CN105063062A - 小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱基因—<i>TaDHN3</i>的克隆、重组、功能分析及其应用。本发明公开了一种小麦耐盐、抗旱基因，即小麦脱水素基因<i>TaDHN3</i>及含有所述基因<i>TaDHN3</i>的植物表达载体，本发明还公开了所述基因<i>TaDHN3</i>在培育耐盐、抗旱植物中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的耐盐、抗旱能力明显提高。

Description

小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，表达载体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，表达载体及其应用。

背景技术

近年来，各种非生物胁迫严重影响作物的产量，其中盐和干旱胁迫对植物的影响尤为突出。小麦是全世界35%以上人口的主食，也是山东省主要粮食作物之一。但小麦属甜土植物，在盐渍化土壤中生长极差。通过基因工程培育耐逆新品种是有效利用盐碱地、提高植物的抗旱能力、增加粮食产量、保障粮食安全的重要手段。目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的的进展。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的耐盐能力提高。因此克隆耐盐相关基因具有重要的意义。

脱水素（又称为第二类胚发育后期丰富蛋白）是ABA依赖的盐胁迫信号转导通路下游的功能基因，其最早发现于胚发育后期，在种子成熟后期的脱水过程中大量表达。除了参与植物正常的生长发育外，脱水素基因主要参与了植物对高盐、干旱、冷等各种非生物胁迫的抗性。目前，人们在不同植物中克隆到一些脱水素基因，转基因实验证明，过表达不同脱水素基因后可提高转基因植株的耐逆性。但由于脱水素基因种类较多，根据结构上的差异，脱水素基因可以分为5大类，分别为：Kn，SKn，KnS，YnSKm，YnKm。不同类脱水素基因功能各异，加上脱水素基因在体内的实际功能还不清楚，因此有关脱水素基因的研究还有许多工作有待研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐盐、抗旱基因——小麦脱水素基因TaDHN3及其应用。我们在前期芯片杂交实验中发现一个代表脱水素基因的探针在盐处理后的小麦根中显著上调表达，本研究在前期研究的基础上，克隆了该脱水素基因，功能研究表明，过表达该基因可提高植物的耐盐和抗旱能力。

本发明的技术方案在于首先根据小麦的表达谱芯片数据选出在小麦幼苗根中显著受盐诱导表达的脱水素基因（探针），然后根据探针序列设计基因特异性引物，从小麦幼苗根的全长cDNA文库中克隆脱水素基因TaDHN3全长cDNA。测序获得序列后，构建包含TaDHN3基因完整ORF的稳定过表达载体，最后在拟南芥中进行功能验证。

本发明提供的小麦耐盐、抗旱基因名称为TaDHN3，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。其氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。

本发明还提供了含上述小麦基因TaDHN3的植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaDHN3。通过引物向SEQIDNo.1序列两侧引入XbaI和SacI双酶切位点，用该引物扩增TaDHN3cDNA序列，并将PCR产物与T在体连接、XbaI和SacI双酶切、回收目的基因片段，然后用相同的酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体pCAMBIA-super1300回收载体大片段并与回收的目标基因片段再连接获得，所述引物序列为：D3ORF5:5’-TCTAGAATGGAGTACCAGGGACAGCAG-3’（XbaI），D3ORF3:5’-GAGCTCTCCAGTGCTGGCCAGGGAGC-3’(SacI)。本发明所述表达载体的特征在于外源基因的表达框中含有TaDHN3基因的完整的编码框，即全长ORF（openreadingframe）。

本发明所述基因TaDHN3在培育耐盐、抗旱植物中的应用。所述植物优选是普通小麦、玉米和水稻等单子叶植物。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，其特点是载体含有本发明中TaDHN3基因的核苷酸序列，如SEQIDNo.1所示。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐、抗旱农作物新品种。

本发明还提供了表达载体pCAMBIA-super1300/TaDHN3在培育耐盐、抗旱植物中的应用。

本发明还提供了提高含有本发明小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3植物耐盐和抗旱性的方法，是将本发明小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3导入宿主植物细胞、组织或植株个体，得到具有耐盐、抗旱性能的植株，所述的宿主植物为小麦、玉米和水稻等单子叶植物。

