴斯德灭菌步骤的组合物中。这一点是特别惊人的，因为，例如，WO92／22581中的AFPs似乎在加热条件下不稳定。

在上述方法的步骤b)中包括将所述牧草或富含AFP的汁液加热到高于60℃的温度。所述温度优选为60-110℃，更优选为80-105℃。所述加热步骤可以在分离富含所述蛋白的汁液(步骤a)之后或在分离富含所述蛋白的汁液之前进行。可以采用任何适于加热所述汁液的方法，例如，常规加热或微波加热，还可以用添加的提取介质、蒸汽等进行加热。

如果使用提取介质的话，优选使用小的体积，以避免对AFP组分的不必要的稀释。可以使用任何合适的提取介质，不过，特别优选使用水。如果需要，可以在被用作提取介质之前将添加剂加入水中。不过，最优选的是，使用基本上不含添加剂的水。

申请人还发现，通过上述方法，可以产生源于牧草的活性很高的AFP。对于本发明来说，术语牧草包括禾本科的成员，例如，包括多年生牧草，如黑麦草(Lolium perenne)，糙毛假牛鞭草(Parapholisstrieosa)，干沼草(Nardus stricta)，Catapodium loliaceum和多花黑麦草(Lolium multiflorum)，普通早熟禾(Poa trivialis)，草地早熟禾(Poa pratensis)，和谷类作物，如冬黑麦、冬小麦和冬大麦。申请人业已测定了该AFP的氨基酸序列。

我们吃惊地发现，源于植物的活性很高的AFPs的特征是具有高含量的下列氨基酸：丝氨酸(S)，苏氨酸(T)和天冬酰胺(A)。具体地讲，申请人业已发现，本发明的优选AFPs的特征是，其蛋白中的氨基酸至少40％是选自S、T和A。AFPs优选源于牧草，特别是禾本科。

本发明AFPs的优选分子量为8-16kDa，更优选10-14kDa，其中，该分子量是根据基因序列确定的，或者通过非修饰形式，例如，非糖基化形式的质谱学测定的。

本发明的第二个方面涉及可源于牧草的AFP，所述AFP具有从N-末端开始的氨基酸序列：D-E-Q-P-N-T-I-S-G-S-N-N-T-V-R-S-G-S-K-N-V-L-A-G-N-D-N-T-V-I-S-G-D-N-N-S-V-S-G-S-N-N-T-V-V-S-G-N-D-N-T-V-T-G-S-N-H-V-V-S-G-T-N-H-I-V-T-D-N-N-N-N-V-S-G-N-D-N-N-V-S-G-S-F-H-T-V-S-G-G-H-N-T-V-S-G-S-N-N-T-V-S-G-S-N-H-V-V-S-G-S-N-K-V-V-T-D-A

本发明的范围还包括其序列与上述序列具有高度相似性的蛋白。对于本发明来说，所有RI活性蛋白的氨基酸序列与上述序列具有至少80％的重叠，并且同样包括在本发明范围内。更优选具有至少90％的重叠，最优选高于95％的重叠，例如，其氨基酸序列与上述序列相同或者仅有1个或2个氨基酸的差别。上述蛋白的同种型也包括在本发明的范围内。

上述蛋白的修饰形式也包括在本发明的范围内。因此所述修饰，如它的糖基化形式不会从本质上影响其冰再结晶抑制特性。

可以通过任何常规方法从牧草中分离富含AFP的汁液，例如，挤压、过滤、匀浆、提取等。在收集所述富含蛋白的组分，例如通过过滤收集之前优选将牧草制成小的碎片或制成浆体。所述浸解作用可以用任何合适方法完成，例如，用一个搅拌器完成。本领域技术人员很容易做到将所述材料分解成便于收集富含蛋白的汁液的形式。

在收集和加热(按照希望的顺序)所述蛋白组分之后，可以用任何常规方法处理所得到的含有AFP的样品，以便消除不可溶的组分，并保留富含AFP的液体。所述不可溶性组分可以通过诸如过滤、沉淀之类的方法除去。然后优选对所述富含AFP的液体作进一步的处理，以便浓缩或分离AFPs，使其成为适于进一步使用的形式。合适的处理的例子是干燥以便获得粉剂或糊剂，进一步浓缩以便获得AFP浓缩物，层析以便将AFPs从提取介质等中分离。本领域技术人员同样很容易确定合适分离的适当方法和条件。

申请人业已测定了编码上述AFP的核酸序列。因此，本发明的第二个方面涉及能够编码本发明AFPs的核酸序列。所述核酸优选具有以下序列：GAT GAA CAG CCG AAT ACG ATT TCT GGG AGC AAC AAT ACT GTC AGATCC GGG AGC AAA AAT GTT CTT GCT GGG AAT GAC AAC ACC GTC ATATCT GGG GAC AAC AAT AGT GTG TCT GGG AGC AAC AAC ACT GTC GTAAGT GGG AAT GAC AAT ACC GTA ACC GGC AGC AAC CAT GTC GTA TCAGGG ACA AAC CAT ATC GTT ACA GAC AAC AAC AAT AAC GTA TCC GGGAAC GAT AAT AAT GTA TCC GGG AGC TTT CAT ACC GTA TCC GGG GGGCAC AAT ACT GTG TCC GGG AGC AAC AAT ACC GTA TCT GGG AGC AACCAC GTT GTA TCT GGA AGC AAC AAA GTC GTG ACA GAC GCT TAA

