CN108070022B - 一种海藻抗冻多肽浓缩液及其制备方法 - Google Patents
一种海藻抗冻多肽浓缩液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种海洋生物抗冻多肽浓缩液及其制备方法，属于食品加工技术领域，一种海洋生物抗冻多肽浓缩液由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液3~10重量份，海洋多糖1~10重量份，磷酸盐0.2~0.5重量份，去离子水30~100重量份；为抗冻多肽提供低成本新原料，提高抗冻多肽提取率，以达到产业化，拓宽应用领域。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种海藻抗冻多肽浓缩液及其制备方法。
背景技术
抗冻蛋白，也称“冰结构蛋白”，是一类附着在冰晶体表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性蛋白质。抗冻蛋白具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质。
目前对于抗冻蛋白的研究，大部分局限在深海鱼类，或其他罕见的植物内，由于其原料成本高，只能停留在实验室研究阶段，难以从中提取进行产业化应用。
据相关研究，有人通过转基因技术，将抗冻基因转移到细菌体内以获取抗冻蛋白，但还存在研究阶段，成本高，未能形成产业化。有人从鱼皮等下脚料产品中提取抗冻多肽，但提取率低也难以广泛应用，大部分提取的所谓抗冻多肽未必有抗冻活性。因此，亟须从低成本的原料中提取高含量的抗冻多肽，并能广泛应用于食品加工领域，乃至其他冷冻领域。
国内外关于鱼糜抗冻剂的研究主要集中在防止蛋白质的冷冻变性方面，通常可作为鱼糜蛋白抗冻剂的糖类物质主要有蔗糖、山梨醇、多聚葡萄糖等，其通过与蛋白结合，使蛋白处于饱和状态从而避免蛋白质之间的聚集变性。减少形成冰晶体的量，减缓蛋白质的相互聚集，进而防止蛋白的凝聚变性。工业上常采用的抗冻剂为4％蔗糖和4％山梨醇的混合物(称“商业抗冻剂”)，但因甜度和热量高，影响了鱼糜及其制品的口味和健康营养价值。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，为抗冻多肽提供低成本新原料，提高抗冻多肽提取率，以达到产业化，拓宽应用领域。
本发明另一个目的是提供一种海洋生物抗冻多肽浓缩液制备方法，同时分离出纯度较高的紫菜抗冻多肽氨基酸序列，弥补藻类或紫菜对抗冻多肽氨基酸序列研究的空白。
本发明技术方案是：
方案一：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，去离子水30～100重量份，百香果汁0.3～0.5重量份；
所述海洋多糖采用海藻多糖、壳聚糖中的一种或者两者任意混合；
所述紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30～45℃，烘干时间为23h；
步骤二：取步骤一得到的1重量份紫菜加入10重量份去离子水，后加入10重量份冰块，混匀打浆，再破碎处理3～5h后得到紫菜原浆；
步骤三：取1重量份步骤二中的紫菜原浆加入0.3～2重量份乙酸，温度为4℃～30℃，静置时间为12～24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后，取上层清液得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15～20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5～7.5，搅拌均匀后放入30℃～60℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为30～180分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10～25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3～5.4、温度为30℃～60℃、酶解时间为30～180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。
其中，所述海藻多糖采用褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉中的一种或者其中任意组合。
其中，所述铃磷酸盐采用三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酸式焦磷酸钠、焦磷酸二氢二钠中的一种或者其中任意组合。
方案二：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
将紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，百香果汁0.3～0.5重量份，溶解于30～100重量份的去离子水中，混合均匀，冷冻浓缩得到海洋生物抗冻多肽浓缩液成品。
方案三：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30～45℃，烘干时间为23h；
步骤二：取步骤一得到的1重量份紫菜加入10重量份去离子水，后加入10重量份冰块，混匀打浆，再破碎处理3～5h后得到紫菜原浆；
