MXPA99000952A - Producto alimenticio congelado que contiene proteina anticongelante estable al calor - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para la recuperación de AFP de fuentes naturales, tal proceso implica las etapas de:I.a aislar un jugo que contiene AFP de la fuente natural y después tratar con calor del jugo a una temperatura de por lo menos 60ºC;o I.b tratar con calor una fuente natural a una temperatura de por lo menos 60ºC seguido por aislamiento de un jugo que contiene AFP de la fuente natural;II. remover la fracción insoluble, por lo que la etapa I.a o I.b se presenta antes de la etapa II.Los AFP en los que el tamaño de cristal de hielo de una composición del AFP en agua después de una rápida congelación a -40ºC seguido por almacenamiento a -6ºC durante 1 hora es de 15 um o menos. Un organismo transformado capaz de expresar por lo menos uno de los AFP. Un producto de confitería congelado, caracterizado porque comprende uno o más AFPs derivados de plantas, en donde los AFPs en una composición acuosa tienen un tamaño de cristal de hielo después del congelamiento rápido a -40ºC seguido por el almacenamiento a -6ºC durante una hora, de menos de 15 um.

Description

PRODUCTO .ALIMENTICIO CONGELADO QUE CONTIENE PROTEINA ANTICONGELANTE ESTABLE AL CALOR Campo Técnico de la Invención La invención se relaciona a un proceso para el aislamiento de proteínas an ti conge 1 ant e s (AFP) y un producto alimenticio congelado que contiene AFP.

Antecedentes de la Invención Las proteínas ant i conge 1 ant e s (AFP) han sido sugeridas para mejorar la tolerancia congelante de productos alimenticios. Para el propósito de la invención, el término AFP tiene un significado bien conocido en la técnica, principalmente son aquellas proteínas que exhiben la actividad de inhibir el crecimiento de cristales de hielo. Véase por ejemplo US 5,118,792. WO 90/13571 describe péptidos ant i conge 1 ant e s producidos químicamente o a través de técnicas de ADN recombinantes. Los AFP convenientemente pueden ser usados en productos alimenticios. El Ejemplo 3B muestra formas de cristal de hielo modificadas si se congela una mezcla de agua-hielo de una película en combinación con 0.01% en peso de AFP.

WO 92/22581 describe AFP de plantas que pueden ser usadas para controlar la forma de cristal de hielo en helados. Este documento también describe un proceso para extraer una composición de polipéptido de espacios ex t ra c elul ar e s de plantas infiltrando hojas con un medio de extracción sin romper las plantas. WO 94/03617 describe la producción de AFP a partir de levadura y su posible uso en helados. WO 96/11586 describe AFP de pescado producido a través de microbios. Varios lugares en la literatura también mencionan el aislamiento y/o el uso de proteínas de planta para cr i opr s t e ce i ón . Las proteínas c r i op r o t e c t o r a s tienen una función en la protección de las membranas de la planta contra el daño por heladas. Sin embargo, estas proteínas no poseen propiedades de inhibición de r e cr i s t ali z a ción y son, por lo tanto, no abarcadas dentro de los términos de AFP. Hincha en Journal of Plant Physiology 1992, 140, 236-240 describe el aislamiento de proteínas c r i opr o t e c t or a s de la col.

Volger en Biochimica et Biiophysica Acta, 412 (1975) , 335-349 describe el aislamiento de proteínas de hoja c ri o r o t e c t or a s de la espinaca. Boothe en Plant Physiol (1995) , 108: 759-803 describe el aislamiento de proteínas de Brassica napus. Nuevamente, estas proteínas se cree que son proteínas c r i op ro t e c t or a s en lugar de AFP. N e-ven en Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993 describe la caracteriz ción de ADN de una proteina cr i opr ote c tora de espinaca. Salzman en Abstracts and Reviews of the 18th Annüal Meeting of the ASEV/Eastern Section in Am. J. Enol. Vitic, Vol. 44, No. 4, 1993 describe la presencia de polipéptidos estables a la ebullición en brotes de Vitis. Aunque las proteínas son análogas a péptidos ant i conge 1 ant e s de pescado, son proteínas c r i opr o t e c t or as y no AFP. Lin en Biochemical and Biophysical Research Communi ca t i on , Vol. 183, No. 3, 1992, páginas 1103-1108, y en Lin, Plant Physiology (1992) 99, 519- 525, describe el polipéptido cri op ro t ec t o r de 15 kDa de Arabidopsis Hakaira. Houde en The Plant Journal (1995) 8(4) , 583-593 menciona proteínas cr i opr o t e c t or as de trigo.

