SK65799A3

SK65799A3 - Antifreeze polypeptides, isolated nucleic sequence being coding antifreeze polypeptide, method to obtain polypeptides and food product containing them

Info

Publication number: SK65799A3
Application number: SK657-99A
Authority: SK
Inventors: Louise J Byass; Charlotte J Doucet; Richard A Fenn; Andrew J Mcarthur; Christopher M Sidebottom; Margaret F Smallwood; Dawn Warrell
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2000-03-13
Also published as: EP0843010A1; CZ295597B6; CN1244895A; JP2000513578A; BR9713984A; PT941332E; TW349953B; ES2259807T3; TR199901695T2; IL129970A0; CZ177799A3; CN1191361C; DK0941332T3; AR013874A1; JP3474200B2; WO1998022591A3; US6797690B1; DE69735441T2; PA8441801A1; AU5550998A

Description

Polypeptidy s mrazuvzdornou aktivitou, izolovaná nukleotidová sekvencia kódujúca mrazuvzdorný polypeptid, spôsob získania polypeptidov a potravinový výrobok s ich obsahom

Oblasť techniky

Vynález sa týka m razu vzdorných polypeptidov (AFP), izolovanej nukleotidovej sekvencie kódujúcej mrazuvzdorný polypeptid, spôsobu získavania polypeptidov, potravinových výrobkov, ktoré obsahujú AFP a ich použitia na zvýšenie mrazovej tolerancie rastlín.

Doterajší stav techniky

Mrazuvzdorné polypeptidy (AFP) boli navrhnuté na zlepšenie mrazovej tolerancie potravín.

Na účel vynálezu má označenie AFP význam veľmi dobre známy v tejto oblasti a to označuje tie proteíny, ktoré inhibujú rast kryštálov ľadu. Napríklad US 5,118,792.

WO 90/13571 opisuje produkciu mrazuvzdorných peptidov chemicky alebo rekombinantnými DNA technikami z rastlín. Mrazuvzdorné polypeptidy môžu byť vhodne využité v potravinách ako je zmrzlina. Príklad 3D ukazuje modifikovaný tvar kryštálu ľadu v prípade ak je zmes voda - ľad zmrazená na film v kombinácii s 0,01 % hmotn. AFP.

WO 92/22581 opisuje AFP z rastlín, ktoré sa dajú využiť na kontrolu tvaru ľadových kryštálov v zmrzline. Tento dokument opisuje aj postup extrakcie polypeptidov z vnútrobunkových priestorov rastlín pomocou infiltrácie listov extrakčným médiom bez porušenia rastlinných buniek.

WO 94/03617 opisuje produkciu AFP z kvasiniek a ich možné použitie v zmrzline. WO 96/11586 opisuje rybie AFP produkované mikroorganizmami.

Doteraz sa však použitie AFP neaplikovalo do komerčne prístupných spotrebiteľských výrobkov. Jedným z dôvodov je ich vysoká cena a obtiažny postup ich získavania. Ďalším problémom sú zdroje AFP, ktoré sú buď ťažko dostupné

-2v požadovanom množstve (napr. ryby obsahujúce AFP), alebo nie sú priamo vhodné na použitie do potravinových výrobkov.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú mrazuvzdorné polypeptidy, ktorých výhodou je, že sa dajú ľahko získať z hojne sa vyskytujúceho prírodného zdroja a zaisťujú dobré vlastnosti výrobkov, v ktorých sú použité.

Bolo zistené, že mrazuvzdorné polypeptidy s dobrými rekryštalizačnoinhibičnými vlastnosťami je možné získať z mrkvy. Predovšetkým sa zistilo, že tieto mrazuvzdorné polypeptidy vykazujú výrazne lepšie vlastnosti v porovnaní s polypeptidmi, izolovanými z inej koreňovej zeleniny. Predovšetkým mrazuvzdorné polypeptidy tohto vynálezu sú schopné poskytovať dobré rekryštalizačno-inhibičné vlastnosti bez výraznej zmeny tvaru ľadových kryštálov, čím prípadne vedú k priaznivejším vlastnostiam, napr. jemná zmrzlina.

Zistilo sa, že molekulová hmotnosť efektívnych mrazuvzdorných polypeptidov je podľa SDS-PAGE zjavne 36 kD. Podľa prvého uskutočnenia sa vynález vzťahuje na mrazuvzdorné polypeptidy, ktoré sa dajú získať z mrkvy a ktorých viditeľná molekulová hmotnosť na SDS-PAGE je 36 kD.

V tejto súvislosti bude zrejmé odborníkom v tejto oblasti, že v dôsledku odchýlky napr. v SDS-PAGE sa dá viditeľná molekulová hmotnosť stanoviť len s určitou odchýlkou vo výsledku. Na účely vynálezu sú odchýlky napríklad od 30 do 40 kD, alebo od 34 do 38 kD tiež zahrnuté do označenia „viditeľná molekulová hmotnosť 36 kD.“

Zistilo sa tiež, že efektívne mrazuvzdorné polypeptidy podľa tohto vynálezu pozostávajú z fragmentov, ktorých aminokyselinová sekvencia je opísaná v príkladoch.

Podľa druhého uskutočnenia sa vynález vzťahuje na polypeptidy, skladajúce sa z jedného alebo viacerých fragmentov (A až E), ktorých aminokyselinová sekvencia je nasledovná:

(A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS (C) LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL-PRO-LEUPHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS (E) X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU-LYS

Vhodné AFP podľa tohto vynálezu pozostávajú zo všetkých čiastočných sekvencií (A až E).

Kompletná aminokyselinová sekvencia vhodného AFP podľa tohto vynálezu je opísaná nižšie. Takže v treťom uskutočnení sa vynález vzťahuje na mrazuvzdomý protein, ktorého aminokyselinová sekvencia je opísaná v zozname 1:

Zoznam 1

ATGAATATTGAATCATCTTTCTGCCCTATTTTGTGCATATGCATGATTTTCCTCTGCCTT

-—----+---------₊---------₊---------₊---------♦---------,— 72

MN'IESSFCPILCICHZFLCL

CCAAACCTCTCTGCATCACAAÄGATGCAACAACAACGACAAGCAAGCTTTACTCCAAATC

73-------+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊— 132

PN'LSASQRCNNNDKQALLQI

AAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCATTACAGACTCATGGGTGTCAGACGACGATTGTTGT

133-------♦---------+---------+---------*---------*---------+— 192

KTALKNPTITDSWVSDDDCC

GGTTGGGACCTAGTCGAATGTGACGAAACCAGCAACCGCATAATTTCCCTCATAATTCAA

193---------------------------.---------í----------í----------+— 252

GWDLVECDETSNRIISLIIQ

GACGACGAAGCTCTCACCGGCCAAATCCCACCTCAGGTGGGAGACCTACCATACCTCCAA

253 -------1---------+---------<·---------♦---------+---------+— 312

DDEALTGQIPPQVGDLPYLQ

GCCTTATGGTTCCGTAAACTCCCCAATCTTTTCGGAAAAATCCCAGAAGAAATTTCTGCA

313-------+---------+---------+---------+---------♦---------372

ALWFRKLPNLFGKIPEEISA

CTCAAAGACCTAAAATCCCTCAGACTCAGCTCGACCAGTCTCAGTGGCCCTGTCCCTTTA

LKDLKSLRLSSTSLSGPVPL TTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTTAACAAACTTTTGGGT

433 -------+-----------------------------*---------♦---------*— 492

FFPQLTKLTCLDLSFNKLLG

-4GTAATCCCTCCTCAGCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTGCACTTAGAACGTAAC

493 -----------------------------------------------*---------*— 552

VIPPQLSTLPNLKALHLERN

GAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGATCCCCGGACATATAT

553 -------+---------1----------+-------------------+---------*— 612

ELTGEIPDIFGNFAGSPDIY

CTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTGTTCCCAAAACTTTTGCTAGAGCAGATCCAATT

613-------+---------+---------*-------------------+---------+““ 6^2

LSHNQLTGFVPKTFARADPI

AGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTCTTGTTTGGGCCTAAA

573-------♦---------₊---------₊---------_----------+---------+— 732

RLDFSGNRLEGDISFLFGPK

AAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGCTTAGTTTCAATTTCTCCAGGGTG

733 -------+---------+---------+---------+---------+---------+— 192

KRLEMLDFSGNVLSFNFSRV

CAGGAGTTTCCACCCTCTTTGACATACTTAGACTTGAACCATAACCAGATCAGCGGAAGT

793 -------+---------+---------+---------+---------+---------+— 852

QEFPPSLTYLDLNHNQISGS

CTGTCGAGTGAATTGGCTAÄATTGGACCTGCAGACATTTAACGTCAGTGATAATAATCTC

853 -------+---------*---------*---------*---------*---------+— 912

LSSELAKLDLQTFNVSDNNL

TGCGGCAAGATTCCAACAGGGGGAAACCTCCAGAGATTCGACCGTACGGCCTATCTCCAC

913-------₊---------₊---------*---------+---------<---------<·— 972

CGKIPTGGNLQRFDRTAYLH

AACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAG

973-------+---------♦---------♦---------+- 1011

NSCLCGAPLPEC·

Do vynálezu sú zahrnuté aj izoformy a deriváty vyššie spomínaných polypeptidov, ktoré si stále udržujú mrazuvzdorné vlastnosti. Vhodné deriváty vykazujú najmenej 75% homológiu s polypeptidom v zozname 1, alebo polypeptidom pozostávajúcim z čiastočných sekvencii (A až E), vhodnejšie vykazujú viac ako 85% homológiu a najvhodnejšie vykazujú viac ako 95%

-5homológiu. Na účely vynálezu označenie derivát zahŕňa tiež modifikované polypeptidy, ktoré si stále udržujú mrazuvzdorné vlastnosti, napríklad glykozylované formy vyššie spomínaných polypeptidov.

Do vynálezu sú zahrnuté aj izolované nukleotidové sekvencie, kódujúce opísané aminokyseliny. Predovšetkým sa vynález vzťahuje na nukleotidovú sekvenciu zo zoznamu 1 a jej alely.

Do vynálezu sú zahrnuté aj nukleotidové fragmenty derivované z kódujúcej oblasti, ktoré sú schopné hybridizovať k príbuzným génom kódujúcim mrazuvzdorné peptidy.

Aj keď sa proteíny vynálezu dajú jednoducho priamo izolovať z mrkvy, na ich produkciu sa dajú použiť aj techniky genetických manipulácií.

Vhodné hostiteľské bunky alebo organizmy môžu byť transformované génovou konštrukciou, ktorá kóduje požadované polypeptidy. Nukleotidová sekvencia, kódujúca polypeptid môže byť vložená do vhodného expresného vektora, ktorý obsahuje nevyhnutné elementy na transkripciu a transláciu, čím umožňuje expresiu za vhodných podmienok (napr. pri správnej orientácii a správnom čítacom rámci a s vhodnými cieľovými a expresnými sekvenciami). Metódy potrebné na konštrukciu expresných vektorov sú dobre známe odborníkom v tejto oblasti.

Na expresiu sekvencii, kódujúcich polypeptid môže byť použitých niekoľko expresných systémov. Tieto zahŕňajú (ale nie sú na ne obmedzené) baktérie, kvasinky, bunkové systémy hmyzu, systémy rastlinných bunkových kultúr a rastliny, všetky transformované vhodnými expresnými vektormi. V tejto súvislosti sú výhodné kvasinky, rastliny a systémy rastlinných bunkových kultúr.

Mnoho druhov rastlín a rastlinných bunkových systémov je možné transformovať konštrukciami nukleových kyselín, ktoré kódujú polypeptidy. Medzi vhodné objekty transformácie by mohli byť zahrnuté kukurica, paradajky, tabak, mrkva, jahody, semená repky a cukrová repa.

Výhodný predmet tohto vynálezu súvisí s použitím AFP podľa vynálezu na zvýšenie mrazovej tolerancie rastlín. Tento prípad môže byť uskutočnený napríklad vyššie opísanou metódou, pri ktorej sú rastliny transformované za účelom zaistenia

-6(zvýšenia) produkcie AFP vynálezu, čoho následkom je zvýšenie mrazovej tolerancie spomínaných rastlín.

Vynález sa vzťahuje aj na protilátky, ktoré sa špecificky viažu na (epitop) polypeptidy vynálezu. Do vynálezu sú tiež zahrnuté polypeptidy, ktoré sú imunologický príbuzné polypeptidom na základe ich skríženej reakcie s protilátkou vytvorenou proti vyššie uvedeným polypeptidom.

Na základe predchádzajúcich informácií je možné na dosiahnutie výhodnej produkcie AFP, ako bolo opísané vyššie, geneticky modifikovať aj iné prírodné zdroje.

Výhodne sú vybrané tie AFP, ktoré majú významné rekryštalizačno inhibičné vlastnosti ľadu. Vhodný test na určenie rekryštalizačno inhibičných vlastností je uvedený v príklade 1. Vhodné AFP v súlade s vynálezom tiež zaisťujú, že veľkosť ľadových častíc v zamrznutých produktoch (stredná dĺžka kryštálu) počas rekryštalizácie je menšia ako 50 pm, vhodnejšia je od 5 do 40 pm.

AFP môžu byť bez obtiaží použité v rôznych potravinových výrobkoch, hlavne v potravinách, ktoré sú zmrazené alebo sú určené na zmrazenie. Mrkvy, ktoré obsahujú AFP v prirodzene sa vyskytujúcich hladinách, nie sú zahrnuté do rozsahu vynálezu. Avšak potravinové produkty, ktoré obsahujú (časti) mrkvy sú do rozsahu vynálezu zahrnuté. Zahrnuté sú aj mrkvy, ktoré boli transformované za účelom nadmernej expresie mrazuvzdorných proteínov, inými slovami, ktoré obsahujú AFP vo výrazne vyšších hladinách ako netransformované mrkvy.

Príkladmi takýchto potravinových produktov sú: mrazené potravinárske výrobky ako zelenina, omáčky, polievky, zákusky, mrazené cukrárenské výrobky ako zmrzlina alebo ľadová voda, mliekarenské produkty, atď.

