CN108220262A - 一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其在海产品保鲜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程领域，具体是一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其在海产品保鲜中的应用。该酶产自海洋Penicillium crustosum（GenBank登录号MG983981）。其应用在海产品保鲜中，保鲜方法为将需要保鲜的海产品先在海洋低温葡萄糖氧化酶溶液和葡萄糖溶液的混合液中浸渍2~20 min，浸渍后再置于保鲜盒中低温保鲜；其中海洋低温葡萄糖氧化酶溶液的浓度为10~60 mg/L，葡萄糖溶液的浓度为1~15 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~3。本发明低温葡萄糖氧化酶在低温条件下，除氧更高效，能够有效防止蛋白质、脂肪等营养成分的氧化，替代了存在安全隐患的化学保鲜。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体是一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其在海产品保鲜中的应用。
背景技术
近年来海产品以富含蛋白和不饱和脂肪酸等独特营养成分而受追捧。我国海域辽阔，拥有丰富海洋资源，海产品的生产将创造巨大经济财富。但海产品因蛋白和水分含量高，存在大量细菌，捕捞出水后极易腐烂变质，影响加工、运输、销售和保存。因此海产品捕捞后应及时采取保鲜措施，以减少营养的消耗和产品的腐烂变质。
目前，海产品保鲜常用方法包括低温保鲜、化学保鲜等。单纯的低温保鲜会造成海产品口感的变化。化学保鲜利用化学制剂作为保鲜剂，但往往会造成化学药物残留。随着化学保鲜引起的安全问题日益严重，生物保鲜因其天然、安全的特点而逐渐被广泛利用。
葡萄糖氧化酶作为一种新型食品添加剂，具有绿色、安全、无污染等特点。用于海产品保鲜，一方面可以氧化葡萄糖产生葡萄糖酸，降低海产品表面pH值，达到抑菌的目的；另一方面，氧气的除去，可以抑制微生物的生长，并且防止脂肪等营养成分氧化。葡萄糖氧化酶的添加，可保持海产品的色、香、味，提供更高的营养价值。但是在低温条件下，葡萄糖氧化酶活性低，保鲜效果不佳。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种海洋低温葡萄糖氧化酶，本发明还提供了海洋低温葡萄糖氧化酶的制备方法及其在海产品保鲜中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种海洋低温葡萄糖氧化酶，所述海洋低温葡萄糖氧化酶产自海洋Penicillium crustosum，（GenBank登录号MG983981）。
上述海洋低温葡萄糖氧化酶的制备方法，所述方法具体如下：
制备过程为Penicillium crustosum接种于发酵培养基，经发酵培养，获得发酵液，过滤菌体后8000r/min 离心20min，硫酸铵盐析过夜，离心，沉淀使用缓冲液复溶后超滤，过葡聚糖层析柱，获得纯酶液。
上述制备方法中，发酵培养基为1-10% 葡萄糖、0.1-3.0% 胰蛋白胨、0.1-2.0%NaNO3、0.1-0.3% FeSO4、0.1-0.5% MgSO4、0.1-1.0% KH2PO4，发酵条件为15-25℃、140-200r/min；硫酸铵浓度为75%，离心条件为12000 r/min离心10 min；超滤条件为截留量为100 kDa的超滤管，5000 r/min超滤10 min；缓冲液为1 mol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液，柱层析填料为Sephadex G-100。
上述海洋低温葡萄糖氧化酶应用在海产品保鲜中。
具体地，所述海产品为对虾，带鱼。
上述海洋低温葡萄糖氧化酶用于海产品保鲜的保鲜方法为：
将需要保鲜的海产品先在海洋低温葡萄糖氧化酶溶液和葡萄糖溶液的混合液中浸渍2~20 min，浸渍后再置于保鲜盒中低温保鲜；其中海洋低温葡萄糖氧化酶溶液的浓度为10~60 mg/L，葡萄糖溶液的浓度为1~15 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~3。
进一步地，需要保鲜的海产品为对虾时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为10~40mg/L，葡萄糖溶液的浓度为1~10mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~2，浸渍时间为2~10 min。
优选地，对虾冷藏保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为20 mg/L，葡萄糖溶液的浓度为5 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1，浸渍时间为4 min；对虾冷冻保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为15 mg/L，葡萄糖溶液的浓度为4 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1.5，浸渍时间为6 min。
进一步地，需要保鲜的海产品为带鱼时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为20~60mg/L，葡萄糖溶液的浓度为2~15 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~3，浸渍时间为4~20 min。
