FI85286C - Koeldbestaendighet foerbaettrande rekombinant- dna-molekyler. - Google Patents
Koeldbestaendighet foerbaettrande rekombinant- dna-molekyler. Download PDFInfo
- Publication number
- FI85286C FI85286C FI895614A FI895614A FI85286C FI 85286 C FI85286 C FI 85286C FI 895614 A FI895614 A FI 895614A FI 895614 A FI895614 A FI 895614A FI 85286 C FI85286 C FI 85286C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- recombinant dna
- protein
- cold
- dna molecule
- gene
- Prior art date
Links
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 11
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 31
- 101150093335 KIN1 gene Proteins 0.000 description 20
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 10
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 9
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 6
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002595 cold damage Effects 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1 85286
Kylmänkestävyyttä parantavat rekombinantti-DNA-molekyyllt
Esillä oleva keksintö koskee uutta kylmältä suojaavaa gee-5 niä, joka on eristetty kasvista Arabidopsis thallana L..
Kasvien kylmänkestävyydestä on olemassa paljon biokemiallista ja fysiologista tietoa, mutta siitä huolimatta ei vielä täysin ymmärretä, mitä kasville todella tapahtuu kyl-10 mässä. Esimerkiksi sitä, minkä takia jotkin kasvit kestävät jäätymistä ja toiset eivät, ei tiedetä tai sitä, mikä on pääasiallisin syy kylmävaurioihin. Mikäli kasvien kylmänkestävyyttä kyettäisiin parantamaan, saavutettaisiin maapallon kylmillä alueilla huomattavia etuja maanviljelyksessä.
15
Kasvin kylmänkestävyys ei ole pysyvä tila, vaan kehittyy altistettaessa kasvi alhaisille, jäätymispisteen yläpuolella oleville lämpötiloille (= akklimaatio). Vaikkakin mRNA:ssa ja polypeptidiprofiileissa on havaittu useita kylmäakklimaa-20 tiolle spesifisiä muutoksia, hyvin vähän tiedetään näiden kylmäindusoituvien proteiinien toiminnasta tai näitä muutoksia säätelevistä mekanismeista. Tähän mennessä ei akklimaa-tiospesifisiä geenejä ole eristetty.
25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on siten eristää kylmänkestävyyttä edistävä geeni, joka voidaan siirtää geenitekniikan menetelmin johonkin hyötykasviin ja indusoida geeni tuottamaan proteiinia, joka parantaa kasvin vastustuskykyä kylmyyttä vastaan.
30
Lisätietojen saamiseksi kasvien kylmänkestävyysprosessin geneettisestä ja molekulaarisesta perustasta tutkittiin esillä olevan keksinnön yhteydessä kylmäakklimaatiospesifi-siä geenejä Arabidopsis thalianasta. Havaittiin, että Arabi-35 dopsis on kylmää kestävä ja että tämä kylmänkestävyys on yhteydessä useisiin muutoksiin geeniekspressiotasolla.
2 85286
Esillä oleva keksintö koskee uutta geeniä, joka eristettiin kasvista Arabidopsls thaliana L.. Yksityiskohtaisemmin, esillä oleva keksintö koskee DNA-molekyyliä, joka käsittää rakennegeenin, joka koodaa kylmänkestävyyttä edistävää 5 proteiinia, tai proteiinia, jolla on samanlaiset biologiset ominaisuudet ja joka on oleellisesti homologinen mainitun proteiinin kanssa, sekä sen säätelyalueen, joka reagoi lämpötilan laskuun. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
10
Geenin, kinl, havaittiin indusoituvan +4°C:ssa kuudessa tunnissa ja toimivan niin kauan kuin kasvia pidetään kylmässä ja menevän pois päältä 12 h:ssa, kun kasvi siirretään takaisin kontrollilämpötilaan. Geeni indusoituu myös vesi-15 ja suolastressillä sekä abskisiinihapolla (ΑΒΑ). ABA on kasvihormoni, joka toimii välittäjänä erilaisissa kasvin stressitilanteissa ja sen on osoitettu ottavan osaa myös kasvien kylmäakklimaatioon. ABA:n (50 μΜ) on havaittu nostavan induktiotason yhtä korkealle kuin kylmä.
