CN108740014B - 一种高果香酸奶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高果香酸奶及其制备方法，所述方法以脱脂牛乳为原料，通过加入白砂糖调整固形物含量，经均质、杀菌后冷却，加入德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146进行发酵。本发明制备方法以德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146为发酵剂，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146产乙酸乙酯高，增香快。该菌株能够在6h内生成高含量的乙酸乙酯，且乙酸乙酯含量可维持较长时间不变，赋予酸奶怡人的果香味。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品发酵的技术领域，具体涉及一种高果香酸奶及其制备方法。
背景技术
酸奶是以优质的牛奶为原料，用纯乳酸菌发酵剂发酵后加工制成的一种乳制品，产品浓稠，质地均匀，具有独特的酸香味，且营养丰富，既可作为便捷小食直接食用，又可作为膳食补充品。
有研究表明影响消费者购买酸奶的主要因素依次是口感，风味，价格，功能和品牌(汤志庆.酸奶消费者行为研究(1)-主要的消费需求[J].乳业科学与技术,2006,28(1):23-24)。酸奶的典型风味物质主要有乙醛、2,3-丁二酮和乙酸乙酯等，贡献出甜味、奶香味和果香味三大酸奶特色风味(R.J.mcgorrin,A.m.Spanier,F.Shahidi,et al.Advances indairy flavor chemistry[C].USA:Special publication-royal society of chemistry,2001:67-84.)。其中，果香味是酸奶的主要风味之一，乙酸乙酯是果香味的主要贡献者。文献“Volatile organic aroma compounds producedby thermophilicandmesophilicmixed straindairy starter cultures”(Imhof R etc.WT-Food Scienceand Technology,1995,28(1):78-86)研究单菌发酵实验时列举了各种发酵菌株的风味组成及其特征，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种在38℃下经30h发酵后最高可产6.17μg/kg的乙酸乙酯。文献“不同品牌酸奶香气成分研究”(牛云蔚,肖作兵,张喆,等.[J].粮食与油脂,2013(9):49-52.)中发现5种品牌的市售酸奶中酯类物质含量均较低，仅有1种酸奶含有乙酸乙酯，其余4种市售酸奶的乙酸乙酯含量均为0μg/kg，表明市售酸奶中乙酸乙酯含量普遍较低。酸奶酸度高，对发酵剂的耐酸特性具有一定要求。因此，研究一种乙酸乙酯含量高，果香味浓郁的酸奶，具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种高果香的酸奶及其制备方法。
具体地，本发明提供了一种高果香酸奶的制备方法，所述方法以脱脂牛乳为原料，通过加入白砂糖调整固形物含量，经均质、杀菌后冷却，加入德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146进行发酵。
本发明利用德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146作为发酵剂进行发酵。本发明人研究发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)CGMCC No.15146菌株发酵时pH降低较快，6h时将pH降为5.17，10h将pH降为4.33；菌株发酵时的酸度值升高较快，6h时酸度值为58.25°T，10h时酸度值为97.50°T；该菌株产乙酸乙酯高，6h可产165.59μg/kg，10h时仍可维持乙酸乙酯含量稳定，含量约为164.07μg/kg，该菌株在发酵后期可维持乙酸乙酯含量基本稳定不变，应用于酸奶的制备中可显著增强最终产品的果香味。
进一步的，添加4-6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为15-18％，优选的调整固形物含量为16％。
进一步的，所述均质的压力为14-21MPa，温度为40-85℃。
进一步的，所述杀菌为65℃下巴氏杀菌30min或105℃下巴氏杀菌10min。
优选的，将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146菌株在改良MRS培养基中活化，然后按1-3％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
或者优选的，将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146直投式发酵剂按0.05-0.2％的重量比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中。
其中，直投式发酵剂是将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146的浓度调整至109cfu/mL以上，经冷冻干燥处理后得到。
进一步的，所述发酵的温度为37-42℃，时间为4-12h。
本发明还提供了所述制备方法制得的高果香酸奶。由于所用发酵剂德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146高产乙酸乙酯，使得制备得到的酸奶中乙酸乙酯的含量较高，具有突出的果香味。
本发明的有益效果为：
本发明制备方法以德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146为发酵剂，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146产乙酸乙酯高，增香快。该菌株能够在6h内生成高含量的乙酸乙酯，且乙酸乙酯含量可维持较长时间不变，赋予酸奶怡人的果香味。
生物材料保藏信息：
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)，已于2018年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.15146。
附图说明
图1为不同发酵剂制得的酸奶的感官评定结果；
图2为本发明高果香酸奶发酵过程中的pH变化；
图3为本发明高果香酸奶发酵过程中的酸度值变化。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1德氏乳杆菌保加利亚亚种的分离与鉴定
