CN107840874A - 一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用 - Google Patents

一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用，属于食品生物技术领域。本发明成功将胡萝卜抗冻蛋白氨基酸序列为模板，合成在毕赤酵母中表达重组胡萝卜抗冻蛋白的全基因序列，并将其在毕赤酵母中重组表达，通过诱导表达，实现抗冻蛋白的大量制备，产量为0.88g/L，为抗冻蛋白的工业化生产提供了帮助。

Description

一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用，属于食品生物技术领域。
背景技术
胡萝卜抗冻蛋白是指在胡萝卜中具有冷诱导特性的抗冻蛋白。其热滞活性较低，但含有多个亲水性冰晶结合域，具有较强的抑制冰晶重结晶的能力。对胡萝卜的低温冻害有很强的保护作用。
胡萝卜抗冻蛋白发现的较早，本身的特性研究的较为透彻，具有较强的抑制重结晶能力，应用范围很广。但是作为植物抗冻蛋白的一种，依然存在着制备困难的问题。依靠提取的方法从胡萝卜中获取抗冻蛋白，工作量大，过程复杂，成本高，得率却很低，且难以获得单一的胡萝卜抗冻蛋白。
基因工程的成熟运用为大量制备胡萝卜重组抗冻蛋白提供了新的方法。通过将胡萝卜中编码抗冻蛋白的基因进行异源表达，然后利用微生物发酵的方法可以实现简单地大量制备胡萝卜重组抗冻蛋白。目前，将胡萝卜抗冻蛋白进行重组表达的研究已有报道，但集中在将胡萝卜基因组中编码抗冻蛋白的原基因在大肠杆菌中进行异源表达。Dang-Quan Zhang等在《Expression,purification,and antifreeze activity ofcarrot antifreezeprotein and its mutants》利用胡萝卜基因组中编码抗冻蛋白的基因分别构建质粒pET11a-DcAFP-N130Q和pET11a-DcAFP-N130V并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达，得到了热值活性为0.35℃(1mg/mL)的重组抗冻蛋白。但是，抗冻蛋白在大肠杆菌内往往不能被正确的加工而形成有活性的抗冻蛋白，且用大肠杆菌表达的蛋白以包涵体的形式存在，这样对后续的分析工作十分困难。且由于大肠杆菌表达的蛋白为胞内蛋白，破碎细胞导致胞内蛋白释放，给目标蛋白的纯化带来很大的困难。
巴斯德毕赤酵母表达系统既有原核生物分子基因操作与生长的特征，又具备真核生物翻译后蛋自修饰的亚细胞机制。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，培养基中也不含其他的蛋白质，这样分泌的外源蛋白占培养液中总蛋白的绝大部分，因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化。Jun Hyuck Lee等根据酵母抗冻蛋白的氨基酸序列，利用最有密码子的原则，翻译出最适的编码重组抗冻蛋白的基因LeIBP并构建质粒pPICZαA-LeIBP，导入毕赤酵母GS115中，发酵液中抗冻蛋白的含量为272mg/L，热值活性为0.4℃，抗冻蛋白热滞活性提升较少。
因此，实现胡萝卜抗冻蛋白在在毕赤酵母中表达，大量制备胡萝卜重组抗冻蛋白，提高胡萝卜抗冻蛋白的热滞活性和重结晶抑制活性，简便高效的提取工艺是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种胡萝卜抗冻蛋白的基因工程菌，所述基因工程菌是以巴斯德毕赤酵母为宿主，表达来源于胡萝卜的抗冻蛋白。
在本发明的一种实施例中，所述胡萝卜的抗冻蛋白的基因CaAFP如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法是：将氨基酸序列为SEQ ID NO.1的抗冻蛋白基因连接到表达载体pPIC9K上，线性化后转化到巴斯德毕赤酵母中，筛选正确的转化子，得到基因工程菌。
本发明的第三个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法是提供一种所述基因工程菌发酵生产抗冻蛋白的方法，具体发酵方法如下：
(1)将基因工程菌在YPD固体平板上进行划线活化，活化的条件是：温度28℃-32℃，时间24-48h；
