CN1244895A - 胡萝卜抗冻多肽 - Google Patents

Abstract

可以从胡萝卜中分离新型抗冻多肽。这些肽可以有利地影响消费品(例如冷冻糖食制品)的性质。

Description

胡萝卜抗冻多肽

发明的技术领域

本发明涉及抗冻多肽(AFP)和含有AFP的食品。

发明背景

已经表明抗冻多肽能改善粮食的耐冻性。

为本发明的目的，术语AFP具有本领域内所熟知的意义，即那些抑制冰晶生长的蛋白。如见US 5,118,792。

WO 90/13571公开了用化学方法或从植物用重组DNA技术产生的抗冻多肽。所述AFP可以适当地用在食品，如冰淇淋中。实施例3B显示了当含有0.01％(重量)AFP的糖水冰糕混合物被冻成一层冰膜时的改性的冰晶形状。

WO 92/22581公开了来自植物的AFP，所述AFP可用于控制冰淇淋中的冰晶形状。这份文件还描述了一项工艺：用一种抽提介质浸润叶片，而不必破碎植物细胞，从植物的细胞间隙提取一种多肽成分。

WO 94/03617公开了从酵母中产生AFP以及它们在冰淇淋中可能的用途。WO 96/11586描述了微生物产生的鱼AFP。

然而，直到现在，AFP的使用还没有应用到商品化的消费品上。其原因之一是成本高以及获得AFP的工艺复杂。另一个问题是AFP的来源或是难以以足够的数量得到(如含有AFP的鱼)，或是不宜直接在食品中使用。

本发明的目标在于提供新型抗性多肽，所述多肽的优点是能容易地从一种丰富的自然资源中得到，并且为使用所述多肽的制品提供良好特性。

已经发现可以从胡萝卜获得具有良好重结晶抑制特性的抗冻多肽。特别是已经发现从胡萝卜得到的抗冻多肽与从其他根菜类分离得到的多肽相比，显示了明显更好的特性。特别是本发明的抗冻多肽能提供良好的重结晶抑制特性，而不会显著改变冰晶的晶体形状，因此有可能导致更有利的特性，如未冻硬的冰淇淋。

申请人已经发现：得自胡萝卜的有效抗冻多肽的一般特征在于所述多肽在SDS-PAGE上具有36kDa的表观分子量。因此本发明的第一方面涉及可以从胡萝卜获得并在SDS-PAGE上具有36kDa表观分子量的抗冻多肽。

关于这一点，本领域的技术人员清楚地知道，由于偏差，如SDS-PAGE中的偏差，只能测定结果中有些变化的表观分子量。为本发明的目的，这些变化范围，如30到40kDa或34到38kDa也包括在术语“表观分子量36kDa”的范围之内。

申请人还发现，依照本发明的有效抗冻多肽包含一些片段，所述片段具有如实施例中所示的氨基酸序列。

因此，本发明的第二方面涉及包含一个或多个具有如下氨基酸序列的片段(A-E)的多肽：

(A)LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS

(B)ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS

(C)LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS

(D)SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-

   PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS

(E)X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-

   PRO-ASN-LEU-LYS

本发明的AFP最好包含所有的部分序列(A-E)。

本发明所优选的AFP的完整氨基酸序列如下所示。因此，本发明的第三方面涉及一种抗冻蛋白，所述抗冻蛋白具有如表1所示的氨基酸序列：

   ATGAATATTGAATCATCTTTCTGCCCTATTTTGTGCATATGCATGATTTTCCTCTGCCTT13  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   72a      M  N  I  E  S  S  E  C  F  I  L  C  I  C  M  I  F  L  C  L     -

   CCAAACCTCTGTGCATCACAAAGATGCAACAACAACGACAAGCAAGCTTTACTCCAAATC73  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   132a      P  N  L  S  A  S  Q  R  C  N  N  N  O  K  Q  A  L  L  Q  I     -

   AAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCATTACAGACTCATGGGTGTCAGACGACGATTGTTGT133  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   192a      K  T  A  L  K  N  P  T  I  T  D  S  W  V  S  D  D  D  C  C     -

   GGTTGGGACCTAGTCGAATGTGACGAAACCAGCAACCGCATAATTTCCCTCATAATTCAA193  --------+---------+---------+---------+---------+---------+--  252a      G  W  D  L  V  E  C  D  E  T  S  N  R  I  I  S  L  I  I  Q     -

   GACGACGAAGCTCTCACCGGCCAAATCCCACCTCAGGTGGGAGACCTACCATACCTCCAA253  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   312a      Q  O  L  A  L  T  G  Q  I  P  P  Q  V  G  Q  L  P  Y  L  Q     -

   GCCTTATGGTTCCGTAAACTCCCCAATCTTTTCGGAAAAATCCCAGAAGAAATTTCTGCA313  -------+---------+---------+---------+---------+-----------+-- 372a      A  L  W  F  R  X  L  P  N  L  F  G  K  I  P  E  E  I  S  A     -

   CTCAAAGACCTAAAATCCCTCAGACTCAGCTCGACCAGTCTCAGTGGCCCTGTCCCTTTA373  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   432a      L  K  D  L  K  S  L  R  L  S  S  T  S  L  S  G  P  V  P  L     -

   TTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTTAACAAACTTTTGGGT433  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   492a      F  F  P  Q  L  T  X  L  T  C  L  D  L  S  T  N  K  L  L  G     -

   GTAATCCCTCCTCAGCTTTGCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTGCACTTAGAACGTAAC493  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   552a      V  I  P  P  G  L  S  T  L  P  N  L  K  A  L  H  L  E  R  N     -

   GAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGATCCCCGGACATATAT553  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   612a      E  L  T  G  E  I  P  G  I  F  G  N  F  A  G  S  P  D  I  Y     -

   CTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTCTTCCCAAAACTTTTGCTAGAGCACATCCAATT613  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   672a      L  S  K  N  Q  L  T  G  F  V  P  K  T  F  A  R  A  D  P  I     -

   AGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTCTTGTTTGGGCCTAAA673  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   732a      R  L  D  F  S  G  N  R  L  E  G  D  I  S  F  L  F  G  P  K     -

   AAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGCTTAGTTTCAATTTCTCCAGGGTG733  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--   792a      K  R  L  E  M  L  D  F  S  G  N  V  L  S  F  N  F  S  R  V     -

   CAGGAGTTTCCACCCTCTTTGACATACTTAGACTTGAACCATAACCAGATCAGCGGAAGT793  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  852a      Q  E  F  P  P  S  L  T  Y  L  D  L  N  H  N  Q  I  S  G  S    -

   CTGTCGAGTGAATTGGCTAAATTGGACCTGCAGACATTTAACGTCAGTGATAATAATCTC833  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  912a      L  S  S  E  L  A  K  L  D  L  Q  T  F  N  V  S  D  N  N  L    -

   TGCGGCAAGATTCCAACAGGGGGAAACCTCCAGAGATTCGACCGTACGGCCTATCTCCAC913  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  972a      C  G  K  I  P  T  G  G  N  L  Q  R  F  D  R  T  A  Y  L  H    -

   AACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAG973  -------+---------+---------+---------+-   1011a      N  S  C  L  C  G  A  P  L  P  L  C  +     -表1

本发明还包括上面所提到的多肽的仍然具有抗冻特性的同工型和衍生物。所述衍生物优选与表1的多肽或含有部分序列(A-E)的多肽显示至少75％的同源性，更优选大于85％的同源性，最优选大于95％的同源性。为本发明的目的，术语衍生物也包括仍然具有抗冻特性的修饰多肽，如上述多肽的糖基化形式。

本发明还包括编码上述氨基酸序列的核苷酸序列。特别是本发明涉及表1的核苷酸序列及其等位基因。

本发明还包括从编码区衍生出的能与编码抗冻肽的相关基因杂交的核苷酸片段。

虽然本发明的蛋白可以很容易地从胡萝卜中直接分离得到，但也可使用遗传操作技术产生本发明所述的蛋白。

用编码所需多肽的基因构成物转化一种合适的宿主细胞或宿主生物。可以将编码所述多肽的核苷酸序列插入一种合适的表达载体中，所述表达载体包含转录和翻译所必需的元件，并且它们的组合方式可以使它们在合适的条件下表达(如，具有恰当的取向并处于正确的读框中，并带有合适的导向和表达序列)。构建这些表达载体所需的方法对于本领域内的技术人员是熟知的。

可以使用多种表达系统来表达所述多肽的编码序列。这些包括但不限于用合适表达载体转化的细菌、酵母、昆虫细胞系统、植物细胞培养物系统和植物。在这一方面，酵母、植物和植物培养物系统是优选的。

可以使用所述多肽的核苷酸构成物转化广泛种类的植物和植物细胞系统。最佳实施方案包括但不限于玉米、番茄、烟草、胡萝卜、草莓、油菜籽和糖甜菜。

本发明的一个最佳实施方案涉及使用本发明的AFP来增强植物的耐霜性。要做到这一点，可以使用，例如，上面的方法，由此转化植物以保证本发明的AFP(增加)产生，从而增强所述植物的耐霜性。

本发明还涉及特异性结合本发明的多肽(的抗原决定部位)的抗体。还包括所述多肽的免疫相关多肽，这些多肽是根据它们与从上述多肽产生的抗体的交叉反应性而确定的。

基于以上信息，还有可能遗传修饰其他自然资源，以便它们能产生如上面所定义的有利的AFP。最好选择那些具有显著的冰重结晶抑制特性的AFP。实施例I指出了一种确定重结晶抑制特性的合适的试验。按照本发明的AFP最好还能在冷冻食品重结晶时提供小于50μm、更优选5到40μm的冰粒大小(平均晶体长度)。

所述AFP可以方便地使用在几种制品中，最好是冷冻或需要冷冻的食品。以天然水平包含AFP的胡萝卜并不包括在本发明范围内。但包含(部分)胡萝卜的食品包括在这个范围内。还包括已被转化以过量表达本发明的AFP的胡萝卜，即比未转化的胡萝卜以显著更高水平含有AFP的胡萝卜。

这样的食品的例子有：冷冻食品如蔬菜、酱汁、汤、快餐，冷冻糖食制品如冰淇淋或糖水冰糕(water-ice)、奶制品等。

使用AFP的优选的制品有冷冻蔬菜或冷冻糖食制品，如冰淇淋或冰糕。基于成品的AFP的水平最好是0.00001到5％(重量)。

如果使用的是干拌混合物或浓缩物，这个浓度可能更高以保证成品冷冻食品中的AFP水平处于上述范围之内。惊人的是，已经发现本发明的组合物可以含有非常少量的AFP而仍然具有高质量。