(1)制备合适的样品稀释梯度并培养
将-80℃冰箱中贮藏的四川阿坝传统牦牛酸乳甘油样品取出，置于冰上解冻。震荡混匀后取0.5mL样品加入4.5mL无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5mL稀释液加入4.5mL无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释，以此类推，直至稀释到10-6，从每个梯度的稀释液中吸取100μL，均匀涂布于LBS固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃厌氧下培养36-48h，并及时观察。
(2)划线分离与纯化
将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验
挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果。
(4)菌种保藏
将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mL液体LBS培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20-24h，吸取1mL菌液至保菌管中，6000rpm 3min离心，去上清，加入1mL30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
(5)16S rDNA序列扩增
吸取1mL菌液6000rpm 3min离心，去上清，水洗两次，得菌泥，加入SDS裂解液破碎细胞壁，再加入酚-氯仿萃取核酸DNA，12000rpm 10min离心取上清，乙醇溶液水洗两次，12000rpm 5min离心去上清，烘干，加入50μL无菌水重悬，即得菌株DNA模板。以此为模板，进行PCR扩增，流程如下：
1)扩增体系25μL：
其中模板量为1μL，Taq酶Mix为12.5μL，27F为0.5μL，1492R为0.5μL，ddH2O为10.5μL。所用引物为27F:AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA(SEQ ID No 1)和1492R:GGT TAC CTTGTT ACG ACT T(SEQ ID No 2)。扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示，长度为1399bp。
2)扩增条件：
预变性温度：105℃
第一步变性：95℃7min；95℃30s
第二步退火：55℃30s
第三步延伸：72℃90s
循环次数：95℃30s，33次循环
第四步最后延伸：72℃5min
第五步保持：12℃10min
(6)琼脂糖凝胶电泳
称取80mL琼脂糖加入锥形瓶中，加入80mL1xTAE，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入2‰核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入PCR扩增产物，每个孔中加入4μL PCR扩增产物，120V 30min跑胶结束后取出，置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录PCR成功样品的编号，将成功的PCR产物置于-20℃冰箱中保藏。
(7)菌株序列送测与鉴定
将PCR成功的样品送到华大基因进行检测，根据华大基因反馈的序列结果，结合NCBI菌株序列数据库进行BLAST检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。结果显示，本发明提供的菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)。
该菌株的菌落特征为：该菌株在固体LBS培养基上由浅灰色至白色，12h左右时菌落呈浅灰色，有光泽，边缘雪花状，透明，扁平，中等大小；40h左右时菌落呈白色，无光泽，边缘不规则，不透明，微凸起，较大。
实施例2德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146发酵酸奶
德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146应用于酸奶的发酵时可增大乙酸乙酯的含量。
1、德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在酸奶发酵过程中乙酸乙酯含量变化
(1)GC-MS测稀酸奶发酵过程中乙酸乙酯含量
气谱条件为：Rtx-WAX毛细管柱；柱子规格：30m×0.25mm×0.25mm，进口温度为240℃，分流比10，柱流速1mL/min，载气为氦气；程序升温：初始温度40℃，保持3min；10℃/min升温至90℃；5℃/min升温至200℃，保持5分钟。
质谱条件为：离子化方式EI，发射能量为70eV，发射电流为200μA，检测器电压为1.4kV，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度：150℃，质荷比30-500。化合物检索结果与NIST和Varian2个标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。以2μL的0.05mg/mL癸酸乙酯为内标，计算乙酸乙酯含量。
(2)酸奶的模拟发酵
以市售菌株C1、C2为对照菌，将-80℃保存的本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146接种于改良MRS液体培养基中，其中改良MRS培养基配方为：胰蛋白胨(10g)、酵母膏(5g)、葡萄糖(20g)、柠檬酸二铵(2g)、乙酸钠(25g)、硫酸镁(0.58g)、硫酸锰(0.11g)、吐温80(1mL)、磷酸二氢钾(6g)、硫酸亚铁(0.03g)、蒸馏水(1000mL)，pH5.5。在37℃下培养12-14h，传代培养2-3次，取菌液100μL接种于顶空气相瓶内(含5mL 16％固形物的酸奶)，置于42℃下培养10h，分别于0h、6h、10h取样，测其挥发性风味物质含量变化。实验使用的菌株信息如表1所示。
表1菌株信息表
(3)发酵过程中乙酸乙酯的含量变化
