CN102234653A - 小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用。小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33，是序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列。本发明的有益效果在于，首次克隆得到了小麦MYB转录因子基因TaMYB33，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，与野生型拟南芥植株相比，含有本发明的TaMYB33基因的转基因拟南芥植株的耐盐、抗旱能力明显提高。

Description

小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用。

背景技术

[0002] 土壤盐渍化和干旱是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子，是制约农业生产和发展的全球性问题，盐害与干旱不仅严重影响植物的生长发育，造成作物减产，而且使生态环境日益恶化。盐渍土可引起植物生理干旱，为害植物组织，影响植物正常营养吸收，阻碍植物正常生长。土壤盐渍化是影响植株生长发育较为严重的环境胁迫之一。植株在摄取了过量的Na等离子后，细胞内离子浓度增高，破坏离子平衡，造成矿物元素的毒害效应，还会导致酶活性丧失，进而导致植株体内正常的代谢过程及生理功能受到不同程度的损坏 。因此，了解植株的耐盐机理，研究盐胁迫下植株的生理生化变化，提高作物的抗旱和/或耐盐能力已经成为现代作物育种工作中亟待解决的关键问题之一。

随着对植物抗旱、耐盐的基础分子生物学研究的不断深入和对抗性基因的不断发现和挖掘，利用转基因手段分离克隆耐盐基因，培育耐盐新品种来获得抗干旱耐盐渍的转基因植物，已经成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的进展。研究表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力提高。

在植物逆境胁迫的信号转到通路中，转录因子起到中心调控的作用。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的转录因子。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力。

MYB是一类在植物生长发育和胁迫应答中发挥重要作用的转录因子家族。广泛参与植物细胞周期的调控、形态建成、次级代谢及胁迫响应等过程。水稻OsMYB3R-2在拟南芥中的异位表达也能够提高转基因株系对冷、旱及盐胁迫的抗性。AtMYB44过表达拟南芥对ABA敏感性增加，ABA诱导气孔关闭更迅速，进而使得植株抗旱性提高。AtMYB96通过整合ABA和生长素信号通路来调控旱胁迫响应。但有关小麦MYB转录因子在耐盐方面的研究报道的还很少。

小麦是重要的农作物，克隆耐盐、抗旱基因，培育耐盐、抗旱小麦新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明首先根据小麦的表达谱芯片数据选出在小麦幼苗根中显著受盐诱导表达的MYB转录因子基因（探针），然后根据探针序列设计基因特异性引物，从小麦全长cDNA文库中克隆TaMYB转录因子全长cDNA，在拟南芥中进行功能验证。

本发明提供了一种小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33及其编码蛋白与应用。

本发明小麦的耐盐、抗旱基因，名称为TaMYB33，其cDNA是序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID No.1由726个碱基组成。

以上所说的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33的编码蛋白，是下述氨基酸序列之一：

（1）序列表中SEQ ID No.2序列；

（2）将序列表中的SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控耐盐、抗旱复苏能力的蛋白质。

以上所说的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID No.2由242个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、转基因植株也在本发明的保护范围之内。

扩增TaMYB33中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的保护范围还包括基因TaMYB33在培育耐盐、抗旱植物中的应用，该植物为小麦或拟南芥。

提高含有小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，是将小麦基因TaMYB33导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到具有耐盐、抗旱性能的植株。

提高含有小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33通过含有小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33的植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaMYB33导入细胞、植物组织或植物个体，用于构建植物表达载体的出发载体为pCAMBIA-super1300。