本发明的有益效果：本发明提供的小麦耐盐、抗旱基因名称为TaDHN3，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明首次克隆得到了小麦脱水素基因TaDHN3，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐、抗旱能力明显提高。

附图说明

图1TaDHN3基因全长cDNA序列的扩增结果。M为λDNA/(EcoRI+HindⅢ)Marker；下同。

图2ABA和NaCl处理后TaDHN3基因在小麦幼苗根和叶中的RT-PCR分析。

图3构建的植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaDHN3的XbarI、SacI双酶切验证结果。

图4-A至图4-C为对照及转基因拟南芥株系的表型鉴定。

图4-A：野生型Col-0及转基因拟南芥株系在不同浓度NaCl处理下初生根根长统计结果；其中WT：未转化的Col-0野生型拟南芥；3、16为转pCAMBIA-super1300/TaDHN3的不同转基因拟南芥株系。CK为对照，即在正常的MS培养基上培养。﹡：P﹤0.05，﹡﹡P﹤0.01。

图4-B：野生型Col-0及转基因拟南芥株系在不同甘露醇浓度处理下初生根根长统计结果；

其中WT：未转化的Col-0野生型拟南芥；3、16为转pCAMBIA-super1300/TaDHN3的不同转基因拟南芥株系。CK为对照，即在正常的MS培养基上培养。﹡：P﹤0.05，﹡﹡P﹤0.01。

图4-C：正常生长3周的拟南芥及正常生长3周然后干旱处理15天的拟南芥生长情况。

具体实施方式

实施例1、TaDHN3基因cDNA序列的克隆

1．1TaDHN3基因全长cDNA序列的克隆和序列测定

1．引物序列

根据芯片探针序列将探针与Genank中的EST库比对，可拼接到含有一个全长ORF的cDNA序列，根据拼接的cDNA序列，设计包含完整ORF的PCR扩增引物，为以小麦幼根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。引物序列为：TaDHN3-5′：5′-CAGCAGCACTAGATTTTGATTC-3′，TaDHN3-3′：5′-CTGTTTGTTCACGTAAACTTGAG-3′。

2．PCR反应体系（50μL）

2×GCbufferⅠ10μl

模板cDNA文库1ul

dNTPs（2.5mMeach）0.5μl

Primer1(10μM)1μl

Primer2(10μM)1μl

LATaq(TaKaRa)0.5ul

ddH₂O加至终体积50μl

3．PCR反应程序为

94℃预变性3min；94℃变性45sec，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。

4．1％琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在900kbp左右处有一条目的条带（图1）。

5．扩增片段的回收、与T载体的链接

对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。PCR产物与pGEM-T(Promega)载体连接，连接体系为：

回收的PCR产物7μl

10×T4连接酶缓冲液1μl

pGEM-T载体(50ng/μl)1μl

T4DNA连接酶（3U/μl）(Takara)1μl

dH2O至10μl

于16℃水浴连接过夜。

6．回收片段的克隆与测序

（1）大肠杆菌感受态细胞的制备

①从-80℃冰箱中拿出保存于甘油中的E.coliDH5a菌株（购自天为时代生物公司），放在冰上缓慢解冻；

②在超净工作台上用接种环划线（LB固体培养基，不含Amp）；

③将平板于37℃恒温培养箱倒置培养过夜；

④挑取平板上的单菌落接种于含5mlLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养14－16小时；

⑤取0.5ml菌液接种于含50mlLB液体培养基的250ml的三角瓶中，37℃振荡（260rpm）培养2－3小时（OD260=0.5）；

⑥将培养的菌液置冰上1小时；

⑦4℃离心4分钟（4000rpm），去上清；

⑧用25ml冰预冷的溶液A将菌体轻轻悬浮起来，再在冰上放置40－45分钟；

⑨重复步骤（8）；

⑩用2.5ml冰预冷的溶液B将菌体轻轻悬浮起来，然后将菌液分装到1.5ml离心管中（每管100μl），放入-80℃冰箱备用。

（2）连接产物的转化

①从-80℃冰箱中取出1管（100μl）感受态细胞，置冰上缓缓解冻30分钟；

②超净工作台上向管中加入5μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟；

③42℃水浴热激90秒，迅速置冰上3－5分钟；

④在超净工作台上向离心管中加入1mlLB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时（260rpm）；