Además, como se ilustra en el Ejemplo VIII, los extractos . de col, espinaca, Brassica napus y Arabidopsis no tienen proteínas de inhibición de cristalización después del calentamiento. Sin embargo, hasta ahora el uso de AFP no ha sido aplicado a productos alimenticios comercialmente disponibles. Una razón de esto es los altos costos y procesos complicados para obtener AFP. Otra razón es que los AFP que ahora han sido sugeridos para usarse en productos alimenticios congelados, no pueden ser incorporados en la mezcla de formulación estándar, ya que tienden a de s e s t abil i z a r s e durante el procesamiento, especialmente durante el paso de pasteurización. Esta de s e s t abi 1 i z ación se cree que es provocada por la desnaturalización de los AFP; este es un efecto bien conocido comúnmente observado para péptidos y proteínas. La presente invención busca proporcionar soluciones a estos problemas. Sorprendentemente, se ha encontrado que los AFP pueden ser aislados de fuentes naturales tales como plantas aclimatadas en .frío a través de un proceso luego relativamente simple. Este proceso conduce por primera vez a la identificación de los AFP que convenientemente pueden ser incorporados en una mezcla para la preparación de productos congelados antes de su pasteurización. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un proceso para la recuperación de AFP a partir de fuentes naturales, tal proceso implica las etapas de: a) aislar el AFP que contiene jugo de la fuente natural; b) tratar con calor la fuente natural o el AFP que contiene jugo a una temperatura de por lo menos 60 ° C ; c) remover la fracción insoluble. La etapa c del proceso anterior, usualmente se presentará después de las etapas a y b. La etapa a y b pueden ser realizadas en cualquier orden deseado, por ejemplo, la etapa a seguida por la etapa b (en el caso de que se caliente un rico jugo en AFP) o la etapa b seguida de la etapa a (en el caso de que la fuente natural sea calentada) o la etapa a y b simultáneamente. Sorprendentemente, se ha encontrado que el proceso de aislamiento de la invención tiene un número de ventajas.

