SK10952000A3 - Mrazuvzdorný proteín, nukleokyselinová sekvencia, mrazený potravinový výrobok s jej obsahom a spôsob jeho získavania - Google Patents
Mrazuvzdorný proteín, nukleokyselinová sekvencia, mrazený potravinový výrobok s jej obsahom a spôsob jeho získavania Download PDFInfo
- Publication number
- SK10952000A3 SK10952000A3 SK1095-2000A SK10952000A SK10952000A3 SK 10952000 A3 SK10952000 A3 SK 10952000A3 SK 10952000 A SK10952000 A SK 10952000A SK 10952000 A3 SK10952000 A3 SK 10952000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- protein
- acid sequence
- aac
- afp
- gta
- Prior art date
Links
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 10
- 235000013611 frozen food Nutrition 0.000 title claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 54
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 24
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 22
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 24
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 21
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 14
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 13
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 13
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 13
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 5
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 241000209049 Poa pratensis Species 0.000 description 4
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 3
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 3
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 240000006597 Poa trivialis Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 2
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 101150038671 strat gene Proteins 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroxypropan-2-yl formate Chemical compound OCC(CO)OC=O LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241000544808 Bromus sterilis Species 0.000 description 1
- 241001609030 Brosme brosme Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000002425 Catapodium marinum Species 0.000 description 1
- 240000006766 Cornus mas Species 0.000 description 1
- 235000003363 Cornus mas Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000380130 Ehrharta erecta Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010028690 Fish Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 240000003857 Holcus lanatus Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920000161 Locust bean gum Polymers 0.000 description 1
- 241000165509 Lolia Species 0.000 description 1
- 244000100545 Lolium multiflorum Species 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 241001148658 Nardus stricta Species 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 241001411142 Parapholis strigosa Species 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000209048 Poa Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001303601 Rosacea Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000022472 cold acclimation Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000011363 dried mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 235000013572 fruit purees Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000711 locust bean gum Substances 0.000 description 1
- 235000010420 locust bean gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003214 poly(methacrylonitrile) Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Freezing, Cooling And Drying Of Foods (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Confectionery (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Mrazuvzdorný proteín, nukleokyselinová sekvencia, mrazený potravinový výrobok s jeho obsahom a spôsob jeho získavania
Oblasť techniky
Vynález sa týka mrazuvzdorných proteínov (AFPs), nukleokyselinová sekvencia, mrazeného potravinového výrobku obsahujúceho AFPs a spôsobu jeho získavania.
Doterajší stav techniky
Mrazuvzdorné proteíny (AFPs) boli navrhnuté za účelom zlepšenia mrazuvzdorných vlastností potravín.
Pre potreby vynálezu je termín AFP v doterajšej technike dobre známy, ide najmä o tie bielkoviny, ktoré vykazujú inhibičnú aktivitu proti rastu kryštálov ľadu. Ako príklad pozri US 5,118,792.
WO 90/13571 opisuje mrazuvzdorné kryštály vyrábané chemicky alebo rekombinantnými DNA metódami. AFPs môžu byť vhodne použité v potravinových výrobkoch. Príklad 3B ukazuje modifikované tvary ľadových kryštálov ak zmes voda-ľad je zmrazená ako povlak v kombinácii s 0,01 % hmotn. AFP.
WO 92/22581 opisuje AFPs z rastlín, ktoré možno použiť na kontrolu tvaru ľadových kryštálov v zmrzline. Tento dokument tiež opisuje spôsob extrahovania polypeptidových zlúčenín z mimobunkového priestoru rastlín infiltrovaním extrakčného média do listov bez porušenia rastlín.
WO 94/03617 opisuje výrobu AFPs z kvasníc a ich možné použitie v zmrzlinách. WO 96/11586 opisuje AFPs z rýb produkované mikróbami.
Viaceré literárne zdroje uvádzajú izoláciu a/alebo použitie rastlinných proteínov na kryoochranu. Kryoochranné proteíny majú funkciu v ochrane rastlinných membrán proti poškodeniu mrazom. Tieto proteíny však nemajú rekryštalizačné inhibičné vlastnosti a preto nespadajú pod termín AFPs.
-2Hincha v časopise Journal of Plánt Physiology, 1992, 140, 236-240 opisuje izoláciu kryoochranných bielkovín z kapusty. Volger v Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), 335-803 opisuje izoláciu kryoochranných listových bielkovín zo špenátu. Boothe v Plánt Physiol (1995), 108: 759-803 opisuje izoláciu bielkovín z Brassica napus. Opäť sa však tieto proteíny považujú skôr za kryoochranné proteíny ako AFPs. Neven v Plánt Molecular Biology 21: 291-305, 1993 opisuje DNA charakteristiku kryoochranného proteínu zo špenátu. Salzman v Abstracts a Reviews z 18. výročného stretnutia ASEVA/ýchodnej sekcie v Am. &j. Enol. Vitie., Zv. 44, č. 4, 1993 opisuje prítomnosť varu odolných polypeptidov v púčikoch Vitis. Hoci proteíny sú analogické s mrazuvzdornými proteínmi rýb, sú to kryoochranné proteíny, a nie AFPs. Lin v Biochemical and Biophysical Research Communication, Zv. 183, č. 3, 1992, str. 1103-1108 a v Lin, Plánt Physiology (1992) 99, 519-525 opisuje 15 kDa kryoochranný proteín z Arabidopsis Hakaira. Houde v Plánt Journal (1995) 8 (4), 583-593 uvádza kryoochranné proteíny z pšenice.
Avšak použitie AFPs sa doteraz neuplatnilo pre komerčne dostupné potravinové výrobky. Jednou z príčin sú vysoké náklady a komplikovaný spôsob získavania AFPs. Ďalšou príčinou je, že AFPs, ktoré boli doteraz navrhované na použitie v potravinových výrobkoch nemôžu byť začlenené do štandardnej zmesi výrobku, pretože majú tendenciu byť nestabilné počas spracovávania, najmä počas pasterizácie. Túto destabilizáciu podľa všetkého spôsobuje denaturácia AFPs, čo je známy efekt bežne pozorovaný u peptidov a proteínov.
V nezverejnenej patentovej prihláške PCT/EP97/03634 bolo opísané, že AFPs môžu byť izolované z prírodných zdrojov, ako napríklad z trávy aklimatizovanej na chlad, a to relatívne jednoduchým spôsobom. Tento spôsob na prvý krát vedie k identifikácii AFPs, ktoré možno vhodne začleniť do zmesi na prípravu mrazených výrobkov pred ich pasterizáciou.
Tento spôsob získavania AFPs z trávy zahŕňa nasledovné kroky:
a) izolovanie šťavy obsahujúcej AFP z trávy;
b) tepelné spracovanie trávy alebo šťavy obsahujúcej AFP na teplotu najmenej 60 °C;
c) odstránenie nerozpustných frakcií.
-3Krok c uvedeného spôsobu zvyčajne nasleduje po krokoch a a b. Kroky a a b možno uskutočniť v akomkoľvek poradí, napríklad krok a môže byť uskutočnený pred krokom b (v takom prípade sa zohreje šťava bohatá na AFP) alebo krok b predchádza kroku a (v takom prípade sa zohreje prírodný zdroj) alebo kroky a a b sa uskutočnia súčasne.
Tento spôsob má veľa výhod. Po prvé, použitím tohto spôsobu už nie je potrebné vyhnúť sa porušeniu trávy, ako je to požadované v spôsoboch podľa WO 92/22581. To významne zvyšuje komerčné využitie spôsoby, napríklad v porovnaní s WO 92/22581, pretože už nie je potrebné vynakladať toľko prostriedkov na špecifické spracovanie. Použitím vysokých teplôt sa zdá byť možné extrahovať z veľkej skupiny peptidov prítomných v tráve AFP, ktorý je veľmi aktívny s ohľadom na inhibičné vlastnosti rekryštalizácie ľadu. Po tretie, napriek očakávaniam použitie vysokých teplôt nedenaturuje všetok proteínový materiál, ale zdá sa, že denaturuje len niektoré proteíny, zatiaľ čo ostatné AFP v tráve majú zlepšenú teplotnú stabilitu. To umožňuje zahrnúť do prípravkov izolované AFPs, ktoré musia byť vystavené vyššej teplote, napríklad v kroku pasterizácie. Toto je zvlášť prekvapujúce, pretože napríklad AFPs z WO 92/22581 sa nezdajú byť stabilné pri zohrievaní.
Uvedený spôsob v kroku b zahŕňa zohrievanie trávy alebo šťavy bohatej na AFP na teplotu vyššiu ako 60 °C. Výhodná je teplota od 60 do 110 °C, najvýhodnejšie od 80 do 105 °C. Krok zohrievania sa môže uskutočniť po izolácii šťavy bohatej na proteíny (krok a ) alebo pred izoláciou šťavy bohatej na proteíny. Môže byť použitý akýkoľvek vhodný spôsob na zohriatie šťavy, napríklad bežné zohrievanie alebo zohrievanie v mikrovlnnej rúre, prípadne s pridaním extrakčného média, s parením, atď.