以上所说的植物宿主为小麦或拟南芥。

MYB 家族在结构上具有由l到3个MYB重复单元组成的MYB结构域，每个MYB重复通常包含50～53个氨基酸，在每个重复的内部又会形成螺旋—转角—螺旋的结构，参与对靶序列的识别。根据MYB结构域所含MYB重复的数量，MYB家族转录因子被分为3种类型，即包含3个MYB重复的3R。MYB、包含2个MYB重复的R2R3—MYB和MYB—related类型，其中，R2R3—MYB是植物中存在最广泛的类型。研究表明，MYB家族转录因子在植物抗逆性方面具有重要作用。AtMYB2、AtMYB41、AtMYB44和AtMYB102是在拟南芥中克隆的4个与抗逆相关的MYB转录因子。AtMYB2是一个受干旱诱导表达的基因，当植物处于缺水的生长条件时，它会作为转录激活因子调节一些受乙烯诱导表达基因的转录，以此来响应生长环境的变化。AtMYB41在正常的生长条件下是不表达的，但经干旱、ABA 及盐胁迫诱导后，则高水平表达，它通过参与调控表皮的合成及细胞增殖来响应各种逆境胁迫。AtMYB44通过依赖于ABA的信号传导网络，参与植物的非生物胁迫响应过程，过表达AtMYB44可以促使植株气孔关闭，从而增加对非生物胁迫的抗性。AtMYB102是一个参与植物渗透胁迫响应的基因，其表达受渗透胁迫及ABA的诱导。水稻Osmyb4基因在拟南芥中过量表达后能增强转基因植株对低温和冻害的抗性～l卅；水稻OsMYB3R—2基因在拟南芥中过量表达后能增强转基因植株对冻害、高盐和干旱的抗性，TaMYB1是在小麦中克隆的一个R2R3—MYB类型的转录因子，该基因的表达与根中氧的浓度相关，同时又受盐、PEG和ABA的诱导。

本发明的有益效果在于，首次克隆得到了小麦MYB转录因子基因TaMYB33，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，与野生型拟南芥植株相比，含有本发明的TaMYB33基因的转基因拟南芥植株的耐盐、抗旱能力明显提高。

附图说明

图1 为TaMYB33基因全长cDNA 序列的扩增结果，M：DNA分子量marker，下同；

图2  NaCl、PEG和ABA处理后TaMYB33基因在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT-PCR分析，Actin为内参；leaf：叶；root：根；

A：200mM NaCl处理；B：15% PEG处理；C：100μM ABA处理；

图3 构建的植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaMYB33的酶切验证结果；

图4 转基因拟南芥的PCR鉴定。T1、T2、T5、T6：TaMYB33转基因拟南芥株系，WT野生型拟南芥植株；

图5 转基因拟南芥株系的表型鉴定；

图5中A：野生型拟南芥和转TaMYB33基因的转基因拟南芥株系幼苗在50mM NaCl处理下的表型；

图5中B：野生型拟南芥和转TaMYB33基因的转基因拟南芥株系干旱15天后的表型；

图5中C：野生型拟南芥和转TaMYB33基因的转基因拟南芥株系干旱20天、复水3天后的表型；

图5中WT：野生型拟南芥株系；T1、T2、T5、T6：转化pCAMBIA-super1300/TaMYB33的拟南芥株系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

以下实施例中如无特别说明均为常规方法。

实施例1   TaMYB33基因cDNA序列的克隆

TaMYB33基因全长cDNA序列的克隆和序列测定

1. 引物序列

根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物，与文库的5′端锚定引物进行配对，以小麦幼苗全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA，引物序列为：Myb3′：5′-CGAACGATTATTGTTCCCTTCAC-3′，NT3：5’-ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’。

2．PCR 反应体系（50μL）

2×GC bufferⅠ          10μl

模板cDNA文库           1μl

dNTPs（2.5mM each）      0.5μl

Primer1 (10μM)          1μl

Primer2(10μM)           1μl

LA Taq(TaKaRa)           0.5μl

ddH₂O                 加至终体积50μl

3．PCR 反应程序为：94℃ 预变性3min；94℃变性45sec，58℃复性1min，72℃延伸2min，循环35 次；72℃延伸5min。

4．1％琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在750bp处有一条目的条带如附图1所示。

5．扩增片段的回收、与T载体的链接

对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行，PCR产物与pGEM-T (Promega)载体连接，连接体系为：

