KR102061671B1 - 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법 - Google Patents

저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102061671B1
KR102061671B1 KR1020180057804A KR20180057804A KR102061671B1 KR 102061671 B1 KR102061671 B1 KR 102061671B1 KR 1020180057804 A KR1020180057804 A KR 1020180057804A KR 20180057804 A KR20180057804 A KR 20180057804A KR 102061671 B1 KR102061671 B1 KR 102061671B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
candida
yeast
spawn
solution
survival rate
Prior art date
Application number
KR1020180057804A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190132819A (ko
Inventor
박희동
김다혜
이새벽
최규택
김동환
전준영
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020180057804A priority Critical patent/KR102061671B1/ko
Publication of KR20190132819A publication Critical patent/KR20190132819A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102061671B1 publication Critical patent/KR102061671B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법 및 저장성 증대방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법 또는 저장성 증대방법에 따르면, 기존 열풍건조 대비 열에 의한 손상을 방지할 수 있고 기존 동결건조 대비 훨씬 적은 에너지와 비용으로 종균을 제조할 수 있다. 또한 캔디다 잼플리니나 효모에 따른 최적 조건으로 제조된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 생존율 및 저장성을 증대시킬 수 있어 토착효모의 종균화 및 상업화와 더불어 국내 과실주의 고품질화에 기여할 수 있으며, 와인 산업에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법{Optimal manufacturing methods of Candida zemplinina starters which produce high level of aromatic compounds using air-blast drying technology}
본 발명은 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법 및 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법에 관한 것이다.
인류 역사에 있어서 와인은 가장 오래된 알코올음료이며, 유럽지역에서 내수용으로 생산 되었던 와인은 점차 세계 각국으로 알려지면서 생산과 소비시장이 확대되었다. 국내 와인 소비는 2008년까지 10년 동안 매년 두 자리 수의 성장을 하였으며, 2015년 상반기에는 처음으로 와인 수입액이 위스키, 브랜디와 같은 양주의 수입액을 앞지른 것으로 나타났다. 이렇듯 와인에 대한 관심은 높아졌으나, 국내 와인 시장의 많은 부분을 수입 와인이 차지하고 있다. 국내 와인 업계는 매출 규모나 업체 수는 외형적으로 늘어나고 있지만 경쟁력 강화를 위한 다양한 상품개발을 실행하지 못하고 있다. 국내 와인의 경쟁력 향상을 위해 국내에서는 포도, 머루, 감, 사과 등 다양한 과일로 와인을 제조하고 있으며, 포도, 머루, 감, 오미자 등 국산 와인 양조에 적합한 양조용 효모 분리 및 와인 품질 개선에 관한 연구가 진행되고 있다.
와인은 과실과 효모, 곰팡이, 박테리아 사이의 복잡한 상호작용의 산물이다. 이러한 미생물들은 발효 과정에서 포도당과 기타 성분을 여러 가지 2차 최종산물로 대사시켜 와인의 특성과 개성을 한 차원 높여준다. 와인의 향기는 다양한 방향족 특성을 지닌 화합물로 구성되며, 와인 속 1000가지 이상의 휘발성 화합물 중 400개 이상은 발효 중 효모가 생산한다. 이러한 화합물들의 성질과 농도는 발효를 하는 효모의 종에 의해 결정되기 때문에, 와인의 향기성분은 발효에 사용하는 효모의 종에 따라 달라진다고 할 수 있다. 최근에는 일반적으로 와인발효에 사용하는 효모인 Saccharomyces cerevisiae종 이외에 와인의 풍미와 품질의 향상에 기여 한다고 알려진 non-Saccharomyces 종에 관한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 non-Saccharomyces 효모는 혐기성 및 호기성 성장이 가능하며, 발효 중에 Saccharomyces 효모와 경쟁하여 2차대사산물을 생산함으로서 와인의 부케(Bouquet)에 영향을 미칠 수 있다.
한편 대부분의 와인 효모들은 동결건조법을 이용해서 건조시킨 분말상태로 유통된다. 동결건조법을 이용하면 효모의 장기 생존력이 우수하고 유통하기가 용이하기 때문에 미생물 보존에 널리 사용된다. 그러나 이러한 동결건조법은 건조 시간이 길고 에너지와 비용의 소모가 크기 때문에 상업적 사용에는 어려움이 있는 실정이다.
건조 과정에서 미생물 세포의 생존율에 영향을 주는 것은 초기 미생물 농도, 보호첨가제, 재수화 조건 등이 있다. 이 중 보호첨가제로는 당류, 아미노산, 비타민 등이 있으며 미생물 종에 따라 첨가제에 의해 보호되는 정도가 다르다. 또한 건조된 미생물은 재수화 과정을 통해 회복되며, 마찬가지로 미생물 종에 따라 가장 적절한 재수화 조건이 다르기 때문에 미생물 종에 따른 최적 조건을 확립하는 것이 중요하다.
이에 본 발명자들은 토착 효모의 종균화와 향기가 우수한 국산 와인 개발을 위하여, 국내에서 재배되는 감에서 분리한 토착 효모와 사과, 아로니아에서 분리한 효모들 중 향기가 우수한 non-Saccharomyces 효모를 선정하였다. 또한 분리 효모의 분말화를 위해 저온송풍건조법, 건조 보호제, 재수화 용액 및 항산화제를 이용하여 각 건조 효모의 생존율을 높일 수 있는 조건을 연구하던 중 저온송풍건조 기법을 이용한 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법 및 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (S1) 캔디다 잼플리니나(Candida zemplinina) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계; (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및 (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (S1) 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계; (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및 (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하며, 상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v) 탈지유; 및 5 내지 15 %(w/v) 수크로오스;를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 건조 보호용 조성물은 비타민 C 또는 글루타티온을 4 내지 7 mM 더 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 재수화 용액은 0.5 내지 1 % NaCl 용액인 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 한세니아스포라 우바룸 효모 종균의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (S1) 캔디다 잼플리니나(Candida zemplinina) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계; (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및 (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법 또는 저장성 증대방법에 따르면, 기존 열풍건조 대비 열에 의한 손상을 방지할 수 있고 기존 동결건조 대비 훨씬 적은 에너지와 비용으로 종균을 제조할 수 있다. 또한 캔디다 잼플리니나 효모에 따른 최적 조건으로 제조된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 생존율 및 저장성을 증대시킬 수 있어 토착효모의 종균화 및 상업화와 더불어 국내 과실주의 고품질화에 기여할 수 있으며, 와인 산업에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 효모 DNA 분리 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 분리한 효모 DNA를 통해 Hinf Ⅰ과 Hae Ⅲ를 사용한 5.8S-ITS 영역의 PCR-RFLP 패턴 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 2a는 상주(SJ) 감 와인의 결과, 도 2b는 청도(CD) 감 와인의 결과를 나타낸다.
도 3은 YPD 배지에서 분리 효모의 아황산(500ppm) 내성을 분광광도계를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. SJ는 상주 감 와인, CD는 청도 감 와인에서의 결과를 나타내며, 그래프의 패턴별로
Figure 112018049865982-pat00001
는 S. cerevisiae를,
Figure 112018049865982-pat00002
는 P. anomala를,
Figure 112018049865982-pat00003
는 H. uvarum를,
Figure 112018049865982-pat00004
는 P. kluyveri를,
Figure 112018049865982-pat00005
는 C. zemplinina 균주를 나타낸다. 상기 설명은 이하 도 4 내지 도 9에서도 동일하게 해당된다.
도 4는 분리 효모의 알코올 내성을 분석하기 위해, 8 %(v/v) 알코올 함량에서의 생육도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 분리 효모의 알코올 내성을 분석하기 위해, 12 %(v/v) 알코올 함량에서의 생육도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 분리 효모의 내당성을 분석하기 위해, 20 %(w/v) 글루코오스 농도에서의 생육도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 분리 효모의 내당성을 분석하기 위해, 50 %(w/v) 글루코오스 농도에서의 생육도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 분리 효모의 내산성을 분석하기 위해, pH 2.0일 때의 생육도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 분리 효모의 내산성을 분석하기 위해, pH 4.0일 때의 생육도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에서 향기 생성능이 우수한 균주로 선정한 상주 20번(P. anomala SJ20), 상주 69번(H. uvarum SJ69), 청도 34번(P. kluyveri CD34), 청도 80번(C. zemplinina CD80), 양평 1번(P. caribbica YP1), 청송 7-16번(P. anomala CS7-16) 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에서 실시한 저온송풍건조 방법을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 P. anomala SJ20 종균의, 여러 가지 당 및 재수화 용액에 따른 생존율, 수분함량 및 생균수를 측정하여 나타낸 도이다. 위쪽 그래프는 저온송풍건조 후의 결과를, 아래쪽 그래프는 저온송풍건조 전의 결과를 나타내며, ■는 생존율, □는 수분함량을 나타낸다. 통계분석 결과(**P<0.01, *P<0.05)는 당을 첨가하지 않고 증류수로 재수화 시킨 샘플과 비교하여 나타낸 결과이다. 상기 설명은 이하 도 13 내지 17에서도 동일하게 해당된다.
