CN117924448A - 一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途，所述原核表达的高活性植物抗冻蛋白是如下a)或b)的高活性植物抗冻蛋白：a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的高活性植物抗冻蛋白；b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有高活性植物抗冻蛋白活性的蛋白。本发明原核表达的高活性植物抗冻蛋白具备出色的低温稳定性，其高效的抗冻活性能显著提高产品在低温条件下的保存稳定性和使用寿命；本发明原核表达的高活性植物抗冻蛋白可以作为一种天然的防冻保鲜剂，或可用作提高产品在低温环境下的稳定性和使用寿命的添加剂，或可以保护敏感的生物药品不受冷冻伤害，其具有重要的商业价值和社会效益。

Description

一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

抗冻蛋白质是亦称作不冻蛋白质或AFP(抗冻蛋白质(Antifreeze protein))的物质，抗冻蛋白质也称冰结合蛋白(Ice Binding protein，IBPs)，能在低温下于冰晶或者低温敏感的物质如细胞膜、酶类等结合，抑制冰晶的形成和生长过程同时稳定低温敏感的物质。其抑制冰晶生长的活性被称为重结晶抑制活性(Recrystallization activity，RI)。由于由于植物自身强大的生命力以及本身结构对于冰晶具有一定程度的耐受，植物冰结合蛋白的热滞活性通常较低，其更倾向于长时间的阻止冰晶的生长，通常具有较高的重结晶抑制活性。常规的抗冻蛋白质显示出抑制冰结晶化和控制冰结晶形状等的效果，并伴有热滞活性。

在此，热滞是指：在蛋白质水溶液中，即使在平衡融点以下的温度、冰也不能生长的温度范围，如果将冰在水溶液中开始生长的温度定义为凝固点，则热滞作为平衡融点和凝固点之间的差被测出。随着对抗冻蛋白功能的深入研究，人们逐渐发现其在食品、化妆品、生物医药领域具有广泛的应用前景。

抗冻蛋白质是吸附在冰结晶表面上发挥上述作用的物质，用于在生物体中保护自身免受细胞冻结。这种抗冻蛋白质已经在例如鱼类、昆虫、植物、菌类、微生物等中被发现。然而，至今为止报道的抗冻蛋白质在鱼类、昆虫、植物、菌类、细菌等生物体内仅微量存在，提取效率非常差，即使大量存在，也存在着生物体本身难以捕获和培养的问题，因此难以通过工业生产并作为食品用途而使用。

此外，作为一种稳定且廉价的具有抗冻活性的抗冻蛋白质未必具有足够的抗冻活性。

发明内容

基于现有技术存在的技术问题，本发明提供一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途，本发明申请的抗冻蛋白质具备出色的低温稳定性。

依据本发明技术方案的第一方面，提供一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白，是如下a)或b)的高活性植物抗冻蛋白：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的高活性植物抗冻蛋白；

b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有高活性植物抗冻蛋白活性的蛋白。

依据本发明技术方案的第二方面，提供一种与上述原核表达的高活性植物抗冻蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码依据本发明技术方案的第一方面所述蛋白酶的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

任选地，所述载体包括表达载体以及转基因植物表达载体；

任选地，所述重组微生物包括工程菌或植物细胞。

优选的，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；

2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述高活性植物抗冻蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前述高活性植物抗冻蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

依据本发明技术方案的第三方面，提供一种上述的原核表达的高活性植物抗冻蛋白在制备抗冻剂中的应用。

依据本发明技术方案的第四方面，提供一种上述的生物材料在制备高活性植物抗冻蛋白或构建转基因植物或添加剂中的应用。

依据本发明技术方案的第五方面，提供一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白的制备方法，其利用上述生物材料制备高活性植物抗冻蛋白。

依据本发明技术方案的第六方面，上述蛋白或上述生物材料在制备生物样本的保护剂、农业保护剂、食品添加剂、化妆品添加剂、药物制剂的辅助材料中的应用。

依据本发明技术方案的第七方面，提供一种用于抗冻剂的生物合成产品，所述产品包括上述蛋白或上述生物材料。

本发明与现有技术相比，本发明原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途至少具有如下有益效果：

1、本发明的抗冻蛋白质具备出色的低温稳定性，这一特性使其在食品加工、化妆品制造及生物医药领域中有着广泛的应用前景。

2、本发明的抗冻蛋白质高效的抗冻活性能显著提高产品在低温条件下的保存稳定性和使用寿命。在食品工业中，可以作为一种天然的防冻保鲜剂；在化妆品领域，可用作提高产品在低温环境下的稳定性和使用寿命的添加剂；在生物医药行业，可以保护敏感的生物药品不受冷冻伤害。