回收的PCR产物                   7μl

10×T4连接酶缓冲液              1μl

pGEM-T载体(50ng/μl)            1μl

T4DNA连接酶（3U/μl）(Takara)   1μl

dH₂O至10μl于16℃水浴连接过夜。

6．回收片段的克隆与测序

（1）大肠杆菌感受态细胞的制备

①从-80℃冰箱中拿出保存于甘油中的E.coli DH5a菌株（购自天为时代生物公司），放在冰上缓慢解冻；

②在超净工作台上用接种环划线（LB固体培养基，不含Amp）；

③将平板于37℃恒温培养箱倒置培养过夜；

④挑取平板上的单菌落接种于含5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养14～16小时；

⑤取0.5ml菌液接种于含50ml LB液体培养基的250ml的三角瓶中，37℃振荡（260rpm）培养2～3小时（OD₂₆₀=0.5）；

⑥将培养的菌液置冰上1小时；

⑦4℃离心4分钟（4000rpm），去上清；

⑧用25ml冰预冷的溶液A将菌体轻轻悬浮起来，再在冰上放置40～45分钟；

⑨重复步骤⑧；

⑩用2.5ml冰预冷的溶液B将菌体轻轻悬浮起来，然后将菌液分装到1.5ml离心管中（每管100μl），放入-80℃冰箱备用。

（2）连接产物的转化

①从-80℃的冰箱中取出1管（100μl）感受态细胞，置冰上缓缓解冻30分钟；

②超净工作台上向管中加入5μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟；

③42℃水浴热激90秒，迅速置冰上3～5分钟；

④在超净工作台上向离心管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时（260rpm）；

⑤室温下5000rpm离心6分钟，弃掉900μl上清液，将剩余100μl上清液重新悬浮菌体，加入40μl的X-gal和4μl的IPTG，混匀，然后用涂布器将其均匀涂到准备的平板上，放置30分钟；

⑥倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出；

⑦放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明；

⑧用灭菌的牙签挑取白斑于装有10ml LB液体培养基（含60μg/mlAmp）的试管中，37℃摇菌过夜。

（3）重组质粒的PCR鉴定及测序

本实验所用的pGEM-T载体的克隆位点的上游有T7启动子，下游有SP6启动子，所以可以用这两个启动子序列做引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定；

①PCR程序：94℃ 预变性10min；94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环35 次；72℃延伸5min；

②PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序，测序结果见SEQ ID No.1。

实施例2

NaCl、PEG、ABA处理条件下TaMYB33 转录因子基因的表达分析

1．材料处理

小麦材料山融3号的种子正常萌发，1周后去掉胚乳，在Hangload培养液继续培养1周后进行胁迫处理。盐胁迫为在液体培养基中施加50mM NaCl，干旱胁迫为施加15％的PEG，ABA处理为施加100μM ABA，处理后0、3、12、24，48小时取幼嫩的叶片和根系，提取小麦总RNA。

2．Trizol法提取小麦Total RNA

（1）将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

（2）待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

（3）加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

（4）4℃，12000rpm离心15分钟；

（5）用移液器吸出上层水相，加入到1.5ml的新离心管中，再在该离心管中加入500μl的异丙醇，上层水相与异丙醇的体积比为1:1，将两者充分混匀，在-20℃下,沉淀30min； 

（6）在4℃，12000rpm的转速下离心10min，弃去上清液；

（7）用1ml的75%乙醇洗涤RNA沉淀，在4℃，8000rpm的转速下离心10min，收集沉淀；

（8）重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

（9）去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10～15分钟，RNA略显透明，加入30～50μl的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

（10）用紫外分光光度法及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量：

a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在2.0±0.1左右。

b)用1%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小，吸取1ul RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液6 5℃变性5分钟，电泳后用EB染色，另取3μl的2kb DNAMarker作为对照。

3．第一链cDNA的合成

   采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit 进行，反应步骤如下：

（1）在Microtube 管中配制下列混合液

              dNTP Mixture (10 mM)      1μl

            Oligo dT Primer (2.5μM)    1μl

            Total RNA                   4μl

            RNase free H₂O              4μl

（2）在PCR仪上进行变性、退火反应

温度      时间

65℃      5 min

4℃       1 min

（3）离心至RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部

（4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液

上述变性、退火后反应液           10 μl

5×PrimerScript^TM Buffer         4 μl

RNase Inhibitor (40U/μl)        0.5 μl

PrimScript^TM RTase                0.5 μl

Rnase Free ddH₂O                   5 μl

 （5）在PCR仪上按下列条件进行反转录反应

42℃       15～30 min

95℃       5 min

4℃

4．PCR 反应及电泳

（1）以cDNA 为模板，进行PCR 反应，引物如下

 TaAct-S：  5’- GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’

   TaAct-A:  5’- GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’

MybRt1:   5’-GTCGTCCGCCACAGATTACTC-3’