步骤三：取1重量份步骤二中的紫菜原浆加入0.3～2重量份乙酸，温度为4℃～30℃，静置时间为12～24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后，取上层清液得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15～20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5～7.5，搅拌均匀后放入30℃～60℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为30～180分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10～25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3～5.4、温度为30℃～60℃、酶解时间为30～180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液；
步骤八：将步骤七得到的紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，百香果汁0.3～0.5重量份，溶解于30～100重量份的去离子水中，混合均匀，冷冻浓缩得到海洋生物抗冻多肽浓缩液成品。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液包括以下两种或两种以上多肽的任
意组合；
SEQ ID NO1:AAAVCSAAAS；
SEQ ID NO2:LGCASLATPL；
SEQ ID NO3:LAGPTCPSPPV；
SEQ ID NO4:PVASAGAGT。
本发明的原理如下：
抗冻多肽的抗冻原理：抗冻多肽通过结构中疏水基团的疏水性和亲水基团的亲水性，来发挥抗冻活性的。在溶液体系结晶时，抗冻多肽分子会吸附在冰晶体表面，通过开尔文效应抑制冰晶体的继续生长。正常情况下，溶液结晶时，冰晶会沿着垂直于冰晶体表面的方向进行生长，在抗冻多肽存在情况下，它们会吸附在冰晶表面阻碍冰晶体的生长，导致其曲率增大，表面积增加。另外，冰晶体表面积的增加会迫使冰晶体系的平衡状态发生改变，从而使溶液冰点降低。所以要想继续生长，冰晶体必须在更低的温度下才能进行。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明从紫菜中提取抗冻多肽，为抗冻多肽提取提供低成本新原料，解决现有抗冻多肽成本高的问题。
2.本发明采用乙酸+中性蛋白酶+胃蛋白酶，提取抗冻多肽特殊工艺，在低温环境下提取，提高了抗冻多肽的活性和得率，适用于产业化发展。
3.本发明分离出纯度较高的紫菜抗冻多肽氨基酸序列，弥补藻类或紫菜对抗冻多肽氨基酸序列研究的空白。
4.本发明制备的海洋生物抗冻多肽浓缩液作为纯天然抗冻剂，改变现有食品加工领域非天然抗冻剂使用的现状。
5.本发明海洋生物抗冻多肽浓缩液利用壳聚糖的亲水性，与紫菜抗冻多肽复合使用，大幅度提高抗冻效率。磷酸盐与壳聚糖、紫菜抗冻多肽的协同作用，防止食物的反复冻融的同时，增加食物的凝胶保水作用，防止水分流失，食物干瘪，影响品质。
6.本发明的海洋生物抗冻多肽浓缩液采用磷酸盐在设置的数值范围内，提高抗冻效率的同时，不影响食品的安全。
7.本发明的制备方法中离心过滤大分子物质，能去除重金属等海洋中有害物质。
8.本发明配方中采用百香果汁中的超氧化物歧化酶(SOD)能减少液体环境中的自由基等有害成分，防止抗冻多肽有效成分被氧化而失去活性；其中含有的丁酸盐具有杀菌的功能，延长抗冻多肽的保质期，保证活性，其中的天然酶和复合有机酸选择性的进一步降解紫菜抗冻浓缩液中的大分子多肽，生成抗冻效果更强的小分子多肽。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，去离子水30～100重量份，百香果汁0.3～0.5重量份；
所述海洋多糖采用海藻多糖、壳聚糖中的一种或者两者任意混合；
所述紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30～45℃，烘干时间为23h，烘干至紫菜重量不再变化。
步骤二：取步骤一得到的1重量份紫菜加入10重量份去离子水，后加入10重量份冰块，混匀打浆，再破碎处理3～5h后得到紫菜原浆；
步骤三：取1重量份步骤二中的紫菜原浆加入0.3～2重量份乙酸，温度为4℃～30℃，静置时间为12～24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15～20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5～7.5，搅拌均匀后放入30℃～60℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为30～180分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10～25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3～5.4、温度为30℃～60℃、酶解时间为30～180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。紫菜抗冻浓缩液需要经过杀菌处理后，于-25℃～-18℃下保存备用。
优选的，所述海藻多糖包括褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉。