AFP的水平优选是0.00001到0.5％(重量)，更优选0.00005到0.3％(重量)，最优选0.0001到0.2％(重量)。

为本发明的目的，没有必要将AFP以纯化形式加入食品中。还有可能是加入一种含有AFP的组合物，如产生AFP的天然材料的提取物。还有可能将食品改性以便原位产生AFP，如在食品中加入能产生AFP的遗传修饰微生物，或甚至遗传改造食品(如蔬菜)以便(所述蔬菜)本身能原位产生AFP。

为本发明的目的，术语冷冻糖食制品包括含有牛奶的冷冻糖食，如冰淇淋、冷冻保加利亚奶酒(yoghurt)、冻果牛奶冻、果汁冰水、冰牛奶和冷冻乳蛋糕、冰糕、粗粒冰糕(granita)和冷冻果糊。

冷冻糖食中的固体(如糖、脂肪、调味品等)水平最好是大于3％(重量)，更优选10到70％(重量)，例如40到70％(重量)。

可以使用任何适于生产冷冻糖食的方法来生产按照本发明的冷冻糖食制品。然而尤其是，在冷冻加工开始前，将配方的所有成分最好充分混合。

实施例实施例I

在各个花盆中种植胡萝卜(Daucus carota cv Autumn King)。当植株约12周大时，转移到冷室中，4℃恒光照4周进行冷适应。每周给植株浇水3次。

用研杵和研钵(预冷至4℃)将新鲜的胡萝卜组织在冰上的等体积缓冲液A(10mM EDTA，20mM抗坏血酸，用Tris缓冲至pH7.4)中磨碎。匀浆物用一层细棉布过滤，并在进一步使用前保存在冰上。

作为比较，种植一些其他肉根植物(root-plant)，并如上所述从根中制备匀浆物。

使用一种改进的“压片分析(splat assay)”(Knight等人，1988)测定抗冻活性。将2.5μl含30％(重量)蔗糖的待检溶液转移到一块干净、适当标记、16mm的圆形盖玻片上。第二块盖玻片置于溶液液滴的顶端，用手指和拇指将夹层压到一起。将夹层放入置于一盒干冰中的保持在-80℃的己烷浴中。所有的夹层都制备好后，用干冰中预冷的镊子从-80℃己烷浴转移到装有保持在-6℃的己烷的观察室中。转移到-6℃中时，可以看到夹层的外观由透明变为半透明。用摄像机记录图像，并以20倍的物镜放大倍数将图像输入一个图像分析系统(LUCIA，Nikon)。在时间＝0时并在30-60分钟后再次记录每个压片(splat)的图像。比较两次分析中冰晶的大小。如果30-60分钟时的大小与t＝0时的大小相比是相似的或仅仅适度增加(即增加少于20％，更优选增加少于10％，最优选增加少于5％)，这就是良好的冰晶重结晶抑制特性的标志。

结果：从夹层压片分析试验看来，来自胡萝卜根、胡萝卜茎和胡萝卜叶的样品具有显著的冰重结晶抑制特性，而根和叶是最有活性的。作为比较，测试了未进行冷适应的胡萝卜根的一个样品，其显示显著更低的活性。在下面的实施例中，使用胡萝卜的根组织对胡萝卜进行进一步的测试。

作为比较，使用30％蔗糖中进行的夹层压片分析试验研究了几种其他蔬菜根。这些蔬菜中有萝卜、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、冬青甘兰(wintergreen cabbage)、欧洲油菜、青菜、欧洲防风和草莓。这些材料来源中没有一种提供显著的冰重结晶抑制活性。实施例II

用预冷的研杵和研钵将胡萝卜根组织在3倍体积(重量/体积)缓冲液(20mM抗坏血酸，10mM EDTA，50mM Tris/HCl，pH7.2)中匀浆，并用一层细棉布过滤。滤液在4℃下6,000g离心10分钟；收集上清液，4℃下100,000g离心1小时。由这个步骤得到的100,000g上清液被称为可溶性组分，沉淀被称为微粒体组分。

4℃下用Gradifrac低压层析系统(Pharmacia)控制的HiLoad泵P-50，以5ml/min的流速将上清液上样到用50mM Tris/HCl pH7.4预平衡的30ml快速Q Sepharose(Pharmacia)柱，用一台UV监测仪(MonitorUV 1，Pharmacia)在OD 280处监测洗脱液，数据记录在一台记录仪(REC 102，Pharmacia)上。收集每5ml的组分。用50mM Tris/HCl pH7.4以相同流速洗柱，直到OD 280回到零。使用0-0.4M NaCl的Tris/HClpH7.4梯度洗脱液150ml进行洗脱，然后用2M NaCl洗柱。如实施例I所述对洗脱液组分进行压片分析。

汇集具有抗冻活性、即表现出重结晶抑制的组分，如下所述用聚乙二醇浓缩：将所述组分转移到截留分子量10kDa的透析袋(Sigma)中，所述透析袋已经用自来水冲洗、在50mM EDTA pH7.5中煮沸10分钟并在milli Q水中清洗。用分子量为15,000-20,000的固体聚乙二醇化合物(Sigma)覆盖装有需浓缩样品的透析袋，4℃温育多达4小时或直到透析袋内的样品体积减少到1/10。