Myb3′：  5′-CGAACGATTATTGTTCCCTTCAC-3′

（2）PCR 体系

ddH₂O                         4.7μl

10× buffer                   2μl

Primer1（2μM）               1μl

Primer2（2μM）               1μl

dNTP（10mM each）             0.2μl

rTaq polymerase（5U/μl）     0.1μl

逆转录cDNA 模板               1μl

Total Volume                  10μl

（3）PCR 程序

94℃ 5min；25～30 cycles，94℃ 20s； 57℃ 60s，72℃ 45s；72℃ 5min。

根据内参Actin 的扩增情况确定PCR 的循环数，调整cDNA 模板的加入量。（4） 1%琼脂糖凝胶电泳，结果见附图2。

实施例3   CaMV35S启动子植物表达载体的构建

植物表达载体pCAMBIA-super1300是含有CaMV35S 启动子和NPTⅡ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶XbaI和KpnI位点。根据基因TaMYB33的cDNA序列，设计包含完整ORF的基因特异性引物，引物序列为：Mybo5: 　5′-GCTCTAGAATGGGGAGGTCTCCTTGCTGC-3′(XbaI),Mybo3:5′-GGGGTACCCTAAATCTGAGACAAACTCTG-3（KpnI），用该对引物扩增TaMYB33的cDNA序列，然后分别用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切载体pCAMBIA-super1300和目的基因片断。完全酶切的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，然后与双酶切的cDNA 片段连结，构建获得植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaMYB33。

（1） 质粒pCAMBIA-super1300空载体和目的基因片断XbaI和KpnI双酶切

酶切体系如下：

XbaI                         lμl

KpnI                         1μl

pCAMBIA-super1300载体       

(或目的基因片段)              5μl

10×Buffer M                 1μl

ddH₂O To                     20μl

于37℃恒温水浴锅酶切3 小时以上；

（2） 酶切产物的电泳与回收

双酶切完成后，以1×TAE 为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pCAMBIA-super1300中载体的大片段和目的基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；

（3）连接

 经酶切的pCAMBIA-super1300载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4 的比例进行16℃连接过夜；

（4）转化

连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml 的LB 固体平板上37℃培养16 小时左右；

（5）重组子的鉴定

质粒酶切鉴定，提取阳性克隆质粒，对质粒进行XbaI和KpnI双酶切，酶切体系同实施例3中的（1）步骤，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，检测到已切开的合适大小的目的基因条带和载体条带，证明载体构建正确，如附图3所示。

实施例4   农杆菌感受态的制备与转化

1．农杆菌GV3101感受态的制备

①从YEP 平板(含50μg/ml 利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP 液体培养基中，200rpm/min，28℃下培养过夜；

②取2ml 过夜培养液接种于50ml 含相同抗生素的YEP 液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀ 达0.5；

③菌液冰浴30min，在4℃，于5000rpm的转速下 离心10min，收集菌体；

④将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L 的NaCl 中，离心收集菌体；

⑤再悬浮于1ml 20mmol/L 冰预冷的CaCl₂ 溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf 管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

2．冻融法转化根癌农杆菌GV3101

①在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg 表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min；

②置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min；

③加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3hr；

④7000rpm 的转速下离心30s ，收集菌体，涂于含50μg/ml 利福平、50μg/ml Kan 的YEP 平板上，28℃倒置暗培养2～3 天。

3． 菌体PCR 鉴定

菌体PCR所用引物同实施例3，方法及程序同实施例2中的（4）。

实施例5  转基因功能验证——拟南芥转化、筛选及表型分析

1．拟南芥的种植

将野生型拟南芥种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton-X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5～6次，点播于MS平板上，于4°C 春化2～3天，然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），在23°C下 培养，16/8 h 光周期，光强30～40μmol·m^-2 ·s^-1；待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展，在剪枝后的4～6 天内，进行农杆菌转化；

2．拟南芥转化

把200 ml 菌液倒入浅盘中，将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动沾花30 ^sec-1 min，取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿，将托盘置暗处培养24 h，然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟；

