CN109234165A - 一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法 - Google Patents

一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌菌种的分离方法，特别是涉及一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法。在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入9‑11重量份的MRS液体培养基中在28℃培养10‑14小时得培养液，取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10‑5、10‑6、10‑7或10‑8的稀释菌液，将稀释菌液分别涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养48‑96小时，挑取有透明圈的单菌落进行纯化、产酸、鉴定、低温驯化得乳酸菌菌种。它以冬季自然发酵酸菜液为原料，分离的耐低温乳酸菌菌种可以在较低温度下生长，利用本发明分离出的乳酸菌取代防腐剂，可缩短酸菜生产周期、大大降低能耗、降低生产成本，使制得的酸菜更加营养、健康、美味。

Description

一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌菌种的分离方法，特别是涉及一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法。
背景技术
酸菜是反映我国饮食文化特征的代表食品，已传承千年之久，但真正的发展是在二十世纪九十年代，酸菜的产业从一家一户用酸菜缸腌制逐步走向了工厂化生产，四季食用。目前酸菜工业化生产主要采用两种发酵方式，其中绝大部分生产企业采用自然发酵，只有少部分企业采用人工接种发酵。
采取自然发酵生产的酸菜，相对来说工艺简单，但是在发酵过程中除了乳酸菌外还有许多酵母菌等其他微生物同时繁殖生长，加工过程中，为了防止涨袋只能人为添加防腐剂，产品质量无法保证，对酸菜产业发展极其不利。
采用人工接种乳酸菌生产酸菜，可明显缩短酸菜的发酵周期，充分发酵后，不需要添加任何防腐剂，同时，乳酸菌也赋予了酸菜丰富的营养和良好的风味，产品外观非常好，但是目前酸菜生产应用的乳酸菌菌种适宜的发酵温度是20-28℃，低于15℃乳酸菌生长受抑制，在东北冬季采用人工接种乳酸菌生产酸菜，为充分发挥乳酸菌菌种优势，必须人为提高生产环境温度，致使能源消耗大，生产成本高。
低温乳酸菌是指在较低温度环境下依然能够正常生长繁殖的一类乳酸菌，但是其优势生长温度一般都超过20℃，多数属于兼性低温乳酸菌，或称耐冷乳酸菌。对于低温乳酸菌，国外的研究主要集中在利用分子生态学与传统培养相结合的手段开发低温乳酸菌将其作为生物保护剂或接种剂，而国内在这两方面的研究鲜有报道。已有的研究多集中于低温冷藏肉及低温青贮饲料等方面，尚未见到针对酸菜的耐低温乳酸菌菌种的选育与研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，它以冬季自然发酵酸菜液为原料，分离的耐低温乳酸菌菌种可以在较低温度下生长，对于采取自然发酵生产酸菜利用本发明分离出的乳酸菌取代防腐剂，可缩短酸菜生产周期，使酸菜更加营养、健康、安全、美味；应用本发明分离的乳酸菌可以大大降低能耗，降低生产成本。
为了实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入9-11重量份的MRS液体培养基中在28℃培养10-14小时得培养液，取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-5、10-6、10-7或10-8的稀释菌液，将稀释菌液分别涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养48-96小时，挑取有透明圈的单菌落进行纯化、产酸、鉴定、低温驯化得耐低温的乳酸菌菌种。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
上述的纯化是将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次。
上述的产酸是将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养36-48小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株。
上述的鉴定是指疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为乳酸菌菌种。
上述的低温驯化是将鉴定后的乳酸菌菌种通过逐步降低温度的方法进行培养得驯化后乳酸菌。
上述的逐步降低温度方法进行培养是将驯化后乳酸菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时。
由于采用上述技术方案，使得本发明具有如下优点效果：
1. 本发明以冬季低温发酵的酸菜液为原料分离得到的乳酸菌，其耐低温能力较强。
2. 本发明在分离前，利用适合乳酸菌生长的培养基对酸菜发酵液进行培养，可以增强乳酸菌的活力，而不利于酸菜液中其他菌的生长，提高了分离的准确性，针对性强。
3. 本发明依据乳酸菌产酸的原理，在鉴定前先进行产酸，可以直接淘汰掉一些不产酸和产酸差的菌种，可以减少后期鉴定的工作量。
4. 本发明通过低温驯化使其得到的乳酸菌菌种更能适应低温环境。
5. 通过酸菜发酵得到的乳酸菌菌种，不仅可以在低温环境中生长，而且接种白菜后生产出的酸菜品质优良。
本发明以冬季自然发酵酸菜液为原料，分离的耐低温乳酸菌菌种可以在较低温度下生长，对于采取自然发酵生产酸菜利用本发明分离出的乳酸菌取代防腐剂，可缩短酸菜生产周期，使酸菜更加营养、健康、安全、美味；应用本发明分离的乳酸菌可以大大降低能耗，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是来限制本发明的范围，根据本发明权利要求中限定的实质和范围所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入9重量份的MRS液体培养基中在28℃培养10小时得培养液；取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-5的稀释菌液；将稀释菌液涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养48小时，挑取有透明圈的单菌落；将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次；将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养36小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株；疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为乳酸链球菌；将鉴定后的乳酸链球菌通过逐步降低温度的方法进行培养，具体是将乳酸链球菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时得耐低温的乳酸菌菌种。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
将本实施分离的耐低温乳酸菌菌种在10℃环境条件下，接种在白菜上密闭发酵23天后，制得酸菜。所得到的酸菜酸香浓郁，质地脆嫩，色泽淡黄有光泽。
实施例2
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入11重量份的MRS液体培养基中在28℃培养14小时得培养液；取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-8的稀释菌液；将稀释菌液涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养96小时，挑取有透明圈的单菌落；将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次；将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养48小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株；疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为植物乳杆菌；将鉴定后的植物乳杆菌通过逐步降低温度的方法进行培养，具体是将植物乳杆菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时得耐低温的乳酸菌菌株。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
将本实施分离的耐低温乳酸菌菌种在12℃环境条件下，接种在白菜上密闭发酵20天后，制得酸菜。所得到的酸菜酸香浓郁，质地脆嫩，色泽淡黄有光泽。
实施例3
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入10重量份的MRS液体培养基中在28℃培养12小时得培养液；取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-5、10-6、10-7或10-8的稀释菌液；将稀释菌液涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养72小时，挑取有透明圈的单菌落；将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次；将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养40小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株；疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为乳酸链球菌；将鉴定后的乳酸链球菌通过逐步降低温度的方法进行培养，具体是将乳酸链球菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时得耐低温的乳酸菌菌种。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
将本实施分离的耐低温乳酸菌菌种在9℃环境条件下，接种在白菜上密闭发酵20天后，制得酸菜。所得到的酸菜酸香浓郁，质地脆嫩，色泽淡黄有光泽。
实施例4
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入10.5重量份的MRS液体培养基中在28℃培养13小时得培养液；取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-5、10-6、10-7或10-8的稀释菌液；将稀释菌液涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养85小时，挑取有透明圈的单菌落；将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次；将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养44小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株；疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为乳酸链球菌；将鉴定后的乳酸链球菌通过逐步降低温度的方法进行培养，具体是将乳酸链球菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时得耐低温的乳酸菌菌种。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
将本实施分离的耐低温乳酸菌菌种在10.5℃环境条件下，接种在白菜上密闭发酵22天后，制得酸菜。所得到的酸菜酸香浓郁，质地脆嫩，色泽淡黄有光泽。
实施例5
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入9.5重量份的MRS液体培养基中在28℃培养11小时得培养液；取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-6的稀释菌液；将稀释菌液涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养55小时，挑取有透明圈的单菌落；将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次；将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养40小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株；疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为短乳杆菌；将鉴定后的短乳杆菌通过逐步降低温度的方法进行培养，具体是将乳酸链球菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时得耐低温的乳酸菌菌种。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
将本实施分离的耐低温乳酸菌菌种在10℃环境条件下，接种在白菜上密闭发酵20天后，制得酸菜。所得到的酸菜酸香浓郁，质地脆嫩，色泽淡黄有光泽。
实施例6
一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入10重量份的MRS液体培养基中在28℃培养12小时得培养液；取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-6的稀释菌液；将稀释菌液涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养72小时，挑取有透明圈的单菌落；将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次；将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养36小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株；疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为植物乳杆菌；将鉴定后的植物乳杆菌通过逐步降低温度的方法进行培养，具体是将植物乳杆菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时得耐低温的乳酸菌菌种。
上述自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
将本实施分离的耐低温乳酸菌菌种在10℃环境条件下，接种在白菜上密闭发酵19天后，制得酸菜。所得到的酸菜酸香浓郁，质地脆嫩，色泽淡黄有光泽。
下面对本发明实施例1、2、3、4、5、6所得到的菌种与现有菌种以及空白对照进行对比试验进一步说明本发明的特点。
试验方法如下：
本试验设三个处理：以本发明所施例1、2、3、4、5、6得到的耐低温乳酸菌菌种与目前生产上常用的乳酸菌菌种接种于白菜中，同时设一个不接种空白对照，在10℃温度条件下密闭发酵25天后，分别测定酸菜的亚硝酸盐含量及PH值，并对酸菜产品进行感官评价。试验结果如下表：
从以上结果可以看出：在10℃温度条件下密闭发酵25天后，利用耐低温乳酸菌菌种接种发酵酸菜与目前生产上常用的乳酸菌菌种相比，乳酸菌生长繁殖较快，产酸量大，亚硝酸盐降解情况良好，酸菜发酵程度明显优于后者。不接种的空白对照与接种发酵的酸菜相比亚硝酸盐含量和PH值明显较高，酸菜的感官品质较差。