将从Q Sepharose柱汇集得到的浓缩物上样到一根苯基Sepharose柱、一根SMART superdex 75凝胶渗透柱或一根FPLC superdex 75凝胶渗透柱。

如下所述使用凝胶渗透层析纯化胡萝卜根抗冻蛋白：

将每20μl的等分样品以40μl/min的流速上样到用含0.15MNaCl的50mM Tris/HCl pH7.4(缓冲液E)预平衡的SMART superdex75柱(Pharmacia)上，用平衡缓冲液以相同流速通过凝胶渗透分离各组分。在OD 280和OD 215处监测洗脱液。收集0.85和0.89ml之间的每80μl组分、0.89和1.24ml之间的每40μl组分以及1.24和3.0ml之间的每100μl组分。根据Blue Dextran溶液的保留体积，确定了柱的外水体积是0.91ml。使用10μl含5mg/ml BSA(Mr 66kDa，保留体积(Ve)＝1.02ml)、3mg/ml碳酸酐酶(Mr 29kDa，Ve＝1.22ml)、2mg/ml细胞色素C(Mr 12.4kDa，Ve＝1.41ml)和2mg/ml抑酶肽(Mr 6.5kDa，Ve＝1.59ml)的溶液以及Ve/Vo相对log Mr作图得到的标准曲线来校正superdex柱。如实施例I所述用压片分析鉴定具有抗冻活性的组分，表现为一个保留体积为1.16ml、表观分子量为40kDa的活性峰。这些测定肯定了由冷适应的胡萝卜得到的36kDa带是一种抗冻肽。

使用Biorad微系统依照Laemmli(1970)进行SDS-PAGE。将要用SDS-PAGE分析的样品溶解于SDS-PAGE样品缓冲液(Laemmli 1970)中，在一台干热加热器(dry heating block)(Techne)上100℃加热5分钟，然后室温下10,000g离心3分钟。将样品(10-15μl)上样到微型凝胶(Biorad，0.75、1.0或1.5mm厚，10、12、15％丙烯酰胺或10-20％梯度丙烯酰胺(Biorad预灌胶))并电泳分离。分离的多肽用考马斯蓝(0.1％(重量/体积)考马斯亮蓝的乙酸/甲醇/milli Q水(体积比5∶4∶31))在凝胶中固定并染色，或用Biorad银染试剂盒，依照厂家的说明进行银染。依照厂家的说明，将凝胶置于一台Biorad Gelair干燥器的两层Gelair玻璃纸之间干燥。使用Sigma高量程和低量程分子量标记试剂盒，依照厂家的说明，测定SDS-PAGE上的表观分子量。

对冷适应的胡萝卜根和没有冷适应的胡萝卜根进行离子交换层析。得到的SDS-PAGE凝胶上显示在冷适应的样品中存在一条36kDa的带。这条带在没有冷适应的根中要少的多。因此这条36kDa的带起因于抗冻活性。实施例III

为进行蛋白测序，如前面实施例所述纯化36kDa胡萝卜根蛋白，然后为保证进一步的纯化，从SDS-PAGE凝胶上切下要测序的样品，然后在聚丙烯酰胺凝胶切片上进行原位蛋白水解消化。

将仍含有少量杂蛋白的基本上纯化的36kDa蛋白制备物加载进12％聚丙烯酰胺凝胶。三条泳道每条都加载入2μg蛋白并在凝胶中电泳，直到染料前沿到达凝胶底部。凝胶在0.2％考马斯亮蓝(重量/体积)、30％甲醇(体积/体积)、1％乙酸(体积/体积)中染色20分钟，然后用30％甲醇脱色直到蛋白带可见。与加载到临近泳道上的分子量标记比较，鉴定36kDa的带，然后用解剖刀片从每条泳道切下这条带，小心地除去杂带。

将凝胶切片转移到一支干净的指管(eppendorf tube)中，用0.5ml50％乙腈(体积/体积)、100mM Tris/Cl，pH8.5洗两次。洗涤除去了一些考马斯亮蓝染料，同时部分脱水凝胶切片。从管中取出凝胶切片，置于实验台上风干直到切片明显萎缩并开始卷曲。然后将切片转移回指管，首先用含1μg内切蛋白酶Lys C(Boehringer Mannheim)的10μl 100mM Tris/Cl，pH8.5重水合。内切蛋白酶Lys C是一种特异性地在赖氨酸残基的羧基端切断多肽链的蛋白酶。接着向凝胶切片加入Tris缓冲液直到它们完全重水合，然后在37℃温育16小时。

温育之后，在管中加入1μl三氟乙酸终止反应，然后在30℃下将凝胶切片用0.3ml 60％乙腈(体积/体积)、0.1％TFA(体积/体积)洗两次共30分钟。这是再次部分脱水凝胶切片，使它们萎缩并洗脱已经产生的肽。将上清液转移到另一支干净的指管中，在一台离心蒸发器中干燥2小时直到样品接近干燥，然后用0.1％TFA悬浮至0.1ml体积。

然后在一台Smart微量纯化系统(Pharmacia)上用反相HPLC分离所述肽。将肽消化物以0.1ml/min的流速加载到一根在0.1％TFA(溶剂A)中平衡的C18柱(2.1×100mm)。然后以同等流速用0-70％的溶剂B的梯度(90％乙腈体积/体积，0.085％TFA体积/体积)洗脱柱子70分钟。在214nm监测光密度，并用流分收集器手动分段收集各个肽峰。将多肽加载进一台492型Perkin Elmer蛋白测序仪，使用液相化学循环按照厂家的建议进行测序。

