ES2303985T3 - Productos alimentarios aireados que contienen hidrofobina. - Google Patents

Abstract

Una composición congelada que comprende hidrofobina en forma aislada, con la condición de que se excluya la hidrofobina de Tricholoma matsutake.

Description

Productos alimentarios aireados que contienen hidrofobina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a productos congelados que incluyen hidrofobinas.

Antecedentes de la invención

Durante el almacenamiento, los cristales de hielo presentes en los productos congelados tienden a aumentar de tamaño como resultados de procesos dinámicos tales como la recristalización. Esto puede conducir a unas características malas del producto, tales como mal aspecto y un gusto inaceptable y/o al daño del producto. Anteriormente se ha sugerido el uso de proteínas denominadas "proteínas anticongelación" (también conocidas como "proteínas estructurales de hielo") para inhibir el proceso de la recristalización del hielo.

Resumen de la invención

Los inventores han descubierto que una clase de proteínas que se encuentran en los hongos, denominadas hidrofobinas, también pueden inhibir el crecimiento de los cristales de hielo en los productos congelados.

En consecuencia, la presente invención proporciona una composición congelada, tal como un producto alimenticio congelado, que comprende hidrofobina, con la condición de excluir la hidrofobina de Tricholoma matsutake. Preferentemente, la hidrofobina se encuentra en forma aislada. En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una composición congelada, tal como un producto alimenticio congelado, que comprende hidrofobina en una forma capaz de ensamblar a una superficie aire-líquido y una composición congelada, tal como un producto alimenticio congelado, a la que se ha añadido la hidrofobina en dicha forma.

Preferentemente la hidrofobina es una hidrofobina de clase II.

En una forma de realización preferida, la hidrofobina está presente en una cantidad de al menos 0,001% p, más preferentemente al menos 0,01% p.

En una forma de realización, la composición congelada está aireada. En otra forma de realización, la composición congelada no está aireada.

La presente invención también proporciona el uso de hidrofobina en un procedimiento de inhibir el crecimiento de los cristales de hielo en una composición congelada. Preferentemente, la hidrofobina se usa para inhibir la recristalización del hielo.

En un aspecto relacionado, la presente invención también proporciona el uso de hidrofobina en un procedimiento de modificación de la forma dominante de los cristales de hielo en una composición congelada.

La presente invención además proporciona un procedimiento de inhibir el crecimiento de los cristales de hielo, por ejemplo la recristalización de hielo, en una composición congelada, en la que el procedimiento comprende añadir a la composición hidrofobina antes y/o durante la congelación de la composición.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un procedimiento de modificación de la forma dominante de los cristales de hielo en una composición congelada, en la que el procedimiento comprende añadir a la composición hidrofobina antes y/o durante la congelación del producto.

En una forma de realización preferida de los usos y procedimientos descritos en lo que antecede, la composición es un producto alimenticio congelado.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el significado que un experto habitual en la técnica entendería normalmente (p. ej., en la fabricación de productos de confitería refrigerados/productos de confitería congelados, química y biotecnología). Definiciones y descripciones de diversos términos y técnicas usadas en la fabricación de productos de confitería refrigerados/congelados se encuentran en Ice Cream, 4ª Edición, Arbuckle (1986), Van Nostrand Reinhold Company, New York, NY. Las técnicas estándar usadas para los procedimientos moleculares y bioquímicos se pueden encontrar en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc., y la versión completa titulada Current Protocols in Molecular Biology).

Hidrofobinas

Las hidrofobinas son una clase de proteínas bien definidas (Wessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38: 1-45; Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646) capaces de autoensamblarse en una interfaz hidrofóbica/hidrofílica y que tienen una secuencia conservada:

(SEC ID Nº 1)X_{n}-C-X_{5-9}-C-C-X_{11-39}-C-X_{8-23}-X_{5-9}-C-C-X_{8-18}-C-X_{m}

en la que X representa cualquier aminoácido, y n y m representan de forma independiente un número entero. Normalmente, una hidrofobina tiene una longitud de hasta 125 aminoácidos. Los residuos de cisteína (C) en la secuencia conservada son parte de los puentes disulfuro. En el contexto de la presente invención, el término hidrofobina tiene un significado más amplio para incluir proteínas funcionalmente equivalentes que todavía muestran la característica de autoensamblarse a una interfaz hidrofóbica-hidrofílica que tiene como resultado una película proteica, tal como proteínas que comprenden la secuencia:

(SEC ID Nº 2)X_{n}-C-X_{1-50}-C-X_{0-5}-C-X_{1-100}-C-X_{1-100-}X_{1-50}-C-X_{0-5}-C-X_{1-50}-C-X_{m}

o partes de las mismas que todavía muestran la característica de autoensamblarse en una interfaz hidrofóbica-hidrofílica resultante en una película proteica. De acuerdo con la definición de la presente invención se puede detectar el autoensamblaje mediante la adsorción de la proteína en Teflón y el uso del dicroísmo circular para establecer la presencia de una estructura secundaria (en general, \alpha-hélice) (De Vocht y col., 1998, Biophys, J. 74: 2059-68).

