SK9099A3 - Frozen confectionery products - Google Patents

Description

Mrazené cukrárske produkty obsahujú jeden alebo viac antimrazových polypeptidov získaných z rastlín. Antimrazové polypeptidy vo vodnej zmesi majú veľkosť kiyštálov ľadu - početný priemer, po rýchlom zmrazení na -40 °C alebo menej, potom nasleduje uskladnenie počas l hodiny pri -6 °C, menej ako 15 pm.

-1 Mrazené cukrárenské produkty

Oblasť techniky

Vynález sa týka mrazených potravinových produktov obsahujúcich antimrazové látky - AFP látky.

Doterajší stav techniky

Anti-mrazové proteíny už boli v literatúre opísané, pozri napríklad Marilyn Griffith a K. Vanya Ewart v Biotechnology Advances, Diel 13, č. 3, str. 375 až 402, 1995. Anti-mrazové látky všeobecne majú jednu alebo viaceré z nasledujúcich vlastností: tepelná hysteréza, inhibícia rekryštalizácie ľadu, riadenie tvaru kryštálov ľadu a interakcia s ľadovými zárodočnými jadrami.

Tepelná hysteréza je najlepšie známa vlastnosť AFP látok a táto vlastnosť sa normálne používa na testovanie prítomnosti AFP látok. Tepelná hysteréza je spôsobená znížením zdanlivej teploty zamŕzania roztoku obsahujúceho aktívnu látku AFP s tepelnou hysterézou bez ovplyvnenia teploty zamŕzania. Identifikácia zdrojov AFP testami tepelnej hysterézy je zoširoka opísaná v literatúre, pozri napríklad John G. Duman v Cryobiology 30, 322 až 328 (1993).

Inhibícia rekryštalizácie ľadu je ďalšia vlastnosť AFP látok. Táto aktivita je tiež označovaná ako potlačenie rastu ľadových kryštálov. Táto vlastnosť sa môže testovať porovnávaním veľkosti ľadových kryštálov v určitom časovom bode pre kryštály v prítomnosti AFP látok a v neprítomnosti AFP látok. Aplikácia tejto metódy pri testovaní rybích AFP látok je opísaná v US patente 5,118,792 (DNA Plánt Technology Corporation).

Tretia vlastnosť AFP látok je ich schopnosť ovplyvniť tvar kryštálov ľadu. Táto vlastnosť pochádza zo selektívneho viazania AFP látok na určité plochy kryštálu ľadu a tým obmedzenia rastu kryštálu v určitých smeroch. Prítomnosť kryštálov ľadu, ktoré majú hexagonálny bipyramidálny tvar sa potom považuje za indikátor prítomnosti AFP látok. Táto metóda je opísaná napríklad na testovanie

-2aktivity extracelulárnych AFP látok ozimnej raži vo WO 92/22581 (University Waterloo).

Štvrtá vlastnosť AFP látok je ich schopnosť inhibovať aktivitu látok pôsobiacich na nukleáciu ľadu. Táto interakcia medzi a AFP látkami a nukleačným činidlom ľadu môže napríklad spôsobiť zvýšenú tepelnú hysterézu. Táto vlastnosť je napríklad testovaná vo WO 96/40973 (University of Notre dáme du Lac)

AFP látky boli navrhnuté na zlepšenie tolerancie produktov proti mrazu. V tomto kontexte boli navrhnuté mnohé aplikácie.

Látky AFP boli napríklad navrhnuté na zlepšenie kryoochrany biologických materiálov (WO 91/12718, Agouron Pharmaceutícals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). AFP látky boli tiež navrhnuté na zabránenie úniku z lipozómov napríklad v kozmetických alebo farmaceutických materiáloch (Pozri WO 96/20695). Ďalšou možnou aplikáciou je zvýšenie tolerancie k mrazu u rastlín začlenením do nich (alebo vyrobením v nich transgeneticky) AFP látok (Pozri J. Celí. Biochem. Suppl. diel 14e, 1990, strana 303 XP002030248, Lee a spol., abstrakt R228). Na použitie v potravinových produktoch, napríklad v zmrazenom jogurte alebo smotanovej zmrzline (US 5,620,732 Pillsbury a WO 96/11586, HSC Research and development limited partnership) boli tiež navrhnuté rybacie AFP látky.

Doteraz však použitie AFP látok nebolo aplikované v komerčnom merítku. Predpokladá sa, že jedným z dôvodov nedostatku komerčnej realizácie je, že hoci boli opísané mnohé AFP látky, v praxi realizácia v skutočných komerčných produktoch naráža na vážne problémy.

Zistilo sa, že jeden z kľúčových dôvodov týchto problémov je ten, že okrem veľkého počtu AFP látok, ktoré boli opísané v literatúre, len obmedzená skupina AFP látok sa môže vhodne aplikovať pre každú aplikáciu; tiež sa zistilo, že tento výber vhodných AFP látok je závislý od požadovanej aplikácie a/alebo atribútov produktu, ktoré sa majú dosiahnuť.

Zvlášť požadovaným zdrojom AFP látok je rastlinný materiál. Rastlinné materiály sa môžu veľmi ľahko získať v relatívne veľkých množstvách a na získanie koncentrátu, obsahujúceho AFP látky sa môžu použiť relatívne jednoduché izolačné

-3postupy. Ďalej sa predpokladá, že použitie AFP látok z rastlinného materiálu bude uprednostnené konzumentmi, ktorí majú sklon uprednostňovať prírodné rastlinné zdroje pred napríklad rybacími AFP látkami.

Marilyn Griffith a K. Vanya Ewart v Biotechnology Advances, Diel 13, č. 3, str. 375 až 402, 1995 uviedli zoznam 27 vyšších rastlinných druhov, v ktorých sa zistila protimrazová aktivita. Tento článok tiež navrhuje široký rozsah možných aplikácií AFP látok.

Zistilo sa, že ak sa zvolí špecifická aplikácia použitia rastlinných AFP látok, vytvára to potrebu špecifického testu na výber obmedzenej skupiny AFP látok, ktoré sa môžu výhodne aplikovať v tejto prihláške.

Prekvapivo sa zistilo, že okrem faktu, že veľký počet rastlín obsahuje AFP látky, len obmedzená skupina rastlín obsahuje AFP látky, ktoré sú schopné poskytnúť dobrú textúru mrazených cukrárenských produktov. Prekvapivo sa zistilo, že sa na výber vhodných AFP látok môže použiť relatívne jednoduchá testovacia metóda.

Početné literárne odkazy udávajú, že AFP látky sa môžu potenciálne použiť na výhodné ovplyvnenie texturálnych vlastností mrazených cukrárenských produktov, ako je napríklad zmrzlina. Avšak väčšina z týchto dokumentov neposkytuje spôsob, ako sa tieto výhodné vlastnosti môžu skutočne dosiahnuť v praxi.

Ďalšia skupina dokumentov opisuje použitie rybacích AFP látok.

WO 96/11586 ukazuje použitie rybacích anti-mrazových polypeptidov v mrazených fermentovaných potravinových produktoch. V tomto dokumente sa nespomína použitie špecifických AFP látok získaných z rastlín v týchto produktoch.

WO 96/39878 opisuje použitie AFP látok v smotanovej zmrzline. Vhodné AFP látky na toto použitie môžu byť získané z krvného a svalového tkaniva antarktických rýb, arktických rýb, červov a hmyzu. Znova sa neuvádza, že sa môžu použiť rastlinné AFP látky.

US 5118792 opisuje v príklade 3B inhibíciu rekryštalizácie pomocou čisteného A-Saf5 syntetického proteínu v zmesiach na nanuky. Znova tento dokument neuvádza použitie AFP látok získaných z rastlín.