En primer lugar, utilizando el proceso ya no es necesario evitar la ruptura de la fuente natural tal como plantas como se requería en los procesos de acuerdo con WO 92/22581. Esto incrementa inmediata y significativamente la api i cabi 1 idad comercial del proceso, por ejemplo, según comparado con WO 92/22581, debido a que ya no serán necesarios altos costos de inversión para procesamiento específico. También, usando las altas temperaturas parece ser posible extraer de un gran grupo de péptidos presentes en las fuentes naturales una nueva selección de AFP muy activos del material natural, tales AFP incluyen péptidos que son muy activos .r.t., y tienen propiedades de inhibición de r e c ri s t a 1 i z a ci ón en hielo. En tercer lugar, contrario a las expectaciones, el uso de altas temperaturas no desna uraliza todo el material proteináceo, sino que solamente parece desnaturalizar algunas de las proteínas, mientras que el resto de los AFP tiene una estabilidad a la temperatura incrementada. Esto hace posible incluir los AFP aislados en composiciones que necesitan ser sometidas a temperaturas más altas, por ejemplo, una etapa de pasteurización. Esto es especialme te sorprendente, por ejemplo, ya que los AFP de WO 92/22581 parecen no ser estables bajo condiciones de calentamiento (véase ejemplo VI) . El proceso de la invención incluye en la etapa b el calentamiento de la fuente natural o el jugo rico .en AFP a una temperatura mayor que 60°C. Preferiblemente, la temperatura es de - 60 a 110°c, más preferiblemente de 80 a 105°C. La etapa de calentamiento puede presentarse después del aislamiento del jugo rico en proteína (paso a) o antes del aislamiento del jugo rico en proteína. Se puede utilizar cualquier forma adecuada para calentar el jugo, por ejemplo, calentamiento convencional o de microondas, calentamiento opcionalmente con un medio de extracción agregado, vapor, etc. Si se utiliza un medio de extracción, referiblemente este es usado en volúmenes pequeños para evitar la dilución innecesaria de la fracción de AFP. Cualquier medio de extracción adecuado puede -ser usado, aunque el uso de agua es especialmente preferido. Si se desea, se pueden agregar aditivos al agua antes de uso para utilizarlos como un medio de extracción. Más preferiblemente, sin embargo, se utiliza agua sustancialmente libre de aditivos. El proceso de la invención puede ser aplicado a cualquier fuente natural de AFP estables al calor. Incluidos en esta lista se encuentran plantas, peces, insectos y microorganismos. Se pueden utilizar especies tanto en existencia natural como especies que hayan sido obtenidas a través de modificación genética. Por ejemplo, los microorganismos o plantas pueden ser genéticamente modificados para expresar AFP y los AFP después pueden ser aislados de acuerdo con la presente invención. Los AFP que tienen por lo menos 80%, de preferencia más del 95% y más preferiblemente 100% de homología a los AFP directamente obtenidos de fuentes . naturales, de esta forma pueden ser obtenidos. Para el propósito de la invención, también se abarcan proteínas que poseen este alto nivel de homología dentro del término de AFP. También estos microorganismos o plantas transformados capaces de expresar genes que codifican a los AFP también están abarcados dentro del alcance de la invención. Se pueden usar técnicas de manipulación genética para producir los AFP estables al calor descritos en la invención. Una célula huésped u organismo apropiado puede ser transformado a través de una construcción del gen que codifica el polipéptido estable al calor deseado. La secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido estable al calor puede ser insertada en un vector de expresión adecuado conteniendo los elementos necesarios para la transcripción y traslación y en una forma que serán expresados bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, en orientación apropiada y en un correcto marco de lectura y con un objetivo apropiado y secuencias de expresión) . Los métodos requeridos para construir estos vectores de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un número de sistemas de expresión puede ser usado para expresar el polipéptido estable al calor que codifica la secuencia. Esto se incluye, pero no se limitan, a bacterias, sistemas de célula de insecto de levadura, sistemas de cultivo de célula de plantas y plantas todas transformadas con los vectores de expresión apropiados. Una amplia variedad de plantas y sistemas de célula de planta pueden ser transformado con las construcciones de ácido nucleico de los polipeptidos aislados en el extracto estable al calor. Las modalidades preferidas podrían incluir, pero no se limitan, a maíz, tomate, tabaco, zanahorias, fresas, semilla de colza y betabel. Preferiblemente, el AFP se deriva de plantas (esto significa que ya sea el AFP es directamente obtenido de la planta como fuente natural o el AFP que tiene un alto grado de homología a estos AFP son t r ans gene t i camen t e producidos en otros organismos) . Cualquier planta que contenga AFP estable al calor puede ser usada, de preferencia sin embargo, son plantas de existencia natural (o sus versiones modificadas genéticas) , las cuales son capaces de crecer bajo condiciones de frío de manera que contienen AFP. Es ecialmente preferido es el uso de centeno de invierno, pastos y juncias perennes. Otras plantas adecuadas pueden venir por ejemplo del grupo de plantas de madera, cereales de invierno, etc. Especialmente de manera preferida es que los AFP estables al calor se deriven de Acer s a c cha r o i de s , Bamboo, Buddleia, Isthecium myosuroides, Ramalina farmaceae, Usnea s ub f 1 or idana , Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aqualitis, Colobanthus quintensis y Agrostis tenuis, Festuca contracta y Poa annua. El jugo rico en AFP puede ser separado de su fuente a través de cualquier proceso conveniente por ejemplo, compresión, filtración, homogenei z a ci ón , extracción, etc. Preferiblemente, la fuente natural de AFP tal como el material de planta se hace en pequeñas piezas o en un lodo antes de que se recoja la fracción rica en proteina, por ejemplo, a través de filtración. Esta maceración puede realizarse a través de cualquier método adecuado, por ejemplo, en un mezclador. . Estará dentro de la habilidad de los expertos en la técnica dividir el material de tal manera que la recolección del jugo rico en proteína pueda presentarse f ác i Ime t e . Después de recoger y calentar (en el orden deseado) la fracción de proteina, la muestra que contiene AFP resultante después puede ser tratada a través de cualquier proceso conveniente con el fin de remover la fracción insoluble y retener la fracción líquida rica en AFP. La fracción insoluble puede ser removida, por ejemplo a través de filtración, precipitación, etc. El liquido rico en AFP después puede ser ventajosamente procesado adicionalmente para concentrar o aislar los AFP para llevarlos en una forma adecuada para uso posterior. Los ejemplos de procesos adecuados son secados para obtener un polvo o pasta, concentración adicional para obtener un concentrado de AFP, cromatografía para separar los AFP del medio de extracción, etc. Otra vez, estará dentro de la habilidad de los expertos en la técnica determinar los medios adecuados y condiciones para un aislamiento apropiado . Para algunas fuentes naturales, los AFP obtenidos a través de los métodos anteriores, puede consistir de una mezcla de dos o más AFP diferentes. Si se desea, estos AFP pueden ser separados a través de cualquier proceso convencional, por ejemplo, cromatografía u otros procesos con base en las diferencias en las propiedades f í s i cas / quí i ca s tales como peso molecular. También, si se desea la composición de aminoácido y la secuencia de los AFP aislados pueden ser determinada. Se puede usar cualquier método adecuado para determinarlas. Ejemplos de métodos adecuados se describen en los ejemplos. También, si se desea, la secuencia de ácido nucleico que codifica los AFP puede ser determinada. El vector que contiene una secuencia de aminoácido capaz de codificar los aminoácidos también está abarcado dentro, del alcance de la invención. Con base en la información anterior, también es posible genéticamente modificar otras fuentes naturales de manera que produzcan los AFP ventajosos como se identificaron anteriormente. Ejemplos , de AFP adecuados se describen en los e j emp los. Se ha encontrado que los AFP obtenidos a través de los procesos anteriores tienen una capacidad incrementada para resistir el tratamiento térmico. Se cree que tales AFP nunca antes habían sido aislados. Como se describe anteriormente, esta resistencia térmica incrementada es particularmente de interés para utilizarse en productos alimenticios que experimentan una etapa de calentamiento, por ejemplo, la pasteuriz ción. De acuerdo con otro aspecto de la invención se relaciona a los AFP, que tienen una estabilidad térmica como se evidencia por ninguna reducción significativa en las propiedades de inhibición de r e cr i s t al i z a c i ón después del tratamiento con calor durante una hora a 80 ° C o 10 minutos a 100°C. Una prueba adecuada para determinar las propiedades de inhibición de r e cr i s t al i z ací ón de hielo se describe en los ejemplos e implica la rápida congelación a -40°C seguido por un almacenamiento de una a -6°C. Preferiblemente, los AFP que son sometidos a esta prueba después del tratamiento térmico dan como resultado un tamaño de partícula de cristal de hielo que es menor que 5 µm mayor que el tamaño de cristal de hielo de una muestra con el mismo AFP, que no .ha sido tratado con calor. Preferiblemente, la diferencia es menor que 3 µm, más preferiblemente menor que 1 µm . Preferiblemente aquellos AFP se seleccionan para que tengan propiedades significativas de inhibición de hielo-recristalización. Una prueba adecuada para determinar las propiedades de inhibición de r e cr i s t ali z aci ón está indicada en el ejemplo VI. Preferiblemente, los AFP de acuerdo con la invención proporcionan un tamaño de partícula siguiendo un ensayo de inhibición de r e cr i s t ali zación de hielo -como se describe en los ejemplos- -de 15 µM o menos, de preferencia de 5 a 15 µm . Los AFP pueden con enientemente ser utilizados en productos alimenticios de preferencia en productos alimenticios que son congelados o están destinados a ser congelados. Especialmente preferido es el uso de los AFP en productos que son calentados por ejemplo, a través de pasteurización o esterilización antes de la congelación. Es ecialmente preferido es el uso en productos de confitería congelados. Ejemplos de tales productos alimenticios son: mezclas de confitería congeladas, tales como mezclas de helado y mezclas de agua helada, las cuales están destinadas para ser pa s t eur i z ada s antes de la congelación. Tales mezclas usualmente son almacenadas a temperatura ambiente. Las formas de producto adecuadas son, por ejemplo: una mezcla en polvo que es empacada por ejemplo en una bolsa o en sacos. Tal mezcla es capaz de formar la base del producto alimenticio congelado, por ejemplo, después de la adición de agua y opcionalmente otros ingredientes y aereación opcional. Otro ejemplo de una mezcla adecuada puede ser una mezcla líquida, (opcionalmente aereada) , la cual, si es necesario después de la adición de componentes adicionales que se realice una aereación opcional adicional.

