CN115772527A

CN115772527A - 小麦耐盐基因TaSec14-7B及其应用

Info

Publication number: CN115772527A
Application number: CN202211293968.9A
Authority: CN
Inventors: 秦余香; 张宝
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2023-03-10

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦耐盐基因TaSec14‑7B，还涉及上述基因的应用；本发明还公开了小麦耐盐基因TaSec14‑7B及含有TaSec14‑7B基因的植物表达载体，以及所述基因TaSec14‑7B在培育耐盐植物中的应用。本发明所述的基因可广泛应用于培育耐盐小麦新品种。本发明首次克隆得到了小麦耐盐基因TaSec14‑7B，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，超表达TaSec14‑7B后转基因植株的耐盐能力明显提高。

Description

小麦耐盐基因TaSec14-7B及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦耐盐基因TaSec14-7B及其应用。

背景技术

土壤盐渍化严重影响作物的生长和产量(Gupta et al.,2020；Sabagh et al.,2021)，尤其是近年来工业化进程的加快，伴随着气温升高、干旱等极端反常的天气等的综合作用，盐渍化土地面积有进一步增加的趋势，对粮食安全和农业的可持续发展造成了很大威胁(Steinhorst et al.,2019)。

小麦是主要的粮食作物之一，其产量对人类生活意义重大，因此，为了更充分地利用盐渍化土地，提高土地利用率，助力小麦增产增收，亟需开发具有较强耐盐性的小麦新品种。

目前，利用植物基因工程克隆小麦耐盐基因，解析其耐盐的分子机制非常重要；这也是培育耐盐小麦新品种、有效利用盐碱地，增加粮食产量的良好途径，与此同时，这对保障粮食安全和农业的可持续发展，以及社会的安全稳定都具有重要意义(Gupta et al.,2020)。

磷脂是植物体生物膜和信号转导的重要组成部分，包括甘油磷脂和鞘磷脂两大类，而磷脂酰肌醇则是细胞内一种非常重要的甘油磷脂，约占细胞膜组分的10％，目前，植物中发现的磷脂酰肌醇主要有磷脂酰肌醇-3-磷酸，磷脂酰肌醇-4-磷酸，磷脂酰肌醇-3，5-二磷酸和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸。

众多研究表明，在磷脂酶C的作用下，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸分解产生第二信使肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，将细胞外信号转为细胞内信号，参与植物生长发育调控和对环境的适应。SEC14是一种重要的磷脂酰肌醇转运蛋白，作为植物生长发育调控和对环境适应信号通路的上游调控元件发挥重要作用。事实上，只含有Sec14结构域的Sec14蛋白主要参与渗透调节(Kearns et al.,1998)；过表达甘蔗ScSEC14p基因提高了甘露醇和氯化钠胁迫下转基因烟草种子的发芽率，增强对干旱和盐胁迫的耐受性(Ren et al.,2021)；玉米ZmSEC14p受冷、盐胁迫和ABA胁迫诱导表达，在拟南芥中过表达ZmSEC14p可提高拟南芥的抗冷性(Wang et al.,2016)。

此外，现有文献表明，目前已克隆的小麦Sec14基因一共有3个不同成员，其中两个参与了小麦的抗病性，一个参与小麦对非生物胁迫响应，但后者只做了表达分析，未有转基因功能研究。总之，目前提高耐盐性的小麦Sec14基因的克隆还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦耐盐基因TaSec14-7B及其应用。

本申请人在本发明中提供了一个小麦Sec14家族成员中的一个耐盐基因TaSec14-7B，该基因在拟南芥中超表达该基因后显著提高了转基因植株的耐盐能力。

本发明的技术方案在于，首先利用生物信息学分析、蛋白互作筛选耐盐基因TaSec14-7B，然后根据数据库中中国春小麦的序列设计TaSec14-7B的基因特异性引物，以NaCl处理的耐盐小麦品种山融3号幼苗cDNA为模板克隆TaSec14-7B的开放读框(ORF)，构建超表达载体，最后通过转化拟南芥进行耐盐功能验证，进一步分析转基因拟南芥耐逆marker基因表达水平和生理指标。

本发明提供的小麦耐盐基因名称为TaSec14-7B，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述小麦耐盐基因TaSec14-7B的氨基酸序列，其编码蛋白如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含上述小麦TaSec14-7B基因的超表达载体pCAMBIA-super1300/TaSec14-7B。

本发明所述基因TaSec14-7B在培育耐盐植物中的应用。

上述的耐盐植物是小麦，或者是拟南芥。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pCAMBIA-super1300/TaSec14-7B。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐小麦新品种。

本发明的有益效果在于，本发明首次克隆得到了小麦耐盐基因TaSec14-7B，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，超表达TaSec14-7B后转基因植株的耐盐能力明显提高。