(2)挑取单菌落，接种至50mL BMGY液体培养基，在转速为150-250rpm，温度25-32℃条件下培养至OD为0.8-2.0，2500-5000×g离心2-8min离心收集菌体；
(3)用80-150mLBMMY液体培养基重新悬浮细胞，在150-250rpm，25-32℃的条件下开始诱导发酵培养；
(4)诱导发酵开始后，每8-16h向发酵液中加入甲醇维持诱导，至发酵液中甲醇的终浓度为0.5-2％(v/v)。诱导发酵。发酵结束后，5000-10000×g离心10min-30min，收集上清液。
(5)用截留分子量为1k-3k的透析膜对得到的上清液进行脱盐处理，除去发酵液中的盐分；然后将截留液进行硫酸铵沉淀，饱和度为70％-90％，2℃-7℃静置20min-90min，7000-10000×g离心20min-30min得到粗蛋白质样品。用去离子水溶解粗蛋白质样品，然后采用RP-HPLC(Delta-Pak C18，3.9×150mm)柱梯度洗脱，洗脱液为体积分数10％-60％(含体积分数为0.1％的三氟乙酸)的乙腈，收集具有热值活性的洗脱峰，然后用截留分子量为1k-3k的透析膜透析32h-60h，冻干，获得抗冻蛋白纯品。
本发明的有益效果：
本发明获得了一种编码重组胡萝卜抗冻蛋白的基因。结果表明，该基因可以在毕赤酵母中高效表达。经过基因工程菌株的构建和筛选，得到了一株可以胡萝卜重组抗冻蛋白、且重结晶抑制活性和热值活性均较高的毕赤酵母菌株，热值活性可达5.42℃，重结晶抑制活性明显高于其它抗冻蛋白。
本发明成功构建的重组毕赤酵母菌株经过诱导发酵，便可实现抗冻蛋白的大量制备，产量为0.88g/L，与从天然产物中提取抗冻蛋白相比，操作简单，且产率高；同时，该重组毕赤酵母菌株可以直接将抗冻蛋白分泌到发酵液中，提取过程简单，这些都为抗冻蛋白的工业化生产提供了帮助。
本发明提供了一种简单且易操作的发酵液中重组胡萝卜抗冻蛋白的纯化方法，本方法易于进行放大实验，这也为重组胡萝卜抗冻蛋白的工业化生产提供了帮助。
本发明提供的重组胡萝卜抗冻蛋白样品，可以明显的降低冻融循环过程中冰晶对面团的破坏程度，同时也可以对酵母起到保护作用。
附图说明
图1摇瓶发酵胡萝卜抗冻蛋白CaAFP1的热值活性
图2摇瓶发酵胡萝卜抗冻蛋白CaAFP2的热值活性
图3摇瓶水平转导pPIC9K空载体的重组酵母菌株发酵液的热值活性
图4发酵罐发酵胡萝卜抗冻蛋白CaAFP1的热值活性
图5发酵罐发酵胡萝卜抗冻蛋白CaAFP2的热值活性
图6发酵罐水平转导pPIC9K空载体的重组酵母菌株发酵液的热值活性
图7抗冻蛋白的重结晶抑制活性：(a)牛血清白蛋白；(b)胡萝卜抗冻蛋白CaAFP1
图8抗冻蛋白的重结晶抑制活性：(a)牛血清白蛋白；(b)胡萝卜抗冻蛋白CaAFP2
图9降低冻融循环过程中冰晶对面团破坏的效果：(a)不添加抗冻蛋白；(b)添加抗冻蛋白CaAFP1
具体实施方式
培养基：
斜面培养基：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物7-20g/L，蛋白胨10-30g/L，琼脂10-20g/L，pH自然；
种子培养基(YPD液体培养基)：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物7-20g/L，蛋白胨10-30g/L，pH自然；
BMGY液体培养基：蛋白胨15-25g/L，酵母提取物7-13g/L，无氨基酸的酵母氮源10-15g/L，生物素0.3-0.5g/L，100mL/L 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，10mL/L甘油，4℃保存备用；
BMMY液体培养基：蛋白胨15-25g/L，酵母提取物7-13g/L，无氨基酸的酵母氮源10-15g/L，生物素0.3-0.5g/L，100mL/L 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，5mL/L甘油，4℃保存备用；
MM固体培养基：葡萄糖15-25g/L，无氨基酸的酵母氮源10-15g/L，生物素0.3-0.5g/L，琼脂10-20g/L；
MD固体培养基：葡萄糖15-25g/L，无氨基酸的酵母氮源10-15g/L，生物素0.3-0.5g/L，琼脂10-20g/L；
差示扫描量热仪测定热滞活性