20
Geenikirjasto rakennettiin λ EMBL3:een ja kylmällä indusoituvat geenit identifioitiin differentiaalihybridisaation avulla. Yksi geeni, se, joka selvimmin indusoitui, valittiin lisäkarakterisointiin. Genomista kloonia käytettiin koetti-25 mena vastaavan cDNA-kloonin löytämiseksi rikastetusta kirjastosta, joka oli rakennettu plasmidiin pUEXl. Molemmat kloonit sekventoitiin, transkription aloituskohta määritettiin "primer extension" -menetelmällä, ja polyadenylaatio-kohta cDNA-sekvensseistä. Genomisen kloonin nukleotidijär-30 jestys on esitetty kuviossa 1. Geenin oletettu säätelyalue on alleviivattu alkaen emäsparista 720 ja päättyen emäspa-riin 2132. Tämän emäsparin jälkeen alkaa DNA-molekyylin varsinainen rakennegeeni. cDNA-sekvenssi ja sitä vastaava aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 2 alleviivattu-35 na.
cDNA-sekvenssin pisin avoin luku jakso (ORF =* open reading frame), alkaen ensimmäisestä ATGrstä alavirtaan transkripti- 3 85286 on aloituskohdasta koodaa 65 aminohapon pituista proteiinia, jonka ennustettu molekyylimassa on 6478 ja isoelektrinen piste 7,2. Proteiinin aminohappojärjestys on esitetty kuviossa 3. Hybridiselektiokokeet osoittivat, että cinl-klooni 5 hybridisoituu mRNArhin, jotka koodaavat samankokoista poly-peptidiä. Proteiini on melko hydrofiilinen ja sillä on paljon α-helikaalista rakennetta. Sen aminohappokoostumus on melko epätavallinen: 22,4 % Ala, 13,4 % Gly ja 13,4 %
Ser. Geeni sisältää 62 ja 117 nukleotidin 5' ja 3' transla-10 toitumattomat alueet, vastaavasti, ja kaksi intronia.
Seuraavassa keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisemmin.
1) Kylmäindusoituvan geenin eristäminen Arabidopsis thaliana 15 -kasvin genomisesta kirjastosta
Genomista kirjastoa varten Arabidopsis thaliana -kasvin totaali-DNA pilkottiin partiaalisesti Sau3a-restriktioent-syymillä ja eristettiin agaroosigeelistä 15-20 kb:n pituiset fragmentit. Fragmentit ligoitiin EMBL3-vektorin BamHl-ent- 20 syymillä katkaistuihin käsivarsiin, ja ligaatioseos in vitro -pakattiin -partikkeleiden sisään sinänsä tunnettua menetelmää käyttäen (Maniatis et ai., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982 ). -partikkeleilla infektoi-25 tiin E.coli-isäntä, ja kylmäindusoituvan geenin sisältävät rekombinanttifaagit etsittiin ns. differentiaalihybridisaa-tion avulla (faagit muodostivat maljalle plakkeja, joista DNA siirrettiin Maniatiksen et ai. mukaisesti hybridisaa-tiossa käytettäville filttereille). Differentiaalihybri-30 disaatiossa koettimina käytettiin kontrollikasveista eristetystä RNA:sta tehtyä cDNA:ta. Jatkoon valittiin rekombinant-ti, joka antoi hybridisaatiossa signaalin kylmä-cDNA:11a, muttei kontrolli-cDNA:11a. Geenin sisältämä fragmentti siirrettiin -vektorista pUCl8-vektoriin, ja geenin tarkempi 35 sijainti fragmentissa määritettiin differentiaalihybridisaa-tion avulla. 4369 kb:n pituinen fragmentti sekventoitiin.
2) cDNA:n valmistaminen
Genomista kloonia vastaava cDNA pyydystettiin kylmä-RNA:sta 40 tehdystä cDNA-kirjastosta. cDNA:n synteesi lähetti-RNA:sta 4 85286 ja kloonaus pUEXl-vektoriin tehtiin käyttämällä Amershamin kittejä (RPN 1256 ja RPN 1282). Koettimena hybridisoinnissa käytettiin genomista kloonia. cDNA sekvensoitiin (kuvio 2).
5 3) DNA:n "Southern blotting"-analyysi "Southern blotting"-analyysi suoritettiin Maniatiksen et ai.
(1982) menetelmän mukaan. Genomisen "Southern blotting"-kokeen tulokset ja ristiinhybridisoituvien cDNA-kloonien sekvenssianalyysi osoittaa, että geeni esiintyy kahtena 10 kopiona Arabidopsiksen genomissa.