도 13은 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 H. uvarum SJ69 종균의, 여러 가지 당 및 재수화 용액에 따른 생존율, 수분함량 및 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 P. kluyveri CD34 종균의, 여러 가지 당 및 재수화 용액에 따른 생존율, 수분함량 및 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 C. zemplinina CD80 종균의, 여러 가지 당 및 재수화 용액에 따른 생존율, 수분함량 및 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 P. caribbica YP1 종균의, 여러 가지 당 및 재수화 용액에 따른 생존율, 수분함량 및 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 P. anomala CS7-16 종균의, 여러 가지 당 및 재수화 용액에 따른 생존율, 수분함량 및 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 P. anomala SJ20 및 H. uvarum SJ69 종균의, 여러 가지 농도의 비타민 C(V) 및 글루타티온(G) 첨가에 따른 생존율을 알아보기 위해 4℃에서 8주간 보관하며 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 P. caribbica YP1 및 P. kluyveri CD34 종균의, 여러 가지 농도의 비타민 C(V) 및 글루타티온(G) 첨가에 따른 생존율을 알아보기 위해 4℃에서 8주간 보관하며 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 저온송풍건조 방법으로 제조된 C. zemplinina CD80 및 P. anomala CS7-16 종균의, 여러 가지 농도의 비타민 C(V) 및 글루타티온(G) 첨가에 따른 생존율을 알아보기 위해 4℃에서 8주간 보관하며 생균수를 측정하여 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명 건조 종균의 저장 온도 및 항산화제(비타민 C(V) 및 글루타티온(G)) 첨가에 따른 저장성을 확인하기 위해, 4℃에서 8주간 보관하며 외관을 촬영하여 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명 건조 종균의 형태학적 관찰을 위해 SEM으로 4,000배에서 촬영하여 나타낸 도이다. 가장 왼쪽 위의 결과부터 오른쪽으로 세 개의 결과는 각각 SJ20(P. anomala SJ20), SJ69(H. uvarum SJ69), YP1(P. caribbica YP1)를 나타내며, 가장 왼쪽 아래의 결과부터 오른쪽으로 세 개의 결과는 각각 CS7-16(P. anomala CS7-16), CD80(Candida zemplinina CD80), CD34(P. kluyveri CD34)의 결과를 나타낸다.
본 발명은 (S1) 캔디다 잼플리니나(Candida zemplinina) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계; (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및 (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명의 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법은 상기 (S1) 단계 이전에 향미 생성능이 우수한 캔디다 잼플리니나 균체를 준비하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 “준비”는 선별일 수 있으며 향미 생성능이 우수한 캔디다 잼플리니나 균체를 준비하여 이용하게 되면, 제조된 종균을 사용하여 와인 제조 시 와인의 향미를 더욱 증대시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서 상기 캔디다 잼플리니나 균체는 non-Saccharomyces 효모로서, 바람직하게는 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P)일 수 있다. 또한 본 발명의 용어 “균체”는 미생물, 효모, 균주 용어와 바꾸어 사용할 수 있다.
본 발명의 캔디다 잼플리니나 CD80 균체(미생물 수탁번호 : KACC93299P)는 52개 균주 중 실험을 통해 우수한 향기 생성능을 가진 균주로서 선발한 균주이다. 따라서 본 발명의 캔디다 잼플리니나 CD80 균체를 사용하여 제조된 종균으로 와인 제조 시 와인의 향미를 더욱 증대시킬 수 있다는 장점이 있다.
상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v), 바람직하게는 7 내지 13 %(w/v), 더욱 바람직하게는 9 내지 11 %(w/v), 가장 바람직하게는 10 %(w/v) 탈지유 및 프룩토오스, 글루코오스, 말토오스, 라피노오스, 수크로오스 및 트레할로오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 당을 5 내지 15 %(w/v), 바람직하게는 7 내지 13 %(w/v), 더욱 바람직하게는 9 내지 11 %(w/v), 가장 바람직하게는 10 %(w/v)로 포함할 수 있다. 상기 탈지유는 미생물의 건조를 보호하며, 상기 당은 미생물의 건조 시 건조 중 세포의 세포막에서 유출되는 구조수를 대체하며, 세포 내에 수소결합하고 있는 극성 단백질 그룹의 풀림과 응집을 방지할 수 있다.
또한 상기 (S1) 단계에서 균체는 펠렛(pellet) 형태일 수 있으며, 종균 용액은 건조 보호용 조성물의 혼합 후 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 락토밀(lactomil)일 수 있고 상기 균체 펠렛과 락토밀의 첨가비는 1:4(w/w), 바람직하게는 1:3.5(w/w)일 수 있다. 부형제인 락토밀을 사용하게 되면 균체를 가루 형태로 만들 수 있다.
상기 (S1) 단계에서 종균 용액은 항산화제를 더 포함할 수 있으며, 상기 항산화제는 비타민 C 또는 글루타티온(glutathione)일 수 있다. 항산화제를 포함시키게 되면 송풍건조로 제조된 건조 효모의 장기보관 시 발생하는 산화과정을 최대한 억제할 수 있어 저장 기간을 더욱 향상시킬 수 있다. 상기 비타민 C 또는 글루타티온은 4 내지 7 mM, 바람직하게는 4 내지 6 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 포함될 수 있다. 상기 용량으로 비타민 C 또는 글루타티온을 포함하게 되면 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성이 더욱 증대되어 8주 동안의 저장 시에도 생균수의 감소를 효과적으로 방지할 수 있다.
또한 상기 (S2) 단계에서 종균 용액을 30 내지 45 ℃, 바람직하게는 35 내지 40 ℃, 더욱 바람직하게는 37 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조할 수 있다. 상기와 같은 온도 범위에서 저온송풍건조 시키게 되면, 기존 열풍 건조 대비 열에 의한 손상을 방지할 수 있고 기존 동결건조 대비 훨씬 적은 에너지와 비용으로 건조시킬 수 있다. 또한 상기 저온송풍건조는 20 내지 60 분, 바람직하게는 30 내지 40 분 동안 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
상기 재수화 용액은 증류수, PBS(Phosphate bufferd saline) 버퍼, NaCl 용액 및 펩톤수(peptone water)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있으며 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 PBS 버퍼는 1xPBS 버퍼, NaCl 용액은 0.85% NaCl 용액, 펩톤수는 1% 펩톤수일 수 있다. 또한 상기 PBS 버퍼는 1X 내지 2X, 바람직하게는 1XPBS 버퍼, NaCl 용액은 0.5 내지 1 %, 바람직하게는 0.7 내지 0.9 %, 더욱 바람직하게는 0.85 % NaCl 용액, 펩톤수는 0.5 내지 1.5 %, 바람직하게는 0.8 내지 1.3 %, 더욱 바람직하게는 1 % 펩톤수일 수 있다. 재수화 용액을 이용하면 건조된 미생물을 재수화 과정을 통해 회복시킬 수 있으며, 상기 용량으로 재수화 용액을 이용하면 더욱 효과적으로 회복시킬 수 있다.
상기 캔디다 잼플리니나 균체는 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P)일 수 있으며, 이 때 상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v), 바람직하게는 7 내지 13 %(w/v), 더욱 바람직하게는 9 내지 11 %(w/v), 가장 바람직하게는 10 %(w/v) 탈지유; 및 5 내지 15 %(w/v), 바람직하게는 7 내지 13 %(w/v), 더욱 바람직하게는 9 내지 11 %(w/v), 가장 바람직하게는 10 %(w/v) 수크로오스;를 포함할 수 있다. 캔디다 잼플리니나 CD80 균체에 상기와 같은 비율로 탈지유 및 수크로오스를 혼합시키게 되면, 혼합시키지 않은 대조군 대비 캔디다 잼플리니나 CD80 효모 종균의 생존율을 현저하게 증대시킬 수 있다.
또한 상기 캔디다 잼플리니나 균체가 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P)일 때, 상기 건조 보호용 조성물은 비타민 C 또는 글루타티온을 더 포함할 수 있다. 비타민 C 또는 글루타티온을 포함시키게 되면, 송풍건조로 제조된 캔디다 잼플리니나 CD80 효모 종균의 저장성이 증대되어 저장 기간에 따른 생균수의 감소를 방지할 수 있다.
또한 상기 비타민 C 또는 글루타티온은 4 내지 7 mM, 바람직하게는 4 내지 6 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 포함할 수 있다. 상기 용량으로 비타민 C 또는 글루타티온을 포함하게 되면 캔디다 잼플리니나 CD80 효모 종균의 저장성이 더욱 증대되어 8주 동안의 저장 시에도 생균수의 감소를 효과적으로 방지할 수 있다.
또한 상기 캔디다 잼플리니나 균체는 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P)일 수 있으며, 이 때 상기 재수화 용액은 NaCl 용액일 수 있다. 재수화 용액으로 NaCl 용액을 사용하게 되면 건조 상태의 캔디다 잼플리니나 CD80 효모 종균의 생존율을 현저하게 증대시킬 수 있어, 종균의 이용성을 더욱 높일 수 있다. 상기 NaCl 용액은 0.5 내지 1 %, 바람직하게는 0.7 내지 0.9 %, 더욱 바람직하게는 0.85 % NaCl 용액일 수 있다. 상기 용량으로 재수화 용액을 이용하면 가장 효과적으로 건조된 미생물을 회복시켜 건조 상태의 캔디다 잼플리니나 CD80 효모 종균의 생존율을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 본 발명은, (S1) 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계; (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및 (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하며, 상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v) 탈지유; 및 5 내지 15 %(w/v) 수크로오스;를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 건조 보호용 조성물은 비타민 C 또는 글루타티온을 4 내지 7 mM 더 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 재수화 용액은 0.5 내지 1 % NaCl 용액인 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법에 따르면 캔디다 잼플리니나 CD80 효모 종균의 생존율을 가장 효과적으로 증대시킬 수 있다.