3、本发明的抗冻蛋白质和其提取及应用技术，不仅填补了当前技术空白，也提供了一种新的、经济有效的工业生产途径，且所得产品适用于广泛的实际应用，具有重要的商业价值和社会效益。

附图说明

图1为依据本发明的制备原核表达的高活性植物抗冻蛋白的工艺流程图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明公开了一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途，其中一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白，是如下a)或b)的高活性植物抗冻蛋白：a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的高活性植物抗冻蛋白；b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有高活性植物抗冻蛋白活性的蛋白。本发明的蛋白质具备出色的低温稳定性，这一特性使其在食品加工、化妆品制造及生物医药领域中有着广泛的应用前景。其高效的抗冻活性能显著提高产品在低温条件下的保存稳定性和使用寿命。在食品工业中，可以作为一种天然的防冻保鲜剂；在化妆品领域，可用作提高产品在低温环境下的稳定性和使用寿命的添加剂；在生物医药行业，可以保护敏感的生物药品不受冷冻伤害，具有重要的商业价值和社会效。

具体地，本申请提出了一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途，所述原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法为一种创新的抗冻蛋白质及其生产方法，该方法旨在实现高效率、低成本的大规模生产。本发明的核心目标是向原料制造商提供高质量的抗冻蛋白质，这些蛋白质以及由它们衍生的多肽和组合物均表现出显著的抗冻活性，这使得它们可以广泛应用于食品、药品、化妆品和农业生产中。此外，本发明还包括了与这些蛋白质和多肽特异性结合的抗体，为研究和应用提供了重要工具。

本发明的重要性在于，现有技术中从萝卜中提取抗冻蛋白质的方法存在工艺复杂、成本高昂且产量不足的问题。为了克服这些挑战，本发明人进行了广泛研究，并最终发现了一种具有极高抗冻活性的植物源蛋白质，从而完成了本项发明。本发明的一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白及其制备方法和用途具体为一种新型的植物源抗冻蛋白质及其提取与应用方法，该抗冻蛋白质来源于萝卜，通过本发明独特的提取技术，克服了现有技术的局限性，实现了对植物抗冻蛋白质的高效提取和大规模生产。现有文献中记录的植物抗冻蛋白质虽然在自然界中的含量稀少，并且提取效率低下，但本发明通过优化萝卜的培育和收获流程，结合先进的生物工程技术，显著提高了目标蛋白质的产出率。

针对前人技术中提及的萝卜幼苗来源的冰结合蛋白质，本发明所涉及的抗冻蛋白质种类与之不同。本发明发现的抗冻蛋白质不仅在结构和功能上具有独特性，而且在提取工艺上更为简化和高效。本发明技术不仅减少了原材料的消耗，降低了生产成本，同时也提高了最终产品的纯度和活性。

更进一步，本发明的抗冻蛋白质具备出色的低温稳定性，这一特性使其在食品加工、化妆品制造及生物医药领域中有着广泛的应用前景。其高效的抗冻活性能显著提高产品在低温条件下的保存稳定性和使用寿命。在食品工业中，可以作为一种天然的防冻保鲜剂；在化妆品领域，可用作提高产品在低温环境下的稳定性和使用寿命的添加剂；在生物医药行业，可以保护敏感的生物药品不受冷冻伤害。

综上所述，本申请的抗冻蛋白质和其提取及应用技术，不仅填补了当前技术空白，也提供了一种新的、经济有效的工业生产途径，且所得产品适用于广泛的实际应用，具有重要的商业价值和社会效益

更具体地，本发明首先提供一种高活性植物抗冻蛋白，是如下a)或b)的高活性植物抗冻蛋白：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的高活性植物抗冻蛋白；

b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有高活性植物抗冻蛋白活性的蛋白。

本发明还提供与上述高活性植物抗冻蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码依据本发明技术方案的第一方面所述蛋白酶的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

任选地，所述载体包括表达载体以及转基因植物表达载体；

任选地，所述重组微生物包括工程菌或植物细胞。

优选地，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；

2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码依据本发明技术方案的第一方面所述高活性植物抗冻蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述高活性植物抗冻蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明还提供上述的高活性植物抗冻蛋白在制备抗冻剂中的应用。

本发明还提供上述的生物材料在制备高活性植物抗冻蛋白或构建转基因植物或添加剂中的应用。

本发明还提供一种高活性植物抗冻蛋白的制备方法，利用上述的生物材料制备高活性植物抗冻蛋白。

本发明还提供上述的蛋白或上述的生物材料在制备生物样本的保护剂、农业保护剂、食品添加剂、化妆品添加剂、药物制剂的辅助材料中的应用。

本发明还提供一种用于抗冻剂的生物合成产品，所述产品包括上述的蛋白或上述的生物材料。

本发明的抗冻方法包括将上述抗冻蛋白质和/或多肽添加至溶液中，用于抑制冰晶的形成和生长。

抗冻蛋白质在本发明中被广泛定义为具有抑制冰晶生长功能的蛋白质。任何通过公知方法(例如通过观察冰晶结构或测定其抑制冰晶生长的特性)表现出抗冻活性的蛋白质均属于本发明的范畴。

本发明的核心在于提供一种经过改良的抗冻蛋白，该蛋白能够在低温条件下有效地控制冰晶的生长与形状，以及应用于多个领域的抗冻配方和方法。本发明的抗冻蛋白质，可被定义为经过氨基酸序列的优化，即使在缺失、取代或添加一个或数个氨基酸后，仍保持或提高其原有的抗冻活性。在此，本发明特别强调氨基酸的变更数目的优选范围：理想情况下为一个，进而扩展至两个，不超过三个，以确保功能性与稳定性的最佳结合。

本发明还考虑到蛋白质的结构多样性，即抗冻蛋白质可能以单一亚基的形式存在，或作为亚基复合体的一部分，此复合体可通过解离实验来进一步研究其特性。本发明的抗冻活性特指蛋白质的能力，通过阻碍冰晶生长和改变其形状，从而抑制冰晶生长或其粗大化的过程，这一功能是通过蛋白质与冰晶表面的结合作用来实现的。

在实现本发明的方法上，抗冻蛋白质的来源灵活多变。自然界中，许多植物可作为抗冻蛋白质的来源，例如但不限于：十字花科的萝卜、西兰花等，伞形科的胡萝卜，百合科的葱，以及菊科的茼蒿等，及其相关品种和改良品种。此外，通过生物工程技术，如利用枯草芽孢杆菌或大肠杆菌等原核表达系统，也可以高效生产抗冻蛋白质。为保证食品级应用的安全性，可选用的枯草芽孢杆菌表达宿主包括但不限于WB800N、DB403、168等。

本发明的冰结晶化抑制物质并无特别限定，例如可从萝卜种子中适当获得。作为萝卜种类并无特别限定，例如潍县青萝卜、水果萝卜。另外，如果使用上述植物的幼苗，特别是使用作为萝卜芽的萝卜苗，则获得本发明涉及的第一抗冻蛋白质。

在本发明中，“类似品种”是指例如，科的类似品种为：即便是属于相同属的植物，在学术分类中也称作相近属的品种，具体植物的类似品种为：即便是属于相同科的植物，在学术分类中也称作相近科的品种。另外，“改良品种”是指通过人工选择、杂交、突变、基因重组等改良的植物。

植物的形态并无特别限定，可以是种子和植物体整体，例如，可以是种子、芽、叶、叶柄等的一部分。

本发明涉及的抗冻蛋白质，可以直接从植物中提取出，或通过低温驯化等方法诱导植物中抗冻蛋白质后，再进行提取。

为低温驯化的温度，并无特别限定，优选0℃以上且20℃以下。另外作为低温驯化的时间，并无特别限定，优选实施3天以上。

本发明涉及的第一抗冻蛋白质，可容易地提取、纯化、回收。作为所述提取方法，并无特别限定，例如，可通过使用了水或有机溶剂的公知的提取方法而获得。提取本发明涉及的第一抗冻蛋白质的溶剂并无特别限定，可将选自水、亲水性有机溶剂、超临界二氧化碳、亚临界水等中的1种以上的溶剂适当地组合使用。

作为亲水性有机溶剂，例如，可列举甲醇和乙醇等，优选可以用于食品加工的溶剂，例如乙醇等。上述溶剂中优选水、乙醇。此外，也可以将水和有机溶剂混合使用。经加温的水或有机溶剂的温度并无特别限定。例如优选0℃以上、进一步优选20℃以上，此外，优选160℃以下，进一步优选120℃以下。此外，作为水性溶剂，可列举醋酸钠等各种缓冲液、乙醇与水的混合溶剂等，但不限于此。可以根据待提取的植物体的种类和量而适当地选择提取溶剂的种类和量。

可以根据需要将本发明涉及的抗冻蛋白质进一步纯化。例如，可通过将倾析、过滤、离心分离等适当组合来除去杂质成分。此外，可通过例如盐析、使用有机溶剂沉淀、亲和层析色谱法、离子交换柱色谱法、凝胶过滤等纯化，通过适当组合透析和超滤等来进行浓缩。

上文中说明的本发明涉及抗冻蛋白质，可根据需要，进一步将其固化为粉末状或颗粒状等任意形态。固化的方法并无特别限定，可以列举例如:按照喷雾干燥或冷冻干燥等常规方法对上述提取物进行粉末化的方法，将提取物吸附并担载于赋形剂上，进而固化为粉末或颗粒状的方法等。上述操作为本领域技术人员所公知的，可以根据用途适当地选择使用。可以使用本发明涉及的抗冻蛋白质阻止冰晶的形成。例如，可以在食品领域、医药领域、农业领域、化妆品领域等使用。

在食品领域中，通过抑制食品中含有的水的冰结晶化，可以防止该食品口味的劣化等。例如，防止淀粉老化，可以抑制食品的口味与品质等的劣化，所述劣化是由于食品中的水发生冰结晶化，物理地压迫蛋白质和油脂成分等，产生结构变化，从而导致的口味与品质等的劣化。

进一步地，萝卜源抗冻蛋白的添加，是一种创新的食品保鲜与加工技术。在食品工业中，该蛋白质的应用主要聚焦于其卓越的降低冰点能力，这使得食品在冷藏或冷冻过程中得以维持原有的口感和营养品质。特别是在冰淇淋、冷饮及其他冷藏食品的生产中，通过精准控制抗冻蛋白的加入量，可以在不影响食品原有风味的前提下，显著提升其抗冻性。进一步的应用还涉及将萝卜抗冻蛋白通过高效的真空渗透技术整合入水果和蔬菜的保存过程中，以此来防止冷藏或运输阶段中的水分流失、质地软化以及微生物导致的腐败现象，极大延长了食品的货架寿命。

在化妆品领域中，可以将其用作防止化妆品品质劣化等的添加剂。例如，在将含有油脂成分的化妆品冷冻时，该化妆品中含有的水发生冰结晶化，物理地压迫该油脂成分，从而破坏其结构，导致品质及使用感发生劣化。如果使用本发明涉及的抗冻蛋白质，通过防止水的冰结晶化，可以保持油脂成分的结构，从而可以抑制品质的劣化等。

进一步地，萝卜抗冻蛋白的应用代表了一种突破性的创新。这种蛋白不仅能够提升化妆品在低温环境下的稳定性，还能够有效延长产品的有效期限，确保了消费者在不同环境下均能获得一致的使用体验。除此之外，由于萝卜抗冻蛋白的良好保湿特性和对紫外线的防护效果，使其在面部护理品(如滋润面霜、精华液)及色彩化妆品(如口红)中的应用日益广泛。此外，利用其对产品稠度和粘度的调控作用，可以进一步优化化妆品的质地，从而提升用户的感官体验和应用效果。

在医疗领域中，可以将其用作冷冻保存生物样品时的保护剂。例如，将细胞、血液、器官等组织等的生物样品放入现有已知的保存液中冷冻保存时，保存液中的水分冻结产生冰结晶，有时该冰结晶会对生物样品造成损伤。然而，如果添加本发明涉及的抗冻蛋白质，则可以抑制冰结晶的产生和生长，因此可以保护生物体样品不受冰结晶所造成的损伤。

进一步地，萝卜抗冻蛋白的功能被拓展至药物制剂的辅助材料。其主要作用在于维护药物在低温储存或运输过程中的稳定性，从而显著提高药品的储存周期及治疗效果。针对生物制药过程中对温度敏感的药物成分，萝卜抗冻蛋白能有效保护其结构不被破坏，尤其是在疫苗、血液制品以及细胞治疗药物等领域表现出巨大的应用潜力。研究亦证实，萝卜抗冻蛋白在低温环境下能够有效维持细胞膜的完整性，调节细胞内外液的平衡，提高细胞对极端环境的耐受力和生存力，为生物医药产品提供了一个全新的保护。

本发明的抗冻蛋白质的形态根据用途各异，可以是直接使用、溶液、浓缩液、悬浮液、冷冻干燥物、粉末、颗粒、片剂等。

此外，本发明涉及的抗体为与上述抗冻蛋白质和/或上述多肽特异性反应的物质，可用于测试在植物中有无该抗冻蛋白质和多肽，或从蛋白质混合物中确定该抗冻蛋白质和多肽。

发明涉及的抗体可根据常用方法制备。例如，通过使用上述抗冻蛋白质和多肽使小鼠、大鼠或兔子等产生免疫反应，并通过将产生该抗体的免疫细胞、脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，进而筛选产生能与上述抗冻蛋白质和多肽特异性反应的抗体的细胞株。培养该细胞株系，并分离纯化得到其分泌的单克隆抗体。

本发明抗冻蛋白质的抗冻活性的测定方法，可以根据植物的种类等进行适当选择。例如，可通过冰结晶结构的观察、抗冻活性的测定等公知的方法来进行，用任意方法确认到抗冻活性提高的情况，均包含在本发明的范围内。抗冻活性的测定，可以按照下述方法进行:例如，将含有23％(w/v)蔗糖的植物提取物溶液冷却至-40℃后，再升温至-6℃，测定通过显微镜观察的冰结晶的平均面积。抗冻活性越强，则该冰结晶的平均面积变得越小，因此，以该数值作为指标，可以定量地评价植物提取物的抗冻活性。与对照相比，只要添加了抗冻蛋白质时冰结晶的形成得到轻微抑制，则判断具有抗冻活性。

本发明提取物的蛋白质含量的测定方法，并无特别限定，可以按照例如考马斯亮蓝法、(Bicinchoninic acid)(BCA)法等公知的方法进行。作为标准蛋白质，并无特别限定，例如牛血清白蛋白(BSA)。

本发明的抗冻蛋白质例如可从作为食品的萝卜苗等各种植物中获得，为此，本发明涉及的抗冻蛋白质对生物体的安全性非常高。此外，本发明涉及的抗冻蛋白质可通过枯草芽孢杆菌大量制备(但按照本发明中的方法制备的蛋白，未必具有足够的活性和产量)。进一步地，通过在食品中添加本发明的抗冻蛋白质，可帮助维持冷冻食品的品质。此外，本发明的抗冻蛋白质和含有该蛋白质的组合物，可有效地用作器官和细胞、血液和血小板等血液成分冷冻保存中的生物体样品保护剂、和具有皮肤保护作用的化妆品等。

本发明的抗冻蛋白质在下述工业中应用具有明显的有益效果。

一、食品工业中的萝卜抗冻蛋白应用。

本发明涉及一种萝卜来源的抗冻蛋白，在食品工业中的应用，该蛋白具有显著提升食品在低温条件下防冻性能的能力。其应用能确保食品在冷藏或冷冻过程中维持其天然口感和营养质量，从而延长保质期，减少食品在低温储存过程中的水分流失、质地软化和微生物变质的可能性。萝卜抗冻蛋白的引入，特别在冷冻食品如冰激凌、冷冻奶制品、冷藏肉类和饮品中，能够通过其小分子分解特性，作为一种天然添加剂增强乳化、稳定化及塑形效果，进而提升最终产品的感官质量和消费者的食用体验。

二、化妆品工业中的萝卜抗冻蛋白应用。

本发明还揭示了萝卜抗冻蛋白在化妆品工业中的多重应用。作为一种天然的化妆品添加剂，萝卜抗冻蛋白可以显著提高产品在低温状态下的稳定性和耐用性。在面对寒冷气候时，化妆品融合了萝卜抗冻蛋白，能够保持其性状不变，延长保质期，确保了在各种温度条件下的安全使用。此外，抗冻蛋白具备卓越的保湿和紫外线防护能力，可以用于制作防晒、保湿化妆品如面霜、精华、口红等，同时增强产品的稠度与黏度，优化用户体验。

三、生物医药领域中的萝卜抗冻蛋白应用。

在生物医药领域，本发明提供了一种利用萝卜抗冻蛋白提高药物稳定性和效能的新途径。作为一种药用辅料，萝卜抗冻蛋白可在药物制剂中发挥关键作用，尤其是在低温储存和运输过程中，能够保护药物成分不受温度波动的影响，维持药效。同时，萝卜抗冻蛋白在生物医药技术中的应用亦十分广泛，如在细胞和组织冻存、蛋白质凝胶电泳等领域，萝卜抗冻蛋白可以有效保护细胞膜的结构完整性，提高生物样本的存活率和实验准确性。此外，其在缓释剂制备和生物反应器构建等方面的应用，为生物技术产品的创新提供了新的材料选择。

下面结合具体实施例及附图1，进一步说明本发明。

实施例1：原核表达载体的构建

使用材料：

pHT43表达质粒及枯草芽孢杆菌菌株WB800N由华东师范大学植物生理与分子生物学实验室保存。Dca-3抗体由华安生物公司制备。其它化学试剂由生工公司提供。

目的基因获得：

从Tair网站下载获得拟南芥Dca-3蛋白氨基酸序列，将序列导入NCBI，通过Blast找到在萝卜中的同源序列。

通过擎科公司制备对应引物，从萝卜品种潍县青幼苗的cDNA中扩增目的基因片段，连接至质粒pHT43(商业购买)上并通过擎科公司测序，结果与序列一致。最后通过化学转化方法转化入枯草菌株WB800N(商业购买)中，并检测到胞外表达。Dca-3蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的核苷酸如SEQ ID No.2所示。

实施例2：原核蛋白提取液的制备

培养基配方：

蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，调节PH至6.5，121℃灭菌15min。

制备方法：

(1)培养基配制：按要求配制相应培养基，灭菌待用。

(2)种子液活化：甘油枯草芽孢杆菌菌平板划线，37℃培育14小时，挑取单克隆37℃220rpm培育10小时作为种子液；

(3)发酵：以1％接种量重新接种于发酵培养基，37℃220rpm下进行3小时～6小时的活化培养，至OD600为1.0，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在37℃220rpm下摇菌12小时以诱导表达。

(4)回收样品：4000rpm离心10分钟，收集上清液；

(5)检测：按相关标准按相关标准进行活菌数、菌落总数、致病菌等项目检测，进行抗冻活性和应用活性检测。

实施例3：原核蛋白提取液的制备

培养基配方同实施例2。

制备方法：

(1)培养基配制：按要求配制相应培养基，灭菌待用。

(2)种子液活化：甘油大肠杆菌菌平板划线，37℃培育14小时，挑取单克隆37℃220rpm培育10小时作为种子液；

(3)发酵：以1％接种量重新接种于发酵培养基，37℃220rpm下进行3小时～6小时的活化培养，至OD600为1.0，加入终浓度为1mM IPTG，在37℃220rpm下摇菌12小时以诱导表达。

(4)蛋白富集：4000rpm离心10分钟，收集沉淀，使用0.1M PBS缓冲液重悬；

(5)样品溶液制备：超声裂解，功率40％，超声5秒，停10秒，持续15分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液；

(6)检测：按相关标准按相关标准进行活菌数、菌落总数、致病菌等项目检测，进行抗冻活性和应用活性检测。

(7)合格品根据活性稀释/浓缩后贴标；

实施例2～实施例3蛋白浓度和抗冻活性的测定

(1)蛋白浓度的测定：

按BCA法进行。

(2)抗冻活性的测定：

在实施例2和3的溶液中，46％蔗糖和各稀释样品1：1混合加入液氮，取出双层玻璃片并用75％乙醇清洗擦干，取1μL制好的样液滴在下玻璃片中央，再盖上上玻璃片压平。通过选择Link软件的冰晶抑制活性测定程序：一阶段，降至0～1℃，第二阶段降至-40℃，第三阶段，上升至-6℃，第四阶段，稳定在-6℃下30分钟，在此过程中拍照记录冰晶状况，通过Image或PS计数冰晶总数目以及每个冰晶大小，观察其大小分布情况。

表1检测结果

根据表1可知，随着蛋白浓度的增加，样品Dca-3的抗冻活性随之增加，并且实施例2得到的蛋白溶液同等目的蛋白浓度活性高于实施例3得到的样品溶液。

实施例2～3通过SDS-PAGE测定分子量

使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12％凝胶)，对实施例2～3的样品于90V下电泳90分钟。将电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色，使蛋白质带可视化。从凝胶染色的结果，确定Dca-3为50kD蛋白。