4) RNA:n "Northern blotting"-analyysi kinl-geenin kylmäindusoituvuus osoitettiin "Northern blotting" -analyysiä käyttäen. "Northern blotting"-analyysi 15 suoritettiin Maniatiksen et ai. (1982) menetelmän mukaan.
"Northern blotting"-menetelmää käytettiin analysoimaan kinl mRNA:n "steady-state"-tasoja akklimaation aikana. Kontrolli-kasveista ja kylmässä pidetyistä kasveista eristettiin totaali-RNA menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Jones 20 et ai., High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants, EMBO J. 4, s. 2411-2418. Totaali-RNA analysoitiin tarkoin Maniatiksen et ai., 1982, menetelmän mukaan. Tulokset on esitetty kuviossa 4. Kuvasta näkyy, että kylmässä kinl-geeniä vastaavaa RNA:ta on so-25 luissa n. 15-20 kertaa enemmän kuin kontrollilämpötilassa +22°C, mikä tarkoittaa, että geeni indusoituu kylmässä.
kinl mRNA oli detektoitavissa 6 tuntia kylmään siirtämisen jälkeen ja taso pysyi korkeana koko akklimaatiovaiheen aika-30 na, joka kesti 7 päivää. Induktion havaittiin olevan kylmä-spesifinen eli kun kasvit siirrettiin takaisin kontrolli-lämpötilaan, kinl mRNA:n määrä putosi 12 tunnissa.
5) Kylmägeenin induktio-ominaisuuksien tutkiminen 35 a) Abskisiinihappo (ABA)
Koska ulkopuolinen abskisiinihapon (ABA) lisääminen indusoi kylmäresistenssiä useissa kasvilajeissa, jotka ovat kylmän-kestäviä, ja tänä aikana on havaittu endogeenisten ABA- 5 85286 tasojen kasvua, tutkittiin reagoiko kinl-geeni ABA:aan.
Koe suoritettiin kuten kohdassa 4 käyttämällä "Northern 0 blotting"-analyysiä. Koettimena käytettiin kinl-cDNA;ta. Kuviossa 5 on esitetty tulokset ABA:n (10 mM ja 100 mM) 5 vaikutuksesta kinl-geenin ilmentymiseen. Havaittiin, että sekä Arabidopsiksen suihkuttaminen 100 μΜ ΑΒΑ:11a että kastelemalla sitä 10 μΜ ΑΒΑ:11a sai aikaan kinl-geenin indusoitumisen. Ensimmäistä kertaa havaittiin suoria moleku-laarisia todisteita ABA:n roolista kylmäakklimaatiossa.
10 b) Vesistressi
Tutkittiin, indusoituuko kinl-geeni vesistressillä. Tavallista tälle stressille on solun vesipotentiaalin aleneminen. On näytetty toteen, että kuihtuminen aiheuttaa pinaa-15 tinlehdille samanlaisia vaurioita kuin jäätymisestä johtuva dehydraatio. On myöskin ajateltu, että kestävyys jäätymistä vastaan johtuu jäätymisen aiheuttaman dehydraation välttämisestä tai kestämisestä. Dehydraatio johtuu siitä, että solujen väliseen tilaan muodostuva jää "imee" veden solun 20 sisästä. On todettu lisäksi, että kylmänkestävyys voidaan indusoida kasveissa pelkällä kuivastressillä ilman altistamista alhaisille lämpötiloille. Kun kasvit altistettiin eri asteiselle kuivuudelle, havaittiin, että kuihtuminen todellakin indusoi kinl-geeniä.
25 c) Suolastressi
Korkea ulkoinen suolapitoisuus johtaa veden poistumiseen solusta seurauksena dehydraatio. Tutkittiin, indusoituuko kinl-geeni suolastressillä (300 mM NaCl). "Northern blot-30 ting" -analyysin tulos osoittaa, että kinl-geeni indusoituu myös suolastressillä (Kuvio 6).