본 발명은 또한, (S1) 캔디다 잼플리니나(Candida zemplinina) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계; (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및 (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법을 제공한다.
또한 상기 (S2) 단계 이후에, 상기 종균 분말을 0 내지 10 ℃, 바람직하게는 2 내지 7 ℃, 더욱 바람직하게는 3 내지 5 ℃, 가장 바람직하게는 4 ℃에서 보관하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 저온송풍건조로 제조된 종균 분말을 상기와 같은 방법으로 제조하여 보관하게 되면, 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 생존율이 향상되어 종균의 저장성이 증대될 뿐만 아니라, 종균 분말의 색이 변질되는 것과 다른 미생물이 증식하는 것을 방지할 수 있어 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성을 효과적으로 증대시킬 수 있다.
본 발명의 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법에 관한 다른 설명은 상기 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법에 관한 기재와의 중복성을 피하고자 생략한다.
따라서 본 발명의 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법 또는 저장성 증대방법에 따르면, 기존 열풍건조 대비 열에 의한 손상을 방지할 수 있고 기존 동결건조 대비 훨씬 적은 에너지와 비용으로 종균을 제조할 수 있다. 또한 캔디다 잼플리니나 효모에 따른 최적 조건으로 제조된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 생존율 및 저장성을 증대시킬 수 있어 토착효모의 종균화 및 상업화와 더불어 국내 과실주의 고품질화에 기여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 감 와인 제조 및 효모의 분리
실시예 1-1. 감 와인 제조
효모의 분리를 위한 감 와인 제조에 사용한 홍시는 2016년 11월 말에 경북 상주와 청도 두 지역에서 구매한 떫은 감을 연화 처리하여 만든 것을 사용하였다. 상기 두 지역의 홍시를 각각 3 kg씩 파쇄한 후 잡균의 오염 방지를 위해 메타중아황산칼륨 (potassium metabisulfite, K2S2O5) 200 ppm을 첨가하였다. 파쇄한 홍시를 각각 10 L 발효용기에 담아 20℃에서 자연발효를 하였다. 상주 홍시의 경우 6일간, 청도 홍시의 경우 12일간 발효를 진행시켜 감 와인을 제조하였다.
실시예 1-2. 효모의 분리
제조한 감 와인에서의 균주 분리를 위해 YPD 고체배지 (1.0% yeast extract, 2.0% peptone, 2.0% glucose, 2.0% agar)를 사용하였다. 감 와인의 발효 시작 시점부터 발효가 종료될 때까지 시료를 2일 간격으로 채취하여 배지에 도말한 뒤 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 최초 분리된 균들 중 생성된 콜로니의 형태를 중심으로 균주들을 YPD 고체 배지에 순수분리 하였다.
분리 결과 최종적으로 191주의 효모를 분리하였으며, 지역별로 상주 감 와인에서는 99주, 청도 감 와인에서는 92주의 효모를 분리하였다.
실시예 2. PCR-RFLP 분석
상주와 청도 감 와인의 발효과정 중 분리된 효모의 유전적인 다양성 패턴을 알아보기 위해 다음과 같은 방법을 통해 분리한 균주의 ITS(internal transcribed spacer) 영역에서 PCR-RFLP 분석을 실시하고 염기 서열을 분석했다.
실시예 2-1. 효모 DNA 분리 및 조작
상기 실시예 1에서 분리한 균주 191개를 YPD 액체배지에 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 설정된 진탕기(shaker)로 24시간 배양한 뒤 원심분리 하여 (13,000 rpm, 10 min) 균체를 회수하였다. 회수한 균체에 5% chelex 0.4 mL를 첨가하고 chelex와 균체가 일정하게 섞일 수 있도록 볼텍싱(vortexing)한 뒤, 90~95℃에서 10분간 보일링(boiling)하고 10분간 방치했다. 같은 과정을 한 번 더 반복한 뒤 원심분리 하여(13,000 rpm, 10 min) 분리된 상등액을 PCR 분석에 사용하였으며, 상기 과정은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
실시예 2-2. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)
PCR에 사용한 프라이머는 Bioneer사(Daejeon, Korea)에서 구매하여 사용하였으며 효모의 ITS(internal transcribed spacer) 영역에서 유니버셜 프라이머(universal primer)인 ITS1과 ITS4의 양쪽 방향으로 합성하였다. PCR은 Tpersnal 48 (Biometra Co., Gottingen, Germany) 장비를 사용하였으며, 사용한 프라이머의 종류와 염기서열은 표 1에 나타내었다. 또한 PCR에 사용하는 반응액의 양이 총 50μL가 되도록 조절했으며, 반응액의 조성은 표 2에, 반응 조건은 표 3에 나타내었다.
표 1. PCR 프라이머의 종류와 염기서열
프라이머
(Primer) 		염기서열(Sequence)
ITS1 5`-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3`
ITS4 5`-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3`
표 2. PCR 반응액 조성
조성(Composition) 양(Amount, μL)
10X Taq reaction buffer 5.00
Template DNA 2.00
Forward primer (10 pmol/ μl) 2.00
Reverse primer (10 pmol/ μl) 2.00
dNTP mixture (10 mM) 1.00
Taq polymerase (5 U/μl) 0.25
Distilled water 37.75
전체량(Total volume) 50.00
표 3. PCR 반응 조건
사이클
(Cycles) 		변성
(Denaturation) 		결합
(Annealing) 		연장
(Extension) 		프리퀀시
(Frequency)
1 94℃/3 min 50℃/1 min 72℃/1 min 1
2 94℃/30 s 50℃/1 min 72℃/1 min 32
3 72℃/10 min 1
실시예 2-3. 제한효소 처리
DAN 단편을 얻기 위해 제한효소는 Hinf Ⅰ, Hae Ⅲ 두 가지를 사용하였으며, 표 4와 같은 조성으로 37℃에서 1시간 반응시켰다.
표 4. 증폭된 효모 DNA의 제한효소 처리를 위한 조성물
조성(Composition) 양(Amount, μL)
PCR product 5.00
Enzyme (Hinf Ⅰ, Hae Ⅲ) 0.5
Enzyme buffer (×10) 0.75
Distilled water 8.75
전체량(Total volume) 15
실시예 2-4. DNA 전기영동
얻어진 DNA 단편들은 다음과 같은 방법으로 전기영동을 통해 확인하였다. DNA 전기영동은 100V 전압에서 진행되었으며, 1.5% agarose gel (Molecular Biology grade, Korea)과 0.5× TBE buffer를 사용하였다. 전기영동이 끝난 gel을 0.5 mg/mL EtBr (Ethdium Bromide) 용액으로 10분간 발색시키고 증류수에 10분간 세척한 다음 UV transilluminator (Vilber Lour mat. TFX-20M, B.0. 66 TORCY-Z,I SUD, Paris, France)로 전기영동 상을 관찰하였다. 균주 별 DNA 단편의 크기 측정을 위한 마커로는 100 bp Plus DNA ladder (Biofact, Lot No, M54G338IG, Korea)를 사용하였다.
전기영동 결과를 도 2에 나타내었으며 도 2a는 상주(SJ) 감 와인의 결과, 도 2b는 청도(CD) 감 와인의 결과를 나타낸다. 또한 이하 도면의 결과에서도 SJ는 상주, CD는 청도 감 와인의 결과를 의미한다.
상기 실시예 2를 통해 Hinf Ⅰ과 Hae Ⅲ를 사용한 RFLP 패턴 분석 결과, 도 2a에서와 같이 상주 감 와인에서 분리된 균주의 패턴은 전반적으로 비슷한 모양의 반복인데 비해 도 2b에서와 같이 청도 감 와인에서 분리된 균주는 상대적으로 다양한 모양의 패턴을 나타내었다. 이는 온도와 습도, 바람 등의 기후조건이 다른 지역에서 서식하는 효모들은 각기 다른 종 다양성을 나타내기 때문으로 판단하였다.
실시예 3. 분리효모의 동정
상기 실시예 2에서 분리한 균주의 패턴 모양을 비교하여 형태가 다르다고 판단된 패턴을 선정하고, 다음과 같은 방법을 통해 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 영역의 염기서열을 분석한 후 상동성 조사를 실시하였다.
구체적으로, 분리한 균주의 5.8S rDNA의 ITS 부위의 염기서열을 기초로 계통분석을 통해 동정하였다. DNA 염기서열 결정은 Solgent사 (Daejeon, Korea)의 sequencing service를 이용하였으며, 염기서열의 상동성 검사는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST를 이용하여 진행하였다. 계통학적 분석을 위한 다중서열정렬 (Multiple Sequence Alignment)은 European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)에서 제공하는 ClustalW2를 이용하였으며, 계통 유연관계 분석에서 염기서열의 편집은 Bioedit 7.2.5를 사용하였다. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA7)을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성 및 분석을 하였다.