优选的，所述磷酸盐为三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酸式焦磷酸钠、焦磷酸二氢二钠中的一种或者两种任意组合。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液的有效多肽成分为以下多肽的两种
或两种以上的任意组合；
SEQ ID NO1:AAAVCSAAAS；
SEQ ID NO2:LGCASLATPL；
SEQ ID NO3:LAGPTCPSPPV；
SEQ ID NO4:PVASAGAGT。
每个序列中的氨基酸都有疏水基团和亲水基团，通过亲水和疏水的交
互作用，吸附于冰晶从而降低冰晶生产温度。
以上序列为紫菜抗冻浓缩液中有效抗冻活性最强的氨基酸序列。
实施例1：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液3重量份，海洋多糖5重量份，磷酸盐0.5重量份，去离子水30重量份，百香果汁0.3重量份；
其中紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为37℃，烘干时间为2h，烘干至紫菜重量不再变化。
步骤二：取步骤一中得到的紫菜0.1kg,分别加入去离子水1kg和冰块1kg，其中，冰块由去离子水冰冻而成，混匀打浆，超声破碎机处理3h后得到紫菜原浆；
步骤三：往步骤二中的紫菜原浆加入0.63kg乙酸，温度为15℃，(冬天水浴加热，夏天低温恒温槽冷却)静置24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min，分离7min后取上层清液，得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照17AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为7.0，搅拌均匀后放入30℃水浴锅或低温恒温槽中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理30分钟，后加热至100℃保持5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为4000r/min，分离7min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照20AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3、温度为50℃、酶解时间为100分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为5000r/min，分离10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。紫菜抗冻浓缩液需要经过杀菌处理后，于-25℃～-18℃下保存备用。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液的有效多肽成分为：
SEQ ID NO1:AAAVCSAAAS；
SEQ ID NO3：LAGPTCPSPPV；
以上序列为紫菜抗冻浓缩液中有效抗冻活性最强的氨基酸序列。
实施例2：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液5重量份，海洋多糖1重量份，磷酸盐0.2重量份，去离子水100重量份，百香果汁0.4重量份；
其中，紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为45℃，烘干时间为2.5h，烘干至紫菜重量不再变化。
步骤二：取步骤一得到的紫菜0.1kg,分别加入去离子水1kg和冰块1kg，其中，冰块由去离子水冰冻而成，混匀打浆，超声破碎机处理4h后得到紫菜原浆；
步骤三：往步骤二中的紫菜原浆加入2.4kg乙酸混匀分解，保持温度为24℃，(冬天水浴加热，夏天低温恒温槽冷却)静置时间18h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为4000r/min，分离10min后取上层清液，得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为7.5，搅拌均匀后放入50℃水浴锅或低温恒温槽中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理180分钟，后加热至100℃保持5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min，分离10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为4、温度为60℃、酶解时间为180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为4000r/min，分离5min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。紫菜抗冻浓缩液需要经过杀菌处理后，于-25℃～-18℃下保存备用下保存备用。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液的有效多肽成分为：
SEQ ID NO1:AAAVCSAAAS；
SEQ ID NO2:LGCASLATPL；
SEQ ID NO3:LAGPTCPSPPV；
SEQ ID NO4:PVASAGAGT。
以上序列为紫菜抗冻浓缩液中有效抗冻活性最强的氨基酸序列。