La ventaja clara de las mezclas anteriormente mencionadas es que la presencia del ingrediente de AFP hace que las mezclas puedan ser congeladas bajo condiciones estables, por ejemplo, en un congelador de tienda o doméstico, sin la formación de formas de cristal de hielo inaceptables y, por lo tanto, con una textura diferente a los productos normalmente obtenidos a través de congelación estable. Más convenientemente estas mezclas son empacadas en recipientes cerrados (por ejemplo, cajas, bolsas, cartones, recipientes de plástico, etc. ) . Para porciones individuales, el tamaño del paquete -generalmente será de 10 a 1000 g. Para tamaños de paquete de porciones múltiples de hasta 500 kg pueden ser adecuadas. Generalmente, el tamaño del paquete será de 10 g a 5000 g. Como se indicó an erio mente, los productos preferidos en donde los AFP son utilizados, son productos de confitería congelados tales como helado o agua helada. Preferiblemente, el nivel de AFP es de 0.0001 a 0.5% por peso basado en el producto final. Si se utilizan concentrados o mezclas en seco, la concentración puede ser más alta con el fin de asegurar que el nivel en el producto de congelado fin l esté dentro de los rangos anteriores. Sorprendentemente, se ha encontrado que las composiciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de AFP, mientras siguen siendo de buena calidad. Sorprendentemente, se ha encontrado que el nivel de. Los AFP puede ser tan bajo como 0.1 a 50 ppm, mientras que siguen proporcionando las propiedades de r e cr i s t ali z ación adecuadas y la tolerancia a la temperatura en productos de confitería congelados. Aunque los solicitantes no desean que esté ligando a ninguna teoría, la razón de esto puede ser que la interacción entre los sólidos de la confitería congelada y los AFP proporciona un excelente mecanismo para inhibir el crecimiento de cristal. Muy convenientemente, el nivel de AFP es de 1 a 40 ppm, especialmente preferido de 2 a 10 ppm. Para los propósitos de la invención, el término producto de confitería congelado incluye confiterías congeladas que contienen leche, tales como helados, yogur congelado, barquillos, sorbetes, cubiertas de leche en hielo y congeladas, agua helados, granitas y purés de fruta congelada. Para algunas aplicaciones, el uso de productos alimenticios fermentados es menos preferido. De preferencia, al nivel de sólidos en la confitería congelada (por ejemplo, azúcar, grasa, saborizante, etc.) es más de 4% en peso, por ejemplo, más de 30% en peso, más preferiblemente de 40 a 70% en peso. Los productos de confitería congelados de acuerdo con la invención p u~e den ser producidos a través de cualquier método adecuado para la producción de confitería congelada. Sin embargo, especialmente se prefiere que todos los ingredientes de la formulación sean completamente mezclados antes de la pasteurización y antes de que inicie el proceso de congelación. El proceso de congelación, ventajosamente puede implicar una etapa de endurecimiento, por ejemplo una temperatura de 34.4°C (-30°F) o más baja.

Ejemplo 1 El' aislamiento de los AFP recogiendo primero el jugo seguido por el tratamiento con calor y aislamiento del AFP. Se cortó centeno de invierno (variedad Halo) en enero (temperatura media en ese mes fue de 3.5°C asegurando la aclimatación apropiada y frío de las plantas) . El tejido se transportó rápidamente al laboratorio para manejo adicional y lavado concienzudo con agua para remover la suciedad. 400 g de los recortes fueron homogene i z ado s a temperatura ambiente en un mezclador de Waring con 800 g de agua hasta que el tejido de la hoja se rompió completamente. El jugo rico en AFP se recogió filtrando a través de 4 capas de muselina. El jugo rico en AFP después se sometió a un tratamiento de temperatura haciendo hervir el jugo durante 10 minutos. Esto provocó la precipitación de la proteina, mientras que el AFP para utilizarse de acuerdo con la invención permaneció en solución. El so renadan e se separó del precipitado centrifugando a 15,000 g durante 20 minutos o a través de filtración adicional muselina. Los AFP pueden ser aislados del sobrenadante a través de secado por congelación. Para propósitos de control, un extracto apoplástico (extracto ex t r ac el u 1 a r ) del centeno de invierno puede ser obtenido como sigue: Las hojas de 30 días de plantas de centeno aclimatadas al frió fueron cortadas en tramos de 3 cm y se lavaron concienzudamente en agua destilada para remover cualquier contenido de células. Las piezas de hoja se colocaron en seco sobre una toalla de papel y totalmente se sumergieron en el medio de extracción de 5 mM EDTA, 10 mM de ácido ascórbico, 2 M de ácido caproico, 2 mM de benzamidina y 1 mM de fluoruro de f eni lme t i 1 s ul f oni 1 o (PMSF) . Después se infiltraron mediante vacío en un matraz de Buchner durante 60 minutos después de este tiempo las hojas se removieron y se moldearon completamente en seco. Después se dispusieron en longitudes en un barril de jeringa de plástico de corte y se centrifugaron moderadamente a 2000 x g durante 30 minutos. El extracto' apoplástico se recogió en un tubo de eppendorf por abajo de la jeringa.