Claims (7)

1.一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于步骤如下：在无菌条件下取1重量份自然发酵的酸菜发酵液接入9-11重量份的MRS液体培养基中在28℃培养10-14小时得培养液，取培养液加入到无菌生理盐水中通过梯度稀释法将其稀释至10-5、10-6、10-7或10-8的稀释菌液，将稀释菌液分别涂布在MRS和M17平板培养基上，经28℃恒温培养48-96小时，挑取有透明圈的单菌落进行纯化、产酸、鉴定、低温驯化得耐低温的乳酸菌菌种。
2.根据权利要求1所述的一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于所述的自然发酵的酸菜发酵液在制备时白菜入酸菜缸的过程中除了盐和水不添加任何其他物质，发酵酸菜的温度在15℃以下。
3.根据权利要求1所述的一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于所述的纯化是将有透明圈的单菌落以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次。
4.根据权利要求1所述的一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于所述的产酸是将纯化后的菌种接种到MRS液体培养基中，经28℃恒温培养36-48小时后，测定其PH值，将PH值高于4的菌株淘汰掉，得疑似乳酸菌株。
5.根据权利要求1所述的一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于所述的鉴定是指疑似乳酸菌株通过糖发酵实验和DNA测序确定其为乳酸菌菌种。
6.根据权利要求1所述的一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于所述的低温驯化是将鉴定后的乳酸菌菌种通过逐步降低温度方法进行培养得驯化后乳酸菌。
7.根据权利要求6所述的一种耐低温酸菜乳酸菌菌种的分离方法，其特征在于所述的逐步降低温度方法进行培养是将驯化后乳酸菌在15℃、13℃、11℃各培养2小时，然后在9℃继续培养10小时。
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