Ak sa použije extrakčné médium, výhodne sa použije len malé množstvo, aby sa zabránilo nežiadúcemu rozpúšťaniu AFP frakcie. Môže byť použité akékoľvek vhodné extrakčné médium, ale najvýhodnejšie je použiť vodu. Ak je to žiadúce. do vody sa môžu pridať aditíva pred použitím extrakčného média. Najvýhodnejšie je však použiť vodu bez akýchkoľvek aditív.
Zistilo sa tiež, že uvedeným spôsobom sa môže získať veľmi aktívny AFP odvodený od trávy. Pre účely vynálezu termín tráva zahŕňa zástupcov čeľade
-4Gramineae, vrátane viacročných tráv, napríklad Lolium perenne, Parapholis strigosa, Nardus stricta, Catapodium loliaceum a Lolium multiflorum, Poa trivialis,
Poa pratensis a obilniny, ako napríklad zimná raž, zimná pšenica a zimný jačmeň.
Prihlasovatelia stanovili sekvenciu aminokyselín tohto AFP.
Prekvapujúco sa zistilo, že veľmi aktívne AFPs, ktoré môžu byť odvodené od rastlín sa vyznačujú vysokou úrovňou aminokyselín: serín (S), treonín (T) a asparagín (N).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu sú mrazuvzdomé proteíny (AFPs), v ktorých najmenej 40 % aminokyselín v proteíne je spomedzi serínu (S), treonínu (T) a asparagínu (N). Výhodne sú AFPs odvodené z tráv, najmä z čeľade Gramineae.
Výhodná molekulová hmotnosť AFPs podľa vynálezu je od 8 do 16 kDa, výhodnejšie od 10 do 14 kDa, kde táto molekulová hmotnosť sa stanovuje z génovej sekvencie alebo hmotnostnou spektrometriou nemodifikovanej formy, napríklad v ne-glykozylovanej forme.
Druhé uskutočnenie vynálezu sa týka AFP, ktorý môže byť odvodený od trávy, pričom aminokyselinová sekvencia tohto AFP na N-konci je nasledovná: D-E-Q-P-N-T-l-S-G-S-N-N-T-V-R-S-G-S-K-N-V-L-A-G-N-D-N-T-V- l-S-G-D-N-N-S-V-S-G-S-N-N-T-V-V-S-G-N-D-N-T-V-T-G-S-N-H-VV-S-G-T-N-H-l-V-T-D-N-N-N-N-V-S-G-N-D-N-N-V-S-G-S-F-H-T-VS-G-G-H-N-T-V-S-G-S-N-N-T-V-S-G-S-N-H-V-V-S-G-S-N-K-V-V-T-
D-A
Do rozsahu vynálezu tiež patria proteíny so sekvenciou, ktorá sa vyznačuje vysokým stupňom podobnosti k uvedenej sekvencii. Pre účely vynálezu je sú jeho rozsahu zahrnuté všetky Rl aktívne proteíny s aminosekvenciou prekrývajúcou sa s uvedenou sekvenciou minimálne z 80 %. Výhodnejšie je prekrytie najmenej 90 %, najvýhodnejšie viac ako 95 %, napríklad také sekvencie aminokyselín, ktoré sa od uvedenej sekvencie líšia buď žiadnou alebo len jednou alebo dvomi aminokyselinami. Do rozsahu sú tiež zahrnuté izoformy uvedených proteínov.
-5Do rozsahu predloženého vynálezu tiež patria modifikované verzie vyššie opísaných proteínov, kde tieto modifikácie materiálne neovplyvňujú vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu, ako napríklad glykozylované verzie.
Šťava bohatá na AFP môže byť získavaná z trávy akýmkoľvek výhodným spôsobom, napríklad lisovaním, filtráciou, homogenizáciou, extrakciou, atď. Výhodne sa tráva pred zberaním frakcií bohatých na proteíny, napríklad filtráciou, naseká na menšie kúsky alebo na riedku kašu. Táto macerácia sa môže uskutočniť akýmkoľvek výhodným spôsobom, napríklad v miešačke. Skúsený odborník ľahko dokáže oddeliť materiál v takej forme, aby sa mohol uskutočniť zber šťavy bohatej na proteíny.
Po zbere a zohrievaní (v požadovanom poradí) proteínové frakcie výsledného AFP obsiahnuté vo vzorke sa môžu spracovať akýmkoľvek výhodným spôsobom za účelom odstránenia nerozpustných frakcií a zachovania tekutých frakcií bohatých na AFP. Nerozpustné frakcie sa môžu odstrániť napríklad filtráciou, vyparovaním, atď. Tekutina bohatá na AFP sa môže potom výhodne spracovávať koncentrovaním a izolovaním AFPs vo forme vhodnej na ďalšie použitie. Príkladmi vhodných spôsobov sú sušenie a následné získavanie prášku alebo pasty, ďalšia koncentrácia za účelom získavania AFP koncentrátu, chromatografia za účelom oddeľovania AFPs z extrakčného média, atd. Opäť je vecou skúseného odborníka stanoviť vhodné prostriedky a podmienky na vhodnú izoláciu.
Stanovila sa tiež sekvencia nukleových kyselín, ktorá kóduje uvedený AFP. Druhé uskutočnenie vynálezu sa teda týka sekvencie nukleových kyselín schopných kódovať AFPs podľa vynálezu.
Výhodná sekvencia nukleových kyselín je nasledovná:
GAT GAA CAG CCG AAT ACG ATT TCT GGG AGC AAC AAT ACT GTC AGA TCC GGG AGC AAA AAT GTT CTT GCT GGG AAT GAC AAC ACC GTC ATA TCT GGG GAC AAC AAT AGT GTG TCT GGG AGC AAC AAC ACT GTC GTA AGT GGG AAT GAC AAT ACC GTA ACC GGC AGC AAC CAT GTC GTA TCA GGA ACA AAC CAT ATC GTT ACA GAC AAC AAC AAT AAC GTA TCC GGG AAC GAT AAT AAT GTA TCC GGG AGC TTT CAT ACC GTA TCC GGG GGG CAC AAT ACT GTG TCC GGG AGC AAC AAT ACC GTA TCT GGG AGC AAC
-6CAC GTT GTA TCT GGA AGC AAC AAA GTC GTG ACA GAC GCT TAA
Do rozsahu predloženého vynálezu sú tiež zahrnuté alelové sekvencie alebo iné sekvencie nukleových kyselín, ktoré sú schopné kódovať vyššie opísané AFPs, napríklad také sekvencie nukleových kyselín, kde v porovnaní s uvedenou sekvenciou bol príslušnými synonymami (t.j. kodónmi kódujúcimi rovnakú aminokyselinu) nahradený len jeden alebo dva kodóny.
Do rozsahu vynálezu sú tiež zahrnuté vektory obsahujúce sekvenciu nukleových kyselín schopných kódovať AFP podľa vynálezu.
Na základe uvedených informácií je tiež možné geneticky modifikovať iné prírodné zdroje tak, aby sa z nich získali výhodné AFPs ako boli opísané vyššie.
Zistilo sa, že AFPs vyššie uvedenej sekvencie zlepšili vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu. Vhodný test na zistenie vlastností inhibície rekryštalizácie ľadu je opísaný v príkladoch a zahŕňa rýchle zmrazovanie na -40 °C a následné uskladnenie pri -60 °C na jednu hodinu. Výhodne AFPs, ktoré sa podrobia tomuto testu po zohriatí majú veľkosť častíc kryštálov ľadu o menej ako 5 pm väčšiu ako veľkosť častíc kryštálov vo vzorke s AFP, ktorá nebola zohriata. Výhodne je rozdiel menší ako 3 pm, najvýhodnejšie menší ako 1 pm.
Výhodné sú tie AFPs, ktoré majú výrazne vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu. Vhodný test na stanovenie vlastností inhibície rekryštalizácie ľadu je opísaný v príkladoch. Výhodne AFPs podľa vynálezu majú veľkosť častíc následne po teste na inhibíciu rekryštalizácie (ako je to uvedené v príkladoch) 15 pm alebo menej, výhodnejšie od 5 do 15 pm.
AFP podľa vynálezu možno vhodne použiť v potravinových výrobkoch, výhodne v takých potravinových výrobkoch, ktoré sú zmrazené alebo majú tendenciu sa zmrazovať. Veľmi výhodné je použitie AFPs vo výrobkoch, ktoré sa zohrievajú napríklad pasterizáciou, predhrievaním alebo sterilizáciou pred zmrazením. Veľmi výhodné je najmä použitie v mrazených cukrovinkách.
Príkladmi takýchto potravinových výrobkov sú: zmesi mrazených cukroviniek, ako napríklad zmesi smotanových zmrzlín a zmesi ovocných zmrzlín, ktoré sa zvyknú pred zmrazením pasterizovať. Takéto zmesi sa zvyčajne skladujú pri teplote
-7miestnosti. Vhodnými formami výrobkov sú: práškové zmesi napríklad vo vreckách alebo vrecúškach. Uvedené zmesi môžu byť základom mrazeného potravinového výrobku, napríklad po pridaní vody a prípadných ďalších prísad a voliteľne po prevzdušnení.