E j emplo 11 Aislamiento de AFP calentando primero la fuente natural, seguido por el aislamiento del jugo rico en AFP y aislamiento del AFP. Se cortó tejido de pasto mixto (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) en enero (temperatura media en este mes fue de 3.5°C asegurando la aclimatación en frío apropiada de las plantas) . El tejido de pasto se transportó rápidamente al laboratorio para manejo adicional y lavado concienzudo con agua para eliminar la suciedad. 500 g de cortes de pasto se colocaron en un horno de microondas de 650 watts y se calentaron a una potencia total durante 5 minutos, por lo que la temperatura se incrementó de 85 a 100°C. Los cortes de pasto después se enfriaron a temperatura amb i en te . Alternativamente, los cortes de pasto se mezclaron con 500 g de agua en ebullición, y la mezcla se volvió a calentar a 100 ° C seguida por ebullición durante 10 minutos bajo agitación y después se dejó enfriar a 60°C. Después de la etapa de calentamiento, el jugo rico en AFP se separó de loa cortes a través de filtración. La masa se agitó continuamen te durante 5 minutos en presencia de un volumen igual de agua y después se comprimió a través de 3 capas de mu s e 1 i na . El sobrenadante puede ser secado por congelación para remover el agua seguido por almacenamiento. Alternativamente, el sobrenadante puede ser congelado para almacenamiento.

E j emplo III Se preparó mezclando una pre-mezcla líquida para preparar helado: Ingredientes % en peso Polvo de leche descremada 11.390 Sacarosa 3.410 Maltodextrina (MD40) 4.000 Goma de algarroba 0.072 Jarabe de maíz 63DE 20.705 Goma Guar 0.048 Genulacta L100 0.020 Mantequilla 9.015 Avicel RC581 0.240 Gelatina 0.140 Monogl i cé r ido (palmitato) 0.450 Vainilla 0.010 AFP (del ejemplo I*) 0.100 o ninguno (control) Agua Resto *Nota: El AFP se agregó como una solución de AFP concentrado usando alguna del agua adicional como diluyente, porcentaje se refiere a la cantidad de AFP.

Esta mezcla convenientemente puede ser pasteurizada a 85°C durante 15 segundos y almacenada congelada en una lata. Estas mezclas pueden ser usadas en la preparación de helado batiendo con un mezclador doméstico convencional a una operación de aproximadamente 100%, seguido por congelación estable en un congelador doméstico. La composición de acuerdo con la invención tuvo una textura marcadamente mejor que la muestra de control.- Se obtuvieron muy buenos resultados utilizando el AFP del Ejemplo II en lugar del AFP del e j empl o I .

Ejemplo IV Se preparó mediante mezclado una pre-mezcla liquida para la preparación de helado: Ingredientes % en peso Polvo de leche descremada 10.00 Sacarosa 13.00 maltodextrina (MD40) 4.00 Goma de algarroba 0.14 aceite de mantequilla 8.00 mon o g 1 i c é r i do (palmitato) 0.30 va i n i Ll a 0.01 AFP (del ejemplo I*) 0.01 o ninguno ( control ) agua Resto *Nota: El AFP se agregó como una solución de AFP concentrado en algo de agua, porcentaje se refiere a la cantidad de AFP. Los ingr edien t e a • fueron mezclados a temperatura ambiente, seguido por pasteurización durante 60 segundos a 89°C. La mezcla se colocó como relleno asépticamente en paquetes de 500 mi, se selló y se almacenó a temperaturas ambiente. La mezcla puede ser utilizada para la preparación de helado batiéndola con un mezclador doméstico ~ convencional a una operación de apro imadamente 70%, seguido por congelación bajo condiciones estables en un congelación doméstico. Después de dos meses de almacenamiento, la composición de acuerdo con la invención tuvo una textura marcadamente mejor que la muestra de control. Se obtuvieron muy buenos resultados utilizando el AFP del Ejemplo II en lugar del AFP del E j em lo I .

E j emplo V Se. repitió el Ejemplo IV, pero ahora se pre aereo la mezcla de helado a una operación de 70% antes del relleno aséptico y el sellado. El producto resultante puede ser almacenado a temperatura ambiente y se puede producir un helado colocando la mezcla en un congelador doméstico y congelando bajo condiciones estables.

Ejemplo VI Las propiedades de inhibición de r e cr i s t a 1 i z a ci ón de los AFP pueden ser determinadas como s i gue : Una muestra de un producto que contiene AFP se sometió a un nivel de sacarosa de 30% en peso (si el nivel de partida de la muestra fue mayor que 30%, esto se realizó a través de dilución, si el nivel de partida fue bajo, se agregó sacarosa a un nivel de 30% ) . Una gota de 3 µL de la muestra se colocó en un cubreobjetos de 22 mm ¿ Después se colocó un cubreobjetos con un diámetro de 16 mm sobre la parte superior y se colocó una carga de 200 g sobre la muestra para asegurar un espesor deslizante uniforme. Los bordes del cubreobjeto fueron sellados con barniz de uñas transparente. El portaobjetos se colocó sobre una etapa de microscopio de temperatura controlada Linkham THM 600. La etapa se enfrío rápidamente ( 50 ° C por minuto) a -40°C para producir una población grande de cristales pequeños. La temperatura de tapa después se elevó rápidamente (50°c por minuto) a 6°C y se mantuvo a esta temperatura. La fase de hielo se observó a -6°C usando un microscopio Leica Aristoplan. Se utilizaron condiciones de luz polarizada junto con una placa de lambda para mejorar el contraste de los cristales de hielo. El estado de la fase de hielo (tamaño de los cristales de hielo) fue registrado a través de una fotomicrografía de 35 mm a T=0 y T=l hora. Generalmente, esta prueba puede ser aplicada a cualquier composición adecuada que comprende AFP y agua. En general, el nivel de AFP en tal composición de prueba no es muy crítico y puede ser, por ejemplo de 0.0001 a 0.5% en peso, de preferencia de 0.0005 a 0.1% en peso y más preferiblemente de 0.001 a 0.05% en peso, por ejemplo de 0.01% en peso.