-4WO 92/22581 opisuje viaceré polypeptidy získané z extracelulárnych priestorov ozimnej raži. Viaceré možné aplikácie týchto polypeptidov sú opísané vo všeobecnosti, Medzi nimi je smotanová zmrzlina. Avšak nie je uvedené, ktoré z polypeptidov by sa mali vybrať na získanie dobrej kvality smotanovej zmrzliny. Zistilo sa, že len špecifické proteíny z ozimnej raži sú vhodné na použitie v smotanovej zmrzline (pozri príklady).

Zistilo sa, že veľký počet rastlín, ktoré doteraz neboli uvedené ako takéto rastliny, obsahuje významnú hladinu obsahu AFP látok. Z druhej strany sa zistilo, že nie všetky AFP látky obsahujúce rastliny poskytujú správny typ AFP látky na priaznivé ovplyvnenie textúry mrazených cukroviniek. Cieľom je poskytnúť konkrétny nový výber rastlinných zdrojov, ktoré prekvapivo poskytujú na jednej strane dobré AFP vlastnosti a na druhej strane sú schopné priaznivo ovplyvniť texturálne vlastnosti smotanovej zmrzliny.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je preto poskytnutie týchto rastlinných AFP látok, ktoré môžu výhodne byť použité v mrazených cukrárenských produktoch.

Podľa prvého aspektu sa vynález týka mrazených cukrárenských produktov obsahujúcich jednu alebo viaceré AFP látky získané z rastlín, kde AFP látky vo vode majú veľkosť kryštálov ľadu po rýchlom zmrazení na -40 °C, po čom nasleduje uskladnenie počas 1 hodiny pri -6 °C (merané ako je opísané nižšie), menej ako 15 pm.

Konkrétne sa zistilo, že vhodné AFP látky sa môžu vybrať tak, že sa zoberie zmes obsahujúca AFP látku vo vodnej zmesi, a rýchle sa táto zmes zmrazí na -40 °C alebo menej, po čom nasleduje uskladnenie počas 1 hodiny pri -6 °C. Vhodné AFP látky spôsobujú veľkosť kryštálov ľadu po uskladnení počas 1 hodiny pri týchto podmienkach menej ako 15 pm, výhodnejšie 5 až 14 pm, najvýhodnejšie 8 až 12 pm. Teplota rýchleho zmrazenia je výhodne -40 až -100 °C, výhodne -80 °C.

Podrobný opis vhodného testu na určenie tejto charakteristiky je uvedený v

-5Príklade 1.

Všeobecne sa test môže aplikovať na akúkoľvek vhodnú zmes obsahujúcu AFP látku a vodu. Všeobecne hladina AFP v takejto testovanej zmesi nie je veľmi kritická a môže napríklad byť od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného, výhodnejšie 0,0005 až 0,1 % hmotnostného, najvýhodnejšie 0,001 až 0,05 % hmotnostného, napríklad 0,01 % hmotnostného. Hladina vody vo vodnej zmesi je výhodne 30 % hmotnostných alebo viac, napríklad 50 % hmotnostných až 99,9999 % hmotnostných.

Na uskutočnenie testu sa môže použiť akákoľvek vhodná zmes obsahujúca AFP látku a vodu. Ak sa to požaduje, môžu byť prítomné aditiva, napríklad sacharóza alebo pufrovacie činidlo. Všeobecne však nebude potrebné získať AFP látku vo vyčistenej forme. Na praktické aplikácie by bolo normálne dostatočné pripraviť kvapalný extrakt alebo šťavu z rastlinného materiálu, pričom sa potom môže testovať tento extrakt alebo šťava. Vhodná metóda na prípravu vhodných kvapalných zmesí je uvedená v Príklade II.

Normálne sa rastliny, ktoré sa majú testovať na vhodné AFP látky, majú podrobiť chladu. Napríklad sa môžu testovať rastliny, ktoré rastú v chladnej klíme, napríklad antarktické rastliny. Alternatívne sa rastliny môžu zbierať počas zimného obdobia, výhodne od decembra do marca, výhodnejšie od januára do februára, najvýhodnejšie v januári (severná hemisféra) alebo v júni až septembri, výhodnejšie v júli až auguste, najvýhodnejšie v júli Qužná hemisféra).

Prihlasovatelia podrobili veľký počet rastlín vyššie opísanému testu. Výsledky sú uvedené v Príkladoch III a IV.

Výhodné zdroje AFP látok sú získané z Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccheraroides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (karotka), Vinea minor (zimozeleň), Vinea major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua (pýr), Poa pratensis (Kentucká modrá tráva), Rostkovia magellanica,

-6Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis a Festuca contracta.

Predpokladá sa, že na základe návodu uvedeného v opise vynálezu bude odborník schopný vybrať ďalšie AFP látky, ktoré sa môžu vhodne získať z rastlín. Použitie týchto AFP látok je tiež zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu.

V jednom uskutočnení zvlášť užitočnom na aplikáciu v potravinových produktoch sú tie rastlinné AFP látky, ktoré spĺňajú vyššie definovaný test veľkosti kryštálov, a ktoré sú získané a netoxických alebo nízko-toxických rastlín. V tomto kontexte sú výhodné AFP látky získané z karotky, tráv, bambusu atď.

Ďalším výhodným výberom z vyššie uvedených zdrojov sú AFP látky získané z druhov lišajníka, konkrétne Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana. Tieto AFP látky vykazujú zvlášť dobré vlastnosti v mrazených cukrárenských produktoch.

Iné AFP látky, ktoré vykazujú zvlášť dobrú aktivitu, sú získané z Juncus squarrosus alebo Geranium.

Pre niektoré aplikácie sa vyberajú tie AFP, ktoré si zachovávajú svoju schopnosť obmedziť rast kryštálov ľadu (podľa dôkazu pomocou vyššie uvedeného testu) aj po tepelnom opracovaní nad teplotou 60 °C, najvýhodnejšie od 80 do 105 °C počas doby najmenej 30 sekúnd, výhodnejšie viac ako 1 minúta, 10 minút alebo dokonca viac ako 1 hodina. Vhodné rastlinné zdroje, ktoré sú tepelne stabilné, sú napríklad cukrový javor, bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua.

-7Okrem rastlín zmienených vyššie, prihlasovatelia testovali AFP látky z Secale cereale (ozimná raž). Viaceré AFP látky ozimnej raži boli opísané v WO 92/22581. Zistilo sa, že 32 kDa proteín získaný z ozimnej raži spĺňa vyššie opísaný test veľkosti kryštálov, kým iné proteíny z ozimnej raži nespĺňajú tento test (pozri Príklad IX.). Na účely tohto vynálezu, ak sú použité AFP látky získané z ozimnej raži, výhodne sa aplikuje 32 kDa proteín.

Ďalšie výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka použitia v mrazených cukrárenských produktoch rastlinných AFP látok, ktoré spĺňajú vyššie uvedený test, a ktoré nie sú získané z ozimnej raži.

Mrazené produkty podľa tohto vynálezu zahrnujú najmenej jednu AFP látku, ktorá sa môže získať z rastlinných zdrojov.

AFP látky sa môžu získať z rastlinných zdrojov pomocou akéhokoľvek vhodného spôsobu, napríklad spôsobmi izolácie ako je opísané vo vyššie uvedených dokumentoch. Alternatívne sa AFP látky môžu extrahovať z rastlín, napríklad prípravou rastlinného extraktu z (častí) rastliny, po čom nasleduje voliteľný krok skoncentrovania. Príklady vhodných metód na získanie týchto extraktov sú uvedené v Príkladoch.

Môžu sa tiež geneticky modifikovať mikroorganizmy alebo rastliny, tak aby došlo k expresii AFP látok a tieto AFP látky sa potom môžu použiť v zhode s týmto vynálezom.