La formación de una película se establece mediante la incubación de una lámina de teflón en la solución proteica, seguida por al menos tres lavados con agua o tampón (Wosten y col., 1994, 1994, Embo. J. 13: 5848-54). La película proteica se puede visualizar mediante cualquier procedimiento adecuado, tal como marcaje con un marcador fluorescente o mediante el uso de anticuerpos fluorescentes, como está bien establecido en la técnica, m y n normalmente tienen valores que varían de 0 a 2000, pero con más frecuencia m y n en total son inferiores a 100 o 200. La definición de hidrofobina en el contexto de la presente invención incluye proteínas de fusión de una hidrofobina y otro polipéptido así como conjugados de hidrofobina y otras moléculas tales como polisacáridos.

Las hidrofobinas identificadas hasta la fecha se clasifican, por lo general, en de clase I o de clase II. Ambos tipos se han identificado en hongos como proteínas secretadas que se autoensamblan en interfaces hidrofílicas en películas anfipáticas. Los ensamblajes de las hidrofobinas de clase I son relativamente insolubles, mientras que los de las hidrofobinas de clase II se disuelven con facilidad en una diversidad de disolventes.

También se han identificado proteínas similares a hidrofobina en bacterias filamentosas, tales como Actinomycete y Streptomyces sp. (documento WO 01/74864). Estas proteínas bacterianas, por contraste con las hidrofobinas fúngicas, sólo forman hasta un puente disulfuro ya que sólo tienen dos residuos de cisteína. Tales proteínas son un ejemplo de equivalentes funcionales a las hidrofobinas que tienen las secuencias consenso que se muestran en las SEC ID Nº 1 y 2, y están dentro del alcance de la presente invención.

Las hidrofobinas se pueden obtener mediante extracción a partir de fuentes nativas, tales como hongos filamentosos, mediante cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, las hidrofobinas se pueden obtener mediante cultivo de hongos filamentosos que secretan la hidrofobina al medio de crecimiento o mediante extracción de los micelios fúngicos con etanol al 60%. Particularmente, se prefiere aislar hidrofobinas a partir de organismos huésped que secretan hidrofobinas de forma natural. Los huéspedes preferidos son hipomicetos (p. ej., Tricoderma), basidiomicetos y ascomicetos. Huéspedes particularmente preferidos son organismos de grado de alimento, tales como Cryptonectria parasitica, que secreta una hidrofobina denominada criparina (MacCabe y Van Alfen, 1999, App. Environ. Microbiol 65: 5431-5435).

Como alternativa, las hidrofobinas se pueden obtener mediante el uso de tecnología recombinante. Por ejemplo, las células huésped, normalmente microorganismos, se pueden modificar para que expresen hidrofobinas y, después, se pueden aislar las hidrofobinas y usar de acuerdo con la presente invención. Las técnicas para introducir en las células constructos de ácido nucleico que codifiquen hidrofobinas son bien conocidas en la técnica. Se han clonado más de 34 genes que codifican hidrofobinas de más de 16 especies fúngicas (véase, por ejemplo, el documento WO 96/41882, que facilita la secuencia de hidrofobinas identificadas en Agaricus bisporus; y Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646). La tecnología recombinante también se puede usar para modificar las secuencias de hidrofobina o sintetizar nuevas hidrofobinas que tengan las propiedades deseadas/mejoradas.

Normalmente, una célula huésped u organismo adecuados se transforman con un constructo de ácido nucleico que codifica la hidrofobina deseada. La secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido se puede insertar en un vector de expresión adecuado que codifica los elementos necesarios para la transcripción y la traducción y, de este modo, se expresarán en las condiciones adecuadas (p. ej., en la orientación adecuada y el marco de lectura correcto y con las secuencias diana y de expresión adecuadas). Los procedimientos requeridos para construir estos vectores de expresión son bien conocidos para los expertos en la técnica.

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Se pueden usar numerosos sistemas de expresión para expresar la secuencia codificadora del polipéptido. Estos incluyen, entre otros, bacterias, hongos (incluidas las levaduras), sistemas celulares de insectos, sistemas de cultivo de células vegetales y plantas todas transformados con los vectores de expresión adecuados. Los huéspedes preferidos son aquéllos que se consideran de grado alimenticio "generalmente reconocidos como seguros" (GRCS).