能够编码上述AFPs的等位基因或其他核酸序列也包括在本发明的范围内，例如，所述核酸序列是上述序列，其中一个或几个密码子业已被其同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)所取代。

含有能够编码本发明AFP的核酸序列的载体也包括在本发明的范围内。

根据上述信息，还可能对其他天然材料进行遗传学修饰，使其能产生上文所定义的优选AFP。

申请人还发现，具有上述序列的AFPs具有改进的冰再结晶抑制特性。测定冰再结晶抑制特性的一种合适的试验方法披露在实施例中，并且包括快速冷冻到-40℃，然后在-6℃下保存1小时。优选在热处理之后进行该试验的AFPs会导致冰晶粒度小于5微米，该粒度大于具有相同的不进行热处理的AFP样品的冰晶粒度。所述差别优选小于3微米，更优选小于1微米。

优选选择具有显著的冰再结晶抑制特性的AFPs。一种用于测定再结晶抑制特性的合适的试验方法披露于实施例中。根据冰再结晶抑制试验，本发明的AFPs优选具有冰粒度-如在实施例中所述-为15微米或更小，更优选5-15微米。

本发明的AFP可方便地用于食品中，优选用于冷冻或打算冷冻的食品中。特别优选的是将AFPs用于加热食品中，例如，在冷冻之前通过巴斯德灭菌，烫漂或消毒。尤其优选用于冷冻糖果制品中。

所述食品的例子有：冷冻糖果混合物，如冰淇淋混合物和冰果子露混合物。该混合物在冷冻之前要进行巴氏灭菌。所述混合物通常储存于环境温度下。合适的制品形式的例子有：被包装在诸如袋或囊中的粉状混合物。所述混合物能够形成所述冷冻食品的基础，例如，在添加水并选择性地添加其他成分和-选择性地通气之后冷冻。

合适的混合物的另一个例子是液体混合物(选择性地通气)，如果必要，在添加其他成分和选择性地进一步通气之后可以冷冻。

上述混合物的显著优点是，AFP成分的存在使其该混合物能够在静止状态下冷冻，例如，在商店或家庭用冰箱中冷冻，而不会产生不可接受的冰晶形状，因此，具有不同于通常通过静止冷冻获得的产品的质地。

十分常见的是，将该混合物包装在密封容器中(例如，纸盒、袋、盒、塑料容器等)，对于一个部分来说，包装的大小通常为10-1000克。对于多个部分来说，包装的大小高达500公斤可能是适当的。一般，包装的大小为10克-5000克。

如上文所述，采用了AFPs的优选制品是冷冻的糖果制品，如冰淇淋或冰果子露。AFPs的含量优选为成品的0．00001-0．5wt％。如果使用干燥混合物或浓缩物的话，其浓度可以更高，以便确保成品冷冻制品中的含量在上述范围内。

对于本发明来说，术语冷冻糖果制品包括含有冷冻糖果的乳制品，如冰淇淋，冷冻酸奶、清凉饮料、果汁牛奶冻、冰牛奶和冷冻乳蛋糕、冰果子露、粗粒冰糕和冷冻果泥。对于某些用途来说，用于发酵食品的用途不太理想。

优选所述冷冻糖果中固体的含量(例如糖、脂肪、芳香剂等)高于4wt％，例如高于30wt％，更优选40-70wt％。

本发明的冷冻糖果制品可以用适用于生产冷冻糖果的任何方法生产。不过，特别优选的是，该配方的所有成分在巴氏灭菌之前以及在冷冻过程开始之前充分混合。所述冷冻过程可优选包括一个硬化步骤，例如达到-30℃或更低的温度。

例I

AFPs的分离是这样进行的：首先加热牧草，然后分离富含AFP的汁液，并分离AFP。

在一月(该月的平均温度为3．5℃，确保植物的适当的冷驯化)切割混合的牧草组织(普通早熟禾，黑麦草，绒毛草(Holcus lanatus)，不实雀麦(Bromus sterilis))。将所述牧草组织迅速转移到试验室中，作进一步的处理，并用水充分洗涤，以便清除污物。