优选地，带鱼冷藏保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为35 mg/L，葡萄糖溶液浓度为8 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶和葡萄糖溶液混合的体积比为1:2，浸渍时间为8min；带鱼冷冻保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为30 mg/L，葡萄糖溶液的浓度为6mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1.5，带鱼浸渍时间为10min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：与现有海产品保鲜所用葡萄糖氧化酶相比，本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶为首次于Penicillium crustosum中制备并用于海产品保鲜，属于海洋低温酶，在低温条件下有较高的催化活性，热敏感，可保证低温条件下的高效催化效率和中高温条件下的迅速失活。与现有的葡萄糖氧化酶相比，本发明低温葡萄糖氧化酶在低温条件下，除氧更高效，能够有效防止蛋白质、脂肪等营养成分的氧化。应用于海产品保鲜时，本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶可替代存在安全隐患的化学保鲜。与葡萄糖配制浸渍所用混合液时，酶用量低，成本花费低，结合低温保鲜，可改善低温保鲜对产品口感上的影响，多重保持海产品的鲜味，提高营养价值。
附图说明
图1 为SDS-PAGE电泳和酶谱试验结果图；A为SDS-PAGE电泳图，B为酶谱图；
图2 温度对本发明海洋低温葡萄糖氧化酶酶活的影响。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶是胞外酶，来源于Penicillium crustosum，制备方法如下：
步骤1，Penicillium crustosum接种于发酵培养基（10% 葡萄糖、0.5% 胰蛋白胨、0.01% NaNO3、0.2% FeSO4、0.2% MgSO4、0.4% KH2PO4），20℃、160 r/min发酵培养24 h，收集发酵液，检测酶活为40 U/mL，使用新华1号滤纸过滤，除去青霉菌球与菌丝；
步骤2，收集步骤1中滤液，8000 r/min离心20 min，除去孢子沉淀，保留上清液；
步骤3， 步骤2得到的上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵最终浓度达到75%，4℃盐析12 h；
步骤4，盐析后的发酵液，12000 r/min离心10 min，除去上清，得到沉淀；
步骤5，盐析沉淀加入1 mol/L pH 7.0的磷酸钠盐缓冲液复溶，获得粗酶液；
步骤6，粗酶液使用100 kDa截留量的超滤管，4℃，5000 r/min离心10 min，留取上层管中蛋白液；
步骤7：蛋白液于4℃过Sephadex G-100层析柱，检测酶活，收集纯酶溶液，酶活为430U/mL，比活力为570 U/mg；
步骤8：纯酶液进行10% SDS-PAGE电泳和酶谱试验，检测分离纯化效果及酶分子量。如附图1A中SDS-PAGE结果所示，M泳道为蛋白Maker，0泳道为缓冲液，1泳道为经上述纯化步骤获得葡萄糖氧化酶纯酶，该酶单体分子大小约为17 kDa，图1B酶谱试验结果中，M泳道为蛋白Maker，Z1泳道为葡萄糖氧化酶纯酶，结果显示该酶大小约为95 kDa，结合两者结果表明，不同于已报道的葡萄糖氧化酶都为二聚体，菌株Penicillium crustosum所产葡萄糖氧化酶为五聚体，是一种新型低温葡萄糖氧化酶。
实施例2
温度对本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶的影响：
步骤1，以实施例1中所述纯酶液，配制10 U/mL的酶溶液；
步骤2，最适反应温度的测定，取酶液、底物溶液分别于0℃、4℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃温度下水浴5 min，将底物溶液加入酶液反应，测定酶活性；底物溶液为葡萄糖、邻联茴香胺、辣根过氧化物酶；
步骤3，不同温度下酶的稳定性测定，步骤2所述温度下水浴60 min，将底物溶液加入酶液反应，测定酶活性，以步骤2中相应温度酶活为100%，计算各温度下的相对酶活。
如附图中所示，本发明海洋低温葡萄糖氧化酶催化反应的最适温度为25℃，高于35℃时酶活迅速降低；在不同温度下，该酶的稳定性显示处理60 min后，在0℃时保留有近50%的酶活，热不稳定，这些性质表明该酶为典型低温酶，在海产品低温保鲜中有潜在应用价值。
实施例3
海洋低温葡萄糖氧化酶应用在对虾保藏中，保鲜方法如下：
步骤1，选用新鲜对虾，清水洗净；
步骤2，将干净对虾在海洋低温葡萄糖氧化酶和葡萄糖的混合液中浸渍一段时间；海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为20 mg/L，葡萄糖溶液浓度为5 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液两者混合比例为1:1，对虾浸渍时间为4 min；
步骤3，在筛绢上滤去对虾上多余混合液；
步骤4，置于保鲜盒中，4℃冷藏保存。
实施例4
海洋低温葡萄糖氧化酶应用在对虾冷冻保鲜中，保鲜方法如下：
步骤1，选用新鲜对虾，清水洗净后；
步骤2，将干净对虾在葡萄糖氧化酶和葡萄糖的混合液中浸渍一段时间；
葡萄糖氧化酶溶液浓度为15 mg/L，葡萄糖溶液浓度4 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液两者混合比例为1:1.5，对虾浸渍时间为6 min；
步骤3，在筛绢上滤去对虾上多余混合液；
步骤4，置于保鲜盒中，-18℃冷冻保存。
实施例5
海洋低温葡萄糖氧化酶应用在带鱼冷藏保鲜中，保鲜方法如下：
步骤1，选用新鲜带鱼，清水冲洗后；
步骤2，将干净带鱼在葡萄糖氧化酶和葡萄糖的混合液中浸渍一段时间；葡萄糖氧化酶溶液浓度为35 mg/L，葡萄糖溶液浓度为8 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液两者混合比例为1:2，带鱼浸渍时间为8 min。
步骤3，在筛绢上滤去对带鱼外表多余的混合液；
步骤4，置于保鲜盒中，4℃冷藏保存。
实施例6
海洋低温葡萄糖氧化酶应用在带鱼冷冻保鲜中，保鲜方法如下：
步骤1，选用新鲜带鱼，清水冲洗后；
步骤2，将干净带鱼在葡萄糖氧化酶和葡萄糖的混合液中浸渍一段时间；
葡萄糖氧化酶溶液浓度为30 mg/L，葡萄糖溶液浓度为6 mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液两者混合比例为1:1.5，带鱼浸渍时间为10 min；
步骤3，在筛绢上滤去对带鱼外表多余的混合液；