Techniky genetickej manipulácie sa môžu použiť na výrobu AFP látok, ktoré majú najmenej 80 %, výhodnejšie viac ako 95 %, najvýhodnejšie 100 % homológiu na AFP látky priamo získané z rastlinných zdrojov, ktoré prirodzene obsahujú AFP látky. Na účely tohto vynálezu tieto AFP látky, ktoré majú túto vysokú úroveň homológie, sú tiež zahrnuté do pojmu AFP látok získaných z rastlín. Na účely tohto vynálezu pojem „AFP látky získané z rastlín“ výhodne nezahrnuje AFP látky, ktoré sa prirodzene vyskytujú v nerastlinných zdrojoch, napríklad rybách a ktoré sa transgenetickými cestami vyrábajú rastlinami.

Genetické manipulačné techniky sa môžu použiť nasledujúcim spôsobom. Príslušná hostiteľská bunka alebo organizmus by sa mohol transformovať pomocou génového konštruktora, ktorý obsahuje oblasť kódujúcu požadovaný polypeptid.

-8Nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid sa môže vložiť do vhodného expresného vektora. Tento vektor kóduje potrebné prvky na transkripciu a transláciu a takým spôsobom, že expresia bude za príslušných podmienok (napríklad vo vhodnej orientácii a správnom čítacom rámci a s príslušnými cieľovými a expresnými sekvenciami).

Metódy vyžadované na konštrukciu týchto vektorov expresie sú dobre známe odborníkom v tejto oblasti.

Na expresiu sekvencie kódujúcej tepelne stabilný polypeptid sa môžu použiť mnohé systémy expresie. Tieto systémy zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, baktérie, bunkové systémy kvasiniek hmyzu, systémy rastlinných bunkových kultúr a rastliny, všetko transformované s príslušnými expresnými vektormi.

AFP látky získateľné z vyššie uvedených zdrojov sa môžu použiť v akýchkoľvek vhodných mrazených cukrárenských produktoch. Na účely vynálezu pojem „mrazené cukrárenské produkty“ zahrnuje mlieko obsahujúce mrazené sladkosti, ako napríklad smotanová zmrzlina, zmrazený jogurt, šerbet, ovocná zmrzlina, mliečna zmrzlina a mrazený vaječný krém, zmrzliny, granity a mrazené ovocné pyré. Pre niektoré aplikácie je použitie vo fermentovaných potravinových produktoch menej výhodné.

Výhodne hladina AFP látok v mrazených cukrárenských produktoch je od 0,0001 do 0,5 % hmotnostného z konečného produktu, výhodnejšie 0,0005 až 0,3 % hmotnostného, najvýhodnejšie 0,001 až 0,2 % hmotnostného.

Výhodne je hladina tuhých látok v mrazených sladkostiach (napríklad cukor, tuk, príchuť atď.) viac ako 2 % hmotnostné, výhodnejšie od 4 do 70 % hmotnostných.

Ak sa to požaduje, mrazené cukrárenské produkty podľa tohto vynálezu môžu byť prevzdušnené, napríklad na našľahanie od 50 do 500 %.

Spôsob prípravy mrazených cukrárenských produktov podľa tohto vynálezu môže byť vybraný z akýchkoľvek vhodných spôsobov prípravy. AFP látky sa môžu všeobecne pridať v rôznych krokoch prípravy, napríklad sa môžu pridať do prvej predzmesi zložiek alebo sa môžu neskôr pridať počas neskoršieho kroku procesu

-9prípravy. Pre niektoré aplikácie je niekedy výhodné pridať AFP látky v relatívne neskorom kroku procesu prípravy, napríklad po (čiastočnom) predzmrazením produktu.

Spôsob zmrazenia mrazených cukrárenských produktov môže byť vybraný z vhodných procesov zmrazovania a môže voliteľne zahrnovať krok prevzdušnenia, napríklad na našľahanie 50 až 300 %. Na niektoré účely je výhodné, že spôsob zmrazenia zahrnuje krok stuženia chladom, napríklad pri teplote -30 Fahrenheitov (-1 °C) alebo nižšej.

Pre niektoré aplikácie môže byť výhodné zahrnovať do mrazených cukrárenských produktov zmes dvoch alebo viacerých rôznych AFP látok. Jedným z dôvodov pre toto môže byť napríklad to, že rastlinný zdroj AFP látok, ktoré sa majú použiť, obsahuje viac než jednu AFP látku a je vhodnejšie pridať takéto látky, napríklad preto, že sú obe prítomné v použitom rastlinnom extrakte. Alternatívne môže niekedy byť žiadúce pridať viac než jednu AFP látku z rôznych zdrojov.

Vynález bude teraz ilustrovaný pomocou nasledujúcich príkladov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Test na určenie veľkosti častíc ľadových kryštálov po rýchlom ochladení nasledovanom uskladnením pri -6 °C počas 1 hodiny.

Výhodný spôsob je takýto:

la) Anti-mrazová aktivita sa merala použitím modifikovanej roztláčacej skúšky (Knight a spol., 1988). 2,5 μΙ skúmaného roztoku v 30 % (hmotnostných) sacharóze sa prenieslo na čisté príslušne označené 16 mm kruhové krycie sklíčko. Druhé krycie sklíčko sa umiestnilo na vrch kvapky roztoku a tento sendvič sa stlačil medzi prstom a palcom. Sendvič sa ponoril do kúpeľa hexánu udržiavaného pri -80 °C v krabici so suchým ľadom. Keď boli pripravené všetky sendviče, preniesli sa z -80 °C hexánového kúpeľa na prehliadaciu komoru obsahujúcu hexán udržiavanú pri -6

-10°C použitím klieští predchladených v suchom ľade. Pri prenose do -6 °C bolo možné vidieť, že sa vzhľad sendvičov menil z priehľadného na zakalený. Obrazy sa zaznamenali pomocou videokamery a zachytili sa do systému analýzy obrazu (LUCIA, Nikon) použitím objektívu 20x. Obrazy jednotlivých roztláčacích skúšok sa zaznamenali v čase = 0 a znova po 60 minútach.

Alternatívne (menej výhodne) sa tieto vlastnosti môžu merať nasledujúcim spôsobom:

Ib) Vzorka produktu, obsahujúceho AFP, obsahujúca vodu sa upravila na hladinu obsahu sacharózy 30 % hmotnostných (Ak východisková hladina vzorky je viac ako 30 % hmotnostných, dosiahlo sa to zriedením, ak východisková hladina bola nižšia, pridala sa sacharóza do hladiny 30 % hmotnostných).

μΙ kvapka vzorky sa umiestnila na 22 mm krycie sklíčko. Potom sa na vrch položí krycie sklíčko 16 mm priemeru a na vzorku sa umiestni 200 g hmotnosť, aby sa zabezpečila vrstva s rovnomernou hrúbkou. Hrany krycieho sklíčka sa uzavrú s čírym lakom na nechty.

Preparát sa umiestni na plošinu Linkham THM 600 teplotné riadeného mikroskopu. Plocha sa rýchlo chladí (50 °C za minútu) na -40 °C, aby sa vytvorila veľká populácia malých kryštálov. Teplota plochy sa potom rýchlo zvyšuje (50 °C za minútu) do -6 °C a udržuje sa pri tejto teplote.

Ľadová fáza sa pozoruje pri -6 °C použitím Leica Aristoplan mikroskopu. Podmienky polarizovaného svetla v spojení s lambda platňou boli použité na zlepšenie kontrastu kryštálov ľadu. Stav ľadovej fázy (veľkosť kryštálov ľadu) sa zaznamenáva pomocou 35 mm fotomikrografie pri T = 0 a T = 1 hodina. Pritom priemerná veľkosť častíc (vizuálne určená, početný priemer) pod 15 pm značí vhodnú AFP látku na použitie v mrazených cukrárenských produktoch.

Príklad 2

Spôsob získania zmesí obsahujúcich AFP látku a vodu.

A) Čerstvé tkanivo časti rastlín, napríklad koreňov, stoniek, púčikov alebo listov, sa rozomlelo v trecej miske s piestikom (ochladené na 4 °C) v rovnakom objeme pufra A (napríklad 10 mmol/l EDTA, 20 mmol/l kyseliny askorbovej, pufrované s Tris na pH 7,4) udržiavanom na ľade. Homogenáty sa prefiltrovali cez jednu alebo viaceré vrstvy mušelínu a udržiavali sa na ľade pred ďalším použitím.