实施例3：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液10重量份，海洋多糖10重量份，磷酸盐0.5重量份，百香果汁0.5重量份，去离子水70重量份；
其中，紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30℃，烘干时间为3h，烘干至紫菜重量不再变化。
步骤二：取步骤一中得到的紫菜0.1kg,分别加入去离子水1kg和冰块1kg，其中，冰块由去离子水冰冻而成，混匀打浆，超声破碎机处理4h后得到紫菜原浆；
步骤三：往步骤二中的紫菜原浆加入4.2kg乙酸混匀分解，保持温度为30℃，(冬天水浴加热，夏天低温恒温槽冷却)静置时间12h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为5000r/min，分离5min后取上层清液，得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5，搅拌均匀后放入60℃水浴锅或低温恒温槽中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理100分钟，后加热至100℃保持5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为5000r/min，分离5min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为5.4、温度为30℃、酶解时间为180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min，分离7min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。紫菜抗冻浓缩液需要经过杀菌处理后，于-25℃～-18℃下保存备用。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液的有效多肽成分为：
SEQ ID NO2:LGCASLATPL；
SEQ ID NO4:PVASAGAGT。
以上序列为紫菜抗冻浓缩液中有效抗冻活性最强的氨基酸序列。
实施例4：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液3重量份，海洋多糖1重量份，磷酸盐0.2重量份，百香果汁0.3重量份，去离子水30重量份；
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30℃，烘干时间为2h，烘干至紫菜重量不再变化。
步骤二：取步骤一烘干后的紫菜0.1kg,分别加入去离子水1kg和冰块1kg，其中，冰块由去离子水冰冻而成，混匀后，用打浆机打成浆液，再使用超声破碎机处理3h后得到紫菜原浆；
步骤三：往步骤二中的紫菜原浆加入0.63kg乙酸混匀分解，温度为4℃，静置时间为12h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，3000r/min，分离5min后取上层清液，得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5，搅拌均匀后放入30℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为30分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min，分离5min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3、温度为30℃、酶解时间为30分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min，分离5min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。紫菜抗冻浓缩液需要经过杀菌处理后，于-25℃～-18℃下保存备用。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液的有效多肽成分为：
SEQ ID NO1:AAAVCSAAAS；
SEQ ID NO3:LAGPTCPSPPV；
以上序列为紫菜抗冻浓缩液中有效抗冻活性最强的氨基酸序列。
实施例5：
一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液10重量份，海洋多糖10重量份，磷酸盐0.5重量份，百香果汁0.5重量份，去离子水100重量份；
所述海洋多糖采用海藻多糖、壳聚糖中的一种或者两者任意混合；
所述紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为45℃，烘干时间为3h，烘干至紫菜重量不再变化。
步骤二：取步骤一烘干后的紫菜0.1kg,分别加入去离子水1kg和冰块1kg，其中，冰块由去离子水冰冻而成，混匀后，用打浆机打成浆液，再使用超声破碎机处理5h后得到紫菜原浆；