将500克切断的牧草放入650瓦的微波炉中，并以最大功率加热5分钟，以便将温度升高到85-100℃。然后将切割过的牧草冷却到环境温度。

另外，可将切割过的牧草与500克煮沸的水混合，然后将该混合物重新加热到100℃，接着在搅拌条件下煮沸10分钟，然后冷却到60℃。

在加热步骤之后，通过过滤将富含AFP的汁液与所述切割部分分离，在有等体积水的条件下连续搅拌所述材料5分钟，然后通过3层薄棉布挤压。

可以对上清液进行冷冻干燥除去水，然后保存。或者，将所述上清液冷冻保存。例II

通过混合下列成分制备用于制备冰淇淋的液体预混合物

成分重量百分比

脱脂奶粉 10．00

蔗糖 13．00

麦芽糖糊精(MD40) 4．00

角豆胶 0．14

黄油 8．00

甘油单酯(棕榈酸酯) 0．30

香草醛 0．01

AFP(源于例I*) 0．01或没有(对照)

水平衡

*注：AFP是以溶解在某些水中的浓缩AFP溶液的形式添加，百分比表示AFP的量。

在环境温度下混合上述成分，然后在89℃下巴氏灭菌60秒。将所述混合物无菌填充到500毫升的包装中，密封，并在环境温度下保存。

可将所述混合物用于制备冰淇淋。通过用常规的家用搅拌器搅拌该混合物使其膨胀率大约70％，然后在家用冰箱中在静止状态下冷冻。

在经过两个月的储存之后，本发明的组合物所具有的质地明显好于对照样品。例III

可以按以下方法测定AFPs的冰再结晶抑制特性：

将含有AFP的制品的样品调整到蔗糖含量为30wt％(如果该样品的起始含量高于30％的话，这一过程是通过稀释进行的，如果起始含量较低的话，则添加蔗糖到30％的含量)。

将3微升的样品液滴放置在22毫米的盖玻片上。然后将直径为16毫米的盖玻片放在液滴顶部，并在样品上放置200克的重量，以确保均匀的玻片厚度。用透明的指甲油密封所述盖玻片的边缘。

将所述玻片放置在Linkham THM600温控显微镜镜台上。将所述镜台快速冷却(每分钟50℃)到-40℃，产生大量小的结晶。然后将镜台的温度快速升高(每分钟50℃)到-6℃，并保持在该温度下。

在-6℃下用Leica Aristoplan显微镜观察冰相。使用偏振光条件和λ板来增强冰晶的对比度。在T=0和T=1小时，用35毫米显微照相术记录所述冰相的状态(冰晶的大小)。

一般，该试验可应用于含有AFP和水的任何合适的组合物上。一般，所述试验组合物中的AFP的含量并不是很重要，并且可以为0．0001-0．5wt％，更优选0．0005-0．1wt％，最优选0．001-0．05wt％，例如，0．01wt％。

任何含有AFP和水的合适的组合物可用于进行该试验。不过，一般，没有必要获得纯化形式的AFP。对于实际应用来说，通常制备天然材料的液体提取物或汁液就足够了，其中，该提取物或汁液可以进行试验。

例如，该方法可应用于在例I中获得的含有AFP的提取物，采用或不采用浓缩步骤。

测定若干样品的再结晶抑制特性。测定在按照例I的提取和加热之后获得的AFP汁液的再结晶特性。

源于在一月份收获的牧草的非热处理的牧草提取物是从Silsoe(UK)获得的。按如下方法将该提取物离心1小时，以便除去土壤和不可溶的碎片，离心机：Sorvall RC3C，转子：H6000A，温度：+5℃，转子速度：5000rpm(7268g)。

对所述提取物的样品进行冷冻干燥，以便测定其总的固体含量。测得该含量为11．48mg／ml。然后用30％的蔗糖溶液将所述干燥的提取物重新水合至其原始总的固体浓度。根据需要用30％的蔗糖溶液通过稀释制备若干溶液。

用上述测定方法测定冰晶再结晶抑制活性。

来自所述再结晶抑制测定的T=0和T=1小时的照片具有用ZeissTGA10分析仪测定的平均冰晶大小。冰晶大小(长度)是通过环绕冰晶的周长划线测定的。将一批冰淇淋的每一个冰晶的最大长度输入一个spreadsheet，在这里分析相关的数据组，以便得到平均值和标准误。

所得到的结果在下面的表中示出。

以上结果表明了最终结晶大小的改变，和牧草提取物的各种稀释液在-6℃下在1小时内冰晶大小的变化。可以看出，获得的牧草提取物中的固体含量可以在很大范围内改变，而依然具有良好的再结晶抑制特性。优选选择在1小时内所产生的冰晶大小为15微米或更小的浓度。

用进行过热处理(100℃下，10分钟)的牧草提取物进行类似的

另外，用相同的再结晶抑制试验测试例I的牧草提取物。获得了以下结果：

热处理冰晶大小，微米

T=0 T=1

60℃，1小时 9．6 11．1

煮沸10分钟 9．8 11．3

以上结果表明即使在对冷驯化牧草的提取物进行加热之后，依然能保持抑制冰晶生长的能力。例IV

多年生黑麦草的种子是由Barenbrug(UK)公司提供的。将所述种子播种到装在9英寸花盆中的Levingtons 2号组合物中，并且在发芽之后(通常是在播种后4-7天发生)，让植物在温室中再生长7-10天，直到植株大约为15-20厘米高。然后将所述植物转移到冷室中，进行冷驯化。驯化是在+4℃下进行30天，给以8-16小时的光照／和黑暗。