已经分析了36kDa带中的几个多肽片段(A-E)，它们包含与下述大致同源的序列：

(A)LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS

(B)ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS

(C)LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS

(D)SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-

   PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS

(E)X-X-GLY-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-

   PRO-ASN-LEU-LYS

实施例IV-a胡萝卜细胞培养物

从Leeds大学生化及分子生物学系获得一种胡萝卜细胞悬浮培养系(NOR)。培养物的保持是每7天把10ml培养物传代到90ml含2.5g/l蔗糖和1mg/l 2，4-D的新鲜Murashige和Skoog培养基(Sigma)中。培养物在一台定轨摇床中以150rpm 25℃下黑暗中培养。

如下所述对NOR培养物进行冷处理：

25℃下生长4天和7天后，将NOR培养物转移到4℃下。在t＝0、t＝7天和t＝14天收获培养物。除了收获这一点外，在每个时间点测定每种培养物的收集细胞体积(PCV)。

如下分析由NOR悬浮培养物得到的培养基样品。取冷冻条件悬浮培养基等分物的1/10体积解冻。取出解冻(冷冻浓缩)部分并如实施例I所述用夹层压片分析测定活性。已经发现得自冷适应培养物的培养基比得自非冷适应的培养物的培养基具有显著得多的活性。

加入100μl 1M Tris/HCl pH7.4，缓冲冷适应的NOR胡萝卜培养基。使用基于实施例II的方法用离子交换层析和凝胶渗透层析来纯化活性：将缓冲过的培养基以1ml/min的流速上样到一根1ml QSepharose柱(Pharmacia)上，结合的分子用3ml等分的起始浓度为0.1M、并以每步0.1M增加到0.5M的NaCl的500mM Tris/HCl pH7.4洗脱下来。收集每1ml的流分，并如实施例I所述测试活性。

如下用凝胶渗透层析纯化有活性的离子交换流分中的抗冻活性。上面得到的活性流分用丙酮沉淀，将沉淀重悬浮于50μl 50mMTris/HCl+0.15M NaCl，pH7.2中。将此溶液10,000g离心10分钟，取20μl加载到Pharmacia SMART系统的一根Superdex 75凝胶渗透柱上。流速为40μl/min，流动相为50mM Tris/HCl+0.15M NaCl，pH7.2。收集每80μl的流分并压片。检测对应于保留体积1.16ml的流分的活性。

使用与实施例II一致的SDS-PAGE分析可以进一步分离活性蛋白。实施例IV-b胡萝卜根培养物

如下开始培育胡萝卜根培养物。

对于每个个体培养物，取10粒表面消毒的胡萝卜(Daucus carotecv Autumn King)种子置于无菌250ml锥形瓶中的100ml含25g/l蔗糖和0.5g/l MES的MS培养基中。于25℃黑暗150rpm振荡的条件下，使种子萌发3周。无菌操作，除去叶和茎。将根放回100ml新鲜培养基中，并再振荡培养2周。

如下从冷处理和未冷处理的根培养物制备匀浆物。用冷的研杵和研钵将速冻的根在3倍液氮中磨碎，然后转移到另一个冷的研杵和研钵，用0.5倍体积冰冷的含30％(重量/重量)蔗糖的50mMTris·HCl+10mM EDTA pH7.4磨碎。匀浆物在4℃下10,000离心10分钟并如实施例I所述测定上清液的活性。在冷处理的根培养物中检测到比未冷处理的根培养物中显著更多的活性。实施例V冰淇淋的制备

洗刷新鲜摘下的在冷水中冷适应(如实施例I中所述)的胡萝卜，制备来自冷适应胡萝卜根的根提取物。除去顶部并用一台国产榨汁机(Russell Hobbs，型号9915)榨出汁液。将汁液冻成1升的冰块并在收集用于冰淇淋实验前贮藏于-20℃。将胡萝卜AFP汁液加入下面的冰淇淋配方：

成分	重量份
		脱脂奶粉	10.000
蔗糖	13.000
		MD40	4.000
刺槐豆胶	0.144
		Genulacta L100	0.016
MGP	0.300
		熔融奶油	8.000
香草醛	0.012
		水	64.528
胡萝卜提取物(得自含1-10mgAFP/kg的冷适应胡萝卜)	4.472

冷冻上面的制剂并通气至106％膨胀量，制备冰淇淋。

测定新鲜样品和已贮藏在-10℃达10天而糟蹋的样品。作为比较，以同样方法测定不含胡萝卜提取物的样品。如下进行测定：

样品在一台Prolan Environment箱中于-18℃平衡大约12小时。从每批冰淇淋中有代表性地选取3个样品，在一台Cryostat温度控制箱中，在一片显微载玻片上涂抹一薄层取自每一块冰淇淋中心的冰淇淋，从每一块冰淇淋制备一片载玻片。滴一滴白节油到载玻片上，再盖上盖玻片。然后将每片载玻片轮流转移到一张控温显微载物台(Leit LaborLux S，Leica×10物镜，温度-18℃)。收集冰晶的图像(大约400个单独的冰晶)并通过一台摄像机(Sanyo CCD)转送到一个图像贮存和分析系统(LECIA Q520MC)。