附图说明

图1为TaSec14-7B基因的cDNA扩增；

图2为TaSec14-7B在耐盐小麦汶农14中NaCl和PEG处理下的表达分析；

图3为TaSec14-7B的亚细胞定位；

图4为TaSe14超表达转基因拟南芥的表型分析；

其中，图a为转TaSec14-7B基因拟南芥基因组PCR分子鉴定；

图b为不同转基因拟南芥株系中TaSec14-7B表达分析；

未转基因拟南芥株系Col-0和转基因株系(L1，L2，L3)在正常MS培养基及不同浓度NaCl(c)和甘露醇(d)处理下的表型分析；

图e，f为图c，d中植株的初生根根长统计；

图5为TaSec14-7B转基因拟南芥Marker基因表达分析；

图6为TaSec14-7B转基因拟南芥生理指标测定。

具体实施方式

为了能使本领域技术人员更好地理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。

实施例1

TaSec14-7B基因cDNA序列的克隆

根据数据库中中国春小麦序列设计基因TaSec14-7B特异性引物，以山融3号小麦幼苗全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。引物序列为：TaSec14-7BF：5′-ATGAATGTGCACCAGGGCTATC-3′，TaSec14-7BR：5′-TTATTTATGGTCGCCATCGGC-3′。

根据以下PCR反应体系进行PCR扩增。

表1 PCR反应体系

组分	体积(μL)
		2×Taq mix	25
TaSec14-7BF(2μM)	5
		TaSec14-7BR(2μM)	5
cDNA	2
		5xGC enhance	13

PCR反应程序为：95℃，3min；95℃，30sec，58℃，30sec，72℃，1min，循环32次；72℃，5min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在约900bp处有一条目的条带，见图1。

对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒进行切胶回收，步骤按说明书进行。

将纯化的目的基因片段与pEASY-T1 Simple Cloning Vector连接，将反应体系混匀，利用掌上离心机快速离心，在PCR仪中37℃反应10min。

表2 T载体连接反应体系

回收片段的克隆与测序：

(1)目的片断的克隆，其具体的步骤采用公开的专利CN111187778A中第0041-0048段的方法；

(2)重组质粒的PCR鉴定及测序

本实验所用的T-simple载体的克隆位点有M13通用引物，所以可以用M13F、M13R对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定；

①PCR程序：95℃，3min；95℃，30sec，58℃，30sec，72℃，1min，循环35次；72℃，5min；

②PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见SEQ ID No.1。

用DNAman软件或NCBI在线软件将测序所得的核酸序列SEQ ID No.1翻译成核酸序列，结果见SEQ ID No.2。

实施例2

不同处理条件下TaSec14-7B基因的表达分析

S1，材料处理

耐盐小麦种子正常萌发，1周后去掉胚乳，Hangload培养液继续培养1周，盐胁迫在液体培养基中施加200mM NaCl、20％PEG，分别在处理后的0h、0.5h、3h、12h、24h取小麦根系；

S2，小麦Total RNA提取

具体步骤按索莱宝总RNA提取试剂盒说明书进行。

S3，第一链cDNA的合成

采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒，根据说明书进行操作。

S4，qRT-PCR(real time PCR)反应

(1)以对照及处理条件下小麦根的cDNA为模板，将目的基因的CDS序列提交到EnsemblPlant网站进行序列比对，根据不同基因序列之间的差异，设计TaSec14-7B基因特异的荧光定量PCR引物。

引物序列为：rsec14F：5′-AATTACCCTGAAAAGGCCG-3′，rsec14R：5′-TGGAACTTTTGATGAACCCTC-3′；TaActinF：5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′，TaActinR：GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC进行qRT-PCR反应。

(2)反应体系见表3；

表3 qRT-PCR扩增体系

组分	体积(μL)
		2×SYBR qPCR Master Mix	5
Rsec14F(2μM)	1
		Rsec14R(2μM)	1
cDNA	1
		ddH<sub>2</sub>O	2

(3)反应程序为：94℃，30s；40cycles，94℃，15s，55℃，15s，72℃，25s。

qRT-PCR结果见图2。

实施例3

TaSec14-7B基因的亚细胞定位

利用Gatway的方法，将目的基因片段与绿色荧光蛋白表达载体35S-eGFP连接。设计含有重组接头，并不含有终止密码子的引物，引物序列为：

Ysec14F：5′-ggggacaactttgtacaaaaaagttggcATGAATGTGCACCAGGG-3′

Ysec14R：5′-ggggacaactttgtacaagaaagttgggcaTTTATGGTCGCCATCGG-3′；

以测序正确的目的序列的质粒为模板，进行PCR扩增并胶回收，获得带有接头的目的基因片段；然后使用GatwayBP克隆试剂盒，将目的基因片段连接到pDONR载体，再使用GatwayLR克隆试剂盒，将目的片段连接到35S-eGFP载体，转入农杆菌感受态细胞GV3101，进行菌液PCR筛选阳性菌落。