Cualquier composición adecuada que comprenda AFP y agua puede ser usada para realizar la prueba. En general, sin embargo, no será necesario obtener el AFP en forma pura. Para aplicaciones prácticas, normalmente será suficiente preparar un extracto o jugo líquido de material natural, en donde este extracto o jugo puede ser después probado. Este método puede ser aplicado por -ejemplo a los extractos que contienen AFP como se obtuvieron en el ejemplo I o II, con o sin una etapa de concentración . Se inhibieron las propiedades de medición de r e c r i s t a 1 i z aci ón de varias muestras. Las muestras se obtuvieron a partir de centeno, las cuales fueron cosechadas .en varios momentos durante el año. Los jugos de* AFP obtenidos después de la extracción y calentamiento de acuerdo con el ejemplo I fueron medidos para sus propiedades de r e cri s t a 1 i z a ci ón como se hizo anteriormente. Como un centeno de comparación se utilizó uno que creció en un invernadero (a temperaturas que normalmente no inducen la formación de AFP) Se midieron los siguientes tamaños de cristal de hielo Mués tras Tamaño de cristal de hielo después de 1 hora (µm) Control 25 muestra de diciembre 17 muestra de enero 10 muestra de febrero 15 muestra de marzo 18 muestra de abril 18 muestra de mayo 25 Estas mediciones muestran que para la buena actividad de AFP, las plantas deben ser cosechadas durante los meses de invierno, por ejemplo, di ci embr e - abr i 1. Especialmente preferidas son las plantas capaces de proporcionar tamaños de cristal de hielo de 15 µm o menos. En este caso, esto puede lograrse cosechando las plantas en enero o febrero. Se realizaron las mismas mediciones en las muestras de AFP de enero, las cuales fueron tratadas con calor (1 hora a 60°C) . No se observó ninguna reducción significativa en las propiedades de recristalización . Como comparación se utilizó el extracto apoplástico del ejemplo I. Esto dio como resultado un tamaño de cristal de hielo final después de 1 hora de 11.1 µm; después del tratamiento con calor hirviendo durante 10 minutos a 100°C, la prueba resultó después de 1 hora en un tamaño de cristal de hielo de 16.8 µ . Este ejemplo muestra que el extracto apoplástíco del centeno de invierno no es estable al calor.

Ejemplo VII Se obtuvieron de Silsoe (UK) extracto de pasto sin tratamiento con calor de pasto cosechado en enero. El extracto se centrifugó durante 1 hora para remover a tierra y desperdicio insoluble, como sigue: Centrífuga: Sorvall RC3C, Ro t or : H 6000 A , T emp e r a t u r a : + 5 ° C , Velocidad de Rotor :5000 rpm (7268 g) • Una muestra del extracto se secó por congelación para determinar su contenido total de sólidos. Este se encontró que fue d 11.48 mg/ml. El extracto después se volvió a hidratar con una solución de 30% de Sacarosa a su concentración total de sólidos original. Se prepararon varias soluciones diluyendo el extracto según fue necesario con una solución de Sacarosa al 30%. Se midió la actividad an t i c onge 1 an t e utilizando el ensayo del ejemplo VI.

Las imágenes de T=0 y T=l hora de los ensayos de inhibición de r e cr i s t al i z a c i ón tuvieron sus tamaños de cristal de hielo medios medidos utilizando el analizador Zeiss TGA 10. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla .

Estos resultados muestran la variación en el tamaño de cristal final y el cambio en el tamaño de cristal de hielo durante 1 hora a -6°C para las diversas diluciones del extracto del pasto. Se puede ver que el nivel de sólidos en el extracto de pasto puede ser variado en una amplia escala, mientras se obtienen buenas propiedades de inhibición de r e c r i s t al i z a ci ón . Preferiblemente, aquellas concentraciones son seleccionadas y dan como resultado un tamaño de cristal de hielo después de 1 hora de 15 micrómetros o menos. Se realizó una prueba similar con extracto de pasto, el cual fue sometido a tratamiento con calor (10 minutos a 100°C) . No se observó ningún deterioro -significativo de las propiedades de inhibición de re cr i s t a 1 i z aci ón . A icionalmente, los extractos de pasto del ejemplo II fueron probados utilizando la misma prueba de inhibición de recristalización. Se obtuvieron los siguientes resultados: Tratamiento con Tamaño de cristal en µm calor T=0 T=l 60 °C 1 hora 9.6 11.1 Ebullición 10 minutos 9.8 11.3 Estos resultados muestran que aún después del calentamiento, el extracto del pasto aclimatado en frío mantuvo la capacidad de inhibir el crecimiento de cristal de hielo.