切割冷驯化过的叶片，并且在用浓盐酸调节到所需要的pH的50mMTris、10mM EDTA中匀浆。匀浆是在Waring搅拌器中进行2次，每次30秒，缓冲液与叶片的比例(w／w)为2．5∶1。

然后将匀浆物放入煮沸的水浴中保持10分钟，并通过4层薄棉布收集。收集到的上清液在Sorvall离心机的8×50毫升转子中用15，000×g的速度进一步离心。

通过例III所述方法测定冰再结晶抑制特性。

在一台Amicon浓缩仪上用PM10膜将热稳定性提取物(10-50毫升)浓缩大约10倍。在FPLC分离系统(Pharmacia)上的快速脱盐柱上对1毫升的浓缩物样品进行脱盐。所述柱用50mM Tris／Cl，10mMEDTA，pH8．5以1毫升／分钟的速度洗脱。一旦监测到的O．D．280nm开始升高，就开始收集组分(1毫升)。合并RI活性组分，通常其体积为3毫升。

将RI活性加样到用相同的Tris，pH8．5缓冲液平衡的Mono Q(HR5×5)柱上。以单一的组分形式收集流出液，并马上用0-0．25M氯化钠的线性梯度，用25分钟时间以1毫升／分钟的速度洗脱。通常发现全部活性仅存在于流出组分的非结合洗脱液中。

用4M氢氧化钠的1微升的液滴将流出组分的pH小心地重新调整到pH9．5，并加样到业已用Tris缓冲液pH9．5重新平衡的Mono Q柱上。作为单一的组分收集流出液，然后马上用0-0．25M 氯化钠的线性梯度，用25分钟时间洗脱。流速为1毫升／分钟，并收集1毫升的组分进行RI测定。发现全部活性结合在所述柱上，并且在流出组分中没有发现活性。洗脱的活性在0．08和0．14M氯化钠之间出现一个峰。

合并来自Mono Q柱的活性峰组分，在PM10 Centricon浓缩仪上浓缩到50微升，并加样到Smart系统(Pharmacia)上的Sephadex75柱上。所述柱用50mM Tris／Cl pH9．5缓冲液平衡，流速为50微升／分钟。将样品收集延迟1．0微升，以便容许柱的间隙体积，然后收集50毫升的组分。将活性组分放在SDS PAGE上电泳。

在获自Novex的10％的Nu Page凝胶上对样品进行电泳。按照生产商说明书中披露的方法制备样品和凝胶缓冲液，并用Novex银染色试剂盒对凝胶进行染色。活性组分含有单一染色蛋白带，表现分子量为29RDa。

还可以通过SDS PAGE分离蛋白样品，然后通过电吸印到PVDF膜上，根据Matsudaira的方法，在10毫升CAPS缓冲液，pH11．0，10％甲醇中进行。将所述膜在甲醇中润湿，然后在Caps缓冲液中平衡10分钟。吸印是在20伏稳定电压下进行16小时。在吸印之后，通过用在50％甲醇，1％乙酸中配制的考马斯亮兰对所述膜进行染色1分钟显现蛋白。然后用50％的甲醇对所述膜进行脱色，直到所述蛋白带清晰可见。在Milli Q水中洗涤所述膜，风干，并在-20℃下保存。

通过下面的常规方法测定29kDa带的N-末端，得到其氨基酸序列：

在通过SDS PAGE分离之后，将被认为是能承受煮沸的RI活性的29kDa的蛋白固定在PVDF膜上，并对氨基末端进行蛋白测序，并成功地测定了头17个残基中的15个的序列。还对从草地早熟禾中分离的27kDa蛋白的N-末端进行了测序(表1)，并发现具有类似的序列，这表明它是相同蛋白家族的一部分。这意味着，在禾本科中存在单一类型的AFPs决定耐煮性RI活性。表1

源于黑麦草的29kDa耐煮RI活性蛋白和源于草地早熟禾的27kDa蛋白的N-末端序列的比较黑麦草-D E Q P N T I S G X N N T V R X G草地早熟禾-A E T P N T I S G T N N例V

首先用苯酚和氯仿的1∶1的混合物提取，然后用氯仿提取。苯酚会使得所述蛋白变性，暴露出疏水性氨基酸残基，使得该蛋白优先分配到有机相中。而亲水性更强的核酸和糖类分配到水相中。具有显著的糖基化程度的蛋白还会分配到界面中。当使用两种不同的有机溶剂时，氯仿是作为更有效的蛋白分配剂，而最终的氯仿提取会清除所有残留量的苯酚。