将筛选到的阳性克隆菌液在10mL YEP培养液中过夜摇菌，再接种到50mL YEP培养液中继续摇菌，直至OD值在1.2～1.5之间，5000rpm离心，收集菌体，利用悬浮液重悬至OD值为0.9，静止2h。利用针头将重悬液注入到烟草中，24h黑暗处理，再正常培养1～2天，取叶片在荧光共聚焦显微镜下观察，结果见图3。

实施例4

TaSec14-7B耐盐功能鉴定

S1，pCAMBIA-super1300/TaSec14-7B拟南芥超表达载体的构建

植物表达载体pCAMBIA-super1300是含有35S启动子和NPTⅡ基因的双元载体，利用同源重组的方法，将目的片段与pCAMBIA-super1300植物过表达载体连接，通过PCR扩增获得目的片段，利用CE Design设计含有pCAMBIA1300S载体同源臂和包含完整ORF的基因特异性引物。

引物序列为：Psec14F:5′-gacgatgataagggcggtaccATGAATGTGCACCAGGGCTATC-3′，

Psec14R:5′-gtcctaggctacgtaggatccTTATTTATGGTCGCCATCGGC-3。

用该对引物扩增TaSec14-7B的cDNA序列，然后分别用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切载体pCAMBIA-super1300；完全酶切的载体在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，然后与扩增的TaSec14-7B基因片段连结，构建获得植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaSec14-7B。

S2，转基因拟南芥的基因组PCR分子鉴定及转基因拟南芥中TaSec14-7B基因的表达分析

(1)拟南芥基因组DNA的提取

CTAB法提取植物基因组DNA。

(2)PCR扩增

以上述拟南芥基因组DNA为模板，用基因特异性引物Psec14F和Psec14R(引物序列见实施例4S1)进行PCR扩增。

表4 PCR体系

组分	体积(μL)
		2×Taq酶	5
Psec14F(2μM)	1
		Psec14R(2μM)	1
cDNA	1
		ddH<sub>2</sub>O	2

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到在转基因拟南芥植株中扩增出一条目的条带，在未转基因植株中未见扩增条带，见图4a。

(4)提取阳性株系的RNA，反转录为cDNA,以此作为模板，引物rsec14F、rsec14R进行qRT-PCR，体系及条件同实施例2，检测转入基因的表达量，见图4b。

S3，转基因拟南芥的表型鉴定

(1)拟南芥的种植

T3代单拷贝纯合转基因拟南芥株系的种子用7.5％次氯酸钠溶液(包括7.5％次氯酸钠和0.01％ Triton-X 100)消毒15min，然后用无菌水漂洗5～6次，点播在不同浓度梯度NaCl以及甘露醇处理过的MS培养基平板上，在4℃冰箱春化三天，将平板放到培养间培养，23℃，16/8h光周期，光强30-40μmol·m^-2·s^-1。

(2)NaCl和甘露醇处理

NaCl处理：将(1)中种有材料的平板放到培养间培养，竖直培养十天左右观察表型，直至出现明显的表型差异，拍照并记录拟南芥主根长度。

结果表明：正常培养条件下野生型初生根稍短于转基因株系，在150mM NaCl处理十天左右后，转基因拟南芥与拟南芥哥伦比亚型(Col-0)四个株系的长势出现差异，转基因株系的根要长于野生型，见图4c，e。

甘露醇处理：在75mM甘露醇处理下三个转基因株系的主根长明显长于野生型，并且侧根数量更多，见图4d，f。

实施例5

TaSec14-7B转基因拟南芥Marker基因表达分析

根据与实施例2中相同的realtime PCR反应程序和相似反应体系(换掉相应基因引物)分析野生型和转基因株系拟南芥在正常培养、100mM NaCl处理下耐逆信号通路中Marker基因的表达情况。

结果表明，在正常培养条件下，转基因株系拟南芥中RD29A,SnRK2.2,2.3基因的表达量高于野生型；在100mM NaCl下转基因株系中所有检测marker基因表达量均高于野生型，表明TaOSCA1可能通过提高上述表达基因的表达水平提高植物的耐盐性。