Výhodnými výrobkami, v ktorých sa používajú AFP sú buď mrazená zelenina alebo mrazené cukrárenské výrobky ako zmrzlina alebo ľadová voda. Výhodná hladina AFP sa pohybuje od 0,00001 do 0,5 % hmotn. v závislosti od finálneho produktu.

Ak sú použité suché mixy alebo koncentráty, koncentrácia by zrejme mala byť vyššia, aby sa zaistila hladina mrazuvzdorných proteínov vo finálnom mrazenom produkte vo vyššie uvedenom rozmedzí. Prekvapivo sa zistilo, že komponenty

-7vynálezu môžu obsahovať veľmi malé množstvá AFP pričom si stále zachovávajú dobrú kvalitu.

Vhodné hladiny AFP sú od 0,00001 do 0,5 % hmotn., vhodnejšie od 0,00005 do 0,3 % hmotn. a najvhodnejšie od 0,0001 do 0,2 % hmotn..

Z hľadiska vynálezu nie je potrebné pridávať do potravinových produktov AFP v purifikovanej forme. Je možné pridať zmes obsahujúcu AFP, napr. extrakt prírodného materiálu, ktorý ich produkuje.

Tiež je možné modifikovať potravinový produkt tým spôsobom, že sú AFP produkované in situ. Napríklad pridaním geneticky modifikovaných mikroorganizmov, ktoré sú schopné produkovať AFP v potravinovom produkte, alebo len geneticky modifikujú potravinový produkt (napr. zeleninu) tak, že je schopný sám produkovať AFP in situ.

Označenie mrazené cukrárenské výrobky zahŕňa cukrovinky, obsahujúce mlieko ako sú zmrzlina, mrazený jogurt, šerbet, ovocná zmrzlina, ľadové mlieko a mrazené pudingy, ľadové vody, granity a mrazené ovocné pretlaky.

Vhodná hladina tuhých látok v mrazených cukrovinkách (napr. cukor, tuk, príchute, atď.) je viac ako 3 % hmotn., vhodnejšia je od 10 do 70 % hmotn., napríklad od 40 do 70 % hmotn..

Mrazené cukrárenské produkty môžu byť podľa vynálezu vyrábané akoukoľvek metódou vhodnou na výrobu mrazených cukroviniek. Je však obzvlášť vhodné všetky ingrediencie zloženia úplne zmiešať pred začatím procesu zmrazovania.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Mrkvy ( Daucus carota kultivar Autumn King) rástli v oddelených črepníkoch. Keď mali rastliny približne dvanásť týždňov boli prenesené do chladnej miestnosti a udržiavané pri teplote 4 °C pri konštantnom svetle, počas 4 týždňov kvôli aklimatizáciu na chlad. Rastliny sa polievali tri krát za týždeň.

-8Čerstvé pletivo mrkiev bolo rozdrvené ochladeným tíčikom v trecej miske (ochladenej na 4 °C) v rovnakom množstve pufra A (10 mM EDTA, 20 mM kyselina askorbová, pufrovaný Tris-om na pH 7,4.) držaného na ľade. Homogenáty boli prefiltrované cez jednovrstvový mušelín a skladované na ľade pred ďalším použitím.

Na porovnanie sa nechala narásť aj iná koreňová zelenina a homogenáty z jej koreňov boli pripravené vyššie opísaným spôsobom.

Mrazuvzdorná aktivita bola meraná pomocou „ splat assay“ testu (Knight et.

al., 1988). 2,5 pl skúmaného roztoku v 30% hmotn. cukróze bolo nanesených na čisté, vhodne označené, 16 mm okrúhle krycie sklíčko. Druhé krycie sklíčko bolo priložené na kvapku roztoku a tento sendvič bol spolu stlačený medzi prstom a palcom. Sendvič bol ponorený do -80 °C hexánového kúpeľa držaného v boxe suchého ľadu. Keď boli všetky sendviče pripravené, preniesli sa z -80 °C hexánového kúpeľa do pozorovacej komory obsahujúcej hexán udržiavaný na -6 “C, pomocou klieští predchladených na suchom ľade. Počas prenosu do -6 ’C bolo možné pozorovať zmenu vzhľadu sendvičov z priehľadného na nepriehľadný. Obrazy boli natočené na video kameru a zachytené v systéme, analyzujúcom obrazy (LUCIA, Nikon) pomocou 20x objektívu. Obrazy každého stlačeného sendviča boli natočené v čase t = 0 a zase po 30 až 60 minutách. Bola porovnávaná veľkosť kryštálov ľadu v oboch prípadoch. Ak je veľkosť po 30 až 60 minutách rovnaká alebo len mierne zväčšená (povedzme menej ako 20% zväčšenie, vhodnejšie je zväčšenie menej ako 10% a najvhodnejšie je zväčšenie menej ako 5%) v porovnaní s veľkosťou v čase t = 0, je to známka dobrých rekryštalizačnoinhibičných vlastností kryštálov ľadu.

Výsledok: zo sendvičového „splat assay“ testu sa zdá, že vzorky z koreňov, stonky a listov mrkvy majú významné rekryštalizačno inhibičné vlastnosti, z nich korene a listy sú najaktívnejšie. Na porovnanie boli testované korene neaklimatizovaných mrkiev, ktoré vykazovali výrazne nižšiu aktivitu. V nasledujúcich príkladoch bolo na ďalšie testovanie použité pletivo mrkvových koreňov.

Na porovnanie bolo niekoľko iných rastlinných koreňov skúmaných pomocou sendvičového „ splat assay testu v 30% cukróze. Medzi touto zeleninou boli repa, kučeravá kapusta, výhonky ružičkového kelu, zimná kapusta, repka, pak choi,

-9paštrnák a jahody. Žiadny z týchto zdrojov materiálu neposkytoval významnú rekryštalizačno-inhibičnú aktivitu.

Príklad 2

Pletivo mrkvových koreňov bolo homogenizované predchladeným tíčikom v predchladenej trecej miske v troch objemoch (hmotnosť/objem) pufru (20 mM kyselina askorbová, 10 mM EDTA, 50 mM Tris/HCI, pH 7,2) a prefiltrované cez jednovrstvový mušelín. Filtrát bol centrifugovaný pri 6000 g desať minút, pri 4 °C. Supernatant bol pozbieraný a zcentrifugovaný pri 100 000 g jednu hodinu, pri 4 °C. Supernatant z tohto kroku predstavuje rozpustnú frakciu a pelet mikrozomálnu frakciu.

Supernatant bol nanesený na 30 ml rýchlo prietokovú Q Sepharose kolónu preekvilibrovanú 50 mM TRIS/HCI pH 7,4 pri prietokovej rýchlosti 5 ml/min, ktorá bola poháňaná pomocou HiLoad pumpy P-50, kontrolovanou pomocou Gradifrac nízkotlakového chromatografického systému (Pharmacia) pri 4 °C. Eluát bol monitorovaný pri OD 280 pomocou UV monitoru (Monitor UV1, Pharmacia) a zaznamenávaný na zaznamenávač grafu (REC 102, Pharmacia). Boli zbierané 5ml frakcie. Kolóna bola premývaná s 50 mM TRIS/HCI pH 7,4 pri rovnakej prietokovej rýchlosti pokiaľ sa OD 280 vrátila na nulu. Potom bol nanesený 150 ml gradient 0 až 0,4M NaCI v TRIS/HCI pH 7,4 a následne bola kolóna premytá 2M NaCI. Eluátové frakcie boli podrobené „splat assay“ testu ako v príklade 1.