3．阳性植株的筛选：T0 代种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton-X100）消毒后，点播在MS选择培养板(30 mg/L 潮霉素)上，于4℃下春化2-3天，移入培养室中培养，大约10天左右，挑选潮霉素抗性植株（长出真叶1～2 对，根伸长至培养基中）并移栽到营养钵中，培养直至种子成熟，采用同样的方法筛选T1 代种子得到T2 代植株，并在T2 代植物中挑选抗性比为3:1 的单插入独立株系，并获得纯合T3代株系进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定；

4．转基因拟南芥的PCR鉴定

（1）拟南芥基因组DNA的提取

①取100mg 左右的新鲜叶片，放入1.5ml 离心管中，液氮速冻，研磨器中磨碎，加入600μl 预热至65℃的2×CTAB 提取缓冲液，混匀置于65℃水浴中放置90min；

②混合物冷至室温后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000rpm 离心10min；

③取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000rpm 离心10min；

④取上清，加入1/10 体积的3mol/L NaAc（pH5.3）和0.7 倍体积的异丙醇，仔细混匀，室温放置15min，沉淀DNA；

⑤用一玻璃钩将DNA 钩出，并转移至一装有800μl 70%乙醇的干净Eppendorf 管中，室温放置数分钟洗涤沉淀，6000g 离心5min；

⑥尽量去尽上清，空气干燥数分钟，溶于适量TE 缓冲液中。

（2）PCR 扩增

以上面提取的拟南芥基因组DNA 为模板，用基因特异性引物（同实施例3）进行PCR扩增。

PCR 体系同实施例2中的（4），PCR 反应程序为： 94℃ 预变性5min；94℃变性45sec，58℃复性45sec，72℃延伸1min，循环35 次；72℃延伸7min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到在转基因拟南芥植株中扩增出一750bp左右的目的条带，在转空载体的植株中未见扩增条带见附图4。 

5．转基因拟南芥的表型鉴定

（1）拟南芥的种植

 T3代单拷贝纯合拟南芥株系的种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton-X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5～6次，点播于MS平板上，于4°C 春化2～3天，然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），23°C 培养，16/8 h 光周期，光强30～40μmol·m^-2 · s^-1。

 （2）NaCl 和干旱胁迫处理

NaCl处理：将萌发2天的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）小心移至含有50mM NaCl的MS培养皿中，竖直培养一周观察表型，结果表明转TaMYB33基因的拟南芥植株的根长明显长于野生型对照植株的根长(附图5A)。

干旱处理：将萌发一周的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）移植培养土中，培养10天后开始控水（不浇水）干旱处理。干旱处理15天后观察表型。结果表明干旱处理15天后，作为对照的野生型拟南芥植株开始萎蔫，一些株系的叶子变得干枯，而转化TaMYB33外源基因的拟南芥植株长势旺盛附图5 B。复水处理3天后再次观察表型，发现对照拟南芥植株枯萎死亡，而转化TaMYB33的拟南芥植株长势良好,如附图5中C所示，说明本发明的小麦基因TaMYB33具有很好的抗旱性。

核苷酸序列表    SEQ ID No.1

1      ATGGGGAGGT CTCCTTGCTG CGACAAGACA GGGATCAAGA GGGGCCCGTG GACGGCGGAG

61     GAGGACATGA CCCTGGTCGC TCACATCGAG CAGCACGGGC ACAGCAACTG GCGGGCGCTG

121    CCCAAGCAGG CCGGCCTGCT GCGGTGCGGC AAGAGCTGCC GCCTTCGGTG GATCAACTAC

181    CTGCGCCCCG ACATCAAGCG TGGCAACTTC ACCGGCGAGG AGGAAGACGC TATCATCCAG

241    CTCCACGCCA TGCTCGGCAA CAGATGGTCC ACCATTGCCG CCAGGCTGCC TGGGAGAACG

301    GACAACGAGA TCAAGAACGT CTGGCACACA CACCTCAAGA AGCGACTCGA CTCGTCCTCG

361    TCCAAGACGT CCGGCCAGGC AGCGCCTAAG CGCAAAGCCA AGAAGCCTGT GGCTGCAGCG

421    AGCACAGCCG ATGGCCCGGT CTCCATGCCA GTGTCATCAC CGGAGCAGCC CATCTCGTCG

481    TCCGCCACAG ATTACTCGAT GGCATCGTCG TTGGAGAACA CGGCAAGCTT TACATCGGAG

541    GAGTTTCAGA TTGAAGACAG TTTTTGGTCG GAGACACTGG CAATGACGGT GGACAGCTCC

601    GGTTCCGCCA TGGAGGCCGG CGTCACCCCA AACAGTGCAT CGCCCTCGTC CAGCAACGAC

661    GAGATGGACT TCTGGGTCAG ACTGTTCATG CAGGCTGGTG AGGTGCAGAG TTTGTCTCAG

721    ATTTAG

 