将10μg样品密封于铝制坩埚中，放置在样品池中央。当设备稳定后，首先降温至-30℃，维持10min。然后升温至10℃，维持3min，然后再次降温至-30℃，记录体系的结晶焓(△Hm)和样品熔点(Tm)。接着，缓慢升温至样品体系为固液混合物的状态，称为保留温度(Th)，保留10min。再将温度从Th降低至-30℃，重复上述过程，在不同的Th处保留10min，分别记录不同Th下样品体系开始结晶的温度(To)以及结晶热(△Hf)。以纯水作为对照。当冰晶含量Ф大于10％时，THA值稳定。因此取Ф大于10％时的THA值作为抗冻蛋白的热滞活性值。冰晶含量(Ф)和THA分别按照公式(1)和(2)计算：
式中，Ф为样品中的冰晶含量；△Hf为保留温度停留后继续降温过程中体系的放热焓，△Hm为样品结晶的总放热焓。
THA＝Th-To (2)
式中，Th为样保留温度，To为结晶温度。
低温显微镜分析重结晶抑制活性
将一滴1mg/mL的抗冻蛋白溶液(1mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为对照)滴在载玻片上，然后再盖上另一载玻片后，置于低温显微镜的冷台上，以10℃/min降温至-50℃，然后在此温度下保留5min。然后温度再以1℃/min升至-16℃，然后在-16和-14℃之间进行循环，3分钟一个循环。进行7次循环后对显微镜下的图像进行拍照，观察图像中的冰晶的大小与形状，与对照相比较，当样品的冰晶大小显著低于对照时，说明该蛋白溶液具有冰的重结晶抑制活性。冰晶越小，说明该蛋白的冰重结晶抑制能力越强。
实施例1基因工程菌株毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1和株毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2的构建
将人工合成的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02的两条基因片段上加限制性内切酶EcoR I和Not I酶切位点，然后分别与载体质粒pMD18连接后得到重组质粒pMD18-T-antifreeze1和pMD18-T-antifreeze2。
利用限制性内切酶EcoR I和Not I分别双酶切质粒pMD18-T-antifreeze1和pMD18-T-antifreeze2，然后胶回收获得基因CaAFP1和CaAFP2；然后利用T4DNA连接酶将其连接到同样用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切的质粒pPIC9K，构建重组表达载体pPIC9K-CaAFP1和pPIC9K-CaAFP2，并将其转化到大肠杆菌JM109中，在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上挑选阳性重组子，并测序验证，得到重组大肠杆菌JM109-CaAFP1和JM109-CaAFP2。
将制备的表达载体pPIC9K-CaAFP1和pPIC9K-CaAFP2分别用限制性内切酶Not I线性化，并利用电转仪(设置参数：1500V，400Ω，4-6ms)将其电转入毕赤酵母。将转化子在MD平板上筛选，得到的阳性重组子再进行MD和MM平板的双重筛选，挑出Mut+基因型转化子。然后，用浓度分别为0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0和4.0g/L抗生素G418在YPD平板上进行梯度筛选，筛选高拷贝转化子，分别得到基因工程菌毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1和毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2。
实施例2摇瓶水平基因CaAFP1和CaAFP2的表达
以转化了pPIC9K空载体的毕赤酵母-pPIC9K作为实验对照，将毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1、株毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2和毕赤酵母-pPIC9K的单菌落分别接种至50mLBMGY液体培养基的250mL摇瓶中，200rpm、28℃恒温振荡培养至对数生长期，即OD600为3～6。室温条件下，3000×g离心5min后收集酵母细胞。弃上清，用100mLBMMY液体培养基重新悬浮细胞于500mL的摇瓶中。然后，200rpm、28℃继续培养并用甲醇诱导表达。