Frakcie, ktoré mali mrazuvzdornú aktivitu, čo sa dokázalo rekryštalizačnou inhibíciou, boli spojené a skoncentrované pomocou polyetylénglykolu nasledovne: frakcie boli prenesené do 10 kDa odrezanej dialyzačnej trubice, ktorá bola premytá vodou z vodovodu, preváraná 10 minút v 50 mM EDTA pH 7,5 a opláchnutá v mili Q vode. Dialyzačná trubica so vzorkou pripravenou na koncentrovanie bola pokrytá zmesou tuhého polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou 15 000 až 20 000 (Sigma) a inkubovaná pri 4 °C až do 4 hodín, alebo dovtedy kým sa množstvo vzorky v dialyzačnej trubici zredukovalo až 10 krát.

-10Spojený koncentrát z Q Sepharose kolóny bol nanesený buď na phenyl Sepharose kolónu, SMART superdex 75 gólovú priepustnú kolónu alebo na FPLC superdex 75 gólovú priepustnú kolónu.

Mrazuvzdorné proteíny mrkvových koreňov boli purifikované pomocou gólovej priepustnej chromatografie nasledovne:

pi alikvoty vzorky sa nanášali na SMART superdex 75 kolónu (Pharmacia) preekvilibrovanú 50 mM Tris/HCL pH 7,4 obsahujúcim 0,15M NaCI (pufor E) pri prietokovej rýchlosti 40 μΙ/min. Komponenty sa separovali na základe gólovej priepustnosti pri rovnakej prietokovej rýchlosti v ekvilibračnom pufri. Eluát bol monitorovaný pri OD 280 a OD 215. Zbierali sa 80 μΙ frakcie medzi 0,85 a 0,89 ml, 40 μΙ frakcie medzi 0,89 a 1,24 ml a 100 μΙ frakcie medzi 1,24 a 3,0 ml. Prázdny objem kolóny bol 0,91 ml čo bolo určené pomocou retenčného objemu roztoku Blue Dextranu. Superdex kolóna bola kalibrovaná nanesením 10 μΙ roztoku, obsahujúceho 5 mg/ml BSA (Mr 66 kDa, retencia (Ve) = 1,02 ml), 3 mg/ml karboanhydrázy (Mr 29 kDa, Ve = 1,22 ml), 2 mg/ml cytochrómu C (Mr 12,4 kDa, Ve = 1,41 ml) a 2 mg/ml aprotininu (Mr 6,5kDa, Ve = 1,59 ml) a štandardná krivka bola zostrojená z Ve/Vo proti log Mr. Frakcie s mrazuvzdornou aktivitou boli určené pomocou „splat assay“ testu z príkladu 1, s vrcholom aktivity pri retenčnom objeme 1,16 ml a zjavnej molekulovej hmotnosti 40 kDa. Tieto merania potvrdili, že 36 kDa pruh z mrkiev aklimatizovaných na chlad bol mrazuvzdorný peptid.

SDS-PAGE bola uskutočnená podľa Laemmliho (1970) pomocou Biorad mini systému. Vzorky analyzované v SDS-PAGE boli rozpustené v SDS-PAGE vzorkovom pufri (Laemmli, 1970), zohrievané 5 minút pri 100 °C v suchom zohrievacom bloku (Techne) a centrifugované 3 minúty pri 10 OOOg pri izbovej teplote.

Vzorky (10 až 50 μΙ) boli nanesené na mini-gély (Biorad, 0,75; 1,0 alebo 1,5 mm hrubé, 10, 12,15% akrylamid alebo 10 až 20% gradiend akrylamidu (hotové od Bioradu)) a elektroforeticky separované. Oddelené polypeptidy boli v géli fixované a farbené buď farbičkou Coomassie blue (0,1% (hmotnosť/objem)) Coomassie Brilliant blue v kyseline acetónovej/metanole/mili Q vode (5:4:31), alebo farbené striebrom pomocou kitu na farbenie striebrom od Bioradu podľa inštrukcií výrobcu. Gély sa sušili medzi dvoma kusmi Gelair celofánu v Biorad gelair sušiarni podľa inštrukcií výrobcu. Na určenie viditeľnej molekulovej hmotnosti na SDS-PAGE boli

-11 použité vysoko a nízko molekulové markery molekulovej hmotnosti od Sigmy podľa inštrukcií výrobcu.

lonomeničová chromatografia bola uskutočnená s chladnými aklimatizovanými koreňmi mrkiev a neaklimatizovanými koreňmi mrkiev. Výsledné SDSPAGE gély poukazovali na prítomnosť 36 kDa pruhu v chladnej aklimatizovanej vzorke. Tento pruh bol oveľa menej výrazný v neaklimatizovanej vzorke. Z tohto dôvodu sa 36 kDa pruhu pripísala mrazuvzdorná aktivita.

Príklad 3

Na proteínové sekvenovanie bol 36 kDa proteín mrkvového koreňa purifikovaný podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade. Potom na zaistenie ďalšej purifikácie bol proteín vyrezaný z SDS-PAGE gélu a in situ proteolyticky štiepený v polyakrylamidovom gélovom plátku.

Pripravené prevažne čisté 36 kDa proteíny, ktoré stále obsahovali malú časť kontaminujúcich proteínov boli nanesené na 12% polyakrylamidový gél. Do troch dráh bolo nanesených po 2 pg proteínu a gélová elektroforéza prebiehala pokiaľ predná časť farbičky nedosiahla koniec gélu. Potom bol gél farbený v 0,2% Coomassie brilliant blue (hmotnosť/objem), 30%-nom (objemové) metanole, 1%-nej (objemové) kyseline octovej počas 20 minút a následne odfarbovaný v 30% metanole dovtedy, kým sa v géli neobjavili proteínové pruhy. Pruh s veľkosťou 36 kDa sa zisťoval porovnaním s markerom molekulovej hmotnosti, ktorý bol nanesený do susednej dráhy. Tento pruh bol z každej dráhy vyrezaný skalpelom, pričom sa dávalo pozor na to, aby neboli vyrezané aj kontaminujúce pruhy.

Vyrezané gélové prúžky boli prenesené do čistej eppendorfky a dvakrát premyté v 0,5 ml 50%-ného (objemové) acetonitrilu, 100 mM Tris/CI, pH 8,5. Premývaním sa odstránila Coomassie farba a tiež sa čiastočne dehydrovali gélové prúžky. Potom boli gélové prúžky z eppendorfky vybraté a nechali sa volne sušiť na laboratórnych stoloch, pokiaľ sa výrazne nescvrkli a nezačali stáčať. Potom boli prenesené naspäť do eppendorfky a rehydrované 10 pl 100 mM Tris/Cl, pH 8,5, ktorý obsahoval 1 pl endoproteinázy Lys C (Boehringer Mannheim). Je to proteináza, ktorá špecificky štiepi poypeptidové reťazce v karboxylovej terminálnej

-12časti lyží nových zvyškov. Ďalej bol ku gélovým prúžkom pridaný Tris pufor až kým sa úplne rehydrovali a potom boli inkubované 16 hodín, pri 37 °C.