氨基酸序列表     SEQ ID No.2

 

1   Met  Gly  Arg  Ser  Pro  Cys  Cys  Asp   Lys  Thr

11  Gly  Ile   Lys  Arg  Gly  Pro  Trp  Thr   Ala   Glu

21  Glu  Asp  Met  Thr  Leu  Val  Ala  His   Ile    Glu

31  Gln  His  Gly   His  Ser  Asn  Trp  Arg  Ala   Leu

41  Pro  Lys  Gln   Ala  Gly  Leu  Leu  Arg  Cys  Gly

51  Lys  Ser  Cys   Arg  Leu  Arg  Trp  Ile   Asn   Tyr

61  Leu  Arg  Pro  Asp  Ile   Lys   Arg  Gly  Asn  Phe

71  Thr  Gly  Glu   Glu  Glu  Asp  Ala  Ile   Ile   Gln

81  Leu  His  Ala   Met  Leu  Gly   Asn  Arg  Trp  Ser

91  Thr   Ile  Ala  Ala  Arg  Leu  Pro  Gly  Arg  Thr

101  Asp  Asn  Glu  Ile  Lys  Asn  Val  Trp  His  Thr

111  His  Leu  Lys  Lys  Arg  Leu  Asp  Ser  Ser   Ser

121  Ser  Lys  Thr  Ser  Gly  Gln  Ala  Ala  Pro  Lys

131  Arg  Lys  Ala  Lys  Lys  Pro  Val  Ala  Ala  Ala

141  Ser   Thr  Ala  Asp  Gly  Pro  Val  Ser  Met  Pro

151  Val   Ser  Ser  Pro  Glu  Gln  Pro  Ile  Ser  Ser

161  Ser   Ala  Thr  Asp  Tyr  Ser  Met  Ala  Ser  Ser

171  Leu  Glu  Asn  Thr  Ala  Ser  Phe  Thr  Ser  Glu

181  Glu  Phe  Gln   Ile  Glu  Asp  Ser  Phe  Trp  Ser

191  Glu   Thr  Leu  Ala  Met  Thr  Val  Asp  Ser  Ser

201  Gly   Ser  Ala  Met  Glu  Ala  Gly  Val  Thr  Pro

211  Asn   Ser  Ala  Ser  Pro  Ser  Ser  Ser  Asn  Asp

221  Glu  Met  Asp  Phe  Trp  Val  Arg  Leu  Phe  Met

231  Gln  Ala  Gly  Glu  Val  Gln  Ser  Leu  Ser  Gln

241  Ile*

 

Claims (10)

1.小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33，其cDNA序列是序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33，其编码蛋白是下述氨基酸序列之一：

（1）序列表中SEQ ID No.2序列；

（2）将序列表中的SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控耐盐、抗旱复苏能力的蛋白质。

3.如权利要求2所述的小麦耐盐、抗旱基因TaMYB33的编码蛋白，其特征在于，所述的蛋白是序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列。

4.含有权利要求1所述基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求1所述基因TaMYB33在培育耐盐、抗旱植物中的应用。

7.如权利要求6中所述基因TaMYB33在培育耐盐、抗旱植物中的应用，所述的植物为小麦或拟南芥。

8.提高含有权利要求1中所述小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，是将小麦基因TaMYB33导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到具有耐盐、抗旱性能的植株。

9.如权利要求8中所述的提高含有权利要求1中所述小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，其特征在于，所述的小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33通过含有所述小麦的耐盐、抗旱基因TaMYB33的植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaMYB33导入细胞、植物组织或植物个体，用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA-super1300。

10.如权利要求8或9中所述的提高含有权利要求1中所述小麦TaMYB33基因的转基因植物耐盐、抗旱性的方法，其特征在于，所述的植物宿主为小麦或拟南芥。

Images