发酵过程中乙酸乙酯的含量变化如表2所示。由表2可知，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在各个发酵时间段内乙酸乙酯产量都高于C1和C2，6h时，C1的乙酸乙酯产量为0μg/kg，C2为123.71μg/kg，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146为165.59μg/kg，高于ImhofR检测的乙酸乙酯(6.17μg/kg)，且高于对照菌株C1和C2，10h时C1酸奶中仍无乙酸乙酯检出，C2酸奶中的乙酸乙酯含量有较大幅度下降，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCCNo.15146发酵的酸奶中的乙酸乙酯的含量为164.07μg/kg，与6h的含量相近，故德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146产乙酸乙酯的能力强，酸奶的感官雷达图如图1所示，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在酸奶中的应用，提高了酸奶的果香味。
表2不同发酵时间段乙酸乙酯产量(μg/kg)
注：不同字母表示同一列间的差异性(p﹤0.05)
2、德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在酸奶发酵过程中pH值变化
将-80℃保存的本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146接种于改良MRS液体培养基中，在37℃下培养12-14h，传代培养2-3次，取菌液100μL接种于5mL的16％固形物的新鲜脱脂牛乳中，置于42℃下培养10h，分别于0h、6h、10h取样，测其pH变化。实验结果如表3及图2所示。由图2可知，C1在6h内pH降到5.63，C2降到5.33，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146降到5.17，pH下降程度高于C1和C2，C1在10h内pH降低到4.40，C2降到4.45，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146降到4.33，pH下降程度高于C1，低于C2，故德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146降低pH的能力较强。
表3不同发酵时间段的pH变化
注：不同字母表示同一列间的差异性(p﹤0.05)
3、德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在酸奶发酵过程中酸度值变化
将-80℃保存的本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146接种于改良MRS液体培养基中，在37℃下培养12-14h，传代培养2-3次，取菌液100μL接种于5mL的16％固形物的新鲜脱脂牛乳中，置于42℃下培养10h，分别于0h、6h、10h取样，测其酸度值变化。实验结果如表4及图3所示。由图3可知，C1在6h内酸度值升高到46.75°T，C2升到48.25T，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146升到58.25°T，酸度值升高程度高于C1和C2，C1在10h内酸度值升高到61.75°T，C2升到92.00°T，德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146升到97.50°T，酸度值升高程度高于C1，低于C2，故德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146的产酸能力较强。
表4不同发酵时间段的酸度值变化(°T)
注：不同字母表示同一列间的差异性(p﹤0.05)
实施例3利用德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加4％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为15％；
(2)均质：均质的压力为14MPa，温度为85℃；
(3)巴氏杀菌：105℃下巴氏杀菌10min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，投入重量比为0.1％的CGMCC No.15146直投式发酵剂，搅拌均匀，在37℃下发酵12h；直投式发酵剂是将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCCNo.15146的浓度调整至109cfu/mL以上，经冷冻干燥处理后得到；
(5)发酵至终点时酸度值为70°T以上，pH为4.70，凝乳后在3℃下过夜放置，并保持24h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为76.16μg/kg，果香味浓郁。
实施例4利用德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加5％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为16％；
(2)均质：均质的压力为18MPa，温度为60℃；
(3)巴氏杀菌：105℃下巴氏杀菌10min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在改良MRS液体培养基中活化2代后，接第3代于脱脂乳培养基中得到凝乳，凝乳中德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146的活菌浓度在3×108cfu/mL，然后将凝乳按2％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中，搅拌均匀，在40℃下发酵10h；
(5)发酵至终点时酸度值为70°T以上，pH为4.50，凝乳后在5℃下过夜放置，并保持48h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为38.05μg/kg，果香味浓郁。
实施例5利用德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为18％；
(2)均质：均质的压力为21MPa，温度为40℃；
(3)巴氏杀菌：105℃下巴氏杀菌10min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在改良MRS液体培养基中活化2代后，接第3代于脱脂乳培养基中得到凝乳，凝乳中德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146的活菌浓度在2×108cfu/mL，然后将凝乳按4％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中，搅拌均匀，在42℃下发酵6h；
(5)发酵至终点时酸度值为70°T以上，pH为4.70，凝乳后在5℃下过夜放置，并保持48h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为51.98μg/kg，果香味浓郁。