⑤室温下5000rpm离心6分钟，弃掉900μl上清液，将剩余100μl上清液重新悬浮菌体，加入40μl的X-gal和4μl的IPTG，混匀，然后用涂布器将其均匀涂到准备的平板上，放置30分钟；

⑥倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出；

⑦放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明；

⑧用灭菌的牙签挑取白斑于装有10mlLB液体培养基（含60μg/mlAmp）的试管中，37℃摇菌过夜。

（3）重组质粒的PCR鉴定及测序

本实验所用的pGEM-T载体的克隆位点的上游有T7启动子，下游有SP6启动子，所以可以用这两个启动子序列做引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定；

①PCR程序：94℃预变性10min；94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min；

②PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果表明所得序列包含一个完整的ORF，长696bp。全长ORF序列见SEQIDNo.1。

实施例2、ABA、NaCl处理条件下TaDHN3基因的表达分析

2．1材料处理

小麦材料山融3号的种子正常萌发，1周后去掉胚乳，Hangload培养液继续培养1周。盐胁迫在液体培养基中施加200mMNaCl，ABA处理施加100μMABA，分别在处理后的0、0.5、3、12、24，48小时取幼嫩的叶片和根系用于提取总RNA。

2．2Trizol法提取小麦TotalRNA。

1．将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2．待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3．加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4．4℃，12000rpm离心15分钟；

5．用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min；

6．4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7．RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8．重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9．去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10．紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1ulRNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的2kbDNAMarker作为对照。

2．3第一链cDNA的合成

采用PrimeScript^TMRT-PCRKit进行。反应步骤如下：

1．在Microtube管中配制下列混合液。

dNTPMixture(10mM)1μl

OligodTPrimer(2.5μM)1μl

TotalRNA4μl

RNasefreeH₂O4μl

2．在PCR仪上进行变性、退火反应。

65℃5min

4℃1min

3．离心数秒钟使RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4．在上述Microtube管中配制下列反转录反应液

上述变性、退火后反应液10μl

5×PrimerScript^TMBuffer4μl

RNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl

PrimScript^TMRTase0.5μl

RnaseFreedH₂O5μl

5．在PCR仪上按下列条件进行反转录反应

42℃15-30min

95℃5min

4℃保温

2．4PCR反应及电泳

1．以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下

TaAct-S:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′

TaAct-A:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′

D3Rt1:5′-TTCAGCGCAGCGCGAGATG-3′

D3Rt2:5′-TGGCCACCAGGGAGCTTCTC-3′

2．PCR体系

ddH₂O4.7μl

10×buffer2μl

Primer1（2μM）1μl

Primer2（2μM）1μl

dNTP（10mMeach）0.2μl

rTaqpolymerase（5U/μl）0.1μl

逆转录cDNA模板1μl

TotalVolume10μl

3．PCR程序

94℃5min；25～30cycles，94℃20s，57℃60s，72℃45s；72℃5min。

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

4．1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。结果表明TaDHN3受ABA和NaCl诱导表达，且与其在叶中的表达相比，TaDHN3在根中的表达较高。

实施例3、 TaDHN3植物表达载体的构建

植物表达载体pCAMBIA-super1300是含有35S启动子和NPTⅡ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶XbaI和SacI位点。根据基因TaDHN3的cDNA序列，设计包含完整ORF的基因特异性引物，同时在引物的5′端分别引入XbaI和SacI酶切位点，引物序列为：D3ORF5:5’-TCTAGAATGGAGTACCAGGGACAGCAG-3’（XbaI），

D3ORF3:5’-GAGCTCTCCAGTGCTGGCCAGGGAGC-3’(SacI)。用该对引物扩增TaDHN3的cDNA序列。将PCR扩增产物回收并与T载体连接，提取质粒后分别用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切含有目的基因的T载体和载体pCAMBIA-super1300载体，分别回收酶切的目的基因序列和1300载体序列，然后连结，构建获得植物表达载体pCAMBIA-super1300/TaDHN3。