Ďalším príkladom vhodnej zmesi by mohla byť tekutá zmes (voliteľne prevzdušnená), ktorá môže byť zmrazená po prípadnom pridaní ďalších komponentov a voliteľnom ďalšom prevzdušnení.
Jasnou výhodou vyššie opísaných zmesi je, že vďaka prítomnosti AFP môžu byť zmesi zmrazené pri podmienkach v stave kľudu, napríklad v mrazničke v obchode alebo doma, a to bez vytvárania nežiadúcich ľadových kryštálov a teda so štruktúrou odlišujúcou sa od tej, ktorá sa dosahuje pri zmrazovaní v stave kľudu.
Veľmi výhodne sa tieto zmesi balia do uzavretých obalov (napríklad kartónov, tašiek, škatúľ, obalov z plastu, atď.). Pri jednotlivých kusoch je veľkosť obalu všeobecne od 10 do 1000 g. Pri viackusových baleniach je výhodná veľkosť obalu do 5000 g. Všeobecne veľkosť obalu je od 10 g do 5000 g.
Ako je uvedené vyššie, výhodnými výrobkami, v ktorých sú použité AFPs, sú mrazené cukrovinky, ako napríklad smotanová zmrzlina alebo ovocná zmrzlina. Výhodne je podiel AFPs od 0,00001 do 0,5 % hmotn. z konečnej hmotnosti výrobku. Ak sa používajú sušené zmesi alebo koncentráty, koncentrácia môže byť vyššia tak, aby bol podiel AFP v konečnom výrobku v rámci uvedeného rozsahu.
Pre účely vynálezu sa pod pojmom mrazená cukrovinka rozumie mrazený výrobok charakteru cukrovinky s obsahom mlieka, napríklad zmrzlina, mrazený jogurt, šerbet, sorbet, ľadové mlieko a mrazený vaječný krém, ovocné zmrzliny, zmrzliny s mramorovou štruktúrou a mrazené ovocné pyré. Použitie vo fermentovaných potravinových výrobkoch je pre niektoré prihlášky menej výhodné.
Podiel tuhých častíc v mrazenej cukrovinke (napríklad cukru, tukov, príchutí, atď.) je výhodne viac ako 4 % hmotn., napríklad viac ako 30 % hmotn., výhodnejšie od 40 do 70 % hmotn.
Mrazené cukrovinky podľa predloženého vynálezu možno vyrobiť akýmkoľvek spôsobom vhodným na výrobu mrazených cukroviniek. Najvýhodnejšie je však úplne zmiešať všetky prísady výrobku pred pasterizáciou a pred začiatkom
-8zmrazovania. Zmrazovanie môže voliteľne zahŕňať krok vytvrdzovania, napríklad pri teplote -30 °C alebo nižšej.
Príklady uskutočnenia vynálezu.
Príklad 1
Izolácia AFPs najprv zohriatím trávy a následnou izoláciou šťavy bohatej na AFP a izolácia AFP
Zmes trávových pletív (Poa trivialis, Lolia perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis) sa zozbierala v januári (priemerná mesačná teplota bola 3,5 °C, čím bola zabezpečená vhodná aklimatizácia rastlín na chlad). Pletivá tráv sa urýchlene preniesli do laboratória na ďalšie spracovanie a starostlivo umyli, aby sa z nich odstránila nečistota.
500 g odrezkov trávy sa umiestnilo do 650 W mikrovlnnej rúry a zohrievalo pri plnom výkone po dobu 5 minút, pričom sa teplota zvýšila na 85 až 100 °C. Odrezky trávy sa potom nechali ochladiť na teplotu miestnosti.
Alternatívne sa odrezky trávy zmiešali s 500 g vriacej vody a zmes sa znovu zohriala na 100 °C a následne varila 10 minút za stáleho miešania a potom nechala vychladnúť na 60 °C.
Po kroku zohrievania sa z odrezkov filtráciou oddelila šťava bohatá na AFP. Masa sa premiešavala 5 minút za prítomnosti rovnakého množstva vody a potom sa prepasírovala cez 3 vrstvy mušelínu.
Kal sa môže vysušiť pri zmrazovaní za účelom odstránenia vody a následne uskladniť. Alternatívne možno kal zmraziť a uskladniť.
Príklad 2
Zmiešaním nasledovných zložiek sa pripravila tekutá predzmes na prípravu zmrzliny:
-9Zložka % hmotn.
odstredené mlieko v prášku sacharóza maltodextrín (MD40) karobová guma maslový olej monoglycerid (palmitát) vanilín
10,00
13,00
4,00
0,14
8,00
0,30
0,01
AFP (podľa Príkladu 1*) voda
0,01 alebo 0 (kontrola) na vyrovnanie ‘Poznámka: AFP sa pridáva ako koncentrovaná roztok AFP vo vode, percento sa týka množstva AFP.
Zložky sa zmiešali pri teplote miestnosti a následne pasterizovali po dobu 60 sekúnd pri 89 °C. Zmes sa aseptický plnila do vreciek s objemom 500 ml, utesnila a uskladnila pri teplote miestnosti.
Zmes sa môže použiť na prípravu zmrzliny šľahaním bežným šľahačom so 70 % výťažkom a následne zmrazením v stave kľudu v bežnej domácej mrazničke.
Po dvoch mesiacoch uskladnenia mal prípravok podľa vynálezu výrazne lepšiu štruktúru ako kontrolná vzorka.
Príklad 3
Vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu AFP sa dajú zistiť nasledovným spôsobom.
Úroveň sacharózy vo výrobku obsahujúcom AFP sa upravila na 30 % hmotn. zriedením (ak podiel vo vzorke bol na začiatku väčší ako 30 % hmotn.) alebo pridaním sacharózy do 30 % hmotn. (ak jej podiel bol nižší).
Kvapka vzorky s objemom 3 μΙ sa kvapla na podložné sklíčko s priemerom 22 mm, ktoré sa potom prikrylo krycím sklíčkom s priemerom 16 mm a zaťažilo hmotnosťou 200 g, aby sa zabezpečila jednotná hrúbka. Okraje sklíčka sa utesnili priesvitným lakom na nechty.
-10Sklíčko sa potom umiestnilo na stolček Linkham THM 600 mikroskopu s riadenou teplotou. Stolček sa rýchlo ochladil na -40 °C (50 °C za minútu), pričom sa vytvorilo veľké množstvo malých kryštálov. Teplota stolčeka sa potom rýchlo zvýšila na -6 °C (50 °C za minútu) a udržiavala sa na tejto teplote.
Fáza ľadu sa pozorovala pri -6 °C s použitím Leica Aristoplan mikroskopu. Za účelom zvýraznenia kontrastu ľadových kryštálov sa použilo polarizované svetlo v spojení s lambda platňou. Stav ľadovej fázy (veľkosť ľadových kryštálov) sa zaznamenával 35 mm fotomikrografiou pri T=0 a T=1 hodina.
Všeobecne možno tento test použiť na akýkoľvek vhodný prípravok obsahujúci AFP a vodu. Všeobecne podiel AFP v takomto testovanom prípravku nie je veľmi rozhodujúci a môže byť napríklad od 0,0001 do 0,5 % hmotn., výhodnejšie od 0,0005 do 0,1 % hmotn., najvýhodnejšie od 0,01 do 0,05 % hmotn., napríklad 0,01 % hmotn.
Na uskutočnenie tohto testu možno použiť akýkoľvek vhodný prípravok obsahujúci AFP a vodu. Všeobecne však nie je nevyhnutné získať AFP v čistej forme. Na praktické využitie by normálne stačilo pripraviť tekutý extrakt alebo šťavu z prírodného materiálu, kde sa môže potom testovať tento extrakt alebo šťava.
Tento spôsob možno aplikovať napríklad na extrakty obsahujúce AFP získané podľa Príkladu 1 s krokom koncentrácie alebo bez neho.
Následne sa merali vlastnosti inhibície rekryštalizácie. Rekryštalizačné vlastnosti sa merali v šťavách obsahujúcich AFP získaných po extrakcii a zohrievaní podľa Príkladu 1.
Zo Silsoe (UK) sa získala tráva neupravená zohrievaním zozbieraná v januári. Extrakt sa centrifugoval 1 hodinu za účelom odstránenia pôdy a nerozpustného odpadu nasledovne: centrifúga Sorvall RC3C, rotor H6000A, teplota +5 °C, rýchlosť rotora 5000 otáčok za minútu (7268 g).
Vzorka extraktu sa vysušila pri zmrazení za účelom stanovenia celkového obsahu tuhej zložky. Zistilo sa, že tento podiel je 11,48 mg/ml. Vysušený extrakt sa potom rehydratoval 30 % roztokom sacharózy na pôvodnú koncentráciu tuhej zložky. Riedením extraktu podľa potreby s 30 % roztokom sacharózy sa pripravilo niekoľko roztokov.