Entre las especies fúngicas adecuadas se incluyen levaduras tales como (entre otras) las de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizo saccharomyces y similares, y especies filamentosas tales como (entre otras) las de los géneros Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium y similares.

Las secuencias que codifican las hidrofobinas son, preferentemente, idénticas en al menos un 80% a nivel aminoacídico a una hidrofobina identificada en la naturaleza, más preferentemente idénticas en al menos un 95% o un 100%. No obstante, los expertos en la técnica pueden hacer sustituciones conservadoras u otros cambios de aminoácidos que no reduzcan la actividad biológica de la hidrofobina, Para el propósito de la invención, estas hidrofobinas que poseen este alto nivel de identidad con una hidrofobina natural también entran dentro del término "hidrofobinas".

Las hidrofobinas se pueden purificar a partir del medio de cultivo o de extractos celulares mediante, por ejemplo, el procedimiento descrito en el documento WO 01/57076, que implica adsorber la hidrofobina presente en una solución que contiene hidrofobina a una superficie y, después, poner en contacto la superficie con un tensioactivo, como Tween 20, para eluir la hidrofobina de la superficie. Véase también Collen y col., 2002, Biochem Biophys Acta. 1569: 139-50; Calonje y col., 2002, Can. J. Microbiol. 48: 1030-4; Askolin y col., 2001, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 124-30; y De Vires y col., 1999; Eur J Biochem. 262: 377-85.

El documento KR 2004 0 18844 describe un procedimiento de aislamiento y purificación de proteína hidrofobina de Tricholoma matsutake.

Composiciones congeladas

Las composiciones congeladas/productos congelados incluyen productos alimenticios congelados y materiales biológicos congelados. Los productos alimenticios congelados incluyen materiales congelados derivados de plantas, así como productos alimenticios procesados congelados, tales como comidas preparadas, salsas y productos de confitería congelados tales como helado, hielo de leche, yogur helado, sorbete, granizados, natillas heladas, helados de agua, sorbete, granitas y purés congelados.

Las composiciones congeladas de la invención pueden estar aireadas o no aireadas. El término "aireado" significa que en el producto se ha incorporado intencionadamente gas, como por ejemplo por medios mecánicos. Preferentemente el gas es un gas de cualquier grado alimentario tal como aire, nitrógeno o dióxido de carbono. Normalmente la cantidad de la aireación, especialmente en el contexto de productos alimentarios aireados, se define en términos de "esponja-miento". En el contexto de la presente invención, el % de esponjamiento se define en términos de volumen como:

(volumen del producto aireado final-volumen de la mezcla)/(volumen de la mezcla) X 100

La cantidad de esponjamiento presente en el producto variará en función de las características del producto deseadas. Por ejemplo, el nivel de esponjamiento en la crema de helado suele ser de aproximadamente 70 al 100%, mientras que el esponjamiento en helados de agua es del 25 al 30%.

Una composición no aireada, tal como un producto alimentario congelado, preferentemente un esponjamiento inferior al 20%, más preferentemente inferior al 10%. Un producto alimentario no aireado no está sometido a etapas premeditadas tales como batir para incrementar el contenido en gas. Sin embargo, se apreciará que durante la preparación de productos alimentarios congelados no aireados, se pueden incorporar en el producto niveles bajos de gas, tal como aire.

Productos de confitería congelados

Entre los productos de confitería congelados se incluyen productos de confitería que normalmente incluyen leche o sólidos de leche, tales helado, helado de leche, yogur congelado, sorbete y natillas congeladas, así como productos de confitería congelados que no contienen leche o sólidos de leche, tales como helado de agua, sorbete, granitas y purés congelados.

El documento de EE.UU. 6096867 se refiere al uso de proteínas anticongelación vegetales en productos de confitería congelados.

Los productos de confitería congelados pueden estar en forma de un producto compuesto, en el que al menos una porción o región del producto, tal como un núcleo o capa, no contiene hidrofobina. Un ejemplo de esto sería un producto contiene un núcleo de helado que carece de hidrofobina, recubierto en una capa de helado, helado de leche o helado de agua que contiene hidrofobina. Se apreciará que en el caso de un producto compuesto, la cantidad en %p de hidrofobina añadida se calcula únicamente en relación con dichos componentes del producto de confitería que contiene hidrofobina y no en relación con el producto completo.

Preferentemente, los productos de confitería congelados aireados tienen un esponjamiento de 25% a 300%, tal como del 25% al 150%, más preferentemente del 50 al 150%.