用具有10kDa截断膜的Amicon超滤室将用黑麦草植物叶片制备的热稳定性提取物浓缩大约10倍。将所得到的浓缩物(0．05毫升)加样到Superdex 75 PC 3．2／30凝胶过滤柱上，在Smart微分离系统(Pharmacia)上运行。用50mM Tris／Cl缓冲液pH9．5以0．05毫升／分钟的速度洗脱该柱，并收集0．05毫升的组分。分析所述组分的冰再结晶抑制活性，并将活性最高的组分合并在一起。将合并后的组分加样到用50mM Tris／Cl缓冲液pH9．5平衡的Mono Q PC 1．6／5柱上，同样在Smart系统上以0．1毫升／分钟的流速洗脱。在加样并洗涤之后，用0-0．4M氯化钠的线性梯度洗脱，并收集0．1毫升的组分。对所述组分进行分析，所述活性是以一个单一峰在大约0．1M氯化钠浓度下洗脱。

在等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(1∶1[24∶1])中涡旋搅拌所述活性组分1分钟。然后以13，000×g的速度离心30分钟。分别收集水相(上部)和有机相(下部)，没有观察到界面。然后通过添加10倍体积的冷冻丙酮并在-20℃下保持16小时使以上两种相沉淀。将所得到的沉淀物重新悬浮在50mM Tris／Cl缓冲液中，测定RI活性，并在SDS PAGE上电泳。

对重新悬浮的组分进行的测定表明，RI活性完全分配到水相中。有机相中没有RI活性，即使在所述组分进行过变性／在6M盐酸胍中复性之后也是如此。这是一种意外的结果，因为蛋白通常一直被认为会分配到有机相中，或者糖蛋白分配到界面中。不过，通过SDS PAGE进行的分析表明，尽管蛋白的主要部分存在于有机相中，但有一个表观分子量为29kDa的蛋白带存在于活性含水组分中，而在有机相中缺乏该带。该带的染色不同于其他蛋白的染色，并且是高度扩散的。

用由冷驯化的阔叶多年生草地早熟禾(草地早熟禾巴塞罗那变种)的叶片制备的耐煮提取物进行类似的苯酚：氯仿提取，同样证实了RI活性优选分配到水相中，并且在SDS PAGE上有一种表观分子量为27kDa的蛋白。

对所述蛋白进行的N-末端蛋白测序证实，它与例IV中所述的AFPs相同。例VI

设计一种简并寡核苷酸引物(Lol1)，并从所述蛋白的N-末端序列(ASP-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE)合成，为GAYGARCARCCIAAYACIAT，其中，Y=C+T，R=A+G，而I=肌苷。

用超级转录逆转录酶(Stratgene)和寡核苷酸引物OG1(GAGAGAGGATCCTCGAG(T)15)按照生产商的说明由5微克的30日龄冷驯化黑草叶片RNA制备第一股cDNA。用1％的第一股cDNA为模板，与Lol1和OG1引物进行PCR反应。该反应是在热循环仪中，用Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)进行30轮次(94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下1分钟)，然后在94℃下进行2分钟的首次变性步骤。

扩增大约600bp的PCR产物，然后用1％的琼脂糖凝胶纯化，并按照生产商的说明克隆到pTAg载体(R&D系统)。在Perkin Elmer(应用生物系统)自动DNA测序仪上用T3和T7引物测定克隆PCR产物的序列。它含有一个大体上类似于下列序列的开放读框GAT GAA CAG CCG AAT ACG ATT TCT GGG AGC AAC AAT ACT GTC AGATCC GGG AGC AAA AAT GTT CTT GCT GGG AAT GAC AAC ACC GTC ATATCT GGG GAC AAC AAT AGT GTG TCT GGG AGC AAC AAC ACT GTC GTAAGT GGG AAT GAC AAT ACC GTA ACC GGC AGC AAC CAT GTC GTA TCAGGG ACA AAC CAT ATC GTT ACA GAC AAC AAC AAT AAC GTA TCC GGGAAC GAT AAT AAT GTA TCC GGG AGC TTT CAT ACC GTA TCC GGG GGGCAC AAT ACT GTG TCC GGG AGC AAC AAT ACC GTA TCT GGG AGC AACCAC GTT GTA TCT GGA AGC AAC AAA GTC GTG ACA GAC GCT TAA并且其推测的氨基酸序列大体上类似于下列序列：D-E-Q-P-N-T-I-S-G-S-N-N-T-V-R-S-G-S-K-N-V-L-A-G-N-D-N-T-V-I-S-G-D-N-N-S-V-S-G-S-N-N-T-V-V-S-G-N-D-N-T-V-T-G-S-N-H-V-V-S-G-T-N-H-I-V-T-D-N-N-N-N-V-S-G-N-D-N-N-V-S-G-S-F-H-T-V-S-G-G-H-N-T-V-S-G-S-N-N-T-V-S-G-S-N-H-V-V-S-G-S-N-K-V-V-T-D-A

所述开放读框编码一种分子量大约为12kDa的蛋白，该蛋白明显小于在SDS PAGE上的29kDa的表观分子量。同样观察到该编码序列含有6个识别糖基化位点(ASN-X-SER／THR)和大量的SER和THR残基，这些残基也可能被糖基化。上述证据表明，从黑麦草中分离的天然蛋白是高度糖基化的。不过，被酶促去糖基化的蛋白依然具有冰再结晶抑制活性表明，糖基化作用对于所述蛋白的活性来说不是必需的。例VII