-11 Aktivita inhibície rekryštalizácie ľadu sa merala použitím vyššie opísaného testu.
Priemerná veľkosť kryštálov z testov inhibície rekryštalizácie z obrázkov pri T=0 a T=1 hodina sa merala použitím analyzéra Zeiss TGA 10. Veľkosť ľadových kryštálov (dĺžka) sa stanovila obkreslením obvodu kryštálov. Maximálna dĺžka každého jednotlivého kryštálu ľadu z dávky zmrzliny bola importovaná do tabuľkového procesora, kde sa analyzovali údaje za účelom zistenia priemernej a štandardnej odchýlky.
Výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke.
| Vzorka | Celkové množstvo tuhej zložky (mg/ml) | Veľkosť kryštálov ľadu (pm) | Rast kryštálov ľadu za 1 hodinu pri -6 ’C (pm) | |
| T=0 | T= 1 hodina pri -6 °C | |||
| Nezriedený | 11,48 | 5,2 | 7,3 | 2,1 |
| 50 % extrakt | 5,74 | 5,5 | 7,6 | 2,1 |
| 25 % extrakt | 2,87 | 6,3 | 8,9 | 2,6 |
| 12,5 % extrakt | 1,435 | 6,6 | 13,1 | 6,5 |
| 6,25 % extrakt | 0,7175 | 8,1 | 14,7 | 6,6 |
| 3,125 % extrakt | 0,359 | 7,4 | 17,0 | 9,6 |
| 1,5625% extrakt | 0,179 | 9,0 | 20,3 | 11,3 |
Tieto výsledky ukazujú rozličné konečné veľkosti kryštálov a zmeny vo veľkosti ľadových kryštálov po 1 hodine pri -6 °C pre rôzne roztoky extraktu trávy. Vidno, že podiel tuhej zložky v extrakte trávy sa môže líšiť, pričom sa stále dosahujú dobré vlastnosti inhibície rekryštalizácie. Výhodne sa uprednostňujú tie
-12koncentrácie, ktorých výsledkom je veľkosť kryštálov ľadu po 1 hodine 15 mikrometrov alebo menej.
Podobný test sa uskutočnil s extraktom trávy, ktorý bol zohrievaný (10 minút pri 100 °C). Nezistilo sa žiadne zhoršenie vlastností inhibície rekryštalizácie.
Dodatočne sa extrakty z Príkladu 1 testovali s použitím rovnakého testu inhibície rekryštalizácie. Získali sa nasledovné výsledky:
Zohrievanie Veľkosť ľadových kryštálov v pm
T=0T=1 °C 1 hodina 9^6IIJ minút var 9,811,3
Tieto výsledky ukazujú, že dokonca aj po zohrievaní extraktu z trávy aklimatizovanej na chlad sa zachovala schopnosť inhibovať rast kryštálov ľadu.
Príklad 4
Semená viacročnej raže (Lolium perenné) boli dodané z Barnbrug (UK) Ltd. Semená boli zasadené do 9 palcových (25,4mm x 9) črepníkov s kompostom Levingtons č. 2 a po vyklíčení, zvyčajne medzi 4 a 7 dňom po zasadení, sa rastliny presadili do skleníka na ďalších 7 až 10 dní až kým nevyrástli do výšky približne 15 až 20 cm. Rastliny sa potom premiestnili do studenej miestnosti na aklimatizáciu na chlad. Aklimatizácia trvala 30 dní pri +4 ’C s 8 až 16 hodinami svetla/tmy.
Listy aklimatizované na chlad sa posekali a homogenizovali v 50 mM Tris,
10mM EDTA prispôsobenom na požadované pH s koncentrovaným HCI.
Homogenizácia trvala 2 x 30 sekúnd v miešači Waring s hmotnostným pomerom tlmivého roztoku a listov 2,5:1.
Homogenát sa potom dal do kúpeľa s vriacou vodou na 10 minút a zozbieral cez štyri vrstvy mušelínu. Zozbieraný kal sa ďalej centrifugoval pri 15 000 xg v 8 x ml rotore centrifúgy Sorvall.
-13Vlastnosti inhibície rekryštalizácie sa testovali spôsobom opísaným v Príklade 3.
Teplotné stabilný extrakt (10 až 15 ml) sa koncentroval približne desaťnásobne v Amicon koncentrátore s použitím PM10 membrány. Vzorky koncentrátu s objemom 1 ml sa odsolili na Rýchlom odsoľovacom stĺpci na FPLC separačnom systéme (Pharmacia). Stĺpec sa nechal prebiehať/pôsobiť pri 1 ml/min v 50 mM Tris/CI, 10mM EDTA, pH 8,5. Zber frakcií (1 ml) sa začal akonáhle sledované O.D. 280 nm začalo stúpať. Rl aktívne frakcie sa ponorili do kúpeľa s objemom 3 ml.
Rl aktivita sa nanášala na Mono Q (HR5 x 5) stĺpec ekvilibrovaný v rovnakom Tris, pH 8,5 tlmivom roztoku. Prepustený materiál sa zozbieral ako jedna frakcia a stĺpec sa hneď eluoval lineárnym gradientom 0 až 0,25 M NaCI po dobu 25 minút pri 1 ml/min. Zvyčajným spôsobom sa zistilo, že celková aktivita je neviazaná a eluuje výlučne v prepustenej frakcii.
Použitím 1 mikrolitrových kvapiek 4M NaOH sa opätovne upravilo pH prepustenej frakcie na 9,5, ktorá sa potom naniesla na Mono Q stĺpec a ten sa znovu ekvilibroval v Tris tlmivom roztoku s pH 9,5. Prepustený materiál sa zozbieral ako jedna frakcia a potom sa stĺpec ihneď eluoval s 0 až 0,25 M NaCI lineárnym gradientom po dobu 25 minút. Rýchlosť prietoku bola 1 ml/min a 1 ml frakcie sa zozbierali na Rl test. Zistilo sa, že celá aktivita bola viazaná na stĺpec a v prepustenej frakcii sa nezistila žiadna aktivita. Aktivita eluovala ako jeden vrchol medzi 0,08 a 0,14M NaCI.
Aktívne vrcholové frakcie z Mono Q stĺpca sa ponorili do kúpeľa, koncentrovali na 50 mikrolitrov na PM10 Centricon koncentrátore a naniesli na Sephadex 75 stĺpec na Smart systéme (Pharmacia). Stĺpec sa ekvilibroval v 50 mM Tris/CI pH 9,5 tlmivom roztoku a rýchlosť prietoku bola 50 mikrolitrov/min. Zber vzoriek sa posunul pre 1 mikroliter prázdneho objemu stĺpca a potom sa zozbierali 50 ml frakcie. Aktívne frakcie sa nechali prebiehať/pôsobiť na SDS PAGE.
Vzorky sa nechali prebiehať/pôsobiť na 10% Page géloch z Novexu. Vzorky a gélový tlmivý roztok sa pripravili spôsobom opísaným v návode od výrobcu a gély sa farbili s použitím striebornej farbiacej sady Novex. Aktívne frakcie obsahovali jediný zafarbený proteínový pás so zjavnou molekulovou hmotnosťou 29 kDa.
- 14Proteínové vzorky sa tiež separovali SDS PAGE, a potom nasledoval elektroblotovanie na PVDF membráne založené na spôsobe podľa Matsudaira v 10 mM CAPS tlmivého roztoku, s pH 11,0, 10 % metanol. Membrána sa namočila v metanole a potom ekvilibrovala v Caps tlmivom roztoku po dobu 10 minút. Sanie trvalo 16 hodín pri stabilnom napätí 20 V. Po saní sa proteiny zviditeľnili farbením membrány s 0,2% coomassieovou brilliantovou modrou v 50% metanole, 1% kyseline octovej po dobu 1 minúty. Membrána sa potom odfarbila s 50% metanolom, až kým sa proteínové pásy úplne nezviditeľnili. Membrána sa premyla v Milli Q vode, vysušila vzduchom a uskladnila pri -20 °C.
N-koniec pásu s molekulovou hmotnosťou sa sekvenoval nasledovnými bežnými spôsobmi, čím sa získala nasledovná sekvencia aminokyselín:
Proteín s molekulovou hmotnosťou 29 kDa, s predpokladanou toleranciou k varu a IR aktivitou sa znehybnil na PVDF membráne po separácii SDS PAGE a podrobil sa proteínovému sekvenovaniu amino-konca a 15 z prvých 17 zvyškov sa úspešne sekvenovalo. Proteín s molekulovou hmotnosťou 27 kDa izolovaný z Poa pratensis sa tiež sekvenoval na N-konci (Tabuľka 1) a zistilo sa, že má podobnú sekvenciu, z čoho sa dá usudzovať, že je z rovnakej skupiny proteínov. Z toho vyplýva, že u čeľade Gramineae existuje jediná skupina AFPs zodpovedných za toleranciu k varu a Rl aktivitu.