상동성 분석을 통해 상주 6번, 상주 7번, 상주 53번, 청도 3번, 청도 4번, 청도 19번, 청도 81번의 총 7가지 균주를 선정하였으며 이에 대한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
표 5. 분리균주의 BLAST 결과
Isolates Species and strain designation Identity (%)
SJ-6 Saccharomyces cerevisiae strain ATCC 208606 100
SJ-7 Pichia anomala strain MTCC 237 100
SJ-53 Hanseniaspora uvarum strain UFLA CWFY3 99
CD-3 Pichia kluyveri strain CBS 188 100
CD-4 Hanseniaspora uvarum strain JBBB-1 100
CD-19 Pichia anomala strain MTCC 3815 100
CD-81 Candida zemplinina isolate MCR9 99
SJ; SangJu persimmon wine, CD; CheongDo persimmon wine
표 6에서와 같이 상주 6번은 일반적으로 와인생산에 많이 사용되고 있는 Saccharomyces cerevisiae 와 100% 상동성을 나타내었으며 상주 7번과 청도 19번은 Pichia anomala와 100% 상동성을 나타내었다. 상주 53번과 청도 4번은 Hanseniaspora uvarum과 각각 99%와 100%, 청도 3번은 P. kluyveri와, 청도 81번은 Candida zemplinina와 100%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 따라서 상주 6번을 제외한 6개의 균주들은 non-Saccharomyces 종임을 확인하였다.
또한 상동성 조사를 마친 균주의 패턴과 동일한 형태를 가진 그룹을 같은 종으로 판단하여 분리균주를 구별하였으며 그 결과는 표 6에 나타내었다.
표 6. 상주 및 청도 감 와인으로부터 분리한 균주 패턴에 따른 효모 수
균주 분리 효모 수 전체
상주 청도
Saccharomyces cerevisiae 7 *ND 7
Pichia anomala 51 20 71
Hanseniaspora uvarum 41 60 101
Pichia kluyveri ND 10 10
Candida zemplinina ND 2 2
전체 99 92 191
*ND = not detected.
표 6에서와 같이, 상주 감 와인에서 분리된 균주는 P. anomala가 51개로 가장 많았고, 청도에서는 H. uvarum이 60개로 가장 많음을 확인하였다. 또한 청도 감 와인에서는 상주 감 와인에서는 발견되지 않은 non-Saccharomyces 균주인 P. kluyveri 와 C. zemplinina가 발견됨을 확인하였다.
실시예 4. 분리균주의 환경내성 분석 및 환경내성에 따른 효모의 1차 선정
실시예 4-1. 아황산 내성 분석
아황산염은 산화방지 및 박테리아의 성장을 저해하는 능력이 탁월하여 식품 저장에 널리 사용되고 있으며, 식품 및 와인의 외관을 향상시키고 품질을 유지시키는 역할을 하는 식품점가물이다. 분리한 균주의 아황산(K2S2O5) 내성을 조사하기 위하여 YPD 액체배지에 500ppm (w/v) 농도의 아황산을 첨가하고 test tube에 5 mL씩 분주하였다. 여기에 분리 균주의 전배양액을 균주 별로 5% (v/v)씩 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 48시간 동안 배양한 뒤, 분광광도계 (Shimazdu Co. UV-1601, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생육도를 측정하였으며, 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서와 같이 상주와 청도 2개 지역에서 분리된 균주 모두 비슷한 수준의 생육도를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4-2. 알코올 내성 분석
발효 과정 중 효모가 겪는 가장 일반적인 스트레스 중 하나는 높은 에탄올 함량이다. 에탄올은 원형질막의 유동성을 증가시키고 정상적인 막 구조를 파괴한다. 와인의 발효가 진행됨에 따라 알코올 함량이 높아지기 때문에, 원활한 와인의 생산을 위해 분리균주의 알코올 내성 연구가 필요하다.
분리한 균주의 알코올 내성을 조사하기 위하여 YPD 액체배지의 알코올 함량이 각각 8% (v/v)와 12% (v/v)가 되게 조절한 뒤 시험관(test tube)에 5 mL씩 분주하였다. 여기에 분리 균주의 전배양액을 균주 별로 5% (v/v)씩 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 48시간 동안 배양한 뒤, 분광광도계로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생육도를 측정하였다. 이 중 알코올 함량 8% (v/v)에서의 결과를 도 4에, 알코올 함량 12% (v/v)에서의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4에서와 같이 알코올 함량 8%에서는 S. cerevisiae 균주와 P. anomala 균주가 다른 균주에 비해 높은 알코올 내성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한 도 5에서와 같이 알코올 함량 12%에서는 S. cerevisiae 균주인 상주 3, 4, 6, 17, 23, 26, 27번 균주들이 가장 우수한 내성을 보였으며, 그 외의 균주들은 생장이 크게 저해되는 것을 확인하였다.
따라서 알코올 내성 분석 결과, non-Saccharomyces 효모 중에 P. anomala 균주가 가장 우수한 알코올 내성을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 4-3. 내당성 분석
와인을 제조하거나 다른 특정 환경에서 효모는 높은 당 농도로 인한 삼투압 스트레스에 대처해야 한다. 분리한 균주의 내당성을 조사하기 위하여 YPD 액체배지의 글루코오스(glucose) 농도를 각각 20% (w/v), 50% (w/v)로 조절한 뒤 시험관에 5 mL씩 분주하였다. 여기에 분리 균주의 전배양액을 균주별로 5% (v/v)씩 접종하여 30 ℃에서 150 rpm으로 48시간 동안 배양한 뒤, 분광광도계로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생육도를 측정하였다. 이 중 20% (w/v) 글루코오스 농도에서의 결과를 도 6에, 50% (w/v) 글루코오스 농도에서의 결과를도 7에 나타내었다.
도 6에서와 같이 글루코오스 20% 첨가 시 상주 감 와인에서 초기에 분리된 균주가 상대적으로 높은 생육도를 나타내는 것을 확인하였다.
또한 도 7에서와 같이 글루코오스 50% 첨가 시, 가장 높은 생육도를 나타낸 균주는 상주 23, 26, 27번의 균주인 S. cerevisiae인 것을 확인하였다. 또한 동일한 non-Saccharomyces 효모 중에서는 대부분 P. anomala의 생육도가 H. uvarum의 생육도보다 더 높은 것을 확인하였다.
실시예 4-4. 내산성 분석
분리한 균주의 내산성을 조사하기 위하여 YPD 액체배지의 pH를 pH 2.0 및 pH 4.0으로 조절한 뒤 시험관에 5 mL씩 분주하였다. 여기에 분리 균주의 전배양액을 균주별로 5% (v/v)씩 접종하여 30 ℃에서 150 rpm으로 48시간 동안 배양한 뒤, 분광광도계로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생육도를 측정하였다. 이 중 pH 2.0일 때의 결과를 도 8에, pH 4.0일 때의 결과를 도 9에 나타내었다.
도 8에서와 같이 pH 2.0일 때 상주 감 와인에서는 상주 18번을 제외한 P. anomala가 H. uvarum의 생육도보다 상대적으로 낮은 값을 나타내었다. 결과적으로 pH 2.0 환경조건에서 P. anomala는 거의 성장하지 못하는 것을 확인하였다. 반면 청도 감 와인에서 분리된 균주는 종별로 특징적인 생육도 차이를 나타내지 않았다.
또한 도 9에서와 같이 pH 4.0에서는 상주와 청도 감 와인에서 분리된 균주 모두 큰 차이 없는 생육도를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4-5. 환경내성에 따른 효모의 1차 선정
일반적인 와인의 알코올 함량은 12%일 때 관능적으로 가장 우수하다고 알려져 있으며, 국내에서 재배되는 포도, 사과, 감 등의 과실은 초기 당도가 낮아 설탕을 첨가하여 약 24 Brix로 당도를 조정한 후 발효에 이용되고 있다. 설탕을 첨가하여 당도가 올라가게 되면 과즙 내의 삼투압이 증가하기 때문에 일부 균주들의 경우 생육이 저해되는 문제가 발생할 가능성이 있다. 또한 발효 과정 중 알코올 함량이 증가하게 되면, 알코올 내성이 약한 균주의 경우에는 생육이 저해되어 사멸하게 되는 경우가 발생할 수 있다. 따라서 향기 생성능이 우수한 발효 효모의 선정 이전에 일반적인 와인의 환경에서 우수한 생육도를 나타내는 효모의 1차선정이 필요하며, 본 발명에서는 상기 실시예 4-1 내지 4-4에서의 환경내성 분석 결과를 토대로 다음과 같이 생육이 우수한 발효 효모를 1차 선정하였다.
아황산 내성의 경우, 본 발명에서 분리한 효모들에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 판단되었다. 또한 내산성의 경우, 일반적인 과실주의 pH 범위가 3.6∼4.0 사이인 것을 감안할 때 pH 4 환경에서 대부분 우수한 생육도를 나타내어 고려대상에서 제외되었다. 알코올 내성의 경우, non-Saccharomyces 효모가 발효 초기 향기생성에 영향을 미친다는 점을 고려하여 8% 알코올 환경에서 생육도를 비교하여 우수 효모를 선정하였다. 또한 내당성의 경우에도 일반적인 와인 발효 환경과 비슷한 20% 글루코오스 환경에서 생육도를 비교하여 종별로 우수 효모를 선정하였다.