3．1质粒pCAMBIA-super1300空载体和目的基因片断XbaI和SacI双酶切

酶切体系如下：

XbaIlμl

SacI1μl

pCAMBIA-super1300载体

(或含有目的基因的T载体质粒)5μl

10×BufferM1μl

ddH₂OTo20μl

于37℃恒温水浴锅酶切3小时以上。

3．2酶切产物的电泳与回收

双酶切完成后，以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pCAMBIA-super1300中载体的大片段和目的基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。

3．3连接

经酶切的pCAMBIA-super1300载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

3．4转化

连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

3．5重组子的鉴定

质粒酶切鉴定。提取阳性克隆质粒，对质粒进行XbaI和SacI双酶切，酶切体系同3．1。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，检测到已切开的合适大小的目的基因条带和载体条带，证明载体构建正确（图3）。

实施例4、农杆菌感受态的制备与转化

4．1农杆菌GV3101感受态的制备

1．从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml

利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

2．取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件

下培养至OD₆₀₀达0.5。

3．菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

4．将菌体重悬于冰浴的10ml0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

5．再悬浮于1ml20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml

Eppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

4．2冻融法转化根癌农杆菌GV3101

1．在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴

30min。

2．置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

3．加入无抗生素的YEP800μl，28℃震荡培养3hr。

4．7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/mlKan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

4．3菌体PCR鉴定。

菌体PCR所用引物同实施例3。方法及程序同2.4。

实施例5、转基因功能验证——拟南芥转化、筛选及表型分析

5．1拟南芥的种植

将野生型拟南芥种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01%Triton-X100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于MS平板上，于4°C春化2-3天。然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），23°C培养，16/8h光周期，光强30-40μmolm-2s-1；待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的4-6天内，进行农杆菌转化。

5．2拟南芥转化

把200ml菌液倒入浅盘中。将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动沾花30sec-1min。取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿。将托盘置暗处培养24h。然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟。

5．3阳性植株的筛选：T0代种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01%Triton-X100）消毒后，点播在MS选择培养板(30mg/L潮霉素)上。于4℃下春化2-3天。移入培养室中培养。大约10天左右，挑选潮霉素抗性植株（长出真叶1-2对，根伸长至培养基中）并移栽到营养钵中。培养直至种子成熟。同样方法筛选T1代种子得到T2代植株。并在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，并获得纯合T3代株系进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定。

5．4转基因拟南芥的PCR鉴定

1．拟南芥基因组DNA的提取

（1）取100mg左右的新鲜叶片，放入1.5ml离心管中，液氮速冻，研磨器中磨碎，加入600μl预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液，混匀置于65℃水浴中放置90min；

（2）混合物冷至室温后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000rpm离心10min；

（3）取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000rpm离心10min；

（4）取上清，加入1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.3）和0.7倍体积的异丙醇，仔细混匀，室温放置15min，沉淀DNA；

（5）用一玻璃钩将DNA钩出，并转移至一装有800μl70%乙醇的干净Eppendorf管中，室温放置数分钟洗涤沉淀，6000g离心5min；

（6）尽量去尽上清，空气干燥数分钟，溶于适量TE缓冲液中。

2．PCR扩增

以上面提取的拟南芥基因组DNA为模板，用基因特异性引物（同实施例3）进行PCR扩增。

PCR体系同2.4。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，58℃复性45sec，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到在转基因拟南芥植株中扩增出一600bp左右的目的条带，在转空载体的植株中未见扩增条带。

5．5转基因拟南芥的表型鉴定

1．拟南芥的种植

T3代单拷贝纯合拟南芥株系的种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01%Triton-X100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于MS平板上，于4°C春化2-3天，然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），23°C培养，16/8h光周期，光强30-40μmolm-2s-1。

2．NaCl和干旱胁迫处理

NaCl处理：将萌发2天的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）小心移植含有50mM、100mMNaCl的MS培养皿中，竖直培养一周观察表型。结果表明在在正常MS培养基上，Col-0野生型拟南芥和转TaDHN3基因的拟南芥表型差异不大，而在含有50mM或100mMNaCl的MS培养基上，转TaDHN3基因的拟南芥植株的根系明显长于野生型Col-0，T测验表明二者根长差异达到了显著性水平（图4-A）。