Tabuľka 1
Usporiadanie sekvencii N-konca proteínu tolerantného k varu a Rl aktívneho, s molekulovou hmotnosťou 29 kDa z Lolium perenne a proteínu s molekulovou hmotnosťou 27 kDa z Poa pratensis
Lolium -DEQPNTISGXNNTVRXG
Poa -AETPNTISGTNN
Príklad 5
Po prvotnej extrakcii so zmesou fenolu a chloroformu v pomere 1 : 1 nasledovala extrakcia chloroformom. Fenol denaturuje proteiny exponovaním
-15rezíduí hydrofóbnych aminokyselín a umožnením delenia výhodne na organickú fázu. Hydrofilnejšie nukleové kyseliny a uhľovodíky sa delia na vodnú fázu. Proteíny s výrazným stupňom glykozylácie sa tiež môžu deliť na rozhranie. Chloroform je prítomný, keďže protein sa delí efektívnejšie pri použití dvoch rozličných organických rozpúšťadiel a konečná extrakcia chloroformu odstráni akékoľvek zvyšné pozostatky fenolu.
Teplotné stabilný extrakt pripravený z listov rastlín Lolium perenne sa koncentroval približne desaťnásobne s použitím Amicon ultrafiltračnej komory s 10 kDalton uzavretou membránou. Výsledný koncentrát sa naniesol na Superdex 75 PC 3,2/30 gélový filtračný stĺpec prebiehajúci/pôsobiaci na mikroseparačnom systéme Smart (Pharmacia). Stĺpec sa eluoval s 50 mM Tris/CI tlmivým roztokom s pH 9,5 pri rýchlosti prietoku 0,05 ml/min a zozbierali sa 0,05 ml frakcie. Frakcie sa testovali na aktivitu inhibície rekryštalizácie ľadu a najaktívnejšie frakcie sa spoločne ponorili do kúpeľa. Tieto frakcie sa potom naniesli na Mono Q PC 1,6/5 stĺpec, ekvilibrovali v 50 mM Tris/CI tlmivom roztoku s pH 9,5 a tiež sa nechali prebiehať/pôsobiť na systéme Smart pri rýchlosti prietoku 0,1 ml/min. Po nanášaní a premývaní sa stĺpec eluoval s lineárnym gradientom 0 až 0,4 NaCI a zozbierali sa 0,1 ml frakcie. Frakcie sa testovali a aktivita eluovala ako jediný vrchol pri približne 0,1 M NaCI.
Aktívne frakcie sa nechali víriť v rovnakom objeme fenolu:chloroformu:izoamyl alkoholu (1:1 [24:1]) po dobu 1 minúty, potom sa centrifugovali pri 13 000 x g po dobu 30 minút. Vodná (hore) a organická (dole) fáza sa zozbierala oddelene, nebolo pozorované žiadne rozhranie. Obe fázy sa potom nechali vyzrážať pridaním desiatich dielov studeného acetónu a udržiavali pri -20 °C po dobu 16 hodín. Výsledné pelety sa resuspendovali v 50 mM Tris/CI tlmivom roztoku, testovali na Rl aktivitu a nechali prebiehať/pôsobiť na SDS PAGE.
Testovanie resuspendovaných frakcií ukázalo, že Rl aktivita sa úplne delí do vodnej fázy. V organickej fáze nebola žiadna Rl aktivita dokonca ani po denaturovaní/renaturovaní frakcií v 6 M hydrochloridu guanidinu. Toto bol nečakaný výsledok, pretože proteíny by sa mali deliť do organickej fázy, alebo glykoproteín do rozhrania. Avšak analýza SDS PAGE ukázala, že hoci väčšina proteínov bola v
-16organickej fáze, jeden proteínový pás so zjavnou molekulovou hmotnosťou 29 kDa bol viditeľný v aktívnej vodnej frakcii, ale chýbal v organickej fáze. Pás mal sfarbenie odlišné od ostatných proteínov a bol veľmi rozptýlený.
Podobná extrakcia fenol:chloroform sa uskutočnila na extrakte tolerantnom k varu pripravenom z listov trávy Poa pratensis var Barcelona aklimatizovaných na chlad. Táto extrakcia tiež ukázala prednostnejšie delenie Rl aktivity do vodnej fázy a proteín mal zjavnú molekulovú hmotnosť 27 kDa na SDS PAGE.
Sekvenovanie proteínu na N-konci proteínov potvrdilo, že sú identické s AFP opísanými v Príklade 4.
Príklad 6
Degenerovaný oligonukleotidové primer (Lol 1) sa vytvoril a syntetizoval z N-konca sekvencie proteínu (ASP-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE), ako GAYGARCARCCIAAYACIAT, kde y =C+T, R=A+G a Hnozín.
Prvý pás cDNA sa pripravil z RNA z 5pg 30-dňových listov Lolium perenne aklimatizovaných na chlad s použitím Superscript reverznej transkriptázy (Stratgene) a oligonukleotodového primeru OG1 (GAGAGAGGATCCTCGAG (t) 15) podľa návodu od výrobcu. 1 % prvého pásu sa použilo ako templát, spolu s Lol1 a OG1 primérmi, v PCR reakciách. Reakcie sa uskutočnili v termálnom cyklovači s použitím Taq DNA polymerázy (Gibco BRL) po 30 cyklov (1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 55 °C a 1 minúta pri 72 °C) po prvotnej denaturácii po dobu 2 minút pri 94 °C.
PCR výrobok s 600 bp sa zväčšil a následne čistil z 1 % agarózového gélu a klonoval na pTAg vektor (R&D systémy) podľa návodu od výrobcu. Klonovaný PCR výrobok sa sekvenoval na automatickom zariadení na sekvenovanie DNA Perkin
Elmer (Applied Biosystems) s použitím T3 a T7 primerov. Obsahoval otvorenú čítaciu konštrukciu dosť podobnú nasledovnej:
GAT GAA CAG CCG AAT ACG ATT TCT GGG AGC AAC AAT ACT GTC AGA
TCC GGG AGC AAA AAT GTT CTT GCT GGG AAT GAC AAC ACC GTC ATA
-17TCT GGG GAC AAC AAT AGT GTG TCT GGG AGC AAC AAC ACT GTC GTA AGT GGG AAT GAC AAT ACC GTA ACC GGC AGC AAC CAT GTC GTA TCA GGA ACA AAC CAT ATC GTT ACA GAC AAC AAC AAT AAC GTA TCC GGG AAC GAT AAT AAT GTA TCC GGG AGC TTT CAT ACC GTA TCC GGG GGG CAC AAT ACT GTG TCC GGG AGC AAC AAT ACC GTA TCT GGG AGC AAC CAC GTT GTA TCT GGA AGC AAC AAA GTC GTG ACA GAC GCT TAA a dedukovaná aminokyselinová sekvencia sa dosť podobala nasledovnej: D-E-Q-P-N-T-l-S-G-S-N-N-T-V-R-S-G-S-K-N-V-L-A-G-N-D-N-T-V- l-S-G-D-N-N-S-V-S-G-S-N-N-T-V-V-S-G-N-D-N-T-V-T-G-S-N-H-VV-S-G-T-N-H-l-V-T-D-N-N-N-N-V-S-G-N-D-N-N-V-S-G-S-F-H-T-VS-G-G-H-N-T-V-S-G-S-N-N-T-V-S-G-S-N-H-V-V-S-G-S-N-K-V-V-T-
D-A
Otvorená čítací rámec kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 12 kDa, ktorá je značne nižšia ako molekulová hmotnosť 29 kDa na SDS PAGE. Pozorovalo sa tiež, že kódovacia sekvencia obsahuje 6 rozpoznateľných glykozylačných miest (ASN-X-SER/THR) a značné množstvo SER a THR rezíduí, ktoré môžu byť tiež glykozylované. Z toho by vyplávalo, že pôvodný protein izolovaný a Lolium je vysoko glykozylovaný. Avšak protein, ktorý bol enzymaticky deglykozylovaný si stále zachováva aktivitu inhibície rekryštalizácie ľadu, z čoho vyplýva, že glykozylácie nie je nevyhnutná na to, aby bol protein aktívny.
Príklad 7
Za účelom dokázania, že cDNA z Lolium perenne opísaná v Príklade 6 kóduje AFP sa uskutočnila expresia kódovacej oblasti. Vytvoril sa kmeň metylotrofickej kvasnice Pichia pastorís obsahujúci Lolium AFP c DNA.
Lolium cDNA sa klonovala na pPIC9 vektor s a - faktor signálovou sekvenciou za účelom zabezpečenia sekrécie z bunky a glykozylácie. Všetky enzýmy boli z Boehringer Mannheim a použili sa podľa návodu od výrobcu.
Konštrukcia vyjadrovacích vektorov, transformácia a rast Pichia boli opísané v príručke Invitrogen Pichia Expression Kit (Version B).