Po inkubácii sa na zastavenie reakcie do eppendorfky pridal 1 μΙ kyseliny trifluóroctovej a následne sa gélové prúžky dva krát premývali v 0,3 ml 60%-ného (objemové) acetonitrilu, 0,1%-nom (objemové) TFA počas 30 minút, pri 30 °C. V tomto kroku sa zase gélové prúžky čiastočne dehydrovali, čo spôsobilo že sa scvrkli a vytvorené proteíny sa z nich vymyli. Supernatant bol prenesený do ďalšej čistej eppendorfky a sušený v centrifugálnom evaporátore 2 hodiny, až kým bola vzorka skoro suchá. Potom bol resuspendovaný do objemu 0,1 ml s 0,1% TFA.

Peptidy boli separované pomocou reverznej fázy HPLC na mikropurifikačnom systéme SMART (Pharmacia). Poštiepené peptidy boli nanesené na C18 kolónu (2,1 x 100 mm) ekvilibrovanú 0,1% TFA (rozpúšťadlo A) pri prietokovej rýchlosti 0,1 ml/min. Potom bola kolóna eluovaná gradiendom 0 až 70% rozpúšťadla B (90% acetonitril (objemové), 0,085% TFA (objemové)) viac ako 70 minút pri rovnakej prietokovej rýchlosti. Optická denzita bola monitorovaná pri 214 nm a jednotlivé proteínové vrcholy boli manuálne zbierané do zbierača frakcií. Polypeptidy boli sekvenované v Perkin Elmer proteínovom sekvensere, model 492, použitím tekutej fázy chemických cyklov ako je doporučené výrobcom.

V 36 kDa pruhu bolo analyzovaných niekoľko polypeptidových fragmentov (A až E), ktorých aminokyselinové sekvencie sú homologické k sekvenciám:

(A) LEU - PRO - ASN - LEU - PHE - GLY - LYS (B) ILE - PRO - GLU - GLU - ILE - SER - ALA - LEU - LYS (C) LEU - THR - X - LEU - ASP - LEU - SER - PHE - ASN - LYS (D) SER - LEU - ARG - LEU - SER - SER - THR - SER - LEU - SER - GLY PRO - VAL - PRO - LEU - PHE - PHE - PRO - GLN - LEU - X - LYS (E) X - X - GLY - VAL - ILE - PRO - X - GLN - LEU - SER - THR - LEU - PRO -ASN-LEU-LYS

Príklad 4a

Mrkvové bunkové kultúry

-13Línia suspenznej kultúry buniek mrkvy (NOR) bola získaná z oddelenia biochémie a molekulárnej biológie Univerzity v Leede. Kultúra bola udržiavaná subkultiváciou 10 ml kultúry do 90 ml čerstvého Murashige a Skoog média (Sigma) obsahujúceho 25g/l cukrózy a 1 mg/l 2,4-D, každých sedem dní. Kultúry boli inkubované v rotačnom trepacom inkubátore pri 150 ot./minútu, pri 25 °C v tme.

NOR kultúra bola nasledovne pripravená na chlad:

NOR kultúry boli po 4d a 7d rastu pri 25 °C prenesené do 4 °C. Kultúry boli odoberané v čase t = 0, t = 7d a t = 14d. Okrem zberu sa určoval celkový bunkový objem pre každú kultúru v každom časovom bode.

Vzorky médií z NOR suspenzných kultúr boli analyzované nasledovne. Približne 1/10 objemu mrazených alikvotov upraveného média suspenznej kultúry bolo rozmrazených. Rozmrazená (mrazom koncentrovaná) časť bola odobratá a jej aktivita bola testovaná pomocou ,, splat assay“ testu opísaného v príklade 1. Zistilo sa, že médium z kultúr aklimatizovaných na chlad obsahuje výrazne viac aktivity ako médium z neaklimatizovaných kultúr.

Na chlad aklimatizované NOR mrkvové médium bolo pufrované pridaním 100 μΙ 1M Tris/HCI pH 7,4. Purifikácia aktivity bola potom uskutočnená pomocou ionomeničovej a gélovej priepustnej chromatografie na základe metód z príkladu 2: pufrované médium bolo nanesené na 1 ml Q Sepharose kolónu (Pharmacia) pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min a naviazané molekuly sa eluovali 3 ml alikvotmi 500 mM Tris/HCI pH 7,4 obsahujúceho koncentrácie NaCI začínajúce pri 0,1 M a zvyšujúce sa na 0,5M po 0,1 M krokoch. Zachytávali sa 1 ml frakcie a testovala sa ich aktivita ako v príklade 1.

Mrazuvzdorná aktivita v aktívnych ionomeničových frakciách bola purifikovaná pomocou gélovej priepustnej chromatografie nasledovne. Aktívna frakcia bola precipitovaná acetónom a pelet bol resuspendovaný v 50 μΙ 50 mM Tris/HCI + 0,15 M NaCI, pH 7,2. Toto bolo potom centrifugované pri 10 000 g, 10 minút a 20 μΙ bolo nanesených na Superdex 75 gélovú priepustnú kolónu v Pharmacia SMART systéme. Prietoková rýchlosť bola 40 μΙ/min a mobilnou fázou bol 50 mM Tris/HCI + 0.15M NaCI, pH 7,2. Zachytávali sa 80 μΙ frakcie. Aktivita bola detekovaná vo frakciách korešpondujúcich retencii 1,16 ml.

-14Ďalšia izolácia aktívnych proteínov môže byť uskutočnená pomocou SDSPAGE analýzy v súlade s príkladom 2.

Príklad 4b

Kultúra mrkvového koreňa

Kultúry mrkvového koreňa boli pestované nasledovne.

Pre každú individuálnu kultúru bolo 10 povrchovo sterilizovaných semien Daucus carote kultivar Autum King vložených do 100 ml MS média obsahujúceho 25 g/l cukrózy a 0,5 g/l MES v sterilnej 250 ml Erlenmyerovej banke. Semená sa nechali klíčiť pri 150 ot./min v tme, pri 25 °C tri týždne. Listy a výhonky boli potom aseptický odstránené. Korene boli vložené do 100 ml čerstvého média a inkubované trasením počas ďalších dvoch týždňov.

Homogenáty boli pripravené z chladom ošetrených a chladom neošetrených koreňových kultúr nasledovne. Rýchlo zmrazené korene boli v chladnej trecej miske chladným tíčikom rozdrvené 3x v tekutom dusíku. Potom boli prenesené do ďalšej chladnej trecej misky a chladeným tíčikom rozdrvené s 0,5x objemom ľadového 50 mM Tris/HCI + 10 mM EDTA pH 7,4 obsahujúceho 30% hmotn. cukrózy. Homogenáty boli centrifugované pri 10 000 g 10 minút, pri 4 °C a ďalej sa testovala aktivita supernatantu ako v príklade 1. V chladom ošetrených koreňových kultúrach sa zistilo výrazne viac aktivity ako v chladom neošetrených koreňových kultúrach.