渗透胁迫处理：将萌发2天的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）小心移植含有50mM、100mM、150mM甘露醇的MS培养皿中，竖直培养一周观察表型。结果表明在在正常MS培养基上，Col-0野生型拟南芥和转TaDHN3基因的拟南芥表型差异不大，而在含有50mM100mM或150mM甘露醇的MS培养基上，转TaDHN3基因的拟南芥植株的根系明显长于野生型，T测验表明二者根长差异达到了显著性水平（图4-B）。

干旱处理：将萌发一周的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）移植培养土中，培养20天后开始控水（不浇水）干旱处理。干旱处理15天后观察表型。结果表明干旱处理15天后，野生型拟南芥植株萎蔫，一些株系的叶子变得干枯(图4－C中的Col-0区域)；而转了TaDHN3外源基因的拟南芥植株长势旺盛，能正常结出荚果(图4-CTaDHN3-3和TaDHN3-16株系)。在图4－C中可见上下两排共6各小穴，其中上排最左面一个穴中未种植植株，上排第2、3个穴中种植的植株是小麦脱水素基因TaDHN3的两个不同的转基因株系的植株，也就是TaDHN3-3和TaDHN3-16株系的植株。下面一排的最左面一个Col-0小穴中种植的是未转基因对照植株。下面一排的第2、3个穴中种植的植株不是本专利内容。