Tento spôsob sa môže všeobecne aplikovať na väčšinu rastlín a poskytnúť čerstvú rastlinnú šťavu obsahujúcu AFP látku. Všeobecne sa môže na tieto účely použiť celá rastlina, hoci z praktických dôvodov sa niekedy môžu použiť len časti (napríklad listy z drevnatých stromov, korene z koreňovej zeleniny a stonky z trávových rastlín).

B) Spôsob extrahovania AFP látok zo zdrojov, ktoré sú schopné vydržať teplo, ako napríklad trávy. Tento spôsob je predstavovaný príkladom použitia zmiešaných tráv. Je však zrejmé, že tento spôsob sa môže rovnako aplikovať na iné tepelne stabilné druhy.

Zmiešané trávové tkanivo (obsahujúce Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus a Bromus sterilis) sa skosilo v januári (priemerná teplota v tomto mesiaci bola 3,5 °C, čo zabezpečuje vhodnú studenú aklimatizáciu rastlín). Tkanivo trávy sa rýchlo prenieslo do laboratória na ďalšie spracovanie a premylo sa dôkladne na odstránenie špiny.

500 g odrezkov trávy sa umiestnilo do 650 Wattovej mikrovlnovej piecky a zahrievalo sa pri plnom výkone počas 5 minút, pričom teplota vzrástla na 85 až 100 °C. Odrezky trávy sa potom ochladili na laboratórnu teplotu.

Po kroku zahrievania sa na AFP látky bohatá šťava oddelila od odrezkov pomocou filtrácie. Táto hmota sa kontinuálne premiešavala počas 5 minút v prítomnosti rovnakého objemu vody a potom sa pretlačila cez 3 vrstvy mušelínu.

Príklad 3

Triedenie rôznych rastlín. Neantarktické rastliny sa zberali v januári (stred zimy). Antarktické rastliny sa zberali uprostred leta (Február až marec)

-12Ak to nie je označené inak, na prípravu šťavy, obsahujúcej AFP látky sa použili korene podľa spôsobu, ako je opísané v Príklade 2a.

Vzorky sa podrobili testu z Príkladu 1a. Vhodné AFP látky na použitie v mrazených cukrárenských produktoch sú označené pozitívnym znamienkom (+).

Okrem toho sa vlastnosti tepelnej hysterézy štiav merali takto: Tepelná hysteréza vzorky produktu obsahujúceho AFP látky sa určila umiestnením roztopeného produktu na mikroskopovacie sklíčko (Camlab Cambridge, hrúbka 0,1 mm). Konce mikrosklíčok sa uzatvoria s petrolejovým želé. Do vzoriek sa pridá ľad použitím aerosólového zmrazovacieho spreja. Sklíčko sa potom ponorilo do etanolového teplotné regulovaného kúpeľa pri -0,1 °C. Po 5 minútach sa kontrolovalo dosiahnutie rovnováhy vzorky. Ak sa ľad roztopil úplne teplota kúpeľa sa znížila po krokoch 0,1 °C po dosiahnutí rovnováhy. Tieto kroky sa opakujú, kým sa nedosiahne teplota, pri ktorej vo vzorke existuje malé množstvo kryštálov ľadu. Po dosiahnutí rovnováhy pri tejto teplote sa teplota kúpeľa znižovala po krokoch 0,01 °C za minútu. Teplota zmrznutia vzorky sa zaznamenáva ako teplota, pri ktorej sa začína šírenie ľadu z kryštálov v rovnováhe. Teplota topenia vzorky sa potom určí zvýšením teploty začínajúc od teploty zmrazenia v krokoch 0,01 °C za minútu, kým sa všetky ľadové kryštály neroztopia. Táto teplota je teplotou topenia vzorky. Tepelná hysteréza vzorky je rozdiel medzi teplotami topenia a teplotou zmrazenia. AFP látky s význačným stupňom tepelnej hysterézy sú označené s pozitívnym znamienkom (+). Získali sa nasledujúce výsledky:

Meno rastliny	Tepelná hysteréza	Inhibícia rekryštalizácie (Pr.1)
Equisitum hymenale	+	-
Picea glauca	+	-
Dicentra cuoularia	+	-
Viola sp.	+	-
Brassica oleracea	+	-
Brassica rapa	+	-
Brassica napus	+	-

Daucus carota	+	+
Vinea minor	+	+
Solanum tuberosum	+	-
Poa annua	+	-
Poa pratensis	+	-
Secale cereale	+	·)
Petroselinum crispum	+	-
Šalvia officinales	+	-

*) Poznámka: aktívny je len 29 až 32 kDa proteín

Tieto výsledky jasne ukazujú, že hoci veľký počet rastlín vykazuje vlastnosti tepelnej hysterézy, len malý podiel z nich spĺňa test rekryštalizácie.

Príklad 4

Triedenie rôznych rastlín. Neantarktické rastliny sa zberali v januári (stred zimy). Antarktické rastliny sa zberali uprostred leta (Február až marec)

Ak to nie je označené inak, na prípravu AFP látky obsahujúcej šťavy sa použili korene podľa spôsobu, ako je opísané v Príklade 2a.

Vzorky sa podrobili testu z Príkladu 1a. Vhodné AFP látky na použitie v mrazených cukrárenských produktoch sú označené pozitívnym znamienkom (+).

Meno rastliny	Rl test
Praslička riečna	-
Asplenium scolopendrium	-
Polystichum mohriodes	+
Pinus sylvestris	-
Picea glauca	-

Cupress sp	-
Laurus	-
Ranunculus biternatus	+
Dicentra	-
Platanus orientalis	-
Udica	-
Pterocarya fraxinifolia	-
Nothofagus antarctica	+
Nothofagus oblique	-
Betu la pendula	-
Beta vulgaris	-
Cerastium fontanum	+
Colobanthus quitensis (úrazník)	+
Rumex acetosella	+
Paeonia	-
Hypericum	-
Alcea	-
Viola	-
Populus alba	-
Salixalba ‘Britzensisť	-
Salix daphnoides	-
Salix fragilis	+
Sorbus aria	-
Brassica napus	-
Erysimum	-
Calluna vulgaris	+
Primula	-
Hydrangea
Sedum	-

Acaena magellanica	+
Crategus monogyna	-
Cotoneaster spp x2	-
Fragaria x ananassa	-
Alchemilla	-
Cytisus	-
Pisum sativum	+
Vicia faba
Medicago sativa
Daphne
Eucalyptus
Aucuba
llex
Acer saccharoides	+
Rhus	-
Oxalis	+
Geranium	+
Hedera	-
Daucus carota	+
Pastinaca sativa	-
Vinea	+
Polemonium	+
Rosmarinus	-
Buddleia	+
Forsythia	+
Fraxinus ornus	-
Lonicera pileata	-
Sambucus nigra	+
Lactuca sativa	-

Tragopodon porrifolius	-
Helianthus tuberosus	-
Juncus squarrosus	+
Carex aquatilis	+
Agrostis tenuis	+
Deschampsia antarctica	+
Festuca contracta	+
Festuca rubra	+
Parodiochloa flabellata	+
Phleum alpinum	+
Poa annua	+
Poa pratensis	+
Rostkovia magellanica (tráva)	+
Bambosoideae sp	+
Muscari armenicum	-
Allium ampeloprasum cv Alaska	-
Allium cepa	-
Chorisodontium aciphyllum	+
Drepanocladus uncinatus	+
Isothecium myosuroides	+
Neckera complanata	-
Polystichum alpestre	+
Polytrichum commune	-
Polytrichum formosum	-
Racometrium lanuginosum	-
Sphagnum capillofolium	-
Sphagnum palustre	-
Alectoria nigricans	+
Caloplaca regalis	+

Himantormia lugubris	+
Hypogymnia physodes	+
Parmelia subrudecta	+
Ramalina farinaceae	+
Stereocaulon glabrum	+
Umbilicaria antarctica	+
Usnea subfloridana	+

Príklad 5

Kvapalná pred-zmes na prípravu smotanovej zmrzliny sa pripravila zmiešaním:

Zložka	% hmotnostné
sušené odstredené mlieko	11,390
sacharóza	3,410
maltodextrín (MD40)	4,000
guma rohovníka obyčajného	0,072
obilný sirup 63DE	20,705
guarová guma	0,048
Genulacta L100	0,020
maslo	9,015
Avicel RC581	0,240
želatína	0,140
monoglycerid (palmitan)	0,450
vanilín	0,010
AFP (z Príkladu 1*)	0,010 alebo žiadne (kontrolná vzorka)
voda	doplnok

* Poznámka: AFP látka sa pridáva ako koncentrovaný roztok použitím trochu pridanej vody ako zrieďovadla; percentá zodpovedajú množstvu AFP látky

-18Táto zmes sa môže vhodne pasterizovať pri 85 °C počas 15 sekúnd a uskladniť v chladenej nádobe.