步骤三：往步骤二中的紫菜原浆加入4.2kg乙酸混匀分解，温度为4℃，静置时间为24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，5000r/min，分离10min后取上层清液，得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为7.5，搅拌均匀后放入60℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为180分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为5000r/min，分离10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为5.4、温度为60℃、酶解时间为180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为5000r/min，分离10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。紫菜抗冻浓缩液需要经过杀菌处理后，于-25℃～-18℃下保存备用。
进一步的，所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g左右新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
进一步的，所述的紫菜抗冻多肽浓缩液的有效多肽成分为：
SEQ ID NO3:LAGPTCPSPPV；
SEQ ID NO4:PVASAGAGT。
以上序列为紫菜抗冻浓缩液中有效抗冻活性最强的氨基酸序列。
实验数据
海洋生物多肽抗冻浓缩液抗冻活性的测定
将海洋生物多肽抗冻浓缩液样品(来源于实施例1、实施例2和实施例3的配方样品)配制成20mg/mL的水溶液。称的海洋生物多肽抗冻浓缩液密封于铝皿内，并置于DSC仪器内。当仪器充满液氮并稳定后，首先降温至-20℃保持5min，再升温至10℃保持5min，获得熔点Tm。接着，将样品降温至-20℃保持5min，然后缓慢升温至样品呈部分熔化状态，即到达其保留温度Th，保持15min，再将温度从Th降至-20℃。重复上述过程，在不同的Th条件下停留15min，分别记录不同Th时样品的起始结晶温度(T0)，按照公式THA＝Th-T0，计算热滞活性。以无抗冻活性的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作为对照。
实施例1样品测定结果如下：
当保留温度为-0.2℃，热滞活性最高0.28℃。实施例2样品测定结果如下：
| 温度/℃ | -0.60 | -0.50 | -0.40 | -0.30 |
| T<sub>h</sub>/℃ | -0.60 | -0.50 | -0.40 | -0.30 |
| T<sub>0</sub>/℃ | -0.66 | -0.6 | -0.64 | -0.51 |
| THA/℃ | 0.06 | 0.10 | 0.24 | 0.21 |
当保留温度为-0.4℃，热滞活性最高0.24℃。实施例3样品测定结果如下：
| 温度/℃ | -0.80 | -0.70 | -0.60 | -0.50 |
| T<sub>h</sub>/℃ | -0.80 | -0.70 | -0.60 | -0.50 |
| T<sub>0</sub>/℃ | -1.0 | -1.32 | -0.83 | -0.83 |
| THA/℃ | 0.20 | 0.62 | 0.23 | 0.33 |
当保留温度为-0.7℃，热滞活性最高0.62℃。实施例4样品测定结果如下：
| T<sub>h</sub>/℃ | -0.3 | -0.2 | -0.1 | 0 |
| T<sub>0</sub>/℃ | -0.3 | -0.2 | -0.1 | 0 |
| THA/℃ | -0.23 | -0.3 | -0.23 | -0.08 |
| T<sub>h</sub>/℃ | -0.07 | 0.1 | 0.13 | 0.08 |
当保留温度为-0.1℃，热滞活性最高0.13℃。
实施例5样品测定结果如下：
| 温度/℃ | -0.2 | -0.1 | 0 | 1 |
| Th/℃ | -0.2 | -0.1 | 0 | 1 |
| T0/℃ | -0.28 | -0.36 | -0.23 | -0.13 |
| THA/℃ | 0.08 | 0.26 | 0.23 | 1.13 |
当保留温度为-0.1℃，热滞活性最高0.26℃。
BSA对照样品测定结果如下：
| 温度/℃ | -0.25 | -0.15 | -0.07 | -0.05 |
| Th/℃ | -0.25 | -0.15 | -0.07 | -0.05 |
| T0/℃ | -0.26 | -0.14 | -0.06 | -0.05 |
| THA/℃ | 0.01 | -0.01 | -0.01 | 0.0 |
BSA的热滞活性基本为零，因此BSA可认定为无抗冻活性。
从实施例1样品、实施例2样品、实施例3样品、实施例4样品、实施例5样品的检测结果得出，实施例3的配方达到最高抗冻活性，最高0.62℃。无百香果汁热滞活性测定：
将实施例3的成分中移除百香果汁，做热滞活性对照试验测定结果如下：其中，保持保留温度不变：
当保留温度为0.7℃，热滞活性最高0.31℃。
对比实施例3的热滞活性结果如下：
| 温度/℃ | -0.80 | -0.70 | -0.60 | -0.50 |
| T<sub>h</sub>/℃ | -0.80 | -0.70 | -0.60 | -0.50 |
| T<sub>0</sub>/℃ | -1.0 | -1.32 | -0.83 | -0.83 |
| THA/℃ | 0.20 | 0.62 | 0.23 | 0.33 |
当保留温度为-0.7℃，热滞活性最高0.62℃。
因此，从上述结果可以看出，百香果汁作为提高影响抗冻活性的因素，可以将最高的热滞活性提高0.31℃，具有显著提高抗冻活性的显著效果。