Príklad 5

Príprava zmrzliny

Koreňový extrakt z mrkvových koreňov aklimatizovaných na chlad bol pripravený tak, že sa najprv v chladnej vode vydrhli čerstvo vytiahnuté na chlad aklimatizované (ako v príklade 1) mrkvy. Vršky sa odstránili a džús sa extrahoval pomocou domáceho odšťavovača (Russel Hobbs, model č. 9915). Džús bol pred použitím v pokusoch so zmrzlinou zamrazený v 1 litrových blokoch a uskladnený na -20 °C. Mrkvový AFP džús bol pridaný do zmrzliny nasledovného zloženia:

Prísady	hmotnostný diel
práškové odstredené mlieko	10,000
cukróza	13,000
MD 40	4,000
živica svätojánskeho chleba	0,144
genulacta L 100	0,016
MGP	0,300
maslový olej	8,000
vanilín	0,012
voda	64,528
mrkvový extrakt (z mrkiev aklimatizovaných na chlad obsahujúcich 1 až 10 mg AFP na kg)	4,472

Zmrzlina bola pripravená zmrazením uvedených prísad a prevzdušnením do presahu 106%.

Merania sa uskutočnili na čerstvých vzorkách a na vzorkách, ktoré boli poškodené skladovaním na -10 ^eC počas 10 dní. Na porovnanie bola rovnakým spôsobom meraná vzorka, ktorá neobsahovala mrkvový extrakt. Merania boli prevedené nasledovne:

Vzorky boli ekvilibrované pri -18 ^eC v Prolanovom enviromentálnom kabinete približne 12 hodín. Reprezentatívne boli vybrané tri vzorky z každej dávky zmrzliny. Z každej bolo zhotovené sklíčko v kabinete, kontrolujúcom kryostatovú teplotu rozotretím tenkej vrstvy zmrzliny odobratej zo stredu každého bloku na mikroskopické sklíčko. Ďalej bola na sklíčko nanesená jedna kvapka liehu a prikrytá krycím sklíčkom. Sklíčka boli za sebou prenesené na teplotné kontrolovaný mikroskopický stolík (Leit LabourLux S, Leica x10 objektív, teplota -18 °C). Zobrazenia kryštálov ľadu ( okolo 400 jednotlivých kryštálov) boli zhromaždené a prenesené prostredníctvom video kamery (Sanyo CCD) do obraz uchovávajúceho a analyzujúceho systému (LEICA Q52OMC).

Uchované zobrazenia kryštálov ľadu boli manuálne zvýraznené obkreslením obvodu ,čím sa zvýraznil celý kryštál. Zvýraznené tvary kryštálov boli potom merané

-16pomocou obraz analyzujúceho softvéru, ktorý započítava množstvo výbežkov potrebných na dokončenie najdlhšej rovnej línie (dĺžka), najkratšej rovnej línie (šírka) a stranového pomeru (dĺžka/šírka). Dáta o kryštáloch ľadu z každej dávky zmrzliny boli importované do počítačového programu, ktorý po prevedení analýzy udaných dát zistil priemernú a štandardnú odchýlku.

Merania tvrdosti zmrzliny boli uskutočnené pomocou Hounsfield H10KM univerzálneho testeru, Hounsfield 100N Load Celí a 10 cm cylindrickej sondy z nehrdzavejúcej ocele. Vzorky zmrzliny boli pripravené 16 hodinovou inkubáciou 486 ml zmrzlinových blokov v kabinete, kontrolujúcom Prolanovu teplotu, nastaveného na -18 °C.

Zmrzlinové bloky boli vybraté z kabinetu, kontrolujúceho Prolanovu teplotu a premiestnené do Housfieldovho H10KM univerzálneho testeru. 10 cm cylindrická sonda bola vtlačená do zmrzlinového bloku pri konštantnej rýchlosti 400 mm/min do hĺbky 20 mm. Maximálna použitá sila zaznamenaná počas kompresie predstavovala tvrdosť zmrzliny. Pozorované praskliny a krehké zlomy vo vzorke boli zaznačené v tabuľke do stĺpca vpravo.

Boli získané nasledovné výsledky:

	Parametre veľkosti kryštálov ľadu	Vlastnosti materiálu
Vzorka	Priemerná dĺžka kryštálov [pm]	Priemerná šírka kryštálov [pm]	Priemerné faktory tvaru kryštálov	Priemerný stranový pomer kryštálov	Tvrdosť [N]	Pozorované krehké trhliny
Mrkvové AFPčerstvé	26,79 ± 1,3	19,00 ±0,9	1,15 ±0,013	1,43 ±0,024	40,8	Ano
Mrkvové AFPpoškodené	33,48 ± 1,3	24,61 ± 0,9	1,13 ±0,013	1,37 ±0,020	59,9	Áno
kont. čerstvé	33,67 ± 1,1	24,79 ± 0,8	1,12 ± 0,008	1,38 ±0,018	27,3	Nie
kont. poškodené	61,77± 2,7	46,54 ± 2,0	1,11 ±0,010	1,37 ±0,020	32,7	Nie

-17Toto dokazuje, že mrazuvzdorné polypeptidy mrkvy majú dobré rekryštalizačno-inhibičné vlastnosti.

Príklad 6

Peptidové sekvencie z príkladu 3 boli analyzované za účelom prípravy oligonukleotidových primérov. Vybrala sa časť peptidu D (GLY - PRO - VAL - PRO - LEU - PHE - PHE - PRO) a bol syntetizovaný primér cp3 (GGI CCI GTI CCI YTI TTY TTY CC, kde I = inozín a Y = C alebo T) (Genosys).

Prvé vlákno cDNA bolo pripravené z 5 μΙ RNA aklimatizovaných koreňov mrkvy použitím Superscript reverznej transkriptázy (Stratagene) a oligonukleotidového priméru OG 1, podľa inštrukcií výrobcu. V následnej PCR reakcii sa použilo 1 % z reakcie prvého vlákna cDNA ako templátu spolu s primérmi cp3 a OG1. Reakcia bola uskutočnená v termálnom cykléri použitím Taq DNA polymerázy (Gibco BRL), počas 30 cyklov (94 °C/1 minúta, 50 ^eC/1 minúta, 72 °C/1 minúta) podľa inštrukcii výrobcu. Koncentrácia všetkých použitých primérov bola 1 μΜ. Výsledné -800 bp PCR produkty boli purifikované a klonované do pTAg vektora (R&D systémy) podľa inštrukcií výrobcu. Klonované cp3 PCR produkty boli sekvenované dideoxyovou sekvenčnou metódou využitím sekvenčného kitu (USB). Nukleotidová sekvencia cp3 PCR produktov a odvodená aminokyselinová sekvencia bola zhodná so sekvenciou v zozname 2:

Zoznam 2

GGGCCGGTGCCGCTGTTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTT ________________________________________________* 60

GPVPLFFPQLTKLTCLDLSF

AACAAACTTTTGGGTGTAATCCCTCCTCAGCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTG

61---------₊---------+---------r— ------+---------** 120

NKLLGVXPPQLSTLPNLKAL

CACTTAGAACGTAACGAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGA

121---------+---------+-----------------♦---------** I

KLERNELTGEIPDIFGN’FAG

-18TCCCCGGACATATATCTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTGTTCCCAAAACTTTTGCT

181---------*---------+----------r---------+---------+---------♦ 240

SPDIYLS HNQLTGFVPKTFA

AGAGCAGATCCAATTAGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTC

241 300

RADPIRLDFSGNRLEGDISF

TTGTTTGGGCCTAAAAAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGCTTAGTTTC

LFGPKKRLEMLDFSGNVLSF

AATTTCTCCAGGGTGCAGGAGTTTCCACCCTCTTTGACATACTTAGACTTGAACCATAAC

361---------1---------+-----------------—----------+---------+ 420

NFSRVQEFPPSLTYLDLNHN

CAGATCAGCGGAAGTCTGTCGAGTGAATTGGCTAAATTGGACCTGCAGACATTTAACGTC

QISGSLSSELAKLDLQTFNV

AGTGATAATAATCTCTGCGGCAAGATTCCAACAGGGGGAAACCTCCAGAGATTCGACCGT

481---------+---------+---------♦---------+---------++ 540

SDNNLCGKIPTGGNLQRFDR

ACGGCCTATCTCCACAACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAGTTACCA

541---------4·---------+---------j-------—-+---------+---+ 600

TAYLHNSCLCGAPLPEC·

TGCAAAATGTGCCTTAAGGTTATCTTTGTAATGAGATATATTATGCAGCTCAAGGCAGAG

601 ----————f660

CAATAAGTTTTCCTAATTTGTTATAGTAAGATATTATTGTATTTCACAGAAAGTGTCTAC *---------_----------_----------_----------TAGGATTCGTAATATATTATAATTGCTCATAATTGTATCTGTTTAATCTGTAATCCAAAA

-------------------+---------+---------♦---------+--------- 78q

ACCTTTATGTATTGGTTTGACACTTTTGAGCTTTAAAAAAAAAAAAAAA

781

829

-19Na to, aby bola zistená kompletná kódujúca oblasť mrkvového AFP bola zostrojená cDNA knižnica. Na purifikáciu mRNA z 500 pg CA (1 mesiac) celkovej mrkvovej RNA bola použitá poly (A) rýchla kolóna (Stratagene), pričom sa postupovalo podľa inštrukcií výrobcu. Všetky výsledné poly (A)+ RNA boli použité na syntézu cDNA a nasledovne na konštrukciu knižnice pomocou lambda ZAP vektor kitu (Stratagene). 1x10⁵ fágových klonov bolo skrinovaných hybridizáciou s cp3 PCR produktom, ktorý bol ³²P rádioaktívne značený a použitý ako hybridizačná sonda.

Predtým než sa inzerty podrobili DNA sekvenčnej analýze boli pozitívne plaky skrínované na čistotu a fagmidy boli vyrezané. Kompletne boli sekvenované inzerty dvoch cDNA klonov. Hoci 5'a 3'neprekladané oblasti obsahovali určitú sekvenčnú variabilitu, kódujúce oblasti boli identické. Nukleotidová sekvencia kódujúcich oblastí dvoch cDNA klonov bola nasledovná:

Zoznam 1

ATGAATATTGAATCATCTTTCTGCCCTATTTTGTGCATATGCATGATTTTCCTCTGCCTT

13-------------------------------------♦---------+---------f— 72

MNIESSFCPILCICMIFLCL

CCAAACCTCTCTGCATCACAAAGATGCAÄCAACAACGACAAGCAAGCTTTACTCCAAATC

-—----+— ------+---------*-------—♦---------*---------1— 132

PNLSASQRCNNNDKQALLQI aaaacagccttgaaaaaccccaccattacagactcatgggtgtcagacgacgattgttgt

133-------+---------+—---------------------------♦------------ 192

KTALKNPTITDSWVSDODCC

GGTTGGGACCTAGTCGAATGTGACGAAACCAGCAACCGCATAÄTTTCCCTCATAATTCAA

193-------+---------+-------------------+— -----------—---+— 252

GWDLVECDETSNRIISLIIQ

GACGACGAAGCTCTCACCGGCCAAATCCCACCTCAGGTGGGAGACCTACCATACCTCCAA

233 -------+---------+---------r---------+---------+---------♦— 312

OOEALTGQIPPQVGDLPYLQ

GCCTTATGGTTCCGTAAACTCCCCAATCTTTTCGGAAAAATCCCAGAAGAAATTTCTGCA

313-------_----------+----------------------------------------— 372

ALWFRKLPNLFGKIPEE-ISA

CTCAAAGACCTAAAATCCCTCAGACTCAGCTCGACCAGTCTCAGTGGCCCTGTCCCTTTA

373-------₊-------------------*---------+-------------------*— 432

LKDLKSLRLSSTSLSGPVPL

TTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTTAACAAACTTTTGGGT

433 -------+---------+-----------------------------*---------♦— <92

FFPQLTKLTCLDLSFNKLLG

GTAATCCCTCCTCAGCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTGCACTTAGAACGTAAC

493-------+---------♦-----------------------------+----------- 552 vippqlstlpnlkalhlern

-20GAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGATCCCCGGACATATAT

553-------_-------------------------------₊---------*---------+— 612

ELTGEIPDIFGNFAGSPDIY

CTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTGTTCCCAAAACTTTTGCTAGAGCAGATCCAATT

613------_+-------—+--------------------*---------r----------— 672

LSHNQLTGFVPKTFARADPI

AGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTCTTGTTTGGGCCTAAA

673 -------+---------+---------+---------+---------+---------+— 732

RLDFSGNRLEGDISFLFGPK

AAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGCTTAGTTTCAATTTCTCCAGGGTG

733-------₊---------+---------+---------+---------♦---------+— 792

KRLEMLDFSGNVLSFNFSRV

CAGGAGTTTCCACCCTCTTTGACATACTTAGACTTGAACCATAACCAGATCAGCGGAAGT

3, 793-------+---------*---------+---------+---------ť---------+— 852

QEFPPSLTYLDLNHNQISGS

CTGTCGAGTGAATTGGCTAAATTGGACCTGCAGACATTTAACGTCAGTGATAATAATCTC

S 833 -------+---------+---------+---------*---------*---------— 912

LSSELAKLDLQTFNVSDNNL

TGCGGCAAGATTCCAACAGGGGGAAACCTCCAGAGATTCGACCGTACGGCCTATCTCCAC

913-------₊---------+---------+---------*---------+---------+— 972

CGKIPTGGNLQRFDRTAYLH

AACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAG

973 -------+---------+---------1---------+- 1011

NSCLCGAPLPEC·

Čiastočná sekvenčná analýza štyroch ďalších klonov dokázala, že obsahujú rovnakú kódujúcu oblasť ako kompletne sekvenované klony. Všetky pozitívne klony zistené skríningom knižnice teda pravdepodobne obsahovali transkrypty rovnakého génu. Existencia len jednej kópie AFP génu v genóme mrkvy bola ďalej dokázaná skutočnosťou, že pri Southernovej analýze, pri ktorej sa reštrikčným enzýmom poštiepila genomická DNA mrkvy, len jeden fragment DNA hybridizoval so sondou.

Príklad 7

Na dôkaz, že mrkvová cDNA ako je uvedené v príklade 4, reprezentuje AFP, bola nasledovne uskutočnená expresia kódujúcej oblasti. Jedna z cDNA bola najprv klonovaná do stredného pUC plazmidového vektora (Messing, 1983), obsahujúceho expresnú kazetu s dvojitým CaMV 35S promotorom (Guerineau, J. F., Woolsten, S., Brooks, L., a Mollineaux, P. (1988)) a potom do binárneho vektora ako je opísané nižšie. Všetky použité enzýmy boli od firmy Gibco BRL a boli použité podľa inštrukcií výrobcu.