-18Lolium cDNA sa klonovala na pPIC9 vektor ako PCR amplifikačný fragment s kompatibilnými reštrikčnými koncami na ligáciu na pPIC9 vektor, ktorá sa vyrobil s použitím cDNA ako templátu a primerov GTATCTCGAGAAAGAGATGAGCAGCCGAACAACGATT a TTAATTCGCGGCCGCCTGTAGGAAAAGTATGGTATATC, ktorými sa začínalo Xhol reštrikčné miesto na 5' konci a Not1 reštrikčné miesto na 3' konci amplifikačného fragmentu a ktoré zabezpečovali, že Lolium cDNA bola v rámci sekrečnej signálovej otváracej čítacej konštrukcie. Reakcie sa uskutočnili v termálnom cyklovači s použitím Taq DNA polymerázy a Pfu dokazovacieho čítacieho enzýmu (Boehringer Mannheim) po 30 cyklov (1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 55 °C a 1 minúta pri 72 °C). Všetky následné PCR reakcie sa uskutočnili pri rovnakých podmienkach, ale bez Pfu enzýmu. Xho1/Not1 cDNA fragment sa potom klonoval na Xho1/Not1 vylúhovaný pPIC 9 vektor a transformoval do kompetentných E. Coli buniek (kmeň XL1-modrý). Po transformácii sa umiestnili na LB platne s 50 gg ml ampicilínu a nechali rásť 16 hodín pri 37 °C. Potom sa transformanty rezistentné na ampicilín zozbierali a analyzovali na integráciu Lolium cDNA prostredníctvom PCR s použitím 5' AOX1 a 3' AOX1 primerov, ktoré boli syntetizované ako je to opísané v príručke Invitrogen Kit Manual.
Plazmidová DNA sa izolovala zo štyroch pozitívnych transformantov pomocou miniprep a linearizované vylúhovaním s Sali na transformáciu do buniek Pichia, ktoré boli vypestované a premyté ako je to opísané v Invitrogen Manual. Linearizovaná DNA po vylúhovaní bola elektroporovaná do buniek Pichia s použitím BioRad GenePulser podľa odporúčania a po pridaní ľadovo vychladeného 1 M sorbitolu bola rozotrená na MD platne, kde pri 30 °C po dobu 24 hodín vyrastali kolónie, až kým sa nestali viditeľné. 16 transformantov sa potom zozbieralo na čerstvé MM a MD platne a transformanty, ktoré rástli normálne na MD platniach, ale pomalšie na MM platniach sa vyselektovali. Tieto transformanty sa potom analyzovali pomocou PCR s použitím 5' a 3' AOX1 primerov a 8 pozitívnych sa testovalo na expresiu.
Najprv sa kolónie inokulovali na BMGY médium a nechali rásť 24 hodín pri 30 °C, potom sa bunky oddelili a preniesli na BMMY médium, kde sa indukovala
-19expresia a vrátili do 30 °C na ďalších 24 hodín. Po 24 a 48 hodinách sa pridal metanol do 0,5 % za účelom zachovania indukcie. Bunky sa potom odstránili centrifúgáciou a alikvotná časť média sa upravila tak, aby obsahovala 30 % sacharózy a potom sa testovala aktivita inhibície rekryštalizácie ľadu. Médium všetkých transformantov sa vyznačovalo výraznou Rl aktivitou, zatiaľ čo médium vyrobené rovnakým spôsobom z kontrolnej Pichia bez integrovanej Lolium cDNA nebolo aktívne vôbec.
Z uvedených príkladov vyplýva, že protein izolovaný z Lolium perenne a príslušná cDNA predstavujú Rl aktívny AFP.
Príklad 8
E. coli XL-1 modrá bola použitá pri všetkých krokoch klonovania; kultúry sa pestovali na 2YT médiu s ampicilínom alebo kanamycínom podľa výberu. Všetky oligonukleotidové primery sa syntetizovali na syntetizéri Perkin Elmer 381A DNA s použitím fosforamidovej metódy v súlade s odporúčaním výrobcov. Platne s mladou kultúrou sa pripravili umiestnením 2 ml bunkovej suspenzie Nicotiana bethiama na Petriho misku s obsahom 25 ml MS solí, B5 vitamínov (1 mg L kyseliny nikotínovej, 1 mg L pyridoxínu, 10 mg L tiamínu, 100 mg L inizitolu) + 1 mg L 2-4D, 0,2 mg L BAP & 0,8 % agaru. Bunky sa potom rozptýlili tak, aby pokrývali celý agar a potom prikryli sterilným filtračným papierovým diskom.
Selekčné médium = MS základné médium + 30 sacharózy, 0,2 mg L IAA, 1 mg I BAP, 0,9 % agaru + 500 mg L cefotaxímu & 100 mg kanamycínu.
Lol1 sekvencia kódujúca AFP a PR1a apoplastickú cieľovú sekvenciu sa
PCR amplifikovali s 5' a 3' oligonukleotidovými primermi vytvorenými za účelom generovania vhodných reštrikčných miest tak, aby sa mohli ligovať na BamHI mieste a zohriaty výrobok sa vložil do Ncol/EcoRI otvoreného pUC intermediálneho plazmidového vektora (Messing 1983). Lol1 AFP sa oddelene vložil do troch pUC vektorov za rozličné promotórové sekvencie (granulová väzba syntázy škrobu;
kruhový vírus na ružičkovom keli; dvojitý 35S vírus mozaiky ružičkového kelu).
-20Potom boli ďalej klonované na rastlinný transformačný binárny vektor a premiestnené do tabaku s použitím transformácie prostredníctvom Agrobacteríum.
PCR reakčné zmesi obsahovali 5 μΙ x10 Taq reakčnej tlmivej zmesi, 1 μΙ dNTPs, 1 μΙ 5' a 3' primerov (50 pmol μΙ), 1 μΙ templátu Lol1, 0,5 μΙ Taq polymerázy a 0,05 μΙ pfu dokazovacieho čítacieho enzýmu. Na skúmavky sa naniesol minerálny olej a podrobili sa 30 cyklom po 1 minúte pri 94 °C, 1 minúta pri 55 °C a 1 minúta pri 72 °C po prvotnom kroku denaturácie pri 94 °C po dobu 2 minút.
Vylúhovanie PCR amplifikačných výrobkov sa uskutočnilo s vhodnými reštrikčnými enzýmami v odporúčanom tlmivom roztoku (Boehringer Mann heim) pri 37 °C po dobu 16 hodín. Lúhovacie zmesi sa separovali na 1 % agarózovom géli a príslušné pásy sa odstránili a vyčistili s použitím Oiagen rýchlej DNA gélovej čistiacej sady podľa návodu od výrobcu.
Priložený a plazmidový vektor sa spojili s použitím T4 ligázy a 5 x 10 tlmivého roztoku v súlade s odporúčaním Stratgene pri 16 °C po dobu 16 hodín. Kompetentné bunky E. coli sa transformovali s použitím 2 μΙ ligačnej reakcie, umiestnili na platňu a nechali rásť cez noc pri 37 °C. Transformanty sa identifikovali pomocou PCR s použitím špecifických 5' a 3' primerov. Plazmidová DNA sa potom izolovala ako je to opísané v Maniatis, Zväzok 1 a správne usporiadanie potvrdilo reštrikčné lúhovaciu analýzu.
Priložené HindlII/EcoRI sa odstránili a ligovali ako predtým do HindlII/EcoRI vylúhovaného všeobecného rastlinného transformačného vektora (GPTV). Kompetentné E. coli sa transformovali a transformanty sa identifikovali pomocou PCR; následne sa sekvenovaním potvrdilo, že izolovaná plazmidová DNA bola správna.
Tri rozličné GPTV vektory sa oddelene transformovali na Agrobacterium tumafaciensis (kmeň LBA 4404) s použitím metódy zmrazovania a rozmrazovania (freeze thaw method) opísanej v príručke Plánt Molecular Biology PMAN A3/7.
Semená Nicotiana tabacum (var Petit Havana) boli povrchovo sterilizované po dobu 10 minút s roztokom 10 % chlornanu sodného a po trojitom prepláchnutí s destilovanou vodou sa preniesli na Murashige & Skoog základné médium + 3 %
-21 sacharózy + 0,9 % agaru. Semená sa pestovali dva týždne, následne sa preriedili na 2 na jednu nádobu a potom sa získali sterilné rastlinky pravidelným mesačným prestrihávaním do MS základného média + 3 % sacharózy + 0,9 % agar.
Bunky Agrobacterium obsahujúce vhodný plazmid sa kultivovali cez noc v • náleve Lennox (5g/l NaCI, 10 g/l extraktu z kvasníc, 10 g/l bactotryptónu a 15g/l agaru), potom sa 10 minút centrifugovali pri 3000 x g a resuspendovali v MS základnom médiu + 3 % sacharózy. Disky listov tabaku odrezávané sterilným korkovým vrtákom sa nainfikovali inkubovaním s kultúrou Agrobacterium po dobu 10 minút, potom sa vysušili na sterilnom filtračnom papieri a umiestnili rubom hore na plát s mladou kultúrou tabakových buniek.