Zmes sa môže sa môže použiť na prípravu smotanovej zmrzliny šľahaním s konvenčným domácim mixérom na našľahanie asi 100 %, po čom nasleduje zmrazenie v kľude v domácej mrazničke.

Zmesi podľa tohto vynálezu mali význačne lepšiu textúru ako kontrolná vzorka.

Podobné výsledky sa môžu získať použitím nasledujúcich rastlinných zdrojov: Acer saccharoides, bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua

Príklad 6

Kvapalná pred-zmes na prípravu smotanovej zmrzliny sa pripravila zmiešaním:

Zložka	% hmotnostné
sušené odstredené mlieko	10,00
sacharóza	13,00
maltodextrín (MD40)	4,00
guma rohovníka obyčajného	0,14
maslový olej	8,00
monoglycerid (palmitan)	0,30
vanilín	0,01
AFP (z Príkladu I*)	0,01 alebo žiadne (kontrolná vzorka)
voda	doplnok

* Poznámka: AFP látka sa pridáva ako koncentrovaný roztok v trochu vody; percentá zodpovedajú množstvu AFP látky.

-19Zložky sa zmiešali pri teplote okolia, po čom nasledovala pasterizácia počas 60 sekúnd pri 89 °C. Zmes sa aseptický plnila do balení po 500 ml, uzavrela a uskladnila pri teplotách okolia.

Zmes sa môže použiť na prípravu smotanovej zmrzliny šľahaním s konvenčným domácim mixérom na našľahanie asi 70 %, po čom nasleduje zmrazenie v kľude v domácej mrazničke. Po dvoch mesiacoch uskladnenia mala zmes podľa tohto vynálezu značne lepšiu textúru než kontrolná vzorka.

Príklad 7

Tento príklad opisuje izoláciu a sekvencovanie karotkových AFP. Podobný spôsob sa môže použiť pre ďalšie rastlinné AFP látky.

Tkanivo koreňov karotky z karotiek aklimatizovaných na chlad sa homogenizovalo v troch objemoch (hmotnosť/objem) pufra (20 mmol/l kyseliny askorbovej, 10 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris/HCI, pH 7,2) v predchladenej trecej miske s piestikom a prefiltrovala sa cez jednu vrstvu mušelínu. Filtrát sa centrifugoval pri 6000 g, desať minút pri 4 °C; supernatant sa oddelil a centrifugoval pri 100000 g počas 1 hodiny pri 4 °C. 100000 g supernatant z tohto kroku sa nazýva rozpustná frakcia a peleta je mikrozomálna frakcia.

Supernatant sa aplikoval do 30 ml kolóny s rýchlym prietokom Q Sepharose (Pharmacia) vopred uvedenej do rovnováhy s 50 mmol/l Tris/HCI pH 7,4 pri rýchlosti prietoku 5 ml/min dodávanej pomocou čerpadla HiLoad púmp P-50 riadeného pomocou Gradifrac nízko tlakového chromatografického systému (Pharmacia) pri 4 °C a eluát sa monitoroval ako absorbancia pri 280 nm pomocou UV monitora (Monitor UV1, Pharmacia) záznam bol na grafickom zapisovači (REC 102, Pharmacia). Zbierali sa 5 ml frakcie. Kolóna sa premyla s 50 mmol/l Tris/HCI pH 7,4 pri rovnakej prietokovej rýchlosti, kým sa absorbancia pri 280 nm nevrátila na nulu. Potom sa aplikoval 150 ml gradient 0 až 0,4 mol/l NaCI v Tris/HCI pH 7,4 nasledovaný premytím kolóny s 2 mol/l NaCI. Eluátové frakcie sa podrobili roztláčacej skúške ako v Príklade 1.

-20Frakcie obsahujúce anti-mrazové aktívne látky sa spojili a skoncentrovali použitím polyetylénglykolu nasledujúcim spôsobom: frakcie sa previedli do dialýznej skúmavky na rez 10 kDa (Sigma), ktorá sa premyla vodovodnou vodou, povarila sa v 50 mmol/l EDTA pH 7,5 počas 10 minút a opláchla sa vodou milli Q. Dialýzne skúmavky obsahujúce vzorku, ktorá sa má skoncentrovať boli zakryté tuhou polyetylénglykolovou látkou s molekulovou hmotnosťou 15000 až 20000 (Sigma) a inkubovali sa pri 4 °C počas doby až do 4 hodín alebo dovtedy, kým sa objem vo vnútri dialýznej trubičky nezmenšil 10 krát.

Spojené koncentráty z kolóny Q Sepharose sa aplikovali buď na kolónu fenyl Sepharose, kolónu gélovej filtrácie SMART Superdex 75 alebo na kolónu gélovej filtrácie FPLC Superdex 75.

Anti-mrazové proteíny zkarotkových koreňov sa čistili pomocou gélovej chromatografie nasledovným spôsobom:

μΙ alikvóty vzorky sa aplikovali na kolónu gélovej filtrácie SMART Superdex 75 (Pharmacia) vopred uvedenú do rovnováhy s 50 mmol/l Tris/HCI pH

7,4 obsahujúcim 0,15 mol/l NaCI (Pufor E) pri prietokovej rýchlosti 40 μΙ/min a zložky sa separovali pomocou gélovej filtrácie pri rovnakej prietokovej rýchlosti rovnovážneho pufra. Eluát sa monitoroval absorbanciou pri 280 nm a 215 nm. Odoberali sa 80 μΙ frakcie medzi 0,85 a 0,89 ml, 40 μΙ frakcie medzi 0,89 a 1,24 ml a 100 μΙ frakcie medzi 1,24 a 3,0 ml. Voľný objem (Vo) kolóny bol 0,91 ml podľa určenia retenčného objemu roztoku Blue Dextran. Kolóna Superdex bola kalibrovaná pomocou 10 μΙ roztoku obsahujúceho 5 mg/ml BSA (Mr 66 kDa, retencia (Ve) = 1,02 ml), 3 mg/ml anhydráza kyseliny uhličitej (Mr 29 kDa, Ve = 1,22 ml), 2 mg/ml Cytochrome C (Mr 12,4 kDa, Ve = 1,41 ml) a 2 mg/ml Aprotinin (Mr 6,5 kDa, Ve = 1,59 ml) a nakreslila sa štandardná krivka Ve/Vo oproti log Mr. Frakcie obsahujúce anti-mrazové aktívne látky sa identifikovali pomocou roztláčacej skúšky v Príklade I, s píkom aktivity, ktorý sa ukázal pri retenčnom objeme 1,16 ml a zdanlivej molekulovej hmotnosti 40 kDa. Tieto merania potvrdili, že 38 kDa pás z karotiek aklimatizovaných na chlad bol anti-mrazovým peptidom.