결과적으로, P. anomala에서는 상주 1, 2, 7, 11, 15, 16, 18, 19, 20, 24, 37, 47번이 다른 P. anomala보다 상대적으로 높은 알코올 및 글루코오스 내성을 나타내었고, H. uvarum에서는 상주 53, 61, 68, 69, 77, 81, 88번과 청도 8, 14, 35, 39, 77, 78, 82번이 상대적으로 높은 생육도를 나타내었다. P. kluyveri와 C. zemplinina는 각각 10개와 2개로 적은 개수가 분리되어 이를 모두 1차 선정 대상에 포함시켰으며, 상기 총 38개의 균주를 1차 선정하였다.
실시예 5. 스니핑 테스트(Sniffing test)에 따른 효모의 2차 선정
스니핑 테스트(Sniffing test)는 코로 냄새를 맡는 실험으로 간편하고 빠르게 향미생성 여부를 판단할 수 있는 실험이다. 이 실험을 통해 향기 생성능이 우수한 non-Saccharomyces 토착 발효 효모를 분리하기 위해서, 앞서 1차 선정된 38개의 균주와 기존에 본 실험실에서 분리·보관중인 사과 분리균 청송 7-16, 13-15번, 아로니아 분리균 강진 14, 16번, 양평 1, 5, 9, 24, 30, 37, 38, 39, 40번, 단양 32번의 총 52개 균주를 사용하였다. 실험에 사용된 52개 균주에 관한 정보는 표 7에 나타내었다.
표 7. 스니핑 테스트에 사용된 분리 효모균
No. Yeasts Strains 환경내성 Origin Ref.
In glucose 20% In alcohol 8%
1 SJ-1 P. anomala 23.960 ± 0.56 4.983 ± 0.05 감 In this sudy
2 SJ-2 P. anomala 21.960 ± 0.16 7.233 ± 0.04 감 In this sudy
3 SJ-7 P. anomala 22.220 ± 0.14 6.057 ± 0.06 감 In this sudy
4 SJ-11 P. anomala 23.027 ± 0.48 6.167 ± 0.019 감 In this sudy
5 SJ-15 P. anomala 21.613 ± 0.18 6.470 ± 0.08 감 In this sudy
6 SJ-16 P. anomala 22.133 ± 0.98 4.393 ± 0.01 감 In this sudy
7 SJ-18 P. anomala 22.067 ± 0.30 6.120 ± 0.07 감 In this sudy
8 SJ-19 P. anomala 22.947 ± .023 6.390 ± 0.06 감 In this sudy
9 SJ-20 P. anomala 21.587 ± 0.06 6.060 ± 0.05 감 In this sudy
10 SJ-24 P. anomala 13.747 ± 0.06 7.443 ± 0.02 감 In this sudy
11 SJ-37 P. anomala 22.547 ± 0.19 4.290 ± 0.10 감 In this sudy
12 SJ-47 P. anomala 10.787 ± 0.04 6.667 ± 0.02 감 In this sudy
13 SJ-53 H. uvarum 12.040 ± 0.04 0.884 ± 0.004 감 In this sudy
14 SJ-61 H. uvarum 6.875 ± 0.03 1.935 ± 0.01 감 In this sudy
15 SJ-68 H. uvarum 9.851 ± 0.03 1.045 ± 0.01 감 In this sudy
16 SJ-69 H. uvarum 7.749 ± 0.12 1.039 ± 0.02 감 In this sudy
17 SJ-77 H. uvarum 9.632 ± 0.02 1.207 ± 0.01 감 In this sudy
18 SJ-81 H. uvarum 9.045 ± 0.05 1.163 ± 0.01 감 In this sudy
19 SJ-88 H. uvarum 8.912 ± 0.21 1.196 ± 0.0 감 In this sudy
20 CD-1 P. kluyveri 7.451 ± 0.06 1.434 ± 0.06 감 In this sudy
21 CD-2 P. kluyveri 10.240 ± 0.15 1.204 ± 0.01 감 In this sudy
22 CD-3 P. kluyveri 10.656 ± 0.11 0.363 ± 0.01 감 In this sudy
23 CD-8 H. uvarum 12.592 ± 0.29 0.980 ± 0.01 감 In this sudy
24 CD-14 H. uvarum 13.003 ± 0.22 1.037 ± 0.01 감 In this sudy
25 CD-23 P. kluyveri 12.683 ± 0.25 0.406 ± 0.02 감 In this sudy
26 CD-25 P. kluyveri 8.960 ± 0.09 1.011 ± 0.01 감 In this sudy
27 CD-34 P. kluyveri 7.109 ± 0.07 1.037 ± 0.02 감 In this sudy
28 CD-35 H. uvarum 7.109 ± 0.06 0.979 ± 0.02 감 In this sudy
29 CD-39 H. uvarum 9.477 ± 0.04 1.055 ± 0.02 감 In this sudy
30 CD-72 P. kluyveri 6.389 ± 0.12 0.700 ± 0.01 감 In this sudy
31 CD-75 P. kluyveri 7.707 ± 0.02 1.029 ± 0.01 감 In this sudy
32 CD-76 P. kluyveri 7.643 ± 0.10 0.866 ± 0.03 감 In this sudy
33 CD-77 H. uvarum 9.765 ± 0.12 1.019 ± 0.02 감 In this sudy
34 CD-78 H. uvarum 7.323 ± 0.03 1.221 ± 0.01 감 In this sudy
35 CD-80 C. zemplinina 9.840 ± 0.07 1.079 ± 0.01 감 In this sudy
36 CD-81 C. zemplinina 9.813 ± 0.10 1.166 ± 0.01 감 In this sudy
37 CD-82 H. uvarum 9.813 ± 0.07 1.423 ± 0.02 감 In this sudy
38 CD-83 P. kluyveri 8.347 ± 0.17 1.206 ± 0.01 감 In this sudy
39 GJ-14 P. anomala 27.400 ± 0.12 4.553 ± 0.01 아로니아 (Cha, 2017)
40 GJ-16 P. anomala 24.340 ± 0.02 4.973 ± 0.02 아로니아 (Cha, 2017)
41 YP-1 P. caribbica 16.580 ± 0.06 1.505 ± 0.01 아로니아 (Cha, 2017)
42 YP-5 P. anomala 27.400 ± 0.24 5.713 ± 0.41 아로니아 (Cha, 2017)
43 YP-9 P. anomala 25.100 ± 0.03 6.157 ± 0.21 아로니아 (Cha, 2017)
44 YP-24 P. anomala 26.980 ± 0.21 5.327 ± 0.14 아로니아 (Cha, 2017)
45 YP-30 P. anomala 27.440 ± 0.14 5.887 ± 0.21 아로니아 (Cha, 2017)
46 YP-37 P. anomala 29.620 ± 0.21 5.253 ± 0.15 아로니아 (Cha, 2017)
47 YP-38 P. anomala 29.260 ± 0.41 5.480 ± 0.04 아로니아 (Cha, 2017)
48 YP-39 P. anomala 29.750 ± 0.12 4.977 ± 0.13 아로니아 (Cha, 2017)
49 YP-40 P. anomala 28.340 ± 0.21 5.723 ± 0.19 아로니아 (Cha, 2017)
50 DY-32 P. caribbica 21.330 ± 0.03 1.570 ± 0.04 아로니아 (Cha, 2017)
51 CS 7-16 P. anomala 30.480 ± 0.21 4.330 ± 0.12 사과 *In lab
52 CS 13-15 P. anomala 31.240 ± 0.32 0.600 ± 0.21 사과 In lab
SJ; SangJu persimmon wine, CD; CheongDo persimmon wine, GJ; GangJin Aronia, YP; YangPyeong Aronia, DY; DanYang Aronia, CS; CheongSong Apple wine
All the data were expressed as meas±SD (n-3).
*In lab, those strains were previously isolated and stored in our laboratory.