Ejemplo VIII Se cosecharon varias plantas conteniendo AFP en enero. Los extractos fueron obtenidos colocando en tierra tejido fresco, por ejemplo, raíces, tallos, brotes u hojas con un mortero (enfriados a 4°C) en un volumen igual de regulador de pH A (10 mM de EDTA, 20 mM de ácido ascórbico, regulado en su pH con Tris a un pH de 7.4) mantenido en hielo*. Los homogenatos se filtraron a través de una o más capas de muselina y se mantuvieron sobre hielo antes de uso adicional. Los extractos fueron sometidos a la prueba de inhibición de r e cr i s t a 1 i z a c i ón del ejemplo VI tanto después del calentamiento a 60°C durante 1 hora y ebullición durante 10 minutos. Las siguientes plantas contuvieron AFP estable al calor según evidenciado por el mantenimiento de las propiedades de inhibición de r e cr i s t a li z a cLó : Acer s a echar oide s , Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea s ub f lor idana , Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis y Agrostis tenuis, Festuca contracta y Poa annua. Las siguientes plantas no contuvieron AFP estable al calor: col, espinaca, Brassica napus y Arabinopsis.

Ejemplo IX La actividad de histéresis térmica de los AFP puede ser probada como sigue: Se colocaron muestras de 1 mi en Eppendorfs en un baño de agua caliente y se calentaron durante 1 hora a 60°C. Después se midieron como sigue las propiedades de histéresis térmica de la muestra: El producto fundido se colocó sobre un mi cr ocubr e o j e t o s (Camlab Cambridge, longitud de trayectoria de 0.1 mm) . Los extremos del mi c r o cubr e ob j e t o s se sellaron con jalea de petróleo. Se introduce hielo en la muestra utilizando una aspersión de congelación en aerosol. El cubreobjetos después se sumergió en un baño a temperatura controlada de etanol a -0.1°C. Después de una e qu i 1 ib r a c i ón de 5 minutos, la muestra se verificó, si el hielo se funde completamente, la temperatura del baño se reduce a 0.1°C en pasos seguido por la e qu i 1 ib r a c i ón . Estos pasos son repetidos hasta que se alcanza una temperatura en donde existe una pequeña cantidad de cristales de hielo en la muestra. Después de la e qu i 1 ibr a ci ón a esta temperatura, la temperatura del baño se redujo en los pasos de 0.01°C por minuto. El punto de congelación de la muestra se registró como la temperatura a la cual la propagación de hielo comienza a partir de los cristales equilibrados. La temperatura de fusión de la muestra después fue determinada incrementando la temperatura empezando en el punto de congelación en los pasos de 0.01°C por minuto hasta que todos los cristales de hielo se funden. Esta temperatura es la temperatura de fusión de la muestra. La histéresis térmica de la muestra es la diferencia entre la temperatura de fusión y la temperatura de congelación. Este procedimiento de prueba se realizó en una primera muestra (antes del tratamiento con calor) y en una segunda muestra después del tratamiento con calor, seguido por enfriamiento. Similarmente, la estabilidad térmica puede ser determinada a través de la prueba anterior, en donde la muestra se hace hervir en agua durante 30 segundos, seguida por la determinación de la histéresis térmica. La histéresis térmica de varias muestras fue medida. Las muestras se obtuvieron de centeno de invierno, las cuales fueron cosechadas en diferentes momentos durante el año. Los jugos de AFP obtenidos después de la extracción y calentamiento de acuerdo con el ejemplo I fueron medidos para su histéresis térmica como en el ejemplo VI. Como comparación, se utilizó centeno de invierno el cual creció en un invernadero (a temperaturas las cuales normalmente no inducen la formación de AFP) . Se midió la siguiente histéresis térmica.

M és tra Histéresis térmica (°C) Control 0.04 muestra de diciembre 0.18 muestra de enero 0.21 muestra de febrero 0.17 muestra de marzo 0.15 muestra de abril 0.12 muestra de mayo 0.05 Estas mediciones muestran que para una actividad de AFP, las plantas deben ser cosechadas durante los meses de invierno, por ejemplo, di ci embr e -ma r z o .

Las mismas mediciones se realizaron en muestras de AFP de enero, las cuales se trataron con calor (1 hora a 60°C) . No se observó ninguna reducción significativa en la histéresis térmica.