SDS-PAGE sa uskutočnila podľa práce Laemmliho (1970) použitím Biorad

-21 mini systému. Vzorky, ktoré sa mali analyzovať pomocou SDS-PAGE sa rozpustili v SDS-PAGE vzorkovom pufri (Laemmli 1970), zahriali sa počas 5 minút pri 100 °C na suchom vyhrievacom bloku (Techne) a centrifugovali sa počas 3 minút pri 100000 g pri laboratórnej teplote. Vzorky (10 až 50 μΙ) sa aplikovali na mini-gély (Biorad, 0,75, 1,0 alebo 1,5 mm hrúbky, 10, 12, 15 % hmotnostných akrylamidu alebo 10 až 20 % hmot-nostných gradient akrylamidu (vopred preliaty cez Biorad)) a separovali sa elektro-foretickým spôsobom. Separované polypeptidy sa fixovali a vyfarbovali sa na géli buď s Coomassie blue (0,1% {hmotn./objem} Coomassie Brilliant Blue v zmesi kyselina octová/metanol/milli Q voda (5:4:31, objemovo)) alebo sa vyfarbovali striebrom použitím vyfarbovacieho kitu Biorad silver podľa návodu výrobcu. Gély sa vysušili medzi dvoma listami celofánu Gelair v Biorad gelair sušiči podľa návodu výrobcu. Na určenie zdanlivej Mr na SDS-PAGE sa použili kity markerov Sigma s vysokým a nízkym rozsahom molekulovej hmotnosti podľa návodu výrobcu.

Iónovovýmenná chromatografia sa uskutočnila s koreňmi karotky aklimatizovanej na chlad a s koreňmi karotky neaklimatizovanej na chlad. Výsledné gély gélovej SDS-PAGE ukázali prítomnosť asi 38 kDa pásu vo vzorke aklimatizovanej na chlad. Tento pás bol oveľa menej silný v koreňoch neaklimatizovaných na chlad. Tento (asi) 38 kDa pás bol teda priradený antimrazovým aktívnym látkam.

Na sekvencovanie proteínu sa proteín asi 38 kDa z koreňov karotky čistil, ako je opísané v predchádzajúcom príklade a potom sa na zabezpečenie ďalšieho čistenia vzorky, ktorá sa má sekvencovať, vyrezali z SDS PAGE gélu a potom sa digerovali proteolyticky in situ v plátkoch polyakrylamidového gélu.

Preparáty do značnej miery čistého proteínu asi 38 kDa, ktoré ešte mali trochu minoritných kontaminujúcich proteínov, sa naniesli na 12 % polyakrylamidový gél. Naniesli sa tri pásiky po 2 pg proteínu a uskutočnila sa elektroforéza, kým čelo farbiva nedosiahlo dno gélu. Gél sa potom vyfarbil v zmesi 0,2 % coomassie brilliant blue (hmotnosť/objem), 30 % metanolu (objemové), 1% kyseliny octovej (objemové) počas 20 minút a potom sa odfarbil s 30 % metanolom,

-22kým sa proteínové pásy nevizualizovali. 38 kDa pás sa identifikoval porovnaním s markermi molekulovej hmotnosti nanesenými v susedných pásikoch a pásy z jednotlivých vzoriek sa vyrezali čepeľou skalpela, pričom sa dával pozor, aby sa vylúčili kontaminujúce pásy.

Plátky gélu sa preniesli do čistej eppendorfovej skúmavky a premyli sa dva krát s 0,5 ml 50 % acetonitrilu (objemové), 100 mmol/l Tris/CI, pH 8,5. Premytie odstránilo časť coomassie farbiva a tiež čiastočne dehydratovalo gélové plátky. Gélové plátky sa potom odstránili zo skúmavky a podrobili sa sušeniu vzduchom na laboratórnom stole, kým významne nezoschli a nezačali sa skrúcať. Potom sa preniesli späť do eppendorfovej skúmavky a rehydratovali sa najprv, 10 μΙ 100 mmol/l Tris/CI, pH 8,5 obsahujúcim 1 μρ endoproteinázy Lys C (Boehringer Mannheim). Toto je proteináza, ktorá špecificky štiepi polypeptidové reťazce na karboxylovom koncovom mieste lyzínových zvyškov. Ďalej sa ku gélovým plátkom pridal Tris pufer, kým sa úplne nerehydratovali a potom sa inkubovali pri 37 °C počas 16 hodín.

Po inkubácii sa pridal do skúmavkyl μΙ kyseliny trifluóroctovej, aby sa zastavila reakcia a potom sa gélové plátky premyli dvakrát s 0,3 ml 60 % acetonitrilu (objemové), 0,1% TFA (objemové) pri 30 °C počas 30 minút. To spôsobilo znova čiastočne dehydratovanie gélových plátkov, pričom sa zosušia a eluovanie peptidov, ktoré sa takto vyvolalo. Supernatant sa preniesol do inej čistej eppendorfovej skúmavky a potom sa vysušil v centrifúgačnom odparovači počas 2 hodín, kým vzorka nebola takmer suchá a resuspendoval sa na objem 0,1 ml s 0,1% TFA.

Peptidy sa potom separovali pomocou HPLC na obrátených fázach na zariadení Smart micropurification systém (Pharmacia). Peptidový výťažok sa nadávkoval na C18 kolónu (2,1 x 100 mm) v rovnováhe s 0,1% TFA (Rozpúšťadlo A) pri prietokovej rýchlosti 0,1 ml/min. Kolóna sa potom eluovala s gradientom 0 až 70 % Rozpúšťadla B (90 % objemových acetonitrilu, 0,085 % objemových TFA) počas 70 minút pri rovnakej prietokovej rýchlosti. Absorbancia sa monitorovala pri 214 nm a individuálne peptidové piky sa odoberali zberačom frakcií pomocou

-23ručného krokovania. Polypeptidy sa sekvencovali nadávkovaním do sekvencera p rote í nov model 492 Perkin Elmer použitím chemických cyklov kvapalnej fázy podľa odporúčaní výrobcu.

Viaceré polypeptidové fragmenty (A až E) sa analyzovali v 38 kDa páse a mali sekvencie v podstate homologické na:

(A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS (C) LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL-

PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS (E) X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU-LYS

Bunkové kultúry na výrobu anti-mrazových proteínov sa pripravili nasledujúcim spôsobom:

Nové bunkové kultúry sa iniciovali na základe metód opísaných v prácach Gamborg a Wetter 1975, Torres 1989, Dodds a Roberts 1985.

Karotka aklimatizovaná na chlad (Autumn King): Povrch zásobných koreňov sa najprv sterilizoval premytím s roztokom detergentu 10 % hmotnostných Teepol, po čom nasledovalo oškrabanie pod tečúcou vodou, potom opláchnutie pod tečúcou vodou počas 15 minút. Kde to bolo praktické (na základe veľkosti) koreň sa olúpal. Koreň sa potom aseptický rozrezal na 0,5 cm plátky, ktoré sa umiestnili v roztoku 70 % objemových etanolu počas 10 minút s pretrepávaním, po čom nasledovalo 10 % objemových Domestos + 2 kvapky Tween 20 (Sigma) počas 25 minút, tiež s pre-trepávaním. Rezy sa potom premyli 3x so sterilnou destilovanou vodou. Valce priemeru približne 0,5 cm sa vyrezali z plátkov použitím sterilného skalpela, a zvyšok sa rozrezal na 2 až 3 mm dĺžky. Tieto tkanivové kotúče (explanty) sa aseptický preniesli na tuhé MS médium obsahujúce 30 g/l sacharózy, 10 mg/l kyseliny indoloctovej (IAA), 0,1 mg/l kinetinu a 8 g/l technického agaru, ktorý bol v 60 ml kontajneroch Sterilin. Explanty sa inkubovali v tme pri 20 °C.

Keď to bolo potrebné, výsledné kalusy sa rozdelili na menšie rezy, ktoré sa naniesli na čerstvé médium. Suspenzia kultúr sa potom iniciovala z aktívne rastúcich kalusov.