La cantidad de hidrofobina presente en las composiciones congeladas de la invención variará, por lo general, en función de la formulación del producto y, en el caso de los productos aireados, el volumen de la fase de aire. Normalmente, el producto contendrá al menos un 0,001 % p de hidrofobina, más preferentemente al menos 0,005 o 0,01 %p. Normalmente, el producto contendrá menos del 1% p de hidrofobina. La hidrofobina puede proceder de una única fuente o de una pluralidad de fuentes, por ejemplo la hidrofobina puede ser una mezcla de dos o más polipéptidos de hidrofobina diferentes.

Preferentemente, la hidrofobina es una hidrofobina de clase II.

En general, la hidrofobina estará en forma aislada, normalmente al menos parcialmente purificada, tal como una pureza de al menos un 10% o un 20%, según el peso de los sólidos. Por tanto, la hidrofobina no se añade como parte de un organismo natural, tal como un champiñón, que expresa de forma natural hidrofobinas. En su lugar, normalmente la hidrofobina se ha extraído de una fuente natural o se ha obtenido mediante expresión recombinante en un organismo huésped.

Las composiciones para producir un producto alimentario congelado de la invención incluyen premezclas líquidas, por ejemplo premezclas usadas en la producción de productos de confitería congeladas, y mezclas secas, por ejemplo polvos, a las que se añaden un líquido acuoso, tal como leche o agua, antes o durante la congelación.

Las composiciones para producir un producto alimentario congelado de la invención comprenderá otros ingredientes, además de la hidrofobina, que normalmente están incluidos en el producto alimentario, por ejemplo azúcar, grasa, emulsionantes, aromatizantes etc. Las composiciones pueden incluir todos los ingredientes restantes requeridos para preparar el producto alimentario de modo que la composición esté lista para su procesamiento para formar un producto alimentario congelado de la invención.

Las composiciones secas para producir un producto alimentario congelado de la invención también comprenderán otros ingredientes, además de la hidrofobina, que normalmente están incluidos en el producto alimentario, por ejemplo azúcar, grasa, emulsionantes, aromatizantes, etc. Las composiciones pueden incluir todos los ingredientes no líquidos restantes requeridos para preparar el producto alimentario de modo que todo lo que necesita el usuario es añadir un líquido acuoso, tal como agua o leche, y la composición está lista para su procesamiento para formar un producto alimentario congelado de la invención. Estas composiciones secas, ejemplos de las cuales incluyen polvos y gránulos, se pueden diseñar para su uso industrial y al por menor, y beneficiarse de una masa reducida y una mayor fecha de caducidad.

La hidrofobina reañade a una composición en una forma y cantidad tal que esté disponible para inhibir el crecimiento de los cristales de hielo, tal como recristalización del hielo y/o modificar la forma dominante de los cristales de hielo. Con el término "añadido" los autores quieren decir que la hidrofobina se introduce intencionadamente en la composición con el fin de aprovechar su capacidad para inhibir el crecimiento de los cristales de hielo y/o modificar la forma dominante de los cristales de hielo. En consecuencia, cuando hay o se han añadido ingredientes que contienen contaminantes fúngicos, que pueden contener polipéptidos de hidrofobina, ello no constituye adición de hidrofobina dentro del contexto de la presente invención.

Normalmente, la hidrofobina se añade al producto en una forma que es capaz de autoensamblarse en una superficie de aire-líquido.

Normalmente, la hidrofobina se añade a las composiciones de la invención en forma aislada, normalmente al menos parcialmente purificada, tal como con una pureza de al menos 10%, en función del peso de los sólidos. Por "añadido en forma aislada", los autores quieren decir que la hidrofobina no se añade como parte de un organismo natural, como un champiñón, que expresa hidrofobinas de forma natural. En su lugar, normalmente la hidrofobina se habrá extraído de una fuente natural o se ha obtenido mediante expresión recombinante en un organismo huésped.

La hidrofobina añadida se puede usar para reducir o inhibir el crecimiento de los cristales de hielo, por ejemplo para inhibir el proceso de la recristalización del hielo y/o modificar la forma dominante de los cristales de hielo (es decir, la forma de los cristales de hielo). La inhibición y/o modificación puede tener lugar durante la congelación y/o después de la congelación, por ejemplo durante el almacenamiento. La inhibición del crecimiento de los cristales de hielo y/o la forma dominante de los cristales de hielo durante la congelación se puede usar para alterar la textura del producto. La inhibición de la recristalización del hielo mejora la estabilidad del producto en respuesta al abuso térmico.

Las hidrofobinas también se pueden usar para inhibir el crecimiento de los cristales de hielo, tal como la recristalización del hielo, y/o la forma dominante de los cristales de hielo en los materiales biológicos celulares. Esto ayudará a reducir el daño celular como resultado de los procesos de congelación usados para preservar los materiales biológicos. Tales materiales biológicos incluyen cultivos de organismos unicelulares y líneas celulares; gametos, por ejemplo esperma y ovarios; y tejidos y órganos derivados de organismos pluricelulares, tanto plantas como animales.