E emplo X Determinación de la secuencia de aminoácidos de AFP El extracto de pasto estable al calor del ejemplo II se concentró aproximadamente diez veces utilizando una cámara de filtración Amicon con una membrana de corte de lOkDa. El concentrado resultante se cargó en una columna de intercambio de anión Mono Q (Pharmacia) HR 5/5 FPLC. Se unió a la columna un regulador de pH de 50 mM de Tris/HCl, pH 8.5, y la fracción activa Rl se eluyó con un gradiente lineal de NaCl a una concentración final de 0.5M en el mismo regulador de pH de Tris pH 8.5. La cromatografía se realizó a una velocidad de flujo de 1 mi min"1 y se recogieron fracciones de 1 mi y se anal i.z aron para la actividad de inhibición de recristalización (como en el ejemplo IX) . Las fracciones activas fueron combinadas conjuntamente y se concentraron a un volumen de 0.05 mi en un concentrador de Centrífuga Centrícon PM10 (Amicon) centrifugado a 10,000 rpm durante 10 minutos en un rotor de Sorvall SS 34 (8 x 50 mi) . El concentrado se cargó sobre una columna de filtración de gel Superdex 75 PC 3.2/30 corriendo en un sistema de mi cr o s epa ra c i ón SMART (Pharmacia) . La columna se eluyó con 50 mM de regulador de pH de Tris/HCl, pH 8.5 a una velocidad de flujo de 0.05 mi min-1. Se recogieron fracciones de 0.05 mi después de que la muestra se cargó a un volumen total de 3.5 mi. Las fracciones fueron analizadas para la actividad de inhibición de r e cr i s t al i z a ci ón (como en el Ejemplo IX) y las fracciones más activas fueron sometidas a separación en un gel SDS PAGE y se e 1 e c t r o t iñe r on antes de la s e cuenci a ción de N-terminal. Las fracciones de Superdex 75 fueron tomadas en el regulador de pH de carga de gel (50 mM de Tris/HCl, pH 6.8, 10% de gliceron, 10 mM de di t i o t r ei t ol , 2% de SDS) y después se separaron en un gel de pol i a cr i 1 amida al 10% después del método de Laemmli. Después de la e 1 ec t r of or es i s , el gel se emparedó contra una lámina de membrana de Problott (Perkin Elmer) humedecida con metanol y se electrotiñó a 20 volts durante 16 horas en un regulador de pH de 10 M de ácido 3-( c i c 1 ohexi lamino )- 1 -propan sul fóni co (CAPS) (pH 11.0) contiene 10% de metanol. Después de la tinción, la membrana se . lavó brevemente con metanol y después con agua milli Q (Millipore) y las proteínas unidas se visualizaron con una solución de 0.1% (p/v) de azul brillante de coomassie. Se visualizaron dos bandas de proteína de pesos moleculares aparentes de 25 kDa y 35 kDa a través de 1-a tinción de coomassie. La proteína de 35 kDa pareció correlaciona se estrechamente a las fracciones Rl más activas. Ambas bandas se cortaron con un escalpelo y se s e cuenc i a r ón . Un área no teñida de la membrana que corresponde a un peso molecular aparente de 65 - 75 kDa también se sometió a s e cu e-nci ac i ón como tinción con plata de geles de las fracciones más activas y que mostraron anteriormente una banda de proteína a este peso mo 1 e c ul a r . Las tres áreas cortadas de membrana fueron secuenciadas cargando a un cartucho de s e cuenci a c i ón Blott y la secuencia determinada usando ciclos de reacción y conversión como se describe por el fabricante ( P e r k i n -E lme r ) . Las listas de secuencia N-terminales se muestran a continuación. El AFP de 25 kDa comprende una secuencia de término N substancialmente homologa a: ALA-THR-ILE-THR-ALA- VAL-ALA- VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-V L-PRO-THR El AFP de 35 kDa comprende una secuencia del término N sustancialmente homologa a: ALA-GLTNT-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN- PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO El AFP de 65-70 kDa comprende una secuencia del término N sustancialmente homologa a: X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR En cada secuencia X denota un aspecto desconocido, el cual puede ser cualquier aminoácido encontrado en proteínas de planta. Para propósito de la invención, el término s u s t an c i almen t e homólogo se refiere a por lo menos un traslape de 80% en aminoácidos, más preferible más de 90% y más preferiblemente de 95 a 100%.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la recuperación de AFP de acuerdo con una o más de las rei indicaciones 2-4 de fuentes naturales, tal proceso implica las etapas de : I. a aislar un jugo que contiene AFP de la fuente natural y después tratar con calor el jugo a una temperatura de por lo menos 60°C; o I.b tratar con calor una fuente natural a una temperatura de por lo menos 60°C seguido por aislamiento de un jugo que contiene AFP de la fuente natural ; II. remover la fracción insoluble. por lo que la etapa I. a o I.b se presenta antes de la etapa II.

2. Los AFP que se obtienen de plantas que tienen una estabilidad térmica según evidenciada por ninguna reducción significativa por las propiedades de inhibición de recristalización de hielo, como se evidencia en que el tamaño de cristal de una composición de AFP tratado con calor en agua después de un rápido congelamiento a -40°C, seguido por almacenamiento a -6°C durante 1 hora es menor que 5 µm, mayor que el tamaño de cristal del hielo del mismo AF-P el cual no ha sido tratado con calor, después de un tratamiento con calor durante 1 hora a 60°c, una hora a 80°C o 10 minutos a 100°C.

3. Los AFP de acuerdo con la reivindicación 2, en los que el tamaño de cristal de hielo de una composición del AFP en agua después de una rápida congelación a -40°C seguido por almacenamiento a -6°C durante 1 hora es de 15 µm o menos.

4. Los AFP de acuerdo con la reivindicación 2, en los que comprenden una o más proteínas que tienen un peso molecular de 25 kDa, 35 kDa y 65-75 kDa, y tienen una secuencia N-terminal sustancialmente homologa a: 25 kDa AFP : ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR 35 kDa AFP: ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR- VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO 65-75 kDa AFP: X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

5. El vector que contiene una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar por lo menos uno de los AFP de la rei indicación 4.

6. Un organismo transformado capaz de expresar por lo menos uno de los AFP de la reivindicación 4.

7. Un producto de confitería congelado, que comprende de 0.0001 a 0.5% por peso del AFP de acuerdo con la reivindicación 2.

8. Una pre-mezcla adecuada para usarse en la producción de un producto de confitería congelado de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende el AFP de la reivindicación 2.

9. Un proceso para la preparación de un producto de confitería congelado, que comprende la preparación de una mezcla de formulación comprendiendo de 0.0001 a 0.5% en peso de un AFP, tal AFP tiene una estabilidad térmica según evidenciado por ninguna reducción significativa en las propiedades de inhibición de r e cr i s t a 1 i z a ci ón después del tratamiento con calor durante 1 hora a 60°C, una hora a 80°C o 10 minutos a 100°C, seguido por congelación de la mezcla bajo condiciones estables.