6) Kasvissa toimivien DNA-konstruktioiden tekeminen ja siirto kasveihin 35 kinl-geenin toimintaa tutkittiin kylmäherkässä ei-akklimoi-tuvassa tupakassa (Nicotiana tabacum SRI) ja Arabldopsikses-sa kahden eri DNA-konstruktion avulla. Ensimmäinen konstruktio (p35S-sense-kinl) sisältää kinl-geenin cDNA oikeinpäin 6 85286 (ns. sense) vahvan aina toimivan kukkakaalimosaiikki-viruk-sen 35 S transkriptin säätelyalueen (p35S; Fromm M. et ai., 1985. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:5824-5828) ohjaamana. Tällä tavalla kinl-geenin vaikutus on lämpötilasta riippuma-5 ton kasvin kaikissa osissa sekä muissa kasvilajeissa toimiva. Toisessa konstruktiossa (p35S-antisense-kinl), kinl-geenin cDNA on väärinpäin (ns. antisense) p35S:n säätelemänä. Siirtämällä tämä konstruktio Arabidopsikseen, josta kinl on eristetty, voidaan eliminoida kinl-geenin vaikutus. 10 Näin selviää, onko kinl-geeni välttämätön Arabldopsiksen akklimaatiossa ja kylmänkestävyydessä.
a) p35S-sense-kinl pUEXl-cDNA-kloonin BamHI-BclI-fragmentti ligoitiin BamHI-15 digestoituun plasmidiin pHTT203. Tuloksena on plasmidi pSKHIOO (Kuvio 7), jossa kinl cDNA on oikeinpäin p35S-sääte-lyn alla ja jossa on selektoitavana markkerina käytettävä tunnettu neomysiinifosfotransferaasi 2 nopaliinisyntetaasi-geenin säätelyalueeseen fuusiota (pnos-npt2) varten sekä 20 tunnetut T-DNA:n reuna-alueet, joita tarvitaan DNA:n siirtoon kasviin.
b) p35S-antisense-kinl pUEXl-cDNA-kloonin Ncol-fragmentti ligoitiin BamHI-diges-25 toituun plasmidiin pHTT203. Tuloksena on plasmidi pSKH107 (Kuvio 8), jossa kinl cDNA on nurinpäin p35S-säätelyn alla ja jossa on selektoitavana markkerina käytettävä pnos-npt2-geeni sekä tunnetut T-DNA:n reuna-alueet.
30 p35S-sense-kinl-konstruktio siirrettiin tupakkaan ja p35S- antisense-kinl^-konstruktio Arabidopsis-kasveihin käyttäen tunnettua Agrobacterium-välitteistä siirtomenetelmää (Her-nalsteens J.P. et ai., 1980, Nature 287:654-656; Valvetens D. et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5536-5540). 35 7 85286 7) Kylmägeenin toiminnan tutkiminen a) Tupakassa
Tupakalla ei ole kinl-geeniä luonnostaan. Transgeenisissä kasveissa, joihin on siirretty konstruktio p35S-sense-kinl, 5 havaittiin, että siirretty rekombinanttigeeni on läsnä ja ilmentyy "Northern blot" -analyysillä (Kuvio 9). Kylmänkes-tävyyskokeessa tupakan lehtipalojen ionivuotoa mitataan lämpötilan funktiona tunnetulla menetelmällä (Sukumaran & Weiser, 1972, Hortscience 7:467-468). Kasvit katsotaan 10 kuolleiksi, kun 50 % ionivuoto tapahtuu. Havaittiin, että transgeenisellä tupakalla on noin 1,2 asteen verran suurempi kylmänkestävyys kuin kontrollikasvilla (Kuvio 10). Tämä osoittaa sen, että kinl-geeni siirrettynä kylmäherkkään kasviin parantaa kyseisen kasvin kylmänkestävyyttä.
15 b) Arabldopsiksessa p35S-antlsense-kinl-konstruktiot tutkittiin Arabidopsikses-sa. Transgeenisten kasvien kylmänkestävyyskoe (Kuvio 11) näyttää, että p35S-antisense-kinl-kasvien akklimaatiokyky 20 on alentunut merkittävästi. Nämä havainnot osoittavat sen, että kinl-geeni vaikuttaa Arabidopsiksen kylmänkestävyyteen ja on välttämätön sille.
8) Säätelyalueen tutkiminen 25 Genomisen kloonin säätelyaluetta sisältävä Hind3-BsmI-frag-mentti liitettiin glukuronidaasigeeniin (gusA; Jefferson R.A. et ai., 1987, J. EMBO 6:3901-3907) ja tämä fuusio siirrettiin tunnettuun vektoriin, joka sisältää selektoita-van markkerin puos-npt2 ja T-DNA:n reuna-alueet. Näin saatu 30 konstruktio pkinl-gusA plasmidissa pMEG3 (Kuvio 12) siirrettiin Agrobakteerin välityksellä tupakkaan.