-24Okrem toho sa suspenzie kultúry kmeňov karotkových buniek (NOR a 0X6) získali z Katedry biochémie a molekulovej biológie, Univerzita Leeds. 10 ml týchto kultúr sa pestovali na 90 ml čerstvého Murashigovho a Skoogovho média (Sigma) obsahujúceho 25 g/l sacharózy a 1 mg/l 2,4-D každých sedem dní. Kultúry sa inkubovali v orbitálne pretrepávanom inkubátore pri 150 otáčok/minútu pri 25 °C v tme.

NOR kultúra sa opracovala nasledujúcim spôsobom:

x 5 ml 7 dní stará NOR kultúra sa pridala do 18 x 100 ml Erlenmeyerových baniek obsahujúcich 45 ml karotkového MS média. Kultúry sa inkubovali pri 25 °C, ako je opísané skôr, počas 4 dní, potom sa teplota inkubátora znížila na 4 °C. Dve banky sa odobrali ihneď a bunky a médium sa zberali, ako je opísané skôr ako t = 0. Zostávajúce banky sa zberali po dvoch v časoch t = 8 h, 1 deň, 2 dni, 4 dni, 7dni, 9 dní, 11 dní a 14 dní.

Aklimatizačné opracovanie chladom sa opakovalo použitím väčších kultúr aj NOR aj 0X6, ktoré sa preniesli do 4 °C po 4 dňoch a 7 dňoch rastu pri 25 °C. Kultúry sa zberali pri t = 0, t = 7dní a t = 14 dní. Okrem zbierania sa pre každú kultúru v každom bode času určilo PCV.

Bunky NOR aklimatizované na chlad sa pripravili pre roztláčaciu analýzu ako v Príklade I nasledujúcim spôsobom: Rýchlo zmrazené bunky sa rozotreli na jemný prášok v kvapalnom dusíku použitím trecej misky s piestikom. Práškové vzorky sa resuspendovali v 2x objeme 10 mmol/l EDTA + 20 mmol/l kyseliny askorbovej, rozmixovali sa počas 30 sekúnd, potom sa centrifugovali pri 10000 g počas 10 minút. 10 μΙ alikvóty supernatantov sa analyzovali roztláčacou skúškou použitím kontrolného pufra ako negatívnej kontrolnej vzorky. Rl aktivita sa detegovala v bunkách aklimatizovaných na chlad a médiu, ale nie vo vzorkách neaklimatizovaných na chlad.

Prostredie vzoriek z NOR suspenzie sa analyzovalo nasledujúcim spôsobom. NOR karotkové médium sa pufrovalo prídavkom 100 μΙ 1 mol/l Tris/HCI pH 7,4. Toto sa potom dávkovalo do 1 ml kolóny Q Sepharose (Pharmacia) pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min naviazané molekuly sa eluovali s 3 ml alikvótmi 50

-25mmol/l Tris/HCI pH 7,4 obsahujúcimi koncentráciu 0,5 mol/l NaCI. Odoberali sa 1 ml frakcie.

Táto aniónová výmenná metóda sa tiež použila na frakcionovanie vzoriek t = 0, 2 dni, 4 dni, 7 dní, 11 dní studenej aklimatizácie a prostredia t = 7 dní bez aklimatizácie na chlad. Frakcie sa testovali z hľadiska aktivity pomocou sendvičovej roztláčacej skúšky, ako je opísané v Príklade I.

„ Anti-mrazové aktívne látky v kultivačnom médiu sa čistili pomocou gélovej chromatografie takýmto spôsobom. 14 na chlad aklimatizovaných 0,5 mol/l NaCI * eluátov z kolóny Q Sepharose (frakcia 2) z vyššie uvedeného postupu sa zrážali acetónom a peleta sa resuspendovala v 50 μΙ 50 mmol/l Tris/HCI + 0,15 mol/l NaCI, pH 7,2. Toto sa potom centrifugovalo pri 10000 g počas 10 minút, a 20 μΙ sa dávkovalo na gélovú kolónu Superdex 75 g v zariadení Pharmacia SMART systém. Prietoková rýchlosť bola 40 μΙ/min a mobilná fáza bola 50 mmol/l Tris/HCI + 0,15 mol/l NaCI, pH 7,2. Zbierali sa 80 μΙ frakcie a analyzovali sa roztláčacou skúškou. Tento postup sa opakoval použitím vzorky t = 14 dní bez aklimatizácie na chlad 0,5 mol/l NaCI eluát z kolóny Q Sepharose a čerstvého média.

Ďalšia izolácia aktívnych proteínov sa môže urobiť pomocou SDS PAGE analýzy, ako je opísané vyššie.

Príklad 8 « Extrakty koreňov zkarotkových koreňov aklimatizovaných na chlad sa pripravili oškrabaním čerstvo vytrhnutých karotiek aklimatizovaných na chlad v studenej vode. Vršky sa odstránili a šťava sa extrahovala použitím domáceho extraktora šťavy (Russell Hobbs, model č. 9915). Šťava sa zmrazila v 1 litrových blokoch a uskladnila pri -20 °C pred odberom na použitie v skúškach zmrzliny.

Karotková AFP šťava sa pridala do nasledujúceho prípravku zmrzliny

Zložka	hmotnostné diely
Sušené odstredené mlieko	10,000
Sacharóza	13,000
MD40	4,000
Guma rohovníka obyčajného	0,144
Genulacta L100	0,016
MGP	0,300
Maslový olej	8,000
Vanilín	0,012
Voda	64,529
‘Karotkový extrakt (z karotiek aklimatizovaných na chlad obsahujúcich 1 až 10 mg AFP látok na kg	4,472

Zmrzlina sa pripravila zmrazením vyššie uvedeného prípravku a prevzdušnením na 106 % našľahanie.

Merania sa urobili na čerstvej vzorke a na vzorkách, ktoré sa podrobili uskladneniu pri -10 °C počas doby 10 dní.

Ako porovnanie sa rovnakým spôsobom merala vzorka bez karotkového extraktu. Merania sa robili nasledujúcim spôsobom:

Vzorky sa uviedli do rovnováhy pri -18 °C v zariadení Prolan Environmental cabinet počas približne 12 hodín. Tri vzorky sa vybrali reprezentačne pre každú dávku zmrzliny a z každej sa pripravil mikroskopovací preparát v zariadení Cryostat - teplotné riadenej skrini - pomocou rozotretia tenkej vrstvy zmrzliny zo stredu každého bloku na mikroskopovacie sklíčko. Jedna kvapka lakového benzínu sa aplikovala na preparát potom sa použilo krycie sklíčko. Každý preparát sa potom preniesol na teplotné riadený statív mikroskopu (Leit LaborLux S, Leica x10 objektív, teplota -18 °C). Zaznamenali sa obrazy kryštálov ľadu (asi 400 individuálnych kryštálov ľadu) a preniesli sa pomocou videokamery (Sanyo CCD) do systému uloženia a analýzy obrazu (LEICA Q520MC).

Uložené obrazy kryštálov sa ručne zvýraznili pomocou obkreslenia okolo ich obvodu, čo potom zvýrazní celý kryštál. Obrazy zvýraznených kryštálov sa potom

-27merali použitím softvéru analýzy obrazu, ktorý počítal počet pixelov potrebných na vyplnenie najdlhšej priamky (dĺžka), najkratšej priamky (šírka), pomer strán (dĺžka/šírka). Údaje pre každý jednotlivý kryštál ľadu dávky zmrzliny sa importovali do tabuľkového procesora, kde sa uskutočnila analýza súboru údajov, aby sa našli priemer a štandardná odchýlka.

Merania tvrdosti zmrzliny sa uskutočnili použitím zariadenia Hounsfield H10KM Universal Tester, Hounsfield 100N Load Celí a 10 cm cylindrickej sondy z nehrdzavejúcej oceli. Vzorky zmrzliny sa pripravili pomocou 16 hodinovej inkubácie 486 ml blokov zmrzliny v zariadení Prolan Temperature Control Cabinet nastavenom na -18 °C.