诱导表达开始后，每12h向发酵液中加入100％甲醇维持诱导，至发酵液中甲醇的终浓度为1％。诱导发酵144h，结束后收集上清液。
用截留分子量为3k的透析膜对得到的上清液进行脱盐处理，除去发酵液中的盐分；然后将截留液进行硫酸铵沉淀，饱和度为80％，4℃静置50min，9000×g离心25min得到粗蛋白质样品。用去离子水溶解粗蛋白质样品，然后采用RP-HPLC(Delta-Pak C18，3.9×150mm)柱梯度洗脱，洗脱液为体积分数40％(含体积分数为0.1％的三氟乙酸)的乙腈，收集具有热值活性的洗脱峰，然后用截留分子量为3k的透析膜透析40h，冻干，获得抗冻蛋白纯品，毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1、毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2和毕赤酵母-pPIC9K的抗冻蛋白纯品分别为CaAFP1、CaAFP2和CaAFP0。然后用去离子水溶解样品。
毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1、株毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2和毕赤酵母-pPIC9K的发酵液中抗冻蛋白的含量分别为0.82g/L，0.27g/L，0g/L。
CaAFP1、CaAFP2和CaAFP0的热滞活性结果见图1、图2和图3，CaAFP1的THA值为4.23℃，CaAFP2的THA值为1.87℃，CaAFP0的THA值为0.05℃，由此可见，CaAFP1的热滞活性最好，抗冻效果最好。
实施例3 7L发酵罐基因CaAFP1和CaAFP2的表达
将毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1、株毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2和毕赤酵母-pPIC9K单菌落分别接种至装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在30℃，200rpm条件下摇床培养20h，作为发酵罐培养种子液。
种子液以体积分数10％的接种量接种于7L发酵罐中，初始装液量2.5L。发酵过程中的溶氧浓度维持在10％以上。整个发酵过程分为甘油分批培养、甘油流加(含短暂甘油甲醇混加)及甲醇诱导培养3个阶段。首先，在28℃、pH 6.0下分批培养10h直至甘油耗尽(表现为DO突然上升)。第二阶段，采用DO-Stat方法流加甘油浓度为500mL/L的分批补料培养基，进行细胞高密度流加培养约20h，然后使细胞在碳源缺乏的环境中生长约1h，耗尽培养基中残余的甘油。在发酵286h后，开始流加甲醇进行诱导，pH值调至5.5，进入诱导表达阶段。诱导时间为700h，在诱导期内，甲醇浓度控制在15g/L水平。
发酵结束后，用截留分子量为1k-3k的透析膜对得到的上清液进行脱盐处理，除去发酵液中的盐分；然后将截留液进行硫酸铵沉淀，饱和度为70％，27℃静置60min，10000×g离心20min得到粗蛋白质样品。用去离子水溶解粗蛋白质样品，然后采用RP-HPLC(Delta-Pak C18，3.9×150mm)柱梯度洗脱，洗脱液为体积分数10％(含体积分数为0.1％的三氟乙酸)的乙腈，收集具有热值活性的洗脱峰，然后用截留分子量为1k-3k的透析膜透析32h，冻干，毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1、毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2和毕赤酵母-pPIC9K的抗冻蛋白纯品分别为CaAFP1、CaAFP2和CaAFP0。然后用去离子水溶解样品。
毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP1、毕赤酵母-pPIC9K-CaAFP2和毕赤酵母-pPIC9K的发酵液中抗冻蛋白的含量分别为0.98g/L，0.31g/L，0g/L。
CaAFP1、CaAFP2和CaAFP0的热滞活性结果见图4、图5和图6，CaAFP1的THA值为5.42℃，CaAFP2的THA值为1.96℃，CaAFP0的THA值为0.06℃，由此可见，CaAFP1的热滞活性最好，抗冻效果最好。