-21 Fagmid pBluescript (Stratagene) obsahujúci cDNA kloň bol štiepený Xho I a chýbajúci 3'konec bol vyplnený použitím Klenovho fragmentu DNA polymerázy I. Fragment cDNA bol z vektora vyštiepený pomocou Eco Rl. Eco Rl/tupý cDNA fragment bol potom klonovaný do stredného pUC plazmidového vektora štiepeného Eco Rl. CaMV 35S - cDNA expresná kazeta bola subklonovaná ako parciálny Hind III fragment do pBin 19 binárneho vektora štiepeného Hind III (Bevan 1984). Konštrukcia binárneho vektora bola vložená do tabaku pomocou Agrobaktériom sprostredkovanej transformácie (ako opisujú Draper, J., Scott, R., Armatage, P. a Walden, R.(1988)).

Transgénne tabakové kalusy boli analyzované na expresiu rekryštalizačnoinhibičnej aktivity hneď ako sa regenerovalo dostatok materiálu rezistentného na kanamycín.

Bola vytvorená malá škála proteínových extraktov z niekoľkých samostatných kanamycín rezistentných kalusov plus niektorých divých typov tabakových kalusov. Približne 2 g pletiva bolo tlčikom rozdrvených v trecej miske s 1 až 2 ml cukrózového pufru (30% cukróza, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 20 mM askorbát, pH 7,2). Roztok bol centrifugovaný pri 10 OOOg, 2 minúty. Supernatant bol prenesený do čistej skúmavky.

Rekryštalizačná aktivita sa testovala na 3 μΙ proteínového extraktu použitím sendvičového „splat assey testu z príkladu 1. Všetky testované kanamycín rezistentné kalusy vykazovali rekryštalizačno inhibičnú aktivitu.

Produkované boli aj stabilné transgénne rastliny exprimujúce mrkvový AFP. Listové extrakty divého typu a transgénnych tabakových rastlín boli podrobené northern analýze použijúc AFP cDNA ako sondu. AFP mRNA bola detekovaná len v transgénnych tabakových rastlinách, čo naznačuje, že AFP mRNA je stabilná v sklenníkových transgénnych tabakových rastlinách. V porovnaní s natívnymi mrkvovými transkriptmi, tabakové AFP transkripty sa zdajú byť trochu väčšie. Táto diskrepancia sa dá vysvetliť metódou konštrukcie AFP expresnej kazety. Keďže CaMV 35S polyadenylačný signál je viac na 3'konci konštrukcie, je pravdepodobné, že tento signál je používaný v transgénnej AFP mRNA, čím vzniká dlhší transkript. Listový extrakt divého typu rastlín a transgénnych tabakových rastlín bol analyzovaný aj western blotom, pri ktorom bola použitá mrkvová AFP protilátka.

-22Skrížená reakcia proteínu bola zistená len u transgénnych tabakových rastlín. Napriek rozdielu v dĺžke transkriptov sa zdá, že proteín produkovaný tabakom má rovnakú veľkosť ako natívny mrkvový AFP.

Predchádzajúce údaje poskytujú dôkaz, že proteín purifikovaný z mrkvy a korešpondujúca cDNA predstavujú aktívny AFP.

ap- ýf

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptidy s mrazuvzdornou aktivitou, ktoré sa dajú získať z mrkvy a ktorých molekulová hmotnosť zistená na SDS-PAGE je 36 kD, ich izoformy a deriváty, ktoré si stále zachovávajú mrazuvzdornú aktivitu.
2. Polypeptidy s mrazuvzdornou aktivitou, pozostávajúce z jedného alebo viacerých fragmentov (A až E), ktorých aminokyselinová sekvencia ja nasledovná:

(A) LEU - PRO - ASN - LEU - PHE - GLY - LYS (B) ILE - PRO - GLU - GLU - ILE - SER - ALA - LEU - LYS (C) LEU - THR - X - LEU - ASP - LEU - SER - PHE - ASN - LYS (D) SER - LEU - ARG - LEU - SER - SER - THR - SER - LEU - SER - GLY PRO - VAL - PRO - LEU - PHE - PHE - PRO - GLN - LEU - X - LYS (E) X - X - GLY - VAL - ILE - PRO - X - GLN - LEU - SER - THR - LEU - PRO -ASN-LEU-LYS a ich izoformy alebo deriváty, ktoré si stále zachovávajú mrazuvzdornú aktivitu.
3. Polypeptidy s mrazuvzdornou aktivitou pozostávajúce z fragmentov (A až E) podľa nároku 2.
4. Polypeptidy s mrazuvzdornou aktivitou, ktorých aminokyselinová sekvencia je zobrazená v zozname 1 a ich izoformy a deriváty, ktoré si stále zachovávajú mrazuvzdornú aktivitu.
5. Izolovaná nukleotidová sekvencia, kódujúca mrazuvzdorný polypeptid podľa jedného alebo viacerých nárokov 1 až 4 a jej alely, kódujúce polypeptidy, ktoré si stále zachovávajú mrazuvzdornú aktivitu.
6. Izolovaná nukleotidová sekvenia korešpondujúca s génovou sekvenciou v zozname 1 a jej alely, kódujúce polypeptidy, ktoré si stále zachovávajú mrazuvzdornú aktivitu.
7. Spôsob získania polypeptidov podľa jedného alebo viacerých nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že polypeptidy sa izolujú z mrkvy aklimatizovaných na chlad.
8. Spôsob získania polypeptidov podľa jedného alebo viacerých nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že polypeptidy sú exprimované pomocou geneticky modifikovaných organizmov.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že organizmami sú s mikroorganizmy, rastliny alebo bunkové kultúry.
10. Protilátka, ktorá je schopná špecificky sa viazať na polypeptid podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4.
11. Polypeptid s mrazuvzdornou aktivitou, ktorý je imunologický príbuzný polypeptidu podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, ako bolo determinované jeho krížovou reaktivitou s protilátkou nároku 10.
12. Potravinový výrobok, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa polypeptid podľa nárokov 1,2,3,4 alebo 11 pod podmienkou, že potravinovým výrobkom nie je mrkva.
13. Potravinový výrobok nároku 12, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že je vo » forme mrazených cukrárenských výrobkov alebo mrazenej zeleniny.
14. Spôsob výroby potravinových produktov, obsahujúcich mrazuvzdorný polypeptid podľa jedného alebo viacerých nárokov 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa kroky:

(a) pridávanie zmesi, obsahujúcej mrazuvzdorný polypeptid do potravinového produktu; alebo (b) in situ produkciu spomínaných mrazuvzdorných polypeptidov.
15. Použitie polypeptidu nárokov 1, 2, 3 alebo 4 na zvýšenie mrazovej tolerancie rastlín.
16. Mikroorganizmy, bunková línia alebo rastlina, ktoré sú schopné exprimovať polypeptid podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 4, pod podmienkou, že rastlinou nie je nemodifikovaná mrkvy.