Claims (7)
1.一种海洋生物抗冻多肽浓缩液，其特征在于：
由以下组分按照以下重量配比配制而成：紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，去离子水30～100重量份、百香果汁0.3～0.5重量份；
所述海洋多糖采用海藻多糖、壳聚糖中的一种或者两者任意混合；
所述紫菜抗冻浓缩液通过以下步骤制备而成：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30～45℃，烘干时间为23h；
步骤二：取步骤一得到的1重量份紫菜加入10重量份去离子水，后加入10重量份冰块，混匀打浆，再破碎处理3～5h后得到紫菜原浆；
步骤三：取1重量份步骤二中的紫菜原浆加入0.3～2重量份乙酸，温度为4℃～30℃，静置时间为12～24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后，取上层清液得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15～20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5～7.5，搅拌均匀后放入30℃～60℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为30～180分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10～25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3～5.4、温度为30℃～60℃、酶解时间为30～180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液。
2.根据权利要求1所述海洋生物抗冻多肽浓缩液，其特征在于：
所述海藻多糖采用褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉中的一种或者其中任意组合。
3.根据权利要求1或2所述海洋生物抗冻多肽浓缩液，其特征在于：所述磷酸盐采用三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酸式焦磷酸钠、焦磷酸二氢二钠中的一种或者其中任意组合。
4.根据权利要求1所述海洋生物抗冻多肽浓缩液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，百香果汁0.3～0.5重量份，溶解于30～100重量份的去离子水中，混合均匀，冷冻浓缩得到海洋生物抗冻多肽浓缩液成品。
5.一种海洋生物抗冻多肽浓缩液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：将干紫菜烘干，烘干温度为30～45℃，烘干时间为23h；
步骤二：取步骤一得到的1重量份紫菜加入10重量份去离子水，后加入10重量份冰块，混匀打浆，再破碎处理3～5h后得到紫菜原浆；
步骤三：取1重量份步骤二中的紫菜原浆加入0.3～2重量份乙酸，温度为4℃～30℃，静置时间为12～24h，得到紫菜分解液；
步骤四：将步骤三中的紫菜分解液送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后，取上层清液得到紫菜上清液；
步骤五：将中性蛋白酶按照15～20AU/kg反应液比例加入到步骤四中得到的紫菜上清液中混合，调整pH值为6.5～7.5，搅拌均匀后放入30℃～60℃水浴锅中，每隔10分钟搅拌一次，酶解处理时间为30～180分钟；后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽提取原液；
步骤六：将步骤五中得到的粗抗冻多肽原液，按照10～25AU/kg反应液加入胃蛋白酶进行二次酶解，调整反应条件为pH为3～5.4、温度为30℃～60℃、酶解时间为30～180分钟，后100℃加热5分钟灭活处理，送入离心机，调整离心机的转速为3000r/min～5000r/min，分离5～10min后取上层清液，得到粗抗冻多肽二次酶解液；
步骤七：将粗抗冻多肽二次酶解液用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤得到超滤滤液，将超滤滤液用截留分子量为300Da的超滤膜超滤得到紫菜抗冻浓缩液；
步骤八：将步骤七得到的紫菜抗冻浓缩液3～10重量份，海洋多糖1～10重量份，磷酸盐0.2～0.5重量份，百香果汁0.3～0.5重量份，溶解于30～100重量份的去离子水中，混合均匀，冷冻浓缩得到海洋生物抗冻多肽浓缩液成品。
6.根据权利要求1、2、4或5任意一种海洋生物抗冻多肽浓缩液的制备方法，其特征在于：
所述百香果汁的采集方法如下：
(1)挑选重量为50g±3g新鲜成熟的百香果；
(2)洗净、晾干，百香果用清水进行冲洗，晾干水；
(3)将果实剖开，挖出果肉；
(4)将果肉连着果籽搅碎成品。
7.根据权利要求1、4或5任意一项所述的海洋生物抗冻多肽浓缩液，其特征在于：包括以下两种或两种以上多肽的任意组合；
SEQ ID NO1:AAAVCSAAAS；
SEQ ID NO2:LGCASLATPL；
SEQ ID NO3:LAGPTCPSPPV；
SEQ ID NO4:PVASAGAGT。
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