人工加亮贮存的冰晶图像：画出晶体的周边，加亮整个晶体。然后使用图像分析软件测量加亮的晶体图像，计数构成最长直线(长)、最短直线(宽)、纵横比(长/宽)所需的像素数目。将一批冰淇淋的每个单独冰晶的数据输入一个电子数据表，分析数据组，求出平均值和标准差。

使用Hounsfield H10KM Universal Tester、Hounsfield 100N LoadCell和一根10cm圆柱状不锈钢探头测定冰淇淋硬度。在一台设定到-18℃的Prolan温度控制箱中温育486ml冰淇淋块16小时，制备冰淇淋样品。

从Prolan温度控制箱中取出冰淇淋块并放入Hounsfield H10KMUniversal Tester。将10cm圆柱状探头以恒定速率400mm/min压入冰淇淋块20mm的深度。使用加压过程中记录到的最大力并表达为冰淇淋的硬度。如果观察到样品的破碎或脆性裂缝，就在右边一栏中指出。

得到了下面的结果

	冰晶大小参数				材料性质
							样品	平均晶体长度/cm	平均晶体宽度/cm	平均晶体形状因子	平均晶体纵横比/-	硬度/N	脆性裂缝的观察
胡萝卜AFP-新鲜	26.79±1.3	19.00±0.9	15±0.013	43±0.024	40.8	有
							胡萝卜AFP-糟蹋	33.48±1.3	24.61±0.9	13±0.013	37±0.020	59.9	有
对照-新鲜	33.67±1.1	24.79±0.8	12±0.008	38±0.018	27.3	无
							对照-糟蹋	61.77±2.7	46.54±2.0	11±0.010	37±0.020	32.7	无

这就证明了胡萝卜AFP具有良好的冰重结晶抑制特性。实施例VI

分析实施例III所示的肽序列对于简并核苷酸引物设计的适合性。选定了肽D(GLY-PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO)的一部分并合成(Genosys)了引物cp3(GGI CCI GTI CCI YTI TTY TTY CC，其中I＝肌苷而Y＝C或T)。

使用Superscript逆转录酶(Stratagene)和一个寡核苷酸引物OG1(GAGAGAGGATCCTCGAG(T)¹⁵)，依照厂家的说明，由5μg冷适应(如实施例I，1个月)的胡萝卜根RNA制备第一条cDNA链。在接下来的PCR中，用1％第一条cDNA链反应物作为模板，并使用cp3和OG1引物。反应在一台热循环仪中进行，使用Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)按照厂家的说明进行30个循环(1分钟94℃，1分钟50℃和1分钟72℃)。所有引物都使用1μM的浓度。对得到的约800bpPCR产物进行凝胶纯化，并按照厂家的说明，克隆进pTAg载体(R&DSystems)。用Sequenase试剂盒(USB)使用的双脱氧测序法序列分析克隆的cp3 PCR产物。cp3核苷酸序列和推导出的氨基酸序列与下面序列大致相似：

    GGGCCGGTGCCGCTGTTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTT1    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  60a        G  P  V  F  L  F  F  P  G  L  T  K  L  T  C  L  D  L  S  F   -

    AACAAACTTTTGGGTGTAATCCCTCCTCACCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTG61   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  120a        N  K  L  L  G  V  I  F  P  Q  L  S  T  L  P  N  L  K  A  L   -

    CACTTAGAACGTAACGAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGA121  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  140a        H  L  E  R  N  E  L  T  G  I  I  P  D  I  F  G  N  F  A  G   -

    TCCCCGGACATATATCTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTGTTCCCAAAACTTTTGCT181  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  240a        S  P  D  I  Y  L  S  H  N  Q  L  T  G  F  V  F  K  T  F  A   -

    AGAGCAGATCCAATTAGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTC241  ---------+---------+---------+---------+----------+--------+  300a        R  A  D  P  I  R  L  D  F  S  G  N  R  L  E  G  D  I  S  F   -

    TTGTTTGGGCCTAAAAAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGCTTAGTTTC301  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  360a        L  F  G  P  K  X  R  L  E  M  L  D  F  S  G  N  V  L  S  F   -

    AATTTCTCCAGGGTGCAGGAGTTTCCACCCTCTTTGACATACTTAGACTTGAACCATAAC361  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  420a        N  T  S  R  V  Q  E  F  P  P  S  L  T  Y  L  Q  L  N  H  N   -

      CAGATCAGCGCAAGTCTGTCGAGTGAATTGGCTAAATTGGACCTGCAGACATTTAACGTC

421   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  180a          Q  I  S  G  S  L  S  S  E  L  A  K  L  D  L  Q  T  F  N  V   -

      AGTGATAATAATCTCTGCGGCAAGATTCCAACAGCGGGAAACCTCCAGAGATTCGACCGT

451   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  540a          Z  D  N  N  L  C  G  K  I  F  T  G  G  N  L  Q  R  F  D  R   -

      ACGGCCTATCTCCACAACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAGTTACCA

541   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  600a          T  A  Y  L  H  N  S  C  L  C  G  A  P  L  P  E  C   *