Infikované listy boli inkubované pri 26 °C po dobu 2 dní pri svetelnej intenzite 2000 luxov a potom odstránili z plátov s mladou kultúrou a premiestnili na selekčné médium. Potom sa inkubovali pri 3000 luxoch, 26 °C, pri 16 hodinách svetla a 8 hodinách tmy a každé dva týždne sa premiestnili na čerstvé médium. Novo rastúce výhonky objavujúce sa na okrajoch disku sa premiestňovali na zakoreňovanie do MS základného média + 3 % sacharózy, 500 mg/l cefotaxímu & 100 mg/l kanamycínu.
Po zakorenení a vyrastení 3 až 4 listov sa jeden list z niekoľkých línií každej rastlinky plus z niekoľkých netransformovaných kontrolných rastliniek odstránilo za účelom testovania na RI. Pletivo listu sa umiestnilo do Eppendorfovej skúmavky a vylúčená miazga sa centrifugovala. Obsah sacharózy v miazge sa pred testovaním upravil na 30 % hmotn.
Niekoľko rastlinných línií z každej konštrukcie vykazovalo výraznú aktivitu inhibície rekryštalizácie. Extrakty z každej z kontrolných rastliniek nevykazovali žiadnu aktivitu. Tým sa jasne dokázalo, že Lol1 AFP bol transformovaný do tabaku, t.j. do rastliny, ktorá nemá vlastný AFP a úspešne sa prejavila ako aktívny proteín bez potreby aklimatizácie na chlad.
Rastliny na účely pestovania sa umiestnili do črepníkov s 50 % perlitu a 50 % rašelinovej zmesi a opätovne presadili na kvitnutie do miestnosti so striedaním 16 hodín svetla pri 26°C a 8 hodín tmy pri 22 °C. Kvety boli samoopeľované a semená sa uskladňovali pri +4°C.
-22Príklad 9
Aby sa dokázalo, že AFP podľa vynálezu nepotrebuje glykozyláciu na to, aby bol aktívny, exprimovala sa kódovacia oblasť v prokaryotickom systéme. Vytvoril sa kmeň Escherichia coli s obsahom AFP cDNA.
Lolium cDNA sa klonovalo na pET32 plazmid z Novagenu s obsahom tioredoxínu na vyjadrenie cieľového génu ako fúzovaného proteinu. Všetky enzýmy boli z Boehringer Mannheim a boli použité po návodu od výrobcu. Konštrukcia vyjadrovacích plazmidov, transformácia a rast E. coli sú opísané v príručkách Novagen pET systém a Promega Applications.
Lolium cDNA sa klonovalo na pET-32 plazmid ako PCR amplifikačný fragment, s kompatibilnými reštrikčnými koncami na ligáciu do viacnásobného klonovacieho miesta pET-32 plazmidu. Tento bol pripravený s použitím Lolium cDNA ako templátu a 5' oligonukleotidového primeru (TTTGCGCTCGAGTTAAGCGTCTGTCACGACTTTG a 3' oligonukleotidového primeru (TTTGCGCCATGGATGAACAGCCGAATACGATTTC), ktorými sa začína Ncol reštrikčné miesto na 5' konci a Xhol reštrikčné miesto na 3' konci amplifikačného fragmentu. Reakcie sa uskutočnili v termálnom cyklovači s použitím Taq DNA polymerázy na 25 cyklov (denaturácia pri 94 °C, zohrievania od 35 °C do 60 °C, expresia pri 72 °C). Všetky nasledujúce PCR reakcie sa uskutočnili za rovnakých podmienok. Ncol/Xhol PCR amplifikačný fragment sa potom klonoval na Ncol/Xhol vylúhovaný pET-32 plazmid a transformoval do kompetentných buniek E. coli (kmeň XL1-modrý). Po transformácii sa umiestnili na LB-ampicilínové platne a nechali rásť 16 hodín pri 37 °C. 10 transformantov rezistentných na ampicilín sa zozbieralo a analyzovalo na integráciu Lolium cDNA pomocou PCR s použitím pET protiprúdových a poprúdových primerov z Novagenu.
Plazmid DNA sa izoloval z 3 pozitívnych transformantov pomocou minprep a vylúhoval pomocou Xhol a Ncol na transformáciu do kompetentných buniek E. coli
BL21 (DE3) ako je to opísané v príručke pET systém. Transformované bunky sa umiestnili na LB-ampicilínové médium a inkubovali 24 hodín pri 37 °C spolu s kontrolnou vzorkou vyrobenou bez transformovaných BL21(DE3) E. coli.
-23Tri pozitívne kolónie transformantov sa vyselektovali, kultivovali v LBampicilínovom médiu a inkubovali 1 hodinu pri 37 °C do dosiahnutia O.D. (λ=600 nm) 0,6 a potom inokulovali do média s väčším objemom a pretriasli pri 37 °C. Keď O.D. dosiahlo 0,5, bunky sa indukovali IPGT na proteínovú expresiu po dobu 3 hodín, ako je to opísané v príručke pET systém.
Vyjadrené proteíny sa izolovali z cytoplazmy buniek E. coli, ako je to opísané v príručke pET systém; bunky sa zozbierali centrifugáciou, resuspendovali v HEPES tlmivom roztoku (25 mM HEPES, 10 mM MgCI2, 100 mM NaCI, 1 mM DTT, pH 7,5) a zničili pôsobením ultrazvukových vibrácií po dobu 10 sekúnd. Cytoplazmatické proteínové frakcie sa centrifugovali a kal sa zozbieral. Alikvotná časť kalu sa upravila tak, aby podiel sacharózy bol 30 % hmotn. a testovala sa na aktivitu inhibície rekryštalizácie ľadu, ako je to opísané v Príklade 3. Cytoplazmatický proteínový extrakt vykazoval významnú Rl aktivitu, zatiaľ čo cytoplazmatický proteínový extrakt vyrobený rovnakým spôsobom z kontrolnej vzorky buniek E. coli bez integrovania Lolium cDNA nevykazoval žiadnu aktivitu.
Fúzovaný proteín sa vyčistil pomocou stĺpca na afinitu ku kovom a tioredoxín sa odstránil vylúhovaním s trombínom. Identita rozštiepeného AFP sa potvrdila proteínovým sekvenovaním N-konca a tento rozštiepený proteín tiež vykazoval významnú aktivitu inhibície rekryštalizácie ľadu.
Z vyššie yuvedeného vyplýva, že ne-glykozylovaný mrazuvzdorný proteín Lolium perenne vyjadrený v E. coli si zachoval aktivitu inhibície rekryštalizácie ako fúzovaný výrobok s tioredoxínom aj po štiepení trombínom.
Claims (11)
1. Mrazuvzdorný proteín, ktorý môže byť odvodený od rastlín, u ktorých 40 % ich aminokyselín je zo skupiny serín, treonín a asparagín a ktorých aminokyselinová • sekvencia sa minimálne z 80 % prekrýva s nasledovnou sekvenciou:
D-E-Q-P-N-T-l-S-G-S-N-N-T-V-R-S-G-S-K-N-V-L-A-G-N-D-N5 T-V-l-S-G-D-N-N-S-V-S-G-S-N-N-T-V-V-S-G-N-D-N-T-V-T-GS-N-H-V-V-S-G-T-N-H-l-V-T-D-N-N-N-N-V-S-G-N-D-N-N-V-SG-S-F-H-T-V-S-G-G-H-N-T-V-S-G-S-N-N-T-V-S-G-S-N-H-V-VS-G-S-N-K-V-V-T-D-A ako aj modifikované verzie tohoto proteínu, u ktorých táto modifikácia materiálne neovplyvňuje vlastnosti inhibície rekryštalizácie ľadu.
2. Mrazuvzdorný proteín podľa nároku 1, ktorý môže byť odvodený od trávy.
3. Mrazuvzdorný proteín podľa nároku 1, kde prekrytie je aspoň 95 %.
4. Mrazuvzdorný proteín podľa nároku 1, kde prekrytie je 100 %.
5. Mrazuvzdorný proteín podľa nároku 1, ktorý bol modifikovaný gly kozy láciou.
-
6. Nukleokyselinová sekvencia, ktorá je schopná kódovať mrazuvzdorný proteín podľa nároku 1.
*
7. Nukleokyselinová sekvencia podľa nároku 6, ktorou je:
GAT GAA CAG CCG AAT ACG ATT TCT GGG AGC AAC AAT ACT GTC
AGA TCC GGG AGC AAA AAT GTT CTT GCT GGG AAT GAC AAC ACC
GTC ATA TCT GGG GAC AAC AAT AGT GTG TCT GGG AGC AAC AAC
ACT GTC GTA AGT GGG AAT GAC AAT ACC GTA ACC GGC AGC AAC
CAT GTC GTA TCA GGA ACA AAC CAT ATC GTT ACA GAC AAC AAC
-25AAT AAC GTA TCC GGG AAC GAT AAT AAT GTA TCC GGG AGC TTT
CAT ACC GTA TCC GGG GGG CAC AAT ACT GTG TCC GGG AGC AAC
AAT ACC GTA TCT GGG AGC AAC CAC GTT GTA TCT GGA AGC AAC
AAA GTC GTG ACA GAC GCT TAA aj s príslušnými alelami.
8. Mrazený potravinový výrobok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje mrazuvzdorný proteín podľa nároku 1.
9. Mrazený potravinový výrobok podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m, že je to zmrazená cukrovinka.
10. Spôsob získavania AFP podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že AFP sa pripravuje pomocou geneticky modifikovaného organizmu.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že organizmom je mikroorganizmus alebo rastlina.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9801408.7A GB9801408D0 (en) | 1998-01-22 | 1998-01-22 | Frozen food product |
| PCT/EP1998/008553 WO1999037782A2 (en) | 1998-01-22 | 1998-12-23 | Frozen food product |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10952000A3 true SK10952000A3 (sk) | 2001-02-12 |
Family
ID=10825736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1095-2000A SK10952000A3 (sk) | 1998-01-22 | 1998-12-23 | Mrazuvzdorný proteín, nukleokyselinová sekvencia, mrazený potravinový výrobok s jej obsahom a spôsob jeho získavania |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6852841B1 (sk) |
| EP (1) | EP1049783B1 (sk) |
| JP (1) | JP2002504316A (sk) |
| CN (1) | CN1183249C (sk) |
| AT (1) | ATE307205T1 (sk) |
| AU (1) | AU747087B2 (sk) |
| BR (1) | BR9814776A (sk) |
| CA (1) | CA2319118A1 (sk) |
| DE (1) | DE69831979D1 (sk) |
| GB (1) | GB9801408D0 (sk) |
| HU (1) | HUP0101252A3 (sk) |
| IL (1) | IL137256A (sk) |
| PL (1) | PL342578A1 (sk) |
| SK (1) | SK10952000A3 (sk) |
| TR (1) | TR200002101T2 (sk) |
| WO (1) | WO1999037782A2 (sk) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| GB9929696D0 (en) | 1999-12-15 | 2000-02-09 | Unilever Plc | Processes and organisms for the production of anti-freeze proteins |
| MXPA03010511A (es) | 2001-05-18 | 2004-03-02 | Danisco | Metodo para preparar una masa con una enzima. |
| AU2002352231A1 (en) * | 2002-01-04 | 2003-07-15 | Unilever Plc | Antifreeze proteins in vegetables |
| US7132263B2 (en) | 2002-09-09 | 2006-11-07 | Agrigenesis Biosciences Limited | Antifreeze proteins isolated from forage grasses and methods for their use |
| US7968767B2 (en) | 2002-09-09 | 2011-06-28 | Jeroen Demmer | Antifreeze proteins isolated from forage grasses and methods for their use |
| AU2003274102B2 (en) * | 2002-12-20 | 2007-01-25 | Unilever Ip Holdings B.V. | Preparation of antifreeze protein |
| JP4547545B2 (ja) * | 2003-09-29 | 2010-09-22 | 学校法人 関西大学 | 穀物種子抽出物およびその用途 |
| WO2005049835A1 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-02 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Ice recrystallisation inhibition protein or antifreeze proteins from deschampsia, lolium and festuca species of grass |
| US20050129810A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-06-16 | Good Humor- Breyers Ice Cream Division Of Conopco Inc | Frozen confectionery product |
| PL1791933T3 (pl) | 2004-07-16 | 2011-12-30 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Sposób enzymatycznego odgumowania oleju |
| EP1917865B1 (en) | 2006-10-20 | 2012-03-28 | Nestec S.A. | Ice-structuring peptides of lactic origin |
| JP5474809B2 (ja) | 2007-11-21 | 2014-04-16 | ロスキレ ユニバーシティ | 氷結合活性を備えたポリペプチド |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04505329A (ja) | 1989-05-10 | 1992-09-17 | ディーエヌエー プラント テクノロジー コーポレイション | 不凍化ポリペプチド |
| US5118792A (en) * | 1989-05-10 | 1992-06-02 | Dna Plant Technology Corporation | Ice crystal growth suppression polypeptides and method of making |
| WO1992022581A1 (en) * | 1991-06-13 | 1992-12-23 | University Of Waterloo | Cold tolerances in plants |
| WO1994003617A1 (en) | 1992-07-29 | 1994-02-17 | Unilever N.V. | Process for producing anti-freeze peptides |
| US5837545A (en) | 1993-01-21 | 1998-11-17 | Research Corporation Technologies, Inc. | Genes, polypeptides, and compositions for cold tolerance in plants |
| CA2104142A1 (en) | 1993-08-16 | 1995-02-17 | Fathey Sarhan | Dna molecule encoding freezing tolerance proteins in gramineae |
| US5646029A (en) | 1993-12-03 | 1997-07-08 | Cooperative Research Centre For Industrial Plant Biopolymers | Plant arabinogalactan protein (AGP) genes |
| US5676985A (en) | 1994-10-12 | 1997-10-14 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Antifreeze polypeptide-expressing microorganisms useful in fermentation and freezing of foods |
| JP2001505404A (ja) * | 1996-06-03 | 2001-04-24 | クイーンズ ユニヴァーシティー アット キングストン | ハマキガ抗凍結タンパク質、遺伝子及びこれらの使用方法 |
| ATE287451T1 (de) | 1996-07-26 | 2005-02-15 | Unilever Nv | Gefrorenes lebensmittelprodukt das hitzestabiles gefrierschutzprotein enthält |
| CZ25499A3 (cs) | 1996-07-26 | 1999-07-14 | Unilever N. V. | Mražený cukrářský produkt |
-
1998
- 1998-01-22 GB GBGB9801408.7A patent/GB9801408D0/en not_active Ceased
- 1998-12-23 EP EP98966702A patent/EP1049783B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-23 TR TR2000/02101T patent/TR200002101T2/xx unknown
- 1998-12-23 US US09/600,787 patent/US6852841B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-23 PL PL98342578A patent/PL342578A1/xx unknown
- 1998-12-23 IL IL13725698A patent/IL137256A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 CA CA002319118A patent/CA2319118A1/en not_active Abandoned
- 1998-12-23 JP JP2000528689A patent/JP2002504316A/ja not_active Withdrawn
- 1998-12-23 AU AU24188/99A patent/AU747087B2/en not_active Ceased
- 1998-12-23 CN CNB988139227A patent/CN1183249C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-23 BR BR9814776-5A patent/BR9814776A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 WO PCT/EP1998/008553 patent/WO1999037782A2/en active IP Right Grant
- 1998-12-23 HU HU0101252A patent/HUP0101252A3/hu unknown
- 1998-12-23 SK SK1095-2000A patent/SK10952000A3/sk unknown
- 1998-12-23 DE DE69831979T patent/DE69831979D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-23 AT AT98966702T patent/ATE307205T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1049783B1 (en) | 2005-10-19 |
| HUP0101252A3 (en) | 2002-06-28 |
| EP1049783A2 (en) | 2000-11-08 |
| CN1183249C (zh) | 2005-01-05 |
| WO1999037782A3 (en) | 1999-09-16 |
| DE69831979D1 (de) | 2006-03-02 |
| IL137256A (en) | 2004-01-04 |
| AU2418899A (en) | 1999-08-09 |
| WO1999037782A2 (en) | 1999-07-29 |
| US6852841B1 (en) | 2005-02-08 |
| GB9801408D0 (en) | 1998-03-18 |
| HUP0101252A2 (hu) | 2001-08-28 |
| TR200002101T2 (tr) | 2001-01-22 |
| ATE307205T1 (de) | 2005-11-15 |
| AU747087B2 (en) | 2002-05-09 |
| JP2002504316A (ja) | 2002-02-12 |
| IL137256A0 (en) | 2001-07-24 |
| BR9814776A (pt) | 2000-10-24 |
| CN1290300A (zh) | 2001-04-04 |
| PL342578A1 (en) | 2001-06-18 |
| CA2319118A1 (en) | 1999-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6156880A (en) | Frozen food product | |
| Kenward et al. | Type II fish antifreeze protein accumulation in transgenic tobacco does not confer frost resistance | |
| SK10952000A3 (sk) | Mrazuvzdorný proteín, nukleokyselinová sekvencia, mrazený potravinový výrobok s jej obsahom a spôsob jeho získavania | |
| AU2794495A (en) | Transgenic plants producing trehalose | |
| AU732169B2 (en) | Carrot antifreeze polypeptides | |
| CA2296005C (en) | Tenebrio antifreeze proteins | |
| CZ20002696A3 (cs) | Protimrazový protein | |
| US7132263B2 (en) | Antifreeze proteins isolated from forage grasses and methods for their use | |
| MXPA00007100A (en) | Frozen food product | |
| MXPA99000952A (en) | Frozen food product containing heat stable antifreeze protein |