De acuerdo con esto, la presente invención también proporciona un material biológico celular congelado que comprende hidrofobina en forma aislada, que comprende, preferentemente, al menos un 0,001% p de hidrofobina, con la condición de excluir específicamente a los seres humanos.

La presente invención proporciona además el uso de hidrofobina para inhibir el crecimiento de cristales de hielo, tal como la recristalización del hielo, y/o modificar la forma dominante de los cristales de hielo en un material biológico celular congelado. La inhibición/modificación puede ser durante y/o después de congelar el material biológico.

A continuación se describirá la presente invención en referencia a los ejemplos siguientes, que únicamente son ilustrativos y no limitantes.

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Descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama que muestra regímenes de cizalladura para los productos congelados aireados.

La Figura 2 es una microfotografía electrónica de barrido de microestructuras de productos congelados aireados, recientes y después de abuso (Aumento x 100).

La Figura 3 es una microfotografía electrónica de barrido de microestructuras de productos congelados aireados, recientes y después de abuso (Aumento x 300).

La Figura 4 muestra microfotografías electrónicas de barrido de microestructuras de productos no aireados (no HFBII) (Aumento 50x).

La Figura 5 muestra microfotografías electrónicas de barrido de microestructuras de productos no aireados (no HFBII) (Aumento 50x).

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Ejemplo 1 Productos congelados aireados

Se prepararon productos congelados aireados usando 3 tipos de proteína:

A.

Caseinato de sodio (NaCas)

B.

Polvo de leche desnatada (PLD)

C.

Hidrofobina (HFBIII) de Trichoderma reesei

Se compararon las propiedades microestructurales y físicas de los productos, tanto antes como después de regímenes de abuso de temperatura.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Materiales

En la Tabla 1 se resumen detalles de los materiales usados y en la Tabla 2 se muestran las formulaciones a partir de las cuales se prepararon cada uno de los productos congelados aireados.

TABLA 1 Materiales usados

1

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TABLA 2 Formulaciones usadas

3

Preparación de los productos congelados aireados Preparación de mezcla (emulsión)

Todas las mezclas se prepararon en lotes de 100 g. Para las mezclas A y B (que contienen caseinato de sodio y polvo de leche desnatada, respectivamente), la proteína se combinó con la sacarosa y se dispersó en agua fría usando un agitador magnético. A continuación, la solución se calentó hasta 60ºC con agitación y se mantuvo durante 5 minutos antes de enfriarse hasta 40ºC. Después se añadió grasa de coco fundida y la mezcla acuosa se sonicó de inmediato (Branson Sonifier con punta afilada de 6,4 mm) durante 3 minutos a una amplitud del 70% con la punta bien sumergida en la solución. Después, la emulsión se enfrió rápidamente en un baño de agua a -1'ºC hasta que la temperatura de la solución era de 5ºC, para cristalizar las gotitas de grasa. Las mezclas se almacenaron a 5ºC hasta su uso posterior.

Para la Mezcla C (que contiene HFB II), primero se dispersó la sacarosa en agua fría con agitación. A continuación, a esto se añadió la mitad de la concentración requerida de HFB II en forma de un alícuota. Después, la solución se sonicó suavemente en un baño sónico durante 30 segundos para dispersar completamente la HFB II. A continuación, esta solución se agitó en un agitador magnético y se calentó hasta 40ºC. Antes de añadir la grasa fundida, la solución se sonicó de nuevo en un baño sónico durante 30 segundos. La grasa fundida se añadió después y la mezcla se emulsionó y enfrió tal y como se describe para las mezclas A y B. Después, a esta solución fría se añadió otro alícuota de HFB II para llevar la concentración de la HFB II hasta 0,2%. El primer 0,1% de la HFB II era para emulsionar y estabilizar la grasa. La segunda adición de HFB II proporcionaría un exceso adecuado de HFB II para proporcionar una buena aireación y estabilidad de la espuma.

El análisis del tamaño de las partículas sobre las emulsiones refrigeradas se realizó usando un Malvern Mastersizer 2000.

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Análisis de las emulsiones

Siguiendo esta metodología, los autores pudieron preparar emulsiones con pequeñas gotitas de grasa. En la Tabla 3 se muestra un resumen de los tamaños medidos de las gotitas de aceite.