实施例6利用德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在制备酸奶
本发明高果香酸奶的制备方法包括以下步骤：
(1)调整固形物含量：在新鲜的脱脂牛乳中添加6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为18％；
(2)均质：均质的压力为21MPa，温度为40℃；
(3)巴氏杀菌：在65℃下巴氏杀菌30min；
(4)接种：酸奶冷却到21℃，将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146在改良MRS液体培养基中活化2代后，接第3代于脱脂乳培养基中得到凝乳，凝乳中德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146的活菌浓度在2×108cfu/mL，然后将凝乳按4％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中，搅拌均匀，在42℃下发酵4h；
(5)发酵至终点时酸度值为70°T以上，pH为4.70，凝乳后在5℃下过夜放置，并保持48h。
上述制备方法制得的高果香酸奶的乙酸乙酯的含量为39.75μg/kg，果香味浓郁。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 光明乳业股份有限公司
<120> 一种高果香酸奶及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
agagtttgat cctggcctca 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1399
<212> DNA
<213> 16S rDNA
<400> 3
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acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtctctg cgtccccgaa gggaaccacc 420
tatctctagg tgtagcacag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat 480
taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg 540
cggtcgtact ccccaggcgg agcgcttaat gcgtttgctg cggcactgag gaccggaaag 600
tccccaacac ctagcgctca tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc 660
gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttgcagacca gagagccgcc ttcgccactg 720
gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg gaattccact ctcctcttct 780
gcactcaaga atgacagttt ccgatgcagt tccacggttg agccgtgggc tttcacatca 840
gacttatcat tccgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa tccggacaac gcttgccacc 900
tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtgac tttctggttg attaccgtca 960
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aaccttcttc actcacgcgg cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc 1080
tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcagtct 1140
ctcaactcgg ctacgcatca ttgccttggt aggcctttac cccaccaact agctaatgcg 1200
ccgcgggctc atcctaaagt gacagcttac gccgcctttc aaacttgaat catgcgattc 1260
atgttgttat ccggtattag cacctgtttc caagtggtat cccagtcttt agggcagatt 1320
gcccacgtgt tactcaccca tccgccgcta gcgtccaaca aatcaccccg aagggatctt 1380
tgaattcagc tcgctcgac 1399
Claims (2)
1.一种高果香酸奶的制备方法，其特征在于，所述方法以脱脂牛乳为原料，通过加入白砂糖调整固形物含量，经均质、杀菌后冷却，加入德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146进行发酵；
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，已于2018年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.15146；
添加4-6％白砂糖，调整脱脂牛乳的固形物含量为15-18％；
所述均质的压力为14MPa，温度为40-85℃；
所述杀菌为65℃下巴氏杀菌30min或105℃下巴氏杀菌10min；
将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146菌株在改良MRS培养基中活化，然后按1-3％的体积比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中；
或者，将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146直投式发酵剂按0.05-0.2％的重量比加入到杀菌后的含糖脱脂牛乳中；
直投式发酵剂是将德氏乳杆菌保加利亚亚种CGMCC No.15146的浓度调整至109cfu/mL以上，经冷冻干燥处理后得到；
所述发酵的温度为37-42℃，时间为4-12h。
2.权利要求1所述的制备方法制得的高果香酸奶。
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