实施例4抗冻CaAFP1和CaAFP2蛋白性质比较
以1mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为对照，按照实施例2中的方法，分析7L发酵罐水平制备的CaAFP1和CaAFP2抗冻蛋白的重结晶抑制活性。
结果分别见图7和图8，可见，CaAFP1抗冻蛋白溶液在反复冻融前后冰晶的大小变化不显著，而CaAFP2抗冻蛋白溶液在反复冻融前后冰晶的大小变化显著，冻融后，冰晶明显变大。因此，抗冻蛋白CaAFP1抑制重结晶能力比抗冻蛋白CaAFP2强。
实施例5抗冻CaAFP1对降低冻融循环过程中冰晶对面团破坏的效果
将200g面粉，120g去离子水和1g抗冻蛋白CaAFP1粉末混匀，经冻融循环处理(-20℃放置48h，室温融化，反复3次)后，以不添加抗冻蛋白的面团作为对照，冷冻干燥并表面喷金后，用扫描电镜观察样品的超微结构。结果如图9所示。由图可知，冷冻后的空白面团(左图)中冰晶升华后留下的孔洞大，且不均匀。而添加BaAFP-1后(右图)，冰晶升华后留下的孔洞小，且均一。说明，添加抗冻蛋白BaAFP-1可以抑制冻融循环过程中冰晶的生长，减小结晶对面团的破坏。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种胡萝卜抗冻蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体是由核苷酸序列如(a)或(b)的基因编码得到的：
(a)SEQ ID NO.01；
(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有热滞活性和重结晶抑制活性的蛋白质核苷酸序列。
2.权利要求1所述突变体的氨基酸序列。
3.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，构建方法是：将氨基酸序列为SEQID NO.1的抗冻蛋白基因连接到表达载体pPIC9K上，线性化后转化到巴斯德毕赤酵母中，筛选正确的转化子，得到基因工程菌。
6.应用根据权利要求3-5任一所述的基因工程菌生产胡萝卜抗冻蛋白突变体的发酵方法，其特征在于，所述方法步骤为：
(1)将基因工程菌在YPD固体平板上进行划线活化，活化的条件是：温度28℃-32℃，时间24-48h；
(2)挑取单菌落，接种至50mL BMGY液体培养基，在转速为150-250rpm，温度25-32℃条件下培养至OD为0.8-2.0，2500-5000×g离心2-8min离心收集菌体；
(3)用80-150mLBMMY液体培养基重新悬浮细胞，在150-250rpm，25-32℃的条件下开始诱导发酵培养；
(4)诱导发酵开始后，每8-16h向发酵液中加入甲醇维持诱导，至发酵液中甲醇的终浓度为0.5-2％(v/v)。诱导发酵。发酵结束后，5000-10000×g离心10min-30min，收集上清液；
(5)分离纯化。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(5)的分离纯化的步骤为：
(1)用截留分子量为1k-3k的透析膜对得到的上清液进行脱盐处理；
(2)然后将截留液进行硫酸铵沉淀，饱和度为70％-90％，2℃-7℃静置2min-90min，7000-10000×g离心20min-30min得到粗蛋白质样品；
(3)用去离子水溶解粗蛋白质样品，然后采用RP-HPLC(Delta-Pak C18，3.9×150mm)柱梯度洗脱，洗脱液为体积分数10％-60％(含体积分数为0.1％的三氟乙酸)的乙腈，收集具有热值活性的洗脱峰，然后用截留分子量为1k-3k的透析膜透析32h-60h，冻干，获得抗冻蛋白纯品。
8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述BMGY液体培养基组分为：蛋白胨15-25g/L，酵母提取物7-13g/L，无氨基酸的酵母氮源10-15g/L，生物素0.3-0.5g/L，100mL/L 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，10mL/L甘油。
9.根据权利要求7或8所述发酵方法得到的胡萝卜抗冻蛋白。
10.权利要求9所述胡萝卜抗冻蛋白在在冷冻面团、冰激凌制作中的应用。
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