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TABLA 3 Tamaño de la partícula de emulsión medida usando el Malvern Mastersizer 2000

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Proceso de congelación por cizalladura

En un vaso de acero inoxidable cilíndrico de doble pared, montado en vertical con unas proporciones internas de 105 mm de altura y un diámetro de 72 mm se cortaron y congelaron simultáneamente 80 ml de la mezcla. La tapa del vaso cubre el 54% del volumen interno, dejando un 46% (180 ml) para la muestra. El rotor usado para cizallar la muestra consta de un propulsor rectangular de las proporciones correctas para rozar el borde superficial del envase mientras rota (dimensiones 72 mm x 41,5 mm). También unidas al rotor se encuentran dos cuchillas semicirculares de alta cizalladura (diámetro de 60 mm) colocadas en un ángulo de 45º con respecto al accesorio rectangular. El vaso está rodeado por una camisa a través de la cual fluye el refrigerante.

En esencia, un prototipo aireado y congelado se produce del siguiente modo: La mezcla que se encuentra en el interior del envase adjunto se mezcla con un propulsor a una elevada velocidad de cizalladura con el fin de incorporar aire. Simultáneamente, el refrigerante fluye alrededor de la camisa del envase para enfriar y congelar la mezcla. El propulsor también roza la pared interna, de modo que retira el hielo que se forma allí y lo incorpora al resto de la mezcla. Se usa alta cizalladura para airear inicialmente la mezcla, y, después, la velocidad de cizalladura se enlentece con el fin de permitir un mejor enfriamiento y congelación. Los regímenes de cizalladura usados para cada mezcla se presentan gráficamente en la Figura 1.

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Para la etapa de congelación y aireación con las Mezclas A y B (que contienen caseinato de sodio y polvo de leche desnatada, respectivamente), se colocó el refrigerante (establecido a -18ºC) para que circulara desde el tiempo = 0 minutos. La agitación relativamente lenta al principio para las Mezclas A y B permitida para el enfriamiento de la mezcla y la generación de alguna viscosidad (a través de la formación e incorporación de hielo) antes de la aireación usando una cizalladura más elevada. Un corto periodo a velocidad elevada incorporó el aire y, después, la velocidad se fue disminuyendo para permitir que las muestras alcancen al menos -5ºC.

Para la Mezcla C (que contiene HFB II), el envase se enfrió hasta 5ºC y se añadió la muestra y se inició la cizalladura alta para la aireación. El refrigerante (a -18º) no se cambió para que circulara hasta 9 minutos debido al mayor tiempo necesario para generar un esponjamiento del 100%. Una vez que el refrigerante se cambió para circular (a 9 minutos), se adoptó el mismo patrón de cizalladura-enfriamiento que el utilizado previamente (para A y B).

Al final del proceso se midió el esponjamiento y las muestras (de aproximadamente 15 g) se colocaron en envases pequeños. Cada producto se enfrió más durante 10 minutos en un conjunto de congelación a -80ºC antes de almacenarse a -20ºC.

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Análisis de los productos congelados aireados

Todos los productos congelados aireados se almacenaron con dos regímenes de temperatura:

(a)

-20ºC. El análisis posterior se realizó en el plazo de una semana desde la producción y los autores lo consideran un producto "fresco".

(b)

Muestras de abuso de temperatura se sometieron a almacenamiento a -10ºC durante 1 o 2 semanas y a continuación se almacenaron posteriormente a -20ºC antes del análisis.

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TABLA 4 Detalles del proceso y esponjamiento de producto para productos preparados a partir de las mezclas A, B y C

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Los productos finales se analizaron del siguiente modo:

Esponjamiento del producto reciente

Análisis SEM en productos frescos y sometidos a abuso de temperatura

Comportamiento a la fusión con productos frescos y sometidos a abuso de temperatura

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Esponjamiento

El esponjamiento para cada uno de los productos se resume en la Tabla 4. Todas las mezclas se podían airear e incorporaban cantidades significativas de aire.

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Estabilidad microestructural: Metodología Microscopia electrónica de barrido (SEM)

La microestructura de cada producto se visualizó usando Microscropia electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM). La muestra se enfrió hasta -80ºC en hielo seco y se cortó una sección de la muestra. Esta sección, de un tamaño de aproximadamente 5 mm x 5 mm x 10 mm, se montó en un soporte de muestras usando un Tissue Tek: compuesto OCT^{TM} (11% de PVA, 5% de Carbowax y un 85% de componentes no reactivos). La muestra, incluido el soporte, se introdujo en pasta de nitrógeno líquido y se transfirió a una cámara de preparación de baja temperatura: Oxford Instrument CT1500HF. La cámara está en vacío, aproximadamente 10 pascales, y la muestra se caliente hasta -90ºC. Lentamente se graba el hielo para poner de manifiesto los detalles de la superficie no producidos por el propio hielo, de modo que el agua se elimina a esta temperatura a vacío continuo durante de 60 a 90 segundos. Una vez grabada, la muestra se enfría hasta -110ºC finalizando la sublimación y se recubrió con oro usando plasma de argón. Este proceso también tiene lugar al vacío con una presión aplicada de 10.000 pascales y una corriente de 6 miliamperios durante 45 segundos. A continuación, la muestra se transfiere a un microscopio electrónico de barrido convencional (JSM 5600) provisto de un Oxford Instruments de fase fría a una temperatura de -160ºC. La muestra se examina y las áreas de interés se capturan mediante software de adquisición de imágenes por vía digital.