상기 표 7의 52개 균주를 대상으로 향기 생성능이 우수한 균주를 선정하기 위해서 다음과 같은 방법으로 스니핑 테스트를 진행하였다. 청도에서 구매한 떫은감을 연화 처리하여 만든 홍시 및 청송에서 구매한 사과를 세척, 파쇄, 여과하여 즙을 얻고 각각 5 mL씩 시험관에 분주하여 고압멸균기(Autoclave)로 멸균하였다. 멸균한 과즙에 분리한 균주의 전배양액을 5% (v/v)씩 접종하고 20 ℃에서 2주간 발효시킨 뒤, 대학생과 대학원생으로 구성된 일반관능요원 10명을 선발하여 향기를 맡게 하고 5점 척도법으로 테스트를 실시하였다. 1점(향기가 매우 나쁘다, 독특하지 않다)부터 5점(향기가 매우 좋다, 독특하다)으로 평가하였으며, 상기와 같이 10명의 관능요원에 의해 수행된 스니핑 테스트의 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
표 8. 분리 효모의 스니핑 테스트 결과
Yeast strains Flavor Yeast strains Flavor
P. anomala 감 사과 H. uvarum 감 사과
SJ-1 + ++ SJ-53 +++ ++
SJ-2 +++ + SJ-61 +++ +
SJ-7 + + SJ-68 +++ ++
SJ-11 + + SJ-69 ++++ ++
SJ-15 + + SJ-77 + ++
SJ-16 + ++ SJ-81 ++ ++
SJ-18 +++ ++ SJ-88 ++ ++
SJ-19 +++ ++ CD-8 ++ +
SJ-20 +++++ ++ CD-14 + ++
SJ-24 + + CD-35 + +
SJ-37 + + CD-39 + ++
SJ-47 + + CD-77 + ++
GJ-14 +++ ++ CD-78 + +
GJ-16 +++ ++ CD-82 +++ ++
YP-5 +++ + P. kluyveri
YP-9 + + CD-1 ++ +
YP-24 + + CD-2 + ++
YP-30 + + CD-3 + ++
YP-37 + + CD-23 ++ +
YP-38 + ++ CD-25 ++ ++
YP-39 + + CD-34 ++++ ++
YP-40 + ++ CD-72 ++ ++
CS 7-16 ++ ++++ CD-75 + ++
CS 13-15 ++ ++ CD-76 + +
CD-83 ++ +
C. zemplinina P. caribbica
CD-80 ++++ +++ DY-32 + +
CD-81 ++ ++ YP-1 ++++ ++
SJ; SangJu persimmon wine, CD; CheongDo persimmon wine, GJ; GangJin Aronia, YP; YangPyeong Aronia, DY; DanYang Aronia, CS; CheongSong Apple wine.
Approval number : 2017-0125
표 8에서와 같이 감 즙에서 가장 높은 점수를 받은 균주들은 상주 20번, 상주 69번, 청도 34번, 청도 80번, 양평 1번이었으며 사과즙에서 높은 점수를 받은 균주는 청송 7-16, 청도 80번인 것으로 확인되었다. 청도 80번의 경우 감 즙과 사과즙 모두에서 높은 점수를 받은 것으로 나타났다.
상기 스니핑 테스트의 결과에 따라, 상주 20번(Pichia anomala SJ20, P. anomala SJ20), 상주 69번(Hanseniaspora uvarum SJ69, H. uvarum SJ69), 청도 34번(Pichia kluyveri CD34, P. kluyveri CD34), 청도 80번(Candida zemplinina CD80, C. zemplinina CD80), 양평 1번(Pichia caribbica YP1, P. caribbica YP1), 청송 7-16번(Pichia anomala CS7-16, P. anomala CS7-16)의 총 6개 균주가 좋은 향기를 생성한다고 판단하여 이를 최종 선정하였으며, 선정한 6가지 균주의 계통수(phylogenetic tree)는 도 10에 나타내었다.
상기 선별한 고향미 생성 6종의 균주는 국립농업과학원에 기탁하였으며 각각 상주 20번(P. anomala SJ20) 균주의 경우 2018년 2월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KACC93297P, 상주 69번(H. uvarum SJ69) 균주의 경우 2018년 2월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KACC93298P, 청도 34번(P. kluyveri CD34) 균주의 경우 2017년 10월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KACC93292P, 청도 80번(C. zemplinina CD80) 균주의 경우 2018년 2월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KACC93299P, 양평 1번(P. caribbica YP1) 균주의 경우 2017년 10월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KACC93291P, 청송 7-16번(P. anomala CS7-16) 균주의 경우 2017년 10월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KACC93290P를 부여받았다.
실시예 6. 최종 선정 효모의 저온송풍건조 및 생존율 측정
실시예 6-1. 사용균주 및 배양조건
저온송풍건조를 위해 상기 실시예 5에서 최종 분리된 균주인 상주 20번(P. anomala SJ20), 상주 69번(H. uvarum SJ69), 청도 34번(P. kluyveri CD34), 청도 80번(C. zemplinina CD80), 양평 1번(P. caribbica YP1), 청송 7-16번(P. anomala CS7-16) 6가지 균주를 실험에 사용하였다. YPD 액체배지 300 mL에 균주의 전배양액을 균주 별로 5% (v/v)씩 접종하여 30℃에서 16시간 동안 배양한 뒤 사용하였다.
실시예 6-2. 저온송풍건조를 통한 분말 종균 제조
저온송풍건조는 무진, 무균 환경으로 건조할 수 있는 무진 건조기 (HanBeak, HB-509C, Korea)를 사용하여 실시하였고 본 발명에서 실시한 저온송풍건조 방법은 도 11에 도식화하여 나타내었다.
도 11에서와 같이 본 발명의 저온송풍건조 시 보호제와 부형제를 처리하였으며 저온송풍건조에 사용된 보호제와 부형제의 조성 및 농도는 하기 표 9와 같다.
표 9. 보호제와 부형제의 조성 및 농도
보호제 부형제
탈지유
(Skim milk) 		당
(Sugars) 		펠렛 : 락토밀
(Pellet : Lactomil)
10% (w/v) 프룩토오스
(Fructose)		 10% (w/v) 1 : 3.5 (w/w)
글루코오스
(Glucose)
말토오스
(Maltose)
라피노오스
(Raffinose)
수크로오스
(Sucrose)
트레할로오스
(Trehalose)
표 9에 나타낸 바와 같이 건조 보호제인 탈지유는 10% (w/v)를 사용하였고, 추가적으로 10% (w/v)의 6가지 당(fructose, glucose, maltose, raffinose, sucrose, trehalose)을 사용하였다. 또한 균체를 가루형태로 만들어주는 부형제는 락토밀 (lactose 89%, maltodextrin 11%)을 사용하였으며 균체 펠렛과 락토밀의 비가 1 : 3.5 (w/w)가 되게 첨가하였다.
그 후 함량이 8%~12%가 될 때까지 30~40분 건조시켜 분말 종균을 제조하였다. 모든 처리구의 수분함량은 건조과정 후 미생물의 생존율이 가장 높다고 판단된 10 ± 2%로 조절하였다. 수분함량은 시료를 칭량한 후 105℃ 건조기(dry oven)에서 3~4시간 건조시킨 뒤 데시케이터에서 20분간 방랭하고 항량에 이를 때까지 무게를 측정하여 구하였다.
실시예 6-3. 재수화 용액 및 처리
재수화 조건이 저온송풍건조 효모에 미치는 영향을 알아보기 위해 증류수(D.W.), 1x PBS(Phosphate bufferd saline) 버퍼, 0.85% NaCl, 1% 펩톤수(peptone water)를 사용하였다. 저온송풍건조를 마친 샘플에 재수화 용액을 넣어 초기 부피로 복원 시킨 후, 1시간 동안 25℃에서 재수화 하였다. 이 후 다음과 같이 멸균수로 단계 희석 하여 YPD 고체배지에서 생존율을 측정하였다.
실시예 6-4. 균주의 생존율 측정
균주의 초기 균수는 YPD 액체배지에서 30℃, 16시간 배양이 끝난 뒤, 저온송풍건조 처리 전에 샘플 1 mL를 취하여 단계 희석한 후 YPD 고체배지에서 30℃, 48시간 배양 후 자라난 콜로니를 계수하여 측정하였다. 처리 조건 별 균주의 생존율은 송풍건조가 완료된 균주를 재수화 용액을 이용하여 초기 부피로 복원 시킨 후, 초기생균수의 조건과 동일하게 배양시킨 뒤 다음의 식을 통해 나타내었다. 생존율 :
Figure 112018049865982-pat00006
. 이에 대한 결과를 도 12 내지 도 17에 나타내었다.
도 12에서와 같이, P. anomala SJ20의 경우, 대조군으로 사용된 당 무첨가 및 D.W. 재수화 조건과 비교하여 당을 첨가하였을 때, 모든 시험구에서 생존율이 증가함을 확인하였고, 10% 라피노오스를 제외한 모든 당, 프룩토오스, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스 및 트레할로오스에서 대조군보다 3배 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 그 중에서 특히 10% 트레할로오스를 첨가하여 1% 펩톤수로 1시간 재수화 하였을 때, 103.76%로 가장 높은 생존율을 나타내었다. 생존율이 100%가 넘어가는 것은 재수화 과정 중 적절한 환경에서 효모들이 증식하였기 때문으로 판단된다.
또한 도 13에서와 같이 H. uvarum SJ69의 경우, 대조군과 비교하여 프룩토오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스 첨가구에서 0.85% NaCl 용액으로 재수화 하였을 때, 특히 높은 생존율을 나타내었으며, 일부 당류에서는 1× PBS 용액도 우수한 재수화 조건임을 확인하였다. 특히 10% 수크로오스 첨가구를 0.85% NaCl 용액으로 1시간 재수화 하였을 때, 144.33%로 매우 높은 생존율을 나타내었다.
또한 도 14에서와 같이 P. kluyveri CD34의 경우, 말토오스, 라피노오스, 수크로오스 첨가구에서는 재수화 용액을 사용하였을 때도 대조군보다 낮은 생존율을 나타내었으며, 일부 조건을 제외한 대부분의 경우 대조군보다 크게 생존율이 증가하지는 않았다. 하지만, 글루코오스 첨가구에서 1% 펩톤수를 사용한 경우 148.92%로 대조군보다 두 배 가까이 생존율이 증가하였으며, 가장 우수한 생존율을 나타낸 조건은 프룩토오스 첨가구에서 0.85% NaCl 용액으로 재수화 하였을 때, 182.10%로 매우 높은 생존율을 나타내었다.