为了证明在例VI中所披露的黑麦草cDNA编码一种AFP，进行所述编码区的表达。制备一种含有所述黑麦草AFP cDNA的巴斯德毕赤酵母菌株(甲基营养酵母)。

将所述黑麦草cDNA克隆到具有α因子信号序列的pPIC9载体上，以确保从细胞中分泌和糖基化。所有的酶均购自BoehringerMannheim，并按照生产商的说明使用。表达载体的构建，毕赤酵母的转化和生长均披露于Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒(B版)手册中。

将所述黑麦草cDNA作为PCR扩增片段克隆到pPIC9载体上，该片段具有相容性限制性末端，以便连接到pPIC9载体上。所述限制性末端是用黑麦草cDNA作模板并使用引物GTATCTCTCGAGAAAAGAGATGAGCAGCCGAACACGATT 和TTAATTCGCGGCCGCCTGTAGGAAAAGTATGGTATATC产生的，所述引物能在扩增片段的5’末端引入Xho1限制位点，并在3’末端引入Not1限制位点，并确保所述黑麦草cDNA处在所述分泌信号开放读框的框内。所述反应在热循环仪上用Taq DNA聚合酶和Pfu校正酶(Boehringer Mannheim)进行30轮次(94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下1分钟)。所有后续的PCR反应是在相同条件下进行的，但没有Pfu酶。然后将Xho1／Not1 cDNA片段克隆到Xho1／Not1消化过的pPIC9载体上，并转入感受态大肠杆菌细胞(菌株XL1-blue)中。在转化之后，将其铺平板到含有50微克／毫升氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下生长16小时。然后挑选20个氨苄青霉素抗性转化体，并通过用5’AOX1和3’AOX1引物进行的PCR，分析所述黑麦草cDNA的整合，所述引物是按照Invitrogen试剂盒手册中的说明合成的。

通过小量制备从四种阳性转化体中分离质粒DNA，并通过用Sal1消化将其线性化，以便转入毕赤酵母细胞中，所述细胞业已按照Invitrogen手册中所述方法生长并洗涤。用推荐的BioRad GenePulser将所述线性化DNA消化物电穿孔到毕赤酵母细胞中，并在添加冰镇1M山梨醇之后分布到MD平板上，并在30℃下生长24小时，直到菌落可见。然后挑取16个转化体接种到新的MM和MD平板上，选择在MD平板上生长正常，而在MM平板上生长较缓慢的转化体。然后用5’和3’AOX1引物通过PCR分析所述转化体，并试验8个阳性转化体的表达。

首先将所述菌落接种到BMGY培养基上，并在30℃下生长24小时，然后离心使所述细胞沉淀，并转移到BMMY培养基上，以便诱导表达，并回温到30℃，再培养24小时。在24和48小时再添加2次甲醇使其浓度为0．5％，以便维持诱导。然后通过离心除去所述细胞，并将培养基的样品调整到30％的蔗糖浓度，并测定冰再结晶抑制活性。所有转化体的培养基都含有显著的RI活性，而用相同方法由不含整合的黑麦草cDNA的对照毕赤酵母产生的培养基没有活性。

上述实施例表明，从黑麦草中分离的蛋白以及相应的cDNA相当于RI活性AFP。例VIII

将大肠杆菌将XL-1 blue用于所有的克隆步骤；培养物生长在2YT培养基上，根据需要通过氨苄青霉素或卡那霉素选择。所有寡核苷酸引物是在Perkin Elmer381A DNA合成仪上合成的，使用生产商所推荐的亚磷酰胺方法。通过将2毫升Nicotiana bethiama的细胞悬浮液铺平板到含有25毫升MS盐，B5维生素(1毫克／升烟酸，1毫克／升吡哆醇，10毫克／升硫胺素，100毫克／升肌醇)+1毫克／升2-4 D，0．2毫克／升 BAP和0．8％琼脂的培养皿上。转动所述细胞使其覆盖琼脂，然后用一个无菌滤纸片覆盖。

选择培养基=MS基本培养基+3％蔗糖，0．2毫升／升IAA，1毫克／升BAP，0．9％琼脂+500毫克／升头孢氨噻和100毫克／升卡那霉素。

用为了产生合适的限制性位点而设计的5’和3’寡核苷酸引物对编码AFP的Lol1序列和PRla质外体定向序列进行PCR扩增，使其能够连接在BamHI位点上，并使得退火的产品插入用NcoI／EcoRI打开的pUC中间质粒载体上(Messing1983)。将所述Lol1AFP分别插入3个pUC载体的不同启动子序列后面(颗粒结合淀粉合成酶；花椰菜蚀环病毒；双35S花椰菜花叶病毒)。然后再将其克隆到植物转化二元载体上，并用农杆菌属介导的转化导入烟草。