Blok zmrzliny sa vybral z Prolan teplotné riadenej skrine a umiestnil sa do zariadenia Hounsfield H10KM Universal Tester. 10 cm cylindrická sonda sa vtlačila do bloku zmrzliny pri konštantnej rýchlosti 400 mm/min do hĺbky 20 mm. Zaznamenala sa maximálna sila počas stláčania a vyjadrila sa ako tvrdosť zmrzliny. Ak sa pozorovalo prasknutie alebo krehký zlom vzorky, zaznačilo sa to do stĺpca na pravej strane.

Získali sa nasledujúce výsledky

	Parametre veľkosti kryštálov ľadu	Vlastnosti materiálu
Vzorka	Stredná dĺžka kryštálu /pm	Stredná šírka kryštálu /pm	Stredný faktor tvaru kryštálu /-	Stredný pomer strán kryštálu /-	Tvrdosť /N	Pozorovanie krehkého zlomu
Karotkové AFPčerstvé	26,79 ±1,3	19,0 ±0,9	1,15 ±0,013	1,43 ±0,024	40,8	áno
Karotkové AFPuskladnené	33,48 ±1,3	24,61 ±0,9	1,13 ±0,013	1,37 ±0,020	59,9	áno
Kontrolná vzorka čerstvá	33,67 ±1,1	24,79 ±0,8	1,12 ±0,008	1,38 ±0,018	27,3	nie
Kontrolná vzorka uskladnená	61,77 ±2,7	46,54 ±2,0	1,11 ±0,010	1,37 ±0,020	32,7	nie

-28Môžu sa urobiť nasledujúce závery:

a) Počiatočná veľkosť kryštálov ľadu je menšia v zmrzline obsahujúcej karotkové AFP látky, teda karotkové látky inhibujú rekryštalizáciu

b) Kryštály ľadu v zmrzline s karotkovými AFP látky spomalili svoje rekryštalizačné procesy.

c) Tvar kryštálov ľadu v zmrzline s karotkovými AFP látky nie je významne odlišný od tvaru pozorovaného v konvenčných zmrzlinách.

d) Vlastnosti materiálu zmrzliny obsahujúcej karotkové AFP látky sú modifikované oproti vlastnostiam uvedeným pre konvenčné zmrzliny. Menovite sú zmrzliny tvrdšie než konvenčné zmrzliny, ale sú ešte mäkšie než zmrzliny obsahujúce napríklad rybacie AFP látky. Po druhé, pozorovalo sa, že zmrzliny obsahujúce karotkové AFP látky sú lámavé.

Podobné veľmi dobré výsledky sa môžu získať použitím Geranium alebo Juncus squarrosus.

Príklad 9

Tento príklad opisuje izoláciu rôznych proteinov z ozimnej raži a ich testovanie.

Listy z rastlín raži aklimatizovanej 30 dní v chlade sa narezali na 3 cm dĺžky a starostlivo sa premyli v destilovanej vode, aby sa odstránil bunkový obsah. Kúsky listov sa poklepaním vysušili na papierovej utierke a úplne sa ponorili do extrakčného činidla 5 mmol/l EDTA, 10 mmol/l kyseliny askorbovej, 2 mmol/l kyseliny kaprónovej, 2 mmol/l benzamidínu a 1 mmol/l fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Potom sa vákuovo filtrovali v Buchnerovej banke počas 60 minút a po tejto dobe sa listy odstránili a poklepaním sa úplne vysušili. Potom sa usporiadali pozdĺžne v odrezanom obale plastovej striekačky a jemne sa centrifugovali pri 2000 X g počas 30 minút. Apoplastický extrakt sa oddelil do Eppendorfovej skúmavky pod striekačkou.

Apoplastický extrakt sa skoncentroval 7 krát použitím Amicon ultrafiltra s PM10 membránou. Počiatočné čistenie sa uskutočnilo nanesením 50 mikrolitrov

-29koncen-trovaného apoplastického extraktu na gélovú kolónu Superdex 75 PC 3,2/3,0 (separačný rozsah 3 až 70 kDa) v separačnom systéme SMART, obe od Pharmacia. Pufrom bol 50 mmol/l Tris/HCI pri pH 9,5. Separácia sa uskutočnila pri prietokovej rýchlosti 50 mikrolitrov za minútu a odoberali sa 50 mikrolitrové frakcie až do objemu 2,5 ml a skúšali sa z hľadiska rekryštalizácie, ako je opísané v Príklade 1.

Aktívne frakcie sa nadávkovali na silne bázickú aniónovovýmennú kolónu MonoQ FPLC od Pharmacia, v rovnováhe v 50 mmol/l Tris/HCI pri pH 9,5, a proteíny sa eluovali použitím rovnakého pufra s lineárnym gradientom do 0,5 mol/l NaCI. Elučný pufer sa pridal do koncentrácie 0,5 mol/l NaCI počas 25 minút, udržiaval sa počas 10 minút a znížil sa na 0 mol/l počas 15 minút. Chromatografia sa uskutočnila pri prietokovej rýchlosti 1 ml za minútu a zbierali sa 1 ml frakcie. Frakcie, ktoré boli pozitívne v teste podľa Príkladu 1, sa skoncentrovali na Centrican PM10 centrifugačnom koncentrátore pri 7000 otáčkach/minútu, kým sa objem nezmenšil na 50 mikrolitrov a dávkovali sa druhý krát na S75 kolónu. Frakcie, ktoré spĺňali test z Príkladu 1 mali jediný pík pri približne 150 mmol/l soli.

Táto aktívna frakcia sa separovala na SDS PAGE (Podobná metodológia ako v Príklade 7). Toto potvrdilo, že 32 kDa bola aktívna frakcia.

kDa frakcia proteínu ozimnej raži sa môže výhodne použiť na prípravu mrazených cukrárenských produktov.

Claims (9)

1. Mrazené cukrárenské produkty, obsahujúce jeden alebo viaceré antimrazové polypeptidy získané z rastlín, vyznačujúce sa tým, že antimrazové poly-peptidy vo vodnej zmesi majú veľkosť kryštálov ľadu - početný priemer, po rýchlom zmrazení na -40 °C alebo menej, po čom nasleduje _a uskladnenie počas 1 hodiny pri -6 °C, menej ako 15 pm, s výhradou, že antimrazový peptid nie je anti-mrazový peptid z Vinea Minor, ktorý je umiestnený v extracelulárnych priestoroch rastlinných buniek a má molekulovú hmotnosť 36 kD, 30 kD, 24 kD, 22 kD, 11 kD, 9 kD alebo 5 kD.

2. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, ž e anti-mrazový polypeptid je získaný z Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccharoides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (karotka), Vinea minor (zimozeleň), Vinea major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua (pýr), Poa pratensis (Kentucká modrá tráva), Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, * Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, v

Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis a Festuca contracta.

3. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že anti-mrazový polypeptid je získaný z rodu lišajníkov, zvlášť Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes,

Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana.

4. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že anti-mrazový polypeptid je získaný z Juncus squarrosus alebo Geranium.

:

5. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m, ž e anti-mrazový polypeptid si zachováva schopnosť obmedziť rast kryštálov ľadu po tepelnom opracovaní nad teplotu 60 °C počas doby najmenej 30 sekúnd, výhodnejšie viac ako 1 minúta.

6. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že anti-mrazový polypeptid je získaný z Acer saccharoides, bambusu, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua.

7. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, ž e anti-mrazový polypeptid je získaný z netoxickej rastliny.

8. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 2, vyznačujúci sa t t ý m, ž e anti-mrazovým polypeptidom je 32 kDa proteín získaný z ozimnej raži.

9. Mrazený cukrárenský produkt podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m, ž e produkt je v podstate bez anti-mrazových polypeptidov z ozimnej raži.