Marker基因的表达检测引物见表5。

表5：Marker基因的表达检测引物表

Primer names	Primer sequences(5′-3′)
		AtActinF	CTTGTACGGTAACATTGTGCTC
AtActinR	GATGGACCTGACTCGTCATAC
		ABF3F	AGAACCTCAACCGGTGGAGAGTG
ABF3R	CATCTGTAGTGGCTGAGTTTGAG
		ABF4F	CTGGTTTAGGGCTCAAAATGG
ABF4R	GGTTCCTCCGTAACTAGCTAATCC
		ABI5F	ATGGTAACTAGAGAAACGAAGT
ABI5R	TTCTCCTCTGCGTTCCAAATAG
		RD29AF	CTGTTGATGAGAAGTTGACTC
RD29AR	GAGAAACTTCAGATTGGAGGAG
		RAB18F	ATGACGAGTACGGAAATCCGATGG
RAB18R	TAGCTCCTCCGCCAGTTCCAAAG
		P5CSF	CACGAAGTTGCAGAGCTATTC
P5CSR	TGGATGGGAATGTCCTGATG

实施例6

TaSec14-7B转基因拟南芥生理指标测定

S1，酶粗提取液的制备

0.05M PBS(pH＝7.8)的配制：取0.663g NaH₂PO₄·2H₂O和16.3849g Na₂HPO₄·12H₂O加蒸馏水定容至1L；

0.05M磷酸缓冲液(pH＝7.8)：取0.663g NaH₂PO₄·2H₂O和16.3849g Na₂HPO₄·12H₂O加蒸馏水定容至1L；

取0.2g样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，加入2mL 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH＝7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中(PBS总用量为8mL)，在4℃、10000g下离心15min，上清液即为酶液。

S2，POD酶活测定

使用愈创木酚试剂测定对照及转基因拟南芥中过氧化物酶(POD酶)的活性，结果见图6。

100μL酶液+2700μL PBS(25mM，PH7.0，+2mM EDTA)+100μL愈创木酚(1.5％，1.5mL定溶于100mL)+100μL H₂O₂(300mM，1.53mL 30％的H₂O₂定溶于50mL)；摇匀，迅速转入比色皿，A470动力学方法测定，每30s读数，共读7次(3min)。

以100μL PBS(提取液)+2700μL PBS(25mM，PH7.0，+2mM EDTA)+100μL愈创木酚(1.5％，1.5mL定溶于100mL)+100μL H₂O₂(300mM)调零。

按下式计算活性POD活性＝(ΔA470×Vt)/(W×Vs×t)(U/g FW)

S3，SOD酶活测定，结果见图6；

NBT反应液：1L PBS(同提取液)+1.93g甲硫氨酸(待完全溶解后再溶其他物质)+0.0458g NBT+0.0291g EDTA+0.00046g核黄素(测定前加入并进行试验)。

3mL NBT反应液于小烧杯中+100μL酶粗提液，于4000Lux下光照15min，以3mL NBT反应液+100μL提取缓冲液为CK；OD 560比色。

计算：SOD活性(u/g)＝[(OD对照－OD测试)/OD对照]×Vt×2/Vs/W。

S4，MDA含量测定，见图6

以3mL，PH＝7.8的PBS(提取液)为对照，加入3mL 0.6％ TBA，混合后于沸水浴上反应15min，冷却后离心(4000×g)10min，上清液仪器调零；

吸取粗酶提取液3mL于带塞试管中，加入3mL 0.6％TBA，混合后于沸水浴上反应15min，冷却后离心(4000×g)10min，上清液分别于紫外可见分光光度计532nm、600nm和450nm处比色。

MDA(μmol/L)＝6.45(OD532－OD600)－0.56OD450

最后MDA含量为：MDA(μmol/gFW)＝[6.45(OD532－OD600)－0.56OD450]×V/样本重量(g)

S5，可溶性糖含量测定，见图6

测定方法同MDA。

结果计算：可溶性糖的浓度(mmol/L)＝11.71×D450，然后进一步换算成叶片可溶性糖含量，单位为μmol/gFW。

转基因拟南芥的POD、SOD活性显著高于野生型，说明在盐胁迫下，转基因拟南芥的抗氧化能力更强，保护植株免受活性氧的伤害；转基因株系的丙二醛含量明显低于野生型，表明在盐胁迫下，转基因株系的过氧化以及受伤害程度小于野生型；转基因株系可溶性糖含量显著高于野生型，因此在盐胁迫下，转基因拟南芥失水可能性小于野生型，能更好地生长。

以上结果表明，转基因拟南芥耐盐胁迫能力更强，TaSec14-7B基因提高了植物耐盐胁迫的能力。

Claims

1.小麦耐盐基因TaSec14-7B，其cDNA序列是序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的小麦耐盐基因TaSec14-7B，其特征在于，其编码蛋白是下述氨基酸序列：序列表中SEQ ID No.2序列。

3.如权利要求1所述的基因TaSec14-7B在培育耐盐植物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物为小麦。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。