PCR反应混合物含有5微升Taq10×反应缓冲液，1微升dNTPs，1微升5’和3’引物(50皮摩尔／微升)，1微升模板Lol1，0．5微升Taq聚合酶和0．05微升pfu校正酶。用矿物油覆盖试管，并在94℃进行2分钟的最初变性步骤之后，进行30轮次的下列反应：94℃下1分钟，55℃下1分钟和72℃下1分钟。

用合适的限制酶进行PCR扩增产物的消化，消化是在37℃下在推荐的缓冲液(Boehringer Mannheim)中进行16小时。在1％的琼脂糖凝胶上分离消化混合物，并切除相关的带，并用Qiagen快速DNA凝胶纯化试剂盒按照生产商的推荐进行纯化。

按照Stratgene的推荐在16℃下用T4连接酶和10×缓冲液连接插入片段和质粒载体16小时。用2微升连接反应物转化感受态大肠杆菌细胞，铺平板，并在37℃下生长过夜。用特殊的5’和3’引物通过PCR鉴定转化体。然后按照Maniatis第一卷中所披露的方法分离质粒DNA，并通过限制性消化分析证实正确的组合。

切除HindIII／EcoRI插入片段，并按上述方法连接到HindIII／EcoRI消化过的通用植物转化载体(GPTV)上。转化感受态大肠杆菌，并通过PCR鉴定转化体；然后通过测序证实所分离的质粒DNA是正确的。

用披露于植物分子生物学手册PMAN A3／7中的冻融方法将所述三种不同的GPTV载体分别转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumafaciens)(菌株LBA4404)中。

用10％的高氯酸钠溶液对烟草(Nicotiana tabacum)(Petit Havana变种)种子进行表面消毒10分钟，然后用蒸馏水漂洗3次，转移到Murashige和Skoog基础培养基+3％蔗糖+0．9％琼脂上。让所述种子生长2周，然后间苗至每个容器2株，此后通过将每个月的苗的切段放入MS基础培养基+3％蔗糖+0．9％琼脂中获得消毒的小植株。在Lennox培养液(5克／升氯化钠，10克／升酵母提取物，10克／升细菌培养用胰化蛋白胨和15克／升琼脂)中培养含有合适的质粒的农杆菌属细胞过夜，然后通过以3000×g的速度离心10分钟回收细胞，并重新悬浮在MS基础培养基+3％蔗糖中。通过与所述农杆菌属培养物一起培养10分钟感染用消毒软木塞打孔器切成的烟草叶片，然后在无菌滤纸上将其拍干，并将其向下放在烟草细胞的保育培养平板上。

在26℃下在2000勒克斯的光照强度下培养所述感染的叶片2天，并从保育培养平板上转移到选择培养基上。然后在26℃下在3000勒克斯的条件下进行培养，给以16小时光照／8小时黑暗，并每隔2周转移到新的培养基上。当在所述叶片的边缘出现新生长的芽时，将其转移到MS基础培养基+3％蔗糖，500毫克／升头孢氨噻和100毫克／升卡那霉素上，进行长根。

在长根并且生长到具有3-4个叶片之后，取每一种结构的若干品系加上若干未转化对照植物的一个叶片进行RI测定。在微量离心管中将所述叶片组织磨碎，并通过离心回收释放出的汁液。在测定之前将所述汁液调整到30％蔗糖(w／v)。

证实每一种结构的若干植物品系具有显著水平的冰再结晶抑制活性。来自所述每一种对照植物的提取物不具有活性。这清楚地表明，Lol1AFP业已转入本身不具有AFP的植物烟草中，并且作为活性蛋白成功地表达，而不需要进行冷驯化。

将选择用于生长的植株盆栽到50％蛭石／50％泥炭混合物中，并进行重新盆栽，在生长室中以26℃／16小时光照／22℃／8小时黑暗周期开花。对花进行套袋，以确保自花授粉，并采集种子，并在4℃下保存。例IX

为了证实本发明的AFP不需要糖基化就具有活性，在原核系统中表达其编码区。制备含有黑麦草AFP cDNA的大肠杆菌菌株。

将所述黑麦草cDNA克隆到获自Novagen的pET32质粒上，该质粒含有硫氧还蛋白，以便以融合蛋白形式表达目标基因。所有的酶均购自Boehringer Mannheim，并按照生产商的说明使用。表达质粒的构建，大肠杆菌的转化和生长都是按照Novagen pET系统手册和Promega应用指南的说明进行的。

将所述黑麦草cDNA作为PCR扩增片段克隆到pET-32质粒上，该扩增片段具有相容性限制末端以便连接到pET32质粒的多克隆位点上。所述末端是用黑麦草cDNA作模板并使用5’寡核苷酸引物(TTTGCGCTCGAGTTAAGCGTCTGTCACGACTTTG)和3’寡核苷酸引物(TTTGCGCCATGGATGAACAGCCGAATACAATTTC)产生的。上述过程在所述扩增片段的5’末端引入一个NcoI限制位点，并3’末端引入一个XhoI限制位点。所述反应是在热循环仪上用Taq DNA聚合酶进行25个轮次(在94℃下变性，从35℃到60℃退火，在72℃下表达)。所有随后的PCR反应是在相同条件下进行的。然后将NcoI／XhoI PCR扩增片段克隆到Nco1／Xho1消化过的pET-32质粒上，并转入感受态非表达大肠杆菌细胞(菌株XL1-Blue)中。在转化之后，将其铺平板到LB氨苄青霉素平板上，并在37℃下生长16小时。挑选10个氨苄青霉素抗性转化体，并通过用购自Novagen的pET上游和下游引物进行的PCR，分析黑麦草cDNA的整合。

通过小量制备从三个阳性转化体中分离质粒DNA，并用XhoI和NcoI消化，并按照pET系统手册中所述方法转入感受态表达大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。将转化过的细胞铺平板到LB氨苄青霉素培养基上，并在37℃下与用非转化的BL21(DE3)大肠杆菌细胞制备的对照一起培养24小时。选择三个阳性转化体菌落，并在LB氨苄青霉素培养基上继代，并在37℃下培养1小时，达到0．6的O．D．(λ=600nm)，然后接种到较大体积的培养基中，并在37℃下摇动。当O．D．达到0．5时，按照pET系统手册中所述方法用IPTG诱导所述细胞进行蛋白表达3小时。

按照在pET系统手册中所述方法从所述大肠杆菌细胞质中分离表达的蛋白；通过离心收获细胞，重新悬浮在HEPES缓冲液(25mM HEPES，10mM氯化镁，100mM氯化钠，1mM DTT，pH7．5)中，并超声处理10秒钟。对细胞质蛋白组分进行离心，并收集上清液。将上清液的样品调整到30％的蔗糖浓度，并按照例III所述方法测定冰再结晶抑制活性。所述细胞质蛋白提取物表现出显著的RI活性，而用不含整合的黑麦草cDNA对照大肠杆菌细胞以相同方法生产细胞质蛋白提取物没有活性。

通过金属亲合柱纯化所述融合蛋白并通过用凝血酶消化除去硫氧还蛋白。通过对所述蛋白的N-末端进行测序证实所裂解AFP的性质，证实这种裂解蛋白也具有显著的冰再结晶抑制活性。

以上实施例证实，在大肠杆菌中表达的非糖基化黑麦草抗冻蛋白，无论是与硫氧还蛋白的融合产物，还是在凝血酶裂解之后都保留其再结晶抑制活性。

Claims

1．可源于植物的抗冻蛋白，其特征在于其氨基酸的至少40％来自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺。

2．如权利要求1的抗冻蛋白，该蛋白可源于牧草。

3．如权利要求1的抗冻蛋白及其修饰形式，所述蛋白至少与下列氨基酸序列具有80％的重叠：D-E-Q-P-N-T-I-S-G-S-N-N-T-V-R-S-G-S-K-N-V-L-A-G-N-D-N-T-V-I-S-G-D-N-N-S-V-S-G-S-N-N-T-V-V-S-G-N-D-N-T-V-T-G-S-N-H-V-V-S-G-T-N-H-I-V-T-D-N-N-N-N-V-S-G-N-D-N-N-V-S-G-S-F-H-T-V-S-G-G-H-N-T-V-S-G-S-N-N-T-V-S-G-S-N-H-V-V-S-G-S-N-K-V-V-T-D-A

4．如权利要求3的抗冻蛋白，其中，所述重叠至少为95％。

5．如权利要求4的抗冻蛋白，其中，所述重叠为100％。

6．如权利要求1的抗冻蛋白，其中，所述蛋白通过糖基化进行过修饰。

7．能够编码权利要求1的抗冻蛋白的核酸序列。

8．如权利要求7的核酸序列，具有以下序列：GAT GAA CAG CCG AAT ACG ATT TCT GGG AGC AAC AAT ACTGTC AGA TCC GGG AGC AAA AAT GTT CTT GCT GGG AAT GACAAC ACC GTC ATA TCT GGG GAC AAC AAT AGT GTG TCT GGGAGC AAC AAC ACT GTC GTA AGT GGG AAT GAC AAT ACC GTAACC GGC AGC AAC CAT GTC GTA TCA GGG ACA AAC CAT ATCGTT ACA GAC AAC AAC AAT AAC GTA TCC GGG AAC GAT AATAAT GTA TCC GGG AGC TTT CAT ACC GTA TCC GGG GGG CACAAT ACT GTG TCC GGG AGC AAC AAT ACC GTA TCT GGG AGCAAC CAC GTT GTA TCT GGA AGC AAC AAA GTC GTG ACA GACGCT TAA及其等位基因。

9．含有权利要求1的抗冻蛋白的冷冻食品。

10．权利要求9的食品，它是冷冻糖果食品。

11．获得权利要求1的AFP的方法，其中所述AFP是通过遗传学修饰的生物产生的。

12．如权利要求11的方法，其中，所述生物是微生物或植物品系。

13．能够表达权利要求1或2的蛋白并具有较强的抗冻能力的植物。