또한 도 15에서와 같이 C. zemplinina CD80의 경우, 수크로오스 첨가구에서 0.85% NaCl 용액으로 재수화 하였을 때, 164.61%로 가장 우수한 생존율을 나타내었다.
또한 도 16에서와 같이 P. caribbica YP1의 경우, 당을 첨가하지 않고 1× PBS 용액과 1% 펩톤수에서 1시간 재수화 하였을 때도 100%가 넘는 높은 생존율을 나타내었으나, 말토오스와 1% 펩톤수를 사용하였을 때 120.66%의 생존율, 라피노오스와 D.W.를 사용하였을 때 123.22%의 생존율, 수크로오스와 0.85% NaCl을 사용하였을 때 147.76%의 생존율로 매우 우수한 생존율을 나타내었다. 또한 가장 높은 생존율을 나타낸 조건은 트레할로오스와 1× PBS 용액을 사용하였을 때, 160.69%로 가장 우수한 생존율을 나타내었다. 프룩토오스와 글루코오스 첨가구에서는 재수화 용액별로 생존율 향상의 효과가 발견되지 않았다.
또한 도 17에서와 같이 P. anomala CS7-16의 경우, 대조군의 초기 생존율이 다른 균주에 비하여 상대적으로 낮은 40.28%의 생존율을 나타내었으나, 말토오스 첨가구에 0.85% NaCl 용액을 사용하였을 때 130.74%의 생존율, 트레할로오스 첨가구에 1×PBS 용액을 사용하였을 때 128.65%의 생존율로 매우 높은 생존율을 나타내었으며, 트레할로오스 첨가구에 0.85% NaCl 용액을 사용하였을 때 152.46%로 가장 높은 생존율을 나타내었다.
상기와 같이 본 발명에서 최종 선정된 6종 발효효모의 송풍건조 시 생존율을 가장 최대로 증대시킬 수 있는 건조보호제와 재수화 용액 조건을 하기 표 10에 나타내었다.
Strain 저온송풍건조 조건 생존율 (%) 증가율(%)
탈지유 10% 당 재수화 용액 시험군 대조군
P. anomala
SJ20		 10% 트레할로오스 1% Peptone water 103.76 21.55 ▲82.21
H. uvarum
SJ69		 수크로오스 0.85% NaCl 144.33 84.07 ▲60.26
P. caribbica
YP1		 트레할로오스 1×PBS 160.69 55.20 ▲105.49
P. kluyveri
CD34		 프룩토오스 0.85% NaCl 182.10 74.26 ▲107.84
C. zemplinina CD80 수크로오스 0.85% NaCl 164.61 84.73 ▲79.88
P. anomala
CS7-16		 트레할로오스 0.85% NaCl 152.46 40.28 ▲112.18
표 10에서와 같이 각 효모별로 건조과정 중에 균체를 보호할 수 있는 당의 종류가 상이한 것을 확인하였고, 재수화 시 환경 변화에 따른 균체 생존율 향상에 영향을 줄 수 있는 재수화 용액의 종류가 각기 다른 것을 확인하였다. 또한 대조군으로 사용된 당 무첨가 및 D.W. 재수화 용액 처리군와 비교하여 최저 60.26%에서 최대 112.18%까지 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 설정한 종균화 최적 조건은 향후 해당 균주의 산업화 단계에서 높은 생존율을 확보한 시제품 생산에 도움을 줄 것으로 기대된다.
실시예 7. 항산화제 첨가에 따른 건조 효모의 저장기간 중 생존율 변화 측정
건조 효모의 성공적인 상업화를 위해서는 건조 효모 시제품의 저장기간을 최대한 확보하는 것이 매우 중요하다. 일반적으로 이용되는 동결건조의 경우 동결된 균체를 승화과정을 통해 건조시킴으로써 안정적으로 수분이 증발하여 오랜 기간 동안 보관이 가능한 장점을 지니고 있다. 반면 송풍건조의 경우에는 제조비용이 10배 가까이 저렴하지만 동결건조보다 상대적으로 높은 수분함량에 의해 쉽게 오염이 가능하고 변질될 가능성이 높다는 단점을 지니고 있다.
본 발명에서는 송풍건조의 이러한 단점을 보완하고 저장기간을 향상시키기 위하여 건조 효모의 장기보관 시 발생하는 산화과정을 최대한 억제하고자 항산화제인 비타민 C와 글루타티온(glutathione)(γ-L-Glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)을 각각 1 mM, 3 mM, 5 mM 첨가하여 건조균체를 제조하고 저장기간 동안의 건조 효모의 생존율을 측정하였다. 건조균체의 보관은 4℃에서 이루어졌으며, 4주 간격으로 8주간 생존율 변화를 측정하였다. 보호제와 재수화 용액은 앞선 실험에서 얻은 최적 조건을 이용하였으며, 대조군으로는 항산화제를 첨가하지 않은 건조균체를 사용하였다. 이에 대한 결과는 도 18 내지 도 20에 나타내었다.
도 18에서와 같이 P. anomala SJ20의 경우, 4주가 지났을 때 모든 시험구에서 큰 차이가 없었으나, 8주가 지났을 때는 3 mM 글루타티온을 첨가한 구에서 가장 낮은 생균수 감소를 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 항산화제를 첨가하지 않은 대조군(Control)에서도 생균수가 약 1 log CFU/mL 밖에 감소하지 않아 P. anomala SJ20에서 항산화제 첨가에 따른 저장성 향상 효과를 크게 나타내지 않음을 확인하였다.
또한 도 18에서와 같이 H. uvarum SJ69의 경우, 4주가 지났을 때 3 mM 비타민 C 또는 1, 3, 5 mM 글루타티온을 첨가한 실험군에서 대조군보다 생균수의 감소가 적었으며, 8주가 지났을 때는 5 mM 글루타티온을 첨가한 실험군에서 가장 생균수의 감소가 적었다. 대조군과 비교하여도 생균수가 0.31 log CFU/mL 더 적게 감소하는 것으로 나타나 H. uvarum SJ69의 경우 항산화제 첨가에 따른 저장성 증대 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한 도 19에서와 같이 P. caribbica YP1의 경우, 모든 시험구에서 4주와 8주가 지났을 때, 모든 항산화제 처리군에서 대조군보다 우수한 저장성 효과를 나타내었으며, 그 중에서도 5 mM vitamin C를 첨가한 시험구에서 생균수의 감소가 가장 적게 나타났다.
또한 도 19에서와 같이 P. kluyveri CD34의 경우에는 4주가 지났을 때는 1 mM 글루타티온 첨가구에서 대조군보다 생균수의 감소가 적었으나, 8주가 지났을 때는 항산화제 무첨가구인 대조군이 가장 적은 생균수 감소를 나타내어 항산화제 첨가에 따른 효과를 발견하지 못하였다.
또한 도 20에서와 같이 C. zemplinina CD80의 경우, 4주가 지났을 때는 대조군이 가장 생균수 감소가 적었으나, 8주가 지났을 때 대조군의 생균수 감소폭이 크게 증가하여 항산화제 첨가구들보다 저장성이 크게 떨어지는 것을 확인하였다. 반면 실험군인 항산화제 첨가구 중에서는 5 mM 비타민 C를 첨가하였을 때 대조군보다 생균수가 0.83 log CFU/mL 더 적게 감소함을 확인하여 가장 우수한 저장성 증대 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한 도 20에서와 같이 P. anomala CS7-16의 경우, 4주가 지났을 때는 대조군과 비타민 C 첨가구들의 생균수 감소 경향이 비슷하였으나, 8주가 지났을 때 대조군의 생균수가 크게 감소함을 확인하였다. 반면 1 mM의 비타민 C를 제외하고 항산화제인 비타민 C와 글루타티온 첨가구들의 생균수가 적게 감소함을 확인하였으며 특히 글루타티온 첨가구에서 생균수 감소가 적어 저장성이 크게 향상됨을 확인하였다. 또한 글루타티온의 경우 첨가 비율에 따라 저장성이 더욱 증대되었으며, 5 mM 글루타티온을 첨가하였을 때 대조군과 비교하여 생균수가 2.03 log CFU/mL 더 적게 감소함을 확인하여 가장 우수한 저장성 증대 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 8. 저장 온도 및 항산화제 첨가에 따른 건조 효모의 저장성 확인
상기 실시예 7에서와 같이 일부 효모들에 있어 항산화제의 첨가가 저장기간 중 생균수 감소를 억제하는 것을 확인하였다. 일반적으로 건조 효모의 보관 온도는 4℃가 권장되고 있으며, 20℃ 이상에서는 부형제 또는 건조보호제 등의 변질에 의해 오염이 일어나거나 잡균이 번식할 가능성이 존재한다. 따라서 본 실시예에서는 항산화제 첨가 시 저장 온도가 저장기간 중 건조효모에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해 각 건조 효모들을 4, 20, 30℃ 온도에서 8주간 저장하며 생균수를 측정하였다. 이에 따른 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에서와 같이, 4℃에서 보관시킨 건조효모들의 경우, 8주가 지났을 때도 색상의 변화가 없었고 단일 효모를 확인할 수 있었다. 반면, 20℃와 30℃의 경우, 4주가 지났을 때부터 건조 효모의 색이 변질되는 것을 확인하였고 2개 이상의 미생물이 증식하여 정확한 카운팅이 어려운 문제점이 발생하였다. 따라서 본 발명에서 개발한 저온송풍건조 효모의 보관 온도는 4℃가 적당할 것으로 판단하였다.