实施例4-1从萝卜苗中提取抗冻蛋白质

将200g萝卜苗液氮研磨粉碎，用50mL 10mM HEPES常温提取5分钟，冻干成干粉后复融为5mL，作为粗提液。

实施例4-2热处理

用恒温槽对40mL实施例4-1获得的粗提取液、于100℃热处理10分钟后，进行离心分离15分钟(10,000×g)。回收离心分离后的上清液。

实施例3蛋白质浓度、抗冻活性以及Dca-3含量测定；

(1)蛋白浓度的测定：

按BCA法进行。

(2)抗冻活性的测定：

在实施例2和3的溶液中，46％蔗糖和各稀释样品1：1混合加入液氮，取出双层玻璃片并用75％乙醇清洗擦干，取1μL制好的样液滴在下玻璃片中央，再盖上上玻璃片压平。通过选择Link软件的冰晶抑制活性测定程序：一阶段，降至0～1℃，第二阶段降至-40℃，第三阶段，上升至-6℃，第四阶段，稳定在-6℃30min，在此过程中拍照记录冰晶状况，通过Image或PS计数冰晶总数目以及每个冰晶大小，观察其大小分布情况。

Dca-3量测定：

根据DCa-3的序列，设计特定抗体3789进行检测。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12％凝胶)，对实施例4-1和4-2的样品于90V下电泳90分钟。对电泳胶用330mA电泳60分钟，将电泳后的凝胶转移到PVDF膜上，使用抗体3789进行孵育，再使用二抗进行孵育，后通过显影液进行可视化。从化学发光的结果，确定在实施例4-1中存在Dca-3，在实施例4-2中不存在Dca-3。

表2检测结果

	实施例4-1	实施例4-2	对照
				冰晶平均面积	289	772	800
蛋白质浓度/μg/mL	600	100	0

根据表2可知，在热处理后实施例4-2的抗冻活性有显著下降，同时通过WB的方式发现热处理后总蛋白含量和Dca-3显著下降，证明Dca-3作为重要的抗冻蛋白质之一，这种方法制备的产物有一定的热稳定性限制。

实施例5：效果验证实验

1、以发酵面团生产为例：

面粉：5kg，水3kg，实施例2，实施例4-1制备得到的蛋白溶液4mL，安琪酵母0.05kg。混合搅拌均匀。制作成面饼和面条。-6℃冷冻10天。取出后发1小时，蒸20分钟，冷却后检测质构。

阴性对照：面粉：5kg，水3kg，，安琪酵母0.05kg，等蛋白浓度的BSA溶液4mL，混合搅拌均匀。-6℃冷冻10天。

阳性对照：面粉：5kg，水3kg，，安琪酵母0.05kg，混合搅拌均匀。

表3实施例2和实施例4-1用于发酵面团的质构结果

根据表3可知，而从质构特点来看，煮熟的面条其硬度、黏度和拉断力显著降低，附着性、弹性和咀嚼性显著增加，这表明经过反复冻融的面团更加软烂，口感更差。采用本发明所述的发酵液制得的面团外表更加光滑，组织细腻，切面气孔更为均匀；面团更Q弹：呈海绵状有更明显弹性，咀嚼感明显。可以看出，本发明所述的发酵液制得的面团在冷冻处理后具有更好的口感，且更有韧性。

2、以酵母菌保护效果为例：

首先选择冷敏感的酵母菌株摇菌过夜。接下来将菌液和实施例2溶液以1：9的比例混合，并测量活菌数(AFU/mL)。随后，将剩余的混合溶液-20℃冷冻24小时，再次测量活菌数(AFU/mL)。将剩余的混合溶液-20℃冷冻96小时，再次测量活菌数(AFU/mL)。最后，比较冷冻前后的活菌数，以评估不同样品溶液的细胞膜保护活性。以最大等浓度的BSA溶液作为对照组。