步骤4，置于保鲜盒中，-18℃冷冻保存。
实施例7
本发明海洋低温葡萄糖氧化酶在对虾冷藏保鲜中，对对虾品质的影响：
按照实施例3，对对虾进行保藏，48 h后取出，测定细菌总数和游离氨基酸含量，并根据GB5009.45-85规定对保鲜效果进行感官评价。结果见表1。
表1
实施例8
本发明海洋低温葡萄糖氧化酶在带鱼冷藏保鲜中，对带鱼品质的影响：
按照实施例5，对带鱼进行保藏，48 h后取出，测定细菌总数和游离氨基酸含量，并根据SC/T 3102-2010规定对保鲜效果进行感官评价。结果见表2。
表2
综上所述，本发明海洋低温葡萄糖氧化酶在低温条件下催化效率高，对热敏感，中高温处理即可迅速失活，可有效用于海产品低温保鲜。在海产品保鲜中应用时，海产品低温保鲜前在低温葡萄糖氧化酶溶液中浸渍，能够在后续保鲜过程中抑制微生物的繁殖，除氧，防止脂肪等物质的变质，保留蛋白，维持组织弹性。说明本发明海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中有潜在应用价值。
以上所述，仅为本发明专利优选的实施例，但本发明专利的保护范围并不限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种海洋低温葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述海洋低温葡萄糖氧化酶产自海洋Penicillium crustosum（GenBank登录号MG983981）。
2.权利要求1所述海洋低温葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，所述方法具体如下：
将Penicillium crustosum接种于发酵培养基，发酵培养获得发酵液，过滤菌体后8000r/min 离心20min，硫酸铵盐析过夜，离心，沉淀使用缓冲液复溶后超滤，过葡聚糖层析柱，获得纯酶液。
3.如权利要求2所述的海洋低温葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，发酵培养基为1-10% 葡萄糖、0.1-3.0% 胰蛋白胨、0.1-2.0% NaNO3、0.1-0.3% FeSO4、0.1-0.5% MgSO4、0.1-1.0% KH2PO4，发酵条件为15-25℃、140-200r/min；硫酸铵浓度为75%，离心条件为12000r/min离心10min；超滤条件为截留量为100kDa的超滤管，5000r/min超滤10min；缓冲液为1 mol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液，柱层析填料为Sephadex G-100。
4.如权利要求1所述的海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用。
5.如权利要求4所述的海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用，其特征在于，所述海产品为对虾，带鱼。
6.如权利要求4或5所述的海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用，其特征在于，保鲜的方法具体如下：
将需要保鲜的海产品先在海洋低温葡萄糖氧化酶溶液和葡萄糖溶液的混合液中浸渍2~20min，浸渍后再置于保鲜盒中低温保鲜；其中海洋低温葡萄糖氧化酶溶液的浓度为10~60mg/L，葡萄糖溶液的浓度为1~15mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~3。
7.如权利要求6所述的海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用，其特征在于，需要保鲜的海产品为对虾时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为10~40mg/L，葡萄糖溶液的浓度为1~10mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~2，浸渍时间为2~10min。
8.如权利要求7所述的海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用，其特征在于，对虾冷藏保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为20 mg/L，葡萄糖溶液的浓度为5mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1，浸渍时间为4min；对虾冷冻保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为15mg/L，葡萄糖溶液的浓度为4mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1.5，浸渍时间为6 min。
9.如权利要求6所述的海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用，其特征在于，需要保鲜的海产品为带鱼时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为20~60mg/L，葡萄糖溶液的浓度为2~15mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1~3，浸渍时间为4~20min。
10.如权利要求9所述的海海洋低温葡萄糖氧化酶在海产品保鲜中的应用，其特征在于，带鱼冷藏保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为35mg/L，葡萄糖溶液浓度为8mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶和葡萄糖溶液混合的体积比为1:2，浸渍时间为8min；带鱼冷冻保存时，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液浓度为30mg/L，葡萄糖溶液的浓度为6mg/L，海洋低温葡萄糖氧化酶溶液与葡萄糖溶液混合的体积比为1:1.5，带鱼浸渍时间为10min。
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