      TGCAAAATGTGCCTTAAGGTTATCTTTGTAATGAGATATATTATGCAGCTCAAGGCAGAG

601   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  660

      CAATAAGTTTTCCTAATTTGTTATAGTAAGATATTATTGTATTTCACAGAAAGTGTGTAC

661   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  720

      TAGGATTCGTAATATATTATAATTGCTCATAATTGTATCTGTTTAATCTGTAATCCAAAA

721   ---------+---------+---------+---------+---------+--------+  740

      ACCTTTATGTATTGGTTTGACACTTTTGAGCTTTAAAAAAAAAAAAAAA

781   ---------+---------+---------+---------+---------  829表II

为获得完整的胡萝卜AFP编码区，构建了一个cDNA文库。使用一根poly(A)+快速柱(Stratagene)按照厂家的说明，从500μg CA(一个月)胡萝卜总RNA中纯化mRNA。所有得到的poly(A)+RNA都用于cDNA合成以及接下来的使用λZAP载体试剂盒(Stratagene)的文库构建。使用cp3 PCR产物作为³²P标记探针，通过杂交筛选1×10⁵重组噬菌体克隆。

筛选阳性噬菌斑以进行纯化，切除噬菌粒，然后用DNA序列分析鉴定插入片段的特征。两个cDNA克隆已经被完整测序。虽然5′和3′非翻译区包含一些序列变异性，但编码区是相同的。两个cDNA克隆的编码区与下面的序列大致相似：

     ATGAATATTGAATCATCTTTCTGCCCTATTTTGTGCATATGCATGATTTTCCTCTGCCTT

13   -------+---------+--------+----------+---------+---------+--  72a        M  N  I  E  S  S  T  C  F  I  L  C  I  C  M  I  F  L  C  L    -

     CCAAACCTCTCTGCATCACAAAGATGCAACAACAACGACAAGCAAGCTTTACTCCAAATC

73   -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  132a        P  N  L  S  A  S  Q  R  C  N  N  N  C  K  Q  A  L  L  Q  I    -

     AAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCATTACAGACTCATGGGTGTCAGACGACGATTGTTGT

133  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  192a        K  T  A  L  K  N  P  T  I  T  C  S  W  V  S  D  O  D  C  C    -

     GGTTGGGACCTAGTCGAATGTGACGAAACCACCAACCGCATAATTTCCCTCATAATTCAA

133  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  252a        C  W  D  L  V  E  C  C  E  T  S  N  R  I  I  S  L  I  I  Q    -

     GACGACGAAGCTCTCACCGGCCAAATCCCACCTCAGGTGGGAGACCTACCATACCTCCAA

253  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  312a        C  D  E  A  L  T  G  Q  I  P  P  Q  V  G  D  L  P  Y  L  Q    -

     GCCTTATGGTTCCGTAAACTCCCCAATCTTTTCGGAAAAATCCCAGAAGAAATTTCTGCA

313  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  372a        A  L  W  F  R  K  L  P  N  L  F  G  K  I  P  E  E  I  S  A    -

     CTCAAAGACCTAAAATCCCTCAGACTCAGCTCGACCAGTCTCAGTGGCCCTGTCCCTTTA

373  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  432a        L  K  D  L  K  S  L  R  L  S  S  T  S  L  S  G  F  V  P  L    -

     TTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTTAACAAACTTTTGGGT

433  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  492a        T  T  P  Q  L  T  K  L  T  C  L  D  L  S  F  N  K  L  L  Q    -

     GTAATCCCTCCTCAGCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTGCAGTTAGAACGTAAC

493  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  552a        V  I  P  P  Q  L  S  T  L  P  N  L  K  A  L  N  L  E  R  N    -

     GAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGATCCCCGGACATATAT

553  -------+---------+---------+---------+---------+--------+--   612a        E  L  T  G  E  I  P  D  I  F  G  N  F  A  G  S  F  D  I  Y    -

     CTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTGTTCCCAAAACTTTTGCTAGAGCAGATCCAATT

613  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  672a        L  S  M  N  Q  L  T  G  F  V  P  K  T  F  A  R  A  O  P  I    -

     AGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTCTTGTTTGGGCCTAAA

673  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  732a        R  L  D  F  S  C  N  R  L  E  G  D  I  S  T  L  F  G  P  K    -

     AAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGCTTAGTTTCAATTTCTCCAGGGTG

733  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  792a        K  R  L  E  M  L  D  F  S  G  N  V  L  S  F  N  F  S  R  V    -

     CAGGACTTTCCACCCTCTTTGACATACTTAGACTTGAACCATAACCAGATCAGCGGAAGT

793  -------+---------+---------+--------+----------+---------+--  852a        Q  E  F  P  P  S  L  T  Y  L  D  L  N  N  N  Q  I  S  G  S    -

     CTGTCGAGTGAATTGGCTAAATTGGACCTGCAGACATTTAACGTCAGTGATAATAATCTC

853  -------+---------+-------------------+---------+---------+--  912a        L  S  S  E  L  A  K  L  D  L  Q  T  T  N  V  S  C  N  N  L    -

     TGCGGCAAGATTCCAACAGGGGGAAACCTCCAGAGATTCGACCGTACGGCCTATCTCCAC

913  -------+---------+---------+---------+---------+---------+--  972a        C  G  K  I  P  T  G  G  N  L  Q  R  F  D  R  T  A  Y  L  W    -

     AACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAG

973  -----------+-----------+------------+--   1011a        N  S  C  L  C  G  A  P  L  P  E  C  *     -

                                    表I

对其他4个克隆的部分序列分析也表明它们与已完全测序的克隆一样包含相同的编码区，因此由该文库筛选得到的所有阳性都可能代表同一基因的转录物。对限制酶消化的胡萝卜基因组DNA进行的Southern分析表明只有一个片段与该探针杂交，这进一步证实了在胡萝卜基因组中只有一个AFP基因的拷贝存在。实施例VII

为证明实施例VI中所示的胡萝卜cDNA代表一种AFP，如下表达所述编码区。如下所述，将其中一段cDNA首先克隆进包含一个双CaMV 35S启动子(Guerineau，J.F.，Woolsten，S.，Brooks，L.，和Mollineaux，P.(1988))表达盒的中间pUC质粒载体(Messing，1993)，然后克隆进一种双载体(binary vector)。所有使用的酶都由Gibco BRL提供并按照厂家的说明使用。

用Xho I消化包含所述cDNA克隆的pBluescript噬菌粒(Stratagene)，并用DNA聚合酶I的克列诺片段填平3′凹端。通过Eco R I消化，从所述载体释放该cDNA片段。然后将Eco R I/平端cDNA片段克隆进Eco R I/平端消化的中间pUC质粒载体。将CaMV35S-cDNA表达盒作为一个部分Hind III片段亚克隆进Hind III切割的pBin 19双载体(Bevan 1984)。然后使用农杆菌介导的转化将所述双载体构成物引入烟草(如Draper，J.，Scott，R.，Armatage，P.，和Walden，R.(1988)所述)。

一旦再生了足够的卡那霉素抗性转基因烟草愈伤组织材料，就分析这些材料中重结晶抑制特性的表达。从几个独立的卡那霉素抗性愈伤组织加上一些野生型烟草愈伤组织提取小量蛋白提取物。用研杵和研钵在1-2ml蔗糖缓冲液(30％蔗糖，50mM Tris，10mM EDTA，20mM抗坏血酸，pH7.2)中磨碎约2g的组织。溶液在10,000g离心2分钟，并将上清液转移到一支新鲜的管中。使用实施例I的蔗糖夹层压片分析方法，测试一个3μl等分的蛋白提取物的重结晶抑制特性。所有测试的卡那霉素抗性愈伤组织提取物都表现出重结晶抑制活性。

也已经产生了表达胡萝卜AFP的稳定的转基因烟草植物。使用AFP cDNA作为探针，对得自野生型和转基因烟草植物的叶提取物进行Northern分析。仅在转基因烟草植物中检测到AFP信息。这表明AFP信息在温室生长的转基因烟草植物中是稳定的。与天然胡萝卜转录物相比，烟草AFP转录物显得稍大一些。这种不一致可以用构建AFP表达盒的方法来解释。因为CaMV 35S多聚腺苷酸化信号是在构成物的3′末端，所以这个信号有可能在转基因AFP信息中使用，因此产生了一种更长的转录物。已经使用一种胡萝卜AFP抗体，用Western印迹分析从野生型和转基因烟草植物得到的叶提取物。仅在转基因烟草植物中检测到交叉反应的蛋白。尽管在转录物大小上有差异，但烟草中产生的蛋白看起来与天然的胡萝卜AFP的大小相同。

上面的数据提供了从烟草纯化得到的蛋白以及相应的cDNA代表一种活性AFP的证据。

Claims (16)

1.抗冻多肽及其同工型或衍生物，其中所述抗冻蛋白可以从胡萝卜中获得，并且在SDS-PAGE上具有36kDa的表观分子量。

2.包含一个或多个片段(A-E)的抗冻多肽及其同工型或衍生物，其中所述片段具有如下所示的氨基酸序列：

(A)LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS

(B)ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS

(C)LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS

(D)SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-

   PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS

(E)X-X-GLY-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-

   PRO-ASN-LEU-LYS

3.包含权利要求2的片段(A-E)的抗冻多肽。

4.具有如表1所示的氨基酸序列的抗冻多肽及其同工型和衍生物。

5.一种分离的核酸序列及其等位基因，其中所述核酸序列编码权利要求1-4中的一项或多项的抗冻多肽。

6.一种分离的核酸序列及其等位基因，其中所述核酸序列大致对应于表1的基因序列。

7.获得依照权利要求1-4中的一项或多项的多肽的方法，其中所述多肽分离自冷适应的胡萝卜。

8.获得依照权利要求1-4中的一项或多项的多肽的方法，其中所述多肽由一种遗传修饰的生物表达。

9.依照权利要求8的方法，其中所述生物是一种微生物、一种植物或一种细胞培养物。

10.能特异性地结合权利要求1、2、3或4的多肽的抗体。

11.权利要求1、2、3或4的多肽的免疫相关多肽，由其与权利要求10的抗体的交叉反应性确定。

12.包含一种权利要求1、2、3、4或11的多肽的食品，条件是所述食品不是以天然水平包含所述多肽的胡萝卜。

13.权利要求12的食品，其是一种冷冻糖食制品或一种冷冻蔬菜。

14.一种方法，用于产生包含一种依照权利要求1、2、3或4中一项或多项的抗冻多肽的食品，包括以下步骤：

(a)在所述食品中添加包含所述抗冻多肽的一种组合物；或

(b)原位产生所述抗冻多肽。

15.权利要求1、2、3或4的多肽的用途，用于提高植物的耐霜性。

16.能够表达权利要求1、2、3或4的多肽的微生物、细胞系或植物，条件是所述植物不是未改良的胡萝卜植物。