序列表

SQIDNo.1

<110>济南大学

<120>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<141>2015-07-30

<160>1

<210>1

<211>696

<212>cDNA

<213>小麦

<221>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<222>（1）…（696）

<400>1

1ATGGAGTACCAGGGACAGCAGCAGCACGGCCGCGTCGACGAGTACGGCAACCCGGTGGCC

61CGACATGGCGTCGGCACCGGCATGGGGACGCACGGCGGCGTCGGCACAGGAGCGGCCGCC

121GGTGGGCATTTCCAGCCCATGAGGGACGAGCACCAGACTGGCCGTGGGATCCTGCACCGC

181TCCGGCAGCTCCAGCTCCAGCTCGTCTGAGGACGATGGCATGGGCGGGAGGAGGAAGAAG

241GGCATCAAGGAGAAGATCAAGGAGAAGCTCCCTGGTGGCCACGGTGACCAGCAGCACACC

301GGTGGCACCTACGGACAGCAGGGTACTGGCATGGCCGGCACCGGCGGCACCTACGGGCAG

361CAGGGTCACACTGGGATGGCCGGCACCGGTGGCACCTACGGACAGCAAGGCCACACTGGG

421ATGGCCGGCACCGGCGGCGCCTACGGGCAGCAGGGTCACACTGGGATGACCGGCACCGGC

481GGCACCTACGGACAGCAGGGCCACACTGGGATGGCCGGCACCGGAGCACATGGCACCACG

541GCCACCGGCGGCACCTACGGGCAGCAGGGCCACACCGGGATGACAGGCACAGGGGCGCAC

601GGCACTGGCGGCGCGTACGGGCAACACGGCACGGACACCGGCGAGAAGAAGGGCATCATG

661GACAAGATCAAGGAGAAGCTCCCTGGCCAGCACTGA

SQIDNo.2

<110>济南大学

<120>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<141>2015-7-30

<160>1

<210>1

<211>231

<212>AA

<213>小麦

<221>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<222>（1）…（231）

<400>1

1MEYQGQQQHGRVDEYGNPVA

21RHGVGTGMGTHGGVGTGAAA

41GGHFQPMRDEHQTGRGILHR

61SGSSSSSSSEDDGMGGRRKK

81GIKEKIKEKLPGGHGDQQHT

101GGTYGQQGTGMAGTGGTYGQ

121QGHTGMAGTGGTYGQQGHTG

141MAGTGGAYGQQGHTGMTGTG

161GTYGQQGHTGMAGTGAHGTT

181ATGGTYGQQGHTGMTGTGAH

201GTGGAYGQHGTDTGEKKGIM

221DKIKEKLPGQH*

序列表

SQIDNo.1

<110>济南大学

<120>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<141>2015-07-30

<160>1

<210>1

<211>696

<212>cDNA

<213>小麦

<221>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<222>（1）…（696）

<400>1

1ATGGAGTACCAGGGACAGCAGCAGCACGGCCGCGTCGACGAGTACGGCAACCCGGTGGCC

61CGACATGGCGTCGGCACCGGCATGGGGACGCACGGCGGCGTCGGCACAGGAGCGGCCGCC

121GGTGGGCATTTCCAGCCCATGAGGGACGAGCACCAGACTGGCCGTGGGATCCTGCACCGC

181TCCGGCAGCTCCAGCTCCAGCTCGTCTGAGGACGATGGCATGGGCGGGAGGAGGAAGAAG

241GGCATCAAGGAGAAGATCAAGGAGAAGCTCCCTGGTGGCCACGGTGACCAGCAGCACACC

301GGTGGCACCTACGGACAGCAGGGTACTGGCATGGCCGGCACCGGCGGCACCTACGGGCAG

361CAGGGTCACACTGGGATGGCCGGCACCGGTGGCACCTACGGACAGCAAGGCCACACTGGG

421ATGGCCGGCACCGGCGGCGCCTACGGGCAGCAGGGTCACACTGGGATGACCGGCACCGGC

481GGCACCTACGGACAGCAGGGCCACACTGGGATGGCCGGCACCGGAGCACATGGCACCACG

541GCCACCGGCGGCACCTACGGGCAGCAGGGCCACACCGGGATGACAGGCACAGGGGCGCAC

601GGCACTGGCGGCGCGTACGGGCAACACGGCACGGACACCGGCGAGAAGAAGGGCATCATG

661GACAAGATCAAGGAGAAGCTCCCTGGCCAGCACTGA

SQIDNo.2

<110>济南大学

<120>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<141>2015-7-30

<160>1

<210>1

<211>231

<212>AA

<213>小麦

<221>小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，重组质粒及其应用

<222>（1）…（231）

<400>1

1MEYQGQQQHGRVDEYGNPVA

21RHGVGTGMGTHGGVGTGAAA

41GGHFQPMRDEHQTGRGILHR

61SGSSSSSSSEDDGMGGRRKK

81GIKEKIKEKLPGGHGDQQHT

101GGTYGQQGTGMAGTGGTYGQ

121QGHTGMAGTGGTYGQQGHTG

141MAGTGGAYGQQGHTGMTGTG

161GTYGQQGHTGMAGTGAHGTT

181ATGGTYGQQGHTGMTGTGAH

201GTGGAYGQHGTDTGEKKGIM

221DKIKEKLPGQH*

Claims (8)

1.一种小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.如权利要求1所述的一种小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。

3.表达载体pCAMBIA-super1300/TaDHN3：通过引物向SEQIDNo.1序列两侧引入XbaI和SacI双酶切位点，然后由XbaI和SacI双酶切植物表达载体pCAMBIA-super1300和SEQIDNo.1所示的基因片断，回收载体大片段和目标基因片段再连接获得，

所述引物序列为：D3ORF5:5’-TCTAGAATGGAGTACCAGGGGCAGCAC-3’（XbaI）

D3ORF3:5’-GAGCTCTCAGTGCTGTCCGCCGGG-3’(SacI)。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的特征在于外源基因的表达框中含有TaDHN3基因的完整的编码框，即全长ORF（openreadingframe）。

5.一种小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3在培育耐盐和抗旱植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述耐盐和抗旱植物是小麦、玉米和水稻等单子叶植物。

7.表达载体pCAMBIA-super1300/TaDHN3在培育耐盐、抗旱植物中的应用。

8.提高含有权利要求1中所述基因TaDHN3植物耐盐和抗旱性的方法，是将权利要求1所述基因TaDHN3导入宿主植物细胞、组织或植株个体，得到具有耐盐、抗旱性能的植株，所述的宿主植物为小麦、玉米和水稻等单子叶植物。