실시예 9. 주사전자현미경(SEM)을 이용한 저온송풍건조 효모 종균의 형태학적 관찰
상기 실시예에서와 같이 보호제와 탈지유를 첨가하여 송풍건조한 6가지 효모 각각의 형태학적 특징을 조사하기 위하여 다음과 같은 방법으로 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 건조 효모의 표면을 관찰하였다. 표면 관찰을 위하여 송풍건조된 효모 분말을 spin vacuum dryer (VC-36R, Taitec, Saitama-ken, Japan)로 37℃에서 30분간 잔존하는 수분을 모두 증발시킨 후 양면 금속 테이프를 이용하여 스터브 (stub)에 고정시켰다. 그런 다음, sputter coater (WI-RES-Coater-001)를 이용하여 금으로 코팅한 후 SEM (SU8220, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 5 kV 전압을 걸어주어 4,000배에서 관찰하였다. 이에 대한 결과를 도 22에 나타내었다. 도 22에서 가장 왼쪽 위의 결과부터 오른쪽으로 세 개의 결과는 각각 SJ20(P. anomala SJ20), SJ69(H. uvarum SJ69), YP1(P. caribbica YP1)를 나타내며, 가장 왼쪽 아래의 결과부터 오른쪽으로 세 개의 결과는 각각 CS7-16(P. anomala CS7-16), CD80(C. zemplinina CD80), CD34(P. kluyveri CD34)의 결과를 나타낸다.
현미경 관찰 결과 도 22에서와 같이, 각 효모들은 탈지유(skim milk)로 추정되는 매우 큰 입자들과 아주 작은 결정 구조의 당류에 둘러싸여 밀집된 형태로 존재하였다. 또한 H. uvarum SJ69 등은 효모 표면이 보호제 용액에 코팅되어 매끄럽지 못하였으며, P. anomala SJ20, P. anomala CS7-16 는 매끄러운 표면을 유지한 채 탈지유와 당류에 덮여진 형태를 유지하였다. 이는 각종 효모별 세포벽의 구조 등에 기인하는 것으로 판단된다. 또한 P. anomala SJ20, C. zemplinina CD80, P. anomala CS7-16 등 일부 효모들에서 출아흔이 발견되어, 1시간 재수화 용액 처리 동안 멈추어져 있던 출아가 다시 진행되어 생존율이 증가하는 원인이 되는 것으로 판단하였다.
모든 실험은 3회 이상 반복 측정한 데이터의 평균과 표준편차를 구하였으며, paired Student’s t-test (p≤0.05 또는 p≤0.01)를 사용하여 유의성을 검증하였다.
국립농업과학원 KACC93297P 20180222 국립농업과학원 KACC93298P 20180222 국립농업과학원 KACC93292P 20171018 국립농업과학원 KACC93299P 20180222 국립농업과학원 KACC93291P 20171018 국립농업과학원 KACC93290P 20171018
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Optimal manufacturing methods of Candida zemplinina starters which produce high level of aromatic compounds using air-blast drying technology <130> KNU1.313P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

  1. (S1) 캔디다 잼플리니나(Candida zemplinina) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계;
    (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및
    (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하고, 상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v) 수크로오스를 포함하며, 상기 재수화 용액은 NaCl 용액인 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 캔디다 잼플리니나 균체는 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P)인 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 캔디다 잼플리니나 균체는 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P)이며,
    상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v) 탈지유를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 건조 보호용 조성물은 비타민 C 또는 글루타티온을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 비타민 C 또는 글루타티온은 4 내지 7 mM 로 포함되는 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 NaCl 용액은 0.5 내지 1 % NaCl 용액인 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  8. (S1) 캔디다 잼플리니나 CD80(Candida zemplinina CD80)(미생물 수탁번호 : KACC93299P) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계;
    (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및
    (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하며,
    상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v) 탈지유; 및 5 내지 15 %(w/v) 수크로오스;를 포함하고,
    상기 건조 보호용 조성물은 비타민 C 또는 글루타티온을 4 내지 7 mM 더 포함하며,
    상기 재수화 용액은 0.5 내지 1 % NaCl 용액인 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 제조방법.
  9. (S1) 캔디다 잼플리니나(Candida zemplinina) 균체와 건조 보호용 조성물을 혼합하여 종균 용액을 제조하는 단계;
    (S2) 상기 종균 용액을 30 내지 45 ℃에서 저온송풍건조시켜 종균 분말을 제조하는 단계; 및
    (S3) 상기 종균 분말에 재수화 용액을 처리하는 단계;를 포함하고, 상기 건조 보호용 조성물은 5 내지 15 %(w/v) 수크로오스를 포함하며, 상기 재수화 용액은 NaCl 용액인 것을 특징으로 하는, 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (S2) 단계 이후에, 상기 종균 분말을 0 내지 10 ℃에서 보관하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 저장성 증대방법.
KR1020180057804A 2018-05-21 2018-05-21 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법 KR102061671B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180057804A KR102061671B1 (ko) 2018-05-21 2018-05-21 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180057804A KR102061671B1 (ko) 2018-05-21 2018-05-21 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190132819A KR20190132819A (ko) 2019-11-29
KR102061671B1 true KR102061671B1 (ko) 2020-01-02

Family

ID=68728807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180057804A KR102061671B1 (ko) 2018-05-21 2018-05-21 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102061671B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874924B (zh) * 2022-01-18 2023-07-18 吉林大学 一株酵母菌菌株cc-pt4及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013192490A (ja) * 2012-03-19 2013-09-30 Research Institute Of Environment Agriculture & Fisheries Osaka Prefecture 微生物乾燥粉末の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013192490A (ja) * 2012-03-19 2013-09-30 Research Institute Of Environment Agriculture & Fisheries Osaka Prefecture 微生物乾燥粉末の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMB Expr,제6권,105호,1-10면(2016) 1부.*
FEMS Yeast Res.,제14권,215-237면 (2014) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190132819A (ko) 2019-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Di Maro et al. Yeast dynamics during spontaneous wine fermentation of the Catalanesca grape
Berbegal et al. Technological properties of Lactobacillus plantarum strains isolated from grape must fermentation
Mendoza et al. Yeast diversity during the fermentation of Andean chicha: A comparison of high-throughput sequencing and culture-dependent approaches
Meersman et al. Breeding strategy to generate robust yeast starter cultures for cocoa pulp fermentations
do Amaral Santos et al. Microbiological and physicochemical characterisation of caxiri, an alcoholic beverage produced by the indigenous Juruna people of Brazil
Nemcová et al. The diversity of yeasts associated with grapes and musts of the Strekov winegrowing region, Slovakia
Miguel et al. Physicochemical and microbiological description of Caxiri–a cassava and corn alcoholic beverage
Cioch-Skoneczny et al. Quantitative and qualitative composition of yeast microbiota in spontaneously fermented grape musts obtained from cool climate grape varieties ‘Rondo’and ‘Regent’
CN110408571B (zh) 一株凝结芽孢杆菌及其应用
CN114134055B (zh) 一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母及其应用
AU2018265499B2 (en) A strain of yeast
KR102061671B1 (ko) 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 캔디다 잼플리니나 효모 종균의 최적 제조 방법
KR102061678B1 (ko) 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 한세니아스포라 우바룸 효모 종균의 최적 제조 방법
KR102061681B1 (ko) 저온송풍건조 기법을 이용한 고향미 생성 피치아 효모 종균의 최적 제조 방법
ES2222088B1 (es) Cepas de saccharomyces cerevisiae cect 11774 y cect 11775 y su empleo en la elaboracion, por fermentacion alcoholica, de bebidas alcoholicas y otros productos alimenticios.
Tapsoba et al. Microbial diversity and biochemical characteristics of Borassus akeassii wine
Ale et al. Freeze-drying of wine yeasts and Oenococcus oeni and selection of the inoculation conditions after storage
CN109749962B (zh) 一株耐受性强、产酸高的山西老陈醋优势土著风味植物乳杆菌及应用
CN108740014B (zh) 一种高果香酸奶及其制备方法
Senses-Ergul et al. Characterization of some indigenous Saccharomyces cerevisiae isolates obtained during vinification of'Kalecik Karasi'and'EMIR'grapes grown in Central Anatolia
Kadhim et al. Morphological and phylogenetic identification of Pichia species associated with foods in Basrah, Iraq
Lenka et al. Yeasts isolated from traditional brem Bali show stress tolerance phenotype against fermentation-related stresses
Yao et al. Selection of potential Bacillus starters for cocoa beans fermentation improvement
KR101460566B1 (ko) 혈전용해효소를 생산하는 싸카로마이세스속 ａｆｙ-1 균주 및 상기 균주를 포함하는 장류
KR101555175B1 (ko) 전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant