KR20240024185A - 항-서리 단백질-기반 식물 보호제 - Google Patents

항-서리 단백질-기반 식물 보호제 Download PDF

Info

Publication number
KR20240024185A
KR20240024185A KR1020247001642A KR20247001642A KR20240024185A KR 20240024185 A KR20240024185 A KR 20240024185A KR 1020247001642 A KR1020247001642 A KR 1020247001642A KR 20247001642 A KR20247001642 A KR 20247001642A KR 20240024185 A KR20240024185 A KR 20240024185A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
frost
plant
amino acid
composition
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020247001642A
Other languages
English (en)
Inventor
가이 반 데일
리즈베스 보글스
Original Assignee
글로바켐 엔브이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 글로바켐 엔브이 filed Critical 글로바켐 엔브이
Publication of KR20240024185A publication Critical patent/KR20240024185A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/1225—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold or salt resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Abstract

본 발명은 항-서리 단백질 및 특히 식물 보호에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-서리 단백질을 코딩하는 핵산, 항-서리 단백질을 생산하는 방법, 항-서리 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물, 적어도 하나의 항-서리 단백질의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 특히 식물 보호제로서 항-서리 단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도 및 해충 및/또는 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-서리 단백질-기반 식물 보호제
본 발명은 항-서리 단백질 및 특히 식물 보호에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-서리 단백질을 코딩하는 핵산, 항-서리 단백질을 생산하는 방법, 항-서리 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물, 적어도 하나의 항-서리 단백질의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 특히 식물 보호제로서 항-서리 단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 용도 및 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다.
비생물적 스트레스, 예컨대 서리 또는 가뭄은 농업 산업의 주요 관심사이며, 식물이 추위, 가뭄, 염 염도, 열, 독소 등에 적절하게 적응하는 것이 항상 가능한 것은 아니기 때문이다. 비생물적 스트레스는 무생물 인자가 살아있는 유기체에 미치는 부정적인 영향을 나타낸다. 비생물적 스트레스 인자는 유기체에 해를 끼칠 수 있는 자연적으로 발생하는 인자, 예컨대 강렬한 햇빛, 온도 또는 바람이다. 비생물적 스트레스는 동물에게도 영향을 주지만, 식물은 특히 환경 인자에 의존하고 위치를 적극적으로 변경할 수 없으므로 특히 비생물적 스트레스에 취약하다. 비생물적 스트레스는 전 세계적으로 작물의 성장 및 생산성에 가장 해로운 인자이다.
예를 들어, 가뭄 스트레스는 농업계에서 작물 손실의 주요 원인 중 하나이다. 마찬가지로, 적어도 일년 내내 영하 온도를 초과하지 않는 지역에서는 서리도 작물 손실에 크게 기여한다.
식물이 가뭄 스트레스에 맞서 싸우는 중요한 방법 중 하나는 기공을 닫는 것이다. 기공 개폐를 조절하는 핵심 호르몬은 아브시스산이다. 가뭄 스트레스를 처리하고 물의 흡수 및 외수송을 조절하는 또 다른 중요한 인자는 아쿠아포린이다. 아쿠아포린은 물 및 기타 필요한 용질을 수송하는 막 채널을 구성하는 필수 막 단백질이다.
서리 손상에 기여하는 한 가지 메커니즘은 식물 세포의 구조 및 기능을 방해할 수 있는 물 결정의 형성이다. 구체적으로, 동결로 인해 식물의 세포가 수축되어 물이 세포 사이의 공간으로 유입되어 동결되고 얼음 결정을 형성할 수 있다. 막이 파손되어 누출된다. 온도가 상승하고 해동이 시작되면, 삼투현상에 의해 물이 세포 내로 다시 흡수된다. 이것이 빠르게 발생하면 조직에 손상이 없지만, 해동이 느리면 세포에 수분이 부족하고 탈수되어 '서리 화상'을 초래한다. 서리 스트레스는 예를 들어 충분한 물이 이용가능한 경우 머리 위에 물을 뿌리거나 식물 근처의 복사열을 유지하기 위해 식물의 머리 위를 보호함으로써 대처할 수 있다. 식물 자체도 동결 관용성을 제공하기 위해 항-서리 단백질 (AFP)을 분비한다.
본 출원은 놀랍게도 일부 AFP가 동시에 키티나제임을 보여준다.
키틴은 화학식 (C8H13O5N)n을 갖는 당류 글루코스의 유도체인 N-아세틸글루코사민의 중합체이다. 장쇄 다당류는 다양한 계통에 걸쳐 매우 다양한 유기체에서 발생한다. 예를 들어, 키틴은 진균의 세포벽, 절지동물, 예컨대 갑각류 및 곤충의 외골격, 연체동물의 치설, 및 물고기 비늘의 주요 구성성분이다. 키틴은 셀룰로스와 필적가능한 구조를 갖는다.
키틴 다당류의 더 짧은 올리고머로의 생물학적 전환은 보존된 키틴-결합 도메인 및 키틴-특이적 활성 부위를 함유하는 가수분해 효소를 필요로 한다. 많은 키틴분해 효소는 에너지원으로서 키틴의 분해를 위해 다양한 박테리아 및 진균에 의해 생산된다. 이들 모두는 글리코실 히드롤라제이지만, 이들은 반응 메커니즘, 열안정성 및 생성물 특징의 측면에서 상이하다 [Patil et al., Enzyme Microb. Technol., 2000. 26: p. 473-483]. 키틴분해 히드롤라제는 작용 방식에 따라 범주화될 수 있다. 엔도-키티나제 (EC 3.2.1.14)는 키틴 다당류 가닥에 무작위로 결합하고, 내부 글리코시드 결합을 가수분해하여 이량체에서 중합체에 이르는 다양한 단편 크기를 생성한다. 대조적으로, 엑소-키티나제 (EC 3.2.1.29)는 키틴의 환원성 또는 비환원성 말단에 결합하여 단량체성 및 더 적은 정도의 이량체성 GlcNAc 단위를 방출한다. 이들 효소는 키틴의 완전한 분해에 필요하다. 최종적으로, 키토비아제 (EC 3.2.1.29)는 GlcNAc 이량체를 절단하여 GlcNAc 단량체를 방출한다 [Tews et al., Nat. Struct. Biol., 1996. 3: p. 638-648]. 다른 효소, 예컨대 셀룰라제 및 리소자임은 또한 키틴에 대해 일부 가수분해 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있지만 이들 기질에 특이적이지는 않다 [Wu et al., J Food Sci Technol, 2012. 49(6): p. 695-703; Aiba, Carbohydr Res, 1994. 261: p. 297-306].
식물의 일반적인 해충은 진균, 곤충 및 연체동물을 포함한다. 해충 침입은 작물 손실 및 원치않는 부산물로 인한 농산물의 오염을 초래할 수 있다.
현재 상업적으로 적용되는 화학적 살충제는 살곤충제, 제초제, 살진균제 및 살서제로서 사용하기 위한 유기염소, 유기인산염, 카르바메이트, 피레트로이드, 트리아진 및 네오니코티노이드 그룹의 성분을 포함한다. 이들 살충제는 농업 지역 뿐만 아니라 비농업 공공 도시 녹지 지역, 운동장, 애완동물 샴푸, 건축 자재 또는 보트 바닥에도 사용되어 원치않는 종의 존재를 제거하거나 방지한다. 이들 성분은 화학적 살충제와 연관되어 수많은 부정적 건강 효과를 비판적으로 검토되어 왔으며, 높은 직업적, 의도적 또는 우발적 노출은 입원 또는 사망을 초래할 수 있는 반면, 노출은 피부 접촉, 오염된 소모품 섭취 또는 흡입을 통해 발생하며, 이때 체지방에 대사, 배설, 저장 또는 축적될 수 있다. [Nicolopoulou-Stamati et al., Front. Public Health, 2016, 4:148]
이상적인 살충제는 인간 건강에 위험하지 않아야 할 뿐만 아니라 환경 친화적이어야 하며 주어진 해충으로부터 식물을 보호하는데 최대한 효율적이고 구체적이어야 한다. 더욱이, 살충제는 이상적으로는 해충의 저항성 발달을 회피해야 한다. 이들 기준을 충족하는 새로운 생성물이 여전히 필요하다.
그러므로 본 출원은 AFP를 사용하여 비생물적 스트레스 및 생물적 스트레스 (예컨대 해충)로부터의 보호를 모두 다룬다.
발명의 설명
본 발명은 비생물적 스트레스, 특히 서리 스트레스 및 가뭄 스트레스 및/또는 해충 방제에 대한 항-서리 단백질-기반 접근법을 제공함으로써 현재 식물 보호제의 문제를 극복하는 것을 목표로 한다. 구체적으로, 본 발명의 접근법은 식물에서 방어 메커니즘의 활성화를 유도함으로써 (즉, 식물 면역을 유도함으로써) 생물적 및/또는 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 항-서리 단백질에 의존한다. 식물은 광범위한 병원체 및 비생물적 스트레스로부터 자신을 방어할 수 있는 면역 시스템을 갖고 있다. 일부 항-서리 단백질은 또한 인간 또는 다른 고등동물에서는 생산되지 않는 키틴을 특이적으로 분해할 수 있으므로, 인간 소비 또는 다른 비-표적 유기체에 위험을 초래하지 않을 것으로 예상된다. 더욱이, 항-서리 단백질은 완전히 생물학적으로 분해가능하므로 환경 친화적이다. 이 외에도, 키틴은 해충, 예컨대 진균 또는 곤충, 뿐만 아니라 연체동물의 치설의 핵심 구조적 구성성분이기 때문에, 이러한 해충은 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질에 대한 저항성을 쉽게 발달시키지 못할 것으로 예상된다.
본 발명자들은 일부 항-서리 단백질이 식물 면역 시스템을 활성화시킨다는 것을 발견하였다. 식물은 이 메커니즘에 의해 비생물적 스트레스 또는 특정 해충, 예컨대 진균 또는 곤충에 대한 더 큰 저항성을 갖게 된다.
본 발명자들은 또한 키틴분해 활성을 갖는 일부 항-서리 단백질이 실제로 해충, 예컨대 진균, 곤충 및 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하는데 사용될 수 있음을 발견하였다.
본 출원은 항-서리 단백질이 해충 침입에 대응하기 위한 식물 보호제로서 어떻게 적용되는지 (예를 들어 식물 또는 식물 부분의 표면에의 항-서리 단백질의 적용을 통해) 처음으로 보여준다.
또한, 본 발명은 항-서리 단백질 및 식물 보호제로서의 이의 후속 사용이 확립된 성분과 비교할 때 뚜렷한 장점을 제공하므로 선행 기술의 식물 보호제에 중요한 기여를 한다. 이러한 장점은 취급 동안 안전성 위험요소의 부재 또는 식품 사슬에 유입 시 병원성의 부재를 포함할 수 있다. 또한, 확립된 성분과 비교할 때, 식물 보호를 달성하기 위해서는 훨씬 더 낮은 농도의 본 발명에 따른 항-서리 단백질이 필요하다. 이는 비용 절감으로 이어질 수 있다.
최종적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항-서리 단백질의 적용이 선행 기술의 식물 보호제의 적용과 조합되어 이에 의해 식물 보호를 더욱 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 하기 바람직한 실시양태를 제공한다:
[1] 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물로서, 항-서리 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 제1 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
[2] [1]에 있어서, 제1 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 것인 조성물.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
[4] [1]에 있어서, 제1 아미노산 서열이 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 것인 조성물.
[5] [1] 또는 [4]에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
[6] [1]-[5] 중 어느 하나에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 제1 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 것인 조성물.
[7] [1]-[6] 중 어느 하나에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 제1 아미노산 서열로 이루어지는 것인 조성물.
[8] [1]-[7] 중 어느 하나에 있어서, 식물 보호제인 조성물.
[9] [1]-[8] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 액체 조성물인 조성물.
[10] [1]-[9] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 수성 조성물인 조성물.
[11] [1]-[10] 중 어느 하나에 있어서, 항-서리 단백질이 0.01 mg/l (w/v) 내지 100 mg/l (w/v)의 농도로 조성물에 포함되는 것인 조성물.
[12] [1]-[11] 중 어느 하나에 있어서, 항-서리 단백질이 0.1 mg/l (w/v) 내지 70 mg/l (w/v)의 농도로 조성물에 포함되는 것인 조성물.
[13] [1]-[12] 중 어느 하나에 있어서, 항-서리 단백질이 5 mg/l (w/v) 내지 30 mg/l (w/v)의 농도로 조성물에 포함되는 것인 조성물.
[14] [1]-[13] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 폴리비닐 알코올을 포함하는 것인 조성물.
[15] [1]-[14] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 폴리비닐 알코올을 6% (v/v) 내지 10% (v/v)의 농도로, 바람직하게는 약 8% (v/v)의 농도로 포함하는 것인 조성물.
[16] 식물 보호제로서 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물의 용도.
[17] [16]에 있어서, 조성물이 [1]-[15] 중 어느 하나에 따른 것인 조성물의 용도.
[18] [16] 또는 [17]에 있어서, 비생물적 스트레스 및/또는 해충에 대한 식물 보호제로서 조성물의 용도.
[19] [16]-[18] 중 어느 하나에 있어서, 식물 보호제가 비생물적 스트레스에 대한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 서리 스트레스 또는 가뭄 스트레스인 조성물의 용도.
[20] [16]-[19] 중 어느 하나에 있어서, 식물 보호제가 비생물적 스트레스에 대한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 서리 스트레스인 조성물의 용도.
[21] [16]-[20] 중 어느 하나에 있어서, 식물 보호제가 비생물적 스트레스에 대한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 가뭄 스트레스인 조성물의 용도.
[22] [16]-[18] 중 어느 하나에 있어서, 식물 보호제가 해충에 대한 것이고, 여기서 해충이 임의로 키틴을 함유하는 유기체, 예컨대 진균 또는 곤충인 조성물의 용도.
[23] [16]-[18] 및 [22] 중 어느 하나에 있어서, 식물 보호제가 해충에 대한 것이고, 여기서 해충이 임의로 진균 또는 곤충인 조성물의 용도.
[24] [16]-[18] 및 [22]-[23] 중 어느 하나에 있어서, 해충이 진균인 용도.
[25] [22]-[24] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸시니아(Puccinia), 푸사리움(Fusarium) 또는 셉토리아(Septoria) 종인 용도.
[26] [22]-[25] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸사리움 또는 셉토리아 종인 용도.
[27] [22]-[26] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸사리움 종, 바람직하게는 푸사리움 쿨모룸인 용도.
[28] [22]-[24] 및 [25] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸시니아 종인 용도.
[29] [22]-[25] 및 [28] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸시니아 트리티시나인 용도.
[30] [16]-[29] 중 어느 하나에 있어서, 식물이 경작가능한 작물, 열매 맺는 식물 또는 채소인 용도.
[31] [16]-[30] 중 어느 하나에 있어서, 식물이 경작가능한 작물, 예컨대 밀인 용도.
[32] [16]-[31] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 식물 또는 식물 부분에 적용되는 것인 용도.
[33] [16]-[32] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 비생물적 스트레스 및/또는 해충이 발생하기 전에 식물 또는 식물 부분에 적용되는 것인 용도.
[34] [16]-[33] 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분이 잎, 열매 또는 종자인 용도.
[35] [16]-[34] 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분이 잎인 용도.
[36] [16]-[34] 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분이 종자인 용도.
[37] [36]에 있어서, 조성물이 파종 전에 종자에 적용되는 것인 용도.
[38] [16]-[37] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 식물 면역을 유도하는 것인 용도.
[39] [16]-[38] 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추가 식물 보호제(들)가 식물 또는 식물 부분에 적용되고, 여기서 추가 식물 보호제(들)는 항-서리 단백질이 아닌 것인 용도.
[40] 식물 또는 식물 부분에 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 비생물적 스트레스 및/또는 해충으로부터 식물을 보호하는 방법.
[41] [40]에 있어서, 조성물이 [1]-[15] 중 어느 하나에 따른 것인, 식물을 보호하는 방법.
[42] [40] 또는 [41]에 있어서, 조성물이 비생물적 스트레스 및/또는 해충이 발생하기 전에 식물 또는 식물 부분에 적용되는 것인, 식물을 보호하는 방법.
[43] [40]-[42] 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분이 잎, 열매 또는 종자인, 식물을 보호하는 방법.
[44] [40]-[43] 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분이 잎인, 식물을 보호하는 방법.
[45] [40]-[43] 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분이 종자인, 식물을 보호하는 방법.
[46] [45]에 있어서, 조성물이 파종 전에 종자에 적용되는 것인, 식물을 보호하는 방법.
[47] [40]-[46] 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 부분이 조성물에 침지되는 것인, 식물을 보호하는 방법.
[48] [40]-[47] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 식물 또는 식물 부분, 예컨대 종자, 예를 들어 코팅된 종자의 표면에 분무에 의해 적용되는 것인, 식물을 보호하는 방법.
[49] [40]-[48] 중 어느 하나에 있어서, 방법이 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 서리 스트레스 또는 가뭄 스트레스인 방법.
[50] [40]-[49] 중 어느 하나에 있어서, 방법이 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 서리 스트레스인 방법.
[51] [40]-[50] 중 어느 하나에 있어서, 방법이 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 가뭄 스트레스인 방법.
[52] [40]-[48] 중 어느 하나에 있어서, 방법이 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 해충이 임의로 진균 또는 곤충인 방법.
[53] [40]-[48] 및 [52] 중 어느 하나에 있어서, 해충이 키틴을 함유하는 유기체, 예컨대 진균 또는 곤충인 방법.
[54] [40]-[48] 및 [52]-[53] 중 어느 하나에 있어서, 해충이 진균인 방법.
[55] [52]-[54] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸시니아, 푸사리움 또는 셉토리아 종인 방법.
[56] [52]-[55] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸사리움 또는 셉토리아 종인 방법.
[57] [52]-[56] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸사리움 종, 바람직하게는 푸사리움 쿨모룸인 방법.
[58] [52]-[55] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸시니아 종인 방법.
[59] [52]-[55] 및 [58] 중 어느 하나에 있어서, 진균이 푸시니아 트리티시나인 방법.
[60] [40]-[59] 중 어느 하나에 있어서, 식물이 경작가능한 작물, 열매 맺는 식물 또는 채소인 방법.
[61] [40]-[60] 중 어느 하나에 있어서, 식물이 경작가능한 작물, 예컨대 밀인 방법.
[62] [40]-[61] 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 식물 면역을 유도하는 것인 방법.
[63] [40]-[62] 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추가 식물 보호제(들)를 식물 또는 식물 부분에 적용하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 추가 식물 보호제(들)는 항-서리 단백질이 아닌 것인 방법.
도 1. 식물 보호제로서 키티나제 활성을 갖는 AFP의 사용. 에프. 쿨모룸(F. culmorum) 성장 및 식물 건강을 키티나제 활성을 갖는 AFP의 존재 하에 평가하였다. (A) 대조군; (B) 대조군+에프. 쿨모룸; (C) Vaffr-2d+에프. 쿨모룸.
도 2. 서리 스트레스에 대한 항-서리 단백질의 보호 활성 (손상 감소). 항-서리 단백질 Vaffr-2d의 엽면 적용에 의해 테스트하였다. 결과는 대조군 (CTL)으로 정규화된다.
도 3. 비생물적 스트레스에 대한 식물 보호제로서 Vaffr-2d의 사용. 서리 스트레스의 존재 하에 엽면 적용 후 배의 수율.
도 4. 식물 면역의 유도제로서의 AFP-6. 밀, 벤치마크(Benchmark)에서 푸시니아 트리티시나에 대한 종자 처리로서의 % 효능.
도 5. 식물 면역의 유도제로서의 AFP-6. (A) 밀, 케이툼(Keitum)에서 푸시니아 트리티시나에 대한 종자 처리로서의 AFP-6의 % 효능. (B) 밀, 케이툼에서 푸시니아 트리티시나에 대한 종자 처리로서의 디펜드 엑스트라(Difend extra)의 % 효능.
도 6. 자스몬산 및 살리실산 경로에 대한 AFP-6의 효과. 종자를 0.1 g/톤 또는 0.175 g/톤의 AFP-6으로 처리하고, 묘목 샘플을 시딩 후 4, 7, 9 및 14일 (dps)에 채취하였다. (A) LOX mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴으로 정규화된다 (하단 패널). (B) OPR3 mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴 (하단 패널)으로 정규화된다. (C) PR1-3 mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴 (하단 패널)으로 정규화된다. (D) PR1-17 mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴 (하단 패널)으로 정규화된다.
도 7. 자스몬산 및 살리실산 경로에 대한 Vaffr-2d의 효과. 종자를 0.175 g/톤의 Vaffr-2d로 처리하고, 식물 샘플을 파종 후 6, 7, 8 및 11일에 채취하였다. (A) OPR3 mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴 (하단 패널)으로 정규화된다. (B) LOX mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴으로 정규화된다 (하단 패널). (C) PR1-3 mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴 (하단 패널)으로 정규화된다. (D) PR1-17 mRNA 수준의 배수-변화가 표시되며, 액틴 (상단 패널) 또는 유비퀴틴 (하단 패널)으로 정규화된다.
발명의 상세한 설명
본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 효소학, 식물 보호, 생화학, 유전학 및 분자 생물학 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으며, 적합한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 맥락에서 사용될 때 용어 "약"은 용어 "약" 다음에 오는 값이 +/- 20% 범위, 바람직하게는 +/-15% 범위, 더욱 바람직하게는 +/- 10% 범위 내에서 달라질 수 있음을 의미한다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 인용된 참고문헌보다 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 달리 명시되지 않는 한 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포함하는" 또는 "포함하다"와 같은 용어의 각 발생은 임의로 "로 이루어진" 또는 "로 이루어진다"로 치환될 수 있다. 화합물 또는 조성물의 맥락에서 용어 "로 본질적으로 이루어진다"는 화합물 또는 조성물의 본질적인 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 추가 구성성분이 존재할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 항-서리 단백질은 상기 아미노산 서열 및 효소의 키틴분해 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가적인 N- 및/또는 C-말단 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 비생물적 스트레스 및/또는 해충 방제에 대한 단백질-기반 접근법을 제공함으로써 현재 식물 보호제의 문제를 극복하는 것을 목표로 한다. 구체적으로, 본 발명의 접근법은 식물을 보호하기 위한 항-서리 단백질에 의존한다. 이들 단백질은 스트레스에 대한 식물 방어 경로의 활성화를 유도하고, 일부는 또한 인간 또는 다른 고등동물에서는 생산되지 않는 키틴을 특이적으로 분해할 수 있으므로, 인간 소비 또는 다른 비-표적 유기체에 위험을 초래하지 않을 것으로 예상된다. 본 출원에서, 용어 "키틴분해 효소"는 용어 "키티나제"와 동의어로 사용된다.
본 개시내용은 아래와 같이 더 자세히 설명된다.
항-서리 단백질
본 발명은 항-서리 단백질, 하나 이상의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 하나 이상의 항-서리 단백질을 포함하거나 이로 (본질적으로) 이루어진 식물 보호제에 관한 것이다. 본 발명은 특히 서열식별번호: 1 또는 2의 AFP, 이의 변이체 또는 이를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열식별번호: 1은 당근으로부터 유래된 AFP (Vaffr-2d라고도 함)를 정의한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 Vaffr-2d가 또한 키틴분해 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 서열식별번호: 2는 AFP-6이라고 불리는 AFP를 정의한다.
본원에 개시된 바와 같은 항-서리 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 (예컨대 100% 동일한) 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하고, 가장 바람직하게는 100% 동일하다. 그러므로, 상기 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이에 따라, 바람직한 항-서리 단백질은 또한 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 (예컨대 100% 동일한) 제1 아미노산 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하고, 가장 바람직하게는 100% 동일하다. 그러므로, 상기 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다.
따라서, 항-서리 단백질은 또한 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 (예컨대 100% 동일한) 제1 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하고, 가장 바람직하게는 100% 동일하다. 그러므로, 상기 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1과 적어도 70% 동일할 수 있다.
예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 2와 적어도 70% 동일할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항-서리 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 15개 아미노산 차이 (예컨대 아미노산 차이 없음)를 나타내는 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 10개, 최대 5개, 또는 최대 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이를 나타낸다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이, 가장 바람직하게는 아미노산 차이 없음을 나타낸다. 그러므로, 상기 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이에 따라, 본원에 개시된 바와 같은 항-서리 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 15개 아미노산 차이 (예컨대 아미노산 차이 없음)를 나타내는 제1 아미노산 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 10개, 최대 5개, 또는 최대 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이를 나타낸다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이, 가장 바람직하게는 아미노산 차이 없음을 나타낸다. 그러므로, 상기 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같은 항-서리 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 15개 아미노산 차이 (예컨대 아미노산 차이 없음)를 나타내는 제1 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 10개, 최대 5개, 또는 최대 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이를 나타낸다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 최대 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이, 가장 바람직하게는 아미노산 차이 없음을 나타낸다. 그러므로, 상기 단백질은 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 1과 최대 15개 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
예를 들어, 제1 아미노산 서열은 서열식별번호: 2와 최대 15개 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
제1 아미노산 서열이 상기 정의된 바와 같은 참조 아미노산 서열과 100% 미만 동일하고/거나 아미노산 차이를 갖는 경우, 항-서리 단백질은 바람직하게는 참조 서열로 (본질적으로) 이루어진 상응하는 항-서리 단백질과 동일하거나 더 나은 보호 효과 (예를 들어 서리 및/또는 가뭄 스트레스에 대한)를 갖는다. 예를 들어, 제1 아미노산이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 70% (및 100% 미만) 동일한 경우, 항-서리 단백질은 바람직하게는 서열식별번호: 1로 (본질적으로) 이루어진 항-서리 단백질과 동일하거나 더 나은 보호 효과를 갖는다. 마찬가지로, 예를 들어, 제1 아미노산이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 최대 15개 (및 적어도 1개) 아미노산 차이를 갖는 경우, 항-서리 단백질은 바람직하게는 서열식별번호: 1로 (본질적으로) 이루어진 항-서리 단백질과 동일하거나 더 나은 보호 효과를 갖는다. 서열식별번호: 2에도 동일한 내용이 준용되어 적용된다.
제1 아미노산 서열이 상기 정의된 바와 같은 참조 아미노산 서열과 100% 미만 동일하고/거나 아미노산 차이를 갖는 경우, 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질은 바람직하게는 참조 서열로 (본질적으로) 이루어진 키틴분해 활성을 갖는 상응하는 항-서리 단백질과 동일하거나 더 나은 분해 속도를 갖는다. 예를 들어, 제1 아미노산이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 70% (및 100% 미만) 동일한 경우, 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질은 바람직하게는 서열식별번호: 1로 (본질적으로) 이루어진 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질과 동일하거나 더 나은 키틴 분해 속도를 갖는다. 마찬가지로, 예를 들어, 제1 아미노산이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 최대 15개 (및 적어도 1개) 아미노산 차이를 갖는 경우, 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질은 바람직하게는 서열식별번호: 1로 (본질적으로) 이루어진 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질과 동일하거나 더 나은 키틴 분해 속도를 갖는다.
제1 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 100% 미만 동일하고/거나 아미노산 차이를 갖는 경우, 통상의 기술자는 아미노산 서열로 (본질적으로) 이루어진 참조, 즉 비변형된 서열과 비교하여 보호 효과 (예를 들어 서리 및/또는 가뭄 스트레스에 대한) 및/또는 키틴 분해 속도를 유지 또는 개선하기 위해 원래 서열을 변형하는 방법을 알고 있다. 보호 효과는 예를 들어 문제의 AFP의 수용액 (또는 대조군으로서 AFP가 없는 동일한 용액)을 식물 부분에 분무하고, 식물을 동결 온도 (서리 스트레스의 경우) 또는 물 공급이 제한된 조건 (가뭄 스트레스의 경우)에서 인큐베이션함으로써 결정될 수 있다. 키틴 분해 속도는 예를 들어 키틴 분말을 기질로서 문제의 AFP의 수용액과 함께 인큐베이션함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, 변형된 효소의 효과 및 참조 서열의 효과를 결정하는데 동일한 방법이 사용된다.
제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"의 백분율 또는 "% 동일성"은 [제2 아미노산 서열의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 총 수]로 나누고 [100%]을 곱하여 계산될 수 있으며, 여기서 제2 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 각 결실, 삽입, 치환 또는 첨가 (제1 아미노산 서열과 비교하여)는 단일 아미노산 잔기 (즉 단일 위치)의 차이로 간주된다. 뉴클레오티드 서열에도 동일한 내용이 준용되어 적용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "아미노산 차이"는 아미노산 삽입, 결실 또는 치환일 수 있으며, 바람직하게는 치환이다. 아미노산 치환은 바람직하게는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 보존적 치환이다. 이러한 보존적 치환은 하기 그룹 (a) - (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환일 수 있다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
보다 구체적으로, 보존적 치환은 하기와 같을 수 있다: Ala에서 Gly 또는 Ser로; Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser로; Gln에서 Asn로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Ala 또는 Pro로; His에서 Asn 또는 Gln로; Ile에서 Leu 또는 Val로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu로; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp로; 및/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu.
키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질은 엔도-키티나제 또는 엑소-키티나제일 수 있다. 바람직하게는, 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질은 진균 및/또는 곤충의 구조적 구성성분으로서 존재하는 키틴을 절단할 수 있다. 진균의 구조적 구성성분은 세포벽일 수 있다. 곤충의 구조적 구성성분은 외골격일 수 있다. 가장 바람직하게는, 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질은 진균의 세포벽에 존재하는 키틴을 절단할 수 있다.
항-서리 단백질은 제1 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제2 아미노산 서열은 전형적으로 단백질의 N-말단에 위치된다.
제2 아미노산 서열은 바람직하게는 길이가 50개 미만의 아미노산, 더욱 바람직하게는 30개 미만, 더욱 더 바람직하게는 25개 미만의 아미노산, 예컨대 22개 아미노산이다.
제2 아미노산 서열은 전형적으로 세포, 예컨대 박테리아 세포로부터 분비를 야기하는 서열이다. 따라서, 제2 아미노산은 신호 펩티드일 수 있다. 제2 아미노산 서열의 구체적인 예는 PelB 신호 펩티드 (서열식별번호: 3)를 포함한다.
항-서리 단백질은 제1 아미노산 서열의 C-말단에 융합된 제3 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제3 아미노산 서열은 전형적으로 단백질의 C-말단에 위치된다.
제3 아미노산 서열은 바람직하게는 길이가 50개 미만의 아미노산, 더욱 바람직하게는 30개 미만, 더욱 더 바람직하게는 20개 미만의 아미노산이다. 가장 바람직하게는, 제3 아미노산 서열은 길이가 10개 미만의 아미노산, 예컨대 6개 아미노산이다.
제3 아미노산 서열은 전형적으로 세포, 예컨대 박테리아 세포에 의한 생산 후 항-서리 단백질의 정제를 용이하게 하는 서열이다. 따라서, 제3 아미노산은 정제 태그일 수 있다. 정제 태그의 구체적인 예는 6xHis 태그 (서열식별번호: 4) 또는 Tag54/6xHis combi-태그를 포함한다. 바람직하게는, 제3 아미노산 서열은 6xHis 태그이다.
그러므로 본 발명은 또한 제1 아미노산 서열, 제2 아미노산 서열 및 제3 아미노산 서열을 포함하거나 이로 (본질적으로) 이루어진 항-서리 단백질을 제공하며, 여기서 제2 아미노산 서열은 PelB 신호 펩티드이고 제3 아미노산 서열은 6xHis 태그이다.
항-서리 단백질은 바람직하게는 정제된 항-서리 단백질이다. 이 맥락에서 "정제된"은 5% 미만의 불순물, 예컨대 2% 미만 또는 심지어 1% 미만의 불순물이 존재함을 의미한다. 이 맥락에서 불순물은 단백질 및 임의로 용매 이외의 임의의 성분을 의미한다.
서열식별번호: 1 또는 이와 적어도 70% 서열 동일성 또는 최대 15개 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-서리 단백질이 특히 바람직하다.
또한, 서열식별번호: 2 또는 이와 적어도 70% 서열 동일성 또는 최대 15개 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-서리 단백질이 특히 바람직하다.
핵산, 벡터 및 숙주 (세포)
본 발명은 또한 항-서리 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
항-서리 단백질을 코딩하는 핵산은 또한 본원에 기재된 바와 같은 하나 초과의 단백질을 코딩할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 서열식별번호: 1과 적어도 70% 동일한 (예컨대 100% 동일한) 제1 아미노산 서열을 포함하는 AFP 및 서열식별번호: 2와 적어도 70% 동일한 (예컨대 100% 동일한) 제1 아미노산 서열을 포함하는 AFP를 코딩하는 핵산을 제공한다.
핵산은 예를 들어 DNA, RNA 또는 이들의 하이브리드일 수 있으며, 또한 PNA와 같은 (예를 들어 화학적으로) 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 단일- 또는 이중-가닥 DNA일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA일 수 있다.
본 발명은 항-서리 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같은 벡터는 유전 물질을 세포 내로 운반하는데 적합한 비히클이다. 벡터는 네이키드 핵산, 예컨대 플라스미드 또는 mRNA, 또는 더 큰 구조에 내장된 핵산, 예컨대 리포솜 또는 바이러스 벡터를 포함한다.
벡터는 일반적으로 예를 들어 하나 이상의 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 종결자(들) 등과 같은 하나 이상의 조절 요소에 임의로 연결되는 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 벡터는 발현 벡터, 즉 적합한 조건 하에, 예를 들어 벡터가 (예를 들어 박테리아 또는 식물) 세포에 도입되는 경우 코딩된 폴리펩티드 또는 구축물을 발현하기에 적합한 벡터일 수 있다. DNA-기반 벡터의 경우, 이는 일반적으로 전사 (예를 들어 프로모터 및 폴리A 신호) 및 번역 (예를 들어 Kozak 서열)을 위한 요소의 존재를 포함한다.
벡터에서, 상기 적어도 하나의 핵산 및 상기 조절 요소는 서로 "작동가능하게 연결"될 수 있으며, 이는 일반적으로 이들이 서로 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리 제어/조절할 수 있는 경우, 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다 (여기서 상기 코딩 서열은 상기 프로모터의 "제어 하에" 있는 것으로 이해되어야 함).
또한, 바람직하게는 항-서리 단백질을 코딩하는 핵산은 발현 시스템의 일부를 구성할 수 있으며, 여기서 핵산은 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 오픈 리딩 프레임은 특정 유기체에 대해 코돈-최적화될 수 있다.
본 발명은 핵산 또는 벡터를 포함하는 (비-인간) 숙주 또는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 적합한 숙주 세포는 식물 세포 또는 미생물 세포일 수 있다.
예를 들어, 농업용 또는 관상용 식물로부터의 식물 세포가 사용될 수 있다. 미생물 세포는 예를 들어 효모 또는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이일 수 있다. 적합한 효모의 예는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질, 이를 코딩하는 핵산, 또는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 식물이 제공된다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터는 식물의 게놈에 포함될 수 있다. 식물의 예는 경작가능한 작물, 예컨대 밀, 열매 맺는 식물 또는 채소를 포함한다. 식물의 예는 곡물, 메이즈, 유채, 벼, 대두 또는 감자를 포함한다.
전형적으로, 식물 (세포)은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지 않는 것일 것이다. 예를 들어, 식물 (세포)은 다우쿠스 카로타(Daucus carota)가 아니다. 예를 들어, 식물 (세포)은 녹조류, 예컨대 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)가 아니다.
생산 방법
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 방법은 적어도 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포, 및 특히 박테리아 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이를 배양하는 단계를 포함한다. 배양은 숙주 세포의 성장에 적합한 배지에서 수행될 수 있다.
방법은 배양 동안 및/또는 배양 후에 숙주 세포 및/또는 배양 상청액을 수확하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배양 (적합한 기간) 후에 상청액을 수확한다.
방법은 항-서리 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-서리 단백질은 초기 황산암모늄 침전 단계 및 가용화된 단백질 침전물의 순차적 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 정제에 의해 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
항-서리 단백질을 생산하는 방법은 예를 들어 하나 이상의 항-서리 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 발현 시스템을 설정하는 것을 포함할 수 있다.
바람직하게는 본 방법에 의해 생산된 항-서리 단백질은 효소의 배양 배지로의 분비 및/또는 배양 상청액으로부터의 정제를 용이하게 하기 위해 N- 및/또는 C-말단 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 방법에 의해 생산된 항-서리 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 제2 및/또는 제3 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 방법은 초기 황산암모늄 침전 단계에 의해 배양 상청액으로부터 항-서리 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 가용화된 단백질 침전물의 순차적 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 정제는 효소에 포함된 아미노산 태그, 예컨대 6xHis 태그를 사용하여 수행된다.
조성물
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 조성물은 식물 면역을 유도한다.
바람직하게는 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 상이한 항-서리 단백질을 포함한다.
조성물은 예를 들어 서열식별번호: 1을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질 및 서열식별번호: 2를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질을 포함할 수 있다.
조성물은 예를 들어 서열식별번호: 1로 본질적으로 이루어진 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질 및 서열식별번호: 2로 본질적으로 이루어진 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질을 포함할 수 있다.
조성물은 예를 들어 서열식별번호: 1로 이루어진 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질 및 서열식별번호: 2로 이루어진 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질을 포함할 수 있다.
조성물은 액체 또는 건조 조성물, 바람직하게는 액체 조성물일 수 있다. 액체 조성물은 적합하게는 수성 조성물일 수 있다. 조성물은 상업용 종자 처리에 사용되는 표준 스티커인 폴리비닐 알코올 (PVOH)을 포함할 수 있다. 조성물 중 폴리비닐 알코올의 농도는 예를 들어 5% (v/v) 내지 15% (v/v), 바람직하게는 6% (v/v) 내지 10% (v/v), 더욱 바람직하게는 약 8% (v/v)일 수 있다.
전형적으로, 조성물은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하는 식물로부터의 추출물을 포함하지 않는다. 예를 들어, 조성물은 다우쿠스 카로타 또는 녹조류, 예컨대 클로렐라 불가리스로부터의 추출물을 포함하지 않는 조성물일 수 있다.
조성물 중 항-서리 단백질 (예를 들어, 키틴분해 효소)의 농도는 예를 들어 0.01 mg/L 내지 250 g/L, 예컨대 0.025 mg/L 내지 100g/L일 수 있다. 대안적으로, 조성물 중 항-서리 단백질 (예를 들어, 키틴분해 효소)의 농도는 예를 들어, 최대 1 g/l (w/v), 예컨대 최대 100 mg/l (w/v), 또는 0.01 mg/l (w/v) 내지 100 mg/l (w/v), 예컨대 0.1 mg/l (w/v) 내지 70 mg/l (w/v), 또는 1 mg/l (w/v) 내지 50 mg/l (w/v), 또는 5 mg/l (w/v) 내지 30 mg/l (w/v), 또는 7 mg/l (w/v) 내지 25 mg/l (w/v), 또는 약 9 mg/l (w/v), 또는 약 13 mg/l (w/v), 또는 약 22 mg/l (w/v)일 수 있다. 농도의 추가 구체적인 예는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 적용에 따라 하기와 같다:
살곤충제 적용 : 0.01% 내지 5% (w/v), 예컨대 0.05% 내지 2.5% (w/v), 바람직하게는 0.1 내지 1% (w/v)
살진균제 적용 : 0.25 μg/100 μl 내지 25.0 μg/100 μl, 예컨대 0.7 μg/100 μl 내지 15.0 μg/100 μl, 바람직하게는 1.25 μg/100 μl 내지 10.0 μg/100 μl
간접 살진균제 적용 : 0.25 μg /100 μl 내지 25.0 μg /100 μl, 예컨대 0.7 μg/100 μl 내지 15.0 μg/100 μl, 바람직하게는 0.65 μg /100 μl 내지 5 μg /100 μl
비생물적 스트레스 : 0.01 mg/L 내지 1 mg/L, 예컨대 0.025 mg/L 내지 0.5 mg/L, 바람직하게는 0.05 mg/L 내지 0.25 mg/L
바람직하게는, 조성물은 보호 효과 및/또는 키틴분해 활성의 억제제를 포함하지 않는다. 이러한 억제제는 금속성 이온 (예를 들어, 2가 이온, 예컨대 Zn2+, Cu2+, Ni2+), 세제 (예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), Triton X100 또는 폴리소르베이트 20), 또는 특정 다른 화학물질 (예를 들어, EDTA, 이미다졸)일 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 조성물은 금속성 이온 및/또는 SDS를 포함하지 않는다.
식물 보호
본 발명자들은 놀랍게도 항-서리 단백질이 서리 및 가뭄 스트레스를 포함하는 상이한 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 더욱이, 놀랍게도, AFP 및 특히 키틴분해 활성을 갖는 것은 또한 해충, 예컨대 진균으로부터 식물을 보호하는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 또한 항-서리 단백질, 및 특히 AFP-6 및 Vaffr-2d가 식물 면역 시스템을 활성화시킨다는 것, 즉 식물 면역을 유도한다는 것을 발견하였다. 용어 "식물 면역을 유도하다" 및 "식물 면역 시스템을 활성화시키다"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 식물 면역의 유도는 예를 들어 식물에서 자스몬산 경로 및/또는 살리실산 경로의 활성화에 대해 테스트함으로써 테스트될 수 있다. 이들 경로는 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 식물 방어 조절제로서 중요한 역할을 한다. 통상의 기술자는 자스몬산 경로 및/또는 살리실산 경로의 활성화에 대해 테스트하는 방법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 자스몬산 경로의 활성화는 자스몬산 경로를 활성화시키기 위해 상향조절되는 LOX 및/또는 OPR3 유전자의 mRNA 수준의 변화를 평가함으로써 테스트될 수 있다 (Chini, 2018: "An OPR3-독립적 pathway uses 4, 5-didehydrojasmonate for jasmonate synthesis"; Nature chemical biology, 14(2), 171-178; doi: https://doi.org/10.1038/nchembio.2540) (Leon, 1999: "Molecular biology of jasmonic acid biosynthesis in 계획ts"; 계획t physiology 및 Biochemistry, 37(5), 373-380; doi: https://doi.org/10.1016/S0981-9428(99)80043-6). 살리실산 경로의 활성화는 PR1-3 및/또는 PR1-17 유전자의 mRNA 수준의 변화를 평가함으로써 테스트될 수 있다. PR1-3 및 PR1-17 단백질의 생산은 식물 호르몬 살리실산과 연관되어 있다 (Van Loon, 1999: "The families of pathogenesis-related proteins, their activities, 및 comparative analysis of PR-1 type proteins"; Physiological 및 molecular 계획t pathology, 55(2), 85-97; doi: https://doi.org/10.1006/pmpp.1999.0213). 자스몬산 경로 및/또는 살리실산 경로의 활성화에 대해 테스트하는 예시적인 방법은 하기 실시예 7에 추가로 기재되어 있다. 식물 면역 시스템은 모든 식물에서 보존되며, 따라서 본 발명에 따른 항-서리 단백질은 모든 식물에서 면역 시스템을 활성화시키는 것으로 가정될 수 있다. 유리하게는, 식물이 비생물적 스트레스 및/또는 해충에 의해 손상되기 전에 식물 면역이 유도된다. 따라서, 바람직하게는 본 발명에 따른 항-서리 단백질 (또는 이를 포함하는 조성물)은 비생물적 스트레스 및/또는 해충이 발생하기 전에, 예를 들어 식물이 비생물적 스트레스 및/또는 해충에 의해 손상되기 전에 식물 또는 식물 부분에 적용된다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항-서리 단백질의 적용이 선행 기술의 식물 보호제의 적용과 조합되어 이에 의해 식물 보호를 더욱 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따른 항-서리 단백질의 적용에 더하여, 항-서리 단백질이 아닌 추가 식물 보호제가 식물 또는 식물 부분에 적용될 수 있다. 이러한 추가 식물 보호제는 예를 들어 살곤충제, 제초제, 살진균제 및 살서제로서 사용하기 위한 화학적 살충제, 예컨대 유기염소, 유기인산염, 카르바메이트, 피레트로이드, 트리아진 및 네오니코티노이드 그룹의 성분일 수 있다. 예를 들어, 이러한 추가 식물 보호제는 디펜드 엑스트라 (25 g/l 디페코나졸 및 25g/l 플루디옥시닐) 및/또는 프로텐도(Protendo) (프로티오코나졸 300 g/l EC) 및/또는 벨로지 에라(Velogy era) (EC 75g/l 벤조빈디플루피르 + 150 g/l 프로티오코나졸)일 수 있다. 이러한 추가 식물 보호제는 또한 예를 들어 하기 언급된 추가 작용제 아스코르브산, 베타인 및/또는 살리실산일 수 있다.
진균 및 비생물적 스트레스에 대한 식물의 자연적 방어 메커니즘을 유도함으로써 해충 및 비생물적 스트레스에 대한 효과 외에도, 항-서리 단백질의 키틴분해 활성은 또한 해충 및 식물 질환에 직접적인 효과를 가질 수 있다.
그러므로 본 발명은 식물 보호제인 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 식물 보호제인 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 식물 보호제로서 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 식물 보호제로서 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
식물 보호제는 바람직하게는 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것 및/또는 해충, 예를 들어 키틴을 함유하는 유기체로부터 식물을 보호하기 위한 것이다.
그러므로, 식물 보호제는 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것일 수 있다. 비생물적 스트레스는 예를 들어 서리, 가뭄, 염, 홍수 또는 열 스트레스를 포함한다. 바람직하게는, 비생물적 스트레스는 서리 스트레스 또는 가뭄 스트레스이다.
식물 보호제는 (또한) 해충, 예를 들어 키틴을 함유하는 유기체로부터 식물을 보호하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 키틴은 진균의 세포벽, 절지동물, 예컨대 곤충의 외골격 및 연체동물의 치설의 주요 구성성분이다. 따라서, 식물 보호제는 진균, 곤충 또는 연체동물, 및 바람직하게는 진균 또는 곤충, 가장 바람직하게는 진균의 침입에 대항할 수 있다.
진균의 예는 아스코미세테스(ascomycetes), 예를 들어 넥트리아세아에(Nectriaceae) 또는 미코스파에렐라세아에(Mycosphaerellaceae) 과를 포함한다. 넥트리아세아에 과의 진균의 예는 푸사리움 속의 진균, 예컨대 푸사리움 옥시스포룸(Fusiarum oxysporum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusiarum graminearum), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum)을 포함한다. 미코스파에렐라세아에 과의 진균의 예는 셉토리아 속의 진균, 예컨대 셉토리아 트리티시(Septoria tritici)를 포함한다. 다른 예는 알테르나리아 솔라니(Alternaria solani), 피토프토라 인페스탄스(Phytophtora infestans), 피티움(Pythium), 마그나포르테 오리자에(Magnaporthe oryzae), 벤투리아 이나에쿠알리스(Venturia inaequalis), 피레노포라 테레스(Pyrenophora teres), 린코스포리움 세칼리스(Rhynchosporium secalis), 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina) 및 라물라리아 콜로-시그니(Ramularia collo-cygni)를 포함한다. 진균은 사상성 진균일 수 있다. 진균은 전형적으로 병원성 진균이다.
곤충의 예는 아피디다에(Aphididae), 테네브리오니다에(Tenebrionidae), 드로소필리다에(Drosophilidae) 또는 아프로포리다에(Aphrophoridae) 과의 곤충을 포함한다. 아피디다에 과의 곤충의 예는 시토비온(Sitobion) 속의 곤충, 예컨대 시토비온 아바나에(Sitobion avanae)를 포함한다. 테네브리오니다에 과의 곤충의 예는 트리볼리움(Tribolium) 속의 곤충, 예컨대 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum)을 포함한다. 드로소필리다에 과의 곤충의 예는 드로소필라(Drosophila) 속의 곤충, 예컨대 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)를 포함한다. 아프로포리다에 과의 곤충의 예는 필라에누스(Philaenus) 속의 곤충, 예컨대 필라에누스 스푸마리우스(Philaenus spumarius)를 포함한다.
보호되는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 경작가능한 작물, 예컨대 밀, 열매 맺는 식물 또는 채소를 포함한다.
식물의 예는 곡물, 메이즈, 유채, 벼, 대두 또는 감자를 포함한다.
본 발명은 항-서리 단백질 또는 적어도 하나의 항-서리 단백질, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 항-서리 단백질을 포함하는 조성물을 식물 또는 식물 부분에 적용하는 것을 포함하는, 비생물적 스트레스 및/또는 해충으로부터 식물을 보호하는 방법을 추가로 제공한다. 전형적으로, 조성물은 식물 또는 식물 부분의 표면에 적용된다.
비생물적 스트레스는 예를 들어 서리, 가뭄, 염 또는 열 스트레스를 포함한다. 바람직하게는, 비생물적 스트레스는 서리 스트레스 또는 가뭄 스트레스이다.
해충은 예를 들어 진균, 곤충 또는 연체동물을 포함한다. 그 예는 상기 제시되어 있다. 바람직하게는, 해충은 진균 또는 곤충, 가장 바람직하게는 진균이다. 해충은 활물기생 또는 사물기생일 수 있다.
항-서리 단백질 또는 조성물의 적용은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 식물 또는 식물 부분을 침지하는 것을 포함할 수 있다. 항-서리 단백질의 또 다른 예시적인 적용은 식물 또는 식물 부분 (예를 들어, 종자)를 항-서리 단백질 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 조성물)로 예를 들어 실시예에 기재된 코팅 방법을 사용하여 코팅하는 것을 포함할 수 있다. 항-서리 단백질의 또 다른 예시적인 적용은 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 식물 또는 식물 부분에 분무하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-서리 단백질은 ha당 약 200 l의 물을 사용하여 약 70 mg/ha의 용량 비율 (즉, 약 0.35 mg/l의 농도로 항-서리 단백질을 포함하는 조성물 사용)로, 또는 ha당 1000 l 또는 1500 l의 물을 사용하여 분무될 수 있다.
식물 부분은 예를 들어 잎, 열매 또는 종자 (예컨대 낟알)일 수 있다. 식물 부분이 종자인 경우, 본 발명에 따른 항-서리 단백질 (또는 이를 포함하는 조성물)은 바람직하게는 파종 전에 종자에 적용된다. 종자는 코팅된 종자 또는 코팅되지 않은 종자일 수 있다. 코팅된 종자 기술은 일반적으로 공지되어 있으며 관련 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 수정할 수 있다.
보호되는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 경작가능한 작물, 열매 맺는 식물 또는 채소를 포함한다. 예는 상기 기재되어 있다.
식물 보호는 또한 식물 또는 식물 세포에서 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-서리 단백질을 발현함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 식물 또는 식물 세포에서 항-서리 단백질을 발현시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다. 발현은 구성적 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 발현은 외부 자극, 예를 들어 비생물적 스트레스 및/또는 해충 침입에 반응하여 유도성일 수 있다 (예를 들어, 비생물적 스트레스 및/또는 조직 손상을 검출할 수 있는 식물의 내인성 감각 메커니즘을 통해).
추가 작용제
항-서리 단백질은 식물 보호제로서 작용할 수 있는 추가 작용제, 예를 들어 비생물적 스트레스에 대한 작용제, 살진균제 및/또는 살곤충제와 적합하게 조합될 수 있다. 이러한 추가 작용제는 예를 들어 아스코르브산, 베타인 및/또는 살리실산일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 아스코르브산, 베타인 및/또는 살리실산을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 살진균제 및/또는 살곤충제를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물 및 이의 용도를 제공한다.
표 1: 서열
실시예
본 출원의 하기 실험 섹션은 본 발명의 비제한적인 예시된 실시양태에 관한 것이다.
실시예 1
진균 침입에 대한 항-서리 단백질의 보호 활성을 테스트하였다. 이를 위해, 항-서리 단백질을 이. 콜라이 BL21 세포에서 생산하였다. 배양 상청액으로부터 효소를 정제하였다.
항-서리 단백질을 발아 테스트에서 보호 활성에 대해 테스트하였다. 간략하게, 하기 단계를 수행하였다:
1. 안전 캐비넷에서 10분 동안 10% 표백제로 밀 종자의 소독.
2. 여과지에서의 발아
3. 엽면 적용 3 dps (시딩 후 일수) 및 1 dbi (감염 전날)
4. 4dps: 병원체 푸사리움 쿨모룸의 첨가
5. 발아 및 식물 건강/식물독소의 모니터링
결과는 도 1에 나타내었다. 결과는 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질 Vaffr-2d의 첨가가 진균 성장의 강한 억제 및 개선된 식물 건강을 초래하였음을 보여준다 (대조군과 비교하여 생물자극제 효과).
그러므로 이들 결과는 키틴분해 활성을 갖는 항-서리 단백질, 특히 본원에 기재된 항-서리 단백질이 식물의 해충, 예컨대 진균의 성장을 효율적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 이에 의해 식물 건강이 개선될 수 있다. 그러므로, 항-서리 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 식물 보호제로서 사용될 수 있다.
실시예 2
항-서리 단백질 Vaffr-2d (표시된 농도의 항-서리 단백질을 포함하는 수성 제형 200 l/ha)을 사과 식물에 엽면 적용하고 식물에 서리 스트레스를 적용함으로써 서리 스트레스에 대한 항-서리 단백질의 보호 활성을 테스트하였다. 결과는 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
표 2
a, b 및 c는 95% 수준에서 통계적 유의성의 정도 증가를 나타낸다.
결과는 Vaffr-2d의 첨가가 투여량 증가에 따른 감소된 서리-손상 및 개선된 식물 건강을 초래하였음을 보여준다.
그러므로 이들 결과는 항-서리 단백질, 특히 본원에 기재된 항-서리 단백질이 서리-손상을 효율적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 이에 의해 식물 건강이 개선될 수 있다. 그러므로, 항-서리 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 식물 보호제로서 사용될 수 있다.
실시예 3
항-서리 단백질 Vaffr-2d 또는 AFP-6을 배 식물에 엽면 적용하고 식물에 서리 스트레스를 적용함으로써 서리 스트레스에 대한 항-서리 단백질의 보호 활성을 테스트하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
결과는 Vaffr-2d 또는 AFP-6의 첨가가 대조군과 비교하여 증가된 배 수율을 초래하였음을 보여준다.
그러므로 이들 결과는 항-서리 단백질, 특히 본원에 기재된 항-서리 단백질이 서리-손상을 효율적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 이에 의해 식물 건강이 개선될 수 있다. 그러므로, 항-서리 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 식물 보호제로서 사용될 수 있다.
실시예 4
Vaffr-2d 또는 AFP-6을 엽면 적용하거나 적용하지 않고 상이한 식물을 상이한 종류의 비생물적 스트레스에 적용하였다.
염 스트레스 실험을 위한 설정:
식물은 트레이에 천공된다
25℃/15℃ (낮/밤) 16시간 명, 8시간 암에서 발아
10일 후 적용
2일 후 8x8 cm의 화분에 재식됨
3개의 가능한 조건
* 재식하는 순간 직접적인 염 스트레스
* 재식 후 4일 동안의 염 스트레스
* 재식 후 7일 동안의 염 스트레스
염 스트레스 = 120 g/L NaCl의 용액 100 mL
결과는 하기 표 3에 나타내었다:
표 3
이들 결과는 항-서리 단백질, 특히 본원에 기재된 항-서리 단백질이 상이한 비생물적 스트레스, 예컨대 염, 가뭄 또는 홍수 스트레스로부터 식물을 효율적으로 보호할 수 있음을 보여준다. 이에 의해 식물 건강이 개선될 수 있다. 그러므로, 항-서리 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 식물 보호제로서 사용될 수 있다.
실시예 5
진균 감염에 대한 효소 AFP-6의 보호 활성을 조사하기 위해, 2회의 온실 시험을 수행하였다.
두 시험 모두에서 종자를 Satec ML2000, 8 l/톤 코팅기에서 하기 단계에 따라 코팅하였다 (이는 예를 들어 상업용 기계로 외삽될 수 있음):
- 배치 코팅기에 필요한 종자의 양 (Satec ML2000에서 min. 50 g 및 max. 2 kg)
- 투여 시작 - 약 10 내지 15초 소요
- 그 후 기계가 작동하는 동안 추가 15초 동안 건조되도록 둔다
- 기계에 업로딩
- 회전 속도 회전자: 500 내지 1000 RPM
- 회전 속도 스피닝 디스크: 2100 내지 3000 RPM
- 전체 프로세스 동안 코팅 온도: +/- 20℃
- 로딩, 투여, 건조 및 업로딩을 포함하여 총 코팅 프로세스는 약 1분 소요된다.
종자 1 톤당 8% (v/v) PVOH를 포함하는 8 l의 물 (즉, 7.36 l 물 + 640 ml PVOH) 중 0.07 g의 AFP-6 (프라우호퍼-게젤샤프트 생산)을 사용하여 코팅을 수행하였다. 그러므로, 코팅 후 AFP-6의 최종 농도는 0.07 g/톤 종자였다. 폴리비닐 알코올 (PVOH)은 상업용 종자 처리에 사용되는 표준 스티커이다. 미처리 대조군은 오직 물 및 8% PVOH이었으며, 활성 성분은 첨가되지 않았다. 화분당 4개의 종자를 6회 반복으로 파종하였다. 제2 시험에서, 비교를 위해 종자를 대안적으로 2 l/톤 농도의 디펜드 엑스트라 (25 g/l 디페코나졸 및 25 g/l 플루디옥시닐)로 코팅하였다. 디펜드 엑스트라는 상업적으로 이용가능한 종자 처리제이다.
밀 품종 벤치마크를 사용하여 제1 시험을 수행하였다. 파종 후 2주에, 갈색 녹병 (푸시니아 트리티시나 감염)으로 심하게 감염된 밀 식물을 자연 감염을 모방하기 위해 시험에 배치하였다. 8일 후, 처리된 객체 및 미처리 객체 중 갈색 녹병 스팟의 백분율을 식물의 상부 잎 3개에서 결정하였다. 효소 처리된 객체의 결과를 미처리 대조군과 비교하고, 미처리 대조군과 비교된 효소의 효능 백분율은 감염 백분율에 기초하여 계산하였다. 가장 어린 잎 (잎 1)은 처리된 및 미처리 대조군에서 감염되지 않았다. 그러므로, 잎 2 및 3을 평가하였다. 미처리 대조군과 비교하여, 잎 2는 69% 적게 감염되었고, 잎 3은 44% 적게 감염되었다 (도 4 참조). 이는 0.07 g/톤 효소 AFP-6으로 코팅된 품종 벤치마크에서 두 잎 모두에 대해 평균 57% 적은 감염 효능이다.
제2 시험의 경우 밀 품종 케이툼을 사용하였다. 파종 후 2주에, 식물에 갈색 녹병 포자 현탁액 (농도 3x105 포자/ml)을 실행이 끝날 때까지 접종하였다. 상부 잎 4개에서 상기 기재된 바와 같이 감염 후 12일에 갈색 녹병 스팟의 백분율을 평가하였다. AFP-6- 또는 디펜드 엑스트라-처리된 객체의 결과를 미처리 대조군과 비교하고, 미처리 대조군과 비교된 처리된 객체의 효능 백분율은 감염 백분율에 기초하여 계산하였다. 가장 어린 잎 (잎 1)은 처리된 및 미처리 대조군에서 감염되지 않았다. 그러므로, 잎 4 - 3 및 2를 갈색 녹병에 대해 스코어링하였다. AFP-6-처리된 식물을 미처리 대조군과 비교하여, 잎 2는 100% 적게 감염되었고, 잎 3은 32% 적게 감염되었다. 가장 오래된 잎 (4)은 27% 더 보호되었다. 이는 0.07g/톤 효소 AFP-6으로 코팅된 품종 케이툼에서 모든 잎에 대해 평균 31%의 효능이었다 (도 5A 참조). 훨씬 더 높은 농도를 사용하였음에도 불구하고 디펜드 엑스트라로 코팅된 종자에 대해 보호가 전혀 관찰되지 않거나 약간만 관찰되었다 (도 5B 참조).
이들 결과는 AFP-6을 사용한 종자 처리가 푸시니아 트리티시나의 진균 감염으로부터 식물을 보호하였으며, AFP-6에 의한 보호가 상업적으로 이용가능한 종자 처리 디펜드 엑스트라에 의한 보호보다 훨씬 우수하다는 것을 보여주었다. AFP-6을 사용한 종자 처리에 의해 보호가 달성되었고 (즉, 간접 살진균제 적용에 의해), 사용된 AFP-6 농도가 매우 낮았고, 어린 잎이 오래된 잎보다 더 잘 보호되었기 때문에, 이들 결과는 효소 AFP-6이 테스트된 두 밀 품종 모두에 대해 식물 면역을 유도함으로써 보호 효과 ("간접 살진균제적 효과")를 발휘하였음을 시사하였다.
실시예 6
식물을 표준 화학적 처리에 추가하여 AFP-6으로 처리할 때 효소 AFP-6이 잎 질환에 대한 식물 보호를 더욱 개선할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 2개의 추가 시험을 수행하였다. 이들 시험은 실제 현장 환경에서 수행하였으며, 여기서 농부들은 화학적 종자 처리 (디펜드 엑스트라, 25 g/l 디페코나졸 및 25 g/l 플루디옥시닐, 2 l/톤 농도)로 밀을 처리하였고, 적어도 2개의 엽면 처리는 계절에 따라 화학물질로 수행하였다: T1 = BBCH 32 및 T2 = BBCH 39. T1 프로텐도의 경우, 프로티오코나졸 300 g/l EC (400 ml/ha) 및 T2 벨로지 에라의 경우 EC 75 g/l 벤조빈디플루피르 + 150 g/l 프로티오코나졸 (1000 ml/ha)을 사용하였다.
이전 실험은 효소 AFP-6이 식물 면역을 유도함으로써 보호 효과를 발휘하였음을 시사하였기 때문에, 두 시험 모두에서 효소 AFP-6을 식물이 진균 병원체에 의해 감염되기 전인 계절에 가능한 한 빨리 첨가하였다. 시험은 400개 종자/㎡로 천공되었다. 하나의 플롯은 24 ㎡였으며, 모든 객체는 4회 반복을 가졌다. 모든 플롯에서, 4개의 식물을 곡물의 엽면 및 이삭 질환에 대한 EPPO 가이드라인 PP(1)/026(4)에 따라 평가하였다. 잎 질환의 백분율 감염은 식물의 상부 잎 3개에 대해 스코어링되었다. 결과: 애보트. 16개 식물의 평균 백분율 감염을 계산하였다 (4개 식물/플롯). 해충 중증도의 효능 백분율은 디펜드 엑스트라를 사용한 화학적 코팅된 객체 (하기 기재된 바와 같은 제1 시험의 경우) 또는 T0 처리 없는 객체 (하기 기재된 바와 같은 제2 시험의 경우)의 함수로 계산되었다.
제1 시험에서, 효소 AFP-6을 종자 처리로서 0.07 g/톤의 농도로 사용하였다. 이 시험에서 품종은 케이툼이었다. 대조군을 2 l/톤 농도의 화학적 종자 처리 디펜드 엑스트라 (25 g/l 디페코나졸 및 25 g/l 플루디옥시닐)로 코팅하였다. 종자를 상기 실시예 5에 대해 기재된 바와 같이 Satec ML2000, 8 l/톤 코팅기에서 코팅하였다. 종자 1 톤당 8% (v/v) PVOH를 포함하는 8 l의 물 (즉, 7.36 l 물 + 640 ml PVOH) 중 0.07 g의 AFP-6 (프라우호퍼-게젤샤프트 생산)을 사용하여 효소 코팅을 수행하였다. 그러므로, 코팅 후 효소의 최종 농도는 0.07 g/톤 종자였다. 폴리비닐 알코올은 상업용 종자 처리에 사용되는 표준 스티커이다. 파종 후 169일에 잎 질환을 평가하고, 화학적 디펜드 엑스트라로 코팅된 객체와 비교하였다.
제2 시험에서, BBCH 32 이전에 AFP-6을 사용한 조기 처리 (즉, BBCH 30에서 "T0" 처리)가 잎 질환에 대한 식물 보호를 더욱 개선할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이 시험에서는 품종 라그나(Ragnar)를 사용하였다. 종자는 디펜드 엑스트라를 사용한 화학적 종자 처리를 가졌다. 식물에 1 l/ha를 사용하여 물 제형 중 0.07 g/l AFP-6의 농도로 분무하였다. 엽면 처리는 BBCH 30에서 수행되었다. 식물을 T0 처리 후 13일에 잎 질환에 대해 평가하고, T0 처리 없는 객체와 비교하였다.
두 시험 모두 동일한 날에 평가되었다. 오직 잎 3만이 잎 질환-유발 진균 셉토리아 트리티시로 감염된 것으로 나타났다. 두 시험 모두에서, 효소 AFP-6이 식물 보호를 개선한 것으로 관찰되었다. 품종 케이툼에서 0.07 g/톤 종자 농도의 종자 처리로서 (제1 시험), 효소 AFP-6의 효능은 화학적 종자 처리 디펜드 엑스트라와 비교하여 24%였다. 품종 라그나 (제2 시험)에서, BBCH 30의 T0 처리는 T0 처리 없음과 비교하여 25%의 효능을 보여주었다. 낮은 농도의 AFP-6으로 수득된 이들 결과는 AFP-6이 식물 면역을 유도함으로써 보호 효과를 발휘한다는 것을 확인한다.
실시예 7
AFP-6 및 Vaffr-2d가 식물 면역을 유도함으로써 보호 효과를 발휘하는지 확인하기 위해 추가 시험을 수행하였다. 이와 관련하여, 식물이 노출되는 스트레스의 종류에 따라 상이한 식물 면역 경로가 촉발될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다:
식물 호르몬인 자스몬산 및 살리실산은 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 식물 방어의 조절제로서 중요한 역할을 한다. 활물기생 병원체에 대한 식물 면역에 대한 효과는 살리실산에 따라 달라진다. 사물기생 병원체의 경우, 자스몬산이 더 중요하다 (Glazebrook, 2005: "Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens"; Annual review of phytopathology, 43, 205; doi: doi. 10.1146/annurev.phyto.43.040204.135923). 또한, 상이한 유형의 비생물적 스트레스는 식물에서 상이한 경로를 촉발할 것이다 (Peleg, 2011: "Hormone balance and abiotic stress tolerance in crop plants"; Current opinion in plant biology, 14(3), 290-295; doi: https://doi.org/10.1016/j.pbi.2011.02.001).
따라서, 하기 시험에서는 AFP-6 및 Vaffr-2d가 식물 면역에 대한 효과를 가진다는 것을 증명하기 위해 4개의 상이한 유전자, 즉 LOX, OPR3, PR1-3 및 PR1-17 유전자를 선택하였다. LOX 및 OPR3 유전자는 자스몬산 경로를 활성화시키기 위해 상향조절된다 (Chini, 2018: "An OPR3-independent pathway uses 4, 5-didehydrojasmonate for jasmonate synthesis"; Nature chemical biology, 14(2), 171-178; doi: https://doi.org/10.1038/nchembio.2540) (Leon, 1999: "Molecular biology of jasmonic acid biosynthesis in plants"; Plant physiology and Biochemistry, 37(5), 373-380; doi: https://doi.org/10.1016/S0981-9428(99)80043-6). 상기 나타낸 바와 같이, 자스몬산은 사물기생 병원체에 대한 식물 면역을 조절하는 중요한 식물 호르몬이다. PR1-3 및 PR1-17은 식물이 활물기생 병원체로부터 자신을 방어하기 위해 생산하는 PR 단백질이다. 이들 화합물의 생산은 식물 호르몬 살리실산과 연결되어 있다 (Van Loon, 1999: "The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins"; Physiological and molecular plant pathology, 55(2), 85-97; doi: https://doi.org/10.1006/pmpp.1999.0213).
AFP-6
AFP-6의 식물 면역 유도 잠재성을 조사하기 위해 실험실 시험을 수행하였다. 종자를 상기 실시예 5에 개괄된 단계에 따라 밀 (품종 캄신(chamsin))에 2개 농도의 AFP-6을 사용하여 Satec ML2000, 8 l/톤 코팅기에서 코팅하였다. 종자 1 톤당 8% (v/v) PVOH를 포함하는 8 l의 물 (즉, 7.36 l 물 + 640 ml PVOH) 중 0.1 g 또는 0.175 g의 AFP-6 (프라우호퍼-게젤샤프트 생산)을 사용하여 코팅을 수행하였다. 그러므로, 코팅 후 효소의 최종 농도는 0.1 g/톤 및 0.175 g/톤 종자였다. PVOH는 상업용 종자 처리에 사용되는 표준 스티커이다. 미처리 대조군은 물 및 8% PVOH로 코팅되었다. 5개의 종자를 페트리 접시의 촉촉한 여과지 위에 배치하였다. 종자를 12시간 명/12시간 암 조건에서 20℃의 인큐베이터에서 발아시켰다. 각 객체에 대해, 3회 반복이 수행되었으며 이는 각 샘플링 시점에 대해 수행되었다. 묘목 샘플을 여과지에 '파종' 후 상이한 시점 (4 - 7 - 9 및 14일)에 채취하였다.
TRI 시약 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 식물 조직으로부터 총 mRNA를 단리하였다. NanoDrop 방법 (ND-1000 분광광도계, 써모 사이언티픽, USA)을 사용하여 총 RNA 농도를 정량화하였다. 전사자 제1-가닥 cDNA 합성 키트 (로슈)의 지침에 따라 고정된 올리고(dT)18 프라이머 및 육량체 프라이머를 사용하여 각 샘플의 1 mg의 RNA로부터 cDNA를 생성하였다. 관심 유전자를 표적화하는 프라이머와 함께 SYBR Green I (Eurogentec, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 위한 qPCR Mastermix Plus를 사용하여 StepOnePlusTM PCR 기계 (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), UK)에서 qRT-PCR을 수행하였다. 다양한 샘플로부터의 전사체의 발현 수준을 표준화된 참조 유전자 액틴 및 유비퀴틴으로 정규화하고, 2- ΔCt 방법을 사용하여 PCR 데이터를 분석하였다.
결과는 도 6에 나타내었다. 이들 결과는 AFP-6이 자스몬산 경로 (LOX & OPR3; 각각 도 6A 및 도 6B 참조) 및 살리실산 경로 (PR1-3 & PR1-17; 각각 도 6C 및 도 6D 참조)를 모두 상향조절한다는 것을 보여준다. 이는 AFP-6이 사물기생 및 활물기생 병원체 (즉, 상이한 종류의 해충) 및 상이한 종류의 비생물적 스트레스에 대해 식물 면역을 프라이밍한다는 것을 의미한다.
Vaffr-2d
Vaffr-2d의 식물 면역 유도 잠재성을 조사하기 위해 온실 시험을 수행하였다. 종자를 상기 실시예 5에 개괄된 단계에 따라 밀 (품종 캄신)에 1개 농도의 Vaffr-2d를 사용하여 Satec ML2000, 8 l/톤 코팅기에서 코팅하였다. 종자 1 톤당 8% (v/v) PVOH를 포함하는 8 l의 물 (즉, 7.36 l 물 + 640 ml PVOH) 중 0.175 g의 Vaffr-2d를 사용하여 코팅을 수행하였다. 그러므로, 코팅 후 효소의 최종 농도는 0.175 g/톤 종자였다. PVOH는 상업용 종자 처리에 사용되는 표준 스티커이다. 미처리 대조군은 물 및 8% PVOH로 코팅되었다. 화분당 40개의 종자를 화분용 토양에 파종하였고, 4개의 화분을 사용하였다. 파종 후 상이한 시점 (6 - 7 - 8 및 11일)에 식물 샘플을 채취하였다. 상기 AFP-6에 대해 기재된 바와 같이 mRNA 추출 및 qRT-PCR을 수행하였다. AFP-6 시험에서와 동일한 유전자가 선택되었다.
결과는 도 7에 나타내었다. 이들 결과는 Vaffr-2d가 또한 자스몬산 경로 및 살리실산 경로 모두의 상향조절을 나타낸다는 것을 보여준다. 이들 결과는 Vaffr-2d를 예를 들어 예방적 처리로서 사용함으로써 다양한 생물적 및 비생물적 스트레스에 대해 식물 면역을 프라이밍할 수 있다는 것을 보여준다.
본원에 기재된 항-서리 단백질, 및 특히 식물 보호에서의 이의 용도, 뿐만 아니라 본원에 기재된 관련 생성물 및 용도는 예를 들어 상업용 식물 보호제, 예를 들어 농업에 사용하기 위한 식물 보호제에 적용될 수 있다. 그러므로 본 개시내용은 산업상 이용가능하다.

Claims (27)

  1. 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물로서, 항-서리 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 제1 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 제1 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-서리 단백질이 서열식별번호: 1-2의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 100% 동일한 제1 아미노산 서열로 이루어지는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 보호제인 조성물.
  7. 식물 보호제로서 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물의 용도.
  8. 제7항에 있어서, 조성물이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 것인 조성물의 용도.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 비생물적 스트레스 및/또는 해충에 대한 식물 보호제로서 조성물의 용도.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 보호제가 비생물적 스트레스에 대한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 서리 스트레스 또는 가뭄 스트레스인 조성물의 용도.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 보호제가 비생물적 스트레스에 대한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 서리 스트레스인 조성물의 용도.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 보호제가 비생물적 스트레스에 대한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 가뭄 스트레스인 조성물의 용도.
  13. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 보호제가 해충에 대한 것이고, 여기서 해충이 임의로 키틴을 함유하는 유기체, 예컨대 진균 또는 곤충인 조성물의 용도.
  14. 제7항 내지 제9항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 보호제가 해충에 대한 것이고, 여기서 해충이 진균인 조성물의 용도.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 진균이 푸사리움(Fusarium) 또는 셉토리아(Septoria) 종인 조성물의 용도.
  16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 경작가능한 작물, 열매 맺는 식물 또는 채소인 용도.
  17. 식물 또는 식물 부분에 적어도 하나의 항-서리 단백질을 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 비생물적 스트레스 및/또는 해충으로부터 식물을 보호하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 조성물이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 것인, 식물을 보호하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 식물 또는 식물 부분이 조성물에 침지되는 것인, 식물을 보호하는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 식물 또는 식물 부분, 예컨대 종자, 예를 들어 코팅된 종자의 표면에 분무에 의해 적용되는 것인, 식물을 보호하는 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 서리 스트레스 또는 가뭄 스트레스인 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 서리 스트레스인 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위한 것이고, 여기서 비생물적 스트레스가 임의로 가뭄 스트레스인 방법.
  24. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 해충이 키틴을 함유하는 유기체, 예컨대 진균 또는 곤충인 방법.
  25. 제17항 내지 제20항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 해충이 진균인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 진균이 푸사리움 또는 셉토리아 종인 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 경작가능한 작물, 열매 맺는 식물 또는 채소인 방법.
KR1020247001642A 2021-06-15 2022-06-15 항-서리 단백질-기반 식물 보호제 KR20240024185A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21179554.7 2021-06-15
EP21179554 2021-06-15
PCT/EP2022/066416 WO2022263568A1 (en) 2021-06-15 2022-06-15 Anti-frost protein-based plant protection agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240024185A true KR20240024185A (ko) 2024-02-23

Family

ID=76483123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247001642A KR20240024185A (ko) 2021-06-15 2022-06-15 항-서리 단백질-기반 식물 보호제

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20240260586A1 (ko)
EP (1) EP4355082A1 (ko)
JP (1) JP2024523901A (ko)
KR (1) KR20240024185A (ko)
CN (1) CN117715513A (ko)
AU (1) AU2022292907A1 (ko)
BR (1) BR112023026169A2 (ko)
CA (1) CA3223155A1 (ko)
CL (1) CL2023003740A1 (ko)
MX (1) MX2023015332A (ko)
WO (1) WO2022263568A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0843010A1 (en) * 1996-11-19 1998-05-20 Unilever Plc Carrot anti-freeze polypeptides
EP1463811A2 (en) * 2001-01-17 2004-10-06 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Chitinases, derived from carnivorous plants polynucleotide sequences encoding thereof, and methods of isolating and using same
US20040121442A1 (en) * 2002-05-05 2004-06-24 Ilan Chet Fungal chitinase, polynucleotide sequences encoding same, promoters of same, and uses thereof
WO2014202089A2 (en) * 2013-06-18 2014-12-24 Roskilde Universitet Variants of anti-freeze polypeptides
WO2015095349A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Yale University Anti-infective properties of antifreeze protein

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022292907A1 (en) 2024-01-18
CL2023003740A1 (es) 2024-08-23
US20240260586A1 (en) 2024-08-08
CN117715513A (zh) 2024-03-15
CA3223155A1 (en) 2022-12-22
EP4355082A1 (en) 2024-04-24
MX2023015332A (es) 2024-03-22
BR112023026169A2 (pt) 2024-03-05
WO2022263568A1 (en) 2022-12-22
JP2024523901A (ja) 2024-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Katiyar et al. Chitosan as a promising natural compound to enhance potential physiological responses in plant: a review
O’Sullivan et al. Tackling control of a cosmopolitan phytopathogen: Sclerotinia
Keymanesh et al. Application of antimicrobial peptides in agriculture and food industry
Kutuzova et al. Resistance of helminthosporium solanistrains to selected fungicides applied for tuber treatment
Beatrice et al. Enhancement of PR1 and PR5 gene expressions by chitosan treatment in kiwifruit plants inoculated with Pseudomonas syringae pv. actinidiae
Khan et al. Fungal bioinoculants for plant disease management
El-Ghaouth et al. Biologically-based technologies for the control of postharvest diseases.
De Vleesschauwer et al. Differential effectiveness of Serratia plymuthica IC1270-induced systemic resistance against hemibiotrophic and necrotrophic leaf pathogens in rice
WO2005112638A1 (ja) 植物または微生物への希少糖の使用
CN107002091A (zh) 过敏反应激发子肽及其用途
Kolomiiets et al. Biotechnological control methods against phytopathogenic bacteria in tomatoes.
AU2015283359B2 (en) Method for prophylaxis of infections in crops and ornamentals, preferably in viticulture, and in woody plants
Zaidi et al. Trichoderma in plant health management.
El-Garhy et al. Field application of safe chemical elicitors induced the expression of some resistance genes against grey mold and cottony rot diseases during snap bean pods storage
Pandey et al. Physiological and molecular signalling involved in disease management through Trichoderma: An effective biocontrol paradigm
Baccelli et al. Water-soluble Trichogin GA IV-derived peptaibols protect tomato plants from Botrytis cinerea infection with limited impact on plant defenses
Taye et al. Biocontrol agents against post harvest decay in fruits and vegetables: A review
Algam et al. Evaluation of chitosan efficacy on tomato growth and control of early blight disease
Goel et al. Anti-phytopathogenic and SAR inducing properties of Neem: a review
US20240260586A1 (en) Anti-frost protein-based plant protection agents
Venkatesan et al. Effect of biocontrol agent, plant extracts and safe chemicals in suppression of mungbean yellow mosaic virus (MYMV) in black gram (Vigna mungo)
Taylor Control of soil borne potato pathogens using Brassica spp. mediated biofumigation
Sokea et al. Micro-pathogen elicitor Hrip1 protein isolated from Alternaria tenuissima induced disease resistance against Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) in tomato (Solanum lycopersicum)
Narayan et al. Plant pathogenesis and disease control
Ramírez-Arrebato et al. Chitosan Protection From Rice Diseases