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Microscopia electrónica de transmisión por criofractura (TEM)

Un bloque pequeño, de aproximadamente 5 mm x 3 mm x 3 mm, se cortó de la muestra sobre una placa de aluminio colocada sobre un lecho de hielo seco usando un escalpelo frío. El bloque de la muestra se montó verticalmente en un soporte para criofractura "TOP HAT" grande usando Tissue-Tek compuesto O.C.T (Sakura Finetek, Europa BV). El soporte se colocó inmediatamente en un dispositivo de transferencia del Cressingtion CFR-50 en nitrógeno líquido y se transfirió a la cámara de criofractura (-180ºC). La muestra se fracturó con un soplido único del cuchillo microtomo con oscilación y después se grabó durante 10 minutos a -95ºC. La superficie grabada se sombreó por rotación (45º) con platino/carbono hasta llegar a un grosor de 2 nm, después se recubrió con carbono hasta alcanzar un grosor de 10 nm. La muestra recubierta se retiró de la cámara y del dispositivo de transferencia y la réplica de metal se extrajo por flotación de la muestra en agua. Las piezas réplica se limpiaron en ácido crómico y se lavaron varias veces con agua antes de su recolección en tamices EM de cobre de malla 400. Los tamices se dejaron secar antes de su análisis mediante TEM.

El análisis TEM se llevó a cabo usando un microscopio JEOL 1200 EX II a 100 KV. Las imágenes se obtuvieron usando una cámara Bioscan y software Digital Micrograph (Gatan Inc).

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Análisis microestructural: Resultados

Se usó microscopia electrónica de barrido (SEM) para analizar la microestructura de los productos frescos y congelados sometidos a abuso de temperatura. Imágenes representativas se pueden ver en las figuras 2 y 3 a diferentes aumentos.

Los resultados de las muestras frescas mostraron que el producto que contiene HFB II (preparado a partir de la mezcla C) fueron significativa y sorprendentemente diferentes a aquéllos que contienen proteínas más convencionales (es decir, la mezcla A o B). Las diferentes propiedades observadas fueron: celdas de aire más pequeñas, cristales de hielo más pequeños, cristales de hielo más angulares y cristales de hielo ligeramente más agrupados. Para los productos A y B, los autores aproximaron el tamaño del cristal de hielo en las muestras frescas a un diámetro de 50-100 \mum. Para el producto C, los inventores aproximaron el tamaño del cristal de hielo a un diámetro de 40-60 \mum.

Tras abuso de temperatura, las imágenes SEM muestran claramente que el producto que contiene HFB II (de la mezcla C) ha conservado su microestructura original, es decir hay relativamente pocos cristales de hielo evidentes y engrosamiento de burbujas. Este es el caso tras 1 y 2 semanas de almacenamiento a -10ºC. No obstante, los prototipos que contienen NaCas y PLD (de las mezclas A y B, respectivamente) muestran un engrosamiento muy intenso del gas y de la estructura del hielo en abuso de temperatura a -10ºC después de sólo una semana.

En general, está claro que el producto congelado hecho que contiene HFB II muestra una estabilidad mucho mayor al abuso de temperatura que el producto congelado hecho usando caseinato de sodio o polvo de leche desnatada. La HFB II posee una influencia sobre el tamaño y la estabilidad de tanto las burbujas de aire como de los cristales de hielo.

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Comportamiento en la fusión: Metodología

Muestras de producto congelado se colocaron en una malla metálica a temperatura ambiente (20ºC). Se observaron diferencias en el modo en el que los productos se fundían, principalmente en la conservación de la forma y la estabilidad de la espuma, como una función del tiempo.

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Comportamiento en la fusión: Resultados

Estas diferencias microestructurales (espuma estable y hielo estable) tuvieron algún impacto sobre el comportamiento en la fusión del producto congelado. La muestra congelada aireada hecha a partir de la mezcla C (que contiene HFB II) conservó su forma en la fusión mejor que el producto hecho con caseinato sódico o polvo de leche desnatada (es decir, las mezclas A y B, respectivamente).