Konstruktion läsnäolo tupakassa ja sen toimivuus tutkittiin määrittämällä tunnetulla menetelmällä gus-aktiivisuus.
- 35 Taulukosta 1 käy ilmi, että pkinl toimii säätelyalueena tupakassa ja että sen toiminta on suurempi alhaisessa lämpötilassa.
β 85286
Taulukko 1 A415nm
+22°C +4°C
kontrolli 0,01 0,01 5 pkinl-gusA 0,281 0,830
Claims (5)
1. Rekombinant-DNA-molekyl, kännetecknad av att den innefattar en strukturgen, som kodar ett protein, 30 och har bassekvens motsvarande baser 2136-3100 i figur 1, ooh dess regleringsomräde med bassekvens motsvarande baser 720-2132 i figur 1.
1. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää kylmänkestävyyttä edistävää proteiinia koodaavan rakennegeenin, jolla on emäsjärjestys, joka vastaa 5 emäksiä 2136-3100 kuviossa 1, ja sen säätelyalueen, jolla on emäsjärjestys, joka vastaa emäksiä 720-2132 kuviossa 1.
2. Rekombinant-DNA-molekyl enligt patentkrav 1, k ä n n e-35 tecknad av att strukturgenen kodar ett köldbestän- dighet förbättrande protein isolerat frän Arabldopsis thaliana L. —växt. 10 85286
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti-DNA-mole-kyyli, tunnettu siitä, että rakennegeeni koodaa
10 Arabldopsis thaliana L. -kasvista eristettyä kylmänkestävyyttä edistävää proteiinia.
3. Rekombinant-DNA-molekyl enligt patervtkravet 1 eller 2, kännetecknad av att den har i figur 1 beskriven bassekvens.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että sillä on kuviossa 15. esitetty emäsjärjestys.
4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen rekom-binantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että sen rakennegeeni koodaa proteiinia, jonka aminohapposekvenssi 20 on esitetty kuviossa 3, tai sille biologiselta aktiivisuudeltaan ekvivalenttia proteiinia, jolla on oleellisesti kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi. 5. cDNA-molekyyli, tunnettu siitä, että sillä on 25 emäsjärjestys, joka on esitetty alleviivattuna kuviossa 2.
4. Rekombinant-DNA-molekyl enligt nägot av patentkraven ovan, kännetecknad av att dess strukturgen kodar ett protein, vars aminosyrasekvens är beskriven i figur 3, eller ett med det till sin biologisk aktivitet ekvivalent protein, som har väsentligen en i figur 3 beskriven amino-10 syrasekvens.
5. cDNA-molekyl, kännetecknad av att den har en i figur 2 beskriven understreckad bassekvens.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI895614A FI85286C (fi) | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Koeldbestaendighet foerbaettrande rekombinant- dna-molekyler. |
| JP2515792A JPH04503013A (ja) | 1989-11-23 | 1990-11-23 | 改良された耐寒冷性ｄｎａ分子 |
| FI913157A FI913157A7 (fi) | 1989-11-23 | 1990-11-23 | Kylmänkestävyyttä parantavat DNA-molekyylit |
| PCT/FI1990/000284 WO1991008292A1 (en) | 1989-11-23 | 1990-11-23 | Dna molecules improving cold-resistance |
| EP90917004A EP0497892A1 (en) | 1989-11-23 | 1990-11-23 | Dna molecules improving cold-resistance |
| CA002044606A CA2044606A1 (en) | 1989-11-23 | 1990-11-23 | Dna molecules improving cold-resistance |
| NO912861A NO912861D0 (no) | 1989-11-23 | 1991-07-22 | Dna-molekyler som gir kulde-bestandighet. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI895614A FI85286C (fi) | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Koeldbestaendighet foerbaettrande rekombinant- dna-molekyler. |
| FI895614 | 1989-11-23 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI895614A0 FI895614A0 (fi) | 1989-11-23 |
| FI895614L FI895614L (fi) | 1991-05-24 |
| FI85286B FI85286B (fi) | 1991-12-13 |
| FI85286C true FI85286C (fi) | 1992-03-25 |
Family
ID=8529413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI895614A FI85286C (fi) | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Koeldbestaendighet foerbaettrande rekombinant- dna-molekyler. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0497892A1 (fi) |
| JP (1) | JPH04503013A (fi) |
| CA (1) | CA2044606A1 (fi) |
| FI (1) | FI85286C (fi) |