表4实施例2用于酵母菌冷冻保护的结果

根据表4可知，通过实施例2得到的Dca-3对酵母菌具有良好的冷冻保护效果。

如图1所示的制备原核表达的高活性植物抗冻蛋白的工艺流程，其包括以下步骤：

步骤S1-1，以萝卜苗作为研究对象；根据抗冻蛋白质特点以及培育的难度，推测抗冻蛋白质在萝卜幼苗中丰度相对较高，同时制备也相对简单，因此以萝卜苗作为研究对象；

步骤S1-2，萝卜品种的选择；收集来自全国各地的十余种萝卜进行研究，并选择萝卜品种；

步骤S1-3，萝卜种子暗培养；将萝卜种子黑暗环境下培养48小时，使其萌发；

步骤S1-4，萝卜幼苗光培养；将萌发的萝卜幼苗在光照条件下培育4～5天，使其生长至合适的时期；

步骤S1-5，4℃冷诱导抗冻蛋白质；将生长好的萝卜苗转移至4℃环境低温处理一段时间，诱导其体内的抗冻蛋白质的大量表达；

步骤S1-6，研磨浸泡萝卜苗；将诱导好的萝卜苗液氮研磨粉碎，并浸泡在特定的溶剂中，将蛋白质释放至溶剂中；特定的溶剂优选为PBS溶剂或PBS溶液，更优选地为50mM(毫摩尔每升)PBS溶液。

步骤S1-7，检测蛋白溶液的抗冻活性；通过实施例2中抗冻活性检测方法以及实施例5-2的检测方法，检测蛋白溶液的抗冻活性；

步骤S2-1，抗冻蛋白质基因的筛选；通过转录组分析找到低温下萝卜表达上调的基因，从中找出可能具有高抗冻活性的蛋白质，并得到其基因序列；

步骤S2-2，构建原核表达载体；设计引物以冷诱导的萝卜苗的cDNA为模版，得到抗冻蛋白的序列，并将其连接至大肠杆菌或枯草芽孢杆菌质粒表达载体，构建重组表达载体；

步骤S2-3，载体菌株表达；选择合适的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌表达菌株，将步骤S2-2中得到的质粒表达转化至表达菌株中；

步骤S2-4，诱导表达；根据表达载体上的诱导启动子，使用不同的诱导剂诱导重组载体在表达菌株中进行表达；

步骤S2-5，提取纯化抗冻蛋白；通过连接的蛋白标签或者通过分子筛和离子筛乃至冰亲和吸附等相关技术，对发酵液中的抗冻蛋白进行提取和纯化；

步骤S2-6，对蛋白进行分析；对于步骤S2-5中提取纯化的蛋白，通过WB的方法使用构建的特异性抗体对其进行鉴定，或通过蛋白质测序对得到的蛋白质进行鉴定

步骤S2-7，检测蛋白溶液的抗冻活性；通过实施例2中抗冻活性检测方法以及实施例5-2的检测方法，检测蛋白溶液的抗冻活性。

本发明的萝卜抗冻蛋白不仅提高了食品和化妆品的质量与安全性，还在生物医药领域中展现出了广阔的应用前景和潜力，且可能通过增强萝卜本身的营养价值和保健功效，为消费者提供更多的健康益处。

特别是，在当前健康意识提升的大环境下，萝卜抗冻蛋白在营养学和健康食品领域的潜在应用也被逐步挖掘。萝卜本身已知含有丰富的维生素C和抗氧化剂，这些成分对于预防疾病和维持身体健康至关重要。通过将抗冻蛋白应用于萝卜或其他蔬菜中，可以不仅增强其在低温条件下的保存能力，而且还可能通过生物强化的方式增加其营养素含量，使得萝卜成为一种具有额外保健功效的食材。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白，是如下a)或b)的高活性植物抗冻蛋白：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的高活性植物抗冻蛋白；

b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有高活性植物抗冻蛋白活性的蛋白。

2.与权利要求1所述原核表达的高活性植物抗冻蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)，编码权利要求1所述酶的核酸分子；

B2)，含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)，含有B1)所述核酸分子的重组载体，

B4)，含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)，含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)，含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)，含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)，含有B4)所述重组载体的重组微生物；

任选地，所述载体包括表达载体以及转基因植物表达载体；

任选地，所述重组微生物包括工程菌或植物细胞。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；

2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述高活性植物抗冻蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述高活性植物抗冻蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的原核表达的高活性植物抗冻蛋白在制备抗冻剂中的应用。

5.权利要求2所述的生物材料在制备高活性植物抗冻蛋白或构建转基因植物或添加剂中的应用。

6.一种原核表达的高活性植物抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，利用权利要求2所述的生物材料制备高活性植物抗冻蛋白。

7.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的生物材料在制备生物样本的保护剂、农业保护剂、食品添加剂、化妆品添加剂、药物制剂的辅助材料中的应用。

8.一种用于抗冻剂的生物合成产品，所述产品包括权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的生物材料。