A medida que el hielo se fundía y formaba agua, fluía a través de la malla de fusión. Sin embargo, para el producto con HFB II, gran parte de la espuma también permaneció en la malla con algunas gotas estables de espuma observadas por debajo (datos no mostrados), ninguna de estas características se observó con las proteínas convencionales (caseinato sódico y polvo de leche desnatada). Esto ilustra las diferencias en la estabilidad de la espuma entre cada una de las proteínas usadas.

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Diferencias en la textura entre los productos A, B y C

Asimismo, se pudieron observar claras diferencias en la textura entre las tres muestras tras una semana de almacenamiento a -10ºC (es decir, muestras sometidas a abuso de temperatura). Al manipular el producto hecho usando caseinato sódico (A) y polvo de leche desnatada (B), se observó que tenían una textura muy suave y muy escamosa, difícil de eliminar con limpieza del papel de silicio usado para revestir el envase de la muestra. Por otro lado, el producto hecho usando HFB II (C) era muy firme y se liberó del papel de silicio que reviste el envase de la muestra con mucha limpieza. En otras palabras, el producto preparado usando HFB II muestra mucha mayor estabilidad al abuso de temperatura en una escala tanto microscópica como macroscópica que el producto preparado usando caseinato sódico o polvo de leche desnatada.

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Ejemplo 2 Productos congelados no aireados

Se prepararon dos soluciones, una con hidrofobina HFB II de Trichoderma reesei, la otra no. Las composiciones de las soluciones fueron las que se muestran en la Tabla 5.

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TABLA 5 Formulaciones para producto no aireados

6

VTT Biotechnology suministró la HFB II, como se ha descrito antes, y Tate & Lyle la sacarosa. La goma xantana era de grado dispersable en agua fría (Keltrol RD), suministrada por CP Kelco (Atlanta, EE.UU.).

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Preparación y análisis de los productos congelados no aireados

Ambas soluciones se prepararon en lotes de 100 g. La solución de sacarosa/goma xantana se preparó añadiendo la cantidad requerida de agua desionizada a temperatura ambiente a una mezcla seca de sacarosa y goma xantana. A continuación, esto se mezcló usando un agitador magnético hasta que los solutos se disolvieron por completo. En el caso de la muestra 2, después se añadió HFB II en forma de una alícuota de una solución de 5,3 mg/ml, tras lo cual la solución se mezcló de nuevo en el agitador magnético durante otros 10 minutos.

La congelación de las soluciones no aireadas se llevó a cabo de forma inactiva (Es decir, sin la aplicación simultánea de cizalladura). Cada solución se usó para llenar una placa petri pequeña de un volumen de 8 ml. A continuación, estás se introdujeron en un congelador doméstico a -18ºC durante 24 horas, periodo durante el cual se produjo la congelación de las muestras.

Tras la congelación, la microestructura de cada muestra se analizó mediante SEM usando el mismo procedimiento de preparación que se describe en el Ejemplo 1.

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Análisis microestructural- Resultados

En las figuras 4 y 6 se pueden observar imágenes SEM representativas de cada muestra con un aumento de 50x. Se puede deducir que la microestructura de la solución que contiene HFB II (muestra 2) es más fina y contiene cristales de hielo con menores dimensiones características. Por ejemplo, las estructuras dendríticas alongadas en la muestra 1 (Figura 4) sin más anchas y más largas que las observadas en la muestra 2 (Figura 5). Esto ilustra la influencia de la hidrofobina en la reducción del proceso de crecimiento de los cristales de hielo, que tiene como resultado cristales de menor tamaño.

Claims (13)

1. Una composición congelada que comprende hidrofobina en forma aislada, con la condición de que se excluya la hidrofobina de Tricholoma matsutake.

2. Una composición congelada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos 0,001% p de hidrofobina.

3. Una composición congelada que comprende al menos 0,001% p de hidrofobina, con la condición de que se excluya la hidrofobina de Tricholoma matsutake.

4. Una composición congelada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la hidrofobina es una hidrofobina de clase II.

5. Una composición congelada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que no está aireada.

6. Una composición congelada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un producto alimenticio.

7. Un producto alimenticio congelado de acuerdo con la reivindicación 6, que es un producto de confitería congelado.

8. Uso de hidrofobina en la inhibición del crecimiento de cristales de hielo en una composición congelada.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la composición congelada es un producto alimenticio.

10. Uso de hidrofobina en la modificación del hábito de los cristales de hielo en una composición congelada.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la composición congelada es un producto alimenticio.

12. Uso de una hidrofobina en la mejora de la tolerancia a la temperatura de un composición congelada.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la composición congelada es un producto alimenticio.