| WO (1) | WO1991008292A1 (fi) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837545A (en) * | 1993-01-21 | 1998-11-17 | Research Corporation Technologies, Inc. | Genes, polypeptides, and compositions for cold tolerance in plants |
| CA2146712C (en) * | 1995-04-10 | 2002-06-25 | Jas Singh | Cold induced promoter from winter brassica napus |
| EP0843010A1 (en) | 1996-11-19 | 1998-05-20 | Unilever Plc | Carrot anti-freeze polypeptides |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HUT55052A (en) * | 1988-03-24 | 1991-04-29 | Gen Hospital Corp | Process for producing artificial chromosome vector |
-
1989
- 1989-11-23 FI FI895614A patent/FI85286C/fi not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-11-23 JP JP2515792A patent/JPH04503013A/ja active Pending
- 1990-11-23 WO PCT/FI1990/000284 patent/WO1991008292A1/en not_active Ceased
- 1990-11-23 CA CA002044606A patent/CA2044606A1/en not_active Abandoned
- 1990-11-23 EP EP90917004A patent/EP0497892A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2044606A1 (en) | 1991-05-24 |
| JPH04503013A (ja) | 1992-06-04 |
| FI85286B (fi) | 1991-12-13 |
| EP0497892A1 (en) | 1992-08-12 |
| FI895614L (fi) | 1991-05-24 |
| FI895614A0 (fi) | 1989-11-23 |
| WO1991008292A1 (en) | 1991-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | A novel rice C2H2-type zinc finger protein lacking DLN-box/EAR-motif plays a role in salt tolerance | |
| Shinwari et al. | AnArabidopsisgene family encoding DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene expression | |
| Van der Zaal et al. | Promoters of auxin-induced genes from tobacco can lead to auxin-inducible and root tip-specific expression | |
| CA2319714C (en) | Plant having altered environmental stress tolerance | |
| Ellis et al. | Does the ocs‐element occur as a functional component of the promoters of plant genes? | |
| US8030472B2 (en) | Compositions and methods for the modification of gene expression | |
| CN116751809A (zh) | 耐盐相关的蛋白GmXTH32及其相关生物材料和应用 | |
| Taniguchi et al. | The promoter for the maize C4 pyruvate, orthophosphate dikinase gene directs cell-and tissue-specific transcription in transgenic maize plants | |
| Zhang et al. | Kiwifruit (Actinidia chinensis) R1R2R3-MYB transcription factor AcMYB3R enhances drought and salinity tolerance in Arabidopsis thaliana | |
| Velasco et al. | Gene structure and expression analysis of the drought-and abscisic acid-responsive CDeT11-24 gene family from the resurrection plant Craterostigma plantagineum Hochst | |
| Hu et al. | Functional roles of the birch BpRAV1 transcription factor in salt and osmotic stress response | |
| AU762816B2 (en) | Cyclin-dependent kinase inhibitors as plant growth regulators | |
| CN101679968B (zh) | 增强植物耐缺铁性的多肽及其应用 | |
| US7211711B2 (en) | Compositions and methods for the modification of gene expression | |
| ES2584320T3 (es) | Promotores preferidos del cámbium/xilema y usos de los mismos | |
| FI85286C (fi) | Koeldbestaendighet foerbaettrande rekombinant- dna-molekyler. | |
| Zhou et al. | CHB2, a member of the SWI3 gene family, is a global regulator in Arabidopsis | |
| CN111072762B (zh) | 一种毛竹衰老相关nap转录因子及其编码基因与应用 | |
| JPWO2004085641A1 (ja) | ストレス誘導性プロモーター及びその利用方法 | |
| WO2006006236A1 (en) | Regulation of environmental stress-tolerance in plants using modified dreb2a gene | |
| KR100360305B1 (ko) | 페튜니아에서얻어진전사인자펫에스피엘2의도입에따른개화의마디간격을단축하는방법 | |
| Fridlender et al. | Repression of the Ac‐transposase gene promoter by Ac transposase | |
| Lee et al. | Promoter activity of a soybean gene encoding a seed maturation protein, GmPM9 | |
| Neuteboom et al. | Interaction between the tobacco DNA‐binding activity CBF and the cyt‐1 promoter element of the Agrobacterium tumefaciens T‐DNA gene T‐CYT correlates with cyt‐1 directed gene expression in multiple tobacco tissue types | |
| JP2002524044A (ja) | 植物病耐性シグナル伝達遺伝子：それに関する材料及び方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: KEMIRA OY |